JPS591500A - ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用したプロモ−タ検出用プラスミドベクタ−及びその製造方法 - Google Patents
ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用したプロモ−タ検出用プラスミドベクタ−及びその製造方法Info
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- JPS591500A JPS591500A JP57110999A JP11099982A JPS591500A JP S591500 A JPS591500 A JP S591500A JP 57110999 A JP57110999 A JP 57110999A JP 11099982 A JP11099982 A JP 11099982A JP S591500 A JPS591500 A JP S591500A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、トリメトプリム耐性の発現を目安としてプロ
モータ活性を有するＤＮＡ断片を検出するための１ラス
ミドであり、アンピシリン耐性遺伝子を遺伝標識として
有するプラスミドベクター及びその製造方法に関するも
のである。
モータ活性を有するＤＮＡ断片を検出するための１ラス
ミドであり、アンピシリン耐性遺伝子を遺伝標識として
有するプラスミドベクター及びその製造方法に関するも
のである。
近年、分子生物学及び遺伝子工学の発展を背景に、組替
えＤＮＡ手法を用いて有用な物質を生み出す方法が脚光
をあびつつある。これまでの分子生物学の成果より、遺
伝子の情報発現は、ＤＮＡからメツセンジャーＲＮＡ
（以下、ｍＲＮＡ と略す。）が作られる段ｌ＠（
転写の段階）及びｍＲＮＡが読みとられてタンパク質を
作る翻訳の段階の２段階でその調節が行われており、遺
伝子には、タンパク質の一次構造を暗号化するＤＮＡ配
列の他に、プロモータと呼ばれる転写１１１訳の開始に
つかさどるＤＮＡ配列の存在が明らかＶＣされている。
えＤＮＡ手法を用いて有用な物質を生み出す方法が脚光
をあびつつある。これまでの分子生物学の成果より、遺
伝子の情報発現は、ＤＮＡからメツセンジャーＲＮＡ
（以下、ｍＲＮＡ と略す。）が作られる段ｌ＠（
転写の段階）及びｍＲＮＡが読みとられてタンパク質を
作る翻訳の段階の２段階でその調節が行われており、遺
伝子には、タンパク質の一次構造を暗号化するＤＮＡ配
列の他に、プロモータと呼ばれる転写１１１訳の開始に
つかさどるＤＮＡ配列の存在が明らかＶＣされている。
最近、遺伝子工学の手法により、微生物を用いたソマト
スタチン、インンエリン、インターフ−ロン等極めて有
用な物質の生産が行われようとしているが、異種ＤＮＡ
であるこれら有用ポリペプチドを暗号化したＤＮＡ、例
えば、ｍＲＮＡから逆転写によって得られるＤＮＡをそ
のまま１ラスミドに導入しただけでなま有用ポリペプチ
ドの生産が開始されず、導入した異種Ｉ）ＨＡの読み取
り、すなわち、プロセータがなければならないことが明
らかにされて８た。また、１０モータにもその活性ｖｃ
＠弱があり、導入した異種ＤＮＡの発現、すなわち、目
的ポリペプチドの生産が、プロモータ活性の強弱に依存
するものと考えられるようになってきた。遺伝子工学の
手法を用いて有用ポリペプチドの生産を異種生物で行う
場合、生産量を高めるためにＩ″ｉ強力なプロモータを
付与することが考えられるが、導入された異種ＤＮＡの
遺伝子船物が多量に生産されることによって、宿主菌が
悪影響を受けることが予想され、また、実際そのような
例も明らかにされている０このため導入された異種ＤＮ
Ａを宿主菌に害をおよほさない程度に効率よく発現させ
るのに都合のよいプロモータを見本発明者らは、このよ
うな事情に鑑み、宿主菌の遺伝子内に存在する槓々の値
開のプロモータを取り出し、特定具備ＤＮＡの発現には
・それに適したプロモータを見い出すことが必要である
と痛感するようになった。このためには、プロモータの
検出が必須である。そこで、プロモータの検出法につい
て鋭意研究を重ねた結果、すでに本発明者らが開発した
トリメト１リム耐性遺伝子を組み込んだプラスミドベク
ター全改貴することにより、プロモータ検出用プラスミ
ドが得られることを見い出し、本発明企完成するに至っ
た。
スタチン、インンエリン、インターフ−ロン等極めて有
用な物質の生産が行われようとしているが、異種ＤＮＡ
であるこれら有用ポリペプチドを暗号化したＤＮＡ、例
えば、ｍＲＮＡから逆転写によって得られるＤＮＡをそ
のまま１ラスミドに導入しただけでなま有用ポリペプチ
ドの生産が開始されず、導入した異種Ｉ）ＨＡの読み取
り、すなわち、プロセータがなければならないことが明
らかにされて８た。また、１０モータにもその活性ｖｃ
＠弱があり、導入した異種ＤＮＡの発現、すなわち、目
的ポリペプチドの生産が、プロモータ活性の強弱に依存
するものと考えられるようになってきた。遺伝子工学の
手法を用いて有用ポリペプチドの生産を異種生物で行う
場合、生産量を高めるためにＩ″ｉ強力なプロモータを
付与することが考えられるが、導入された異種ＤＮＡの
遺伝子船物が多量に生産されることによって、宿主菌が
悪影響を受けることが予想され、また、実際そのような
例も明らかにされている０このため導入された異種ＤＮ
Ａを宿主菌に害をおよほさない程度に効率よく発現させ
るのに都合のよいプロモータを見本発明者らは、このよ
うな事情に鑑み、宿主菌の遺伝子内に存在する槓々の値
開のプロモータを取り出し、特定具備ＤＮＡの発現には
・それに適したプロモータを見い出すことが必要である
と痛感するようになった。このためには、プロモータの
検出が必須である。そこで、プロモータの検出法につい
て鋭意研究を重ねた結果、すでに本発明者らが開発した
トリメト１リム耐性遺伝子を組み込んだプラスミドベク
ター全改貴することにより、プロモータ検出用プラスミ
ドが得られることを見い出し、本発明企完成するに至っ
た。
すなわち、本発明け・プロモータ活性を有するＤＮＡＭ
片を特定制限酵素部位に導入することにより、トリメト
プリム耐性を発現するプラスミドベクター、及ヒすでに
本発明者らが開発したトリメトプリム耐性遺伝子を組み
込んだプラスミドベクターの特定ＤＮＡを除去した後、
特定制限酵素によって切断、される配列を結合すること
によってプロモータ検出用プラスミドベクターを製造す
る方法を提供するものである。
片を特定制限酵素部位に導入することにより、トリメト
プリム耐性を発現するプラスミドベクター、及ヒすでに
本発明者らが開発したトリメトプリム耐性遺伝子を組み
込んだプラスミドベクターの特定ＤＮＡを除去した後、
特定制限酵素によって切断、される配列を結合すること
によってプロモータ検出用プラスミドベクターを製造す
る方法を提供するものである。
本発明に用いられる宿主菌は・大腸菌であるが、該プラ
スミドが自立的に寝装される宿主、例えば、大腸菌の近
緑菌であれば応用可能である。以下は、大腸菌について
記載している。
スミドが自立的に寝装される宿主、例えば、大腸菌の近
緑菌であれば応用可能である。以下は、大腸菌について
記載している。
トリメトプリムは、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨ
ＰＲと略す。）の強力な拮抗阻害剤であり、ＤＨＰＲが
阻害されることによりアミノ酸及び核酸の合成反応に必
須なテトラヒドロ葉酸の供給が止められる。このことか
らトリメトプリムけ１抗細菌剤として用いられるが、ト
リメト１リムに対する抵抗性を宿主に付与させるために
は、すでに発明者らが明らかにしているようｖｃＣ特許
出願、５６−１４３５２０）ＤＨＰＲ遺伝子を多コピー
プラスミドに組み込んで宿主に導入し１細胞内における
この遺伝子の含量を高めてＤＨＰＲを多量に生産させる
ことによって達成できる。ＤＨＰＲａ伝子け、作られる
タンパク質のアミノ酸配列を暗号化しているＤＮＡ配列
と、この暗号音読み取らせるための配列であるプロモー
タ配列とから成り立っている。
ＰＲと略す。）の強力な拮抗阻害剤であり、ＤＨＰＲが
阻害されることによりアミノ酸及び核酸の合成反応に必
須なテトラヒドロ葉酸の供給が止められる。このことか
らトリメトプリムけ１抗細菌剤として用いられるが、ト
リメト１リムに対する抵抗性を宿主に付与させるために
は、すでに発明者らが明らかにしているようｖｃＣ特許
出願、５６−１４３５２０）ＤＨＰＲ遺伝子を多コピー
プラスミドに組み込んで宿主に導入し１細胞内における
この遺伝子の含量を高めてＤＨＰＲを多量に生産させる
ことによって達成できる。ＤＨＰＲａ伝子け、作られる
タンパク質のアミノ酸配列を暗号化しているＤＮＡ配列
と、この暗号音読み取らせるための配列であるプロモー
タ配列とから成り立っている。
従って後者すなわち、プロモータ配列を除くことにより
ＤＨＦＲ遺伝子は、ＤＨＦＲ全作らなくなるが、前者す
なわちＤＨＦＲ自体を暗号化しているＩＩＮＡ配列の前
に、他の７〜ロモータ活性を有するＤＮＡ？接続すると
、この再生遺伝子は、ＤＨＦＲＴｈ生産するようになる
。従って、プロモータ活性分検出するためＫは、ＤＨ？
Ｒａ伝子を組み込んだプラスミドを改造して、ＤＨＰＲ
遺伝子の１０モータ配列全除き、ＤＨＦＲ自体を暗号化
しているＤ Ｎ 、Ａ配列の前に他のＤＮＡを接続しや
すいように特定制限酵素部位を形成すればよい。このよ
うにして形成したプラスミドは、プロモータ配列を接続
することによりＤＨＰＲを生産することができるように
なるので、宿主にトリメトプリム耐性を付与することが
できる。従って、トリメトプリムを言む培地に生育する
宿主菌からのみ、プロモータ配列が導入されたプラスミ
ドを得ることができ、プロモ−夕配列をも／ｌないＤＮ
Ａが導入されたプラスミドを有する宿主菌は、トリメト
プリムを含む培地に生育できないので、プロモータの検
出を容易に行うことができる。しかしながら、現在まで
トリメトプリム耐性の出ｆｉｋマーカーとしたプロモー
タ検出プラスミドベクターはまだ開発されていなかった
。
ＤＨＦＲ遺伝子は、ＤＨＦＲ全作らなくなるが、前者す
なわちＤＨＦＲ自体を暗号化しているＩＩＮＡ配列の前
に、他の７〜ロモータ活性を有するＤＮＡ？接続すると
、この再生遺伝子は、ＤＨＦＲＴｈ生産するようになる
。従って、プロモータ活性分検出するためＫは、ＤＨ？
Ｒａ伝子を組み込んだプラスミドを改造して、ＤＨＰＲ
遺伝子の１０モータ配列全除き、ＤＨＦＲ自体を暗号化
しているＤ Ｎ 、Ａ配列の前に他のＤＮＡを接続しや
すいように特定制限酵素部位を形成すればよい。このよ
うにして形成したプラスミドは、プロモータ配列を接続
することによりＤＨＰＲを生産することができるように
なるので、宿主にトリメトプリム耐性を付与することが
できる。従って、トリメトプリムを言む培地に生育する
宿主菌からのみ、プロモータ配列が導入されたプラスミ
ドを得ることができ、プロモ−夕配列をも／ｌないＤＮ
Ａが導入されたプラスミドを有する宿主菌は、トリメト
プリムを含む培地に生育できないので、プロモータの検
出を容易に行うことができる。しかしながら、現在まで
トリメトプリム耐性の出ｆｉｋマーカーとしたプロモー
タ検出プラスミドベクターはまだ開発されていなかった
。
次に本発明の実施態様について説明する。
まず、プラスミドベクターｐＴＰ５〜３をＳａｌ ｌに
よって切断し１その後再びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
再結合することにより、約４３００ｉｆｉ基対より成る
プラスミドＤＮＡを作成する。Ｓａｌ （け、ｐＴＰ５
−３を３＋所で切断し、約４３００，１２００及び６０
０塩基対の３つのＤＮＡ断片を形成する。
よって切断し１その後再びＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて
再結合することにより、約４３００ｉｆｉ基対より成る
プラスミドＤＮＡを作成する。Ｓａｌ （け、ｐＴＰ５
−３を３＋所で切断し、約４３００，１２００及び６０
０塩基対の３つのＤＮＡ断片を形成する。
このうち約４３００塩基対のり、Ｎ Ａ断片は、アンピ
シリン耐性遺伝子、プラスミドの複製に関与する遺伝子
及びＤ ＩＩ ＦＲ遺伝子のうちプロモータのごく一部
を欠いた遺伝子を含んでいる。よって、得られる約４３
００塩基対のプラスミド（ｐＴＰ ６−６と呼称する。
シリン耐性遺伝子、プラスミドの複製に関与する遺伝子
及びＤ ＩＩ ＦＲ遺伝子のうちプロモータのごく一部
を欠いた遺伝子を含んでいる。よって、得られる約４３
００塩基対のプラスミド（ｐＴＰ ６−６と呼称する。
）は、アンピシリン耐性を宿主に付与するが、トリメト
プリム耐性を付与することはできない。しかし、このプ
ラスミドにおいては、ＤＨＰＲ遺伝子のプロモータの大
部分を含んでいるためブロモ−々油性分もたないＤＮＡ
断片が導入された場合でもＤＨＰＲを作る可能性が考え
られるので、ｐＴＰ６−６をＳａｌ ｉで切断し、次い
で二本鎖ＤＮＡに特異的に働いて両端から核酸を分解す
る酵素エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１全作＃４させるこ
とにより、プロモータの大部分を除く。得られる直鎖状
ＤＮＡの両端は平滑末端である。さらに、異種ＤＮＡを
導入しやすいように特定制限酵素によって切断されるＤ
ＮＡ配列を付は加えて、環状ＤＮＡとし目的プラスミド
ベクターを得る。
プリム耐性を付与することはできない。しかし、このプ
ラスミドにおいては、ＤＨＰＲ遺伝子のプロモータの大
部分を含んでいるためブロモ−々油性分もたないＤＮＡ
断片が導入された場合でもＤＨＰＲを作る可能性が考え
られるので、ｐＴＰ６−６をＳａｌ ｉで切断し、次い
で二本鎖ＤＮＡに特異的に働いて両端から核酸を分解す
る酵素エキソヌクレアーゼＢＡＬ３１全作＃４させるこ
とにより、プロモータの大部分を除く。得られる直鎖状
ＤＮＡの両端は平滑末端である。さらに、異種ＤＮＡを
導入しやすいように特定制限酵素によって切断されるＤ
ＮＡ配列を付は加えて、環状ＤＮＡとし目的プラスミド
ベクターを得る。
特定制限酵素によって切断される部位の創設は、例えば
、ＨｉｎｄｌｌＮｃよって切断される部位は、Ｈｌｎｄ
ｌｌＩリンカ−と呼ばれるｄ（ｐＯＡＡＧＯＴＴＧ）
なる配列をもつＤＮＡをエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１
によって得られる直鎖状ＤＮＡの平滑末端ＶｃＴ４ＤＮ
Ａリガーピを用いて結合し、これを再びＨ１ｎ４ ｌに
よって切断するとＤＮＡの両端は接着末端となる。両端
をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合すると環状ＤＮＡが得られ
、Ｔ４ＤＮＡ ＩＪガーゼで結合された部位はＨｔｎａ
ｐｌによって切断される配列がル成される。このように
して得られるプラスミドベクターが果たしてプロモータ
検出ベクターであるか否かは、次に示されるようにして
確かめることができる。すなわち、ｐＢ１３２２ｉ旧−
１１Ｑ ｌでｖＪ ｈ Ｌ 、さらに、切断点にＨｌｎ
ｄ ｌリンカ−を結合し、再びＨｌｎｄ ｌＩｌで勇断
する。これと、上記ｖｃおいて得られたプラスミドをＨ
ｌ−ｎｄＪｌで切断したものとをＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合し、宿主に取り込ませる。この操作によって宿主が
トリメトプリム耐性？獲得したとすれば、用いたプラス
ミドはフロモータを検出したことになり、プロモータ検
出プラスミドベクターであることが判明する。
、ＨｉｎｄｌｌＮｃよって切断される部位は、Ｈｌｎｄ
ｌｌＩリンカ−と呼ばれるｄ（ｐＯＡＡＧＯＴＴＧ）
なる配列をもつＤＮＡをエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１
によって得られる直鎖状ＤＮＡの平滑末端ＶｃＴ４ＤＮ
Ａリガーピを用いて結合し、これを再びＨ１ｎ４ ｌに
よって切断するとＤＮＡの両端は接着末端となる。両端
をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合すると環状ＤＮＡが得られ
、Ｔ４ＤＮＡ ＩＪガーゼで結合された部位はＨｔｎａ
ｐｌによって切断される配列がル成される。このように
して得られるプラスミドベクターが果たしてプロモータ
検出ベクターであるか否かは、次に示されるようにして
確かめることができる。すなわち、ｐＢ１３２２ｉ旧−
１１Ｑ ｌでｖＪ ｈ Ｌ 、さらに、切断点にＨｌｎ
ｄ ｌリンカ−を結合し、再びＨｌｎｄ ｌＩｌで勇断
する。これと、上記ｖｃおいて得られたプラスミドをＨ
ｌ−ｎｄＪｌで切断したものとをＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合し、宿主に取り込ませる。この操作によって宿主が
トリメトプリム耐性？獲得したとすれば、用いたプラス
ミドはフロモータを検出したことになり、プロモータ検
出プラスミドベクターであることが判明する。
１ｐＢＲ３２２のＨｌｎ（！ ｎとＨｌｎｄｌｌｌによ
る切断によって得られる断片のうち少なくとも一つけプ
ロモータ構造を完全に有する。（Ｊ、 Ｇ、 ５ｕｔｃ
ｌｉｆｆｅ。
る切断によって得られる断片のうち少なくとも一つけプ
ロモータ構造を完全に有する。（Ｊ、 Ｇ、 ５ｕｔｃ
ｌｉｆｆｅ。
（！ｏｌｄ ８ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙ
＋ｎｈｏｓｉｕｍ、４３゜７７ （１９７９））１ また、次の方法によっても本発明の１ラスミドベクター
は得られる。
＋ｎｈｏｓｉｕｍ、４３゜７７ （１９７９））１ また、次の方法によっても本発明の１ラスミドベクター
は得られる。
すなわち、ｐＴＰ６−６ ｙｒｓａｌ ｌで切断し、エ
キソヌクレアーゼＢＡＬ３１を作用させて得られる直鎖
状ＤＮＡＶｃＨ１ｎｄｌリンカ−を結合する。これと、
大腸菌の染色体ＤＮＡを混合し、Ｈｌｎｄ ＠によって
切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合し種々のプラスミド
ＤＮＡを作り、これ全大腸菌に取り込ませ、トリメドブ
・リム耐性となった大腸菌を分離し、これから１ラスミ
ド？単離する。このプラスミドをＨｉｎｄｌｔｌｖｃよ
って切断し、再びＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで結合し、大腸
菌に取り込ませ、アンピシリン耐性でかつ、トリメトプ
リムには耐性のない菌株？分離する。この菌株から１ラ
スミドを・分離すると目的のプロモータ検出用プラスミ
ドベクターが得られる。
キソヌクレアーゼＢＡＬ３１を作用させて得られる直鎖
状ＤＮＡＶｃＨ１ｎｄｌリンカ−を結合する。これと、
大腸菌の染色体ＤＮＡを混合し、Ｈｌｎｄ ＠によって
切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合し種々のプラスミド
ＤＮＡを作り、これ全大腸菌に取り込ませ、トリメドブ
・リム耐性となった大腸菌を分離し、これから１ラスミ
ド？単離する。このプラスミドをＨｉｎｄｌｔｌｖｃよ
って切断し、再びＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで結合し、大腸
菌に取り込ませ、アンピシリン耐性でかつ、トリメトプ
リムには耐性のない菌株？分離する。この菌株から１ラ
スミドを・分離すると目的のプロモータ検出用プラスミ
ドベクターが得られる。
なお、このようにして得られるプラスミドベクターのＨ
１ｎｄＩ１１切断部位は、いわゆるアダプターＤＮＡと
呼ばれる合成Ｔ）ＮＡ全用いて他の制限酵素によって切
断される部位に変換することができる。よって、本発明
における特定制限酵素部位けＨｉｎｄ Ｉ１１部位に限
定されないことは自明である。
１ｎｄＩ１１切断部位は、いわゆるアダプターＤＮＡと
呼ばれる合成Ｔ）ＮＡ全用いて他の制限酵素によって切
断される部位に変換することができる。よって、本発明
における特定制限酵素部位けＨｉｎｄ Ｉ１１部位に限
定されないことは自明である。
次に、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
なお、実施例における菌体からのプラスミドの分離けＴ
ａｎａｌｃａ及びＷｅｉａｂｌｕｍの方法（Ｔ、Ｔａｎ
ａｋａ、Ｂ、ＷａｉｓｈｌｕｍｉＪ、Ｂａｃｔｅｒｉ−
ｏｌｏｇｙ、 １２１．３５４． （１９７５） ｌ
に、ＤＮＡの宿主への取り込みは、Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法（Ｍ、 Ｖ。
ａｎａｌｃａ及びＷｅｉａｂｌｕｍの方法（Ｔ、Ｔａｎ
ａｋａ、Ｂ、ＷａｉｓｈｌｕｍｉＪ、Ｂａｃｔｅｒｉ−
ｏｌｏｇｙ、 １２１．３５４． （１９７５） ｌ
に、ＤＮＡの宿主への取り込みは、Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法（Ｍ、 Ｖ。
Ｎｏｒｇａｒｄ、に、Ｋｅｅｍ、Ｊ、Ｊ、Ｍｏｎａｈａ
ｎｉ（ｌｅｎｅ。
ｎｉ（ｌｅｎｅ。
３．２７９．（１９７９）ｌ ７（従りｆＣ。
実施例
プラスミドベクターｐＴＰ５−３は宿主にトリメトプリ
ム、テトラサイクリン及びアンピシリンの３檎の薬剤に
対する耐性を付与するプラスミドベクターであり発明者
らが開発したものである。第１図にｐＴＰ５−３の制限
酵素による切断地図を示す。約０３μｆのｐＴＰ５−３
を７５μｌの反応液（６ｍＭＭｇ０１ｇ 、０．２ｍＭ
エチレンジアミンテトラ酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す。
ム、テトラサイクリン及びアンピシリンの３檎の薬剤に
対する耐性を付与するプラスミドベクターであり発明者
らが開発したものである。第１図にｐＴＰ５−３の制限
酵素による切断地図を示す。約０３μｆのｐＴＰ５−３
を７５μｌの反応液（６ｍＭＭｇ０１ｇ 、０．２ｍＭ
エチレンジアミンテトラ酢酸（以下、ＥＤＴＡと略す。
）及びｌ ５０ ｍＭ Ｎａ１ｌを含むＢｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−８０１緩衝液（ｐＨ７６）ｌ中で、５ユニツトの制
御！ｌｉ！酵素Ｓａｌ ｌを用いて３７℃２時間反応さ
せた。さらに、６５℃で５分間保つことにより制限酵素
ｓａｌ■１失活させた後、水中に保ち、１５μｌの５０
１１ＩＭ Ｍｇ（ＩＩ、 、 １５μｌの０１Ｍジチオ
トレイトール（以下、Ｉ）ＴＴと略す。）１５μｌの５
ｍＭ ＡＴＰ、７μｌのＬＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝液
（ｐＨ７，４）、２３μｌの水及び０．２ユニツトのＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１８時間反応させ、Ｄ
ＮＡ末端を連結はせることにより再環化反応を行わせた
。この反応生成物をＮｏｒｇａｒｄらの方法に従ってｆ
ｆ１ａｃｈｅｒｉｃｈｉ＆ ｃｏｌｉ Ｋ−１２０６
００株に取り込ませた。この処理をした菌体をｚＯμｌ
／−アンピシリンナトリウム？含む栄養寒天培地（２９
／ｌグルコース、Ｌｌｌ／ｌ Ｋ、ＨＦ２番、５ｔｉ／
ｌポリペプトン、５９／ｌイーストエキス及び１５９
／ ｌ寒天よりなる培地）上にまき、生長する菌体を約
１０００個得ｆｃｏこれらの菌体のうち１００個を適当
に選んで、２μｙ ／ｍｊ！ トリメトプリム及び２０
μｌ／−アンピシリンナトリウムを含む栄養寒天培地上
ｖｃ移し、トリメトプリムに対して耐性を示すかを勇ぺ
たところ、７２個の菌体け、この培地では生長できなか
った。このような菌体、すなわち、アンピシリン耐性で
トリメトプリムに感受性である菌体から一株選んでプラ
スミドを単離した。得られたプラスよドの大きざは、約
４３００頃基対であり、制限＠、ｇＳｈ１７．ＥｃｏＲ
ｌ及びＰｓｔ （によってそれぞれ−ケ所切断されたが
、Ｈｌｎｄ ｌ及びＢａｍＨＩ によっては切断されな
かった。このプラスミドをｐＴＰ６−６と名ずけた。
ｓ−８０１緩衝液（ｐＨ７６）ｌ中で、５ユニツトの制
御！ｌｉ！酵素Ｓａｌ ｌを用いて３７℃２時間反応さ
せた。さらに、６５℃で５分間保つことにより制限酵素
ｓａｌ■１失活させた後、水中に保ち、１５μｌの５０
１１ＩＭ Ｍｇ（ＩＩ、 、 １５μｌの０１Ｍジチオ
トレイトール（以下、Ｉ）ＴＴと略す。）１５μｌの５
ｍＭ ＡＴＰ、７μｌのＬＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝液
（ｐＨ７，４）、２３μｌの水及び０．２ユニツトのＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で１８時間反応させ、Ｄ
ＮＡ末端を連結はせることにより再環化反応を行わせた
。この反応生成物をＮｏｒｇａｒｄらの方法に従ってｆ
ｆ１ａｃｈｅｒｉｃｈｉ＆ ｃｏｌｉ Ｋ−１２０６
００株に取り込ませた。この処理をした菌体をｚＯμｌ
／−アンピシリンナトリウム？含む栄養寒天培地（２９
／ｌグルコース、Ｌｌｌ／ｌ Ｋ、ＨＦ２番、５ｔｉ／
ｌポリペプトン、５９／ｌイーストエキス及び１５９
／ ｌ寒天よりなる培地）上にまき、生長する菌体を約
１０００個得ｆｃｏこれらの菌体のうち１００個を適当
に選んで、２μｙ ／ｍｊ！ トリメトプリム及び２０
μｌ／−アンピシリンナトリウムを含む栄養寒天培地上
ｖｃ移し、トリメトプリムに対して耐性を示すかを勇ぺ
たところ、７２個の菌体け、この培地では生長できなか
った。このような菌体、すなわち、アンピシリン耐性で
トリメトプリムに感受性である菌体から一株選んでプラ
スミドを単離した。得られたプラスよドの大きざは、約
４３００頃基対であり、制限＠、ｇＳｈ１７．ＥｃｏＲ
ｌ及びＰｓｔ （によってそれぞれ−ケ所切断されたが
、Ｈｌｎｄ ｌ及びＢａｍＨＩ によっては切断されな
かった。このプラスミドをｐＴＰ６−６と名ずけた。
第２図にｐＴＰ６−６の制限酵素による切断地図を示す
。
。
ｅＫＶｃ１約５ａｙ）Ｉ）ＴＰ ６−６ ヲ４００ ｐ
ｌｏ 反応液（６ｒｎＭ ＭｇＯ１１、０，２ｍＭ
ＥＤＴＡ、及び１５０ｍＭＮ２Ｌ１ｌを含む８ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝液（ｐＨ７，６）１中で１０ユニ７
トの制限酵素５ａ１（ｙ２市いて３７℃で２時間反応さ
せた後、８μｌのｌ Ｍ Ｔｒｉｏ−ＨＯＩ緩ｍｌ （
ｐＨａｏ）、＋ｐｌのＩＭ ＭｇＯ１４，５ｐｌ：のＩ
Ｍ Ｃａｂｌｅ 、 ８μｌの５Ｍ Ｎａ１ｌ及
びｌＪｊ／の０．２５Ｍ ［ＣＤＴＡ を加え、２
５℃に保ち、２ユニツトのエキソヌクレアーゼＢＡＪＪ
３１を２０秒作用させた。
ｌｏ 反応液（６ｒｎＭ ＭｇＯ１１、０，２ｍＭ
ＥＤＴＡ、及び１５０ｍＭＮ２Ｌ１ｌを含む８ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝液（ｐＨ７，６）１中で１０ユニ７
トの制限酵素５ａ１（ｙ２市いて３７℃で２時間反応さ
せた後、８μｌのｌ Ｍ Ｔｒｉｏ−ＨＯＩ緩ｍｌ （
ｐＨａｏ）、＋ｐｌのＩＭ ＭｇＯ１４，５ｐｌ：のＩ
Ｍ Ｃａｂｌｅ 、 ８μｌの５Ｍ Ｎａ１ｌ及
びｌＪｊ／の０．２５Ｍ ［ＣＤＴＡ を加え、２
５℃に保ち、２ユニツトのエキソヌクレアーゼＢＡＪＪ
３１を２０秒作用させた。
エキソヌクレアーぜの反応け、４００μｌの水飽和７−
ノールを加えることにより停止させ１．５０００回転／
回転速心分離により水層と７−ノール層とに分け、水層
を取り、これを５０ｍＭのＮａ１ｌ を含む５０ｍＭ
Ｔｒ’１５−Ｍｏ１ 綴衝液（ｐＨ７，４）に透析し
た。透析液ＤＮＡ液４００μｌに、４０μｌの３Ｍ
０Ｈ１００ＯＨａを加え、さらに１−のエタノールを加
え、−２０℃に一晩保ち、ＤＮＡを沈でんさせた。１２
０００回転、１５分間の遠心分［により沈でんを集め、
７５μｌの５０ｒｎＭ Ｔｒｉｌｌ−ＨＯＩ緩衝液（
ｐＨ７，４）に溶解した。これに、１５Ｚｊ７の５０ｍ
Ｍ ＭｇＯ１１、１５μｌのαＬＭ’ ＤＴＴ、 １５
μｒの５ｍＭ ＡＴＰ、 ’／、ｕＩ！のＩＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＯＩ緩衝液（ｐＨ７，４）、２３μｌの水、７
μｌの３．５μＭＨ１ｎｄｌヌクレオチドリンカー（（
１（ｐ（ＩＡＡＧＯＴＴＧ月及び１０ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼに、加えて、４℃で１８時間反応させた。
ノールを加えることにより停止させ１．５０００回転／
回転速心分離により水層と７−ノール層とに分け、水層
を取り、これを５０ｍＭのＮａ１ｌ を含む５０ｍＭ
Ｔｒ’１５−Ｍｏ１ 綴衝液（ｐＨ７，４）に透析し
た。透析液ＤＮＡ液４００μｌに、４０μｌの３Ｍ
０Ｈ１００ＯＨａを加え、さらに１−のエタノールを加
え、−２０℃に一晩保ち、ＤＮＡを沈でんさせた。１２
０００回転、１５分間の遠心分［により沈でんを集め、
７５μｌの５０ｒｎＭ Ｔｒｉｌｌ−ＨＯＩ緩衝液（
ｐＨ７，４）に溶解した。これに、１５Ｚｊ７の５０ｍ
Ｍ ＭｇＯ１１、１５μｌのαＬＭ’ ＤＴＴ、 １５
μｒの５ｍＭ ＡＴＰ、 ’／、ｕＩ！のＩＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＯＩ緩衝液（ｐＨ７，４）、２３μｌの水、７
μｌの３．５μＭＨ１ｎｄｌヌクレオチドリンカー（（
１（ｐ（ＩＡＡＧＯＴＴＧ月及び１０ユニツトのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼに、加えて、４℃で１８時間反応させた。
これをＤＮＡ混液混液基ずけた。
ＤＮＡ混液全２０μｌ取り、これに水４８μｌを加え、
さらに７μｌの０．６Ｍ Ｎａ（！ｌ、７０ｍＭ
２−メルカプトエタノール及び７０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ
０１２ を含む’７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝
液（ｐ Ｈ７，４）を加え、３７℃に保ち、これ［５ユ
ニツトのｏｔｎａｌを１１１え２時間反応させた。この
反応液を６５℃、５分間の熱処理をしてＨｌｎｄ Ｉｌ
ｌを失活させた後、１５ｐｌ （’） ５０ ｍＭ
Ｍｇ ＯＩｔ 、 ｌ ５ ｆｉｌｏ ０１ Ｍ
ＤＴＴ。
さらに７μｌの０．６Ｍ Ｎａ（！ｌ、７０ｍＭ
２−メルカプトエタノール及び７０ ｍ Ｍ Ｍ ｇ
０１２ を含む’７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝
液（ｐ Ｈ７，４）を加え、３７℃に保ち、これ［５ユ
ニツトのｏｔｎａｌを１１１え２時間反応させた。この
反応液を６５℃、５分間の熱処理をしてＨｌｎｄ Ｉｌ
ｌを失活させた後、１５ｐｌ （’） ５０ ｍＭ
Ｍｇ ＯＩｔ 、 ｌ ５ ｆｉｌｏ ０１ Ｍ
ＤＴＴ。
１５μｌの５ｍＭ ＡＴＰ、７μｌの１Ｍ Ｔｒｌ
ａ−Ｈ（！１緩衝液（ｐＨ７，４）、２３μｌ の水及
び２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１
８時間反応させた。このような処理をしたＤＮＡ液ｆｔ
Ｋｓｃｈｅ−ｒｊ、ｏｈｉａ ｃｏｌ、ｉ Ｋ−１
２０ａｏ ０株に取り込ませた。この処理をした菌体を
ｚｏ、ｕｐ／−のアンピシリンナトリウムを含む栄養寒
天培地上にまき・生長する菌体を約５００個得た。この
菌体から２４個適当ＶＣ選びプラスミドを単離し、Ｈｔ
ｎａｌで切断したところ、３種のプラスミドがＨｌｎｄ
Ｉｌ［によって切断された。３種のプラスミドをそれぞ
れｐＴＰ ？ −２、ｐＴＰ ７−８及びｐＴＰ？−１
６と名ずけた。
ａ−Ｈ（！１緩衝液（ｐＨ７，４）、２３μｌ の水及
び２ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４°Ｃで１
８時間反応させた。このような処理をしたＤＮＡ液ｆｔ
Ｋｓｃｈｅ−ｒｊ、ｏｈｉａ ｃｏｌ、ｉ Ｋ−１
２０ａｏ ０株に取り込ませた。この処理をした菌体を
ｚｏ、ｕｐ／−のアンピシリンナトリウムを含む栄養寒
天培地上にまき・生長する菌体を約５００個得た。この
菌体から２４個適当ＶＣ選びプラスミドを単離し、Ｈｔ
ｎａｌで切断したところ、３種のプラスミドがＨｌｎｄ
Ｉｌ［によって切断された。３種のプラスミドをそれぞ
れｐＴＰ ？ −２、ｐＴＰ ７−８及びｐＴＰ？−１
６と名ずけた。
Ｓ ａ ｉ、 ｔ ｏ及びＭｉｕｒａの方法Ｉ Ｈ，５
ａｉｔｏ、 Ｋ。
ａｉｔｏ、 Ｋ。
ＭｉｕｒａｉＢｌｏｃｈｉｎｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ
ｔａ、７２゜６１９（１９６３）ｌに従って、Ｅｓｃｂ
ｅｒｉｃｈｌａｃｏｌｌ Ｋ−１２０６００株から得た
ＤＮＡ約１μｆとｐＴＰ ７−２ （もしくは、ｐＴ
Ｐ？−８またげｐＴＰ？−１６）約１μｆを７５μｌの
反応液（７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝液（ｐＨ７，４）
、７ｍＭ ＭｇＯ１，。
ｔａ、７２゜６１９（１９６３）ｌに従って、Ｅｓｃｂ
ｅｒｉｃｈｌａｃｏｌｌ Ｋ−１２０６００株から得た
ＤＮＡ約１μｆとｐＴＰ ７−２ （もしくは、ｐＴ
Ｐ？−８またげｐＴＰ？−１６）約１μｆを７５μｌの
反応液（７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＯＩ緩衝液（ｐＨ７，４）
、７ｍＭ ＭｇＯ１，。
７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、６０ｍＭＮａ１
ｌ ｌ中で、５ユニツトのＨｌｎｄ ＩＩを用いて３７
℃、１時間消化させた。さらに、６５℃で５分間保って
Ｈｉｎｄｌｌｌｔ−失活させた後、水中に保ち、１５μ
ｊの５０ｍＭ ＭｇＯ１ｇ 、１５μｌのＤＴＴ、１
５μｌの５ｍＭ ＡＴＰ、７μｌのＬＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＯＩ緩衝液（ｐＨ７，４）、２３μｌの水及び１ユニ
ツトのＴ ４ＤＮＡリガーゼを加え・４℃で１８時間反
応させん。この反応液をＩａｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ Ｋ−１２０６００株に取り込ませた。この処
理をした菌体全２０μｇ／＋−のアンピシリンナトリウ
ム及び２μｆ／ ｔｎｌ ト＋）メトプリムを含む栄養
寒天培地上にまいたところ、ｐＴＰ ？ −２及びｐＴ
Ｐ７−８を用いた場合は生長する菌体が得られ７２：が
、ｐＴＰ？−１６では得られなかった。
ｌ ｌ中で、５ユニツトのＨｌｎｄ ＩＩを用いて３７
℃、１時間消化させた。さらに、６５℃で５分間保って
Ｈｉｎｄｌｌｌｔ−失活させた後、水中に保ち、１５μ
ｊの５０ｍＭ ＭｇＯ１ｇ 、１５μｌのＤＴＴ、１
５μｌの５ｍＭ ＡＴＰ、７μｌのＬＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＯＩ緩衝液（ｐＨ７，４）、２３μｌの水及び１ユニ
ツトのＴ ４ＤＮＡリガーゼを加え・４℃で１８時間反
応させん。この反応液をＩａｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ Ｋ−１２０６００株に取り込ませた。この処
理をした菌体全２０μｇ／＋−のアンピシリンナトリウ
ム及び２μｆ／ ｔｎｌ ト＋）メトプリムを含む栄養
寒天培地上にまいたところ、ｐＴＰ ？ −２及びｐＴ
Ｐ７−８を用いた場合は生長する菌体が得られ７２：が
、ｐＴＰ？−１６では得られなかった。
ｐ’ｒｐ ７−２とｐＴＰ７−８の分子サイズをアガロ
ースゲル電気泳動で比較したところｐＴＰ？−８が小ざ
かった。すでに本明細書に述べであるようｒｃｐＴＰ７
−２及びｐＴＰ？−８はいずれも、プロモーフ検出プラ
スミドベクターとして使用できることけ明白である。
ースゲル電気泳動で比較したところｐＴＰ？−８が小ざ
かった。すでに本明細書に述べであるようｒｃｐＴＰ７
−２及びｐＴＰ？−８はいずれも、プロモーフ検出プラ
スミドベクターとして使用できることけ明白である。
ｐ’ｒｐ ７−２及びｐＴＰ ？ −８共に、Ｈ１ｎａ
ｌｉ以外ＶＣＥａｏＲｌ 、 Ｐｓｔ ｌ 、 Ｐｙｕ
Ｉによって各−ケ所切１１ｔｉ ８れたが、ＢａｍＨ
Ｉ、 Ｓａ、ｌ ｌｖｃよっては切断されなかった。ｐ
ＴＰ７−８の制限酵素による切断地図を第３図に示す。
ｌｉ以外ＶＣＥａｏＲｌ 、 Ｐｓｔ ｌ 、 Ｐｙｕ
Ｉによって各−ケ所切１１ｔｉ ８れたが、ＢａｍＨ
Ｉ、 Ｓａ、ｌ ｌｖｃよっては切断されなかった。ｐ
ＴＰ７−８の制限酵素による切断地図を第３図に示す。
第１図は、ｐＴＰ５−３の制限酵素による切断地図、第
２図は、ｐＴＰ６−６の制限酵素による切断地図及び第
３図は、ｐＴＰ ？ −８の制限酵素による切断地図で
あり、図中符号は制限酵素を表わし、ＥけＥａｏＲＴ、
ＨけＨ１ｎｄ…、ＢけＢａｍＨｌ、８け５ａＸ）及び
ＰけＰｓｔ７を示す。また旭数字の単位はキロ塩基であ
り、遠吠のＤＮ Ａｐ造を便宜上直線状で表わしている
が、本来は、両端が同一部位である。
２図は、ｐＴＰ６−６の制限酵素による切断地図及び第
３図は、ｐＴＰ ？ −８の制限酵素による切断地図で
あり、図中符号は制限酵素を表わし、ＥけＥａｏＲＴ、
ＨけＨ１ｎｄ…、ＢけＢａｍＨｌ、８け５ａＸ）及び
ＰけＰｓｔ７を示す。また旭数字の単位はキロ塩基であ
り、遠吠のＤＮ Ａｐ造を便宜上直線状で表わしている
が、本来は、両端が同一部位である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 特定制限酵素部位にプロモータ活性を有するＤＮＡ
断片を挿入することにより、トリメトプリム耐性なる遺
伝標識を有するようになることを特徴とするプロモータ
検出用プラスミドベクター。 ２ 大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子２組み込んだ
プラスミドベクターから、その１０モータ活性全特定制
限酵素による切断とエキソヌクレアーぜによる切断を用
いて欠落させ、その後、ジヒドロ葉＃還元酵素を暗号化
する配列の直前に特定制限酵素によって切断されるＤＮ
Ａ配列を付加することを特徴とするプロモータ検出用プ
ラスミドベクターの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57110999A JPS591500A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用したプロモ−タ検出用プラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57110999A JPS591500A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用したプロモ−タ検出用プラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS591500A true JPS591500A (ja) | 1984-01-06 |
| JPS6237958B2 JPS6237958B2 (ja) | 1987-08-14 |
Family
ID=14549830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57110999A Granted JPS591500A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を利用したプロモ−タ検出用プラスミドベクタ−及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS591500A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102660394B1 (ko) * | 2019-03-11 | 2024-04-24 | 에이치엘만도 주식회사 | 전동 파워스티어링 시스템의 오버레이 제어 장치 및 그 방법 |
-
1982
- 1982-06-28 JP JP57110999A patent/JPS591500A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6237958B2 (ja) | 1987-08-14 |
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