JPS58185524A - 液体クロマトグラフイ−による体液成分の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発ｆ！Ａは一定組＊Ｏ＄動相を流しつつ、体液を直談
注入し分子ふるいと分配壕九は吸着とｔ同時に起むさせ
ながら行なう液体クロマトグラフィーによみ体液成分の
分離方法Ｋｌｌｌする。

体Ｉ［社血液、リン／ｌｍ、組織液に大別され、それぞ
れ多数の成分よりなるが、その組成は健康状１ｉＫよっ
て変わるといわれ１いる。また七の中には体内への投入
又祉体内からの除去によって治療に役立つものもある．
したかつ１体液を簡便、迅速かつ多数の酸分κ分離する
方法は主として生化学中医学勢の分野から常に求められ
ている。

液体クロマトグラ７イーは、崩漿、血清或いは尿６０体
濠中の溶存物ｊｌＯ分離法としては、電気泳動性や分別
沈殿法κくらべ１迅速性、簡便性あるいは適用物質範一
〇広１等においてすぐれているため近年注目管集めてい
る。液体クロマトグラフィーは分ａｉｍによって分子ふ
るいクロマトグラフィー（グル濾過、またＦｉグルパー
ミエーシ。

ンクロマトグラフィーともいい、以下ＧＰＣと表わす）
と吸着又は分配クロマトグラフィーとに大別される。Ｇ
ＰＣＦｉ充填剤（以下グルと色う）のボアよ、Ｉトさい
分子サイズの成分はその太き芒に応じてグルのボア内へ
浸透し、大きい成分はグルの外を累過シする原理を利用
して分子サイズの大きい成分から溶媒と共に順次溶出さ
せる方法である。

一方吸着又は分配クロマトグラフィーは被分１ｌｌｉ物
質の固定相つまクグル内又はグル表面への吸着や分配を
利用し、吸着や分配の強さに応じて分離せしめる方法で
、低分子物質相互の分離に適するが、高分子量物質はグ
ルＫａ看されて溶離しにくくなるので被分離対象として
は不適当と場れ１いる。

体液中の物質上液体クロマトグラフィーによって分離す
る場合、ＧＰＣｉ用いると血漿や血清はもとより有形成
分を含まない体液であれはすべて直接注入でき、移動相
全途中で変えることもないため操作が簡便であるが、分
子量が近接した物質の分ｍか困難なためクロマトグラム
上で検出されるピーク数はある程度限られる。一方吸着
又は分配クロマトグラフィーを用いると血嬢や血清のよ
うに蛋白質會含む体液の場合は前処理として除蛋白等が
会費で、ざらに途中で移動相の変更が必要な場合も多く
、全体に操作か複雑で、蛋白’Ｊ［％高分子量物質の分
離もできないが、低分子成分については検出さね、るビ
ークの数はＧＰＣにくらべて多い。

近年ＧＰＣ用グルにイオン交換基金導入して分子ふるい
と吸着又は分配管同時に起こらしめて試料の前処理の簡
略化と検出ピーク数の増大とｔｌｉｉｊ時に満たす試み
もなされているが、この方法社途中でＳ動相を変える操
作を伴なうものであｐ、繰返し迅速に分離するには不適
当である。

本発明者は液体クロマトグラフィーによる体液分離の前
記問題点を牌決すべく鋭意検討管重ねた結果、体液成分
を簡便、迅速かつ詳細に分離する方法會開発し、本発明
を完成するに到った。

すなわち本発明は液体クロマトグラフィーにょる体液成
分の分離において、一定組成の移動相を如しつつ有形成
分を含まない体液なｔｉ接注入し、分子ふるいと吸着ま
た祉分配と會同時に起こさせながら行なうことｔ−％黴
とする体液成分の分離方法に関プる。

本発明における体液は、体内の液状物たとえは血漿、血
清、胃液、膵液、組汁、尿、汗あるいはＩｋＩＩ胞内液
％ρ・あけられる。なかでも採取が容易で、かつ甘まれ
る成分が低分子がら篩分子にゎたっ１極めて多種である
血漿や血清食用いた場合に本発明の効果Ｆｉ％に大きい
。

本発明では°これらの体液を１除蛋白等の前処理操作を
することなく直接クロマトグラフに注入することができ
る。注入された体液はその成分によって主としてグルの
分子ふるい作用に基ついて湿量される本のと、さらに吸
着又は分配の作用が加わって溶出されるものがあるため
、浴出彼に検Ｗされるピークは分子ふるい単独で分離す
る場合よＶ屯多い。

液体クロマトグラフィーにおいて５ｉＪｋ２　Ｏような
分離像ｍｔ推定する指標として、分配係数（Ｋａ）があ
り、次式て表わされる。

Ｖｌ−ｖ。

Ｋｄ＝ｖＩ ｖｌ：溶出容量 ｖｏ：充填カラム中ｏグル粒子間空隙容量ｖＩ：充填カ
ラム中のｒル粒子内孔量 陶は式からもわかるよりに被分離物質のｒル相と移動相
との分配状ｍｔ表わす、被分離物質がグルとの関に相互
作用のない状態て行なわれるＧＰＣの場合［Ｋ、１が１
以下でかっＶｌが大体ＧＰＣの検量線て予測される値に
なる。またグルと親和性が大きく吸着、分配し易いもの
ではｖｌがＧＰＣの検量線て予ｍ畜れる値よ〕も大きく
なり、がっ、Ｋ４が１以上になるもの４ある。

以下余白 本発明において、分子ふるい作用は、少なくともデキス
トラン又はＩリエチレングリコールが分子１の大きいｊ
−に溶出すること、つまりＫｄが１以下で分子蓋が小さ
いほどＫｄが大きくなることで確Ｖでき、また吸着また
は分配は尿酸の溶出容重がデキストラン又は４リエチレ
ングリコールの検ｔｉから予想される値よりも大きくな
り、Ｋｄが１．２〜５．０の範囲にあることで確關でき
る。したがって本発明における体液成分の分離は、デキ
ストラン又はポリエチレングリコール、尿及び尿酸のＫ
ｄが前記範囲にある条件下で行なうことが好ましく、良
好な分離が可能になる。尿酸のＫｄは１．２〜３０の範
囲にあることがさらに好ましい。

また蛋白質を多量に含む体液の場合は、前記条件に加え
て蛋白質のＫｄがＯ〜１．０の範囲にある条件下で行な
えば、蛋白質のデルへの吸着によるカラム性能の低下を
き九すことがなく、シかも迅速で高度な分離が可能にな
る。

このように分子ふるいと分配、吸着とを同時に起こさせ
て多数のピークを検出する場合、分離に用いる充填カラ
ムは全多孔質デルの高密度かつ均一な充填状態を有する
ものを用いるのが良い、このような充填状態の力２ムを
用いることでピークをシャー７’に検出することが可能
になり、より多数のピーク管検出できるようになる。充
填カラ人中のデル床の均一度は、ＧＰＣ分離分離横動い
て一定条件下で測定して得られた理論段相当高（Ｈ＊１
ｇｋｔ　ｉｃｑｕｌｖａｌｅｍｔ　ｔｈｅ　ａ　Ｔｈ＊
ｏｒｓｔｔｃａｌＰｌａｔｏ　、略し−ｒｕｚｔｐ）を
ｆ　４　（ＩＦ均粒径（Ｄ、）で割りた値、坤ちｎｚｔ
ｉｓ／Ｄｐが相対的危目安となる。

本発明で用いるカラムのデル床の均一度はＨｗＴｐ／Ｄ
、が２．０〜４．０１好壕しくは２．５〜３５の範Ｈに
あるのが良い、預け？／Ｄｐが４．０以上では分離能が
低下しやすくなり、２．０以下のカラムは高分離能が期
待されるが再現性喪〈作製することが困難になる。　Ｈ
ＩＣＴＰはクロマトダラフィー実行の際の移動相の組成
や溶質種等、によってその値が異なる場合があるので、
本発明ていうＨ酊Ｐとは、溶質としてエチレンダリコー
ルのｌチ水溶液を用い、蒸留水を溶離液、温度２５℃、
移動相の流速（空塔速度として）　１．５　ｍ／Ｈｒと
し７た場合に得られる値と定義する。またり、はコール
タ−カウンター（米国コールタ−エレクトロニクス社）
を用いて測定され、粒子径ｄｌの表われる頻度をｎｌと
すれば次式で求められる。

さらに本発明で用いる充填カラム＃ｉグル粒子間空隙容
１１（Ｖ。）、デル粒子内孔１ｔ（Ｖｔ）及び充填密度
（Ｐａ）が適当な範囲にあることによってより一層ｉｌ
ｌ、度の分離が可能になり、Ｃｖｔ／Ｖｏ）が１，０〜
２．０、好ましくは１．２〜１．８、またＰｄＦｉＯ，
６２以上、好オしくけ０．６６以上にあるのが良い。小
粒径のデルを用い高速で高度の分離を必要とする高速液
体クロマトグラフ（−の場合は、〔■πν糎〕、（Ｖ（
ｚ〜。〕及びＰｄが前記範囲にあることが特に好ましい
。Ｖｌはカラム内に保有するデルの乾燥重量ａにデルの
保水量Ｗ１奢乗じて求め、■ｏはカラムの空塔容積をＶ
ｌ、）ｆ″ルの基質容積をＶｇ−ａ／ｄとしてＶ。＝ｖ
ｔ−（ｖｌ＋ｖｇ）　ヨり求めらレル−１＆Ｐ４１ｄ１
−（Ｖｏ／Ｖｔ）として算出できる。さらに保水ｌ。

Ｗｒは乾燥ｌ’ＪＬ１１が粒子内部に含みうる水（ＩＩ
）のことで、蒸留水と十分平衡にしたデルを遠心分離器
にかけてデル表面に付着している水を除去したのち、そ
の重量（Ｗｔ）及び乾燥後の重量（Ｗ鵞）を求め次式に
よって求める仁とができる。

ｗｌ　−ｗ。

Ｗ−″　ｗ３ とコロ’ｔ”　［Ｖ１／〜＠）ｅＰ４−及びＷｒの相Ｗ
ａＦｉで表わされる０本発明で用いる充填カラムのＰｄ
はＷｒとの関連で調和をはかることが肝要であり、そう
する仁とにより　ＨＩ’ｒＰ／Ｄ、を損なう仁とのない
高密充填が達成される・ このような充填カラムを得るためＫＦｉ、充填時に、デ
ル床に急激な圧力あるいは液流の負荷を４えない配慮が
望ましい、−＃：、とえばデルスラリーをカラム内に導
入してデル床を形成させるとき、デルスラリーのカラム
内流速を０２〜１．５　ｍ／ｈｒ［！Ｍ！整しでカラム
内容積に対する流出液の前置の比が１以上の間、上記の
流速を保持してｒル床を形成させると良い。充填密度を
さらに高くする場合はｒル床１１１１あたりの最大昇圧
連間を１分間あたり６０　ｋｙ／＋＋ｗ”以下、好まし
くは４０　ｋｇ７ｍ”以下で平均外圧速度を１時間あた
り２〜８０１／（Ｍ”で連続あるいは断続的に昇圧する
と良い。このようにして形成されたｒル床は高密度で均
一なものとなりｒルの％性を十分に引き出した良好なカ
ラムが得られる。更に詳細には、特願昭５６−１７９８
５号明細書に記載の通りである。

分子ふるいと分配、吸着とを四時に起こさせることは、
ｒルや溶離溶媒を適当に選択することによって可能にな
る。

ｒルは水まだは水溶液中でのＣ，ＰＣに用い得る程度の
親水性、死目、孔径分布及び機械的強度をもち、同時に
被分離物質によちては分配または吸着作用を示し得る官
能基を有するものが良い。ｒルの親水性は水酸基、アミ
ド基、エステル基等の非イオン性官能基に基づくことが
好ましく、中でも水酸基は％に好ましい、死目は保水量
（ｗ７）がその目安となり、０５〜３０１／ＩＩの範囲
にあるのが良く、より小粒径での機械的強度を必要とす
る高速液体クロマトグラフィーの場合Ｆｉ０．８〜２．
０１／ｌの範囲にあるのが好ましい、またｒルの平均粒
径は実施するクロマトグラフィーの目的に応じて設定す
るのが好ましいが、一般には、５〜５００　ｓｍの範囲
にあるのが良く、高速液体クロマトグラフィーに用いる
場合は６〜２０ｓｒｍが好オしく、６〜１５声■の範囲
にあるのかさらに好ましイ、コノヨウなｒルの一例とし
ては、カルがン酸ビニルエステルとインシアヌレート環
を有する架橋性単量体をこれらの単量体を溶解するが、
水に嬉解しにくい有機＃ｌ媒の共存下に懸濁重合を行な
い、得られ九粒状共重合体のエステル基の８０％以下を
エステル交換まえはケン化せしめて得られるものがある
。

カルｌン酸ビニルエステルとしては酢酸ビニル、プロピ
オンｌｌＣニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニルおよびピノ
童すン駿ビニルの中から単独又は二種以上の組合せで用
いられ、なかでも重合やエステル交換またはケン化及び
入手の容易さから酢酸ビニルやプロピオン酸ビニルが肴
に好まし、い。

インシアヌレート環を有すゐ架橋性単量体としては、ト
リアリルインシアヌレート、ノアリルデローｆイルイソ
シアヌレートなどがあるが、トリアリルイソシアヌレー
トはカルＩン酸ビニＡエステルとの共重合性が良く、エ
ステル交換やケン化に対しても安定性が大きいので好オ
しい。用いるカルメン酸ビニルエステルとインシアヌレ
ート環を有する単量体の割合は、次式で表わされる架橋
度Ｘが０．２以上、好ましくは０２〜０．４の範囲にあ
るように設定するのが良い。

ここでａはカルゲン酸ビニルエステルのモル数、ｃはイ
ンシアヌレ−）１１！を有する単量体のモル数である。

さらに前記単量体を懸濁共重合させる際に、共重合体に
・トマネント−７を形成させるとと１に、そのＩアの死
目、孔径分布を制御するために、ドブチルエーテル、シ
ー２−エチルへキシルエーテ４％のエーテル化合物、ブ
タノール、へブタノ−の一種以上を単量体に加える。有
ＩＩＩ溶媒は単量体で用いられる。高速液体クロマトグ
ラフィー用ｒ共重合体の孔径あるいは孔径分布を制御す
るた重合によって得られた粒状共重合体を、水やアルコ
ールを溶媒とし、酢やアルカリを用いてケン化又はエス
テル交換を行なう。エステル交換又はケン化反応は、エ
ステル基の８０−以下、好オしくけ４０〜８０％が反応
して水酸基になるよう、溶媒、温度、時間等の反応条件
を設定するのが良い。

このようなグルの製法の例やケン化率の求め方の鮮細は
ｔ＋！ｆ願昭５５−１８３７０３号明細書に記載の通り
である。

本発明でクロマトグラフィーに用いる移動相は、分子ふ
るいと分配または吸着とを同時に起こらしめるように考
慮してグルや被分離物質に応じて、純水、塩化す）　Ｉ
Ｊウム水溶液、塩化カリウム水溶液、酢酸ソーダ水溶液
、リン酸ソーダ水溶液、トリスヒドロキシメチルアミノ
メタン水溶液等の中から濃度や−を調整し、単独又は混
合して用いられる。たとえば酢酸ビニル−トリアリルイ
ノシアヌレート共重合体をケン化してなるグルを用い、
血清や血漿を注入して分離する場合は、塩化ナトリウム
−リン酸ソーダ水溶液を用いるのが良い。

本発明の液体クロマトグラフィーによる体液成分の分離
においては、血清や血漿等の蛋白質を多量に含む体液で
も直接注入することができる。サンプル液は有形成分を
含んでいなければ良く、前処理がほとんど不要である。

しかも移動相が一定組成のため、分離中の移動相の置換
や分離後の再置換が不要で繰に返し迅速に注入可能であ
り、かつ溶出容量やピーク高さ郷りロマトダラム全体の
再現性も良い。さらに分子ふるいと分配、吸着の分離作
用が同時に働く丸め、蛋白質等のグルへの不可逆吸着に
よる充填カラムの性能低下がなく、検出されるピークは
ＧＰＣ単独によるものよりも多い、このように本発明の
方法は体液サンプリング後直ちに分析できて、情報量が
多くＮｉＮ性の良いクロマトグラムを得ることができる
ため、臨床検査に用い九場合患者の病態に関する情報を
迅速に得ることができて直ちに油壷に結びつけることが
できる。このようなことは本発明ではじめて可能になっ
た。さらに本発明が体液中の有用又は有害酸分の分離に
も葎めて好都合であることけ舊うまでもない。

以下に本発明方法の実施例を示すが、本発明の範囲をこ
れらの実施例に限定するものでないことはいうまでもな
い。

実施例１ Ｆｌｌ［［’＝ニル１００、）！ｊアリルイソシアヌレ
ー１３５．７１ｉ、酢酸ｎ−ブチル９５ｇ、及び２，２
′−アゾビスインブチロニトリル３．３Ｎよりなる均一
混合液と、少量の／＋Ｊビニルアルコール及び…緩衝剤
を溶解した水８００ｄとを２ｔフラスコに入れ、十分攪
拌したのち６５℃で１８時間、さらに７５℃で５時間加
熱攪拌して懸濁重合を行ない粒状共重合体を得だ、濾過
、水洗、次いでアセトン抽出後、カセイソーダ４７Ｉｉ
及びメタノール２１よりなる溶液中で１５℃で２０時間
共重合体のエステル交換反応を行なった。得られた粒子
を分級して平均粒径（Ｄ、）９．５μｍのグルを得た。

ダルの水酸基密度から求めたケン化率は６４％で、ｗｒ
ハ１．５０９／Ｉであった。次にこのグルを７ｇ（乾燥
重量あたり）を０．２　Ｍ／１Ｎａ２８０４水溶液１０
０Ｊｌｊ＃ＰＫ−夜浸漬して膨潤させた抜、超音波ホモ
ジナイザーを用いて５分間分散させ、内径７．５冨諺。

長５２５０關のステンレスカラム、内径が同じで長すが
１００ｇｏ＋のステンレスのプレカラム、内容積１００
ｍ１．のノダッカーの順で接続され、あらかじめ０．２
　Ｍｌｌ　Ｎｍ、８０４水溶液で・９力−出口ｔ”ｔ’
満たし九ツタツカ−にｒ、ル、スラリーを投入し九、パ
ッカー密對談ｉ４ツカー上部に設けた充填液供給口より
　０２　Ｍｌｌ　Ｎａ、ｓｏ４水Ｓ＊を０．５　ｌｌｌ
ｌ分で６０分間通液しグルスラリーをカラム内に導入し
グル床を形成させた０次いで最大昇圧速度５　ｋｌ／ｌ
ｘ”　／分以下でかつ平均外圧速度５　ｋｌ／ｅｓ”　
／時間で充填液の流量を段階的に増し、カラムの入口圧
力が各々２４　＃／ｍ婁、　４３　ｋｌ／ｃｘａ”　、
及び５２　ｋｉｔ／ｅｘｓ”に到達後同一圧力で２時間
充填液を流しつづけた。その後・臂、カー及びプレカラ
ムを取りはずしエンドツイツチ（ングでグル床を固定し
充填カラムを得た。

さらに同じグルを用い同様の充填操作を繰返して充填カ
ラムをもう１本書た。前述したように１９Ｇエチレング
リコール水溶液を＃；％、純水を溶離溶媒としてそれぞ
れのカラムのＨＥＴＰ／Ｄ、を求めたところ２９及び２
６であった。さらに袴々の分子ｔｕ知のデキストラン及
びポリエチレングリコールを分析して得た分子量と溶出
容％の関件、つまり検ｔｍけ第１図の通りでそれぞれ分
子１の大睡い順に溶出することがＭｕされた。次に０３
Ｍ／１ｌＮａＣ１および０．１　Ｍ／ｌリン酸ナトリウ
ムを含むｐＨ７，０の水溶液を溶離液として重版の人血
清グロブリン（ＩｇＧ）、人血清アルブミンを分析した
ところ、いずれも回収率約１００−でかつｒル粒子間空
隙容量に相当すると思われる溶出容量付近で溶出し７た
。また尿酸は同様な条件における溶出容量は１３．７１
／及び１３８ｔ７でＩリエチレングリコールの検量線か
ら予」される値（８〜９ＩＬｔ）よりもかなり大きい値
を示した。これらのことから蛋白質はｒルの外側を素通
択しかつ吸着されずに溶出するのに対して、尿酸はｒル
への分配または吸着作用が働いて溶出容量が大きくなる
と推定される。

さらに２本のカラムを連結して同様な条件で透析治療を
行なっている腎臓病患者の血清を直接注入して分析した
ところ第１図の多数のピークを、もつクロマトグラムを
得た。同じ血清を１ｏ回分析し友が、各ピークの位置、
高さ郷はとんど同じクロマトグラムを再現性良く得るこ
とができた。最°後にカラム中のｒルを抜きとってｒル
を乾燥し、明細書中に示し友方法てＶ・及びｖｌを求め
分配係数Ｋｄを計算したところ次表のようになった。デ
キストラン及びぼりエチレングリコールは１以下でかつ
分子量の小さいほどに４は大逼くなシ、尿酸は１．９で
高い値を示した。これらの仁とから分子ふるい及び吸着
又は分配の両件用の存在を確認できた。

以下余白

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で作製した充填カラムの１本を用いて
測定したポリエチレングリコール（三角印）、及びデキ
ストラン（丸印）の溶出客層：と分子量の対数の関係を
表わすグラフ図である。 第２図は実施例１で作製した充填カラム２本を連結して
用い、腎臓病患者の血清を＋に接注入して得られたクロ
マトグラムである。 第１図 数 溶出容−二（ｍｌ）−→

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １４体クロマトグラフィーにより体液成分會分離するに
   あ九シ、一定組成の移動相ｔｆｉＬっつ有形成分を含ま
   ない体液を直接注入し、分子ふるいと吸着または分配と
   【同時に起こさせながら行なうことｔ−特徴とする体液
   成分の分離方法。 ２、次式で表わきれる分配係数（Ｋａ）がデキストシン
   又はポリエチレングリコールについては分子量が小さい
   ほど大きくなり、尿酸については１．２〜５．０の間に
   ある条件下で行なう％軒請求の範咄第１項に記載の体液
   成分の分離方法。 Ｋｄ＝ｖ、−ゝ ｉ ■Ｒ：溶出容量。 ■ｏ：充填充填カラムダル粒子間空隙 容量。 ｖｌ：光横カラム中のグル粒子内孔量・３、全多孔質グ
   ルの高置充填床からなり本文中に定義したＨｉ：ＴＰ／
   Ｄ、て示されるグル床の均一度が２．０〜４．０″′ｃ
   Ｔｏる充填カラムを用いる特許請求の範■＠１ｍ又は第
   ２項に記載の方法。