JP3832973B2

JP3832973B2 - Human transcription-related protein and cDNA encoding this protein

Info

Publication number: JP3832973B2
Application number: JP23590198A
Authority: JP
Inventors: 晃彦小室; 美帆呂佐伯; 誠志加藤
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-08-21
Filing date: 1998-08-21
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2018-08-21
Also published as: JP2000060562A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、ヒト核蛋白質Ｎpw38と結合する新規なヒト転写関連蛋白質と、この蛋白質をコードしているヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡ、および上記蛋白質に対する抗体に関するものである。この発明の蛋白質および抗体は、各種疾患の診断および治療に有用であり、ヒトｃＤＮＡは遺伝子診断用プローブや遺伝子治療用遺伝子源として有用である。また、ｃＤＮＡは、この発明の蛋白質を大量生産するための遺伝子源として用いることが出来る。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト核蛋白質Ｎpw38は、ＷＷドメインを有する３８ｋＤａの核蛋白質として見いだされた［小室ら、第７０回日本生化学会大会講演要旨集、p.548 ］。ＷＷドメインとはＳＨ２、ＳＨ３、ＰＨ、ＰＴＢドメインと類似した蛋白質−蛋白質相互作用モチーフの新しいファミリーである。このドメインは、２個の保存されたトリプトファンを持つ約40アミノ酸残基からなり、ＳＨ３ドメインと同様にプロリンリッチなアミノ酸配列に結合することが知られている[H. I. Chen and M. Sudol. (1995 ) Proc. Natl. Sci.92, 7819-7823]。Ｎｐｗ３８のＷＷドメインは、転写活性促進作用を有することが示されている［小室ら、第２０回日本分子生物学会年会講演要旨集、ｐ．３６９］。したがって、このＷＷドメインに結合する蛋白質が、転写活性化に関与していると考えられる。
【０００３】
転写活性に関与する因子は、発生・分化などの生命現象のみならず、癌等の疾患とも密接に関係している［村松正寛編、NEW メディカルサイエンス、「転写のしくみと疾患」］。従って、これらの蛋白質は特定遺伝子の転写・翻訳を調節する低分子医薬品を開発するためのターゲット蛋白質としての可能性を秘めており、できるだけ多くの転写関連蛋白質を得ることが望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、医薬品などの開発に有用なヒト蛋白質、特に、ヒト核蛋白質Ｎpw38と結合する新規な転写関連蛋白質を提供することを課題としている。
またこの出願の発明は、この蛋白質をコードするヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡおよび蛋白質に対する抗体などの遺伝子操作材料を提供することを課題としている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
この出願は、上記の課題を解決する発明として、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むヒト転写関連蛋白質を提供する。
また、この出願は、配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは複数のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むヒト転写関連蛋白質を提供する。
【０００６】
さらに、この出願は、上記のヒト転写関連蛋白質をコードするヒト遺伝子、この遺伝子のｃＤＮＡであって、配列番号２の塩基配列を含むｃＤＮＡ、および配列番号２の一部配列からなるＤＮＡ断片を提供する。
さらにまた、この出願は、上記ｃＤＮＡを保有する組換えベクター、および上記のヒト転写関連蛋白質に対する抗体を提供する。
【０００７】
以下、この発明の実施の形態について詳しく説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
この発明のヒト転写関連蛋白質は、公知の方法、すなわちヒトの臓器、細胞株などから単離する方法、この発明によって提供されるのアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいはこの発明によって提供されるｃＤＮ断片を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。例えば、組換えＤＮＡ技術によって蛋白質を取得する場合には、この発明のｃＤＮＡ断片を有するベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行なうことによりインビトロで発現できる。また翻訳領域を公知の方法により適当な発現ベクターに組換えてやれば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等で、コードしている蛋白質を大量に発現させることができる。
【０００９】
この発明の蛋白質をインビトロ翻訳でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域をＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに組換え、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含む、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加してやれば、この発明の蛋白質をインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７
１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢluescript IIなどが例示できる。
【００１０】
この発明の蛋白質を大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ｃＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、この発明のｃＤＮＡの翻訳領域を組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養してやれば、このｃＤＮＡがコードしている蛋白質を微生物内で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させてやれば、任意の領域を含む蛋白質断片を得ることができる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによってこのｃＤＮＡがコードする蛋白質部分のみを取得することもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
【００１１】
この発明の蛋白質を真核細胞でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、このｃＤＮＡの翻訳領域を、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに組換え、真核細胞内に導入してやれば、この発明の蛋白質を動物細胞内で生産することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この蛋白質を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００１２】
この発明の蛋白質を原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１３】
この発明の蛋白質には、配列番号１で表されるアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列を含むペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれる。これらのペプチド断片は抗体を作製するための抗原として用いることができる。この発明の蛋白質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も含まれる。例えば、実施例に挙げたグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質などである。
【００１４】
この発明の遺伝子は、上記蛋白質をコードするヒトの遺伝子であって、例えば、この発明のｃＤＮＡまたはその一部配列をプローブとして、既存のゲノムライブラリーから単離することができる。
この発明のｃＤＮＡは、例えばヒト細胞由来ｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。ｃＤＮＡはヒト細胞から抽出したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを鋳型として合成する。ヒト細胞としては、人体から手術などによって摘出されたものでも培養細胞でも良い。ｃＤＮＡは、岡山−Berg法［Okayama, H and Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2:161-170 (1982)］、Gubler−Hoffman 法［Guler, U. and Hoffman, J. Gene 25:263-269 (1983)］等、いかなる方法を用いて合成してもよいが、完全長クローンを効率的に得るためには、実施例にあげたようなキャッピング法［Kato, S. et al. Gene 150:243-250 (1994) ］を用いることが望ましい。また市販のヒトｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーからこの発明のｃＤＮＡをクローン化するには、この発明のｃＤＮＡの任意の部分の塩基配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。また、目的とするｃＤＮＡ断片の両末端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いて、ヒト細胞から単離したｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により、この発明のｃＤＮＡ断片を調製することもできる。
【００１５】
この発明のｃＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を含むことを特徴とするものであり、1926bpのオープンリーディングフレームを有している。このオープンリーディングフレームは、641 アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしている。
この発明の蛋白質は、いかなる組織でも発現しているので、配列番号２に記載のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細胞から作製したヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、この発明のｃＤＮＡと同一のクローンを容易に得ることができる。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドをプライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、目的ｃＤＮＡを合成することもできる。
【００１６】
この発明の蛋白質は、転写活性化能を有するヒト核蛋白質Ｎpw38と結合するものであり、また、ポリリボＧや一本鎖ＤＮＡとも結合する。従って、この発明の蛋白質は、転写調節において重要な役割を有していると考えられる。
一般にヒト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従って配列番号２において、１または複数個のヌクレオチドの付加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換がなされているｃＤＮＡもこの発明のｃＤＮＡに含まれる。
【００１７】
同様に、これらの変更によって生じる、１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換がなされている蛋白質も、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性を有する限り、この発明の蛋白質に含まれる。
この発明のＤＮＡ断片には、配列番号２で表される塩基配列のいかなる部分塩基配列を含むｃＤＮＡ断片（１０ｂｐ以上）も含まれる。また、センス鎖およびアンチセンス鎖からなるＤＮＡ断片もこの範疇に入る。これらのＤＮＡ断片は遺伝子診断用のプローブとして用いることができる。
【００１８】
この発明の蛋白質に対する抗体は、蛋白質それ自体、またはその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。
【００１９】
【実施例】
次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応は、文献［"Molecular Cloning. Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1989”］に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特に記載の無い場合は宝酒造社製のものを用いた。各酵素反応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従った。ｃＤＮＡ合成は文献［Kato, S. et al.,Gene 150:243-250, (1994)］に従った。
実施例１：ヒトＮpw38ｃＤＮＡのクローニング
ヒト胃癌細胞ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ97/03190記載）から選択したｃＤＮＡクローンの大規模塩基配列決定の結果、クローンＨＰ10345 を得た。このクローンは、170bp の５’非翻訳領域、798bp のオープンリーディングフレーム、52bpの３’非翻訳領域からなる構造を有していた（配列番号３）。オープンリーディングフレームは265 アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。
【００２０】
モチーフ配列検索を行ったところ、46番目から78番目までの領域が、ＷＷドメインと類似性を有していた。52番目と75番目のトリプトファン、78番目のプロリンが、これまで知られている全てのＷＷドメインに保存されているアミノ酸残基である。この蛋白質のアミノ酸配列における他の特徴として、21番目から41番目までの酸性アミノ酸残基（アスパラギン酸とグルタミン酸）に富む領域、104 番目から176 番目までの酸性アミノ酸残基と塩基性アミノ酸残基が交互に並ぶ領域があることなどが挙げられる。
実施例２：大腸菌によるＧＳＴ融合蛋白質の発現
EcoRI 認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる25 merのセンスプライマー(5'-CCGAATTCATGCCGCTGCCCGTTGC-3') とEcoRI 認識部位を付加した停止コドンまでを含む25 merのアンチセンスプライマー(5'-CCGAATTCTCAATCCTGCTGCTTGG-3') を用い、ｐＨＰ10345 を鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物を EcoRIで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１(Pharmacia社製) の EcoRI部位に挿入した。塩基配列を確認した後、宿主大腸菌ＢＬ21の形質転換を行った。ＬＢ培地中で37℃で５時間培養し、IPTGを最終濃度が0.4 mMになるように加え、さらに37℃で2.5 時間培養した。菌体を遠心により分離し、溶解溶液（50 mM Tris-HCl（pH7.5 ）, 1mM EDTA-1 % Triton X-100 , 0.2% SDS, 0.2 mM PMSF ）に溶かし、一度-80 ℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を行った。1000 x gで30分遠心し、上清にグルタチオンセファロース４Ｂを加え、４℃で１時間インキュベートした。ビーズを十分洗浄した後、溶出溶液（10 mM Tris-50 mMグルタチオン）で融合蛋白質を溶出した。その結果、分子量約 60 kDa の GST-HP10345融合蛋白質を得た。
（３）Ｎpw38結合蛋白質の精製
HeLa-S3 細胞（1 x 10¹⁰個）に低張バッファー（20 mM Hepes (pH7.4), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂）を加え、4 ℃で10分間放置し、ダウンス型ホモジェナイザーにより均一化した。1000 x g, 15分の遠心により核画分を得た。核画分を0.5 ％NP-40 を含む低張バッファーで２回洗浄した後、高張バッファー（20 mM Hepes (pH7.4), 250 mM NaCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.5% NP-40）により４℃、30分間抽出し、核抽出液とした。
【００２１】
上記の核抽出物40 ml にGST-Ｎpw38融合蛋白質25 mg を加え、４℃、ローテーターにて２時間攪拌した。グルタチオンセファロース４Ｂを加え、さらに、４℃、２時間インキュベートし、ビーズを十分洗浄した後、10 mM Tris、50 mM グルタチオンで溶出した。溶出液をSDS-PAGEにかけたところ、約100kDaの蛋白質が含まれていた。この蛋白質をＮpw38ＢＰ１と命名した。SDS-PAGEゲル上のバンドをPVDF膜に転写後、100 kDa のバンドをプロテインシーケンサーG1000A (HEWLETT PACKARD 社) にのせ、Ｎ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、配列番号４で表されるアミノ酸配列が得られた。
実施例４：Ｎpw38ＢＰ１をコードするｃＤＮＡのクローニング
決定したアミノ酸配列25残基を用いてデータベースをサーチしたところ、この配列はＥＳＴクローン（GenBank^TM登録番号AA206624）がコードする蛋白質のアミノ酸配列と一致した。このＥＳＴクローンの塩基配列をもとにして、６アミノ酸残基をコードする領域に対するアンチセンスプライマー（5'-TGTAGATCTCCGTCCCAT-3'）を合成した。ヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−1080ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ98/11217に記載）を鋳型とし、アンチセンスプライマーとＴ７プライマーを用い、Ｎpw38ＢＰ１ｃＤＮＡの5'上流領域をＰＣＲにより増幅したところ約200bp のｃＤＮＡ断片を得た。このｃＤＮＡ断片をプローブとしてヒトフィブロサルコーマ細胞株ＨＴ−1080ｃＤＮＡライブラリー（ＷＯ98/11217記載）をスクリーニングした結果、クローンＨＰ00169 を得た。このクローンは、配列番号２に示したとおり、1,926 bpのオープンリーディングフレームを有していた。また、オープンリーディングフレームは配列番号１に示した６４１アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。
実施例５：インビトロ翻訳による蛋白質合成
Ｎpw38ＢＰ１ｃＤＮＡを有するプラスミドベクターを用いて、Ｔ_NＴウサギ網状赤血球溶解物キット（プロメガ社製）によるインビトロ転写／翻訳を行なった。その際に［³⁵Ｓ］メチオニンを添加し、発現産物をラジオアイソトープでラベルした。いずれの反応もキットに付属のプロトコールに従って行なった。プラスミド２μg を、Ｔ_NＴウサギ網状赤血球溶解物12.5μl 、緩衝液（キットに付属）0.5 μl 、アミノ酸混合液（メチオニンを含まない）２μl 、［³⁵Ｓ］メチオニン（アマーシャム社）２μl （0.3 ＭＢq/μl ）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ0.5 μl 、ＲＮasin20Ｕを含む総量25μl の反応液中で30℃で90分間反応させた。反応液３μl にＳＤＳサンプリングバッファー（125mM トリス塩酸緩衝液、pH6.8 、120mM ２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ溶液、0.025 ％ブロモフェノールブルー、20％グリセロール）２μl を加え、95℃３分間加熱処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。オートラジオグラフィーを行なったところ、約100kDaの翻訳産物のバンドが得られた。オープンリーディングフレームから予想されるＮpw38ＢＰ１の分子量は、約70kDa である。翻訳産物の分子量はそれよりも大きい値を示すが、細胞から単離したＮpw38ＢＰ１の分子量も約100kDaであることから、この蛋白質の見かけの分子量は約100kDaであることが判明した。
実施例６：Ｎpw38ＢＰ１の大腸菌による発現
EcoRI 認識部位を付加した翻訳開始コドンから始まる26mer のセンスプライマー（5'-CCGAATTCATGGGACGGAGATCTACA-3'）とSalI認識配列を付加した停止コドンまでを含む26mer のアンチセンスプライマー（5'-CCGTCGACTCACAGTAGCCCTTCCAT-3'）を用い、クローンHP00169 を鋳型としてＰＣＲにより翻訳領域を増幅した。ＰＣＲ産物をEcoRI とSalIで消化し、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１(Pharmacia社製) のEcoRI とSalI部位に挿入した。塩基配列を確認した後、宿主大腸菌ＪＭ109 の形質転換を行った。ＬＢ培地中で37℃で５時間培養し、IPTGを最終濃度が0.4 mMになるように加え、さらに37℃で4 時間培養した。菌体を遠心により分離し、溶解溶液（50 mM Tris-HCl pH7.5, 1mM EDTA, 0.2 mM PMSF ）に溶かし、一度-80 ℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を行った。10,000 x gで30分遠心し、上清にグルタチオンセファロース４Ｂを加え、４℃で１時間インキュベートした。ビーズを十分洗浄した後、溶出溶液（10 mM Tris-HCl, 50 mM グルタチオン）で融合蛋白質を溶出した。
実施例７：抗体作製
上記の融合蛋白質を抗原として家兔に常法により免疫を行い抗血清を得た。抗血清はまず、40％飽和硫安沈殿画分をGST アフィニティーカラムによりGST 抗体を除いた。素通り画分をさらにGST-HP00169 の抗原カラムにより精製した。
実施例８：ウェスタンブロット
HeLa-S3 細胞ライセートを SDS-PAGE により分離し、PVDF膜ブロットした後、５％スキムミルクを含む0.05 % Tween20 -PBS （TPBS）で１時間室温でブロッキングし、抗体をTPBSで10,000倍希釈したものと１時間インキュベートした。TPBSで３回洗浄し、さらにTPBSで10,000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ IgGと１時間インキュベートした。TPBSで４回洗浄し、ECL 試薬（Amersham社製）により発光させて検出したところ、約100kDaの位置にシグナルが得られた。
実施例９：Ｎpw38ＢＰ１の核酸結合能
Ｎpw38ＢＰ１ｃＤＮＡを鋳型とした、ウサギ網状赤血球インビトロ翻訳産物と種々の核酸との結合能を検討した。ポリリボＡアガロース、ポリリボＧアガロース、ポリリボＵアガロース、ポリリボＣアガロース、二本鎖ＤＮＡセルロース、一本鎖ＤＮＡセルロース（いずれもファルマシア社製）とインビトロ翻訳産物をHKN 緩衝液［Hepes(pH7.4), 150 mM NaCl, 0.01% NP40 ］中で室温、20分間インキュベートした。HKN 緩衝液で５回洗浄し、担体に結合した蛋白質をSDS-PAGEにより分析したところ、Ｎpw38ＢＰ１はポリリボＧならびに一本鎖ＤＮＡに特異的に結合することがわかった。
【００２２】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、癌などの病態の診断および治療等に有用な新規なヒト転写関連蛋白質とその抗体が提供される。また、この発明のｃＤＮＡ等の遺伝子操作材料を用いることによって、このヒト蛋白質を大量に製造することができる。そして、この蛋白質と結合する低分子化合物をスクリーニングすることによる、新しい型の抗腫瘍剤などの医薬を探索することが可能となる。
【００２３】
【配列表】

[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a novel human transcription-related protein that binds to the human nuclear protein Npw38, a human gene encoding this protein, the cDNA of this gene, and an antibody against the protein. The protein and antibody of the present invention are useful for diagnosis and treatment of various diseases, and human cDNA is useful as a gene diagnostic probe and gene therapy gene source. Moreover, cDNA can be used as a gene source for mass-producing the protein of this invention.
[0002]
[Prior art]
The human nuclear protein Npw38 was found as a 38 kDa nuclear protein having a WW domain [Komuro et al., 70th Annual Meeting of the Japanese Biochemical Society, p.548]. The WW domain is a new family of protein-protein interaction motifs similar to the SH2, SH3, PH, and PTB domains. This domain consists of about 40 amino acid residues with two conserved tryptophans, and is known to bind to proline-rich amino acid sequences as well as the SH3 domain [HI Chen and M. Sudol. (1995 Proc. Natl. Sci. 92, 7819-7823]. The WW domain of Npw38 has been shown to have a transcriptional activity promoting effect [Komuro et al., 20th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, p. 369]. Therefore, it is considered that the protein that binds to the WW domain is involved in transcriptional activation.
[0003]
Factors involved in transcriptional activity are closely related not only to life phenomena such as development and differentiation, but also to diseases such as cancer [Masamatsu Muramatsu, NEW Medical Science, “Transcriptional Mechanisms and Diseases”]. Therefore, these proteins have the potential as target proteins for developing small molecule drugs that regulate the transcription and translation of specific genes, and it is desired to obtain as many transcription-related proteins as possible.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The invention of this application was made in view of the circumstances as described above, and it is an object of the present invention to provide a novel transcription-related protein that binds to a human protein useful for the development of pharmaceuticals and the like, in particular, the human nucleoprotein Npw38. It is said.
Another object of the invention of this application is to provide genetic manipulation materials such as a human gene encoding the protein, cDNA of the gene, and an antibody against the protein.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
This application provides a human transcription-related protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an invention for solving the above problems.
This application also provides a human transcription-related protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added.
[0006]
Further, this application provides a human gene encoding the above-mentioned human transcription-related protein, a cDNA of this gene, comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and a DNA fragment comprising a partial sequence of SEQ ID NO: 2 To do.
Furthermore, this application provides a recombinant vector carrying the cDNA and an antibody against the human transcription-related protein.
[0007]
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The human transcription-related protein of this invention is a known method, that is, a method of isolating from human organs, cell lines, etc., a method of preparing a peptide by chemical synthesis based on the amino acid sequence provided by this invention, or this invention Can be obtained by a method of producing by recombinant DNA technology using the cDN fragment provided by For example, when a protein is obtained by recombinant DNA technology, it can be expressed in vitro by preparing RNA from a vector having the cDNA fragment of the present invention by in vitro transcription and performing in vitro translation using this as a template. In addition, if the translation region is recombined into an appropriate expression vector by a known method, a large amount of the encoded protein can be expressed in Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, animal cells and the like.
[0009]
When the protein of the present invention is produced by expressing DNA by in vitro translation, the translation region of this cDNA is recombined into a vector having an RNA polymerase promoter, and a rabbit reticulocyte lysate containing RNA polymerase corresponding to the promoter, If added to an in vitro translation system such as wheat germ extract, the protein of this invention can be produced in vitro. Examples of the RNA polymerase promoter include T7, T3, SP6 and the like. The vectors containing these RNA polymerase promoters include pKA1, pCDM8, pT3 / T7.
18, pT7 / 319, pBluescript II and the like.
[0010]
When the protein of the present invention is produced by expressing DNA in a microorganism such as Escherichia coli, the expression vector having an origin, promoter, ribosome binding site, cDNA cloning site, terminator, etc. capable of replicating in the microorganism is used. After creating an expression vector in which the translation region of the cDNA is recombined and transforming the host cell with this expression vector, the resulting transformant can be cultured to produce a large amount of the protein encoded by the cDNA in the microorganism. Can be produced. At this time, if a start codon and a stop codon are added before and after an arbitrary translation region and expressed, a protein fragment containing the arbitrary region can be obtained. Alternatively, it can be expressed as a fusion protein with another protein. It is also possible to obtain only the protein portion encoded by this cDNA by cleaving this fusion protein with an appropriate protease. Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system and the like.
[0011]
When the protein of the present invention is produced by expressing DNA in eukaryotic cells, the translated region of this cDNA is recombined into an eukaryotic expression vector having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site, and the like. If introduced into eukaryotic cells, the protein of this invention can be produced in animal cells. Examples of expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, and pYES2. As eukaryotic cells, mammalian cultured cells such as monkey kidney cells COS7 and Chinese hamster ovary cells CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, Xenopus egg cells and the like are generally used, but those that can express this protein are used. Any eukaryotic cell can be used. In order to introduce an expression vector into a eukaryotic cell, a known method such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method can be used.
[0012]
In order to isolate and purify the target protein from the culture after the protein of this invention is expressed in prokaryotic cells or eukaryotic cells, known separation operations can be combined. For example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out and solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, Examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography.
[0013]
The protein of the present invention includes peptide fragments (5 amino acid residues or more) containing any partial amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. These peptide fragments can be used as antigens for preparing antibodies. The protein of the present invention includes a fusion protein with any other protein. For example, a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) mentioned in the Examples.
[0014]
The gene of the present invention is a human gene encoding the above protein, and can be isolated from an existing genomic library using, for example, the cDNA of the present invention or a partial sequence thereof as a probe.
The cDNA of the present invention can be cloned from, for example, a human cell-derived cDNA library. cDNA is synthesized using poly (A) + RNA extracted from human cells as a template. The human cells may be those that have been removed from the human body by surgery or cultured cells. cDNA is determined by Okayama-Berg method [Okayama, H and Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2: 161-170 (1982)], Gubler-Hoffman method [Guler, U. and Hoffman, J. Gene 25: 263-269 (1983)] and the like, but in order to efficiently obtain full-length clones, the capping method [Kato, S. et al. Gene 150: 243-250 (1994)] is preferably used. A commercially available human cDNA library can also be used. In order to clone the cDNA of the present invention from a cDNA library, an oligonucleotide is synthesized based on the nucleotide sequence of an arbitrary part of the cDNA of the present invention, and this is used as a probe, followed by colony or plaque high by a known method. Screening by hybridization may be performed. In addition, an oligonucleotide that hybridizes to both ends of the target cDNA fragment is synthesized, and using this as a primer, the cDNA fragment of the present invention is prepared from mRNA isolated from human cells by RT-PCR. You can also.
[0015]
The cDNA of the present invention is characterized by including the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and has a 1926 bp open reading frame. This open reading frame encodes a protein consisting of 641 amino acid residues.
Since the protein of this invention is expressed in any tissue, screening a human cDNA library prepared from human cells using an oligonucleotide probe synthesized based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 Thus, a clone identical to the cDNA of the present invention can be easily obtained. Alternatively, the target cDNA can also be synthesized using these oligonucleotides as primers, using the polymerase chain reaction (PCR) method.
[0016]
The protein of the present invention binds to the human nuclear protein Npw38 having transcription activation ability, and also binds to polyriboG and single-stranded DNA. Therefore, the protein of this invention is considered to have an important role in transcriptional regulation.
In general, polymorphisms due to individual differences are frequently observed in human genes. Accordingly, a cDNA in which one or more nucleotides are added, deleted and / or substituted with other nucleotides in SEQ ID NO: 2 is also included in the cDNA of the present invention.
[0017]
Similarly, a protein having one or a plurality of amino acid additions, deletions and / or substitutions with other amino acids caused by these changes also exhibits the activity of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. As long as it has, it is included in the protein of this invention.
The DNA fragment of the present invention includes a cDNA fragment (10 bp or more) containing any partial base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. In addition, DNA fragments consisting of a sense strand and an antisense strand also fall into this category. These DNA fragments can be used as probes for gene diagnosis.
[0018]
The antibody against the protein of the present invention can be obtained as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody by a known method using the protein itself or a partial peptide thereof as an antigen.
[0019]
【Example】
EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. The basic procedures and enzyme reactions related to DNA recombination were in accordance with the literature ["Molecular Cloning. Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]] Restriction enzymes and various modifying enzymes unless otherwise specified. The buffer composition of each enzyme reaction and the reaction conditions were in accordance with the attached instructions, and cDNA synthesis was performed in the literature [Kato, S. et al., Gene 150: 243-250, ( 1994)].
Example 1: Cloning of human Npw38 cDNA As a result of large-scale sequencing of a cDNA clone selected from a human gastric cancer cell cDNA library (described in WO97 / 03190), clone HP10345 was obtained. This clone had a structure consisting of a 170 bp 5 ′ untranslated region, a 798 bp open reading frame, and a 52 bp 3 ′ untranslated region (SEQ ID NO: 3). The open reading frame encoded a protein of 265 amino acid residues.
[0020]
When the motif sequence search was performed, the 46th to 78th regions had similarity to the WW domain. The 52th and 75th tryptophan and the 78th proline are amino acid residues conserved in all WW domains known so far. Other characteristics of the amino acid sequence of this protein include the region rich in 21st to 41st acidic amino acid residues (aspartic acid and glutamic acid), 104th to 176th acidic amino acid residues and basic amino acid residues. For example, there are alternating areas.
Example 2: Expression of GST fusion protein by E. coli
25-mer sense primer (5'-CCGAATTCTCAATCCTGCTGCTTGG-3) including a 25-mer sense primer (5'-CCGAATTCATGCCGCTGCCCGTTGC-3 ') starting from the translation start codon with EcoRI recognition site and a stop codon with EcoRI recognition site The translation region was amplified by PCR using pHP10345 as a template. The PCR product was digested with EcoRI and inserted into the EcoRI site of pGEX-5X-1 (Pharmacia). After confirming the base sequence, the host E. coli BL21 was transformed. The cells were cultured in LB medium at 37 ° C. for 5 hours, IPTG was added to a final concentration of 0.4 mM, and further cultured at 37 ° C. for 2.5 hours. The cells are separated by centrifugation, dissolved in a lysis solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA-1% Triton X-100, 0.2% SDS, 0.2 mM PMSF) and frozen at -80 ° C once. After melting, ultrasonic crushing was performed. The mixture was centrifuged at 1000 xg for 30 minutes, glutathione sepharose 4B was added to the supernatant, and the mixture was incubated at 4 ° C for 1 hour. After thoroughly washing the beads, the fusion protein was eluted with an elution solution (10 mM Tris-50 mM glutathione). As a result, a GST-HP10345 fusion protein having a molecular weight of about 60 kDa was obtained.
(3) Purification of Npw38 binding protein
Add hypotonic buffer (20 mM Hepes (pH7.4), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ ) to HeLa-S3 cells (1 x 10 ¹⁰ cells), leave at 4 ° C for 10 minutes, and dounce homogenizer To make it uniform. Nuclear fraction was obtained by centrifugation at 1000 xg for 15 minutes. The nuclear fraction was washed twice with a hypotonic buffer containing 0.5% NP-40 and then washed with a hypertonic buffer (20 mM Hepes (pH7.4), 250 mM NaCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.5% NP-40). Extracted at 30 ° C. for 30 minutes to obtain a nuclear extract.
[0021]
To 40 ml of the above nuclear extract, 25 mg of GST-Npw38 fusion protein was added and stirred at 4 ° C. with a rotator for 2 hours. Glutathione Sepharose 4B was added, and the mixture was further incubated at 4 ° C. for 2 hours. The beads were thoroughly washed, and then eluted with 10 mM Tris and 50 mM glutathione. When the eluate was subjected to SDS-PAGE, a protein of about 100 kDa was contained. This protein was named Npw38BP1. The band on the SDS-PAGE gel was transferred to a PVDF membrane, and the 100 kDa band was placed on a protein sequencer G1000A (HEWLETT PACKARD) to determine the N-terminal amino acid sequence. As a result, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 was obtained.
Example 4: Cloning of cDNA encoding Npw38BP1 A database was searched using the determined amino acid sequence of 25 residues, and this sequence matched the amino acid sequence of the protein encoded by the EST clone (GenBank ^TM accession number AA206624). Based on the nucleotide sequence of this EST clone, an antisense primer (5′-TGTAGATCTCCGTCCCAT-3 ′) for a region encoding 6 amino acid residues was synthesized. Using the human fibrosarcoma cell line HT-1080 cDNA library (described in WO98 / 11217) as a template, the 5 'upstream region of Npw38BP1 cDNA was amplified by PCR using an antisense primer and a T7 primer, and a cDNA fragment of about 200 bp was obtained. It was. As a result of screening the human fibrosarcoma cell line HT-1080 cDNA library (described in WO98 / 11217) using this cDNA fragment as a probe, clone HP00169 was obtained. This clone had an open reading frame of 1,926 bp as shown in SEQ ID NO: 2. The open reading frame encoded a protein consisting of 641 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1.
Example 5: Protein synthesis by in vitro translation In vitro transcription / translation was performed with a _TN T rabbit reticulocyte lysate kit (Promega) using a plasmid vector having Npw38BP1 cDNA. At that time, [ ³⁵ S] methionine was added, and the expression product was labeled with a radioisotope. All reactions were performed according to the protocol attached to the kit. 2 μg of plasmid, 12.5 μl of _TN T rabbit reticulocyte lysate, 0.5 μl of buffer (supplied with the kit), 2 μl of amino acid mixture (without methionine), 2 μl of [ ³⁵ S] methionine (Amersham) (0.3 MBq / μl), 0.5 μl of T7 RNA polymerase, and RNasin20U were reacted for 90 minutes at 30 ° C. in a total reaction volume of 25 μl. To 3 μl of the reaction solution was added 2 μl of SDS sampling buffer (125 mM Tris-HCl buffer, pH 6.8, 120 mM 2-mercaptoethanol, 2% SDS solution, 0.025% bromophenol blue, 20% glycerol), and heat-treated at 95 ° C. for 3 minutes. Thereafter, it was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. When autoradiography was performed, a translation product band of about 100 kDa was obtained. The molecular weight of Npw38BP1 predicted from the open reading frame is about 70 kDa. Although the molecular weight of the translation product is larger than that, the molecular weight of Npw38BP1 isolated from the cell is also about 100 kDa, and thus the apparent molecular weight of this protein was found to be about 100 kDa.
Example 6: Expression of Npw38BP1 by E. coli
A 26mer sense primer (5'-CCGAATTCATGGGACGGAGATCTACA-3 ') starting from the translation start codon with EcoRI recognition site and a 26mer antisense primer (5'-CCGTCGACTCACAGTAGCCCTTCCAT-3') including the stop codon with SalI recognition sequence The translation region was amplified by PCR using the clone HP00169 as a template. The PCR product was digested with EcoRI and SalI and inserted into the EcoRI and SalI sites of pGEX-5X-1 (Pharmacia). After confirming the base sequence, the host E. coli JM109 was transformed. The cells were cultured in LB medium at 37 ° C. for 5 hours, IPTG was added to a final concentration of 0.4 mM, and further cultured at 37 ° C. for 4 hours. The cells were separated by centrifugation, dissolved in a lysis solution (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.2 mM PMSF), frozen at −80 ° C. and thawed, and then subjected to ultrasonic crushing. After centrifugation at 10,000 xg for 30 minutes, glutathione sepharose 4B was added to the supernatant and incubated at 4 ° C for 1 hour. After thoroughly washing the beads, the fusion protein was eluted with an elution solution (10 mM Tris-HCl, 50 mM glutathione).
Example 7: Antibody production Rabbits were immunized by the conventional method using the above fusion protein as an antigen to obtain antiserum. For antiserum, first, GST antibody was removed from a 40% saturated ammonium sulfate precipitate fraction using a GST affinity column. The flow-through fraction was further purified with an antigen column of GST-HP00169.
Example 8: Western blot
HeLa-S3 cell lysate was separated by SDS-PAGE, blotted with PVDF membrane, blocked with 0.05% Tween20-PBS (TPBS) containing 5% skim milk for 1 hour at room temperature, and antibody diluted 10,000 times with TPBS. Incubated for 1 hour. The plate was washed 3 times with TPBS, and further incubated with horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG diluted 10,000 times with TPBS for 1 hour. When the plate was washed four times with TPBS and detected by light emission using an ECL reagent (Amersham), a signal was obtained at a position of about 100 kDa.
Example 9: Nucleic acid binding ability of Npw38BP1 The binding ability of rabbit reticulocyte in vitro translation products and various nucleic acids using Npw38BP1 cDNA as a template was examined. PolyriboA agarose, polyriboG agarose, polyriboU agarose, polyriboC agarose, double-stranded DNA cellulose, single-stranded DNA cellulose (both manufactured by Pharmacia) and in vitro translation products were mixed with HKN buffer [Hepes (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.01% NP40] at room temperature for 20 minutes. After washing 5 times with HKN buffer and analyzing the protein bound to the carrier by SDS-PAGE, it was found that Npw38BP1 specifically binds to polyriboG and single-stranded DNA.
[0022]
【The invention's effect】
As described above in detail, the present invention provides a novel human transcription-related protein and its antibody useful for diagnosis and treatment of pathological conditions such as cancer. In addition, the human protein can be produced in large quantities by using genetic manipulation materials such as cDNA of the present invention. Then, it becomes possible to search for drugs such as a new type of antitumor agent by screening low molecular weight compounds that bind to this protein.
[0023]
[Sequence Listing]

Claims

A human transcription-related protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

A human gene encoding the human transcription-related protein according to claim 1 .

The cDNA of the human gene according to claim 2, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 .

A DNA fragment comprising a continuous sequence of 10 bp or more in the base sequence of SEQ ID NO: 2 and functioning as a probe for the gene of claim 2 or the cDNA of claim 3 .

A recombinant vector carrying the cDNA of claim 3 .

An antibody against the human transcription-related protein of claim 1 .