JPS585040B2 - α−アミラ−ゼ基質及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、表面的に架橋することにより膨潤性を調整し
、減少させたデンプンもしくはアミロース粒子からなり
、この粒子は直径０．０１〜０．２０１ｍである、α−
アミラーゼの測定のために測定可能な基で誘導体化され
た粒子状デンプンを基礎とする基質及びその製造法に関
する。

血清中のα−アミラーゼ濃度の測定は膵臓機能の重要な
臨床的パラメーターである。

α−アミラーゼがデンプン及びデンプン誘導体の１，４
−グリコシド結合を分解することは公知である。

この場合、攻撃は鎖末端から行なわれるだけでなく、架
橋したデンプン分子の鎖中央でも始まる。

これにより不溶性デンプンは分解されて可溶性デンプン
片になり、非分枝の鎖は、最終的に、マルトースになる
。

この分解が行なわれる速度は、存在し、作用するアミラ
ーゼ量の尺度である。

着色不溶性デンプンを使用すると、着色可溶性断片が生
じるから、生じた溶液の着色から分解の度合いを導き出
すことができる（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ第２３巻、１
９６７年、８０５頁）。

ここでは、色素として、セルロース繊維の着色にも使用
されるような活性色素が提案される。

ところで、デンプンは完全に不溶性ではなく、従って、
処理（例えば着色）しにくいので、西ドイツ国特許出願
公開第１９０１５１７号公報では、可溶性デンプンの架
橋（例えば、エピクロルヒドリンで）により完全に不溶
性ゲルを製造し、次いでこれを粉砕し、着色するという
ことが提案されていた。

結局、このアミラーゼ測定系の正確さは、反応の終了（
停止）後も過剰基質が存在する程、すなわち、反応の間
、酵素が常に最適に分解することができる程度の大過剰
の基質が提供されるということに依り決まる。

更に、このことは、比較測定のために同様な基質量だけ
でなく、この基質の比較可能な程度の表面積、同じく、
比較可能で、均質な架橋状物質を提供しなければならな
いということを意味する。

西ドイツ国特許出願公開第１９０１５１７号公報による
基質の場合、アミラーゼは、確かに、重量単位当り比較
可能な表面積（ゲルを粉砕し、篩により同様な大きさの
断片とすることにより）を提供するが、それに反し、常
に同一な架橋度を再現することはできない、それという
のは、１つには、自体すでに単一でないデンプンの分解
の際には、平均して、配合物毎に異なった長さの可溶性
デンプン断片が生じるからであり、もう１つには、引き
続く架橋の際、いわゆるトロムスドルフ（Ｔｒｏｍｍｓ
ｄｏｒｆ）効果により不均一な架橋生成物が予期される
からである。

トロムスドルフ効果とは、自体加速性の、エントロピー
損失により発熱的に経過する架橋反応であり、この架橋
反応は制御するのが非常に困難である。

これらの理由により、前記のように製造された基質はチ
ャージ毎に異なる。

上昇する酵素濃度での吸光の直線性にも問題が生じる（
ＣＩｉｎ、Ｃｈｉｍ。

Ａｃｔａ第４７巻、１９７３年、２３３頁）。

従って、１包装毎に較正曲線をつくらなければならず、
このことは付加的な経費を意味する。

従って、本発明の課題は、これら公知のデンプンを基礎
とするα−アミラーゼの架橋した基質の欠点を除去し、
チャージ内でもチャージ毎にも、著しく均質であり、よ
り良好な吸光の直線性を与え、新しい較正曲線の製作す
る必要のない基質を製造することである。

この課題は本発明により、α−アミラーゼの測定のため
に、測定可能な基で誘導体化された粒子状デンプンを基
礎とする基質により解決し、この基質は調整され、減少
した膨潤性を有する表面的に架橋したデンプンもしくは
アミロース粒子からなり、かつ、この粒子が直径０．０
１〜０．２０ｍｍであることを特徴とする。

すでに、エーテル形成剤により非ゲル化アンプンを架橋
することは、米国特許第２５００９５０号明細書により
公知である。

ここに記載された生成物は食物として、並びに、織物仕
上の分野で使用可能である。

更に、西ドイツ国特許出願公告第１６６８５１５号明細
書に、架橋により膨潤性が抑制されたこの種のデンプン
粒子をβ−アミラーゼ、α−１，４−グルコシダーゼ又
はホスホリラーゼで分解し、カン詰保存する食料の成分
として、これに改良された低温安定性を与えるデンプン
分解生成物を得ることも公知である。

前記直径の表面的に架橋され誘導体化されたデンプン又
はアミロース粒子がα−アミロースにより、特に均一に
攻撃され、従って、分析用に適しているという、どんな
示唆もこれから得ることはできない。

意想外にも、自体不均質なデンプンが架橋後に膨潤によ
り、著しく一様に分解され、従ってα−アミラーゼのた
めの基質として優れた適性を有する基質を生じる。

自体すでに架橋されたアミロペクチン被膜がデンプン粒
子の外側で以下に記載する方法により強化され、こうし
て通常の膨潤が妨げら札これによりある一定の内圧下に
ある基質をα−アミラーゼに提供すると思われる。

本発明の有利な実施形によれば、基質は膨潤していない
デンプン粒子１００ｇ当り２官能性架橋剤０．０００９
〜０．００２７モルで架橋されているデンプン粒子より
成る。

この際、直径０．０１〜０．１ｍｍの間の膨潤していな
い粒子が特に、有利である。

もう一つの有利な実施形によれば、基質は膨潤していな
いアミロース粒子１００ｇ当り２官能性架橋剤０．０２
〜０．０７モルで架橋されているアミロース粒子からな
る。

このためには、直径が０．０５〜０．２０ｍｍであるア
ミロース粒子が、特に好適であるということが判明した
。

膨潤したデンプンを水性媒体中で２官能性架橋剤で架橋
することにより、調整され、減少された膨潤性を有する
粒子形のデンプンもしくはアミロースを製造する本発明
方法は、膨潤していない直径０．０１〜０．２０ｍｍの
デンプン又はアミロース粒子から出発し、これを表面的
架橋にのみ十分な含有量の架橋剤を有する溶液中で、架
橋剤が使い尽くされるまで懸濁させ、その後、自体公知
法で、この粒子を測定可能な基で誘導体化することより
なる。

好適な２官能性架橋剤は、例えば、脂肪族ハロゲン化物
、例えば、プロピレンジクロリド、ジクロルペンタン、
エチレンジプロミド、グリセリンジクロルヒドリン、ジ
クロルブタン、エーテル形成性エポキシハロゲン化合物
、例えば、エピクロルヒドリン及びエピブロムヒドリン
、シアヌルクロリド、オキシ塩化燐、メタホスフェート
及びポリメタホスフェート、アルデヒド、例えばホルム
アルデヒド、グルタルジアルデヒド、アクロレイン、無
水琥珀酸及び類似のものである。

すでに前記のように、本方法をデンプン粒子に利用する
際、膨潤していないデンプン粒子１００ｇ当り架橋剤０
．０００９〜０．００２７モルを使用し、この場合、こ
の粒子の直径は０．０１〜０．１ｍｍの間であるのが最
も有利である。

それに対して、アミロース粒子の場合は、膨潤していな
いアミロース粒子１００ｇ当り架橋剤０．０２〜０．０
７モルで最高の結果が得られ、この際膨潤していない粒
子の直径は、０．０５〜０．２０ｍｍであるのが最もよ
い。

この差は、デンプン粒子の場合、天然アミロペクチン被
膜は自体すでに架橋しており、従って、所望の抑制した
膨潤性の達成のために、比較的価かな架橋剤が必要であ
ることに基づく。

少なすぎる架橋剤の場合、膨潤性は太きすぎ、架橋剤の
量が高すぎる場合、粒子は安定となりすぎ、α−アミラ
ーゼにより攻撃可能な遊離アミロース鎖でに十分に存在
しなくなる。

それに反し、アミロースは、はじめから架橋していない
ので、本発明による基質を製造するために１０倍以上の
架橋剤量を使用する。

デンプンの場合、本発明により膨潤が制御されるが、冷
水中に不溶性の、結晶性アミロース粒子の場合は、架橋
によりはじめて、膨潤性の生成物が得られる。

工業用アミロースでは、しばしば、なおある程度のアミ
ロペクチンを含有しているので、アミロペクチン含有量
を測定し、これから、必要な架橋剤量をひきだすのが有
利である。

基質を誘導体化する、測定可能な基としては、先ず、色
素又は色素形成基、すなわち、あとになってはじめて、
もう一つの成分と反応して色素となるようなものがこれ
に該当する。

この色素は可視光で又は可視でない波長で吸収してもよ
い。

螢光色素も好適である。

更に、放射性又は酵素的測定可能な基を導入することも
できる。

１−クロールー３−（アニリン−２−スルホン酸）−５
−（アニリン−２−スルホン酸）−４−ジアミノアント
ラキノン−スルホン酸−トリアジン〔シバクロンブルー
３ＧＡ）は特に好適であることが判明した。

更に、全ての１−クロル−トリアジニル色素及び１，３
−ジクロル−トリアジニル色素を使用することもできる
。

ジアゾ系を有する色素は、多糖類との相互作用、並びに
、その疎水性に基づき不適当であることが判明した。

前記の有利な色素の他にも、他の化学的に類似の構成の
色素も同様に良好に使用可能であることは判明したが、
しかしながら、これらは実際上は添加物として多量のナ
フタリンスルホン酸を含有しており、このナフタリンス
ルホン酸は非常に僅かな量ですでにα−アミラーゼを阻
害する。

化学構造から基質の誘導体化に好適である他の測定可能
な基に関しても、これらがα−アミラーゼ自体を阻害し
ないということは重要であり、又このことは、すべての
場合に容易に簡単な予試験により確認することができる
。

誘導体化自体は専門家に公知の方法で行なわれ、例えば
、木綿染色工場で通常行なわれており、ここでは詳細に
記載する必要はない。

本発明によるα−アミラーゼ測定用基質を、約５ｍｇ／
ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌの量で使用するのは有利である
。

約２０〜約５０ｍｇ／ｍｌの量は、特に、有利である、
というのはこの際、すべての条件下に、すなわち、病的
な血清の場合にも十分大きい基質過剰が存在するからで
ある。

添付図面において、本発明による試薬を、着色したデン
プンを基礎とする市販アミラーゼ基質２種と、同様な基
質量でかつその他は同一の条件で単位時間当りの生じる
吸光度に関して比較する。

曲線１は本発明によるデンプンを基礎とする基質を同定
し、曲線２は本発明によるアミラーゼを基礎とする基質
を同定し、曲線３は可溶性デンプンを架橋し、引き続き
着色して製造した市販の基質を同定し、曲線４は、原則
的には曲線３の基質と同様にして製造した、他の起源の
市販の基質を同定している。

基質はすべてシバクロンブルー３ＧＡで着色した。

図中に示した曲線は、それぞれ１０％−基質懸濁液５．
０ｍｌをα−アミラーゼ基準１００μｌと共に３０℃で
恒温保持して得られた。

一定の時間に０．５Ｎ ＮａＯＨ１０ｍ１を添加し、濾
過し、吸光度Ｅ５７８をｎ＝２で空気に対し測定した。

図が示すように、本発明の基質においては、比較基質が
示すのと、はぼ同じ空試験値の場合のほとんど２倍の高
さの吸光度が得られる。

次に実施例につき本発明を詳述する。

例１ ジャガイモデンプンからのα−アミラーゼ基質の製法 水６１中にＮａＯＨ１６ｇを攪拌下に導入し、次いで、
デンプン（平均粒子径０．０１〜０，１ｍｍ篩過）１０
００ｇを添加攪拌し、徐々にエピクロルヒドリン２ｍｌ
を満願する。

配合物を室温で１５時間撹拌し、その後２ＮＨＣ１でｐ
Ｈ７〜８としく２ＮＨＣ１約２００ｍ１）、約１時間放
置する。

この際、架橋デンプンは沈澱するから、僅かに濁った上
澄液を傾瀉除去する。

残分２〜３１をメタノール約５倍量中に強力な撹拌下に
導入する。

この懸濁液をあと１時間、後撹拌し、次いで沈澱を吸引
濾過し、室温で真空乾燥させる。

収量：０．８〜１Ｋｇ 着色は次のように実施する：硫酸ナトリウム（無水）６
Ｋｇを撹拌加温下に水３０１中に溶かし、次いで、９８
℃まで加熱し、架橋デンプン１Ｋｇを少量ずつ添加する
。

次いで、色素０．４Ｋｇ（シバクロンブルー３ＧＡ０．
４Ｋｇ）を添加し、その後、この溶液をこの温度で１０
分間保持する。

これに燐酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ０，９２Ｋｇを添加
し、その後、この溶液をもう１度９５〜９８℃で１５分
間撹拌する。

その後、冷却させ、沈澱させる。配合物を濾別又は遠心
分離し、濾液が無色となるまで洗浄する。

膨潤含水生成物をメタノール５倍容量中に強力な攪拌下
に導入する。

生じた懸濁液をあと１時間後撹拌し、引き続き濾別する
。

次いでアセトンで後洗浄し、室温で真空乾燥させる。

収量二着色架橋デンプン１．０〜１．１Ｋｇシバクロン
ブルー３ＧＡのかわりに１−クロル−トリアジニル色素
を使用し、前記と同様に操作することにより、相応する
着色架橋デンプンが得られる。

例２ アミロースを基礎とするα−アミラーゼ基質の製造 例１に記載したと同様にして実施するが、デンプンの代
わりに平均粒子径０．０５〜０．２０ｍｍ（篩過）のア
ミロース１０００ｇとエピクロルヒドリン２５属を使用
する。

例３ α−アミラーゼ測定の実施 試 薬： 濃度 基質の懸濁液 燐酸ナトリウム緩衝剤２０ｍ
Ｍｏｌ 中に ２０ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣ１ ＮａＣｌ３０含有、 ｐＨ７，０ 水酸化ナトリウム溶液 ０．５ Ｎ 測定条件： 恒温保持温度 ３０℃ 恒温保持時間 １５分間 測定波長 ５７８ｎｍ（５５０〜６５ｎ
ｍ）層の厚さ １ｃｍ 試薬空試験値：検体のかわりに蒸留水を使用反応容器中
にピペットで測定し入れる： 懸濁液（３０℃） ５．０ｍｌ 検体 ０．１ｍｌ 混合し、３０℃で正確に１５分間恒温保持する。

反応は、 ０．５Ｎ ＮａＯＨ１，０ｍｌ添加により中止し、襞付
濾紙により濾過（場合により、遠心分離及び注意深い傾
瀉）。

上澄液の吸光を試薬空試験値（ＲＬＷ）に対し測定。

色−又は酵素−標準溶液により評価。

【図面の簡単な説明】

添付図面は本発明による試薬を、デンプンを基礎とする
市販アミラーゼ基質と、同一条件下で単位時間当りに生
ずる吸光度に関して比較したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ α−アミラーゼの測定のために測定可能な基で誘導
   体化された粒子状デンプンを基礎とし、表面的に加橋す
   ることにより膨潤性を調整及び減少させた直径０．０１
   〜０．２０ｍｍのデンプンもしくはアミロース粒子から
   なることを特徴とするα−アミラーゼ基質。 ２ 膨潤されていないデンプン粒子１００ｇ当り２官能
   性架橋剤０．０００９〜０．００２７モルで架橋されて
   いるデンプン粒子からなる、特許請求の範囲第１項記載
   の基質。 ３ 粒子は０．０１〜０．１０の間の直径を有する特許
   請求の範囲第２項記載の基質。 ４ 膨潤していないアミロース粒子１００ｇ当り２官能
   性架橋剤０．０２〜０．０７モルで架橋されているアミ
   ロース粒子からなる、特許請求の範囲第１項記載の基質
   。 ５ アミロース粒子が０．０５〜０．２０ｍｍの間の直
   径を有する、特許請求の範囲第４項記載の基質。 ６ 測定可能な基としての、ジアゾ色素系を有しない活
   性色素で誘導体化されている、特許請求の範囲第１項〜
   第５項のいずれかに記載の基質。 ７ 膨潤したデンプンを水性媒体中で２官能性架橋剤で
   架橋することにより、調整し、減少した膨潤性を有する
   粒子形のデンプンもしくはアミロースからなるα−アミ
   ラーゼ基質を製造する場合に、膨潤していない直径０．
   ０１〜０．２０ｍｍのデンプン又はアミロース粒子から
   出発し、これを表面的架橋にのみ十分な含有量の架橋剤
   を有する溶液中に架橋剤が使い尽くされるまで懸濁させ
   、その後、自体公知法で、この粒子を測定可能な基で誘
   導体化することを特徴とする、α−アミラーゼ基質の製
   造法。 ８ 膨潤していないデンプン粒子１００ｇ当り架橋剤０
   ．０００９〜０．００２７モルを特徴とる特許請求の範
   囲第７項記載の方法。 ９ 直径０．０１〜０．１ｍｍの間の膨潤していないデ
   ンプン粒子を特徴とる特許請求の範囲第７項又は第８項
   記載の方法。 １０ 膨潤していないアミロース粒子１００ｇ当り架橋
   剤０．０２〜０．０７モルを特徴とる特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。 １１ 直径０．０５〜０．２０ｍｍの間のアミロース粒
   子を特徴とる特許請求の範囲第７項又は第１０項記載の
   方法。 １２ 架橋剤としてエピクロルヒドリンを特徴とる特許
   請求の範囲第７項〜第１１項のいずれかに記載の方法。 １３ 粒子を１−クロル−３−（アニリン−２−スルホ
   ン酸）−５−（アニリン−２−スルホン酸−４−ジアミ
   ノアントラキノン−スルホン酸）−トリアジンで誘導体
   化する、特許請求の範囲第７項〜第１２項のいずれかに
   記載の方法。