JPH1189580A - Warts protein, polynucleotide encoding the protein, its antisense polynucleotide, and antibody recognizing the protein - Google Patents
Warts protein, polynucleotide encoding the protein, its antisense polynucleotide, and antibody recognizing the proteinInfo
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、脊椎動物、特に哺
乳類動物におけるショウジョウバエwarts蛋白質の
ホモログ蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレ
オチドに関する。また、前記ポリヌクレオチドのアンチ
センスポリヌクレオチドに関する。また、前記ホモログ
蛋白質を認識する抗体に関する。[0001] The present invention relates to a homologous protein of a Drosophila warts protein in a vertebrate, particularly a mammal, and a polynucleotide encoding the protein. In addition, the present invention relates to an antisense polynucleotide of the polynucleotide. The present invention also relates to an antibody that recognizes the homolog protein.
【0002】[0002]
【従来の技術】脊椎動物の中でもヒトは最も高度に分化
した神経系を持つ生物である。しかし、該神経系につい
ての解析はその複雑な機構のため遅れている。特に脳神
経系に発生する腫瘍については、他の腫瘍に比べその解
析が遅れている。脳神経系においては、悪性腫瘍はもち
ろんのこと、良性腫瘍であっても発生部位によっては患
者の生命を脅かすことがあり、脳神経腫瘍の発生機序の
解明の進展が待たれている。BACKGROUND ART Among vertebrates, humans are organisms having the most highly differentiated nervous system. However, analysis of the nervous system has been delayed due to its complex mechanism. In particular, the analysis of tumors occurring in the cerebral nervous system is delayed compared to other tumors. In the cranial nervous system, not only malignant tumors, but also benign tumors can be life-threatening for patients depending on the site of occurrence, and elucidation of the mechanism of the onset of cranial nerve tumors is awaited.
【0003】一方、ショウジョウバエでは、神経発生の
解析の過程で多くの突然変異体が得られており、その遺
伝学的解析が進んでいる。ショウジョウバエwarts
遺伝子(以降d−warts遺伝子ということがある)
がコードするショウジョウバエwarts蛋白質(以
降、d−wartsということがある)はセリン/スレ
オニンキナーゼであるDMタンパク質キナーゼ(DM−
PK)とホモロジーを有し、シグナル伝達系への関与が
示唆されている。d−warts遺伝子は、その欠失に
より上皮細胞の異常増殖や成虫原基の過形成を起こすこ
とが知られている。On the other hand, in Drosophila, many mutants have been obtained in the course of analysis of neurogenesis, and genetic analysis thereof is in progress. Drosophila warts
Gene (hereinafter sometimes referred to as d-warts gene)
Encodes a Drosophila warts protein (hereinafter sometimes referred to as d-warts), which is a serine / threonine kinase DM protein kinase (DM-
PK), and has been suggested to be involved in the signal transduction system. It is known that the deletion of the d-warts gene causes abnormal growth of epithelial cells and hyperplasia of the adult primordium.
【0004】[0004]
【発明が解決しようとする課題】ショウジョウバエの遺
伝子のホモログ遺伝子が脊椎動物、特に哺乳類動物にも
存在するかは、直ちには予想しにくいが、もしd−wa
rts遺伝子のホモログ遺伝子が脊椎動物、特に哺乳類
動物に存在するならば、該遺伝子が脊椎動物、特に哺乳
類動物の脳神経系に発生する腫瘍の発生機序の解明に利
用可能である。本発明は、d−warts遺伝子のホモ
ログ遺伝子を脊椎動物から単離し、その塩基配列を決定
し、該遺伝子がコードするホモログ蛋白質を提供するこ
とを課題とする。It is difficult to immediately predict whether a homologue of a Drosophila gene is present in vertebrates, particularly mammals.
If a homolog gene of the rts gene is present in a vertebrate, particularly a mammal, the gene can be used to elucidate the mechanism of the development of a tumor that occurs in the vertebrate, especially the mammalian nervous system. An object of the present invention is to isolate a homolog gene of the d-warts gene from a vertebrate animal, determine its nucleotide sequence, and provide a homolog protein encoded by the gene.
【0005】また、前記ホモログ遺伝子に対応する塩基
配列からなるRNA等を含む前記ホモログ蛋白質をコー
ドするポリヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレ
オチドを提供することを課題とする。また、前記ホモロ
グ蛋白質を認識する抗体を提供することを課題とする。It is another object of the present invention to provide a polynucleotide encoding the homolog protein, including an RNA comprising a nucleotide sequence corresponding to the homolog gene, and an antisense polynucleotide thereof. Another object is to provide an antibody that recognizes the homolog protein.
【0006】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトにおける
d−wartsのホモログ蛋白質であるh−warts
および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供す
るものである。ポリヌクレオチドは、代表的なものとし
てDNAとRNAがある。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is directed to h-warts, a homologous protein of d-warts in humans.
And a polynucleotide encoding the protein. Polynucleotides typically include DNA and RNA.
【0007】本発明者は、d−warts遺伝子の塩基
配列をもとにESTデータベースを探索してプライマー
を作製し、該プライマーを用いてヒト脳胎児cDNAラ
イブラリーを鋳型にしてPCRを行うことでヒトにおけ
るd−warts遺伝子のホモログ遺伝子であるh−w
arts遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した。そ
して、ヒトにおけるd−wartsのホモログ蛋白質で
あるh−wartsのアミノ酸配列を決定した。The present inventors searched the EST database based on the base sequence of the d-warts gene to prepare primers, and performed PCR using the primers and a human brain fetal cDNA library as a template. Hw, a homolog gene of the d-warts gene in humans
The arts gene was isolated and its nucleotide sequence was determined. Then, the amino acid sequence of h-warts, a homologous protein of d-warts in human, was determined.
【0008】また、本発明は、h−wartsのアミノ
酸配列における一または複数のアミノ酸を置換、欠失ま
たは付加してなるアミノ酸配列からなる蛋白質(h−w
arts変異体)を提供するものである。この場合、変
異体とh−wartsとのホモロジーは75%以上であ
ることが好ましい。また、d−wartsとh−war
tsの間で保存されている部分には変異がないものであ
ることが好ましい。具体的には、h−wartsのアミ
ノ酸配列(配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列)
の354番目のTyrから366番目のHisまでの部
分、407番目のGlnから427番目のLysまでの
部分、464番目のArgから482番目のAsnまで
の部分、488番目のLeuから509番目のAspま
での部分、522番目のGluから531番目のGlu
までの部分、538番目のSerから577番目のHi
sまでの部分、626番目のLeuから642番目のL
euまでの部分、662番目のGluから672番目の
Alaまでの部分または752番目のHisから764
番目のProまでの部分には、変異がないことが好まし
い。The present invention also relates to a protein (hw) comprising an amino acid sequence obtained by substituting, deleting or adding one or more amino acids in the amino acid sequence of h-warts.
arts mutant). In this case, the homology between the mutant and h-warts is preferably at least 75%. Also, d-warts and h-war
It is preferred that the portion conserved between ts has no mutation. Specifically, the amino acid sequence of h-warts (the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing)
From the 354th Tyr to the 366th His, the 407th Gln to the 427th Lys, the 464th Arg to the 482th Asn, the 488th Leu to the 509th Asp Part, 522th Glu to 531st Glu
From the 538th Ser to the 577th Hi
s from 626th Leu to 642nd L
eu, 662th Glu to 672th Ala or 752th His to 764
It is preferable that there is no mutation in the portion up to the Pro.
【0009】また、本発明は、前記h−wartsをコ
ードするポリヌクレオチドまたはh−warts変異体
をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の相補塩基配
列からなるアンチセンスポリヌクレオチドをも開示する
ものである。アンチセンスポリヌクレオチドは、代表的
なものとしてアンチセンスDNAとアンチセンスRNA
がある。[0009] The present invention also discloses an antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the h-warts or the polynucleotide encoding the h-warts mutant. Antisense polynucleotides are typically represented by antisense DNA and antisense RNA.
There is.
【0010】また、本発明は、h−wartsもしくは
h−warts変異体をコードするポリヌクレオチドの
全部または12塩基以上からなる一部であるポリヌクレ
オチドを開示するものである。このポリヌクレオチド
は、コード領域の部分のものについては、それぞれh−
wartsまたはh−warts変異体の部分長蛋白質
を作製するために使用可能である。また、プローブとし
ても使用可能である。[0010] The present invention also discloses polynucleotides which are all or part of 12 or more nucleotides encoding polynucleotides encoding h-warts or h-warts mutants. This polynucleotide has a h-
Warts or h-warts mutants can be used to make partial length proteins. It can also be used as a probe.
【0011】また、本発明は、h−wartsまたはh
−warts変異体のアンチセンスポリヌクレオチドの
全部または12塩基以上からなる一部であるアンチセン
スポリヌクレオチドを開示するものである。このアンチ
センスポリヌクレオチドは、それぞれh−wartsま
たはh−warts変異体の生合成を阻害することが可
能である。また、プローブとしても使用可能である。Further, the present invention relates to h-warts or h-warts.
The present invention discloses an antisense polynucleotide which is all or a part consisting of 12 or more bases of the antisense polynucleotide of the -warts mutant. This antisense polynucleotide is capable of inhibiting the biosynthesis of h-warts or h-warts mutants, respectively. It can also be used as a probe.
【0012】また、本発明は、前記の各ポリヌクレオチ
ドまたはアンチセンスポリヌクレオチドを化学修飾した
ポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチド
を開示するものである。The present invention also discloses a polynucleotide or an antisense polynucleotide obtained by chemically modifying each of the above polynucleotides or antisense polynucleotides.
【0013】また、本発明は、前記のh−wartsも
しくはh−warts変異体をコードするポリヌクレオ
チドの一部または前記のh−wartsもしくはh−w
arts変異体のアンチセンスポリヌクレオチドの一部
(一本鎖DNA、RNAまたはそれらが化学修飾された
ものを含む)をプローブとして、他の脊椎動物のcDN
Aライブラリーから該プローブとハイブリダイズする当
該動物におけるh−warts遺伝子のホモログ遺伝子
(d−warts遺伝子のホモログ遺伝子でもある)で
あるcDNAを取得する方法を開示するものである。[0013] The present invention also relates to a part of the polynucleotide encoding the h-warts or the h-warts mutant or the h-warts or hw.
A part of the antisense polynucleotide of the arts mutant (including single-stranded DNA, RNA or a chemically modified product thereof) is used as a probe to detect cDNA of other vertebrates.
The present invention discloses a method for obtaining a cDNA that is a homolog gene of the h-warts gene (also a homolog gene of the d-warts gene) in the animal that hybridizes with the probe from the A library.
【0014】また、本発明は、前記のh−warts遺
伝子のホモログ遺伝子の取得方法により取得されたcD
NAを開示するものである。本明細書において、このh
−warts遺伝子のホモログ遺伝子をwarts遺伝
子という。Further, the present invention relates to a cD obtained by the above method for obtaining a homolog gene of the h-warts gene.
This discloses the NA. In the present specification, this h
-A homolog gene of the wurts gene is called a wurts gene.
【0015】また、本発明は、前記h−warts遺伝
子のホモログ遺伝子がコードするh−wartsのホモ
ログ蛋白質(d−wartsのホモログ蛋白質でもあ
る)を開示するものである。本明細書において、このh
−wartsのホモログ蛋白質をwartsという。前
記のwartsは、遺伝子を導入した形質転換体に作製
させることが可能である。The present invention also discloses a h-warts homolog protein (also a d-warts homolog protein) encoded by the h-warts gene homolog gene. In the present specification, this h
The homolog protein of -warts is called warts. The above warts can be produced in a transformant into which a gene has been introduced.
【0016】また、本発明は、h−warts、h−w
arts変異体またはwartsのいずれかを認識する
抗体を開示するものである。Further, the present invention provides h-warts, hw
It discloses an antibody that recognizes either the arts mutant or the warts.
【0017】[0017]
【発明の実施の形態】各脊椎動物のcDNAライブラリ
ーから該動物におけるwarts遺伝子を得るために使
用するプローブとしては、d−wartsとh−war
tsの間でホモロジーが高い部分、すなわち種をこえて
よく保存されている部分のアミノ酸配列をコードする部
分を含むDNAを用いることができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The probes used for obtaining the warts gene in each vertebrate cDNA library from the vertebrate animal include d-warts and h-warp.
A DNA containing a portion having a high homology between ts, that is, a portion encoding an amino acid sequence of a portion that is well conserved across species can be used.
【0018】図1を参照して、d−wartsとh−w
artsとでアミノ酸配列がよく保存されている部分
は、h−wartsのアミノ酸配列(配列表の配列番号
1に記載のアミノ酸配列)の354番目のTyrから3
66番目のHisまでの部分、407番目のGlnから
427番目のLysまでの部分、464番目のArgか
ら482番目のAsnまでの部分、488番目のLeu
から509番目のAspまでの部分、522番目のGl
uから531番目のGluまでの部分、538番目のS
erから577番目のHisまでの部分、626番目の
Leuから642番目のLeuまでの部分、662番目
のGluから672番目のAlaまでの部分、752番
目のHisから764番目のProまでの部分が挙げら
れる。なお、図1において、右端の数字は、当該行の右
端のアミノ酸が何番目であるかを示す。この部分をコー
ドするDNAは、h−warts遺伝子の塩基配列(配
列表の配列番号2に記載の塩基配列)の1069番目の
Tから1107番目のTまで、1228番目のCから1
290番目のGまで、1389番目のCから1455番
目のTまで、1471番目のCから1536番目のTま
で、1573番目のGから1602番目のAまで162
1番目のAから1740番目のCまで、1885番目の
Cから1935番目のGまで、1993番目のGから2
025番目のAまで、2263番目のCから2301番
目のTまでの部分である。Referring to FIG. 1, d-warts and hw
and the part whose amino acid sequence is well conserved between Tyr at position 354 in the amino acid sequence of h-warts (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing).
66th section from His, 407th section from Gln to 427th Lys, 464th section from Arg to 482th Asn, 488th Leu
To the 509th Asp, the 522th Gl
u to 531st Glu, 538th S
er to the 577th His, the 626th Leu to the 642th Leu, the 662th Glu to the 672th Ala, the 752th His to the 764th Pro, and the like. Can be In FIG. 1, the rightmost numeral indicates the number of the rightmost amino acid in the row. The DNA encoding this portion is composed of the nucleotide sequence of the h-warts gene (the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) from the 1069th T to the 1107th T, and from the 1228th C to the 1st C.
From the 1389th C to the 1455th T, from the 1471th C to the 1536th T, from the 1573th G to the 1602th A,
From the first A to the 1740th C, from the 1885th C to the 1935th G, from the 1993th G to 2
It is the part from the 2263th C to the 2301st T up to the 025th A.
【0019】したがって、上記の部分を含む塩基配列か
らなるDNAをプローブとして、各脊椎動物のcDNA
ライブラリーから該動物のwarts遺伝子を得ること
ができる。特に好ましくは、哺乳類動物のcDNAライ
ブラリーから該動物のwarts遺伝子を得ることがで
きる。また、プローブには、前記DNAに対応する塩基
配列からなるRNAも使用可能である。Therefore, using a DNA consisting of the nucleotide sequence containing the above-described portion as a probe, cDNA of each vertebrate
The warts gene of the animal can be obtained from the library. Particularly preferably, the warts gene of a mammal can be obtained from a cDNA library of a mammal. Further, as the probe, RNA consisting of a base sequence corresponding to the DNA can be used.
【0020】各脊椎動物のcDNAライブラリーからw
arts遺伝子を得る方法を以下に例示する。 1.cDNAライブラリーの作製 目的とする脊椎動物のcDNAライブラリーを該動物の
mRNAから作製する。または市販のcDNAライブラ
リーを用いてもよい。106 程度のプラークをNZY寒
天培地上に作製し、このcDNAライブラリーを『Mo
lecularCloning Second Edi
tion』(1989年、ColdSpring Ha
rbor Laboratory Press)9.3
8−9.41ページに記載の方法に従ってニトロセルロ
ース膜上に固定する。その後、この膜を2×SSCで6
0℃で洗浄する。From each vertebrate cDNA library,
The method for obtaining the arts gene is exemplified below. 1. Preparation of cDNA Library A desired vertebrate cDNA library is prepared from the mRNA of the animal. Alternatively, a commercially available cDNA library may be used. About 10 6 plaques were prepared on NZY agar medium, and this cDNA library was referred to as “Mo
rectangularCloning Second Edi
Tion "(1989, ColdSpring Ha
rbor Laboratory Press) 9.3
Immobilize on nitrocellulose membrane according to the method described on page 8-9.41. Then, this film was subjected to 6 × 2 SSC.
Wash at 0 ° C.
【0021】2.warts遺伝子の取得 プローブとして例えば、配列表の配列番号2に記載の塩
基配列の1621番目のAから1740番目のCまでの
塩基配列からなるcDNAを用いて、以下の操作によ
り、上記cDNAライブラリーから全長のwarts遺
伝子を得ることができる。 1)プローブとなるDNAを標識する。例えば、Tak
ara MEGA LABELキット(登録商標、宝酒
造社製)が使用可能である。 2)次に、下記の組成のDNA反応液を調製し、この液
を37℃で30分間インキュベートした後、70℃で1
0分間熱処理し、酵素を失活させる。 DNAプローブ(2pmol/μl) 2μl 10倍ホスホライレイション緩衝液 2μl 〔γ−32P〕ATP(370MBq/ml)(アマシャム製) 5μl T4 ポリヌクレオチドキナーゼ 1μl 合計10μl2. Acquisition of the warts gene For example, using a cDNA consisting of the nucleotide sequence from the 1621st A to the 1740th C of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as a probe, A full-length warts gene can be obtained. 1) Label DNA serving as a probe. For example, Tak
The ara MEGA LABEL kit (registered trademark, manufactured by Takara Shuzo) can be used. 2) Next, a DNA reaction solution having the following composition was prepared, and this solution was incubated at 37 ° C for 30 minutes, and then incubated at 70 ° C for 1 minute.
Heat treat for 0 min to inactivate enzyme. DNA probe (2 pmol / μl) 2 μl 10-fold phosphorylation buffer 2 μl [γ-32P] ATP (370 MBq / ml) (Amersham) 5 μl T4 polynucleotide kinase 1 μl Total 10 μl
【0022】3)T50E(50mM Tris−Cl
pH8.0、1mM EDTA)で平衡化されたSe
phadexG−25(登録商標、ファルマシア社製)
を1.5mlポリプレップカラム(バイオラッド社製)
にベッドボリュームが1mlになるように詰め、2)で
熱処理をしたDNA反応液を該カラムに載せる。 4)その後、T50Eを200μlずつカラムに4回流
し、2回目の200μlで溶出した画分から標識化DN
Aプローブを得ることができる。3) T50E (50 mM Tris-Cl
Se equilibrated with pH 8.0, 1 mM EDTA)
phadex G-25 (registered trademark, manufactured by Pharmacia)
To a 1.5 ml polyprep column (Bio-Rad)
And the heat-treated DNA reaction solution in step 2) is placed on the column. 4) Thereafter, 200 μl of T50E was applied to the column four times, and the labeled DN was extracted from the fraction eluted with the second 200 μl.
A probe can be obtained.
【0023】5)上記で得られる標識化DNAプローブ
画分のうち150μlを、該膜上に固定したプラークの
cDNAプローブと以下の条件でハイブリダイズさせ
る。 プレハイブリダイゼーション 6×SSC 5×Denhaldt’s 0.05% ピロリン酸ナトリウム 100μg/ml denatured herrin
g spermDNA 0.5%SDS 総液量 50ml 反応温度37℃ 反応時間1時間 ハイブリダイゼーション 6×SSC 1×Denhaldt’s 0.05% ピロリン酸ナトリウム 100μg/ml denatured herrin
g spermDNA 1×106 cpm/ml cDNAプローブ 総液量50ml 反応温度42℃ 反応時間18時間5) 150 μl of the labeled DNA probe fraction obtained above is hybridized with the plaque cDNA probe fixed on the membrane under the following conditions. Prehybridization 6 × SSC 5 × Denhardt's 0.05% sodium pyrophosphate 100 μg / ml denatured herrin
g spermDNA 0.5% SDS Total volume 50 ml Reaction temperature 37 ° C. Reaction time 1 hour Hybridization 6 × SSC 1 × Denhardt's 0.05% sodium pyrophosphate 100 μg / ml denaturated herrin
g sperm DNA 1 × 10 6 cpm / ml cDNA probe Total volume 50 ml Reaction temperature 42 ° C. Reaction time 18 hours
【0024】6)ハイブリダイズの終了したニトロセル
ロース膜を以下の条件で1回ずつ洗浄する。 6×SSC、0.1%SDS 500ml 温度40℃ 時間20分間 3×SSC、0.1%SDS 500ml 時間42℃ 時間20分間 7)洗浄したニトロセルロース膜はKODAK XAR
5フィルムに−80℃で一晩露光し、オートラジオグラ
フとする。 8)得られたオートラジオグラフから、陽性のプラーク
の位置を決定し、対応する寒天上のプラークをSM溶液
に回収する。 9)回収したプラークについて、常法により再度NZY
寒天培地上にプラーク形成を行わせ、ニトロセルロース
膜上に固定する。 10)5)〜9)の過程を3回繰り返す。その結果、単
一なものとなった陽性のプラークを回収し、100μl
のSM溶液に懸濁し、ファージを安定化させる。該プラ
ークからwarts遺伝子を単離することができる。6) Wash the hybridized nitrocellulose membrane once under the following conditions. 6 × SSC, 0.1% SDS 500 ml, temperature 40 ° C., time 20 minutes 3 × SSC, 0.1% SDS 500 ml, time 42 ° C., time 20 minutes 7) The washed nitrocellulose membrane is KODAK XAR
Exposure to 5 films at -80 ° C overnight to make an autoradiograph. 8) From the obtained autoradiograph, determine the position of the positive plaque, and collect the corresponding plaque on agar in SM solution. 9) For the recovered plaque, re-use NZY by a standard method.
The plaque is formed on an agar medium and fixed on a nitrocellulose membrane. 10) Repeat steps 5) to 9) three times. As a result, a single positive plaque was collected and 100 μl
To stabilize the phage. The warts gene can be isolated from the plaque.
【0025】3.warts遺伝子の大量調製 1)SM溶液に懸濁したプラークのファージ50μlと
Y1090r−大腸菌20μlを混合し、37℃、15
分間放置する。 2)その後、100μg/mlアンピシリンを含む10
mlNZY培地に1)で混合した溶液を移し、37℃で
6時間培養する。 3)8000rpm、5分間遠心分離し、上清を回収す
る。 4)該上清に、5M NaClを1ml、ポリエチレン
グリコール6000を1.1gを加え、溶かす。 5)該溶液を氷上に1時間置き、その後10000rp
m、4℃で20分間遠心分離を行う。 6)沈殿を回収し、700μlのSM溶液に懸濁する。 7)クロロホルムを500μl加えて撹拌し、残った大
腸菌を溶かす。 8)5000rpm、10分間遠心分離し、水層を回収
する。3. Large-scale preparation of the warts gene 1) 50 μl of plaque phage suspended in SM solution and 20 μl of Y1090r-E. coli were mixed at 37 ° C. for 15 minutes.
Leave for a minute. 2) Then, 10 μg / ml ampicillin containing 10 μg / ml
Transfer the solution mixed in 1) to ml NZY medium and incubate at 37 ° C for 6 hours. 3) Centrifuge at 8000 rpm for 5 minutes and collect the supernatant. 4) 1 ml of 5M NaCl and 1.1 g of polyethylene glycol 6000 are added to the supernatant and dissolved. 5) Place the solution on ice for 1 hour, then 10,000 rpm
centrifuge at 4 ° C. for 20 minutes. 6) Collect the precipitate and suspend in 700 μl of SM solution. 7) Add 500 μl of chloroform and stir to dissolve the remaining E. coli. 8) Centrifuge at 5000 rpm for 10 minutes to collect the aqueous layer.
【0026】9)これに、1mg/ml RNase
A、5mg/ml DNaseI(共にシグマ製)を各
1μlずつ加え、37℃で1時間放置したのち、20%
ポリエチレングリコール6000(0.8M NaC
l)を600μl加え、氷上に30分間放置する。 10)4℃で、15000rpm、20分間遠心分離し
た後、沈殿を回収する。 11)この沈殿に500μlのSM溶液、50μlの5
M NaCl、50μlの0.5M EDTAを加え、
更に、400μlのフェノールを加えて撹拌し、ファー
ジを溶かしてcDNAを遊離させる。 12)該溶液を室温で15000rpm、5分間遠心分
離した後、水層を回収する。これに1mlのエタノール
を加え、15000rpm、20分間遠心分離し、液層
を捨てる。 13)70%エタノール1mlで沈殿を洗浄し、100
μlのTE溶液(Tris−Cl(pH8.0)10m
M、1mM EDTA)に沈殿を溶かす。これによりD
NA溶液を得ることができる。9) 1 mg / ml RNase
A, 1 μl each of 5 mg / ml DNase I (both from Sigma) was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
Polyethylene glycol 6000 (0.8M NaC
l) is added to the mixture and left on ice for 30 minutes. 10) After centrifugation at 4 ° C. and 15000 rpm for 20 minutes, collect the precipitate. 11) 500 μl of SM solution, 50 μl of 5
M NaCl, 50 μl of 0.5 M EDTA was added,
Further, 400 μl of phenol is added and stirred to dissolve the phage and release the cDNA. 12) The solution is centrifuged at room temperature at 15000 rpm for 5 minutes, and the aqueous layer is collected. To this, 1 ml of ethanol is added, centrifuged at 15000 rpm for 20 minutes, and the liquid layer is discarded. 13) Wash the precipitate with 1 ml of 70% ethanol,
μl of TE solution (Tris-Cl (pH 8.0) 10m
M, 1 mM EDTA). This gives D
An NA solution can be obtained.
【0027】4.warts遺伝子の塩基配列の決定 ダイターミネーター法によりwarts遺伝子の全塩基
配列を決定する。オートシーケンサーを用いることがで
きる。4. Determination of the base sequence of the warts gene The entire base sequence of the warts gene is determined by the dye terminator method. An auto sequencer can be used.
【0028】5.アミノ酸配列の決定 4.で決定した塩基配列から、wartsのアミノ酸配
列を決定することができる。例えば、市販のプログラム
(例えば、GENETYX(登録商標)−CDプログラ
ムVer.34(ソフトウェアディベロプメント社製)
を用いて可能である。5. 3. Determination of amino acid sequence The amino acid sequence of warts can be determined from the nucleotide sequence determined in (1). For example, a commercially available program (for example, GENETYX (registered trademark) -CD program Ver. 34 (manufactured by Software Development Co., Ltd.))
Is possible.
【0029】6.形質転換体の作製 上記でwarts遺伝子が得られる。このwarts遺
伝子をベクターに挿入し、適当な宿主に導入して形質転
換体を作製することができる。この形質転換体を適当な
培地で培養して、蛋白質を作製することができる。6. Preparation of Transformant The warts gene is obtained as described above. A transformant can be prepared by inserting the warts gene into a vector and introducing it into an appropriate host. The transformant can be cultured in an appropriate medium to produce a protein.
【0030】自然の変異によりまたは人工の変異(例え
ば、Molecular Cloning 2nd E
dition(Cold Spring Harbor
Laboratory Press、1989年)1
5.1−15.113ページに記載の方法)により、ポ
リヌクレオチドがコードするポリペプチドの主たる機能
に変化を与えることなく、該ポリヌクレオチド変化させ
ることが可能である。例えば、この方法により、本発明
のh−wartsについても配列表の配列番号1に記載
のアミノ酸配列における一または複数のアミノ酸を置
換、欠失または付加したアミノ酸配列からなる蛋白質、
すなわちh−warts変異体を作製することが可能で
ある。[0030] Natural or artificial mutations (eg, Molecular Cloning 2nd E)
edition (Cold Spring Harbor)
Laboratory Press, 1989) 1
5.1-15.113), the polynucleotide can be changed without changing the main function of the polypeptide encoded by the polynucleotide. For example, according to this method, the h-warts of the present invention also include a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 have been substituted, deleted or added,
That is, it is possible to produce an h-warts mutant.
【0031】本発明のh−warts変異体のアミノ酸
配列は、該変異体をコードする遺伝子の塩基配列から決
定することが可能である。例えば、市販のプログラム
(例えば、GENETYX(登録商標)−CDプログラ
ムVer.34(ソフトウェアディベロプメント社製)
を用いて可能である。The amino acid sequence of the h-warts mutant of the present invention can be determined from the nucleotide sequence of the gene encoding the mutant. For example, a commercially available program (for example, GENETYX (registered trademark) -CD program Ver. 34 (manufactured by Software Development Co., Ltd.))
Is possible.
【0032】遺伝暗号の縮重により、ポリヌクレオチド
から生産されたポリペプチドのアミノ酸配列を変えるこ
となく、該ポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも一
部の塩基を他の種類の塩基に置換することができる。し
たがって、本発明のwartsをコードするポリヌクレ
オチドとは、縮重の全てのパターンを含むものである。Due to the degeneracy of the genetic code, at least a part of the base sequence of the polynucleotide can be replaced with another type of base without changing the amino acid sequence of the polypeptide produced from the polynucleotide. . Therefore, the polynucleotide encoding the warts of the present invention includes all patterns of degeneracy.
【0033】配列表の配列番号2に記載の塩基配列から
なるDNAは、天然に存在するh−warts遺伝子で
ある。The DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is a naturally occurring h-warts gene.
【0034】本発明は、前記h−wartsをコードす
るポリヌクレオチドのアンチセンス鎖の塩基配列からな
るアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体を含
むものである。該アンチセンスポリヌクレオチドは、h
−wartsをコードするポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズすることが可能なものであり、それがハイブリダ
イズするポリヌクレオチドがコード領域のポリヌクレオ
チドであれば該ポリヌクレオチドがコードするポリペプ
チドの生合成を阻害することが可能である。ポリペプチ
ドの生合成を阻害するためのアンチセンスポリヌクレオ
チドは、12塩基以上からなることが好ましい。一方、
細胞内に全長のアンチセンスポリヌクレオチドを取り込
ませるのは、あまりに長くても不適である。細胞内にア
ンチセンスポリヌクレオチドを取り込ませ、warts
の生合成を阻害させる場合、12塩基以上30塩基以
下、好ましくは15塩基以上25塩基以下、より好まし
くは18塩基以上22塩基以下の塩基からなるアンチセ
ンスポリヌクレオチドを用いるのがよい。また、アンチ
センスポリヌクレオチドはプローブとしても使用可能で
ある。The present invention includes an antisense polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the antisense strand of the polynucleotide encoding h-warts and a derivative thereof. The antisense polynucleotide comprises h
-Capable of hybridizing to a polynucleotide encoding warts, and inhibiting the biosynthesis of a polypeptide encoded by the polynucleotide if the hybridizing polynucleotide is a polynucleotide of a coding region. Is possible. The antisense polynucleotide for inhibiting polypeptide biosynthesis preferably comprises 12 or more bases. on the other hand,
Incorporation of full-length antisense polynucleotides into cells is inappropriate even for too long. Incorporate antisense polynucleotide into cells, warts
When the biosynthesis of is inhibited, an antisense polynucleotide consisting of 12 to 30 bases, preferably 15 to 25 bases, more preferably 18 to 22 bases is used. Antisense polynucleotides can also be used as probes.
【0035】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドま
たはその一部分は、塩基、リン酸、糖からなるヌクレオ
チドが複数結合したものが、天然には存在しないものを
含めて全て含まれる。代表的なものは、アンチセンスD
NAとアンチセンスRNAである。The antisense polynucleotide of the present invention or a part thereof includes all nucleotides consisting of a plurality of nucleotides consisting of bases, phosphates and sugars, including non-naturally occurring nucleotides. The typical one is antisense D
NA and antisense RNA.
【0036】本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに
ついて、公知のアンチセンス技術を用いて、目的のDN
AやmRNAとの結合力、組織選択制、細胞透過性、ヌ
クレアーゼ耐性、細胞内安定性の高い様々なアンチセン
スポリヌクレオチド誘導体が得られる。The antisense polynucleotide of the present invention can be prepared by using a known antisense technique to obtain a desired DN.
Various antisense polynucleotide derivatives having high binding strength to A or mRNA, tissue selection, cell permeability, nuclease resistance and intracellular stability can be obtained.
【0037】ハイブリダイズのし易さの点では、一般的
には、ステムループを形成している領域の塩基配列に相
補的な塩基配列を持つアンチセンスポリヌクレオチドま
たはその誘導体を設計するとよいとされている。本発明
のアンチセンスポリヌクレオチドおよびその誘導体は、
必要に応じ、ステムループを形成することが可能であ
る。From the viewpoint of ease of hybridization, it is generally considered to be desirable to design an antisense polynucleotide or a derivative thereof having a base sequence complementary to the base sequence of the region forming the stem loop. ing. The antisense polynucleotide of the present invention and a derivative thereof,
If necessary, a stem loop can be formed.
【0038】また、翻訳開始コドン付近、リボソーム結
合部位、キャッピング部位、スプライス部位の配列に相
補的な配列を有するようなアンチセンスポリヌクレオチ
ドは、一般に高い発現抑制効果が期待できる。したがっ
て、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドまたはその
誘導体であって、wartsをコードする遺伝子または
mRNAの翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、
キャッピング部位、スプライス部位の相補的な配列を含
むものは、高い発現抑制効果が期待される。An antisense polynucleotide having a sequence complementary to the sequence near the translation initiation codon, ribosome binding site, capping site, or splice site can generally be expected to have a high expression suppressing effect. Accordingly, the antisense polynucleotide of the present invention or a derivative thereof, wherein the gene encoding warts or the mRNA has a translation initiation codon, a ribosome binding site,
Those containing a sequence complementary to the capping site and the splice site are expected to have a high expression suppressing effect.
【0039】現在一般的に知られている誘導体は、ヌク
レアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少な
くとも一が高められた誘導体であることが好ましい。特
に好ましくは、フォスフォロチオエート結合を骨格構造
として有する誘導体である。本発明のポリヌクレオチド
およびその誘導体についても、これらの機能または構造
を有する誘導体が含まれる。The derivatives generally known at present are preferably derivatives having at least one of enhanced nuclease resistance, tissue selectivity, cell permeability and binding strength. Particularly preferred are derivatives having a phosphorothioate bond as a skeletal structure. The polynucleotide of the present invention and its derivatives also include derivatives having these functions or structures.
【0040】天然型のアンチセンスポリヌクレオチドで
あれば、化学合成機を使用して合成したり、h−war
tsをコードする遺伝子を鋳型とするPCR法により本
発明のアンチセンスポリヌクレオチドを作製することが
できる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォ
ロチオエート型等、誘導体の中には、化学合成できるも
のもある。この場合には、化学合成機に添付されている
説明書にしたがって操作を行い、得られた合成産物を逆
相クロマトグラフィー等を用いたHPLC法により精製
することによっても、目的のアンチセンスポリヌクレオ
チドまたはその誘導体を得ることができる。As long as it is a natural type antisense polynucleotide, it can be synthesized using a chemical synthesizer or h-warm.
The antisense polynucleotide of the present invention can be prepared by a PCR method using a gene encoding ts as a template. Some derivatives, such as a methylphosphonate type and a phosphorothioate type, can be chemically synthesized. In this case, the desired antisense polynucleotide can be obtained by performing the operation according to the instructions attached to the chemical synthesizer and purifying the obtained synthetic product by HPLC using reverse phase chromatography or the like. Alternatively, a derivative thereof can be obtained.
【0041】本発明のh−wartsをコードするポリ
ヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドまた
はそれらの一部(連続する12塩基以上の塩基配列から
なるポリヌクレオチド)であるポリヌクレオチドは、c
DNAライブラリーからwarts遺伝子をスクリーニ
ングするためのプローブとして使用可能である。このと
きGC含有率が30ないし70%のものが好適に使用可
能である。また、連続する15塩基以上の塩基配列から
なるポリヌクレオチドが特に好ましい。プローブとして
用いる該ポリヌクレオチドは誘導体であってもよい。通
常、上記の塩基数以上の配列は特異性のある配列である
と認識されている。該プローブを用いたスクリーニング
において使用するcDNAライブラリーとしては、mR
NAから作製されたものが好ましく使用できる。また、
これらのcDNAライブラリーからランダムサンプリン
グにより選択された一群のcDNAを検索の試料とする
ことができる。また、市販のものでも使用可能である。The polynucleotide encoding the h-warts of the present invention, its antisense polynucleotide or a part thereof (polynucleotide having a continuous base sequence of 12 or more bases) is c-type.
It can be used as a probe for screening the warts gene from a DNA library. At this time, those having a GC content of 30 to 70% can be suitably used. Further, a polynucleotide consisting of a continuous base sequence of 15 or more bases is particularly preferred. The polynucleotide used as a probe may be a derivative. Usually, a sequence having the number of bases or more is recognized as a sequence having specificity. The cDNA library used in the screening using the probe includes mR
Those prepared from NA can be preferably used. Also,
A group of cDNAs selected from these cDNA libraries by random sampling can be used as a sample to be searched. Also, commercially available products can be used.
【0042】本発明のh−wartsをコードするポリ
ヌクレオチド、そのアンチセンスポリヌクレオチドまた
はそれらの一部(連続する12塩基以上の塩基配列から
なるポリヌクレオチド)であるポリヌクレオチドは、プ
ローブとして使用可能である。該ポリヌクレオチドをプ
ローブとして、各組織由来のmRNAについてノーザン
ブロットハイブリダイゼーションを行うことにより、h
−warts遺伝子由来のmRNAが発現している組織
を見出すことが可能である。The polynucleotide encoding the h-warts of the present invention, the antisense polynucleotide thereof, or a polynucleotide thereof (a polynucleotide consisting of a continuous base sequence of 12 or more bases) can be used as a probe. is there. By performing Northern blot hybridization on mRNA from each tissue using the polynucleotide as a probe, h
-It is possible to find a tissue in which mRNA derived from the warts gene is expressed.
【0043】DNA又はRNAをを化学合成するとき
に、側鎖をメチル化すること、あるいはビオチン化する
こと、またはリン酸基部分のOをS置換すること等の化
学的に修飾することはよく知られている。例えば、配列
表の配列番号2に記載のDNAを化学合成するときに、
該化学修飾を行い、配列表に示されたDNAそのものと
異なるものを合成することが可能である。また、cDN
Aライブラリーから取得されたcDNAであっても放射
性同位体で標識することも可能である。したがって、本
発明のDNA及びRNAは、上記の化学修飾されたDN
A、RNAまたはアンチセンスポリヌクレオチドをその
範囲に含むものである。化学修飾されたDNAまたはR
NAは、蛋白質をコードする機能またはプローブとして
の機能をいずれも発揮可能なものであり、化学修飾され
たアンチセンスポリヌクレオチドは、プローブまたは蛋
白質の生合成を阻害する機能をいずれも発揮可能なもの
である。When chemically synthesizing DNA or RNA, it is often the case that the side chain is methylated or biotinylated, or chemically modified such as S-substitution of O in the phosphate group. Are known. For example, when chemically synthesizing the DNA described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
By performing the chemical modification, it is possible to synthesize a DNA different from the DNA itself shown in the sequence listing. Also, cDN
Even cDNA obtained from the A library can be labeled with a radioisotope. Therefore, the DNA and RNA of the present invention can be obtained by using the above-mentioned chemically modified DN.
A, RNA or antisense polynucleotide is included in the scope. Chemically modified DNA or R
NA can exhibit both a protein-encoding function and a probe function, and a chemically-modified antisense polynucleotide can exhibit both a probe or protein biosynthesis-inhibiting function. It is.
【0044】プラスミドを大腸菌等の適当な宿主に導入
して、形質転換体を得ることは公知の方法により可能で
ある。得られた形質転換体を培養して遺伝子の増幅また
は蛋白質の発現を行わせ、wartsを製造することが
可能である。また、同様に、その変異体であるwart
s変異体をコードするDNAを導入した形質転換体を培
養して、warts変異体を作製させることが可能であ
る。形質転換体に作製させたwartsまたはwart
s変異体を含む培養物を回収し、必要に応じて濃縮、可
溶化、透析、各種クロマトグラフィー等の操作を行うこ
とにより、本発明のwartsまたはwarts変異体
を精製することが可能である。It is possible to obtain a transformant by introducing the plasmid into an appropriate host such as Escherichia coli by a known method. It is possible to produce warts by culturing the obtained transformant to amplify the gene or express the protein. Similarly, the mutant, wart,
By transforming the transformant into which the DNA encoding the s mutant has been introduced, a warts mutant can be produced. Warts or wart produced by the transformant
By recovering the culture containing the s mutant and performing operations such as concentration, solubilization, dialysis, and various types of chromatography as necessary, it is possible to purify the warts or the warts mutant of the present invention.
【0045】形質転換体の培養については、各種の教科
書があり、本発明に記載の塩基配列に基づいてwart
sまたはwarts変異体を発現させることも、公知の
方法により可能である。このとき、宿主としては、大腸
菌等の細菌、酵母、動物細胞のいずれも使用可能である
が、特には動物細胞が好ましい。細胞に遺伝子を導入す
るには、リボソーム法、エレクトロポーレーション法等
を用いることができる。There are various textbooks on culturing the transformants, and based on the nucleotide sequence described in the present invention, a warm is used.
It is also possible to express the s or warts mutant by a known method. At this time, as the host, any of bacteria such as Escherichia coli, yeast, and animal cells can be used, and animal cells are particularly preferable. To introduce a gene into a cell, a ribosome method, an electroporation method, or the like can be used.
【0046】得られた培養物からwartsまたはwa
rts変異体を精製する精製方法には、免疫沈降法、塩
析法、限外濾過法、等電点沈殿法、ゲル濾過法、電気泳
動法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマ
トグラフィー法や抗体クロマトグラフィー法等の各種ア
フィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシ
ング法、吸着クロマトグラフィー法および逆相クロマト
グラフィー法等があり、適宜選択して行えばよい。From the obtained culture, warts or wa
Purification methods for purifying the rts mutant include immunoprecipitation, salting out, ultrafiltration, isoelectric point precipitation, gel filtration, electrophoresis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and the like. There are various affinity chromatography methods such as an antibody chromatography method, a chromatofocusing method, an adsorption chromatography method, a reverse phase chromatography method and the like, which may be appropriately selected and performed.
【0047】また、製造段階において、製造するwar
tsまたはwarts変異体は、他のポリペプチドとの
融合ペプチドとして形質転換体に生産させてもよい。こ
の場合は、精製工程において、ブロムシアン等の化学物
質やプロテーゼ等の酵素で処理して、wartsまたは
warts変異体を切り出す操作が必要になる。In the manufacturing stage, the war
A ts or warts mutant may be produced in a transformant as a fusion peptide with another polypeptide. In this case, in the purification step, it is necessary to perform an operation of treating with a chemical substance such as bromocyan or an enzyme such as a prosthesis to excise the warts or warts mutant.
【0048】wartsもしくはwarts変異体また
はそれらに特異的なアミノ酸配列からなるポリペプチド
をヒト以外かつ該wartsが由来する動物以外の動物
に免疫することで該wartsを認識する抗体(war
ts抗体)またはwarts変異体を認識する抗体(w
arts変異体抗体)がそれぞれ得られる。このwar
ts抗体またはwarts変異体抗体がwartsまた
はwarts変異体をそれぞれ認識することを確認する
ことは、ウェスタンブロット法、ELISA法や免疫染
色法(例えばFACSでの測定)等により可能である。An antibody that recognizes warts by immunizing animals other than humans and animals other than the animals from which the warts or the mutants thereof or the polypeptide having the amino acid sequence specific thereto is immunized.
ts antibody) or an antibody that recognizes the warts mutant (w
arts variant antibodies). This war
It is possible to confirm that the ts antibody or the warts mutant antibody recognizes the warts or the warts mutant, respectively, by a Western blot method, an ELISA method, an immunostaining method (for example, measurement by FACS), or the like.
【0049】また、免疫原として、蛋白質の一部であっ
ても該蛋白質の一部をウシ血清アルブミンなどの他のキ
ャリアー蛋白質に結合させたものを用いることは、よく
用いられる方法である。該蛋白質の一部は、例えばペプ
チド合成機を用いて合成してもよい。なお、蛋白質の一
部としては、8アミノ酸残基以上からなるものであるこ
とが好ましい。抗原性が明らかとなった物質について
は、免疫感作によってポリクローナル抗体が得られるな
らば、該免疫した動物のリンパ球を用いたハイブリドー
マによりモノクローナル抗体が産生されることはよく知
られている。したがって本発明の抗体はモノクローナル
抗体もその範囲内に含むものである。It is a commonly used method to use, as an immunogen, one obtained by binding a part of the protein to another carrier protein such as bovine serum albumin, even if it is a part of the protein. A part of the protein may be synthesized using, for example, a peptide synthesizer. In addition, it is preferable that a part of the protein is composed of eight or more amino acid residues. It is well known that, for a substance whose antigenicity has been revealed, if a polyclonal antibody is obtained by immunization, a monoclonal antibody is produced by a hybridoma using lymphocytes of the immunized animal. Therefore, the antibodies of the present invention also include monoclonal antibodies.
【0050】本発明においては、抗体は活性フラグメン
トをも包含するものである。活性フラグメントとは、抗
原抗体反応活性を有する抗体のフラグメントを意味し、
具体的には、F(ab′)2 、Fab′、Fab、Fv
などを挙げることができる。例えば、本発明の抗体をペ
プシンで分解するとF(ab’)2 が得られ、パパイン
で分解するとFabが得られる。F(ab’)2 を2−
メルカプトエタノールなどの試薬で還元して、モノヨー
ド酢酸でアルキル化するとFab’が得られる。Fvは
重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーで結合させた
一価の抗体活性フラグメントである。これらの活性フラ
グメントを保持し、その他の部分を他の動物のフラグメ
ントに置換することでキメラ抗体が得られる。In the present invention, an antibody also includes an active fragment. An active fragment means a fragment of an antibody having antigen-antibody reaction activity,
Specifically, F (ab ') 2 , Fab', Fab, Fv
And the like. For example, when the antibody of the present invention is digested with pepsin, F (ab ') 2 is obtained, and when digested with papain, Fab is obtained. F (ab ') 2 is 2-
Reduction with a reagent such as mercaptoethanol and alkylation with monoiodoacetic acid gives Fab '. Fv is a monovalent antibody active fragment in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked by a linker. A chimeric antibody can be obtained by retaining these active fragments and substituting other portions with fragments of another animal.
【0051】本発明の抗体は、wartsの発現等の機
能の解明や腫瘍の形成機構の解明のために使用可能であ
る。The antibody of the present invention can be used for elucidating functions such as expression of warts and elucidating the mechanism of tumor formation.
【0052】wartsの検出については、抗体を用い
る方法、酵素反応を利用する方法が挙げられる。抗体を
用いる方法としては具体的には、標識されたwart
s抗体を用いてwartsを検出する方法、wart
s抗体および該抗体の標識二次抗体を用いてwarts
を検出する方法が挙げられる。標識としては、例えば放
射性同位元素(RI)、酵素、アビジン又はビオチン、
もしくは蛍光物質(FITCやローダミン等)が利用さ
れる。The detection of warts includes a method using an antibody and a method using an enzymatic reaction. As a method using an antibody, specifically, a labeled warm
for detecting warts using s antibody, wart
using antibodies and labeled secondary antibodies to the antibodies
Is detected. Labels include, for example, radioisotopes (RI), enzymes, avidin or biotin,
Alternatively, a fluorescent substance (FITC, rhodamine, or the like) is used.
【0053】酵素反応を利用する方法としては、例え
ば、ELISA法、免疫凝集法、ウェスタンブロット
法、フローサイトメトリーを用いた免疫反応分子の同定
方法又はそれらに類似する方法が挙げられる。Examples of a method utilizing an enzyme reaction include an ELISA method, an immunoagglutination method, a Western blot method, a method for identifying an immunoreactive molecule using flow cytometry, or a method similar thereto.
【0054】[0054]
【実施例】以下に実施例を挙げて、より詳細に本発明を
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。 <実施例1>h−warts遺伝子の単離および塩基配
列の決定 1.ESTデータベースの検索 インターネットのESTデータベース(mRNAの断片
の配列を登録してあるデータベース、http://w
ww.ncbi.nlm.nih.gov./dbES
T/)に登録された配列(EST)から、d−wart
s遺伝子とホモロジーのある配列を探索したところ、Z
13665として登録されている配列がヒットした。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples. <Example 1> Isolation of h-warts gene and determination of base sequence EST database search Internet EST database (database in which sequences of mRNA fragments are registered, http: // w
ww. ncbi. nlm. nih. gov. / DbES
From the sequence (EST) registered in T /), d-wart
When searching for a sequence with homology to the s gene,
The sequence registered as 13665 was hit.
【0055】2.プライマーの合成 ヒトcDNAライブラリーから、上記のZ13665の
塩基配列の一部の塩基配列からなるDNAフラグメント
を取得するために以下のプライマーを合成した。Z13
665の3’側に、5’プライマーとしてwarts
S1プライマー5’−TATTCTCCTCAAGCA
TTTAAATTC−3’(配列表の配列番号6に記載
の塩基配列)、3’プライマーとしてwarts S2
プライマー5’−TTTATGGAGCAACATGT
AGAAAAT−3’(配列表の配列番号7に記載の塩
基配列)を設計し、DNA合成機(ABI社製、モデル
392)にて合成した。合成したプライマーは、蒸留水
で20pmol/μlに調製した。これをPCRプライ
マーとして用いて、以下のPCR操作を行った。2. Synthesis of Primers The following primers were synthesized from a human cDNA library in order to obtain a DNA fragment consisting of a part of the base sequence of Z13665 described above. Z13
665 on the 3 'side as 5' primers
S1 primer 5'-TATTCTCCTCAAGCA
TTTAAATTC-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing);
Primer 5'-TTTATGGAGCAACATGT
AGAAAAT-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing) was designed and synthesized using a DNA synthesizer (ABI, model 392). The synthesized primer was adjusted to 20 pmol / μl with distilled water. Using this as a PCR primer, the following PCR operation was performed.
【0056】3.PCR(1) cDNAライブラリーには、ヒト胎児脳のMatath
on−Ready cDNAライブラリー(クローンテ
ック社製)を用い、以下の条件でPCRを行った。プラ
イマーとしてwarts S1プライマーのみを使用
し、3’方向への一方向のみのPCRを行った。PCR
操作は、以下の組成からなる液を試験管に入れ、その上
にミネラルオイルを15μl重層し、94℃で5分間放
置した。 cDNAライブラリー(1μg/μl) 2μl dNTP混合液(各NTPを20pmol/μlにて蒸留水中に溶解) 1μl warts S1プライマー(20pmol/μl) 1μl 10倍濃度のPCR緩衝液(400mM Tris−HCl(pH8.3)、 1M KCl、100mM MgCl2 、100mM DTT) 1.5μl 蒸留水 9μl Taqポリメラーゼ(5unit/μl) 0.5μl 合計 15μl その後、「60℃で30秒間、続いて72℃で1.5分
間、続いて94℃で30秒間のサイクル」を50回繰り
返して反応を行った。次いで55℃で2分間、最後に7
2℃で10分間反応させて、断片の伸長反応を行いPC
R操作を完了した。3. PCR (1) The cDNA library contains the human fetal brain Math
Using an on-Ready cDNA library (manufactured by Clontech), PCR was performed under the following conditions. Using only the warts S1 primer as a primer, PCR was performed in only one direction in the 3 ′ direction. PCR
For the operation, a liquid having the following composition was placed in a test tube, and 15 μl of a mineral oil was overlaid thereon, and left at 94 ° C. for 5 minutes. cDNA library (1 μg / μl) 2 μl dNTP mixture (each NTP dissolved in distilled water at 20 pmol / μl) 1 μl warts S1 primer (20 pmol / μl) 1 μl 10-fold concentration of PCR buffer (400 mM Tris-HCl (pH8) 3), 1 M KCl, 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT) 1.5 μl distilled water 9 μl Taq polymerase (5 unit / μl) 0.5 μl total 15 μl Then, “30 ° C. for 30 seconds, followed by 1.5 minutes at 72 ° C. Then, a cycle of 94 ° C. for 30 seconds ”was repeated 50 times to carry out the reaction. Then at 55 ° C for 2 minutes, finally 7
The reaction was carried out at 2 ° C for 10 minutes to carry out a fragment extension reaction,
R operation completed.
【0057】その後、上記で得たPCR産物を鋳型とし
て、warts S2プライマーとcDNAのAP2プ
ライマーを用いて2度目のPCR操作を行った。2度目
のPCR操作は、以下の組成からなる液を試験管に入
れ、その上にミネラルオイルを20μl重層し、94℃
で5分間放置した。 上記で得たPCR産物(1μg/μl) 5μl dNTP混合液 2μl warts S2プライマー(20pmol/μl) 1μl AP2プライマー(20pmol/μl) 1μl 10倍濃度のPCR緩衝液(400mM Tris−HCl(pH8.3)、 1M KCl、100mM MgCl2 、100mM DTT) 2μl 蒸留水 8.5μl Taqポリメラーゼ(5units/μl) 0.5μl 合計 20μl その後、「60℃で30秒間、続いて72℃で1分間、
続いて94℃で30秒間のサイクル」を40回繰り返し
て反応を行った。次いで55℃で2分間、最後に72℃
で10分間反応させて、断片の伸長反応を行いPCR操
作を完了した。Thereafter, a second PCR operation was performed using the PCR product obtained above as a template and the primers warts S2 and the AP2 primer of cDNA. In the second PCR operation, a liquid having the following composition was placed in a test tube, and 20 μl of mineral oil was layered thereon, and the mixture was heated at 94 ° C.
For 5 minutes. PCR product obtained above (1 μg / μl) 5 μl dNTP mixture 2 μl warts S2 primer (20 pmol / μl) 1 μl AP2 primer (20 pmol / μl) 1 μl 10-fold concentration of PCR buffer (400 mM Tris-HCl (pH 8.3)) 1 M KCl, 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT) 2 μl Distilled water 8.5 μl Taq polymerase (5 units / μl) 0.5 μl Total 20 μl Then, “60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1 minute,
Subsequently, the cycle of 94 ° C. for 30 seconds ”was repeated 40 times to carry out the reaction. Then at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C
For 10 minutes to perform a fragment extension reaction to complete the PCR operation.
【0058】4.塩基配列の決定(1) 上記で得た3’伸長反応によるDNA断片(以降、フラ
グメントAということがある)をミニゲル電気泳動
(0.75%アガロースゲル)させて、フラグメントA
のバンドをゲルから切り出した。GeneClean
(バイオ101社製)でフラグメントAを回収して、ミ
ニゲル電気泳動でバンドをチェックした。4. Determination of base sequence (1) The DNA fragment obtained by the 3 ′ extension reaction obtained above (hereinafter sometimes referred to as fragment A) was subjected to minigel electrophoresis (0.75% agarose gel) to obtain fragment A.
Was cut from the gel. GeneClean
Fragment A was collected using Bio-101 (manufactured by Bio-101), and bands were checked by minigel electrophoresis.
【0059】フラグメントAを1μl取り、99μlの
TEにて希釈した。260nmでの吸光度(A260)
を測定し、DNA濃度を計算した(A260が1.0の
ときのDNA濃度を50μl/mlとした。)。DNA
濃度が1μg/μlになるようにTEでフラグメントA
を希釈した。1 μl of the fragment A was taken and diluted with 99 μl of TE. Absorbance at 260 nm (A260)
Was measured and the DNA concentration was calculated (when A260 was 1.0, the DNA concentration was 50 μl / ml). DNA
Fragment A with TE to a concentration of 1 μg / μl
Was diluted.
【0060】この希釈液について、warts S2プ
ライマー、AP2プライマーを用いて、ダイターミネー
ター法により、オートシークエンサー(ABIモデル3
73A)を用いて、DNAシークエンスを行い、フラグ
メントAの塩基配列を決定した。この塩基配列を配列表
の配列番号3に示す。An autosequencer (ABI model 3) was prepared for this diluted solution by the dye terminator method using the primers warts S2 and AP2.
DNA sequence was performed using 73A), and the nucleotide sequence of fragment A was determined. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
【0061】5.PCR(2) 前記のPCRと同様の方法で、Z13665の5’側
に、5’プライマーとしてwarts AS1プライマ
ー 5’−TGAAGTTGTAATCTGTTTCT
TTTC−3’(配列表の配列番号8に記載の塩基配
列)、3’プライマーとしてwarts AS2プライ
マー 5’−CTTGTTTTTCCTAACAGTA
ATAGG−3’(配列表の配列番号9に記載の塩基配
列)を設計し、DNA合成機(ABI社製、モデル39
2)にて合成した。合成したプライマーは、蒸留水で2
0pmol/μlに調製した。これをPCRプライマー
として用いて、PCR操作を行った。cDNAライブラ
リーには、ヒト胎児脳のMatathon−Ready
cDNAライブラリー(クローンテック社製)を用
い、以下の条件でPCRを行った。プライマーとしてw
arts AS2プライマーのみを使用し、5’方向へ
の一方向のみのPCRを行った。PCR操作は、以下の
組成からなる液を試験管に入れ、その上にミネラルオイ
ルを15μl重層し、94℃で5分間放置した。 cDNAライブラリー(1μg/μl) 2μl dNTP混合液(各NTPを20pmol/μlにて蒸留水中に溶解) 1μl warts AS2プライマー(20pmol/μl) 1μl 10倍濃度のPCR緩衝液(400mM Tris−HCl(pH8.3)、 1M KCl、100mM MgCl2 、100mM DTT) 1.5μl 蒸留水 9μl Taqポリメラーゼ(5unit/μl) 0.5μl 合計 15μl その後、「60℃で30秒間、続いて72℃で1.5分
間、続いて94℃で30秒間のサイクル」を50回繰り
返して反応を行った。次いで55℃で2分間、最後に7
2℃で10分間反応させて、断片の伸長反応を行いPC
R操作を完了した。5. PCR (2) In the same manner as in the above PCR, 5'-side of Z13665, as a 5 'primer, a warts AS1 primer 5'-TGAAGTTTGTAATCTGTTTCT
TTTC-3 ′ (base sequence described in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing), 3 ′ primer as warts AS2 primer 5′-CTTGTTTTTCTCAAACAGTA
ATAGG-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing) was designed, and a DNA synthesizer (ABI, model 39) was designed.
It was synthesized in 2). The synthesized primers were mixed with distilled water.
It was adjusted to 0 pmol / μl. Using this as a PCR primer, a PCR operation was performed. The cDNA library contains Mathon-Ready of human fetal brain.
Using a cDNA library (manufactured by Clontech), PCR was performed under the following conditions. W as a primer
Using only the arts AS2 primer, PCR was performed in only one direction in the 5 'direction. In the PCR operation, a liquid having the following composition was placed in a test tube, and 15 μl of mineral oil was overlaid thereon, and left at 94 ° C. for 5 minutes. cDNA library (1 μg / μl) 2 μl dNTP mixture (each NTP dissolved in distilled water at 20 pmol / μl) 1 μl warts AS2 primer (20 pmol / μl) 1 μl 10-fold concentration of PCR buffer (400 mM Tris-HCl (pH8) 3), 1 M KCl, 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT) 1.5 μl distilled water 9 μl Taq polymerase (5 unit / μl) 0.5 μl total 15 μl Then, “30 ° C. for 30 seconds, followed by 1.5 minutes at 72 ° C. Then, a cycle of 94 ° C. for 30 seconds ”was repeated 50 times to carry out the reaction. Then at 55 ° C for 2 minutes, finally 7
The reaction was carried out at 2 ° C for 10 minutes to carry out a fragment extension reaction,
R operation completed.
【0062】その後、上記で得たPCR産物を鋳型とし
て、warts AS1プライマーとcDNAのAP2
プライマーを用いて2度目のPCR操作を行った。2度
目のPCR操作は、以下の組成からなる液を試験管に入
れ、その上にミネラルオイルを20μl重層し、94℃
で5分間放置した。 上記で得たPCR産物(1μg/μl) 5μl dNTP混合液 2μl warts AS1プライマー(20pmol/μl) 1μl AP2プライマー(20pmol/μl) 1μl 10倍濃度のPCR緩衝液(400mM Tris−HCl(pH8.3)、 1M KCl、100mM MgCl2 、100mM DTT) 2μl 蒸留水 8.5μl Taqポリメラーゼ(5units/μl) 0.5μl 合計 20μl その後、「60℃で30秒間、続いて72℃で1分間、
続いて94℃で30秒間のサイクル」を40回繰り返し
て反応を行った。次いで55℃で2分間、最後に72℃
で10分間反応させて、断片の伸長反応を行いPCR操
作を完了した。Then, using the PCR product obtained above as a template, the primers warts AS1 and AP2 of the cDNA
A second PCR operation was performed using the primers. In the second PCR operation, a liquid having the following composition was placed in a test tube, and 20 μl of mineral oil was layered thereon, and the mixture was heated at 94 ° C.
For 5 minutes. PCR product obtained above (1 μg / μl) 5 μl dNTP mixture 2 μl warts AS1 primer (20 pmol / μl) 1 μl AP2 primer (20 pmol / μl) 1 μl 10-fold concentration of PCR buffer (400 mM Tris-HCl (pH 8.3)) 1 M KCl, 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT) 2 μl Distilled water 8.5 μl Taq polymerase (5 units / μl) 0.5 μl Total 20 μl Then, “60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1 minute,
Subsequently, the cycle of 94 ° C. for 30 seconds ”was repeated 40 times to carry out the reaction. Then at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C
For 10 minutes to perform a fragment extension reaction to complete the PCR operation.
【0063】6.塩基配列の決定(2) 上記で得た5’伸長反応によるDNA断片(以降、フラ
グメントBということがある)をミニゲル電気泳動
(0.75%アガロースゲル)させて、フラグメントB
のバンドをゲルから切り出した。GeneClean
(バイオ101社製)でフラグメントBを回収して、ミ
ニゲル電気泳動でバンドをチェックした。6. Determination of base sequence (2) The DNA fragment obtained by the 5 ′ extension reaction (hereinafter sometimes referred to as fragment B) obtained above was subjected to minigel electrophoresis (0.75% agarose gel) to obtain fragment B.
Was cut from the gel. GeneClean
Fragment B was recovered using a Bio-101 (manufactured by Bio-101), and bands were checked by minigel electrophoresis.
【0064】フラグメントBを1μl取り、99μlの
TEにて希釈した。260nmでの吸光度(A260)
を測定し、DNA濃度を計算した(A260が1.0の
ときのDNA濃度を50μl/mlとした。)。DNA
濃度が1μg/μlになるようにTEでフラグメントB
を希釈した。1 μl of the fragment B was taken and diluted with 99 μl of TE. Absorbance at 260 nm (A260)
Was measured and the DNA concentration was calculated (when A260 was 1.0, the DNA concentration was 50 μl / ml). DNA
Fragment B with TE to a concentration of 1 μg / μl
Was diluted.
【0065】この希釈液について、warts AS1
プライマー、AP2プライマーを用いて、ダイターミネ
ーター法により、オートシークエンサー(ABIモデル
373A)を用いて、DNAシークエンスを行い、フラ
グメントBの塩基配列を決定した。この塩基配列を配列
表の配列番号4に示す。For this diluent, warts AS1
DNA sequencing was carried out using a primer and AP2 primer by an auto-sequencer (ABI model 373A) by a dye terminator method, and the nucleotide sequence of fragment B was determined. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
【0066】7.PCR(3) 前記のPCRと同様の方法で、フラグメントBの5’側
に、5’プライマーとしてwarts AS11プライ
マー 5’−CTGGAGCAGAAGATGACTG
AGGCC−3’(配列表の配列番号10に記載の塩基
配列)、3’プライマーとしてwarts AS12プ
ライマー 5’−CATGCCCACTGCTCGGG
GATGACT−3’(配列表の配列番号11に記載の
塩基配列)を設計し、DNA合成機(ABI社製、モデ
ル392)にて合成した。合成したプライマーは、蒸留
水で20pmol/μlに調製した。これをPCRプラ
イマーとして用いて、PCR操作を行った。cDNAラ
イブラリーには、ヒト胎児脳のMatathon−Re
ady cDNAライブラリー(クローンテック社製)
を用い、以下の条件でPCRを行った。プライマーとし
てwarts AS12プライマーのみを使用し、5’
方向への一方向のみのPCRを行った。PCR操作は、
以下の組成からなる液を試験管に入れ、その上にミネラ
ルオイルを15μl重層し、94℃で5分間放置した。 cDNAライブラリー(1μg/μl) 2μl dNTP混合液(各NTPを20pmol/μlにて蒸留水中に溶解) 1μl warts AS12プライマー(20pmol/μl) 1μl 10倍濃度のPCR緩衝液(400mM Tris−HCl(pH8.3)、 1M KCl、100mM MgCl2 、100mM DTT) 1.5μl 蒸留水 9μl Taqポリメラーゼ(5unit/μl) 0.5μl 合計 15μl その後、「60℃で30秒間、続いて72℃で1.5分
間、続いて94℃で30秒間のサイクル」を50回繰り
返して反応を行った。次いで55℃で2分間、最後に7
2℃で10分間反応させて、断片の伸長反応を行いPC
R操作を完了した。7. PCR (3) In the same manner as in the above-mentioned PCR, on the 5 ′ side of fragment B, as a 5 ′ primer, a warts AS11 primer 5′-CTGGGAGCAGAAGATGATCGACTG
AGGCC-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing), 3' primer as a warts AS12 primer 5'-CATGCCCACTGCTCGGG
GATGACT-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing) was designed and synthesized using a DNA synthesizer (ABI, model 392). The synthesized primer was adjusted to 20 pmol / μl with distilled water. Using this as a PCR primer, a PCR operation was performed. The cDNA library contains Mathon-Re of human fetal brain.
ady cDNA library (Clontech)
Was performed under the following conditions. Using only the warts AS12 primer as the primer, 5 ′
PCR was performed in only one direction. The PCR operation is
A liquid having the following composition was placed in a test tube, and 15 μl of a mineral oil was overlaid thereon, and left at 94 ° C. for 5 minutes. cDNA library (1 μg / μl) 2 μl dNTP mixture (each NTP dissolved in distilled water at 20 pmol / μl) 1 μl warts AS12 primer (20 pmol / μl) 1 μl 10-fold concentration of PCR buffer (400 mM Tris-HCl (pH8) 3), 1 M KCl, 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT) 1.5 μl distilled water 9 μl Taq polymerase (5 unit / μl) 0.5 μl total 15 μl Then, “30 ° C. for 30 seconds, followed by 1.5 minutes at 72 ° C. Then, a cycle of 94 ° C. for 30 seconds ”was repeated 50 times to carry out the reaction. Then at 55 ° C for 2 minutes, finally 7
The reaction was carried out at 2 ° C for 10 minutes to carry out a fragment extension reaction,
R operation completed.
【0067】その後、上記で得たPCR産物を鋳型とし
て、warts AS11プライマーとcDNAのAP
2プライマーを用いて2度目のPCR操作を行った。2
度目のPCR操作は、以下の組成からなる液を試験管に
入れ、その上にミネラルオイルを20μl重層し、94
℃で5分間放置した。 上記で得たPCR産物(1μg/μl) 5μl dNTP混合液 2μl warts AS11プライマー(20pmol/μl) 1μl AP2プライマー(20pmol/μl) 1μl 10倍濃度のPCR緩衝液(400mM Tris−HCl(pH8.3)、 1M KCl、100mM MgCl2 、100mM DTT) 2μl 蒸留水 8.5μl Taqポリメラーゼ(5units/μl) 0.5μl 合計 20μl その後、「60℃で30秒間、続いて72℃で1分間、
続いて94℃で30秒間のサイクル」を40回繰り返し
て反応を行った。次いで55℃で2分間、最後に72℃
で10分間反応させて、断片の伸長反応を行いPCR操
作を完了した。Then, using the PCR product obtained above as a template, the warts AS11 primer and the cDNA AP
A second PCR operation was performed using the two primers. 2
In the second PCR operation, a solution having the following composition was put into a test tube, and 20 μl of mineral oil was overlaid thereon,
It was left at ℃ for 5 minutes. PCR product obtained above (1 μg / μl) 5 μl dNTP mixture 2 μl warts AS11 primer (20 pmol / μl) 1 μl AP2 primer (20 pmol / μl) 1 μl 10-fold concentration of PCR buffer (400 mM Tris-HCl (pH 8.3)) 1 M KCl, 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT) 2 μl Distilled water 8.5 μl Taq polymerase (5 units / μl) 0.5 μl Total 20 μl Then, “60 ° C. for 30 seconds, followed by 72 ° C. for 1 minute,
Subsequently, the cycle of 94 ° C. for 30 seconds ”was repeated 40 times to carry out the reaction. Then at 55 ° C for 2 minutes and finally at 72 ° C
For 10 minutes to perform a fragment extension reaction to complete the PCR operation.
【0068】8.塩基配列の決定(3) 上記で得た5’伸長反応によるDNA断片(以降、フラ
グメントCということがある)をミニゲル電気泳動
(0.75%アガロースゲル)させて、フラグメントC
のバンドをゲルから切り出した。GeneClean
(バイオ101社製)でフラグメントCを回収して、ミ
ニゲル電気泳動でバンドをチェックした。8. Determination of base sequence (3) The DNA fragment obtained by the 5 ′ extension reaction (hereinafter sometimes referred to as fragment C) obtained above was subjected to minigel electrophoresis (0.75% agarose gel) to obtain fragment C.
Was cut from the gel. GeneClean
Fragment C was collected using a Bio-101 (manufactured by Bio-101), and bands were checked by minigel electrophoresis.
【0069】フラグメントCを1μl取り、99μlの
TEにて希釈した。260nmでの吸光度(A260)
を測定し、DNA濃度を計算した(A260が1.0の
ときのDNA濃度を50μl/mlとした。)。DNA
濃度が1μg/μlになるようにTEでフラグメントC
を希釈した。1 μl of the fragment C was taken and diluted with 99 μl of TE. Absorbance at 260 nm (A260)
Was measured and the DNA concentration was calculated (when A260 was 1.0, the DNA concentration was 50 μl / ml). DNA
Fragment C with TE to a concentration of 1 μg / μl
Was diluted.
【0070】この希釈液について、warts AS1
1プライマー、AP2プライマーを用いて、ダイターミ
ネーター法により、オートシークエンサー(ABIモデ
ル373A)を用いて、DNAシークエンスを行い、フ
ラグメントCの塩基配列を決定した。この塩基配列を配
列表の配列番号5に示す。This diluent was added to the warts AS1
DNA sequencing was performed by an autosequencer (ABI model 373A) by a dye terminator method using one primer and AP2 primer, and the nucleotide sequence of fragment C was determined. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
【0071】9.h−warts遺伝子の取得 5’プライマーとしてフラグメントCの一部に相当する
S17センスプライマー 5’−TCTGGAAACA
TGGAATACGTAATC−3’(配列表の配列番
号12に記載の塩基配列)を、3’プライマーとしてフ
ラグメントAの一部に相当するAS22アンチセンスプ
ライマー 5’−TATGGGTAGCCATTGTC
ATCAAAA−3’(配列表の配列番号13に記載の
塩基配列)をDNA合成機(ABIモデル392)で合
成した。9. Acquisition of h-warts gene S17 sense primer corresponding to a part of fragment C as 5 'primer 5'-TCTGGAAACA
TGGAATACGTATAC-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 12 in the sequence listing) was used as the 3' primer and an AS22 antisense primer corresponding to a part of fragment A 5'-TATGGGTAGCCATTGTC
ATCAAAAA-3 ′ (base sequence described in SEQ ID NO: 13 in the sequence listing) was synthesized using a DNA synthesizer (ABI model 392).
【0072】ヒト胎児脳cDNAライブラリー(クロー
ンテック社製)を鋳型として上記のプライマーを用いて
PCR反応を行った。以下の組成からなる液を試験管に
入れ、その上にミネラルオイルを20μl重層し、94
℃で5分間放置した。 ヒト胎児脳cDNAライブラリー(1μg/μl) 5μl dNTP混合液(各NTPを20pmol/μlに蒸留水中に溶解) 1μl S22センスプライマー(20pmol/μl) 1μl AS22アンチセンスプライマー(20pmol/μl) 1μl 10倍濃度のPCR緩衝液(400mM Tris−HCl(pH8.3)、 1M KCl、100mM MgCl2 、100mM DTT) 2μl Taqポリメラーゼ(5units/μl) 0.5μl 蒸留水 9.5μl 合計 20μlA PCR reaction was performed using a human fetal brain cDNA library (Clontech) as a template and the above primers. A solution having the following composition was placed in a test tube, and 20 μl of mineral oil was overlaid thereon.
It was left at ℃ for 5 minutes. Human fetal brain cDNA library (1 μg / μl) 5 μl dNTP mixture (each NTP dissolved in distilled water at 20 pmol / μl) 1 μl S22 sense primer (20 pmol / μl) 1 μl AS22 antisense primer (20 pmol / μl) 1 μl 10 times Concentration of PCR buffer (400 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1 M KCl, 100 mM MgCl 2 , 100 mM DTT) 2 μl Taq polymerase (5 units / μl) 0.5 μl distilled water 9.5 μl total 20 μl
【0073】その後、「60℃で30秒間、続いて72
℃で2分間、続いて94℃で30秒間のサイクル」を4
0回繰り返して反応を行った。次いで、55℃で2分
間、最後に72℃で10分間反応させてPCR操作を完
了した。上記の反応後、PCR産物について、ミニゲル
電気泳動(0.75%アガロースゲル)を行った。その
結果、約2440kbpのバンドが観察された。上記に
よりh−warts遺伝子が単離された。h−wart
s遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号2に示す。図2
にh−wartsの全長遺伝子、フラグメントA、フラ
グメントB、フラグメントCおよびZ13665の位置
関係を示す。After that, “30 ° C. for 30 seconds,
Cycle for 2 minutes at 94 ° C followed by 30 seconds at 94 ° C.
The reaction was repeated 0 times. Then, the reaction was carried out at 55 ° C. for 2 minutes and finally at 72 ° C. for 10 minutes to complete the PCR operation. After the above reaction, the PCR product was subjected to mini-gel electrophoresis (0.75% agarose gel). As a result, a band of about 2440 kbp was observed. As described above, the h-warts gene was isolated. h-wart
The nucleotide sequence of the s gene is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. FIG.
Shows the positional relationship among the full length gene of h-warts, fragment A, fragment B, fragment C and Z13665.
【0074】10.アミノ酸配列の決定 上記の塩基配列より、h−wartsのアミノ酸配列を
決定した。このアミノ酸配列を配列表の配列番号1に示
す。h−warts蛋白質とd−warts蛋白質のホ
モロジーは、約70%であり、種間でよく保存された蛋
白質である。両者の対比を図1に示す。図1において、
h−wartsをh−wtsで表し、d−wartsを
d−wtsで表す。また、h−wartsのDM−PK
ドメインは配列表の配列番号1のアミノ酸配列の405
番目のLeuから768番目のTrpまでの部分であ
る。h−wartsとDM−PKとのホモロジーは約5
0%であった。h−wartsはその一次構造から、シ
グナル伝達および分化または増殖、特に悪性腫瘍との関
連が示唆される。10. Determination of amino acid sequence The amino acid sequence of h-warts was determined from the above base sequence. This amino acid sequence is shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The homology between the h-warts protein and the d-warts protein is about 70%, and the protein is well conserved among species. FIG. 1 shows a comparison between the two. In FIG.
h-warts is represented by h-wts, and d-warts is represented by d-wts. Also, h-warts DM-PK
The domain is 405 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
It is a portion from the Leu to the 768th Trp. The homology between h-warts and DM-PK is about 5
It was 0%. The primary structure of h-warts suggests signal transduction and differentiation or proliferation, particularly in relation to malignancies.
【0075】11.形質転換体の作製 上記の塩基配列からなる全長のhーwarts遺伝子を
pBj−Mycベクターに挿入し、該ベクターを大腸菌
DH5αに導入して形質転換体を作製した。この形質転
換体をmyc−wartsと名付け、平成9年9月24
日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した(受
託番号FERM P−16441)。11. Preparation of Transformant A full-length h-warts gene consisting of the above nucleotide sequence was inserted into a pBj-Myc vector, and the vector was introduced into Escherichia coli DH5α to prepare a transformant. This transformant was named myc-warts and was named September 24, 1997.
Deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Accession No. FERM P-16441).
【0076】<実施例2>h−wartsの各組織にお
ける発現 ヒトの各組織のポリA+RNA(mRNA)およびヒト
の各種細胞のポリA+RNA(mRNA)それぞれにつ
いて、各2μgをブロットしたメンブレン(Human
Multiple Tissue Northern
Blot I、同IIおよびHuman Cance
r Cell Line Multiple Tiss
ue Northern Blot(クローンテック社
製))に、以下の1)ないし4)の操作で標識化したフ
ラグメントAを、ハイストリンジェンシーの条件下で、
Molecular Cloning A Labor
atory Manual Second Editi
on 7.39ページないし7.52ページの記載にし
たがってハイブリダイズさせ、ノーザンブロットハイブ
リダイゼーション法による解析を行った。 1)Takara MEGA LABELキット(登録
商標、宝酒造社製)を用いて、h−warts遺伝子の
フラグメントA(実施例1で作製したもの)を標識化し
た。 2)次に、下記の組成のDNA反応液を調製し、この液
を37℃で30分間インキュベートした後、70℃で1
0分間熱処理し、酵素を失活させた。 DNAプローブ(2pmol/μl) 2μl 10倍ホスホライレイション緩衝液 2μl 〔γ−32P〕ATP(370MBq/ml)(アマシャム製) 5μl T4 ポリヌクレオチドキナーゼ 1μl 合計10μl<Example 2> Expression of h-warts in each tissue 2 μg of each of poly A + RNA (mRNA) of human tissues and poly A + RNA (mRNA) of various human cells was blotted on a membrane (Human).
Multiple Tissue Northern
Blot I, II and Human Cance
r Cell Line Multiple Tissue
ue Northern Blot (manufactured by Clontech)) and fragment A labeled by the following operations 1) to 4) under the conditions of high stringency under the conditions of high stringency.
Molecular Cloning A Labor
attory Manual Second Editi
on page 7.39 to 7.52, and hybridized and analyzed by Northern blot hybridization. 1) Fragment A of h-warts gene (produced in Example 1) was labeled using a Takara MEGA LABEL kit (registered trademark, manufactured by Takara Shuzo). 2) Next, a DNA reaction solution having the following composition was prepared, and this solution was incubated at 37 ° C for 30 minutes, and then incubated at 70 ° C for 1 minute.
Heat treatment was performed for 0 minutes to inactivate the enzyme. DNA probe (2 pmol / μl) 2 μl 10-fold phosphorylation buffer 2 μl [γ-32P] ATP (370 MBq / ml) (Amersham) 5 μl T4 polynucleotide kinase 1 μl Total 10 μl
【0077】3)T50E(50mM Tris−Cl
pH8.0、1mM EDTA)で平衡化されたSe
phadexG−25(登録商標、ファルマシア社製)
を1.5mlポリプレップカラム(バイオラッド社製)
にベッドボリュームが1mlになるように詰め、2)で
熱処理をしたDNA反応液を該カラムに載せる。 4)その後、T50Eを200μlずつカラムに4回流
し、2回目の200μlで溶出した画分から標識化DN
Aプローブを得た。3) T50E (50 mM Tris-Cl
Se equilibrated with pH 8.0, 1 mM EDTA)
phadex G-25 (registered trademark, manufactured by Pharmacia)
To a 1.5 ml polyprep column (Bio-Rad)
And the heat-treated DNA reaction solution in step 2) is placed on the column. 4) Thereafter, 200 μl of T50E was applied to the column four times, and the labeled DN was extracted from the fraction eluted with the second 200 μl.
A probe was obtained.
【0078】各組織についての結果の写真を、図3およ
び図4に示す。写真より、h−wartsのmRNA
(9.5kbのバンド)が肺および腎臓以外の組織で発
現していることが分かった。Photos of the results for each tissue are shown in FIGS. 3 and 4. From the photograph, mRNA of h-warts
(9.5 kb band) was found to be expressed in tissues other than lung and kidney.
【0079】各種細胞についての結果の写真を図5に示
す。写真より、肺癌由来細胞A549以外の細胞に発現
が認められた。FIG. 5 shows photographs of the results for various cells. From the photograph, expression was observed in cells other than the lung cancer-derived cell A549.
【0080】<実施例3>組み換えh−warts蛋白
質の作製 全長のhーwarts遺伝子をpBj−Mycベクター
に挿入し、該ベクターをCOS細胞(ATCC CRL
−1651)に導入して形質転換体を作製した。この形
質転換体を1×106 個に、50mM Tris−HC
l、150mMNaCl、1%Triton X−10
0、50mMヨードアセトアミド、2mM MgC
l2 、2mM CaCl2 、0.1% NaN3 、10
μg/ml大豆トリプシンインヒビター、1μg/ml
アプロチニン、1mM PMSF(フェニルメチルスル
ホニルフロライド)、1μg/mlロイペプチンからな
る組成の細胞溶解液100μlを加えてよく攪拌して溶
解した。氷上に60分間放置した後、15,000rp
mで10分間遠心分離し、上清液を回収した。Example 3 Preparation of Recombinant h-warts Protein The full-length h-warts gene was inserted into a pBj-Myc vector, and the vector was inserted into a COS cell (ATCC CRL).
1651) to prepare a transformant. This transformant was reduced to 1 × 10 6 cells in 50 mM Tris-HC.
1, 150 mM NaCl, 1% Triton X-10
0, 50 mM iodoacetamide, 2 mM MgC
l 2 , 2 mM CaCl 2 , 0.1% NaN 3 , 10
μg / ml soybean trypsin inhibitor, 1 μg / ml
Aprotinin, 100 μl of a cell lysis solution composed of 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), and 1 μg / ml leupeptin were added, and the mixture was stirred well to dissolve. After leaving on ice for 60 minutes, 15,000 rpm
and centrifuged at 10 m for 10 minutes, and the supernatant was collected.
【0081】回収した上清液に、免疫していないウサギ
のIgG 1mgを結合させたCNBr活性化セファロ
ースビーズ(ファルマシア社製)(抗体濃度1mg/m
l樹脂)50mlを添加した。4℃で一晩反応後、遠心
分離を行い、ビーズに結合する非特異的結合蛋白質を除
去し、上清を回収した。To the collected supernatant, CNBr-activated Sepharose beads (manufactured by Pharmacia) in which 1 mg of non-immunized rabbit IgG was bound (antibody concentration: 1 mg / m2)
(1 resin) was added. After reaction at 4 ° C. overnight, centrifugation was performed to remove non-specifically bound proteins binding to the beads, and the supernatant was recovered.
【0082】この上清10μlを、等量のSDS−PA
GE用サンプルバッファーおよび1μlの2−メルカプ
トエタノール(2ME)と混和し、95℃で熱処理を5
分間行った。その後、5−20%のグラディエントゲル
で電気泳動した。電気泳動後、ゲルをクマシー染色し
た。その結果、約88kDの位置にバンドが観察され、
組み換えh−wartsが作製されたことが確認され
た。10 μl of the supernatant was added to an equal volume of SDS-PA
Mix with GE sample buffer and 1 μl 2-mercaptoethanol (2ME) and heat treat at 95 ° C. for 5 minutes.
Minutes. Then, it was electrophoresed on a 5-20% gradient gel. After electrophoresis, the gel was Coomassie stained. As a result, a band was observed at a position of about 88 kD,
It was confirmed that recombinant h-warts were produced.
【0083】<実施例4>染色体マッピング h−wartsの全長遺伝子の染色体マッピングを、ラ
ジエイションハイブリッド細胞を用いたPCR法により
決定した。wartsシークエンス内にプライマーwt
s S6 5’−ACACAGGCTCAGAGATT
AAAA−3’(配列表の配列番号14に記載の塩基配
列)、プライマーwts AS7 5’−CCTCGA
ATTCCAGGCCCTTTTACAA−3’(配列
表の配列番号15に記載の塩基配列)を設計し、リサー
チジェネティクス(Research Genetic
s)社のヒトホールゲノム(human whole
genome)の93個のラジエイションハイブリッド
クローン(radiation hybrid clo
ne)に対しPCRを行った。その結果、前記プライマ
ー(wts S6またはwts AS7)がハイブリダ
イズしたパネルのセクション番号を、Whitehea
d Institute/MIT Center fo
r Genome Research(http:ww
w−genome.wi.mit.edu/cgi−b
in/contig/rhmapper.pl.)へ電
子メールで送り、該番号のパネルの染色体位置および塩
基配列の情報を得た。その塩基配列について、ESTデ
ータベースを探索したところ、ESTに登録されている
複数の塩基配列が、h−warts遺伝子の一部の塩基
配列とオーバーラップした。その結果、h−warts
は、ESTデータベースに登録されているD6S311
とWI5215の間に位置し、6番染色体長腕6q25
に位置づけられた。<Example 4> Chromosome mapping Chromosome mapping of the full-length gene of h-warts was determined by PCR using radiation hybrid cells. Primer wt in warts sequence
s S6 5'-ACACAGGCTCAGAGATT
AAAA-3 '(base sequence described in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing), primer wts AS7 5'-CCTCGA
ATTCCAGGCCCTTTTTACA-3 ′ (base sequence described in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing) was designed, and Research Genetics (Research Genetic) was designed.
s) Human whole genome (human whole)
Genome) 93 radiation hybrid clones
ne) was subjected to PCR. As a result, the section number of the panel to which the primer (wts S6 or wts AS7) was hybridized was changed to Whitehea.
d Institute / MIT Center fo
r Genome Research (http: www
w-genome. wi. mit. edu / cgi-b
in / contig / rhmapper. pl. ) By e-mail to obtain information on the chromosome position and nucleotide sequence of the panel with the number. When the EST database was searched for the base sequence, a plurality of base sequences registered in the EST overlapped with a part of the base sequence of the h-warts gene. As a result, h-warts
Is D6S311 registered in the EST database
Between chromosome 6 and long arm 6q25
Was positioned.
【0084】[0084]
【発明の効果】本発明により、ショウジョウバエのwa
rtsのホモログ蛋白質が脊椎動物にも存在することが
始めて明らかになった。本発明のwartsはシグナル
伝達、上皮細胞の分化または異常増殖に関与すると予想
される。したがって、本発明のwarts、その遺伝子
およびwartsを認識する抗体は腫瘍の形成の機序解
析に有効である。According to the present invention, Drosophila wa
It was first shown that rts homolog proteins are also present in vertebrates. The warts of the present invention are expected to be involved in signal transduction, epithelial cell differentiation or abnormal proliferation. Therefore, the warts of the present invention, their genes and antibodies recognizing warts are effective for analyzing the mechanism of tumor formation.
【0085】また、本発明のh−warts遺伝子は、
他の脊椎動物、特には哺乳類動物のcDNAライブラリ
ーから該動物におけるwarts遺伝子とのホモロジー
がd−warts遺伝子よりも高いとことから、h−w
artsをコードするポリヌクレチド、そのアンチセン
スポリヌクレオチドまたはそれらの一部は、他の脊椎動
物、特には哺乳類動物から該動物におけるwarts遺
伝子を取得するためのからプローブとして適している。Further, the h-warts gene of the present invention comprises:
Since the homology with the warts gene in other vertebrates, especially mammalian cDNA libraries, is higher than the d-warts gene in the animal, hw
Polynucleotides encoding arts, their antisense polynucleotides or portions thereof are suitable as probes for obtaining the warts gene in other vertebrates, especially mammals, from the animal.
【0086】[0086]
配列番号:1 配列の長さ:785 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:蛋白質 配列 Met Glu Tyr Val Ile Ser Arg Ile Ser Pro Val Pro Pro Gly Ala Trp 1 5 10 15 Gln Glu Gly Tyr Pro Pro Pro Leu Phe Asn Thr Ser Pro Met Asn Pro 20 25 30 Pro Asn Gln Gly Gln Arg Gly Ile Ser Ser Val Pro Val Gly Arg Gln 35 40 45 Pro Ile Ile Met Gln Ser Ser Ser Lys Phe Asn Phe Pro Ser Gly Arg 50 55 60 Pro Gly Met Gln Asn Gly Thr Gly Gln Thr Asp Phe Met Ile His Gln 65 70 75 80 Asn Val Val Pro Ala Gly Thr Val Asn Arg Gln Pro Pro Pro Pro Tyr 85 90 95 Pro Leu Thr Ala Ala Asn Gly Gln Ser Pro Ser Ala Leu Gln Thr Gly 100 105 110 Gly Ser Ala Ala Pro Ser Ser Tyr Thr Asn Gly Ser Ile Pro Gln Cys 115 120 125 Met Met Val Pro Asn Arg Asn Ser His Asn Met Glu Leu Tyr Asn Ile 130 135 140 Ser Val Pro Gly Leu Gln Thr Asn Trp Arg Gln Ser Ser Ser Ala Pro 145 150 155 160 Ala Gln Ser Ser Pro Ser Ser Gly His Glu Ile Pro Thr Trp Gln Pro 165 170 175 Asn Ile Pro Val Arg Ser Asn Ser Phe Asn Asn Pro Leu Gly Asn Arg 180 185 190 Ala Ser His Ser Ala Asn Ser Gln Pro Ser Ala Thr Thr Val Thr Ala 195 200 205 Ile Thr Pro Ala Pro Ile Gln Gln Pro Val Lys Ser Met Arg Val Leu 210 215 220 Lys Pro Glu Leu Gln Thr Ala Leu Ala Pro Thr His Pro Ser Trp Ile 225 230 235 240 Pro Gln Pro Ile Gln Thr Val Gln Pro Ser Pro Phe Pro Glu Gly Thr 245 250 255 Ala Ser Asn Val Thr Val Met Pro Pro Val Ala Glu Ala Pro Asn Tyr 260 265 270 Gln Gly Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys His Leu Leu His Gln Asn Pro 275 280 285 Ser Val Pro Pro Tyr Glu Ser Ile Ser Lys Pro Ser Lys Glu Asp Gln 290 295 300 Pro Ser Leu Pro Lys Glu Asp Glu Ser Glu Lys Ser Tyr Glu Asn Val 305 310 315 320 Asp Ser Gly Asp Lys Glu Lys Lys Gln Ile Thr Thr Ser Pro Ile Thr 325 330 335 Val Arg Lys Asn Lys Lys Asp Glu Glu Arg Arg Glu Ser Arg Ile Gln 340 345 350 Ser Tyr Ser Pro Gln Ala Phe Lys Phe Phe Met Glu Gln His Val Glu 355 360 365 Asn Val Leu Lys Ser His Gln Gln Arg Leu His Arg Lys Lys Gln Leu 370 375 380 Glu Asn Glu Met Met Arg Val Gly Leu Ser Gln Asp Ala Gln Asp Gln 385 390 395 400 Met Arg Lys Met Leu Cys Gln Lys Glu Ser Asn Tyr Ile Arg Leu Lys 405 410 415 Arg Ala Lys Met Asp Lys Ser Met Phe Val Lys Ile Lys Thr Leu Gly 420 425 430 Ile Gly Ala Phe Gly Glu Val Cys Leu Ala Arg Lys Val Asp Thr Lys 435 440 445 Ala Leu Tyr Ala Thr Lys Thr Leu Arg Lys Lys Asp Val Leu Leu Arg 450 455 460 Asn Gln Val Ala His Val Lys Ala Glu Arg Asp Ile Leu Ala Glu Ala 465 470 475 480 Asp Asn Glu Trp Val Val Arg Leu Tyr Tyr Ser Phe Gln Asp Lys Asp 485 490 495 Asn Leu Tyr Phe Val Met Asp Tyr Ile Pro Gly Gly Asp Met Met Ser 500 505 510 Leu Leu Ile Arg Met Gly Ile Phe Pro Glu Ser Leu Ala Arg Phe Tyr 515 520 525 Ile Ala Glu Leu Thr Cys Ala Val Glu Ser Val His Lys Met Gly Phe 530 535 540 Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Asp Arg Asp Gly 545 550 555 560 His Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Thr Gly Phe Arg Trp Thr 565 570 575 His Asp Ser Lys Tyr Tyr Gln Ser Gly Asp His Pro Arg Gln Asp Ser 580 585 590 Met Asp Phe Ser Asn Glu Trp Gly Asp Pro Ser Ser Cys Arg Cys Gly 595 600 605 Asp Arg Leu Lys Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ala Arg Gln His Gln Arg 610 615 620 Cys Leu Ala His Ser Leu Val Gly Thr Pro Asn Tyr Ile Ala Pro Glu 625 630 635 640 Val Leu Leu Arg Thr Gly Tyr Thr Gln Leu Cys Asp Trp Trp Ser Val 645 650 655 Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Leu Val Gly Gln Pro Pro Phe Leu Ala 660 665 670 Gln Thr Pro Leu Glu Thr Gln Met Lys Val Ile Asn Trp Gln Thr Ser 675 680 685 Leu His Ile Pro Pro Gln Ala Lys Leu Ser Pro Glu Ala Ser Asp Leu 690 695 700 Ile Ile Lys Leu Cys Arg Gly Pro Glu Asp Arg Leu Gly Lys Asn Gly 705 710 715 720 Ala Asp Glu Ile Lys Ala His Pro Phe Phe Lys Thr Ile Asp Phe Ser 725 730 735 Ser Asp Leu Arg Gln Gln Ser Ala Ser Tyr Ile Pro Lys Ile Thr His 740 745 750 Pro Thr Asp Thr Ser Asn Phe Asp Pro Val Asp Pro Asp Lys Leu Trp 755 760 765 Ser Asp Asp Asn Glu Glu Glu Asn Val Asn Asp Thr Leu Asn Gly Met 770 775 780 Val 785 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 785 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Protein sequence Met Glu Tyr Val Ile Ser Arg Ile Ser Pro Val Pro Pro Gly Ala Trp 1 5 10 15 Gln Glu Gly Tyr Pro Pro Pro Leu Phe Asn Thr Ser Pro Met Asn Pro 20 25 30 Pro Asn Gln Gly Gln Arg Gly Ile Ser Ser Val Pro Val Gly Arg Gln 35 40 45 Pro Ile Ile Met Gln Ser Ser Ser Lys Phe Asn Phe Pro Ser Gly Arg 50 55 60 Pro Gly Met Gln Asn Gly Thr Gly Gln Thr Asp Phe Met Ile His Gln 65 70 75 80 Asn Val Val Pro Ala Gly Thr Val Asn Arg Gln Pro Pro Pro Pro Tyr 85 90 95 Pro Leu Thr Ala Ala Asn Gly Gln Ser Pro Ser Ala Leu Gln Thr Gly 100 105 110 Gly Ser Ala Ala Pro Ser Ser Tyr Thr Asn Gly Ser Ile Pro Gln Cys 115 120 125 Met Met Val Pro Asn Arg Asn Ser His Asn Met Glu Leu Tyr Asn Ile 130 135 140 Ser Val Pro Gly Leu Gln Thr Asn Trp Arg Gln Ser Ser Ser Ala Pro 145 150 155 160 Ala Gln Ser Ser Pro Ser Ser Gly His Glu Ile Pro Thr Trp Gln Pro 165 170 175 Asn Ile Pro Val Arg Ser Asn Ser Phe Asn Asn Pro Leu Gly Asn Arg 180 185 190 Ala Ser His Ser Ala Asn Ser Gln Pro Ser Ala Thr Thr Val Thr Ala 195 200 205 Ile Thr Pro Ala Pro Ile Gln Gln Pro Val Lys Ser Met Arg Val Leu 210 215 220 Lys Pro Glu Leu Gln Thr Ala Leu Ala Pro Thr His Pro Ser Trp Ile 225 230 235 240 Pro Gln Pro Ile Gln Thr Val Gln Pro Ser Pro Phe Pro Glu Gly Thr 245 250 255 Ala Ser Asn Val Thr Val Met Pro Pro Val Ala Glu Ala Pro Asn Tyr 260 265 270 Gln Gly Pro Pro Pro Pro Tyr Pro Lys His Leu Leu His Gln Asn Pro 275 280 285 Ser Val Pro Pro Tyr Glu Ser Ile Ser Lys Pro Ser Lys Glu Asp Gln 290 295 300 Pro Ser Leu Pro Lys Glu Asp Glu Ser Glu Lys Ser Tyr Glu Asn Val 305 310 315 320 Asp Ser Gly Asp Lys Glu Lys Lys Gln Ile Thr Thr Ser Pro Ile Thr 325 330 335 Val Arg Lys Asn Lys Lys Asp Glu Glu Arg Arg Glu Ser Arg Ile Gln 340 345 350 Ser Tyr Ser Pro Gln Ala Phe Lys Phe Phe Met Glu Gln His Val Glu 355 360 365 Asn Val Leu Lys Ser His Gln Gln Arg Leu His Arg Lys Lys Gln Leu 370 375 380 Glu Asn Glu Met Met Arg Val Gly Leu SerGln Asp Ala Gln Asp Gln 385 390 395 400 400 Met Arg Lys Met Leu Cys Gln Lys Glu Ser Asn Tyr Ile Arg Leu Lys 405 410 415 Arg Ala Lys Met Asp Lys Ser Met Phe Val Lys Ile Lys Thr Leu Gly 420 425 430 Ile Gly Ala Phe Gly Glu Val Cys Leu Ala Arg Lys Val Asp Thr Lys 435 440 445 Ala Leu Tyr Ala Thr Lys Thr Leu Arg Lys Lys Asp Val Leu Leu Arg 450 455 460 Asn Gln Val Ala His Val Lys Ala Glu Arg Asp Ile Leu Ala Glu Ala 465 470 475 480 Asp Asn Glu Trp Val Val Arg Leu Tyr Tyr Ser Phe Gln Asp Lys Asp 485 490 495 Asn Leu Tyr Phe Val Met Asp Tyr Ile Pro Gly Gly Asp Met Met Ser 500 505 510 Leu Leu Ile Arg Met Gly Ile Phe Pro Glu Ser Leu Ala Arg Phe Tyr 515 520 525 Ile Ala Glu Leu Thr Cys Ala Val Glu Ser Val His Lys Met Gly Phe 530 535 540 Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Ile Leu Ile Asp Arg Asp Gly 545 550 555 560 His Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Thr Gly Phe Arg Trp Thr 565 570 575 His Asp Ser Lys Tyr Tyr Gln Ser Gly Asp His Pro Arg Gln Asp Ser 580 585 590 Met Asp Phe Ser Asn Glu Trp Gly Asp ProSer Ser Cys Arg Cys Gly 595 600 605 Asp Arg Leu Lys Pro Leu Glu Arg Arg Ala Ala Arg Gln His Gln Arg 610 615 620 Cys Leu Ala His Ser Leu Val Gly Thr Pro Asn Tyr Ile Ala Pro Glu 625 630 635 635 640 Val Leu Leu Arg Thr Gly Tyr Thr Gln Leu Cys Asp Trp Trp Ser Val 645 650 655 Gly Val Ile Leu Phe Glu Met Leu Val Gly Gln Pro Pro Phe Leu Ala 660 665 670 Gln Thr Pro Leu Glu Thr Gln Met Lys Val Ile Asn Trp Gln Thr Ser 675 680 685 Leu His Ile Pro Pro Gln Ala Lys Leu Ser Pro Glu Ala Ser Asp Leu 690 695 700 Ile Ile Lys Leu Cys Arg Gly Pro Glu Asp Arg Leu Gly Lys Asn Gly 705 710 710 715 720 Ala Asp Glu Ile Lys Ala His Pro Phe Phe Lys Thr Ile Asp Phe Ser 725 730 735 Ser Asp Leu Arg Gln Gln Ser Ala Ser Tyr Ile Pro Lys Ile Thr His 740 745 750 Pro Thr Asp Thr Ser Asn Phe Asp Pro Val Asp Pro Asp Lys Leu Trp 755 760 765 Ser Asp Asp Asn Glu Glu Glu Asn Val Asn Asp Thr Leu Asn Gly Met 770 775 780 Val 785
【0087】配列番号:2 配列の長さ:2442 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列 TCTGGAAAC ATG GAA TAC GTA ATC TCC CGA ATC TCT CCT GTC CCA CCT 48 GGG GCA TGG CAA GAG GGC TAT CCT CCA CCA CTT TTC AAC ACT TCC CCC 96 ATG AAT CCT CCT AAT CAA GGA CAG AGA GGC ATT AGT TCT GTT CCT GTT 144 GGC AGA CAA CCA ATC ATC ATG CAG AGT TCT AGC AAA TTT AAC TTT CCA 192 TCA GGG AGA CCT GGA ATG CAG AAT GGT ACT GGA CAA ACT GAT TTC ATG 240 ATA CAC CAA AAT GTT GTC CCT GCT GGC ACT GTG AAT CGG CAG CCA CCA 288 CCT CCA TAT CCT CTG ACA GCA GCT AAT GGA CAA AGC CCT TCT GCT TTA 336 CAA ACA GGG GGA TCT GCT GCT CCT TCG TCA TAT ACA AAT GGA AGT ATT 384 CCT CAG TGT ATG ATG GTG CCA AAC AGA AAT AGT CAT AAC ATG GAA CTA 432 TAT AAC ATT AGT GTA CCT GGA CTG CAA ACA AAT TGG CGT CAG TCA TCT 480 TCT GCT CCA GCC CAG TCA TCC CCG AGC AGT GGG CAT GAA ATC CCT ACA 528 TGG CAA CCT AAC ATA CCA GTG AGG TCA AAT TCT TTT AAT AAC CCA TTA 576 GGA AAT AGA GCA AGT CAC TCT GCT AAT TCT CAG CCT TCT GCT ACA ACA 624 GTC ACT GCA ATT ACA CCA GCT CCT ATT CAA CAG CCT GTG AAA AGT ATG 672 CGT GTA TTA AAA CCA GAG CTA CAG ACT GCT TTA GCA CCT ACA CAC CCT 720 TCT TGG ATA CCA CAG CCA ATT CAA ACT GTT CAA CCC AGT CCT TTT CCT 768 GAG GGA ACC GCT TCA AAT GTG ACT GTG ATG CCA CCT GTT GCT GAA GCT 816 CCA AAC TAT CAA GGA CCA CCA CCA CCC TAC CCA AAA CAT CTG CTG CAC 864 CAA AAC CCA TCT GTT CCT CCA TAC GAG TCA ATC AGT AAG CCT AGC AAA 912 GAG GAT CAG CCA AGC TTG CCC AAG GAA GAT GAG AGT GAA AAG AGT TAT 960 GAA AAT GTT GAT AGT GGG GAT AAA GAA AAG AAA CAG ATT ACA ACT TCA 1008 CCT ATT ACT GTT AGG AAA AAC AAG AAA GAT GAA GAG CGA AGG GAA TCT 1056 CGT ATT CAA AGT TAT TCT CCT CAA GCA TTT AAA TTC TTT ATG GAG CAA 1104 CAT GTA GAA AAT GTA CTC AAA TCT CAT CAG CAG CGT CTA CAT CGT AAA 1152 AAA CAA TTA GAG AAT GAA ATG ATG CGG GTT GGA TTA TCT CAA GAT GCC 1200 CAG GAT CAA ATG AGA AAG ATG CTT TGC CAA AAA GAA TCT AAT TAC ATC 1248 CGT CTT AAA AGG GCT AAA ATG GAC AAG TCT ATG TTT GTG AAG ATA AAG 1296 ACA CTA GGA ATA GGA GCA TTT GGT GAA GTC TGT CTA GCA AGA AAA GTA 1344 GAT ACT AAG GCT TTG TAT GCA ACA AAA ACT CTT CGA AAG AAA GAT GTT 1392 CTT CTT CGA AAT CAA GTC GCT CAT GTT AAG GCT GAG AGA GAT ATC CTG 1440 GCT GAA GCT GAC AAT GAA TGG GTA GTT CGT CTA TAT TAT TCA TTC CAA 1488 GAT AAG GAC AAT TTA TAC TTT GTA ATG GAC TAC ATT CCT GGG GGT GAT 1536 ATG ATG AGC CTA TTA ATT AGA ATG GGC ATC TTT CCA GAA AGT CTG GCA 1584 CGA TTC TAC ATA GCA GAA CTT ACC TGT GCA GTT GAA AGT GTT CAT AAA 1632 ATG GGT TTT ATT CAT AGA GAT ATT AAA CCT GAT AAT ATT TTG ATT GAT 1680 CGT GAT GGT CAT ATT AAA TTG ACT GAC TTT GGC CTC TGC ACT GGC TTC 1728 AGA TGG ACA CAC GAT TCT AAG TAC TAT CAG AGT GGT GAC CAT CCA CGG 1776 CAA GAT AGC ATG GAT TTC AGT AAT GAA TGG GGG GAT CCC TCA AGC TGT 1824 CGA TGT GGA GAC AGA CTG AAG CCA TTA GAG CGG AGA GCT GCA CGC CAG 1872 CAC CAG CGA TGT CTA GCA CAT TCT TTG GTT GGG ACT CCC AAT TAT ATT 1920 GCA CCT GAA GTG TTG CTA CGA ACA GGA TAC ACA CAG TTG TGT GAT TGG 1968 TGG AGT GTT GGT GTT ATT CTT TTT GAA ATG TTG GTG GGA CAA CCT CCT 2016 TTC TTG GCA CAA ACA CCA TTA GAA ACA CAA ATG AAG GTT ATC AAC TGG 2064 CAA ACA TCT CTT CAC ATT CCA CCA CAA GCT AAA CTC AGT CCT GAA GCT 2112 TCT GAT CTT ATT ATT AAA CTT TGC CGA GGA CCC GAA GAT CGC TTA GGC 2160 AAG AAT GGT GCT GAT GAA ATA AAA GCT CAT CCA TTT TTT AAA ACA ATT 2208 GAT TTC TCC AGT GAC CTG AGA CAG CAG TCT GCT TCA TAC ATT CCT AAA 2256 ATC ACA CAC CCA ACA GAT ACA TCA AAT TTT GAT CCT GTT GAT CCT GAT 2304 AAA TTA TGG AGT GAT GAT AAC GAG GAA GAA AAT GTA AAT GAC ACT CTC 2352 AAT GGG ATG GTA TAA AAATGGAAAG CATCCTGAAC ATGCATTCTA TGAATTTACC 2407 TTCCGAAGGT TTTTTGATGA CAATGGCTAC CCATA 2442SEQ ID NO: 2 Sequence length: 2442 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA sequence TCTGGAAAC ATG GAA TAC GTA ATC TCC CGA ATC TCT CCT GTC CCA CCT 48 GGG GCA TGG CAA GAG GGC TAT CCT CCA CCA CTT TTC AAC ACT TCC CCC 96 ATG AAT CCT CCT AAT CAA GGA CAG AGA GGC ATT AGT TCT GTT CCT GTT 144 GGC AGA CAA CCA ATC ATC ATG CAG AGT TCT AGC AAA TTT AAC TTT CCA 192 TCA GGG AGA CCT GGA ATG CAG AAT GGT ACT GGA CAA ACT GAT TTC ATG 240 ATA CAC CAA AAT GTT GTC CCT GCT GGC ACT GTG AAT CGG CAG CCA CCA 288 CCT CCA TAT CCT CTG ACA GCA GCT AAT GGA AGA CCT TCT GCT TTA 336 CAA ACA GGG GGA TCT GCT GCT CCT TCG TCA TAT ACA AAT GGA AGT ATT 384 CCT CAG TGT ATG ATG GTG CCA AAC AGA AGA AAT AGT CAT AAC ATG GAA CTA 432 TAT AAC ATT AGT GTA CCT AGA ACA CACA TGG CGT CAG TCA TCT 480 TCT GCT CCA GCC CAG TCA TCC CCG AGC AGT GGG CAT GAA ATC CCT ACA 528 TGG CAA CCT AAC ATA CCA GTG AGG TCA AAT TCT TTT AAT AAC CC A TTA 576 GGA AAT AGA GCA AGT CAC TCT GCT AAT TCT CAG CCT TCT GCT ACA ACA 624 GTC ACT GCA ATT ACA CCA GCT CCT ATT CAA CAG CCT GTG AAA AGT ATG 672 CGT GTA TTA AAA CCA GAG CTA CAG ACT GCT TTA GCACT ACA CAC CCT 720 TCT TGG ATA CCA CAG CCA ATT CAA ACT GTT CAA CCC AGT CCT TTT CCT 768 GAG GGA ACC GCT TCA AAT GTG ACT GTG ATG CCA CCT GTT GCT GAA GCT 816 CCA AAC TAT CAA GGA CCA CCA CCA CCC TACCA AAA CAT CTG CTG CAC 864 CAA AAC CCA TCT GTT CCT CCA TAC GAG TCA ATC AGT AAG CCT AGC AAA 912 GAG GAT CAG CCA AGC TTG CCC AAG GAA GAT GAG AGT GAA AAG AGT TAT 960 GAA AAT GTT GAT AGT GGG GAT AAA GAA AAA CAG ATT ACA ACT TCA 1008 CCT ATT ACT GTT AGG AAA AAC AAG AAA GAT GAA GAG CGA AGG GAA TCT 1056 CGT ATT CAA AGT TAT TCT CCT CAA GCA TTT AAA TTC TTT ATG GAG CAA 1104 CAT GTA GAA AAT GTA CTC AAA TCT CAT CAG CAG CGT CTA CAT CGT AAA 1152 AAA CAA TTA GAG AAT GAA ATG ATG CGG GTT GGA TTA TCT CAA GAT GCC 1200 CAG GAT CAA ATG AGA AAG ATG CTT TGC CAA AAA GAA TCT AAT TAC ATC 1248 CGT CTT AAA AGG GCT AAA ATG GAC AAG TCT ATG TTT GTG AAG ATA AAG 1296 ACA CTA GGA ATA GGA GCA TTT GGT GAA GTC TGT CTA GCA AGA AAA GTA 1344 GAT ACT AAG GCT TTG TAT GCA ACA AAA ACT CTT CGA AAG AAA GAT GTT 1392 CTT CTT CGA AAT CAA GTC GCT CAT GTT AAG GCT GAG AGA GAT ATC CTG 1440 GCT GAA GCT GAC AAT GAA TGG GTA GTT CGT CTA TAT TAT TCA TTC CAA 1488 GAT AAG GAC AAT TTA TAC TTT GTA ATG GAC TAC ATT CCT GGG GGT GAT 1536 ATG ATG AGC CTA AGA ATG GGC ATC TTT CCA GAA AGT CTG GCA 1584 CGA TTC TAC ATA GCA GAA CTT ACC TGT GCA GTT GAA AGT GTT CAT AAA 1632 ATG GGT TTT ATT CAT AGA GAT ATT AAA CCT GAT AAT ATT TTG ATT GAT 1680 CGT GAT GGT CAT AAA TTG ACT GAC TTT GGC CTC TGC ACT GGC TTC 1728 AGA TGG ACA CAC GAT TCT AAG TAC TAT CAG AGT GGT GAC CAT CCA CGG 1776 CAA GAT AGC ATG GAT TTC AGT AAT GAA TGG GGG GAT CCC TCA AGC TGT G24 GGA AGA CTG AAG CCA TTA GAG CGG AGA GCT GCA CGC CAG 1872 CAC CAG CGA TGT CTA GCA CAT TCT TTG GTT GGG ACT CCC AAT TAT ATT 1920 GCA CCT GAA GTG TTG CTA CGA ACA GGA TAC ACA CAG TTG TGT GAT TGG 19 68 TGG AGT GTT GGT GTT ATT CTT TTT GAA ATG TTG GTG GGA CAA CCT CCT 2016 TTC TTG GCA CAA ACA CCA TTA GAA ACA CAA ATG AAG GTT ATC AAC TGG 2064 CAA ACA TCT CTT CAC ATT CCA CCA CAA GCT AAA CTC AGT CCT GAA GCT 2112 TCT GAT CTT ATT ATT AAA CTT TGC CGA GGA CCC GAA GAT CGC TTA GGC 2160 AAG AAT GGT GCT GAT GAA ATA AAA GCT CAT CCA TTT TTT AAA ACA ATT 2208 GAT TTC TCC AGT GAC CTG AGA CAG CAG TCT GCT TCA TACATT CCT AAA 2256 ATC ACA CAC CCA ACA GAT ACA TCA AAT TTT GAT CCT GTT GAT CCT GAT 2304 AAA TTA TGG AGT GAT GAT AAC GAG GAA GAA AAT GTA AAT GAC ACT CTC 2352 AAT GGG ATG GTA TAA AAATGGAAAG CATCCT GATC ATGCATTCGATCATTGATCATGATCATTGATCATC CCATA 2442
【0088】配列番号:3 配列の長さ:1374 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列 TAT TCT CCT CAA GCA TTT AAA TTC TTT ATG GAG CAA CAT GTA GAA AAT 48 GTA CTC AAA TCT CAT CAG CAG CGT CTA CAT CGT AAA AAA CAA TTA GAG 96 AAT GAA ATG ATG CGG GTT GGA TTA TCT CAA GAT GCC CAG GAT CAA ATG 144 AGA AAG ATG CTT TGC CAA AAA GAA TCT AAT TAC ATC CGT CTT AAA AGG 192 GCT AAA ATG GAC AAG TCT ATG TTT GTG AAG ATA AAG ACA CTA GGA ATA 240 GGA GCA TTT GGT GAA GTC TGT CTA GCA AGA AAA GTA GAT ACT AAG GCT 288 TTG TAT GCA ACA AAA ACT CTT CGA AAG AAA GAT GTT CTT CTT CGA AAT 336 CAA GTC GCT CAT GTT AAG GCT GAG AGA GAT ATC CTG GCT GAA GCT GAC 384 AAT GAA TGG GTA GTT CGT CTA TAT TAT TCA TTC CAA GAT AAG GAC AAT 432 TTA TAC TTT GTA ATG GAC TAC ATT CCT GGG GGT GAT ATG ATG AGC CTA 480 TTA ATT AGA ATG GGC ATC TTT CCA GAA AGT CTG GCA CGA TTC TAC ATA 528 GCA GAA CTT ACC TGT GCA GTT GAA AGT GTT CAT AAA ATG GGT TTT ATT 576 CAT AGA GAT ATT AAA CCT GAT AAT ATT TTG ATT GAT CGT GAT GGT CAT 624 ATT AAA TTG ACT GAC TTT GGC CTC TGC ACT GGC TTC AGA TGG ACA CAC 672 GAT TCT AAG TAC TAT CAG AGT GGT GAC CAT CCA CGG CAA GAT AGC ATG 720 GAT TTC AGT AAT GAA TGG GGG GAT CCC TCA AGC TGT CGA TGT GGA GAC 768 AGA CTG AAG CCA TTA GAG CGG AGA GCT GCA CGC CAG CAC CAG CGA TGT 816 CTA GCA CAT TCT TTG GTT GGG ACT CCC AAT TAT ATT GCA CCT GAA GTG 864 TTG CTA CGA ACA GGA TAC ACA CAG TTG TGT GAT TGG TGG AGT GTT GGT 912 GTT ATT CTT TTT GAA ATG TTG GTG GGA CAA CCT CCT TTC TTG GCA CAA 960 ACA CCA TTA GAA ACA CAA ATG AAG GTT ATC AAC TGG CAA ACA TCT CTT 1008 CAC ATT CCA CCA CAA GCT AAA CTC AGT CCT GAA GCT TCT GAT CTT ATT 1056 ATT AAA CTT TGC CGA GGA CCC GAA GAT CGC TTA GGC AAG AAT GGT GCT 1104 GAT GAA ATA AAA GCT CAT CCA TTT TTT AAA ACA ATT GAT TTC TCC AGT 1152 GAC CTG AGA CAG CAG TCT GCT TCA TAC ATT CCT AAA ATC ACA CAC CCA 1200 ACA GAT ACA TCA AAT TTT GAT CCT GTT GAT CCT GAT AAA TTA TGG AGT 1248 GAT GAT AAC GAG GAA GAA AAT GTA AAT GAC ACT CTC AAT GGG ATG GTA 1296 TAA AAATGGAAAG CATCCTGAAC ATGCATTCTA TGAATTTACC TTCCGAAGGT 1349 TTTTTGATGA CAATGGCTAC CCATA 1374SEQ ID NO: 3 Sequence length: 1374 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA sequence TAT TCT CCT CAA GCA TTT AAA TTC TTT ATG GAG CAA CAT GTA GAA AAT 48 GTA CTC AAA TCT CAT CAG CAG CGT CTA CAT CGT AAA AAA CAA TTA GAG 96 AAT GAA ATG ATG CGG GTT GGA TTA TCT CAA GAT GCC CAG GAT CAA ATG 144 AGA AAG ATG CTT TGC CAA AAA GAA TCT AAT TAC ATC CGT CTT AAA AGG 192 GCT AAA ATG GAC AAG TCT ATG TTT GTG AAG ATA AAG ACA CTA GGA ATA 240 GGA GCA TTT GGT GAA GTC TGT CTA GCA AGA AAA GTA GAT ACT AAG GCT 288 TTG TAT GCA ACA AAA ACT CTT CGA AAG AAA GAT GTT CTT CTT CGA AAT 336 CAA GTC GCT CAT GTT AAG GCT GAG AGA GAT ATC CTG GCT GAA GCT GAC 384 AAT GAA TGG GTA GTT CGT CTA TAT TAT TCA TTC CAA GAT AAG GAC AAT 432 TTA TAC TTT GTA ATG GAC TAC ATT GGG GGT GAT ATG ATG AGC CTA 480 TTA ATT AGA ATG GGC ATC TTT CCA GAA AGT CTG GCA CGA TTC TAC ATA 528 GCA GAA CTT ACC TGT GCA GTT GAA AGT GTT CAT AAA ATG GGT TTT ATT 576 CAT AGA GAT ATT AAA CCT GAT AAT ATT TTG ATT GAT CGT GAT GGT CAT 624 ATT AAA TTG ACT GAC TTT GGC CTC TGC ACT GGC TTC AGA TGG ACA CAC 672 GAT TCT AAG TAC TAT CAG AGT GGT GAC CAT CCA CGA GAT AGC ATG 720 GAT TTC AGT AAT GAA TGG GGG GAT CCC TCA AGC TGT CGA TGT GGA GAC 768 AGA CTG AAG CCA TTA GAG CGG AGA GCT GCA CGC CAG CAC CAG CGA TGT 816 CTA GCA CAT TCT TTG GTT GGG ACT CCC AAT TAT GCA CCT GAA GTG 864 TTG CTA CGA ACA GGA TAC ACA CAG TTG TGT GAT TGG TGG AGT GTT GGT 912 GTT ATT CTT TTT GAA ATG TTG GTG GGA CAA CCT CCT TTC TTG GCA CAA 960 ACA CCA TTA GAA ACA CAA ATG AAG ATC ATG ATC ATC TGG CAA ACA TCT CTT 1008 CAC ATT CCA CCA CAA GCT AAA CTC AGT CCT GAA GCT TCT GAT CTT ATT 1056 ATT AAA CTT TGC CGA GGA CCC GAA GAT CGC TTA GGC AAG AAT GGT GCT 1104 GAT GAA ATA AAA GCT CAT CCA TTT TTT AAA ACA ATT GAT TTC TCC AGT 1152 GAC CTG AGA CAG CAG TCT GCT TCA TAC ATT CCT AAA ATC ACA CAC CCA 1200 ACA GAT ACA TCA AAT TTT GAT CCT GTT GAT CCT GAT AAA TTA TGG AGT 1248 GAT GAT AAC GAG GAA GAA AAT GT A AAT GAC ACT CTC AAT GGG ATG GTA 1296 TAA AAATGGAAAG CATCCTGAAC ATGCATTCTA TGAATTTACC TTCCGAAGGT 1349 TTTTTGATGA CAATGGCTAC CCATA 1374
【0089】配列番号:4 配列の長さ:582 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列 GGA CTG CAA ACA AAT TGG CGT CAG TCA TCT TCT GCT CCA GCC CAG TCA 48 TCC CCG AGC AGT GGG CAT GAA ATC CCT ACA TGG CAA CCT AAC ATA CCA 96 GTG AGG TCA AAT TCT TTT AAT AAC CCA TTA GGA AAT AGA GCA AGT CAC 144 TCT GCT AAT TCT CAG CCT TCT GCT ACA ACA GTC ACT GCA ATT ACA CCA 192 GCT CCT ATT CAA CAG CCT GTG AAA AGT ATG CGT GTA TTA AAA CCA GAG 240 CTA CAG ACT GCT TTA GCA CCT ACA CAC CCT TCT TGG ATA CCA CAG CCA 288 ATT CAA ACT GTT CAA CCC AGT CCT TTT CCT GAG GGA ACC GCT TCA AAT 336 GTG ACT GTG ATG CCA CCT GTT GCT GAA GCT CCA AAC TAT CAA GGA CCA 384 CCA CCA CCC TAC CCA AAA CAT CTG CTG CAC CAA AAC CCA TCT GTT CCT 432 CCA TAC GAG TCA ATC AGT AAG CCT AGC AAA GAG GAT CAG CCA AGC TTG 480 CCC AAG GAA GAT GAG AGT GAA AAG AGT TAT GAA AAT GTT GAT AGT GGG 528 GAT AAA GAA AAG AAA CAG ATT ACA ACT TCA CCT ATT ACT GTT AGG AAA 576 AAC AAG 582SEQ ID NO: 4 Sequence length: 582 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA sequence GGA CTG CAA ACA AAT TGG CGT CAG TCA TCT TCT GCT CCA GCC CAG TCA 48 TCC CCG AGC AGT GGG CAT GAA ATC CCT ACA TGG CAA CCT AAC ATA CCA 96 GTG AGG TCA AAT TCT TTT AAT AAC CCA TTA GGA AAT AGA GCA AGT CAC 144 TCT GCT AAT TCT CAG CCT TCT GCT ACA ATC ACT GCA ATT ACA CCA 192 GCT CCT ATT CAA CAG CCT GTG AAA AGT ATG CGT GTA TTA AAA CCA GAG 240 CTA CAG ACT GCT TTA GCA CCT ACA CAC CCT TCT TGG ATA CCA CAG CCA 288 ATT CAA ACT GTT CAA CCC AGT CCT TTTCT GAG GGA ACC GCT TCA AAT 336 GTG ACT GTG ATG CCA CCT GTT GCT GAA GCT CCA AAC TAT CAA GGA CCA 384 CCA CCA CCC TAC CCA AAA CAT CTG CTG CAC CAA AAC CCA TCT GTT CCT 432 CCA TAC GAG TCA ATC AGT AAG CAG AAA GAG GAT CAG CCA AGC TTG 480 CCC AAG GAA GAT GAG AGT GAA AAG AGT TAT GAA AAT GTT GAT AGT GGG 528 GAT AAA GAA AAG AAA CAG ATT ACA ACT TCA CCT ATT ACT GTT AGG AAA 576 AAC AAG 582
【0090】配列番号:5 配列の長さ:795 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to mRNA 配列 GTTCCTCAGA GGCATGGCCC GCCACTAGGA GAAAGTGTGG CCTATCATTC TGAGAGTCCC 60 AACTCACAGA CAGATGTAGG AAGACCTTTG TCTGGATCTG GTATATCAGC ATTTGTTCAA 120 GCTCACCCTA GCAACGGACA GAGAGTGAAC CCCCCACCAC CACCTCAAGT AAGGAGTGTT 180 ACTCCTCCAC CACCTCCAAG AGGCCAGACT CCCCCTCCAA GAGGTACAAC TCCACCTCCC 240 CCTTCATGGG AACCAAACTC TCAAACAAAG CGCTATTCTG GAAAC ATG GAA TAC GTA 297 ATC TCC CGA ATC TCT CCT GTC CCA CCT GGG GCA TGG CAA GAG GGC TAT 345 CCT CCA CCA CTT TTC AAC ACT TCC CCC ATG AAT CCT CCT AAT CAA GGA 393 CAG AGA GGC ATT AGT TCT GTT CCT GTT GGC AGA CAA CCA ATC ATC ATG 441 CAG AGT TCT AGC AAA TTT AAC TTT CCA TCA GGG AGA CCT GGA ATG CAG 489 AAT GGT ACT GGA CAA ACT GAT TTC ATG ATA CAC CAA AAT GTT GTC CCT 537 GCT GGC ACT GTG AAT CGG CAG CCA CCA CCT CCA TAT CCT CTG ACA GCA 585 GCT AAT GGA CAA AGC CCT TCT GCT TTA CAA ACA GGG GGA TCT GCT GCT 633 CCT TCG TCA TAT ACA AAT GGA AGT ATT CCT CAG TGT ATG ATG GTG CCA 681 AAC AGA AAT AGT CAT AAC ATG GAA CTA TAT AAC ATT AGT GTA CCT GGA 729 CTG CAA ACA AAT TGG CGT CAG TCA TCT TCT GCT CCA GCC CAG TCA TCC 777 CCG AGC AGT GGG CAT GAA 795SEQ ID NO: 5 Sequence length: 795 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA sequence GTTCCTCAGA GGCATGGCCC GCCACTAGGA GAAAGTGTGG CCTATCATTC TGAGAGTCCC 60 AACTCACAGA CAGATGTAGG AAGACCTGTCGATCAGTCGATCAG ATTTGTTCAA 120 GCTCACCCTA GCAACGGACA GAGAGTGAAC CCCCCACCAC CACCTCAAGT AAGGAGTGTT 180 ACTCCTCCAC CACCTCCAAG AGGCCAGACT CCCCCTCCAA GAGGTACAAC TCCACCTCCC 240 CCTTCATGGG AACCAAACTC TCAAACAAAG CGCTATTCTG GAAAC ATG GAA TAC GTA 297 ATC TCC CGA ATC TCT CCT GTC CCA CCT GGG GCA TGG CAA GAG GGC TAT 345 CCT CCA CCA CTT TTC AAC ACT TCC CCC ATG AAT CCT CCT AAT CAA GGA 393 CAG AGA GGC ATT AGT TCT GTT CCT GTT GGC AGA CAA CCA ATC ATC ATG 441 CAG AGT TCT AGC AAA TTT AAC TTT CCA TCA GGG AGA CCT GGA ATG CAG 489 AAT GGT ACT GGA ACT GAT TTC ATG ATA CAC CAA AAT GTT GTC CCT 537 GCT GGC ACT GTG AAT CGG CAG CCA CCA CCT CCA TAT CCT CTG ACA GCA 585 GCT AAT GGA CAA AGC CCT TCT GCT TTA CAA ACA GGG GGA TCT GCT GCT 633 CCT TCG TCA TAT ACA AAT GGA AGT ATT CCT CAG TGT ATG ATG GTG CCA 681 AAC AGA AAT AGT CAT AAC ATG GAA CTA TAT AAC ATT AGT GTA CCT GGA 729 CTG CAA ACA AAT TGG CGT CAG TCT TCT CCA GCC CAG TCA TCC 777 CCG AGC AGT GGG CAT GAA 795
【0091】配列番号:6 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 TATTCTCCTC AAGCATTTAA ATTC 24SEQ ID NO: 6 Sequence length: 24 Sequence type: number of nucleic acid chains: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid sequence TATTCTCCTC AAGCATTTAA ATTC 24
【0092】配列番号:7 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 TTTATGGAGC AACATGTAGA AAAT 24SEQ ID NO: 7 Sequence length: 24 Sequence type: number of nucleic acid chains: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid sequence TTTATGGAGC AACATGTAGA AAAT 24
【0093】配列番号:8 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 TGAAGTTGTA ATCTGTTTCT TTTC 24SEQ ID NO: 8 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: other nucleic acid sequence TGAAGTTGTA ATCTGTTTCT TTTC 24
【0094】配列番号:9 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 CTTGTTTTTC CTAACAGTAA TAGG 24SEQ ID NO: 9 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single strand Topology: linear Sequence type: other nucleic acid sequence CTTGTTTTTC CTAACAGTAA TAGG 24
【0095】配列番号:10 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 CTGGAGCAGA AGATGACTGA GGCC 24SEQ ID NO: 10 Sequence length: 24 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid sequence CTGGAGCAGA AGATGACTGA GGCC 24
【0096】配列番号:11 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 CATGCCCACT GCTCGGGGAT GACT 24SEQ ID NO: 11 Sequence length: 24 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid sequence CATGCCCACT GCTCGGGGAT GACT 24
【0097】配列番号:12 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 TCTGGAAACA TGGAATACGT AATC 24SEQ ID NO: 12 Sequence length: 24 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid sequence TCTGGAAACA TGGAATACGT AATC 24
【0098】配列番号:13 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 TATGGGTAGC CATTGTCATC AAAA 24SEQ ID NO: 13 Sequence length: 24 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid sequence TATGGGTAGC CATTGTCATC AAAA 24
【0099】配列番号:14 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 ACACAGGCTC AGAGATTAAA A 21SEQ ID NO: 14 Sequence length: 21 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Sequence ACACAGGCTC AGAGATTAAA A 21
【0100】配列番号:15 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 CCTCGAATTC CAGGCCCTTT TACAA
25SEQ ID NO: 15 Sequence length: 25 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acid sequence CCTCGAATTC CAGGCCCTTT TACAA
25
【図1】h−wartsおよびd−wartsのアミノ
酸配列を対比させた図である。FIG. 1 is a diagram comparing the amino acid sequences of h-warts and d-warts.
【図2】h−warts遺伝子を取得する過程で得られ
たcDNAフラグメント、ESTおよび各プライマーの
位置関係を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the positional relationship between a cDNA fragment, EST and each primer obtained in the process of obtaining the h-warts gene.
【図3】ヒト各組織のmRNAについて、h−wart
sのcDNAをハイブリダイズさせたノーザンブロット
ハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動写真であ
る。FIG. 3 shows h-wart for mRNA of each human tissue.
5 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization obtained by hybridizing cDNA of s.
【図4】ヒト各組織のmRNAについて、h−wart
sのcDNAをハイブリダイズさせたノーザンブロット
ハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動写真であ
る。FIG. 4 shows the h-wart of mRNA of each human tissue.
5 is an electrophoretic photograph showing the results of Northern blot hybridization obtained by hybridizing cDNA of s.
【図5】ヒト各細胞株のmRNAについて、h−war
tsのcDNAをハイブリダイズさせたノーザンブロッ
トハイブリダイゼーションの結果を示す電気泳動写真で
ある。FIG. 5 shows h-war of mRNA of each human cell line.
It is an electrophoresis photograph which shows the result of Northern blot hybridization which hybridized ts cDNA.
─────────────────────────────────────────────────────
────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成9年9月25日[Submission date] September 25, 1997
【手続補正1】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図3[Correction target item name] Figure 3
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図3】 FIG. 3
【手続補正2】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図4[Correction target item name] Fig. 4
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図4】 FIG. 4
【手続補正3】[Procedure amendment 3]
【補正対象書類名】図面[Document name to be amended] Drawing
【補正対象項目名】図5[Correction target item name] Fig. 5
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【図5】 FIG. 5
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI G01N 33/532 G01N 33/532 A // C12P 21/02 C12P 21/02 C (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 西山 康之 熊本県熊本市平成一丁目2番12号 (72)発明者 佐谷 秀行 熊本県熊本市渡鹿一丁目16番6号31──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI G01N 33/532 G01N 33/532 A // C12P 21/02 C12P 21/02 C (C12N 15/09 ZNA C12R 1:91) ( C72P 21/02 C12R 1:19) (72) Inventor Yasuyuki Nishiyama 2-1-1, Heisei 1-chome, Kumamoto-shi, Kumamoto Prefecture (72) Inventor Hideyuki Saya 1-16-16, Wataka, Kumamoto-shi, Kumamoto Prefecture
Claims (10)
列からなる蛋白質1. A protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
列における一または複数のアミノ酸を欠失、他のアミノ
酸と置換または他のアミノ酸を付加してなるアミノ酸配
列からなる蛋白質。2. A protein comprising an amino acid sequence obtained by deleting one or more amino acids, substituting another amino acid, or adding another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
ドするポリヌクレオチド。3. A polynucleotide encoding the protein according to claim 1 or 2.
ンチセンス鎖の塩基配列からなるアンチセンスポリヌク
レオチドまたは該アンチセンスポリヌクレオチドの誘導
体。4. An antisense polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the antisense strand of the polynucleotide according to claim 3, or a derivative of the antisense polynucleotide.
は請求項4に記載のアンチセンスポリヌクレオチドのう
ちの一部であって、連続する12塩基以上からなるポリ
ヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチド。5. A polynucleotide or antisense polynucleotide which is a part of the polynucleotide according to claim 3 or the antisense polynucleotide according to claim 4, wherein the polynucleotide or the polynucleotide comprises 12 or more consecutive bases.
のポリヌクレオチドまたはアンチセンスポリヌクレオチ
ドを化学修飾したポリヌクレオチドまたはアンチセンス
ポリヌクレオチド。6. A polynucleotide or an antisense polynucleotide obtained by chemically modifying the polynucleotide or the antisense polynucleotide according to any one of claims 3 to 5.
らなるDNAのホモログであるcDNAを取得する方法
であって、請求項5または6に記載のポリヌクレオチド
またはアンチセンスポリヌクレオチドをプローブとし
て、脊椎動物のcDNAライブラリーから該プローブと
ハイブリダイズするcDNAを取得する方法。7. A method for obtaining a cDNA which is a homolog of a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, wherein the polynucleotide or the antisense polynucleotide according to claim 5 or 6 is used as a probe. And obtaining a cDNA that hybridizes with the probe from a vertebrate cDNA library.
らなるDNAのホモログであるcDNAであって、請求
項7に記載の方法によって取得されたcDNA。8. A cDNA which is a homolog of a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and which is obtained by the method according to claim 7.
る蛋白質であって、請求項8に記載のcDNAがコード
するアミノ酸配列からなる蛋白質。9. A protein which is a homolog of the protein according to claim 1, wherein the protein comprises the amino acid sequence encoded by the cDNA according to claim 8.
に記載の蛋白質を認識する抗体。10. An antibody recognizing the protein according to claim 1, 2 or 9.
Priority Applications (3)
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