JPS5853747B2 - 基質濃度の測定方法および酵素電極系 - Google Patents

基質濃度の測定方法および酵素電極系

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JPS5853747B2
JPS5853747B2 JP52118253A JP11825377A JPS5853747B2 JP S5853747 B2 JPS5853747 B2 JP S5853747B2 JP 52118253 A JP52118253 A JP 52118253A JP 11825377 A JP11825377 A JP 11825377A JP S5853747 B2 JPS5853747 B2 JP S5853747B2
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研一 中村
史朗 南海
孝志 飯島
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Matsushita Electric Industrial Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酸化還元酵素を用いた従来の酵素電極では実
現不可能であった基質の濃度を測定する方法及びこの基
質の濃度測定に用いる新規な酵素電極系に関する。
従来、酸化還元酵素と補酵素とレドックス化合物を集電
体と組み合せた酵素電極系においては、いずれも酵素基
質として還元型物質を用い、それらがまず酸化還元酵素
で酸化されることを常としていた。
すなわち、第1図に示すよ−うに、還元型基質AH2が
酵素の作用で脱水素され、ついで補酵素及びレドックス
化合物からなる電子伝達共役系を通して移行し、最終的
には集電体上でレドックス化合物BH2の酸化反応が起
こる。
そこで、このアノード電流を測定することにより基質濃
度を求めたり、適当な対極、例えば酸素極と組み合わせ
ていわゆる酵素電池を構成することが試みられている。
例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下
NADで示す)を補酵素とする酸化還元酵素のアルコニ
ル脱水素酵素、乳酸脱水素酵素を用いたエタノール、乳
酸のセンサーについての報告がある( Bulleti
n of the ChemicalSociety
of Jaoanz 48 (11) 、 3246
1975年)。
ここで還元型基質であるエタノール及び乳酸は、それぞ
れ相当する脱水素酵素で脱水素(酸化)され、酸化型基
質であるアセトアルデヒド及びピルビン酸になる。
同時に補酵素NAD(酸化型)は還元されてNADHに
なり、この還元型補酵素はレドックス化合物(酸化型)
によって酸化される。
そして最終的に還元されたレドックス化合物が集電体上
で酸化され、元の還元型に戻る。
このようにして酵素反応に基づく酸化反応が集電体上に
おける酸化(アノード)反応と結びつけられ、基質の濃
度が集電体に流れる電流の大小によって測定できること
になる。
前記の報告では、レドックス化合物としてフラビンモノ
ヌクレオチド、フェナジンメトサルフェート、メチルビ
オロゲンなどを用いており、このうち前2者は電子伝達
の効果があり、アノード電流が得られているが、メチル
ビオロゲンについては全くアノード電流が得られておら
ず、メチルビオロゲンは電子伝達体としての役割を果た
していないことになる。
この理由は、補酵素及びレドックス化合物の酸化還元電
位を比較してみると説明がつく。
次表にpH7における酸化還元電位の比較を示す。
物 質 名 酸化還元電位Eo’NAD
−0,320Vフラビンモノヌクレオ
チド −〇、219Vフェナジンメトサルフェート
+o、osovメチルビオロゲン −〇、4
46V一般に、酸化還元電位Eo’が責な物質はど、そ
れが卑な物質を酸化する能力が大きいことはよく知られ
ていることであるが、表でみると、フラビンモノヌクレ
オチド、フェナジンメトサルフェートともにEo’がN
ADより貴であり、メチルビオロゲンはNADより卑で
ある。
以上のことからメチルビオロゲン(酸化型)はNADの
還元型を酸化する能力は小さく、前記文献でアノード電
流が得られないのはこのためであると考えられる。
しかし、このことは逆にメチルビオロゲン(還元型)は
NADの酸化型を還元する能力を有していることになる
本発明者らは、この点に着目し、特に基質として酸化型
基質を用い、さらにレドックス化合物として補酵素の酸
化還元電位より卑なる電位を有する物質を選択すること
により、第1図に示したものと逆方向の反応が容易に起
こることを見出し、還元型基質のみに作用する従来の酵
素電極に対し酸化型基質に作用する新しいタイプの酵素
電極系を開発することに成功した。
以下本発明をその実施例により説明する。
実施例 1 第2図に酸化型基質濃度の測定系を示す。
図において、1は酵素電極系(以下単に酵素電極という
)で、酵素、補酵素及びレドックス化合物を溶解させた
緩衝液2に集電体としての銀板3が浸漬されており、濃
度を測定しようとする基質は緩衝液2に溶解される。
4は対極で、緩衝液5中に白金集電体6が浸漬されてい
る。
7は飽和カロメル参照電極SCEで、塩橋8をとおして
酵素電極とつながっている。
9はセパレータである。まず、メチルビオロゲン(酸化
型)を、銀集電体3をひたしたpH7,0のリン酸緩衝
液2に溶解し、SCEに対し一〇、5Vの電位で還元型
にし、さらに補酵素NADH(還元型)及びアルコール
脱水素酵素を液2に溶解させる。
集電体3でのカソード電流が定常値に達したところで酸
化型基質としてアセトアルデヒドを液2に加えると、カ
ソード電流の増加が認められる。
アセトアルデヒドのI X 10−’モル/11の濃度
増加に対し、カソード電流が増加し、約2分で定常値に
達し、電流増加量は約30μAであった。
アセトアルデヒドの各種濃度に対しカソード電流増加分
をプロットすると第3図のようになり、アセトアルデヒ
ド濃度0.5X10”−’〜5X10−’モル/lの範
囲で、濃度と電流増加分との間に直線関係が認められる
このように酵素電極1はアセトアルデヒドのセンサーと
して用いることができる。
実施例 2 この例では、酵素、補酵素及びレドックス化合物を、実
施例1のように緩衝液中に溶解するのではなく、集電体
近傍に固定した酵素電極を用いる。
この電極の構造を第4図に示す。
図において、10は円柱状の合成樹脂製電極支持体であ
り、その下端に設けた凹部11の底面に銀集電体12を
取り付けている。
13は支持体10の下端から側面にわたって被覆した半
透膜であり、集電体12と半透膜13との間に形成され
る空間部には酵素、補酵素及びレドックス化合物が固定
される。
14は膜固定用リング、15はリード線である。
集電体12と半透膜13との間の空間部に、乳酸脱水素
酵素、アガロース上に固定したNAD、下記の構造式を
有するN 、 N’−ビス(γ−アミノプロピル)−4
,4’−ジピリジニウムフロマイドとシアヌリルクロラ
イドの縮合型ポリビオロゲンをp)17.0の緩衝液に
溶解させた溶液を存在させこのように作製した酵素・補
酵素、レドックス化合物固定化電極は、実施例1と同様
の測定系を用いてピルビン酸のセンサーとして使うこと
ができる。
I X 10−’モル/lのピルビン酸濃度の増加に対
し、カソード電流が増加し約3分で定常値に達し、電流
増加量は10μAであった。
ピルビン酸のlXl0 ’〜lXl0”−3モル/l
の濃度範囲で、濃度と電流増加分との間に直線関係がみ
とめられ、このような酵素電極はピルビン酸センサーと
して用いることができる。
レドックス化合物としては上記実施例以外にも骨フ 昔下記の表に示すような各種ビオロゲン誘導体を用いる
ことが可能である。
物 質 名 酸化還元電位Eo’(pH7)エチ
ルビオロゲン −0,449Vベタインビオロ
ゲン −〇、444Vベンジルビオロゲン
−〇、 363 Vさらに、ポリビオロゲンとして下
記の構造を有する各種ポリビオロゲンを用いることもで
きる。
N 、 N’−ビス(γ−アミノプロピル)−4,4’
−ジピリジニウムブロマイドとイソフタロイルクロライ
ドとの縮合ポリマー N 、 N’−ビス(γ−アミノプロピル)−4,4’
−ジピリジニウムブロマイドとピロメリチルクロ**ラ
イ ドとの縮合ポリマー N 、 N’−ビス(γ−n−プロピルアミノプロピ
30※メリチルクロライドとの結合ポリマール)−4,
4’−ジピリジニウムブロマイドとピロ※レドックス化
合物としては、上記各種ビオロゲン誘導体以外にも2−
アミノアクリジン(Eo’=−0,468V)、、 1
−アミノアクリジン(Eo’=−0,394V)などを
用いることができる。
さらにキノリン誘導体である1−エチルキナルジニウム
アイオダイド(E o′=−0,5V ) 、 1−エ
チルキノリニウムアイオダイド(E o’=−0,5■
)、ピリジン誘導体である1−エチルピリジニウムブロ
マイド(EO’=−0,6V)、1−セチルピリジニウ
ムクロライド(B o’=−0,6V )なども用いる
ことができる。
また補酵素としてはイソクエン酸脱水素酵素、グルタミ
ン酸脱水素酵素の補酵素であるニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸(Eo′=0.324V)があり
、前記のレドックス化合物はいずれもこれと組み合わせ
て用いることが可能である。
酵素電極の集電体としては、集電体上でレドックス化合
物のカソード反応が起こる時に水素の発生反応が起こら
ないことが望ましく、このためには水素過電圧ができる
だけ犬なるものが適する。
また一方では液中に溶解しにくいものが望ましい。
このような点からSn * Ni tAg t Zn
、Au。
C、S n 02 などを集電体として用いることがで
きる。
ptはしばしば酵素電極の集電体として用いられるが、
水素過電圧が小さく、本発明に用いる集電体としてはあ
まり適当なものではない。
実施例かられかるように、酵素、補酵素、レドックス化
合物は集電体を浸漬した緩衝液中に存在してさえすれば
、それらが溶解状態で存在していようとまた固定化され
た状態で存在していようと酵素電極は全体としてその機
能をなし得るのである。
しかし、酵素、補酵素、レドックス化合物は緩衝液中に
溶解させて用いるよりは、実施例2のごとく固定化した
方が再使用がきき、より実用には適する。
さらに酵素、補酵素、レドックス化合物は半透膜で集電
体近傍に保持固定化するのみでなく、粉末状集電体と混
合一体化してゲル状とし、その外側を半透膜でおおって
固定することも可能である。
本発明の酵素電極を用いることにより、酸化還元酵素の
酸化型基質の濃度を測定することが新しく可能となる。
酸化型基質の濃度を酵素電極を用いて測定することは従
来全く行なわれておらず、本発明の酵素電極はセンサー
としての測定物質領域をより広げるものである。
さらに本発明の酵素電極は、物質合成用として用いるこ
とも可能であり、ピルビン酸からの乳酸の合成、アセト
アルデヒドからのエタノール合成など各種物質合成に用
いることが可能である。
【図面の簡単な説明】
第1図は従来の酵素電極における反応模式図、第2図は
本発明の酵素電極を用いた基質濃度測定系の構成図、第
3図はアセトアルデヒド濃度と酵素電極のカソード電流
増加分との関係を示す図。 第4図は酵素電極の構成例を示す縦断面図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 酸化還元酵素、前記酸化還元酵素と共役する補酵素
    、この補酵素と共役しかつ酸化還元電位が補酵素のそれ
    より卑なるレドックス化合物、集電体及び基質を含む系
    において、前記集電体上での前記レドックス化合物のカ
    ソード反応電流を測定することにより前記基質の濃度を
    測定することを特徴とする基質濃度の測定方法。 2 酸化還元酵素、これと共役する補酵素、この補酵素
    と共役しかつ酸化還元電位が補酵素のそれより卑なるレ
    ドックス化合物及び集電体よりなり、集電体を浸漬した
    緩衝液中に前記酸化還元酵素、補酵素及びレドックス化
    合物が存在していることを特徴とする酵素電極系。 3 レドックス化合物がビオロゲン誘導体である特許請
    求の範囲第2項記載の酵素電極系。 4 レドックス化合物がアクリジン誘導体である特許請
    求の範囲第2項記載の酵素電極系。 5 レドックス化合物が、キノリン誘導体である特許請
    求の範囲第2項記載の酵素電極系。 6 レドックス化合物が、ピリジン誘導体である特許請
    求の範囲第2項記載の酵素電極系。
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