JPS58501009A - ゼロ標準血清の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　ゼロ標準血清の製造方法 技術分野 本発明は免疫学的検定技術に有用なゼロ標準血清の製造方法に閤する。

背景技術 放射性配位子ホルモン検定は世界中の病院の実験室において常套手段となってい る。この試験の感度への鍵は、対照例の目盛決定物質（カリプレーター）及び標 準、又場合により檜釈剤として使用されるホルモンの無い血清の利用可能性にあ る。

放射性免疫学的検定（ラジオイムノアッセイ）或いは免疫学的放射分析検定或い は酵素標識免疫学的検定において使用される標準曲線のゼロ点を得るためにはチ ロキシンを含有しない標準制御血清が必要である。

更に、甲状腺機能先進性血清の正確な読みを得るためにはゼロ標準対照血清の使 用も又必要である。この様にゼロ標準対照血清が利用可能である場合には、甲秋 味機能九道性血清を既知の因数でゼロ標準対照血清で稲沢することができる。Ｔ ４試練を次いで上紀緒方法により行い、標準曲線から得られる値と比較する。こ れらの曲線から読みが得られた後、檜釈因数を読みに適用する。正確な因数は、 ゼロ標準が極めて低い水準のホルモンを有する場合にのみ得られる。

例えば、米国脣許第３，７７６．６９８号明細書では、一定量の酸性化血清を周 期律表のＩＡ族、ＩＡ族、■Ａ族、ＩＢ族及び１族の金鵬元素のリン酸塩、酸化 物、水酸化物、ケイ酸塩、炭酸塩、アルミン酸塩及び４ｍ酸塩よりなる群から選 ばれる粒状無機結晶性吸収材と接触させることによりゼロ標準血清を調製してい る。

ホルモンの無い血清のｓｍ方法として次の二つの代替法も又現在使用されている ：１）ＴＳＨの無い血清は置換チロキクン治療が行われている下垂体機能低下症 の患者の血清のプールの蓄積管により作ることができる、或いは２）血清は健康 な人々からの遊離縦索−吸着血清の要時間の高速１１＋遠心分離により作ること ができる。

遊離炭素の使用は、しかしながら、多量の血清が加工される場合には時間及び鉄 置面において１屠を伴うものである。

血清から有効に甲状腺ホルモン（例えば、ＴＪ戚いＦｉＴ４　）を除去すること が可能なためには、処理炭素中に増大した表面積を与えることが必要である。市 販の炭素は、通常、炭素をスチームで約１０００℃近辺の温度において活性化す ることにより作られる。この活性化は、おそらく、炭素の自然に積層した構造間 に捕えられているタール類及び挿入物質を除去するものであり、それにより、中 間層領域への接近を可能にするものである。得られる表面積の増加は、しかしな がら、最終生成物の構造的硬質性を犠牲にするものである。

高速遠心分離において炭素と血清とを混合する際に課される機械的な力は、練い 活性化縦索構造を断片化するのに十分である。上澄血清は、通常、黒色の出現と して見ることのできる炭素断片を含有する。血清からの小さな炭素断片の除去に は、収集剤として作用する技術等級のカオリンの添加が必要とされ、次いで爽に 混合及び遠心分離が必要とされる。場合によっては、完全な除去のためには、コ ロイド状凝集さえも十分ではなく、ミクロン径の膜を通しての１過が必要とされ る。

大きな炭素顆粒（約４００ミクロン直径の範囲を有する）は甲状腺ホルモン除去 の貧弱な効率を示すのに対し、パッチにおいて使用されるより小さな粉末化炭素 顆粒はよシ効率がよいにも拘らず、分離操作における遅さ及び余分の工程の点か ら不便である。

炭素粒子床に人工的に圧力差を与えることによりホルモン除去の効率ｔ−増加さ せる試みには各種問題が含まれている。炭素粒子の構造的４１ｋｉ１［性は、昧 された圧力に耐えるに不十分であり、積層配列の破談と興に粒子の崩壊も生じ得 る。又、炭素粒子床を造ってチャンネリングが迅速に生じ、その後除去効率の迅 速な低下が生じる。

米国特許第３，１４９，０２３号明細書に記載されている如く、炭素粒子が、シ ート上に均一に分散され、瓢固に保持され、且つ実質的に擦り落ち、剥れ落ち及 びよごされることなく担持されている。しかしながら、この米国特許のシートは 、タバコのフィルター、空気フィルター、ガスフィルター、果物及び雰囲気中の ガスにより変色或いは腐敗しがちな脂質のための包装紙、衛生ナプキン用の積場 シート製品中の脱臭層及び傷用の外科包帯など”として使用されている。それら 社、血清からの甲状腺ホールモンの除去においては使用されていない。

米国特許第３．１４９，０２３号明細書の材料は、増加圧力用途に有用であると さえも期待されておらず、又最も重要なことに、最終製品の一体性及び組成が重 要である血清のような生物学的材料の処理における増加圧力適用において有用で あると説明されてもいない。

ゼロ標準血清の一製に尚り、最終生成豐はホルモン以外の必要な天然血清成分社 会て含有すべきである。

可能な限り蛋白質、炭水化物、脂質、ビタミン及び塩類などは処理前と実質的に 同一水準で残存すべきである。前記米国特許第３．１４９．０２３号明細書には 、その炭素充填シートが人の血清のような微妙な生物学的材料の処理に使用する ことができること、処理が高圧において行われ得ること及びそれらの処理の結果 ホルモンの選択的除去が行えることについて社何等の開示もなされていない。

要するに、ヒトの血清からホルモンを除去してゼロ標準血清を調製する方法であ って、その方法が迅速、安価及び操作が開本であり、１１ｉｌｌ製するのに簡単 な材料を用い、且つ最終標準製品に対して非破壊的であり非変性的であるといっ た方法は従来技術により禾だ記載されていない。

従って、その様な方法のｍ喪が依然として存在し、本発明はその様な１１！喪を 満たすものである。

発明の開示 従って、本発明の目的はヒトのゼロ標準血清の製造方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的線ホルモン、例えば、甲状腺ホルモンをヒトの血清から 除去する方法を提供することである。

又、本発明のもう一つの目的は炭素処理にょクヒトの血清からホルモンを除去す る方法を提供することである。

更に本発明のもう一つの目的は、！ｌ！質的に検出不可能な量のホルモンを含有 するヒトの血清を提供することである。

これら及び以下の説明においてより容易に明らかとなるその他の目的紘下記の方 法を提供することによシ達成され喪： ヒトの血清から甲状腺或い唸ステロイｒホルモｙを除去する方法において、腋血 清ｔｌｐａｉ（約０．０７ｋｇ／ａｍ　）より大きな圧力差において、自己結合 性繊維のマトリックス中に炭素粒子を内部分散してなシ、骸炭素粒子の９０−を 越える粒子が約５０ミクロン未満の平均直径を有する複合シートと接触させるこ とを特徴とする方法。

本発明の請合的は又約０．５β１７ｄｉ　未満のヒト甲状腺或いはステロイドホ ルモンを有するヒト血清を提供することによシ達成された。

ｌｉ１面の簡単な説明 本発明のより完全な評価〈及びそれに伴う多くの利点は、本発明が付属の図面に 関連して考慮される以下の詳ａｔ説明によりよりよく理解されるにつれて容易に 得られるであろう： 付属の図面中、第１図は、円筒状−２ム中に順次積層した複合シートによるヒト 血清処理の概略説明図である： 籐２図は、本発明の複合炭素充填７−ト及び比較例として遊離炭素粒子床を生理 学的（７，０〜７．５）ｐＨにおいて用いた場合の吸着時間の全ヒト血清からの Ｔ３の除去に及ばず影響を示すグラフである：第３図は、本発明の炭素充填複合 シート及び比較例として遊離炭素粒子床を生理学的（７，０〜７．５）　ｐＨに おいて使用する場合のヒト血清の循環のヒト血清からの除去に及ぼす影響を示す グラフである：第４図は、本発明の炭素充填複合シートの充填された或いは比較 例として遊離炭素粉末床が充填された９ｍｍ直径の円筒状カラムを生理学的（７ ，０〜７．５）　ｐｉｔにおいて使用する場合の圧力蓄積の影響を示すグラフで ある。

発明を実施するための最良態様 本発明は、ホルモン類、例えば甲状腺ホルモン、が、全ヒト血清を、各々自己− 結合性繊維のマトリックス中に高度に精製された縦素粒子を内部分散してなる１ 以上の複合シートと接触させることにより迅速且つ選択的にＳ製されることが可 能である、という発見に基づいている。この複合シートを用いてホルモンを除去 することは、炭素粒子単独をスラリー状或いは床に充填して使用することよりも はるかにより効率的である。

炭素粒子を均一にマトリックス中に分散させるととにより、血清を粒子と接触さ せる際に圧力差を利用して炭素構造を損傷することなく処理方法の速度を増加さ せることが可能となる。

炭素粒子の機械的硬質性は、粒子が複合体マ）　ＩＪラックス造体中に保持され ているので、本発明の圧力差により害されない。接触後ｖｃ２Ｉｉｊられる血清 試料は炭素断片を全く含有しない。

圧力差の使用は又、処理方法の時間における実質的減少を可能くする。

更に、床内に充填された炭素で処理される液体は、最小の抵抗で通過しようとす る一般的喚向を有し、それにより最も有効な吸着表面を避ける傾向を有する。

本発明はマトリックス中の炭素の固定位置により、充填粒子カラム内で通常生ず るチャンネリング影響の問題を回避する。

炭素充填マトリックスを用いるカラム法は、拡散限定要因を味去し、それを速ｒ ｔ編的機構で１挾えるので、その＆着速区は床形態の遊離粉末にお轄るそれより も数倍扁いものである。

マトリックス−結合炭素粒子の使用は又炭素中の利用可能な活性部位をそれらの 最大の舵力まで利用するために必要なだけ多くの回数血清を循環させる能力全付 与させる利点を有するが、しかし、これは処理時開を増大させる。

本発明の改良は、処理効率がｐＨ範囲を成る樵のホルモンのそれぞれに対して一 定の値内に限定することによって最大にすることができるという発見から生じた ものである。下記参照。

縦索含有複合シートは、各種炭素充填量及び自己結合性マ）　９ツクスを形成す る各種精製度合の繊維を用いて製造することができる。充填量及び繊維精製度の 変化は複合シートの多孔度の正確なコントロール、即ち遊離炭素粒子を使用する 場合には利用することのできないコントロール、を可能にする。多孔度をコント ロールすることは、広範囲の圧力の使用を許容し、最適圧力社特別の商業的ｌ！ 請及び機器の利用可能性に応じて選択することができる。

本発明で用いられる「ホルモン」という川崎は、炭素の使用によりヒト血清から 吸着することのできるヒト血清中に存在する任意のステロイドホルモン及び甲状 腺ホルモンを包含して意味するものである。甲状腺ホルモン（Ｄ１４＝体例Ｆｉ 、、Ｔ３　（）ソーヨー１’チロニン）、〒４（チロキシン）、或いは免疫学的 検定系或いは関連した検定系により検定され、その存在量がその様々検定系にお いて使用されるゼロ標準血清中において実質的に検出不可能であるといわせざる をえない任意のその他の甲状腺ホルモンである。ステロイドホルモンの具体例と しては、コルチゾール、エストロゲン類、アンｒロゲン類、コルチコイド類及び プロゲスチン類などがある。

ヒト血液からのヒト血清の１１４Ｍ、は一般的に周知でおるので、余り詳細には 説明しない。任意のヒト血液から血清を製造する方法を用いて本発明の血清を製 造することができる。例えば、赤血球を遠心分離により血液から分離する。上澄 血漿を、例えば、トロンビン及びカルシウムの株加により凝固する。或いは又、 血液を単に凝固させる。血清をｆ過酸いは分離により凝固血液から分離し、適轟 なｐＨｍｌ１ｉ後にホルモン除去の準備が堅う。

本発明において用いられる「全」ヒト血清は、蛋白質、ホルモン、酵素、抗体、 ぎタミン、ミネツルなどの必要な生理学的及び生物学的成分を全て生物学的成分 の正常範Ｈにて含有するものである。その様な血清が本発明の方法における出発 血清として使用され、該方法の後にはホルモンの欠除及びおそらくはコレステロ ールの減少量の他は実質的に全てそのｔまである血清が得られる。

畿素含Ｉ’ｌ１台シートは、任意の種鵡の繊維化することのできる繊維、例えば ／（Ｊエチレン或いはセルロース繊維及び粉末化炭素よシなる。この複合シート は、又その他の以下に説明する如き添加剤を含有してもよい。

これらのシートは米国特許出願第１２３．４６７号（１９８０年２月２１日出ｊ ［）に記載されている方法に従ってｌＩｌ製することができ、この特許出願は本 発明に２いて準用する。

以下の説明において、−製はセルロース繊維に関連して説明されるが、しかしそ れは一般的に任意の噴錐の繊維化可能な繊維に適用可能なものである。

セルロース繊維は、顕著に異った寸法の種類を有する二つの別個の部分よりなる のが好ましい。主たる部分は通常のセルロース繊維であり、従たる部分は高度に 精製されたパイプである。

木材パイプ繊維の精製の状態は、標準スクリーン上の繊維の形成パラＰを通過す る流量の測定か行われる「ろ水産試験」によりめられる。ろ水＆６１１定のため の最も普通の二つの器械は［カナダ標準型ろ水産（Ｃ８Ｆ）試験器」及び［クヨ ツパー・リーグラー（８ｅｈｏｐｐ＊ｒ−Ｒ１＊ｇｌ曝ｒ）ろ本震試験器］でめ る。

これらの方法の両者において測定される量は、底部にオリフィス出口を有する受 水器からオーバーフローする水の容積（ｍｌで表現）である。本発明においては 、Ｃ８Ｆ測定が使用される。

粗い未叩解木材Δルプ繊維は、スクリーンから受水器中に高い排水速度を与え、 多量のオーバーフロー容積をもたらし、従って高いろ水［を記録する。典型的な 木材ノイズは＋４００ｍ１〜＋８００ｍ１のカナダ標準型ろ水産値を示す。紙或 いはフィルタ媒体製造において、その様なノルジはセルロース繊維を切断及び（ 又は）ＷＲ錐化する叩解のような機械的精製方法に付される。そのような叩解繊 維は、より遅い排水速ｉ會示し、従って低いろ水産を示す。紙工業において使用 される最も高度にｎ摂されたパイプはいわゆるグラブンＡルゾであり、これは長 時間の叩解に付されたものであり、＋８０〜＋１００ｍ１のカナダ標準型ろ水産 値を示す。

精製をグ２シンＡルゾ状態を越えて継続すると、測定されるろ水産が時間と共に 増大する点に到達する。

この範囲のろ水産においてオーバーフロー流中に繊維微細粉が認められ、伺等か の固体物質がスクリーン上にマットを形成するよシもスクリーンを通過して来て いることが明らかである。精製が継続されるとオーバーフロー中の微細粉の量が 増加し、だんだんスクリーンを通過する物質が増加する。この範囲のろ水産を「 反転した」と説明され、便宜上気のｆｆ１（例−２００ｍ１）が与えられる。特 別の精製装置及び長い精製時間を用いることにより−１０００ｍｌ　までの反転 ＣＦ６値を達成することが可能である。

数種の型のパルプ精製器が市販されているが、これらは二つの基本間−に分類さ れ、即ち円錐双いはＪｏｒｄａｎ製及び円盤証に分類される。円ａｍ、特に二重 円盤精製器は本発明の高度に精製されたパルプの１ｉｌＩ製に４９に適したもの のように思われる。

本発明において使用される標準等級の木材パルプ（以下「未精製」と称する）は ＋４００〜＋８００ｍ１のカナダ標準型ろ水産を有する。未精製パルプはシート の全重量のｌＯ重量嘩の少量或いは２０〜３０重量１％までを占め工業的血清処 理用途に適した構造特性を有するフィルター媒体シートを提供する。

＋１００〜−６００ｍ１の範囲のカナダ標準瀝ろ水産値を有する高度に精製され たパルプは又、本発明のシートに全重量の１〜１５−の範囲で添加される。実施 に際し、１０重量−を越える高度に精製されたパルプ或いは一６００ａｓｌよシ 大きな反転カナダ標準型ろ水産値を示す［６パルプを使用することには殆んど利 点がないようである。通常未楕＆！パルプ対高度に精製され九ノセルプの重量比 は約２：１〜１０　：　１、好ましくは３：ｌ〜５：１の範囲にある。

３０重重量上越える未精製パルプが使用される場合には、処理方法の際に炭素粒 子がシートから洩れだすことが見出された。１５％より多い高度に精製されたｐ Ｒルプを使用する場合には、シートが余シにも緊密に充填され、貫流効率が減少 する。

一つの組成物は、例えば、複合体シートの全重量に基づいて１８〜２０９６のセ ルロース未ｎｇ４緻雑及び８〜１０−の精製パルプよりなる本のである。

最良の組成物の中には５−の−２５０Ｃ８Ｆ　ｔ−有する繊維、６−のＯＣ８Ｆ を有する繊維、５−の４０ＣＢＦｔ−有する繊維及び１５１６の未精製繊維を含 有するものがある。

未精製セルロース繊維の平均直径は３０〜５０ミクロンであるのに対し、１ＩＩ ｌ＋度に精製されたパルプの平均直径は通常約１ミクロン未満である。

本発明においては、マニラ麻、ジュート、カラン（ｅ＠ｒｏｍ）、シサル（ｓｉ ｓｓａｌ）、漂白或いは未漂白クラフト、或いはコーズ（ｌｃｏ寡Ｕ）などの天 然セルロース繊維を使用することができる。その様な天然セルロース繊維はシー トに強度を与えるために結合剤を必要としないので好ましい。しかしながら少量 の添加結合剤を導入してセルロース材料により形成される結合を高めることは可 能である。

メラミン、ポリアミン、及びイリアミドなどの結合剤を１−以下のオーダーで使 用することができる。適轟な樹脂及び電荷変性剤を記載する次の三つの特許出願 を参照として引用する： 米国特許出願第０７４．３７６号（１９７９年９月１０日出願）、 米ｍｓ許出願籐１４７，９７５号（１９８０年５月８日出願）、 米国籍許出帽に１６４，７９７号（１９８０年６月３０日出願）。

これらの特許出願は本＠明において準用する。

自己結合性シートはヒト血清からホルモンを吸着することのできる任意の種類の 炭素を含有することができるが、しかし、該縦素粒子の９０−以上は約５０ミク ロン未満の平均直径を有するべきである。これは、２７０メツシＳを越える、最 ４好ましくは３２５メツシユを越える径を有する高度に精製された炭素粒子に相 当する。これより大きい炭素粒子径の使用は、本方法の効率を減少させる。

炭素構造は六面体に配列された炭素原子の平行な層よシなるものと、尚分野で一 般的に理解されている。

炭素が活性化されていない場合は、中間層空間はタール類その他の不純物などの 挿入−質により占められている。中間層空間をノクージするために高温における 活性化が必要である。活性化社通常５００〜２０００℃の温度において行われる 。本発明において有用な活性化炭素材料の具体例は、Ｎｏｒｌｔ、ＬＣ−３００ （Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙより販売）、Ｄａｒｅｏ　 （Ａｔ　ｌａｇ　Ｐｏｗｄｅｒ　Ｃｏｍｐａｎｙより販売）などでおる。これら の中で最も好ましいのはＮｏｒｉｔである。

本発明の複合体シートは炭素の約１０〜９０重量−の量で活性化縦索を含有する ことができる。１０−未満の量は十分な除去能力を与えることができないのに対 し、９ｏｌｔ−越える量は炭素のシートからの望ましくない除去及び最終製品へ の混入などの問題を生じる。好ましくは炭素の量Ｆｉ５０〜９０嘔、最も好まし くは７０〜８０チである。

本発明に従ってゼロ標準血清を調製する際に、マトリックス−結合屍素粒子を使 用することの付加的な利点は、複合シートを、その中に、方法の効率を相乗的効 果により爽に高めることのできるイオン交換街脂或いは水溶性重合体などのその 他のホルモン吸着量の吸着材を導入することによって製造することができること である。従来技術において、甲状腺ホルモン吸着に使用され、本発明のシート中 に有利に導入することのできる吸着材としては、米国特許第３，４１４，３８３ 号明細書に開示されているイオン交換樹脂、Ｍｕｒｐｈｙとｐａｔｔ＠ｓによる Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＣＩＣｌＩｎ１ｅａｌＥｎｄｏｅｒｉｎｏ１ｏの第２４ 巻：第１８７頁（１９６４年）に記載されている架橋デキストクンの非イオン性 樹脂ゲル、米国特許第３，６６６．８５４号明細書に記載されている粒状無機結 晶性材料、Ｒｏｌｌｅｒｔ　らによるＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ　 Ｍｅ＋目ｅｉｎｅの纂１３巻：第８９３頁（１９７２年）に記載されている微小 球体アルブミンなどを挙げることができる。

前記諸文献の開示内容は本発明において準用する。

炭素含有シートを成形するに際しては、任意の標準シート形成方法を使用するこ とができる。例えは、精製及び未ｎ製繊ａｔ先ず水中に約１−の粘ｍ度に分散す る。次いで尿素をこの繊維スラリーに添加した後、必要に応じて水溶性樹脂を添 加する。十分な分散時間を与えた後、スラリーを真空フェルト化して７−ト形状 にする。水は最小の抵抗の通路を選択する傾向を常に有するので、真空フェルト 化法は粒子及び線維のシート構造中における均一な分布に対する自己調整機構を 与える。これらのシートは、有孔表面上に、通常、それぞれ２８０５ｍ〜７０５ ｍのメツシュ開口度を有する５０メツシユ〜２００メツシユの範囲で実際上変化 し得る金網メツシュ上に形成するのが便利である。これより小さいメツシュは目 詰りの問題及び／又は構造的不適性のために不適尚である。

有孔真空フェルト化表面内の開口部の大きさ並びに形成シートのセルロース繊維 マトリックスの孔径は、所望のサブミクロンのフィルター媒体シートを製造する ために必要とされる黴細繊維戚いは粒状成分の寸法の幾らか或いは全てと比較し て極めて大きいものである。

湿潤シートはオープン中において約り４９℃〜約１７７℃（約３００−３５０” Ｆ）Ｋ＞いて２０分〜２時間乾燥される。

この方法により得られる炭素含有複合シートは乾燥状態或い社湿潤状態において も高い強度を有するので、紙のシートとして取扱うことができる。

本発明において用いられる「血清を・曲・複合体シート・・・・・・と接触させ る」という語句はその様な接触を起こさせる任意の利用可能な手段を包含するこ とを意味する。例えば、シートを各種直径の円盤或いはパッドに切断し、豪数の その様な円盤或いはノにラドを適切にフィツトする円筒カラム中に積層すること ができる。

緩衝溶液で予備膨潤させて円盤をもれなくきちんとカラム末端に押し付ける。カ ラム内に設置される円盤の数の選択は、除去されるホルモンの濃度及び許容可能 なカラムの圧力差と被処理血清の流量との間のＡランスに応じて異る。典型的な 実験的組立てが第１図に示されている。

標準的な操作条件下において、積層された複合体シートの膨潤円盤或いはパッド の元項物を有するクロマトグラフカラムの内端に耐圧キャップが付属され、全ヒ ト血清がカラム内を流される。本発明の方法の一つの利点は、標準的嬬動ポンプ を用いて高圧力差において貫流を行うことができることである。好ましくは、圧 力差は１−４００ｐｓｉ　（０，０７〜２８ｋｇ／ｅｍ”）、より好ましくは１ 　＝　５０　ｐｓ　ｉ　（０，０７−３，５ｋｇ／ｃｍ２）、最も好ましくは１ 〜２０ｐｍｉ　（０，０７〜１．４）ｃｇ／　ｅ　！！Ｉ　”　）である。圧力 差がＩ　Ｐｌｉ　（０，０７ｋｇ／ｅａｓ”）未満になると活性炭素の完全利用 が行われず、処理が余シにも遅くなる。４００ｐｓｉ　（約２８ｋｇ／ａｍ２） より高い圧力も勿論特に高性能液体クロマトグラフにおいては設備の問題及び圧 力コントロールの問題がその様な方法を高価で繁雑なものにしない限りにおいて 、勿１！Ｉｆ！用することが可能である。しかしながら、１〜２０ｐｓｌ　（０ ，０７〜１．４ｋｇ／ｅｍ２）の範囲で作動する通常の実験室の嬬動ポンゾを使 用することにより優れた結果が得られる。

ｐＨ変化が除去速度及び選択率に大きな影響を有することが観察された。血清が ｐｉ（９〜１２、好ましくは約１１に調整されるならばＴ３及び〒４が最も効果 的且つ選択的に除去される。血清が、ｐＩ１４．０〜６．０、好ましくは約５に 調整されるならばコルチゾールが最も効果的且つ選択的に除去される。かように 、血清のｐＨを二段階操作の第一段階の約５から纂二段階の約１１に変化させる ことは最も好ましい実施方法である。

カラム内のシート円盤或いはパッドの数、流速、フィルター前後の圧力差、カラ ムを通過する血清再循環の使用及び数、炭素充填量、繊維精製度、温度及び再生 シートを使用する可能性などは全て本方法において調製することのできる変数で ある。

圧力、炭素充填量、ｎ製の程度及びｐＨが上記範囲に保たれる場合には、残りＯ Ａラメ−ターは１景ではなく、これら）ぐラメ−ターは更に不当な実験を行うこ となく当業者により容易に調整することができるものである。

全ての・ぞラメ−ターの最適化は不側の条件及び循環される特別の試料の必要性 並びに利用可能な機器などに応じてケースバイケースに行われる。特定の状況下 における最適化は下記の実施例及び比較例において更に例示する。

本発明の方法により得られる血清は、実質的に検出不可能な量の甲状腺ホルモン を含有する全ヒト血清である。本発明において使用される「実質的に検出不可能 な」という用語は血清中の甲状腺ホルモンの存在が現在利用可能な最も正確な免 疫学的検定系の感度のレベルより低いことを示す。

かように、実質的に検出不可能な量のヒト甲状腺ホルモンを含有する全ヒト血清 を提供することは本発明のもう一つの実施態様で・ある。

最終生成書中のコルチゾール、Ｔ３及び〒４の水準は０６５μｇ／ｄｉ未満、好 ましくは００−１ｓ／ｄｌ　未満である。

ヒト血清中のその他の成分の標準値或いは標準的範囲は年令、性及び時間並びに ホルモンの影響に応じて広範に変化するものである。この平均値がわかればヒト 血清中の各樵成分の「標準的」水準は本発明の蛾終生成物を更に特徴付ける手段 として提供される：アルブミン水準：３．５−５ｇ／ｄｉ；グロブリン水準；２ 〜３．５ｓ／ｄｌ；　及び全コレステー−ル水準＝１３０〜２３０ｍｇ／ｄｉ。

本発明の血清は、ラジオイムノアッセイ、酵素標識免疫学的検定、凝集反応免疫 検定、及びその他のその様な方法及び系において標準として使用することができ る。それは検定キット類として或いは個々に供給することができる。

以上、本発明を一般的に説明したが、以下具体例に則して本発明を説明するが、 これらの具体例は例示を目的とするものであり、轡に断９のない限り本発明を限 定する趣旨のものではない。

Ｔ３、Ｔ４並びにコルチゾールの測定線市販されているラジオイムノアッセイキ ットを使用して行われた。

これらのキットは、放射性標識化された及び未標識化Ｔ３或いは〒４或いはコル チゾール分子がＴ３或いはＴ４に対する特異的抗体用の結合部位に対して競争す るという原理に基づいて設計されている。抗体の使用量はインキュベートの最終 容量中のその＃度が未標識化ホルモンの不存在下における標識化ホルモンのほぼ ５０−を結合するようなものである。対照例或いはｆ過試料中にはｊｌ！に余分 のＴ　ａ、Ｔ　４或いはコルチゾール分子が存在するのでこの量の未榛繊化Ｔ３ 、〒４或いはコルチゾールは標識化ホルモン分子と虜争し、結合状態において存 在する放射性分子の量を権釈する。第二の抗体、ヤイ抗−ウサイガンマグロブリ ン、を添加してホルモン分子に結合した第一の抗体の複合体の沈澱を助ける。遠 心分離後大金な抗体複合体が試験管の底に沈澱する。結合部分を含有する沈Ｓａ ｔ次いでカウントすることができる。

本発明による以下の具体例で使用される炭素／ぐツＰの配合を表１に示す。

Ｃ，クロマトグラフカラム ＠１図に示したカラムを使用した。炭素シートは２５ｍｍ、４７ｍｍ、或いは１ ０インチ（約−２５，４ｃｍ）径の円盤に切断し、適切にフィツトするカラムに 充填した。緩衝溶液による予備膨潤によりＡラドがカラム内に洩れなくきちんと 押し込まれた。

■　具体例 縦素粒子床と混合することによる血清からのホルモンの吸着速度は拡散律速であ る。吸着速度は血清中の禾牧着ホルモンと炭素上に吸着されたホルモンの閣の濃 匿差に応じて異る。ホルモンが次第に炭素上に吸着されるにつれ、一度差は減少 し、これがａ着速度を減少させる。不発明のクロマトグラフカラムによる吸着に おいては、吸着速度は下記の如く接触時間により制御することができる： 接触時間＝（フィルター容槓×全フィルター数）／血清の流量 多くの炭素フィルターカラムについて得られた結果を表２にまとめて示す。血清 は２〜５０ｐｓｉ　（０，１４〜３　、５　ｋ　ｇ　／　ｅ　ｍ　”　）の範囲 の嬬動圧力及び生理学的ｐｉｌｌにおいてカラム内を循環させられた。

上記データは、フィルターの径、フィルターの数如何に拘らず甲状腺ホルモンの 水準は迅速にゼロに近い水準に減少するのに対し、蛋白質の水準は元の範囲に残 ることを示している。

厘　比較例 比較例を実施するに当シデータｔ−１分当りのカウント数（ｅｐｍ）で示す。ラ ジオイムノアッセイ法の性質によりｅｐｆｆｌ水準が＾ければ高い程得られる血 清中のホルモンの水準は低くなる。除去率は下記の１式により計算した： （１） 式中、 （ａ）ＴＣ（総カウント数）；未襟織化Ｔ３或いはＴ４　（即ち、ゼロ標準）の 不存在下における標識化Ｔ３戚いＦｉＴ４の総カウント数 ｅｐｍ　水準は蛾高値である。

（ｂ）対照血清＝未ｆ過未処理ヒト血清。未標識化ホルモンの最高換度によシｅ ｐｍ　水準はこの場合において最低である。

（ｃ）試料血清＝ｅｐｍ水準が総カウント数と対照カウント数の間にある炭素に よＦ）濾過或いは吸着された血清。ｅｐｍ　水準の読みが為ければ高い程血清か らのホルモンの除去率が効果的となる。

（ｄ）キットゼロ二市販の甲状腺ホルモンのないヒト血清であり標準としての役 割を果たす。処理試料中のｅｐｍ　水準の読みがこの値より高い場合には血清試 料中の未標識化ホルモンは市販の値よりも更に低いことを意味するのに対し、０ ９ｍ水準がそれよりも低い場合にはそれはほんの僅かの−の甲状腺ホルモンが除 去されたにすぎないことを意味する。

式１から、１００チ除去率は甲状腺ホルモンの量が市販のラジオイムノアッセイ キットによシ供給される甲状腺ホルモンのないヒト血清に対比して１００チ容認 可能な水準まで除去されたことを示す。

下記の近似（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ　）固定条件下において、粉末状炭素に よる吸着対複合体シート構造物中の炭素による吸着によるホルモン除去の効率の 直接の比較を行った。

１、複合体シート中の７（ｌ炭素配合量に基づいて見積られた等しい重量の炭素 量。

２　吸着物（血清）対吸着材（炭素粉末）の等比。

３、等しい吸着時間の長さ。

全実験において、線量の遊離縦索を時々渦巻き攪拌しなから１００ｒｎｌの血清 と混合した。かように、血清は炭素（チャコール）粒子床と殆んどの時間接触し ていた。炭素粉末を次いで遠心分離により血清から除去した。検定前に上澄液中 に残された微細粒子を０．４５或いは０．２　ミリミクロン膜を通してｒ遇する ことにより除去した。

Ａ、吸着時間に及ぼす効果 炭素ノットによるＴ３除去に対する吸着時間への線形的効果が生理学的ｐＨにお いて表３及び第２図に見られる。

拡散線むしろ遅い進行過程であるので、炭素扮末による吸着は第２図に示す如く その外表面においてのみ生ぜるものと思われる。研究に使用された炭素量を倍増 すると〒３除去のチも倍増する。

Ｂ、／＃ノット内血清の再循環の効果 表４及び第３図は生理学的ｐＨにおいて血清をノット内を貴重環させるととによ るＴ３の連続的除去を示す。

遊離炭素粒子を使用した場合には血清中のＴ３水準は殆んど変化しない。

吸着時間は流量或いはカラム内に設置されるｄ　７　ｐの数のいずれによっても コントロールすることができる。表５は生理学的ｐＨＫおける徴着薪究において カラムの流速及びカラム内のΔツＰａをコントロールすることの利点を示す。流 速は粉末化縦索と混合する場合に嬬容易に受け入れることのできな一因子である 。

Ｄ、カラ五前後のΔＰの効果 縦索で充填されたカラムが常に濾過中にチャンネルを形成することは共通の現象 である。圧力が高くなればなる程チャンネル形成の発生はより悪くなる。縦索粉 末をカラム内に充填することによる圧力蓄積を第４図に示す。カラムに吸着用粉 末化炭素を高圧において充填することは非実用的であり不可能である。本発明に おいて説明される炭素Δラドを作成する技術は、粉末化炭素をチャンネリングを 回避する特別の位置に固定し、Δットの多孔度を、分子の炭素内部孔中への移動 をはかるに最適な圧力に対して調整する独特の機構を提供する。〒３除去に対す る圧力差の効果を表６にＴ４及びコルチゾール除去についての生理学的ｐＨにお ける研究は表７及び８に示される。

あ ■　注意深くコントロールされたｐＨｌ１ｌｉ！における具体例 甲状腺及びステロイドホルモンの最も効率が良く且つ選択的な除去は、血清の内 因性結合蛋白質を不活性化するアルカリ性或いは酸性ｐＨ条件を用いて達成され る。活性内因性結合蛋白質の存在下においては、炭素（チャコール）は極めて効 率のよいバインダー（〉ｌＸ１０”１１モル）と競争しなければならない。甲状 −ホルモンはｐＨ１０，９において最も有効に除去され（表９．１０）、又ステ ロイドホルモンはｐＨ５，ＯＫよって最も有効に除去される（表１１）ことが示 されている。

表１２は本発明のパッドを用いヒト血清からのＴ３、Ｔ４及び；ルチゾールの代 表的除去を更に示す。

容量　５０１　５０１　３１１ 原料蛋白質　８．０　８．０　８．５ 出発ｐｉｉ　１０．８８　１０．８８　７．５５カラム＠　１　１　１ ／ぐツドーン′カラム　９６　９８　４５流量　１５０ｍ１／Ｇ　１６０ｍ１／ ｆｉ　１５０ｍ１／分処理時間　６．７　６．７　６．９ 炭素（チャ＝ｒ−ル）前　５．２１ｍｇ／ｄｌ　１５０ｎｇ／ｄｌ　１３．４ｓ ｇ／ｄｉ炭素１回通過　−−４，５μｍ１ 炭素、２回通過　−−５，０μｍ／ｄ１炭素３回通過　−−０，Ｏｕｇ／ｄｌ 炭素後　０．０μｇ／ｄｌ　Ｏｎｇ／ｄｌ　Ｏ，ＯＪｇ／ｄｉ以上、本発明を十 分に説明したが、組成物及び製造のパラメーター及び処理方法並びにそれから得 られる最終生成物は本発明或いはその実施感体の趣旨或いは範囲に影響を及ぼす ことなく広範な範囲において変化させることができることは当業者により了解さ れるであろう。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ 吸眉吋間ｃ令） ＦＩＧ、３ Ｆ　Ｉ　Ｇ、４ 翠叢量（＜ｌ） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ヒト血清からホルモンを除去する方法において、ｌ　ｐｓｉ　（約０−０ ７ｋｇ／ａｍ”　）よシ高い圧力差ＫＴｈいて、該血清を１自己結合性繊維のマ トリックス内に炭素粒子を内部分散して有し、該炭素粒子の９０−を越える部分 が約５０ミクロン未満の平均粒径を有するものよりなる複合体シートと接触させ ることを特徴とする方法。 λ　咳ホルモンがチロキシン及ヒドリ冒−ｒチロニンよりなる群から遇はれる甲 状腺ホルモンであり、ｐＨが９．０−１２．０　に維持される、請求の範囲第１ ｇＩＬ記載の方法。 ３、該ホルモンがステロイドホルモンであり、ｐＨが４．０−６．０に維持され る、請求の範囲第１項記載の方法。 ４、該圧力が１〜２００ｐｓｌ（約０．０７〜１４ｋｇ／ａｍ”）である、請求 の範囲第１項記載の方法。 ５、該複合体シートがセルロース繊維及び活性炭よりなる、請求の範１１Ｊｇ１ 項記載の方法。 ６、鍍セルロース繊維が２〜ｌＯ：１重量比の未精製パルプ及び高駁樗製パルプ よりなる、請求の範囲第５項記載の方法。 ７、該ｉｌｌ！Ｉｔｓ製パイプが＋１０１００−−６Ｏ０のカナダＩＩｉ準形ろ 水ｉ［（Ｃ８Ｆ）籠を有する、請求の範囲第６８、核未精製パルプが＋４００〜 ＋８００ｍ１　のカナダ標準形ろ水度値を有する、請求の範囲第６項記載の方法 。 ９、該未精製パルプがシートの全重量の１０〜３〇−を占める、請求の範［４５ 項記載の方法。 １０、該高を精製パルプがシートの全重量の１〜１５９６を占める、請求の組曲 ＷＪ５項紀載の方法。 １１、該未精製パルプがシートの全重量の１８〜２０嘔を占め、及び該高度精ｍ Ａルプがシートの全重量の８〜１０嘔を占める、請求の範囲＠５項記載の方法１ ２、該炭素が該シート中にホルモン吸着量にて存在する、請求の範−第５項記載 の方法。 １３、該量が該シートの全重量の１０〜９０％である請求の範囲第１１項記載の 方法。 １４、肢シートが炭素以外のホルモン吸着量のホルモン吸着材料を含む、ｆＩＩ 氷の範囲１１１ｇ５項記載の方法。 １５、該回収全ヒト血清が５ナノグラム／ｄ１未満の７３、コルチゾール、及び Ｔ４ｔ−含有する、請求の範囲第１項記載の方法。 １６、該複合体シートが円筒状カラム内の内部に退会する複数の実質的に円形の ／ｑツＰの形状で存在する、請求の範囲第１項〜第１５項のいずれか一項に記載 の方法。 １７、全血清原料がカラム内を通過され、順次該円形Ａッドの各々と接触させら れる、請求の範囲第１．６項記載の方法。 １８、該血清を該パッド含有カラム内に再循環させる、請求の範囲第１７項記載 の方法。