JPS5842972A - 癌の診断方法 - Google Patents
癌の診断方法Info
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- JPS5842972A JPS5842972A JP14146481A JP14146481A JPS5842972A JP S5842972 A JPS5842972 A JP S5842972A JP 14146481 A JP14146481 A JP 14146481A JP 14146481 A JP14146481 A JP 14146481A JP S5842972 A JPS5842972 A JP S5842972A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57476—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncofetal proteins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、癌の診断方法およびその方法に使用する診断
用試薬に関するものである。
用試薬に関するものである。
近年、癌の診断方法について種々の手法が開発され、た
とえばＸ線診断、内視鏡診断、細胞診、生検、画像診断
などの形態学的診断法における技術進歩は癌の早期診断
に大きな実績を築きつつある。一方、癌を血液生化学的
に診断しようとする試みも数多くなされ、たとえば、ａ
−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、塩基性フェトプロテイ
ン（ＢＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、
アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプ
チダーゼ、アルドラーゼ、ヒト繊毛ゴナドトロピン、Ａ
ＣＴＨ、カルシトニンなどをマーカーとする診断法が知
られている。しかしながら、これらの血液生化学的診断
法は、癌組織から分泌される癌胎児性蛋白をそれに対す
る特異的抗体で定量する方法、もしくは癌化に伴なう組
織の壊死により細胞内から漏出される各種酵素を検出す
る方法が主であり、癌細胞に対して特異的な抗体を血清
中で検出して癌を診断しようとすることについては未だ
報告はない。
とえばＸ線診断、内視鏡診断、細胞診、生検、画像診断
などの形態学的診断法における技術進歩は癌の早期診断
に大きな実績を築きつつある。一方、癌を血液生化学的
に診断しようとする試みも数多くなされ、たとえば、ａ
−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、塩基性フェトプロテイ
ン（ＢＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、フェリチン、
アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスペプ
チダーゼ、アルドラーゼ、ヒト繊毛ゴナドトロピン、Ａ
ＣＴＨ、カルシトニンなどをマーカーとする診断法が知
られている。しかしながら、これらの血液生化学的診断
法は、癌組織から分泌される癌胎児性蛋白をそれに対す
る特異的抗体で定量する方法、もしくは癌化に伴なう組
織の壊死により細胞内から漏出される各種酵素を検出す
る方法が主であり、癌細胞に対して特異的な抗体を血清
中で検出して癌を診断しようとすることについては未だ
報告はない。
一方、胚細胞性腫瘍は、主に若年層の性腺に発生し、病
理形態的に発生の分化段階を異にした種種の成分を含む
腫瘍群を指■するが、現在、その特異的かつ多彩な性質
により、臨床の診断、治療上の問題に関してだけでなく
、発生学、病理学、免疫学、生化学などの各基礎分野に
おいて特に癌と細胞分化との関係という観点から多くの
研究がなされている。
理形態的に発生の分化段階を異にした種種の成分を含む
腫瘍群を指■するが、現在、その特異的かつ多彩な性質
により、臨床の診断、治療上の問題に関してだけでなく
、発生学、病理学、免疫学、生化学などの各基礎分野に
おいて特に癌と細胞分化との関係という観点から多くの
研究がなされている。
１９７３年、アルツエト（Ａｒｔｚｔ）により発見され
たＦ９抗原は、奇形癌細胞ＯＴＴ６０５０由来の培養細
胞株であるＦ９細胞を同系の１２９／ＳＶ系マウスに免
疫して得られた抗血清により検出された細胞表面抗原で
ある。Ｆ９抗原はマウスすべての奇形癌細胞、精子（ヒ
トを含む）、精巣細胞、初期胚などに存在することが証
明されている。
たＦ９抗原は、奇形癌細胞ＯＴＴ６０５０由来の培養細
胞株であるＦ９細胞を同系の１２９／ＳＶ系マウスに免
疫して得られた抗血清により検出された細胞表面抗原で
ある。Ｆ９抗原はマウスすべての奇形癌細胞、精子（ヒ
トを含む）、精巣細胞、初期胚などに存在することが証
明されている。
その後、１９７７年、ホルデン（Ｈｏｌｄｅｎ）、ホー
ガン（Ｈｏｇａｎ）らによりヒトの精巣原発の奇形癌細
胞株（Ｓｕｓａ．Ｔｅｒａ）の細胞表面上に、１２９／
ＳＶ系マウスで作製した抗Ｆ９抗体と対応する抗原が存
在する事実が、細胞毒性試験（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔ
ｅｓｔ）ならびに吸収試験（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔ
ｅｓｔ）により証明された。
ガン（Ｈｏｇａｎ）らによりヒトの精巣原発の奇形癌細
胞株（Ｓｕｓａ．Ｔｅｒａ）の細胞表面上に、１２９／
ＳＶ系マウスで作製した抗Ｆ９抗体と対応する抗原が存
在する事実が、細胞毒性試験（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｔ
ｅｓｔ）ならびに吸収試験（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔ
ｅｓｔ）により証明された。
以上のことから、本発明者らはヒト精巣奇形癌由来の細
胞株がマウス抗Ｆ９抗体と反応する抗原を有するという
事実に着目し、同系マウスに免疫して作製された抗Ｆ９
抗体と同様の抗体がヒトの担癌生体においても検出しう
るのではないかという推察のもとに、ヒト胚細胞性腫瘍
患者血清中に抗Ｆ９抗体が存在するか否かの検索に着手
した。
胞株がマウス抗Ｆ９抗体と反応する抗原を有するという
事実に着目し、同系マウスに免疫して作製された抗Ｆ９
抗体と同様の抗体がヒトの担癌生体においても検出しう
るのではないかという推察のもとに、ヒト胚細胞性腫瘍
患者血清中に抗Ｆ９抗体が存在するか否かの検索に着手
した。
すなわち、ヒト血清中の抗体の検出法として ｉｎｖｉ
ｔｒｏ で継代されているＦ９細胞を標的とした間接蛍
光抗体法を用いて検索試験を重ねた。その結果、正常人
血清１１０例、皮様嚢腫１０例を含む良性卵巣腫瘍１８
例の患者血清ではいずれも抗Ｆ９様抗体を検出しなかっ
た。さらに、卵巣原発でありながら、病理形態学的に異
なる腫瘍である腺癌患者血清９例でもほとんど反応性を
示さなかった。それに対し、未分化胚細胞種を除く胚細
胞性腫瘍（奇形癌、卵黄嚢腫、絨毛性腫瘍、奇形腫）患
者血清７例では著明に反応性を示し、抗Ｆ９様抗体の存
在を示唆した。
ｔｒｏ で継代されているＦ９細胞を標的とした間接蛍
光抗体法を用いて検索試験を重ねた。その結果、正常人
血清１１０例、皮様嚢腫１０例を含む良性卵巣腫瘍１８
例の患者血清ではいずれも抗Ｆ９様抗体を検出しなかっ
た。さらに、卵巣原発でありながら、病理形態学的に異
なる腫瘍である腺癌患者血清９例でもほとんど反応性を
示さなかった。それに対し、未分化胚細胞種を除く胚細
胞性腫瘍（奇形癌、卵黄嚢腫、絨毛性腫瘍、奇形腫）患
者血清７例では著明に反応性を示し、抗Ｆ９様抗体の存
在を示唆した。
本発明者らは、これらの事実の発見に基いてさらに研究
を進め、マウスＦ９細胞を〔３Ｈ〕でラベルしたグルコ
サミン、フコース、ガラクトースなどの糖で標識し、プ
ロナーゼ処理により〔３Ｈ〕−糖ペプチドを得、これを
標識抗原としてヒト胚細胞性腫瘍患者血清中の抗体の検
出を行なった。この結果、（１）正常人血清、良性卵巣
腫瘍患者血清、卵巣腺癌患者血清ではほとんど抗Ｆ９様
抗体の存在は検出されず、（２）胚細胞系卵巣腫瘍患者
血清では抗Ｆ９様抗体の存在が著明に検出された。した
がって、標識化された癌細胞またはその表面抗原を用い
ることにより、癌患者の血清中に胚細胞性腫瘍抗原に対
する抗体の存在を検出することができ、その検出によっ
て癌の診断、病理分類、悪性度の判定、臨床経過観察が
有効に行えることが明らかとなった。
を進め、マウスＦ９細胞を〔３Ｈ〕でラベルしたグルコ
サミン、フコース、ガラクトースなどの糖で標識し、プ
ロナーゼ処理により〔３Ｈ〕−糖ペプチドを得、これを
標識抗原としてヒト胚細胞性腫瘍患者血清中の抗体の検
出を行なった。この結果、（１）正常人血清、良性卵巣
腫瘍患者血清、卵巣腺癌患者血清ではほとんど抗Ｆ９様
抗体の存在は検出されず、（２）胚細胞系卵巣腫瘍患者
血清では抗Ｆ９様抗体の存在が著明に検出された。した
がって、標識化された癌細胞またはその表面抗原を用い
ることにより、癌患者の血清中に胚細胞性腫瘍抗原に対
する抗体の存在を検出することができ、その検出によっ
て癌の診断、病理分類、悪性度の判定、臨床経過観察が
有効に行えることが明らかとなった。
本発明は、以上の知見に基いて完成されたものである。
すなわち、癌を血液生化学的に診断する方法として、胚
細胞性腫瘍抗原に対する抗体の血清中の存在を、標識化
した癌細胞またはその表面抗原により検出することを特
徴とする癌の診断方法を提供するものである。さらに本
発明は、このような方法の実施に用いられる標識化した
癌細胞またはその表面抗原からなる癌診断用試薬を提供
するものである。
細胞性腫瘍抗原に対する抗体の血清中の存在を、標識化
した癌細胞またはその表面抗原により検出することを特
徴とする癌の診断方法を提供するものである。さらに本
発明は、このような方法の実施に用いられる標識化した
癌細胞またはその表面抗原からなる癌診断用試薬を提供
するものである。
本発明においては、癌診断用試薬として標識化した癌細
胞またはその表面抗原が用いられる。ここに「癌細胞」
とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で培養可能な癌細胞株であっ
て、診断対象の癌患者の血清中に存在する胚細胞性腫瘍
抗原に対する抗体に対して免疫応答可能な表面抗原をそ
の細胞表面上に有するものを指■する。さらに「表面抗
原」とは、前記癌細胞表面に存在する糖タンパク質であ
って、診断対象の癌患者血清中に存在する胚細胞性腫瘍
抗原に対する抗体に対して免疫応答可能なものを指■す
る。また「胚細胞性腫瘍抗原」とは、一般的に分化の初
期段階で特異的に出現するものであって、その後の分化
段階では通常は全く出現しないが、癌化することにより
出現する抗原をいう。
胞またはその表面抗原が用いられる。ここに「癌細胞」
とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ で培養可能な癌細胞株であっ
て、診断対象の癌患者の血清中に存在する胚細胞性腫瘍
抗原に対する抗体に対して免疫応答可能な表面抗原をそ
の細胞表面上に有するものを指■する。さらに「表面抗
原」とは、前記癌細胞表面に存在する糖タンパク質であ
って、診断対象の癌患者血清中に存在する胚細胞性腫瘍
抗原に対する抗体に対して免疫応答可能なものを指■す
る。また「胚細胞性腫瘍抗原」とは、一般的に分化の初
期段階で特異的に出現するものであって、その後の分化
段階では通常は全く出現しないが、癌化することにより
出現する抗原をいう。
このような癌細胞の代表例としては、ヒト、マウスなど
の温血動物の奇形癌（テラトカルシノーマ）細胞、黒色
腫（メラノーマ）細胞、急性リンパ白血病細胞などの確
立された培養細胞株が挙げられ、さらに具体的には、マ
ウス奇形癌細胞株Ｆ９、同ＰＣＣ３、同ＰＣＣ４、同Ｃ
８６−Ｓ１、ヒト奇形癌培養細胞株Ｔｅｒａ Ｉなどが
例示できる。
の温血動物の奇形癌（テラトカルシノーマ）細胞、黒色
腫（メラノーマ）細胞、急性リンパ白血病細胞などの確
立された培養細胞株が挙げられ、さらに具体的には、マ
ウス奇形癌細胞株Ｆ９、同ＰＣＣ３、同ＰＣＣ４、同Ｃ
８６−Ｓ１、ヒト奇形癌培養細胞株Ｔｅｒａ Ｉなどが
例示できる。
また、これらの表面抗原は、癌細胞に対してプロナーゼ
などによる酵素処理、非イオン性界面活性剤（たとえば
、トリトンＸ−１００、ＮＰ−４０など）などによる化
学的処理などを施して細胞を消化し、糖ペプチド画分を
分取することにより調製することができる。
などによる酵素処理、非イオン性界面活性剤（たとえば
、トリトンＸ−１００、ＮＰ−４０など）などによる化
学的処理などを施して細胞を消化し、糖ペプチド画分を
分取することにより調製することができる。
癌細胞およびその表面抗原に対する標識物質としては、
３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉなどの放射性同位元素
、β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、マイクロパーオキシダーゼなどの酵素
、ダンシルクロリド、フルオレスカミンなどの発蛍光物
質などを適用することができる。
３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉなどの放射性同位元素
、β−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、マイクロパーオキシダーゼなどの酵素
、ダンシルクロリド、フルオレスカミンなどの発蛍光物
質などを適用することができる。
標識化方法は、それぞれの標識物質について常用される
公知の方法手段によればよい。たとえば、放射性同位元
素により標識する場合には、〔３Ｈ〕−フコース、〔３
Ｈ〕−グルコサミン、〔３Ｈ〕−ガラクトース、〔３Ｈ
〕−マンノースなどの放射性同位元素標識糖類、〔１４
Ｃ〕−ロイシン、〔３５Ｓ〕−メチオニンなどの放射性
同位元素標識アミノ酸などを培地に添加し、これを用い
て癌細胞を培養することにより代謝的に標識を行うこと
ができる。また、ラクトパーオキシダーゼ触媒の１２５
Ｉ標識（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．５５、ｐ
３９０（１９７０）参照）、ガラクトースオキシダーゼ
酸化後のトリチウム化ホウ素ナトリウム（ＮａＢ〔３Ｈ
〕４）還元によるトリチウム標識（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ． Ｖｏｌ．２４８、ｐ４３１１（１９７３）参照
）、温和な条件下での過ヨウ素酸酸化後のトリチウム化
ホウ素ナトリウム還元によるトリチウム標識（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２５２、ｐ５８８８（１９
７７）参照）などの方法を適用することもできる。
公知の方法手段によればよい。たとえば、放射性同位元
素により標識する場合には、〔３Ｈ〕−フコース、〔３
Ｈ〕−グルコサミン、〔３Ｈ〕−ガラクトース、〔３Ｈ
〕−マンノースなどの放射性同位元素標識糖類、〔１４
Ｃ〕−ロイシン、〔３５Ｓ〕−メチオニンなどの放射性
同位元素標識アミノ酸などを培地に添加し、これを用い
て癌細胞を培養することにより代謝的に標識を行うこと
ができる。また、ラクトパーオキシダーゼ触媒の１２５
Ｉ標識（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． Ｖｏｌ．５５、ｐ
３９０（１９７０）参照）、ガラクトースオキシダーゼ
酸化後のトリチウム化ホウ素ナトリウム（ＮａＢ〔３Ｈ
〕４）還元によるトリチウム標識（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ． Ｖｏｌ．２４８、ｐ４３１１（１９７３）参照
）、温和な条件下での過ヨウ素酸酸化後のトリチウム化
ホウ素ナトリウム還元によるトリチウム標識（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２５２、ｐ５８８８（１９
７７）参照）などの方法を適用することもできる。
酵素標識は、たとえば、癌細胞表面あるいは表面抗原の
ペプチド鎖もしくは糖鎖の水酸基、アミノ基、カルボキ
シル基、チオール基などの官能基と、酵素蛋白の官能基
とを適宜な架橋化合物を介して結合させる方法などが適
用できる（石川ら編「酵素免疫測定法」株式会社医学書
院、昭和５３年１２月１５日発行、第３０〜５７頁参照
）。
ペプチド鎖もしくは糖鎖の水酸基、アミノ基、カルボキ
シル基、チオール基などの官能基と、酵素蛋白の官能基
とを適宜な架橋化合物を介して結合させる方法などが適
用できる（石川ら編「酵素免疫測定法」株式会社医学書
院、昭和５３年１２月１５日発行、第３０〜５７頁参照
）。
本発明における癌の診断は、前記のような標識化した癌
細胞またはその表面抗原を用いてヒト血清中の胚細胞性
腫瘍抗原に対する抗体の存在量を検出することによって
行われる。抗体の検出法は通常のイムノアッセイ法に準
じて行えばよい。すなわち、次のような基本的操作によ
って実施される。
細胞またはその表面抗原を用いてヒト血清中の胚細胞性
腫瘍抗原に対する抗体の存在量を検出することによって
行われる。抗体の検出法は通常のイムノアッセイ法に準
じて行えばよい。すなわち、次のような基本的操作によ
って実施される。
（１） 測定血清試料の調整
（２） 標識化した癌細胞もしくはその表面抗原の添加
、および抗原抗体反応 （３） ＢＦ分離 （４） 標識量の測定、および抗体量の算出診断測定に
供する血清試料の調製は常法によればよい。採血後、遠
心分離して得た血清を適宜な希釈用緩衝液を用いて希釈
し、アッセイに供することができる。希釈用緩衝液とし
ては、抗原抗体反応および標識量の検出測定に悪影響を
与えないイムノアッセイに常用されているものを選択す
ればよく、たとえば、りん酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが用いられる。
、および抗原抗体反応 （３） ＢＦ分離 （４） 標識量の測定、および抗体量の算出診断測定に
供する血清試料の調製は常法によればよい。採血後、遠
心分離して得た血清を適宜な希釈用緩衝液を用いて希釈
し、アッセイに供することができる。希釈用緩衝液とし
ては、抗原抗体反応および標識量の検出測定に悪影響を
与えないイムノアッセイに常用されているものを選択す
ればよく、たとえば、りん酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが用いられる。
抗原抗体反応も常法にしたがって行えばよく、反応に好
適な反応条件（温度、ｐＨ、時間等）を設定して実施す
ればよい。
適な反応条件（温度、ｐＨ、時間等）を設定して実施す
ればよい。
ＢＦ分離操作により、抗体に結合した標識化癌細胞もし
くは表面抗原と、未結合の遊離している標識化物とを分
離する。ＢＦ分離方法としては、硫酸アンモニウムによ
る分画法、デキストラン被覆活性炭による分別吸着法、
ポリエチレングリコールによる分別沈殿法、第二抗体に
よる分別沈殿法、適当な担体に不溶化した第二抗体によ
る固相法などを採用することができる。
くは表面抗原と、未結合の遊離している標識化物とを分
離する。ＢＦ分離方法としては、硫酸アンモニウムによ
る分画法、デキストラン被覆活性炭による分別吸着法、
ポリエチレングリコールによる分別沈殿法、第二抗体に
よる分別沈殿法、適当な担体に不溶化した第二抗体によ
る固相法などを採用することができる。
標識量の測定は、ＢＦ分離により得られる抗体に結合し
た標識化物画分、あるいは未結合の標識化物画分につい
て、標識物質の種類に応じた公知の測定手段により行え
ばよい。標識量の測定に基いて血清中の抗体量を算出す
ることができる。
た標識化物画分、あるいは未結合の標識化物画分につい
て、標識物質の種類に応じた公知の測定手段により行え
ばよい。標識量の測定に基いて血清中の抗体量を算出す
ることができる。
かくして、癌の羅患と関連づけられた胚細胞性腫瘍抗原
に対する抗体の存在を、それに免疫反応性を有する標識
化した癌細胞もしくはその表面抗原により血清中におい
て検出することにより、癌の診断を行うことが可能とな
る。また、癌の種類と産生される抗体の種類との特定の
関係を解析し、その抗体に対する癌細胞もしくはその表
面抗原の特異性を利用すれば、特定の標識化癌細胞もし
くは表面抗原を選択して血清検査を行うことにより、癌
の種類の判定が可能となる。たとえば、前述したように
、また後述する実施例においてさらに詳らかなように、
標識化Ｆ９抗原によれば、胚細胞系卵巣腫瘍の診断、腫
瘍の病型分類が血清生化学的に可能である。特に胚細胞
系卵巣腫瘍の診断および病型分類については、従来生検
などの形態学的診断が困難とされており、開腹手術によ
ってはじめてなされていただけに、本発明の意義には図
り知れないものがある。
に対する抗体の存在を、それに免疫反応性を有する標識
化した癌細胞もしくはその表面抗原により血清中におい
て検出することにより、癌の診断を行うことが可能とな
る。また、癌の種類と産生される抗体の種類との特定の
関係を解析し、その抗体に対する癌細胞もしくはその表
面抗原の特異性を利用すれば、特定の標識化癌細胞もし
くは表面抗原を選択して血清検査を行うことにより、癌
の種類の判定が可能となる。たとえば、前述したように
、また後述する実施例においてさらに詳らかなように、
標識化Ｆ９抗原によれば、胚細胞系卵巣腫瘍の診断、腫
瘍の病型分類が血清生化学的に可能である。特に胚細胞
系卵巣腫瘍の診断および病型分類については、従来生検
などの形態学的診断が困難とされており、開腹手術によ
ってはじめてなされていただけに、本発明の意義には図
り知れないものがある。
以下、実施例を挙げて本発明のより具体的な説明とする
。ただし、これらは単なる実施態様の例示であって、本
発明の技術思想の範囲を限定するものではない。
。ただし、これらは単なる実施態様の例示であって、本
発明の技術思想の範囲を限定するものではない。
実施例１（標識化Ｆ９抗原の調製）
マウス奇形癌細胞Ｆ９細胞をＲＰＭＩ１６４０（１５％
ウシ胎児血清含有）培地に懸濁し、０．１％ゼラチンコ
ートプレート上で３７℃、２４時間培養し、〔３Ｈ〕−
フコースを５０μｃｉ／１０ｍｌ培地あて添加してさら
に２４時間培養した。培養液を除去した後、アール氏液
（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋を含まないもの）で１回洗浄し、
０．０５％ＥＤＴＡ含有りん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ
）−ＲＰＭＩ１６４０培地（１：３）で３７℃、３０分
間処理した。ピペッティングによりプレート表面から細
胞を剥離させ、１０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離し
た。細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して上清を除去す
る操作を３回繰り返し、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０、０．０１Ｍ塩化カルシウム含有）で１回洗浄
した。細胞を再び０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に懸濁させ
、プロナーゼＥ（科研化学社製）４０ｍｇ／４ｍｌ緩衝
液あておよびトルエン０．２〜０．４ｍｌを加えて３７
℃で４８時間処理した。反応液を１００℃で５分間処理
した後、３０００ｒ．ｐ．ｍで１５分間遠心分離し、上
清をセファデックスＧ５０カラムクロマトグラフィー（
０．０５Ｍ酢酸緩衝液を水酸化アンモニウムでｐＨ６．
０に調整したもので緩衝、カラムサイズ１．８×６７ｃ
ｍ）に付し、通過液画分より〔３Ｈ〕−フコース標識Ｆ
９抗原を得た。
ウシ胎児血清含有）培地に懸濁し、０．１％ゼラチンコ
ートプレート上で３７℃、２４時間培養し、〔３Ｈ〕−
フコースを５０μｃｉ／１０ｍｌ培地あて添加してさら
に２４時間培養した。培養液を除去した後、アール氏液
（Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋を含まないもの）で１回洗浄し、
０．０５％ＥＤＴＡ含有りん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ
）−ＲＰＭＩ１６４０培地（１：３）で３７℃、３０分
間処理した。ピペッティングによりプレート表面から細
胞を剥離させ、１０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離し
た。細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離して上清を除去す
る操作を３回繰り返し、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０、０．０１Ｍ塩化カルシウム含有）で１回洗浄
した。細胞を再び０．１Ｍトリス塩酸緩衝液に懸濁させ
、プロナーゼＥ（科研化学社製）４０ｍｇ／４ｍｌ緩衝
液あておよびトルエン０．２〜０．４ｍｌを加えて３７
℃で４８時間処理した。反応液を１００℃で５分間処理
した後、３０００ｒ．ｐ．ｍで１５分間遠心分離し、上
清をセファデックスＧ５０カラムクロマトグラフィー（
０．０５Ｍ酢酸緩衝液を水酸化アンモニウムでｐＨ６．
０に調整したもので緩衝、カラムサイズ１．８×６７ｃ
ｍ）に付し、通過液画分より〔３Ｈ〕−フコース標識Ｆ
９抗原を得た。
実施例２（ヒト血清中の抗体の検索）
正常人血清、悪性胚細胞性腫瘍患者血清、良性卵巣腫瘍
患者血清、卵巣腺癌患者血清について〔３Ｈ〕−フコー
ス標識Ｆ９抗原を用いて抗体の検索を行った。アッセイ
法は以下のとおりであった。
患者血清、卵巣腺癌患者血清について〔３Ｈ〕−フコー
ス標識Ｆ９抗原を用いて抗体の検索を行った。アッセイ
法は以下のとおりであった。
患者血清をＰＢＳ（１％ウシ血清アルブミン含有、ｐＨ
７．４）で希釈し、その６０μｌに実施例１で得られた
〔３Ｈ〕−フコース標識Ｆ９抗原３０μｌを加え、３７
℃で３０分、さらに４℃で３０分反応させた。反応液に
飽和硫酸アンモニウム溶液９０μｌを加え、３０００ｒ
．ｐ．ｍで１５分遠心分離し、沈殿を集めて５０％硫酸
アンモニウム溶液に懸濁させて３０００ｒ．ｐ．ｍで５
分間遠心分離する洗浄操作を２回繰り返し、得られた沈
殿をＰＢＳ２００μｌに溶解させ、その１００μｌを用
いて液体シンチレーションカウンターにより〔３Ｈ〕量
を測定した。
７．４）で希釈し、その６０μｌに実施例１で得られた
〔３Ｈ〕−フコース標識Ｆ９抗原３０μｌを加え、３７
℃で３０分、さらに４℃で３０分反応させた。反応液に
飽和硫酸アンモニウム溶液９０μｌを加え、３０００ｒ
．ｐ．ｍで１５分遠心分離し、沈殿を集めて５０％硫酸
アンモニウム溶液に懸濁させて３０００ｒ．ｐ．ｍで５
分間遠心分離する洗浄操作を２回繰り返し、得られた沈
殿をＰＢＳ２００μｌに溶解させ、その１００μｌを用
いて液体シンチレーションカウンターにより〔３Ｈ〕量
を測定した。
その結果は第１表のとおりであった。
第１表
特許出願人 （６７７）ヤマサ醤油株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）癌を血清生化学的に診断する方法であって、胚細胞
性腫瘍抗原に対する抗体の血清中の存在を、標識化した
癌細胞またはその表面抗原により検出することを特徴と
する癌の診断方法。 ２）標識化した癌細胞またはその表面抗原からなる癌診
断用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14146481A JPS5842972A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | 癌の診断方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14146481A JPS5842972A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | 癌の診断方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5842972A true JPS5842972A (ja) | 1983-03-12 |
Family
ID=15292487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14146481A Pending JPS5842972A (ja) | 1981-09-07 | 1981-09-07 | 癌の診断方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5842972A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1983004311A1 (en) * | 1982-06-03 | 1983-12-08 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for preparing fucose antigen and antibody for distinguishing it, measurement of tumor-associated sugar chain utilizing the same, and kit for the measurement |
-
1981
- 1981-09-07 JP JP14146481A patent/JPS5842972A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1983004311A1 (en) * | 1982-06-03 | 1983-12-08 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for preparing fucose antigen and antibody for distinguishing it, measurement of tumor-associated sugar chain utilizing the same, and kit for the measurement |
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