JPS5816683A - Protease and its preparation - Google Patents
Protease and its preparationInfo
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- JPS5816683A JPS5816683A JP56114417A JP11441781A JPS5816683A JP S5816683 A JPS5816683 A JP S5816683A JP 56114417 A JP56114417 A JP 56114417A JP 11441781 A JP11441781 A JP 11441781A JP S5816683 A JPS5816683 A JP S5816683A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、プロテアーゼ及びその製法に関する。さらに
詳しくは抗炎症効果の優れたプロテアーゼ及びこのプロ
テアーゼを微生物によって製造する方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a protease and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a protease with excellent anti-inflammatory effects and a method for producing this protease using microorganisms.
従来1微生物のプロテアーゼとしては、かび、細菌、放
線菌からの産生が知られている。Conventionally, proteases produced by microorganisms are known to be produced by fungi, bacteria, and actinomycetes.
また、消炎プロテアーゼとしては、セラチアnからのダ
ーゼン■(武田薬品工業KK)、ストレプトミセス・グ
リセウスによるエンビナース■(科研化学KK)、スト
レプトミセス・スバルソゲネスによるプロテアーゼ55
−11 A、バチルス・スフエリカスによる新規プロテ
アーゼであるバチロペブチターゼ・0等が知られている
。In addition, anti-inflammatory proteases include Dazen■ from Serratia n (Takeda Pharmaceutical KK), Enbinase■ from Streptomyces griseus (Kaken Kagaku KK), and protease 55 from Streptomyces subvarsogenes.
-11 A, Bacillus sphaericus, a novel protease, Bacillus pebutitase 0, etc. are known.
これらのプロテアーゼを消炎剤として用いる場合には、
これらが蛋白質であるため、多量に投与できないという
制約があり、少量の使用で効果のある消炎活性の高い、
すなわち比活性の高いプロテアーゼが求められていた。When using these proteases as anti-inflammatory agents,
Since these are proteins, there is a restriction that they cannot be administered in large quantities.
In other words, a protease with high specific activity has been sought.
また消炎プロテアーゼの至適pHは、生体内と同じく中
性に近いものが求められていた。In addition, the optimal pH of anti-inflammatory protease has been required to be close to neutral, just as it is in living organisms.
本発明者らは、これらの点に注目し、比活性の高い中性
プロテアーゼについて検討した結果、消炎酵素活性の優
れたプロテアーゼを見出し、本発明に至った。The present inventors paid attention to these points and investigated neutral proteases with high specific activity, and as a result, discovered a protease with excellent anti-inflammatory enzyme activity, leading to the present invention.
本発明はまた、このプロテアーゼの好適な製造−方法に
関するものであり、バチルス属に属する微生物を利用し
て消炎性の優れたプロテアーゼを製造する方法に関する
。The present invention also relates to a suitable method for producing this protease, and relates to a method for producing a protease with excellent anti-inflammatory properties using a microorganism belonging to the genus Bacillus.
すなわち本発明は、下記の特徴を有するプロテアーゼM
TK−56である。That is, the present invention provides protease M having the following characteristics.
It is TK-56.
(a) 分子量: 56.000 (ゲルp過法)(
b)紫外線吸収スペクトル=275〜280nmに極大
吸収を有し、245〜255nmに極小吸収を有する。(a) Molecular weight: 56.000 (gel p-filtration method) (
b) Ultraviolet absorption spectrum: maximum absorption at 275-280 nm and minimum absorption at 245-255 nm.
(C) 等電点: pI=8.9t−0,1(d)
溶解性:水に可溶であるが、アセトン、ベンゼン〜ヘ
キサン、クロロホルムには不溶。(C) Isoelectric point: pI=8.9t-0,1(d)
Solubility: Soluble in water, but insoluble in acetone, benzene to hexane, and chloroform.
(e) pH作用性:カゼインを基質として使用した
蛋白質分解活性の好適Illは、6〜8であり、pH6
・5〜7.5に至適pHを有する。(e) pH effect: The preferred Ill for proteolytic activity using casein as a substrate is 6 to 8;
・It has an optimum pH of 5 to 7.5.
(t) pH安r性:57℃、311分+7)処理テ
Lt、pH6〜10の範囲で、8o%以上の活性を示し
安定である。(t) pH stability: 57° C., 311 minutes + 7) Stable, showing activity of 80% or more in the pH range of 6 to 10.
(g) 作用適温の範囲=カゼインを基質として使用
した蛋白質分解作用の適温は、55℃〜6o℃であり、
至適温度は約50℃である。(g) Range of suitable temperature for action = The suitable temperature for proteolytic action using casein as a substrate is 55°C to 6o°C,
The optimum temperature is about 50°C.
(1,) 阻害: ffDTA及びジピリジルによっ
て阻害され、阻害の程度はEDTA>ジピリジルである
。(1,) Inhibition: Inhibited by ffDTA and dipyridyl, the degree of inhibition is EDTA>dipyridyl.
パ5クロロマーキュリツクベンゾニー)、(POMB)
、フルオロリン酸ジイソプロピル、及び大豆由来のトリ
プシンインヒビターは、本件プロテアーゼMIC−56
の活性に影響を与えない。またHg′+、Fe科及びO
a++にょっても阻害されるが、その程度はHg+F>
F e+F〜a a” テアル。5 chloromercuric benzony), (POMB)
, diisopropyl fluorophosphate, and soybean-derived trypsin inhibitor are the protease MIC-56.
does not affect the activity of Also Hg′+, Fe family and O
It is also inhibited by a++, but the extent is Hg+F>
F e+F~a a” Theal.
(1) pH及ヒm度ニョル失活c7)条件” 1)
H4,0%57℃、30分間て、70%以上が失活する
。一方、pHjD、 37℃、10分間テノ失活は、2
0%以下テアル。サラニpH7,70℃、10分間で完
全に失活する。(1) pH and temperature inactivation c7) conditions” 1)
More than 70% of H4.0% is deactivated at 57°C for 30 minutes. On the other hand, teno inactivation at pHjD, 37°C for 10 minutes was 2
Less than 0% teal. Sarani pH 7, 70°C, completely inactivated in 10 minutes.
また本発明は、プロテアーゼの好適な製造方法に関する
ものであり、バチルス属に属し、プロテアーゼMTK−
56を生産する細菌を、培地において好気的条件下で培
養し、培養物からプロテアーゼMTK−56を採取する
ことを特徴とするプロテアーゼMTE−56の製造方法
に関する。The present invention also relates to a suitable method for producing protease, which belongs to the genus Bacillus and contains protease MTK-
The present invention relates to a method for producing protease MTE-56, which comprises culturing bacteria that produce MTE-56 in a medium under aerobic conditions, and collecting protease MTK-56 from the culture.
本発明で使用されるプロテアーゼMTE−56生産微生
物は、プロテアーゼMTRニー56を生産することがで
きるバチルス属に属する全ての菌株、突然変異株および
変種を包含する。中でもとくに好ましい菌株は、本発明
者が土壌の中から採取した消炎酵素活性の著しく高い菌
株MT2051である。The protease MTE-56 producing microorganism used in the present invention includes all strains, mutants and variants belonging to the genus Bacillus that are capable of producing the protease MTRnee-56. Among these, a particularly preferred strain is strain MT2051, which was collected from soil by the present inventor and has extremely high anti-inflammatory enzyme activity.
以下に本菌株の菌学的性質を記す。The mycological properties of this strain are described below.
(a) 形態的性質
ブイヨン寒天上で37°02日培養した栄養細胞は、0
.7〜1.2X5〜10ミクロンの桿菌である。(a) Morphological properties Vegetative cells cultured on bouillon agar for 37°02 days
.. 7-1.2 x 5-10 micron rods.
細胞は1ケ又は2ケが連結して存在する。30℃2日〜
6日の培養で胞子の形成が認められる。One or two cells exist connected together. 30℃ 2 days~
Spore formation is observed after 6 days of culture.
胞子は主として胞子のう中央にでき、端にも生ずる。大
きさは直径0.7〜1.2 X 1.2〜2.5の円筒
形である。運動性があり、ダラム染色は陰性で抗酸性で
ある。Spores are formed mainly in the center of the sporangium, but also at the edges. The size is cylindrical with a diameter of 0.7 to 1.2 x 1.2 to 2.5. It is motile, Durham staining is negative, and it is acid-fast.
(b) 各培地における生育状態
(1)肉汁寒天平板および肉汁寒天斜面培養28℃にお
いて表面平滑で光沢のあるコロニーが生育する。コロニ
ーは金縁(entlre)であり、28℃、2週間の培
養で直径が8〜10mmになる。色は鈍黄色(buff
)、著しく粘稠。(b) Growth status in each culture medium (1) Broth agar plate and broth agar slant culture Colonies with smooth surfaces and gloss grow at 28°C. Colonies have golden edges and become 8-10 mm in diameter after two weeks of culture at 28°C. The color is dull yellow (buff)
), noticeably viscous.
(2)加糖寒天斜面培養 普通寒天斜面より生育が良好で、表面の光沢も著しい。(2) Sweetened agar slant culture Growth is better than on ordinary agar slopes, and the surface is also noticeably glossier.
(3)食塩添加肉汁培養 5%食塩添加で生育しない。(3) Salt-added meat juice culture Will not grow with addition of 5% salt.
(4)肉汁液体培養
1〜2日で皮膜状となり、やがてかなり厚い粘性の扁い
ゲル状の膜になる。沈殿は、ごく少ない。(4) Meat juice becomes a film after 1 to 2 days of liquid culture, and eventually becomes a fairly thick, viscous, flat gel-like film. There is very little precipitation.
(5)肉汁ゼラチン穿刺培養 22℃、1週間で液化する。(5) Meat juice gelatin puncture culture It liquefies in one week at 22°C.
(6) リドマスミルク
すみやかに脱色する。皮膜が形成され、やがてペプトン
化する。また2〜3日でミルクの凝固がおこり、白い塊
を生ずる。(6) Promptly decolorize lidmus milk. A film is formed and eventually turns into peptone. In addition, milk coagulation occurs within 2 to 3 days, producing white lumps.
(7)グルコース、アス′パラギン寒天培養生育する。(7) Growth on glucose and asparagine agar.
(2) MRテスト 陰性(3
) VPテスト 陰性(4)イ
ンドールの生成 陰性(5)硫化水素の
生成 陰性(6)でんぷんの加水分解
陽性(7) クエン酸の利用(Kos
er’s) 陰性(8)無機窒素源の利用
硝酸塩 利用しない。(2) MR test negative (3
) VP test Negative (4) Production of indole Negative (5) Production of hydrogen sulfide Negative (6) Hydrolysis of starch Positive (7) Utilization of citric acid (Kos
er's) Negative (8) Use of inorganic nitrogen sources Nitrate Do not use.
(ウイッケルハムの合成培 地で) アンモニウム塩 利用する。(Wickelham's synthetic medium on the ground) Use ammonium salt.
(同 上) (9)色素の生成 認められない。(Same as above) (9) Formation of pigment was not observed.
(10)ウレアーゼの生成 陽性(著しい)(11
)カタラーゼ 陽性
(1の生育の範囲
pH4,5〜8.5で生育し、pH6〜8が最適である
。温度は5ON38℃が最適であり、45℃までは生育
しているが、50℃を越えると生育しない。(10) Urease production positive (significant) (11
) Catalase positive (growth range of 1) Grows at pH 4, 5 to 8.5, optimally at pH 6 to 8. Optimum temperature is 5ON at 38°C, grows up to 45°C, but grows at 50°C If it exceeds it, it will not grow.
(13) #素に対する態度 好気性である。しかし嫌気的状態でも生育可能である。(13) # Attitude towards basics It is aerobic. However, it can also grow under anaerobic conditions.
(14)糖類の資化性、酸の生成及びガスの発生本菌株
の諸性質をバージニーのマニュアル・オプ・デイターミ
ネーテイブ・バクテリオロジ−(Bergey’s M
anual of DeterminativeBaa
teriology) 1975年版により調べると、
バチルス属に属するが、既知の種に相当するものがない
。(14) Sugar assimilation, acid production, and gas production The various properties of this strain were determined using Bergey's Manual Op Determinative Bacteriology (Bergey's M
annual of DeterminativeBaa
According to the 1975 edition,
It belongs to the genus Bacillus, but there is no known equivalent species.
従って本菌株をバチルス属の新種と判定し、バチルス・
イワクニエンシス・ノボ・スベーシーズMT2031(
Bacllus iwakuniensis −n、
Sp。Therefore, this strain was determined to be a new species of the genus Bacillus, and
Iwakuniensis novo subbases MT2031 (
Bacillus iwakuniensis-n,
Sp.
MT2031)と命名した。It was named MT2031).
本発明のプロテアーゼMTE−56を生産するには、例
えば上記のバチルス属の新種バチルス・イワクニエンシ
スMT−2031を、炭素源、窒素源、塩類その他の物
質を含有する培地に接種し、適当な温度、例えば約28
〜35℃で、酵素力価が最高に達するまでの適当な時間
、振とう又は通気攪拌培養して生産する方法がある。と
くに酵母菌体を含む培地や、大豆粕を含む培地を用いれ
ば、プロテアーゼMTK−56の生産量を増加させるこ
とができる。To produce the protease MTE-56 of the present invention, for example, the above-mentioned new species of Bacillus, Bacillus iwakuniensis MT-2031, is inoculated into a medium containing a carbon source, a nitrogen source, salts and other substances, and an appropriate temperature, e.g. about 28
There is a method of producing the enzyme by culturing with shaking or aeration at ~35°C for an appropriate period of time until the enzyme titer reaches its maximum. In particular, the production amount of protease MTK-56 can be increased by using a medium containing yeast cells or a medium containing soybean meal.
上記のようにして培養された培養物は、遠心分離、濾過
などの方法で清澄にした後、この清澄液に例えば硫酸ア
ンモニウムを加えて目的の酵素を沈でんさせ、採取する
ことができる。またさらにイオン交換樹脂、ゲルー過法
を利用して、上記沈殿物を精製して、極めて活性の高い
プロテアーゼかくして得られた新規のプロテアーゼMT
E−56の理化学的性質を以下に示讐。The culture cultured as described above is clarified by centrifugation, filtration, or the like, and then, for example, ammonium sulfate is added to the clarified liquid to precipitate the enzyme of interest, and the enzyme can be collected. Further, the above precipitate was purified using an ion exchange resin and a gel filtration method, and a novel protease MT with extremely high activity was obtained.
The physical and chemical properties of E-56 are shown below.
(1)作用
カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用の好適p
Hは、図2に示す如く、6〜8であり、至適pH6,!
5〜7.5の中性プロテアーゼである。(1) Preferred p for proteolytic action using casein as a substrate
As shown in FIG. 2, H is 6 to 8, and the optimum pH is 6,!
5-7.5 neutral protease.
(2) 基質特異性
各種蛋白質に対する相対分解速度を表2に示した。なお
市販の酵素ダーゼン■の文献値を併表2.相対分解速度
”
(3) 至適pH
カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用における
pHの影響を図2に示す。至適pHは6.5〜7.5で
ある。(2) Substrate specificity Relative degradation rates for various proteins are shown in Table 2. In addition, the literature values of the commercially available enzyme Dazen ■ are also listed in Table 2. Relative Decomposition Rate" (3) Optimal pH Figure 2 shows the influence of pH on proteolysis using casein as a substrate. The optimal pH is 6.5 to 7.5.
(4) pH安定性
各種pHで57℃、30分間加熱後の残存活性を測定し
た結、果を図3に示す0
pH6〜10の範囲で80%以上、I)H6,5〜9の
範囲で、90%以上の残存活性を示した。(4) pH stability The residual activity after heating at 57°C for 30 minutes at various pH values was measured, and the results are shown in Figure 3. It showed residual activity of 90% or more.
(5)力価の測定法
蛋白質分解活性の測定は、Kunitzの方法を一部改
変して(pHを9.0から7.5に変更して)行った。(5) Measurement of titer The proteolytic activity was measured by partially modifying the Kunitz method (by changing the pH from 9.0 to 7.5).
すなわち、2.0%ハマルステン氏法カゼイン液1−0
m/s (L2M )リス塩酸緩衝液(pH7,5)
0−5Jおよび酵素液0−5m1からなる反応液を用い
157℃で10分間インキュベートした。反応直後に5
%トリクロル酢酸(TOA)液3.OJを加え、攪拌し
て反応を停止し、50分間放置したのち、遠心分離(3
000rpm)シた。上清のOD275nmを測定し、
酵素液のかわりに水0.5c++5を反応液に加えて反
応して得たTOA上清を対照とし、対照のOD と
の差を求めた。チロシンの27575nm
nmでの吸光係数からOD の値をチロシン275
n重
量に換算し、上記条件下で、1分間に1μgのチロシン
をTCA上清中に生成する酵素量を1unitとして活
性を表示した。なお、1μg/m11のチロシン液(3
%TOA中)のOD は、0.0073575n
m
であった。That is, 2.0% Hammarsten casein solution 1-0
m/s (L2M) Lis-HCl buffer (pH 7,5)
A reaction solution consisting of 0-5 J and 0-5 ml of enzyme solution was used and incubated at 157°C for 10 minutes. 5 immediately after the reaction
% trichloroacetic acid (TOA) solution 3. Add OJ, stir to stop the reaction, leave for 50 minutes, and centrifuge (3
000rpm). Measure the OD275nm of the supernatant,
A TOA supernatant obtained by adding 0.5c++5 of water to the reaction solution instead of the enzyme solution was used as a control, and the difference in OD from the control was determined. 27575 nm of tyrosine The value of OD from the extinction coefficient at nm is 275 nm of tyrosine.
The activity was expressed in terms of n weight, and the amount of enzyme that produced 1 μg of tyrosine in the TCA supernatant per minute under the above conditions was defined as 1 unit. In addition, 1 μg/ml tyrosine solution (3
%TOA) is 0.0073575n
It was m.
(6)至適温度及び嚇定温度範囲
カゼインを基質として使用した蛋白質分解作用の温度依
存性を図4に示す。本酵素の作用最適温度は約50℃に
ある。(6) Optimal temperature and threat temperature range Figure 4 shows the temperature dependence of proteolytic action using casein as a substrate. The optimum temperature for the action of this enzyme is about 50°C.
また温度安定性を図5に示す。本酵素は40℃以下で安
定であり、50℃では約90%の残存活性がある。Furthermore, temperature stability is shown in FIG. This enzyme is stable at temperatures below 40°C, and has approximately 90% residual activity at 50°C.
(乃 pHおよび温度による失活の条件図3に示す如<
、pH4以下で急速に失活し、pH4,0,37℃、3
0分間で約80%が失活した。(Conditions for inactivation by pH and temperature as shown in Figure 3)
, rapidly deactivated below pH 4, pH 4.0, 37℃, 3
Approximately 80% of the activity was inactivated in 0 minutes.
一方、アルカリ性側では比較的安定で、pH10、37
℃、60分で約10%が失活するのみである。On the other hand, it is relatively stable on the alkaline side, with pH 10 and 37.
Only about 10% is deactivated in 60 minutes at ℃.
また図5に示す如く、70℃、10分間て、完全に失活
する。Moreover, as shown in FIG. 5, it is completely inactivated at 70° C. for 10 minutes.
(8)イオン濃度の影響 リン酸緩衝液の濃度の影響を図6に示す。(8) Effect of ion concentration The effect of phosphate buffer concentration is shown in FIG.
(9)阻害剤の影響
阻害剤の影響を表5に示す。さらに金属塩による影響を
表4に示す。(9) Effect of inhibitors Table 5 shows the effects of inhibitors. Furthermore, Table 4 shows the influence of metal salts.
表 3
表 4
(10)プロテアーゼの精製方法
実施例1に示す方法で得た粗酵素サンプルは次の方法で
分離精製することができる。Table 3 Table 4 (10) Protease purification method The crude enzyme sample obtained by the method shown in Example 1 can be separated and purified by the following method.
すなわち粗酵素サンプル1gを10m/の水に溶解し、
pH6,7の30mMリン酸カリウム緩衝液(以下KP
Bと略す)で平衡化したsp−セファデックスカラム(
2,5X 60α)上部に静かに流し込み、30mMの
KPB(pH6,7)で活性p 7 ): 3p 全溶
出する。ここで得た活性画分はセファデックスG−10
0ゲルp適用カラム(2,5X100CIII)にかけ
、さらに精製する。活性画分は硫酸アンモニウム塩析(
70%飽和)で集め、透析したのち、凍結乾燥する。That is, 1 g of crude enzyme sample was dissolved in 10 m/ml of water,
30mM potassium phosphate buffer with pH 6,7 (hereinafter referred to as KP)
A sp-Sephadex column (abbreviated as B) equilibrated with an sp-Sephadex column (abbreviated as B)
2,5X 60α) and elute all active p7):3p with 30mM KPB (pH 6,7). The active fraction obtained here is Sephadex G-10
0 gel p application column (2,5×100 CIII) for further purification. The active fraction was extracted with ammonium sulfate salting out (
70% saturation), dialyzed, and lyophilized.
(11)分子量
ゲルp過法により測定した分子量は約56..000で
ある。(11) Molecular weight The molecular weight measured by gel p-filtration method is approximately 56. .. It is 000.
(12)元素分析値
0 44.3%
H6,1%
N 15.5%
0 25・5%
元素分析値は、酵素の純度により多少変化することがあ
る。(12) Elemental analysis value 0 44.3% H6.1% N 15.5% 0 25.5% The elemental analysis value may vary somewhat depending on the purity of the enzyme.
(13)紫外線吸収スペクトル
図1に示す如く、吸収極大は、約275〜280nmに
あり、吸収極小は、245〜255nmにある。(13) Ultraviolet absorption spectrum As shown in Figure 1, the absorption maximum is approximately 275 to 280 nm, and the absorption minimum is approximately 245 to 255 nm.
λ ”278nm
ax
x’、4 (278nm)= 14.1(14)アミノ
酸組成物
表5に本酵素のアミノ酸組成を示す。λ "278nm ax x', 4 (278nm) = 14.1 (14) Amino acid composition Table 5 shows the amino acid composition of this enzyme.
アミノ酸組成の割合は、酵素の純度、分析精度により多
少変化することがある。The amino acid composition ratio may vary somewhat depending on the purity of the enzyme and analytical accuracy.
表 5
(15)カラゲニン浮腫抑制活性測定法(イ)皮下投与
法
7連合で購入したWister系雄性ラットを1週間予
備飼育し、1区7匹としく対照区は1区10匹)、酵素
を生理食塩水に溶解し、5.0mll/ktiCラット
)の割合で皮下投与した。Table 5 (15) Carrageenin edema inhibitory activity measurement method (a) Subcutaneous administration method Wistar male rats purchased from 7 associations were preliminarily bred for one week, with 7 rats per group and 10 rats per group in the control group), and the enzyme was administered. It was dissolved in physiological saline and administered subcutaneously at a rate of 5.0 ml/ktiC rat).
酵素液投与1時間後に、1%カラゲニン溶液0・05m
/をラット右後肢足跳皮下に注射し、その3時間後に、
両後肢足首関節部位を切断し、両足首間の重量差を浮腫
強度として、酵素の浮腫抑制率を算出した。1 hour after enzyme solution administration, 1% carrageenan solution 0.05 m
/ was injected subcutaneously into the right hind leg of the rat, and 3 hours later,
The ankle joints of both hind legs were amputated, and the edema suppression rate of the enzyme was calculated using the weight difference between both ankles as the edema intensity.
(ロ)十二指腸投与法
7連合で購入し、1週間予備飼育し、1夜絶食したWi
ster 、1%雄性ラットをエーテル麻酔下で腹部正
中線に沿って約1備の切開を加え、十二指腸部位を引き
出した。胃の幽門部を指で軽く押え、酵素液が胃に逆流
しないようにして、十二指腸内投与を行った。投与後、
切開部位を2か所縫合して麻酔を解除した。(b) Duodenal administration method 7 Wi
In ster, 1% male rats, an approximately 1 incision was made along the abdominal midline under ether anesthesia, and the duodenal region was pulled out. The enzyme solution was administered into the duodenum by lightly pressing the pyloric region of the stomach with a finger to prevent the enzyme solution from flowing back into the stomach. After administration,
The incision site was sutured in two places and the anesthesia was removed.
酵素液を投与して1時間後に1%カラゲニン溶液0・1
mlをラット右足跳皮下に注入し、その後5時間して左
右足首の重量差を求めた。ただし予備テストにおいて麻
酔および手術の影響で正常ラットに比べ約60%の浮腫
しか得られなかったので、起炎剤の量を皮下投与の場こ
れにより、対照区に対する投与区の浮腫抑制率を算出し
た。なお対照区は1区10匹、投与区は1区7匹用い、
その平均値を算出した。1 hour after administering the enzyme solution, 1% carrageenin solution 0.1
ml was injected subcutaneously into the rat's right leg, and 5 hours later, the weight difference between the left and right ankles was determined. However, in the preliminary test, due to the effects of anesthesia and surgery, only about 60% of the edema was obtained compared to normal rats, so the amount of inflammatory agent was subcutaneously administered.From this, the edema suppression rate in the treated group compared to the control group was calculated. did. In addition, 10 animals were used in each group for the control group, and 7 animals were used in each group for the treatment group.
The average value was calculated.
(16)カラゲニン浮腫抑制活性(消炎活性)(10)
の方法で精製したプロテアーゼMT E−56を、(1
5)(イ)に示した方法で、ラットに皮下投与し1その
消炎活性を測定した。結果を表6に示す。(16) Carrageenin edema inhibitory activity (anti-inflammatory activity) (10)
Protease MTE-56 purified by the method of (1
5) The anti-inflammatory activity was measured by administering subcutaneously to rats by the method shown in (a). The results are shown in Table 6.
本発明の酵素は、市販されているエンビナース0やダー
ゼン■に比べ、ED5oの値が約4倍以上であり、著し
く優れたカラゲニン浮腫抑制活性を示している。The enzyme of the present invention has an ED5o value of about 4 times or more as compared to commercially available Enbinase 0 and Dazen ■, and exhibits extremely excellent carrageenan edema suppressing activity.
同様にして、精製された本発明のプロテアーゼを(15
)(ロ)に示す方法で、ラットの十二指腸に投与し、そ
の腸管吸収によるカラゲニン浮腫抑制活性を測定した。Similarly, the purified protease of the present invention (15
) By the method shown in (b), the carrageenan was administered to the duodenum of rats, and the carrageenan edema-inhibiting activity by intestinal absorption was measured.
結果を表7に示す。The results are shown in Table 7.
本発明の酵素は、市販のエンピナース■〜ダーゼン■に
比べ約6.5倍以上の活性を示していまた、本発明のプ
ロテアーゼMTK−56と、市販されているダーゼンの
、エンピナース■の諸本発明のプロテアーゼMTE−5
6は1表8に示す如く、プロテアーゼとしての比活性が
著しく高い。また表6及び表7に示す如く、消炎活性が
従来知られている酵素に比べ著しく高いものである。The enzyme of the present invention exhibits approximately 6.5 times more activity than the commercially available Empinase ■ to Dazen ■. protease MTE-5
As shown in Table 1, No. 6 has a significantly high specific activity as a protease. Furthermore, as shown in Tables 6 and 7, the anti-inflammatory activity is significantly higher than that of conventionally known enzymes.
さらに本発明のプロテアーゼは、高力価であり、消化剤
、化粧品、洗剤、食肉の軟化剤、肉エキスの製造、絹の
精練、皮革製造、プラスティンの製造などの用途にも用
いられる。Furthermore, the protease of the present invention has a high titer and can be used for purposes such as digestive agents, cosmetics, detergents, meat tenderizers, production of meat extracts, silk scouring, leather production, and plastin production.
次に実施例を示す。Next, examples will be shown.
実施例1
表9に示す組成の培地400 mlを24容の坂ロフラ
スコに入れ、120℃、15分滅菌する。同組成の培地
で培養したバチルス・イワクニエンシスMT2031の
前培養液50m1を加え、28℃、1100rpで48
時間振とう培養した。培養液中のプロテアーゼは(5)
に示した力価の測定法で測菜、2 s 300un1t
s/m1であった。培養後、硫酸アンモニウムを30%
飽和になるよう(培養液に対し17.6%(−/v )
)に加え、攪拌して不純タンパクを析出したのち、遠心
分離(10,000rpm、 10分)して\これを除
去した。Example 1 400 ml of a medium having the composition shown in Table 9 is placed in a 24 volume Sakaro flask and sterilized at 120°C for 15 minutes. Add 50 ml of preculture solution of Bacillus iwakuniensis MT2031 cultured in a medium of the same composition, and
Cultured with shaking for hours. Protease in the culture solution (5)
Measured by the titer measurement method shown in 2 s 300un1t
It was s/m1. After culturing, add 30% ammonium sulfate.
To saturation (17.6% (-/v) to the culture solution)
) and stirred to precipitate impure proteins, which were removed by centrifugation (10,000 rpm, 10 minutes).
得られた上清に硫酸アンモニウムをさらに9o%飽和に
なるよう(上清に対し44.9%)に加え、酵素活性画
分を析出させたのち、遠心分離(10+000rpm1
0分)して集めた。集めた酵素をできるだけ少量の水に
懸濁し、透析用セロハンチューブにつめ、両端をしつか
り結んだのち、24時間ないしは48時間冷水(15℃
以下)中で透析した。透析後、不溶物を遠心分離して除
き、凍結乾燥し、得られた粉末を粗酵素サンプルとした
。これを本文(10)に示したプロテアーゼの精製方法
に従って精製し、11の培養液から0.1gのプロテア
ーゼMTE−56を表9 培地組成
実施例2
実施例1の培地の圧搾酵母の代りに乾燥酵母1%あるい
は大豆粕5%を主成分とする培地を用い、実施例1と同
様に21の坂ロフラスコを用い、バチルス・イワクニエ
ンシスMT2031を接種し、28℃でpH6,5〜7
.5の範囲にコントロールしつつ、48表10.主成分
のプロテアーゼ生産への影響実施例3
実施例1に示した石油に食塩を添加し、プロテアーゼ生
産への効果を調べた。バチルス、イヮクニエンシスMT
2051を接種後、培養は実施例1と同様に行った。結
果は表11に示したように塩化ナトリウム0.1〜0・
5%、特に0.25%添加することにより、パン用圧搾
酵母を用いても乾燥酵母(実施例2)と同配以上のプロ
テアーゼ活性が得られ表119食塩のプロテアーゼ生産
への影響Ammonium sulfate was further added to the obtained supernatant to a saturation of 90% (44.9% relative to the supernatant) to precipitate the enzyme active fraction, followed by centrifugation (10+000 rpm).
0 minutes) and collected. Suspend the collected enzyme in as little water as possible, pack it in a cellophane tube for dialysis, tie tightly at both ends, and soak in cold water (15°C) for 24 to 48 hours.
(below). After dialysis, insoluble matter was removed by centrifugation and freeze-dried, and the resulting powder was used as a crude enzyme sample. This was purified according to the protease purification method shown in text (10), and 0.1 g of protease MTE-56 was obtained from the culture solution of 11 as shown in Table 9. Using a medium containing 1% yeast or 5% soybean meal as the main component, Bacillus iwakuniensis MT2031 was inoculated using a No. 21 Sakalo flask as in Example 1, and the pH was adjusted to pH 6.5 to 7 at 28°C.
.. 48 Table 10. while controlling to the range of 5. Effect of main components on protease production Example 3 Salt was added to the petroleum shown in Example 1, and the effect on protease production was investigated. Bacillus, Iwakuniensis MT
After inoculating 2051, culturing was carried out in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 11, with sodium chloride ranging from 0.1 to 0.
By adding 5%, especially 0.25%, a protease activity equal to or higher than that of dry yeast (Example 2) can be obtained even when using compressed bread yeast.Table 119 Effect of salt on protease production
図1は、プロテアーゼMTE−56の水溶液(MTE−
56325mg/ltn#蒸留水)の紫外線吸収スペク
トルを示す。
図2は、カゼイン分解活性に関するプロテアーゼMTJ
C−56の至適pHを示す。
図3は、カゼイン分解活性に関するプロテアーゼMTE
−56のpH安定性を示す。
図4は、種々の温度におけるプロテアーゼMTE−56
の蛋白分解相対活性を示す。
図5は、プロテアーゼMTI!1−56の温度安定性を
示す(各温度て10分間処理した)。
図6は一プロテアーゼMTK−56の活性に゛およぼす
イオン濃度(リン酸緩衝液)の影響を示す。
出願人 三井石油化学工業株式会社
代理人 山 口 和
図2 至適IH
=H
図4 至適湿度
温度(′C)
図3 ミH安定性
H
図5 湿度安定性
湿度(’C)
m6、 イオン濃度L
トン酸緩
・影響Figure 1 shows an aqueous solution of protease MTE-56 (MTE-56).
56325mg/ltn#distilled water). Figure 2 shows protease MTJ regarding caseinolytic activity.
The optimum pH of C-56 is shown. Figure 3 shows protease MTE with respect to caseinolytic activity.
-56 pH stability. Figure 4 shows protease MTE-56 at various temperatures.
The relative proteolytic activity of Figure 5 shows Protease MTI! It exhibits a temperature stability of 1-56 (treated for 10 minutes at each temperature). Figure 6 shows the effect of ion concentration (phosphate buffer) on the activity of one protease, MTK-56. Applicant Mitsui Petrochemical Industries Co., Ltd. Agent Kazu Yamaguchi Figure 2 Optimal IH = H Figure 4 Optimal humidity temperature ('C) Figure 3 MiH stability H Figure 5 Humidity stability humidity ('C) m6, ion Concentration L Tonic acid slowing/effect
Claims (4)
IIL) 分子量: 56,000(ゲルp過法)(
b) 紫外線吸収スペクトル:275〜280nmに
極大吸収を有い245〜255nmに極小吸収を有する
。 (、) 等電点:pl二8.9±0.1(d) 溶
解性:水に可溶であるが、アセトン、ベンゼン、ヘキサ
ン、クロロホルムむこ(1不溶。 (e) pH作用性:カゼインを基質として使用した
蛋白質分解活性の好適pHは6〜8であり、pH6,5
〜7.5に至適pHを有する。 (f) I)H安定性:37℃、30分の処理で&ま
、pH6〜10の範囲で80%以上の活性を示し、安定
である。 (C) 作用適温の範囲:カゼインを基質とじて使用
した蛋白質分解活性の適温は、55℃〜60℃であり、
至適温度は約50°Cである。 (h) 阻害: EDTA及びジピリジルによって阻
害され、阻害の程度はKDTA>ジピリジルである。パ
ラクロロマーキュリツクベンゾエート(POMB)、フ
ルオロリン酸ジイソプロピル、および大豆由来のトリプ
シンインヒビターは本件プロテアーゼMTE−56の活
性に影響を与えない。またHg、FeおよびOa に
よっても阻害されるが、その程度はHg++>ye++
〜Oa′+である。 (1) pH及び温度による失活の条件?pH4,0
,37℃、60分間で、70%以上が失活する。 一方、pH10,57℃、10分間での失活は、20%
以下である。さらにpH7,70℃、10分間で完全に
失活する。(1) Protease MTK-56 (
IIL) Molecular weight: 56,000 (gel p-filtration method) (
b) Ultraviolet absorption spectrum: maximum absorption at 275-280 nm and minimum absorption at 245-255 nm. (,) Isoelectric point: pl28.9±0.1 (d) Solubility: Soluble in water, but insoluble in acetone, benzene, hexane, chloroform (1) (e) pH effect: Casein The preferred pH for proteolytic activity using as a substrate is 6 to 8;
It has an optimum pH of ~7.5. (f) I) H stability: After treatment at 37°C for 30 minutes, it exhibits 80% or more activity in the pH range of 6 to 10 and is stable. (C) Range of suitable temperature for action: The suitable temperature for proteolytic activity using casein as a substrate is 55°C to 60°C,
The optimum temperature is about 50°C. (h) Inhibition: Inhibited by EDTA and dipyridyl, the degree of inhibition is KDTA>dipyridyl. Parachloromercuric benzoate (POMB), diisopropyl fluorophosphate, and soybean-derived trypsin inhibitors do not affect the activity of the subject protease MTE-56. It is also inhibited by Hg, Fe, and Oa, but the degree of inhibition is Hg++>ye++
~Oa′+. (1) Conditions for inactivation due to pH and temperature? pH4.0
, 70% or more is inactivated at 37°C for 60 minutes. On the other hand, the deactivation at pH 10, 57°C for 10 minutes was 20%.
It is as follows. Furthermore, it is completely inactivated at pH 7 and 70°C for 10 minutes.
6を生産する細菌を培地において好気的条件下で培養し
、培養物からプロテアーゼMTFニー56を採取するこ
とを特徴とするプロテアーゼMTK−56の製造方法。(2) Belongs to the genus Bacillus and has protease MTffi-5
A method for producing protease MTK-56, which comprises culturing bacteria producing protease MTK-6 in a medium under aerobic conditions, and collecting protease MTF K-56 from the culture.
生産する細菌が、バチルス・イワクニエンシスMT−2
osi(微工研菌寄第6034号、FIRM p−10
34)であることを特徴とする特許請求の範囲第(2)
項に記載の製造方法。(3) Bacillus iwakuniensis MT-2 belongs to the genus Bacillus and produces the protease MTB-56.
osi (Feikoken Bibori No. 6034, FIRM p-10
Claim No. 34)
The manufacturing method described in section.
0.1ないし0.5重量%含有する培地を用いることを
特徴とする特許請求の範囲第(2)項に記載の製法。(4) The production method according to claim (2), wherein a medium containing 0.1 to 0.5% by weight of sodium chloride in the medium components is used as the medium.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56114417A JPS5816683A (en) | 1981-07-23 | 1981-07-23 | Protease and its preparation |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP56114417A JPS5816683A (en) | 1981-07-23 | 1981-07-23 | Protease and its preparation |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5816683A true JPS5816683A (en) | 1983-01-31 |
JPH0137117B2 JPH0137117B2 (en) | 1989-08-04 |
Family
ID=14637173
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56114417A Granted JPS5816683A (en) | 1981-07-23 | 1981-07-23 | Protease and its preparation |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5816683A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58178221A (en) * | 1982-04-13 | 1983-10-19 | Yamato Scale Co Ltd | Measuring conveyer |
-
1981
- 1981-07-23 JP JP56114417A patent/JPS5816683A/en active Granted
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58178221A (en) * | 1982-04-13 | 1983-10-19 | Yamato Scale Co Ltd | Measuring conveyer |
JPH0139536B2 (en) * | 1982-04-13 | 1989-08-22 | Yamato Scale Co Ltd |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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JPH0137117B2 (en) | 1989-08-04 |
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