【発明の詳細な説明】
男性の授精能を判定するための検定、装置及び器具
発明の背景
精液試料の授精能の判定
最近の研究によれば、夫婦に子どもができない場合、その約40%が男性側の
不妊原因によるものが占めているという。加えて、男性による避妊具の使用が上
昇している。例えば、最近の概算では、米国内では50万件を越える精管切除術
が毎年行われ、世界中ではその数は約200万件だという。精管切除術に加えて
、男性側で使用する経口避妊具が様々な種類、開発されている。男性向避妊法に
より、授精能のある男性が妊娠を引き起こす可能性は減少したが、100%効果
的な男性避妊法はない。さらに、多くの男性向避妊法は効果が顕れるまでにある
一定の期間を必要とする。
世界保健機関の設定した基準によれば、精液に授精能があると見なされるのは
、一人の男性が1.5から5.0ミリリットルの範囲で少なくとも二回射精して
得られた精液が、それぞれ2000万精子/mLを越える精子密度、及び/又は
、(1−4段階で)2を越える前進運動を伴った60%の運動率を有していなけ
ればならない。加えて、その精液試料には凝集、膿精、過粘稠性があってはなら
ない(1991年、モズビー−イヤー ブック社刊、第2版、リップシュルツ
LI及びSS ハワーズ編、「男性側の不妊」中、184ページ、シグマン、M
.他による、低授精能の男性の評価)。
通例、男性側の不妊は精子の低運動率及び/又は数に基づいて診断されている
。しかしながら、処理の過程で損傷を受けたことが原因で、実は生存しているの
に運動していないように見える精子があるため、運動率による分析は誤った否定
的
結果を出すことがある。精子数に関しては、2000万精子/mL以上の精子濃
度があれば授精可能な範囲と見なされているが、運動を行なっていない、生存し
ていない精子もこの数に含まれてしまうことがある。精子数及び運動率は多くの
場合、市販の器具、例えば、光学顕微鏡やコンピュータビデオ分析システムを用
いて評価されている。
米国特許第5,068,089号は、染料の色を薄くする精子の働きに基づい
てヒトの精子の授精能を検査する家庭用器具を述べている。(比色分析的に表れ
る)色の希薄の程度が精子の授精能を示しているとされている。しかしながら、
この検査には時間がかかり、室温を越える温度でのインキュベーションが必要で
あり、また精子細胞による希薄なのか、精液試料に含まれている可能性のある他
の細胞による希薄なのかを区別できない。
米国特許第5,219,729号は、精子の卵母細胞透明帯片に対する結合親
和性に基づいて授精能を判定する検査室用検定を述べている。結合が強いほど、
精液試料の授精能は高い。しかしながら、この検定には提供されたばかりの卵母
細胞片が必要であり、また少なくとも4時間はこの卵母細胞片に精液を接触させ
ておかねばならない。
米国特許第5,434,057号は、フマラーゼ活性の検出に基づいて男性の
授精能を判定する検定及び器具を述べている。しかしながら、フマラーゼは細胞
間で偏在し、これが精液試料中に含まれている可能性のある細胞(上皮、白血球
及び細菌又はカビ)についても言えるため、この特許が主張するようにフマラー
ゼ活性が精子数及び運動率の正確な指標かどうかは疑わしい。
検査室、診察室又は家庭において精液試料の授精能を検査する簡単で、迅速か
つ正確な検定法が求められている。人工授精技術の効果の伸び
体外授精(IVF)、配偶子卵管内注入(GIFT)、子宮内媒精(IUI)
及び精子細胞質内注入(ICSI)などの人工授精技術(ART)により、自然
な過程での妊娠ができない場合に妊娠を促す方法が提供されている。これらの技
術はまた、動物の品種改良や遺伝子導入動物を生むことにも用いることができる
。
しかしながら、人工授精技術をしても必ずしも妊娠に至るとは限らない。例え
ば、体外授精の成功率は約25%と計算されており、一方配偶子卵管内注入の成
功率は約31%と算出されている。人工授精技術による試みが不成功に終わる要
因と考えられるものの一つには、精液試料がすべて授精可能というわけではない
ことがある。最近の研究によれば、夫婦に子どもができない場合、その約40%
が男性側の不妊原因によるものが占めているという。
さらに、精液試料が妊娠を引き起こすことのできない確率は、その精液試料が
一定期間保存されていたか又は冷凍保存されていたものであるときに高くなる。
この発見は、冷凍保存された精液を用いてきた人工授精技術にとって大きな意味
がある。冷凍保存は、致死量以下の低温損傷を起こすことがあり、この場合、細
胞の生存率は、解凍後、時間を経るにつれ新鮮な細胞に比べて急速に減少してい
く。致死量以下の低温損傷は、凍結及び解凍の際の位相の変移によって膜が脆化
することに一因があること判明している(アルバレス、J.G.及びB.T.ス
トーリー、(1993)J.男性病学 14(3):199−209)。より小
さい程度のものでは、致死量以下の低温損傷は精液のホスホリピドの自発的脂質
過酸化(SLP)によって引き起こされることが判っている(アルバレス、J.
G.及びB.T.ストーリー、(1993)J.男性病学 14(3):199
−209並びにJ.G.アルバレス及びB.T.ストーリー(1992)J.男
性病学 13(3):232−241)。自発的脂質過酸化は、冷凍保存されな
かった精子の運動寿命に制限を与えている大きな要因だと考えられる(アルバレ
ス、J.G.及びB.T.ストーリー、(1988)配偶子研究23:77−9
0、並びにアルバレス、J.G.及びB.T.ストーリー、(1985)生物学
的生殖機能、32:342−351)。自発的脂質過酸化によって起きるホスホ
リピドに結合した不飽和脂肪酸成分の選択的酸化は、精子の血漿及び先体膜及び
DNAの酸化という大きな損傷に拡大する。
しかしながら、精液試料の冷凍保存は人工授精においてはごく一般に行われて
おり、実際には、伝染性の感染源(例えばエイズなど)をドナーが持っていない
か、媒精前に検査するためには必要である。例えば、ドナーは多くの場合、特定
の試料を提供してから6カ月後に検査を受け、その結果が陰性である場合のみ、
保存された試料が媒精に用いられるのである。
子どもをもうけるために人工授精にたよる夫婦が増加している。加えて、体外
受精技術を家畜の飼育業者が用いたり、遺伝子導入動物を生むために用いること
もますます増えている。人工授精の成功率を上げるための方法が必要とされてい
る。
発明の要約
大まかに言えば、本発明は、精子含有試料(例えば精液)から運動精子を分離
しかつ数量化する、及び/又は精液試料の妊娠能力を判定するための装置、方法
及び器具を特徴としている。概略的に言えば、本装置は精子含有試料を分離する
容器を含むが、この容器は運動率に基づいて精子を分別するよう構成することが
好ましい。所望に応じて、容器は(例えば、じょうご型など)採集が容易となる
ような形状とすることができる。好適な実施例では、精子含有試料中の運動精子
のみ進入及び泳動を可能とし、非運動性の細胞は禁じる捕捉具が容器の内部に配
置されている。この捕捉具の適した位置には、この捕捉具内に泳動する精子の妊
娠能力を判定する手段を配置することが好ましい。もしくは、分離した運動精子
をこの捕捉具から取り出して別個に検査することも可能である。
一実施例では、捕捉具は、精子含有試料と流体連絡する区画室(例えば試験管
)
である。別の実施例では、捕捉具は精子含有試料よりも濃度の低い流体であって
、従って運動精子は容易に通過できるが、非運動性の細胞は容易に通過できない
ものとしている。さらに別の実施例では捕捉具は多孔性膜を含み、この膜によっ
て分離域から精子含有試料を分離することで、この精子含有試料中に存在する可
能性のある非運動精子やその他の細胞の通過を妨げる一方、運動精子の分離域へ
の進入を可能としている。
二番目の観点から、本発明は妊娠能力の高い精液試料を判別する検定を特徴と
している、この検定を用いて男性ドナーの授精能の状態を表し示すことができ、
また人工授精技術(ART)に使用することを選択することもできる。好適な実
施例では、そのプロセスは、1)一人のドナーから時を変えて複数の精液試料を
採取するステップと、2)各精液試料から一定アリクォット採取するステップと
、3)各アリクォットを検査して妊娠能力を判定するステップと、4)高い妊娠
能力を有する少なくとも一つの精液試料を、妊娠を起こすための人工授精に用い
るステップとを含む。好適な実施例では、この検査は、ストレスを加えて生じさ
せた脂質の過酸化の指標、又は指標の変化を数量化することに基づいている。精
液の脂質過酸化を示すものとして特に好適な指標は、精子のスーパーオキシドジ
スムターゼ(SOD)活性であり、この活性は例えば抗SOD抗体を用いて数量
化することができる。
第三番目の観点からは、本発明は精液試料の妊娠能力を検出することにより、
不妊の可能性のある男性を判別するか、又は精管切除術後あるいは特定の避妊薬
を投与した後での男性を評価するスクリーニング検定を特徴としている。好適な
実施例では、このスクリーニング検定は運動精子の数を判定することに基づいて
いる。一実施例では、運動性の精子をまず分離し、計数する。数量化の結果、約
5万運動精子/mL未満であれば避妊薬に効果があり、その精液試料の妊娠能力
が低いことを示している。別の実施例では、精子の数量化は精子含有試料に対し
て直接行われており(運動性及び非運動性の精子を分別せずに)、数量化の結果
が約2000万精子/mL未満であれば、その試料の妊娠能力が低く、また約2
000万精子/mLを越え、かつ約4000万精子/mL未満であればその試料
の妊娠能力は境界線上であり、約4000万精子/mLを越えていればその試料
の妊娠能力が高いことが判る。下限値の2000万精子/mLは、運動性及び非
運動性の精子の両方を含む。不妊を診断するにはこの値はあまり参考にはならな
いが、スクリーニングテストの一部として用いるものとして意図されている。こ
のようにして、男性が本器具を用いて自らの授精能を検査し、約2000万精子
/mL未満であった場合、不妊の可能性があると知ることができる。
第四番目の観点からは、本発明は、一箱に梱包された数多くの簡単な試薬及び
装置を含む、精子診断器具及びシステムを特徴としている。妊娠能力の高い精液
試料を判別しようと用いた一実施例では、本器具は、精子分離手段及び、妊娠能
力の高い精液試料を判別する手段を含むことができる。選択に応じて、この精子
分離手段は採集が容易となるよう適した形状となる(例えばじょうご型)。さら
に選択に応じて、精子の分離に用いるべく精液を液化する試薬(例えばプロナー
ゼ又はキモトリプシン)がこの器具に含まれる。好ましくは、この妊娠能力の高
い精液試料を判別する手段とは脂質の過酸化に基づくものであり、また妊娠能力
(不妊又は男性避妊薬の効果)をスクリーニングする手段とは精子数に基づくも
のであるとよい。
本開示の検定、装置及び器具は、実施が容易であり、約15分未満で終了する
ことができる。本検定、装置及び器具で得られる情報は、例えば食事、睡眠、運
動、喫煙などの発がん物質に対する暴露、及びアルコールの摂取などの因子が、
その後に得られた精液試料の授精能にどのような変化を及ぼすか、その影響を観
察するために用いることができる。さらに、本装置、器具及び方法を用いて、あ
る特定の男性の不妊治療又は避妊手術が効果的であったか、またはその後この同
じ男性から得られた精子が卵母細胞と接触したときに妊娠を引き起こすかどうか
を示させることができる。さらに加えて、本検定、装置及び器具は、特定の精液
試料が人工授精に用いるのに適しているかどうかを判定することにも用いること
ができる。
本検定、装置及び器具の中には検査室での使用に適したものがあり、また一方
では診察室及び/又は家庭で使用できるものもある。その他の特徴及び利点は、
以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から容易に明らかとなるであろう。
図面の簡単な説明
図1は、運動精子を収容して捕捉する試験管を含む精子分離装置の一実施例の
透視図である。
図2は、より濃度の高い精子含有試料と接触する、より濃度の低い流体膜を含
む精子分離装置の別の実施例の透視図である。
図3は、多孔性膜が運動精子採集域から精液試料を分別する、精子分離装置の
さらに別の実施例の透視図である。
図4は、ストレステストの得点が約0.8を越える精液試料及びストレステス
トの得点が0.8未満の試料を冷凍保存したときの運動率回復を示したグラフで
ある。
発明の詳細な説明
本発明は、精子含有試料(例えば精液)から運動精子を迅速に回収することの
できる、使用の簡単な装置と、その装置を用いて妊娠能力の高い精液試料を判別
しようとする検定及び器具とに関する。本発明はまた、男性不妊をスクリーニン
グ検査すると共に、男性避妊薬が効果的か、又は効果が顕れてきたかを確認する
検定及び器具に関する。
好適な精子分離装置は精子の運動率に基づいており、精液を収容する収容手段
と、運動精子を分離するために該収容手段内に選択的に配置可能な分離手段と、
運動精子を検査して妊娠能力を判定する手段とを含む。一実施例を図1に示す。
容器10は、男性ドナーの射精液を含む試料30を収容するための、試料受け2
1を形成する側壁12、14、16及び18及び底部20を有する。図示された
ものは立方体であるが、容器10は精子含有試料を捕捉し保持するために適して
いればいかなる形状又は大きさを選択してもよい。捕捉具24は容器の試料受け
21内に配置することができるが、試料30と流体連絡していると好ましい。当
業者であれば、接着剤の使用も含めて数多くの公知の方法を用いて捕捉具24を
容器10の底部20に取り付けることができ、また何らかの適した支持手段によ
って容器10内に支持可能であることが理解されよう。捕捉具24は、筒状とし
て図示はされているが、運動精子を分離かつ保持するために適していればいかな
る形状又は大きさでもよく、また、例えば試験管、毛細管、ストロー、ピペット
やその他の内側に導管を有した受容体等、市販の器具が含まれるであろう。加え
て、容器10について、図示のものは略直方体形状であるが、男性ドナーが精液
試料を採集及び捕捉するのに便利な形状であれば、例えばじょうご型など、いか
なる形状を選択してもよい。容器10及び捕捉具24は、例えばガラスやプラス
チックなど、適した生物学的適合性材料であればいかなるものから形成してもよ
い。
図示の試料30は運動精子及び非運動精子の両方を含んでいることが考えられ
る。好適な実施例によれば、捕捉具24は試料受け21内に配置されるか、又は
、運動精子が受容器24の導管22に泳動できるよう構成されている。受容器2
4で運動精子を捕捉し、次にこの捕捉された運動精子を分析してこの精液試料の
妊娠能力を判定する。例えば、試料30中の運動精子が確実に捕捉具内24に泳
動し終えるのに充分な時間が経過した後、捕捉具を容器10から取り出し、試料
34の妊娠能力を判定するために運動精子を検査する手段を含んだ第二容器31
、例えば試験管内に配置することができる。
もしくは、検出機構36を捕捉具24の導管22内に取り付けることができる
。好ましくは、導管22内に泳動する運動精子はこの検出機構36と接触すると
よ
い。この検出機構は、精子含有試料の妊娠能力を判定するために、運動精子を検
査する手段を含んだ適した膜又は基質を含むことが好ましい。
あるいは、運動精子を、機械的又は流体バリヤとの接触あるいは勾配に基づい
て精液試料中の非運動性細胞から分離することも可能である。例えば、図2に示
されるように、比較的密度の高い精子含有試料を、より密度の低い流体層に接触
させることが可能であるが、この流体層は精子含有試料と同様の温度、ペーハー
及び塩分濃度であることが好ましい。図2及びそれ以降の図面すべてにおいて、
同様の部材は同じ参照符号に上付きプライム符号を付して示されている。図示の
容器10‘は第一流体層40及び第二流体層46を含む。第一流体層40は、男
性ドナーから得た精液試料、及び選択的に、その精液試料を液化する適した試薬
、例えばプロナーゼ又はキモトリプシンを含む。層40は典型的には運動精子及
び/又は非運動精子を含む。第二流体層46は好ましくは第一流体層40より密
度の低い流体であり、そのため、容器10’の高さ方向に密度の勾配を生じてい
る。層40及び46の間で密度が減少していることにより、試料流体層40から
採集流体層46への運動精子の泳動が促進される。流体40及び46のこの垂直
方向に層を成す構造は、互いにエミッシブル又は部分的にエミッシブルな流体を
適切に選択することで得られる。
好適な実施例では、精液試料は容器内に配置されるか、または、容器10‘に
投入される前に射精液を液化すべく試薬と混合される。密度の低い第二流体層4
6を次に容器10’に投入すると、第一流体層40から分離しつつ垂直方向の上
方に配置される。充分な時間が経過すると、容器10‘内の高さ方向で密度勾配
が減少しているために試料層40に含まれた運動精子は第二流体層46に泳動す
る。このように、運動精子は第二流体層46から分離される。所定の時間(例え
ば5分間)後、流体層46から流体試料を例えばピペット50などで採取し、試
験液54を容れた試験管52に投入する。この試験液は、ペルオキシダーゼ共役
抗SOD及び/又は抗GPxIgGポリクローン性抗体を有する低張性溶液を含
んだものであることが好ましい。結合ヒツジ抗SOD及び/又は抗GPxIgG
ポリクローン性抗体を含む試験紙をこの試験液に浸し、取り出した後、ペルオキ
シダーゼ基質(例えば過酸化水素及びDAB)を含む最終溶液に浸す。運動精子
の存在に反応して試験紙は所定色に変化する。この色をカラーチャートに比較し
て精液試料の妊娠能力を判定する。あるいは、運動精子を含ませたピペットから
、精子試薬を含んだ試験紙に直接滴下してもよい。
変更例では、図3に示すように、第二採集流体層46を多孔膜60に置き換え
ることもできる。透過性の多孔膜60により、非運動精子が試料層40‘から膜
60内へ又は膜60を通過して泳動することに対して物理的抵抗が生じる又は与
えられる。しかし、この多孔膜60は、運動精子が試料層40‘と膜60との間
を移動することは妨げないため、分離層10’内の運動精子の泳動並びに分離を
容易とする。多孔膜60は、運動精子が損傷を受けることなく通過できるもので
あれば、いかなる適した生物学的適合材料から構成してもよい。
また別の観点から、本発明は、精液試料の妊娠能力を判定するための好適な方
法に関する。ここで言う「高い妊娠能力」を有する精液試料とは、卵母細胞と接
触したときに約50%を越える確率で妊娠を引き起こせる試料を言う。妊娠能力
の高い精液試料は妊娠を引き起こす確率が高いものではあるが、妊娠能力の高い
精液試料と卵母細胞との接触は妊娠の成功を保証するものではない。他の因子、
例えば卵母細胞がヒトの精子クロマチンの凝縮を解くことができなかったり、卵
母細胞のDNAに欠陥がある場合(例えば加齢により)、二細胞の胎芽の固まり
や早期に死滅した胎芽などにより、妊娠能力の高い精液試料でも妊娠を引き起こ
せないことがある。
他方、「妊娠能力の低い」精液試料は、卵母細胞と接触してもごくわずか、又
は全く妊娠を引き起こす見込みのないものである。ある特定の男性から採取した
精液試料が妊娠能力の低いものであると判明しても、以後採取する精液試料もま
た妊娠能力の低い試料であるとは言えない。任意の男性から得た精液試料の妊娠
能力は時間で変化し、食事、睡眠、運動、喫煙やその他の発がん性物質への暴露
、
又はアルコールや麻薬の摂取によっても変化することがあるため、特定の精液試
料の妊娠能力は概して、約48時間に限ってのみ正しいと言える。
開示の検定で用いられる好適な精子含有試料(例えば精液)は、ヒト又は動物
(例えば、ウシ、ウマ、羊などの家畜や、絶滅の危機にある動物)から得られる
。正確な結果を得るためには、試験は採集されたばかりの射精液に対して行なう
ことが好ましい。
妊娠能力の高い精液試料を判別する目的で行なうのに好適な検査は脂質の過酸
化検査であり、この検査は脂質の過酸化の指標、又は、規定された条件下での一
定時間における指標の変化を計測するものである。次に、得られた数値をその特
定の指標の基準値と比較してその精液試料の妊娠能力を判定する。
ストレステストでは、脂質過酸化の特定の指標がストレスに反応して一定時間
内にどれだけ変化するかを計測する(ストレステスト)。ストレステストの得点
は、脂質過酸化の指標のストレスを与えた後で計測した値をストレスを与える前
に計測した値で除算して得られる。テストでの得点を得るのに適したストレス又
はストレス物質の例には、放射エネルギー(熱線(例えば例2に示されたように
)、電磁波)、冷凍−解凍、酸化又は化学物質(例えば例3に示されたような第
一鉄/アスコルビン酸塩系などの酸化剤)に対する暴露)がある。
ストレスに反応して変化を起こす脂質過酸化の指標は、例として、運動率
:脂質過酸化の指標として運動率を用い、ストレスとしては熱(例えば摂
氏約27から45度の範囲で少なくとも1時間インキュベーションする)を採用
すると、テストの得点が約0.8を越えれば妊娠能力が高いことを示している。
約0.8未満のテスト得点は能力が低いことを示す。脂質過酸化分解生成物
:脂質過酸化分解生成物(例えば脂質ヒドロペルオキシド
、
マロンアルデヒド、ペンタン、エタンなど)のストレスを与えた後の値が、スト
レスを与える前の値に対して相対的に高い(テスト得点<0.5)試料は、妊娠
を引き起こす可能性が低いが、テスト得点が約0.5以上であれば妊娠を引き起
こす可能性が高い。脂質は分光光度分析法で分析することも可能である。例えば
、脂質ヒドロペルオキシドをヘキサンを用いて抽出し、233nmで検出するこ
ともできる。マロンアルデヒドをチオバルビツル酸と反応させた後532nmで
計測することも可能である(タペル、A.L.他、(1959)「生物化学、生
物物理の資料」80:326)。ペンタン及びエタンはヘッドスペースガスクロ
マトグラフィーによって計測可能である。膜ホスホリピドの比率
:高率で酸化する試料は、ホスファチジルエタノールアミ
ン(PE)対ホスファチジルコリン(PC)の比が約0.5未満であるが、低率
(運動率の損失で示したときテスト得点>約0.8)で酸化する試料はPE/P
C比が約0.7よりも大きい。従って、妊娠能力の高い精子はPE/PC比が約
0.7より大きく、かつ約1.5未満であり、妊娠能力がいくらかある精子はP
E/PC比が約0.5より大きく、かつ約0.7末満であり、そして妊娠能力が
低い精子はPE/PC比が約0.5未満である。PE及びPCは、例えば高性能
薄膜クロマトグラフィーを用いて計測することができる(アルバレス、J.G.
他、(1987)J 液体クロマトグラフィー10:3557)。
脂質の過酸化を示す指標で、妊娠能力の指標として直接計測できるものの例に
は以下のものが含まれる。DNAの酸化
:高率で酸化する試料は、高レベルのオキソ−8−デオキシグアノ
シン(オキソ8dG)を有するが、このオキソ−8−デオキシグアノシンは、例
えば電気化学的検出法を用いた高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によっ
て計測することができる(フラガ、C.G.他、(1991)科学的手法国立ア
カデミー88:11003)。妊娠能力の高い精子のDNAのオキソ8dG/μ
gは約20fモル未満であるが、妊娠能力の低い精子のDNAのオキソ8dG/
μgは
約40fモルよりも大きい。スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)活性
:固相結合した抗Cu/Zn−S
OD抗体及び、酵素で標識付けされた抗−Cu/Zn−SOD抗体を用いて、例
3に示したようにSOD活性を検出することができる。SOD活性が約9U/1
08セル以上の精液試料が、IVF後の高い妊娠率(つまり高い妊娠能力)に関
連があることが判明しており、7U/108セル未満の活性は低妊娠率(つまり
低い妊娠能力)と関連づけられている。表面SOD免疫蛍光検査法
:高率で酸化する試料は表面SOD免疫蛍光度が低く
、また全SOD活性も低い。表面SOD免疫蛍光度は、例えばヒツジ抗−Cu/
Zn−SODIgGポリクローン性抗体及びFITC−共役のウサギの抗ヒツジ
第二抗体を用いたフローサイトメトリによって計測することができる(アルバレ
ス、J.G.、フロリダ州、タンパ、第18年次米国男性病理学会、1993、
要約書170)。約300FITC単位を越えるものは妊娠能力が高いことを示
し、約300FITC未満であれば妊娠能力が低いことを示している。不飽和脂肪酸の飽和脂肪酸に対する比率
:不飽和脂肪酸は酸化を起こしやすいが
、飽和脂肪酸はこの変化を起こしにくい。不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン
酸(22:6)の、飽和脂肪酸であるパルミチン酸(16:0)に対する比率、
又は他の不飽和脂肪酸の飽和脂肪酸に対する比率を求めて、妊娠能力の予測に用
いることが可能である。高率で酸化する試料のドコサヘキサエン酸対パルミチン
酸比は低いであろう。不飽和/飽和脂肪酸は、1時間、摂氏40度で1Nのナト
リウムメトキシドを用いたアルカリメタノリシスに続くガスクロマトグラフィー
により計測可能である(アルバレス、J.G.及びJ.C.タッチストーン、脂
質分析の実際の手引き、論文集:I−脂肪酸、ノレル プレス(ニュージャージ
ー州)、1991)。不飽和対飽和脂肪酸の比率が約1.0以上であれば妊娠能
力が高いことを示し、比率が約0.5以上かつ約1.0未満であれば妊娠能力が
境界線上にあり、比率が約0.5未満であれば妊娠能力が低いことを示す。クレアチンキナーゼ活性
:精液中のクレアチンキナーゼ濃度は精子形成の最終段
階における細胞質の突き出しの程度を反映している。異常なほど高レベルのクレ
アチンキナーゼ活性を呈する試料もまた、PE/PC比(PE/PC比<0.5
及びマロンアルデヒドの生成が多いこと)から判定すると高率の脂質過酸化を行
なうことが判明している。この相関関係により、クレアチンキナーゼ活性の検出
を精液試料の妊娠能力の判定手段とすることが裏づけられる。人の精液のクレア
チンキナーゼ活性は、クレアチンキナーゼがADPと反応してクレアチン及びA
TPを生じ、続いてヘキソキナーゼがATP及びグルコースと反応してグルコー
ス−6−燐酸を生じ、さらにグルコース−6−燐酸デヒドロゲナーゼがグルコー
ス−6−燐酸及びNADPと反応してNADPHを生じるという過程の結果生じ
たNADPHに対して、365nmで分光光度分析を行なうことで計測すること
ができるこれらの条件で生じたNADPHは人の精液中のクレアチンキナーゼの
活性に比例している(フザー、G.(1988)配偶子の研究19:67)。ク
レアチンキナーゼ(CK)は二つのイソホーム、つまりMM及びBBの形をとる
。妊娠能力の高い精子は約10%以上のCK−MM/CK−MM+CK−BB比
を有する。
ストレスに対する脂質過酸化の指標の値又は値の変化は、当業者に公知の技術
及び装置を用いて数量化することが可能である。特にどの脂質過酸化指標を選択
するかは、必要とされる精度と、結果を検出する装置が手に入るかで決定される
であろう。
後述の例4でその詳細が述べられる、器具として用いられる好適な実施例にお
いては、精子の脂質過酸化の指標は精子のスーパーオキシドジスムターゼ(SO
D)活性に基づいている。特に好適な実施例では、精子のSOD活性はSOD抗
体を用いて検査される。個々で用いられるように、精子の脂質過酸化の指標を検
出するために使用する抗体は、抗原と結合するものであればいかなる材料でもよ
い(例えば、ポリクローン性、モノクローン性又は単鎖抗体又は抗体片、例えば
Fab2片のFabなど)。
精子のSOD、又は、他の抗原による脂質過酸化の指標の免疫検出は、数々の
競合的又は非競合的検定法のいずれを用いても達成することができる。概して、
競合的免疫検定法では、SODを精子含有試料に加え、限られた数の抗体結合部
位をめぐり精子とSODとで競合させ、その結果、精子と抗体及び標識SOD抗
体との複合体を形成させる。標識SOD及びSOD抗体の濃度を一定に保つこと
で、形成される標識SOD抗体の複合体の量は、試料中の精子量に反比例するこ
ととなる。従って精子SODの量的判定は、標識SOD抗体の複合体に基づいて
行なうことができる。競合的検定法は均質的に行なってもよい(つまり、抗体結
合トレーサ(例えば標識したSOD)を自由トレーサから分離する必要はない。
なぜなら、抗原−抗体の相互反応により、直接的又は間接的に、トレーサの標識
グループから得られた信号に計測可能な変化が生じるからである。)。あるいは
、競合的検定法を異質的に行なってもよい(つまり、試料中のリガンド量を判定
する前に結合トレーサを自由トレーサから分離することが必要である)。
競合的免疫検定法とは対照的に、非競合的検定法は、抗体−精子共役物の形成
が平衡状熊に達するのに充分な時間、精子含有試料を固定化SOD抗体でインキ
ュベーションすることを含む。SOD抗体は直接又は間接的に標識付けしてもよ
い。例えば、間接的標識付けは、未結合の精子を取り除く分離ステップの後で、
固定化抗体−精子の複合体を、この抗体−精子錯体に特定の第二の標識抗体に接
触させることで行なうことができる。未結合の第二抗体を取り除く第二分離段階
に続いて、結合した第二抗体の量を検出し、結合精子の指標として計測すること
ができる。この方法の一例は後述の例5で述べる。
代表的な競合的及び非競合的免疫検定法には、蛍光偏光免疫検定法(FPIA
)、
蛍光免疫検定法(FIA)、酵素免疫検定法(EIA)、比濁分析抑制免疫検定
法(NIA)、酵素結合免疫検定法(ELISA)及びラジオイムノアッセイ(
RIA)が含まれる。この様々な免疫検定法を行なう一般的な技術は当業者には
公知である。さらに、ほとんどの方法の概略的説明が米国特許第5,051,3
61号でなされており、この特許はここに参考文献として編入されている。抗体
は、検出を容易とするようないかなる方法で標識付けしてもよい。好適な標識は
、酵素(例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウ
レアーゼ、β−ガラクトシダーゼ)、酵素共同因子、放射性同位体(例えば、3
H、14C、125I、32P、131I及び35S)、蛍光化合物(例えばフルオレセイン
、ローダミン、アロフィコシアニン、フィコエリトリン、エリトロシン、ユーロ
ピアン、ルミノール、ルシフェリン及びクマリン)及び着色又は未着色ビーズ又
は粒子(例えばシリカゲル、調整ポアガラス、磁性体、セファッデクス/セファ
ローズ、セルロース、金属(例えば金)又はラテックス)を含む。抗体を固定す
るための好適な支持物質は、膜(例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリア
ミド、ポリビニリデンジフルオリド、ガラス繊維、紙)、ビーズ又は粒子及び試
験管(例えば、ガラス、プラスチック又は金属の毛細管、ストロー又はピペット
)を含む。
高い妊娠能力を備えた精液試料を判別する上述の方法に基づいて、本発明はま
た、人工授精技術(ART)(つまり、精子を乱視と接触させて妊娠を引き起こ
させる手法)を用いて妊娠を引き起こす際の成功率を上げる手法を特徴としてい
る。ARTの例には、体外授精(IVF)、配偶子卵管内注入(GIFT)、子
宮内媒精(IUI)及び精子細胞質内注入(ICSI)が含まれる。ARTを行
う手続きは開業医に公知である。時とともにARTがさらに向上することが期待
される。
発明の好適なプロセスは、あるドナー(例えばARTを行っている夫婦の男性
側)から時を変えて複数の精液試料を採取することを含む。例えば、ドナーは一
日おきに新しい精液試料を提供してもよい。次に各試料から一定アリクォット
(例えば1×106セル)を取ってテスト用とし、残りを将来的にARTで使用
する場合のために貯蔵(例えば冷凍保存)する。好ましくはこのプロセスに、特
定のアリクォットと、それが取られた貯蔵試料とを相関付ける手段が含まれてい
るとよい。例えば、第一日目にある試料から取られたアリクォットと、それが取
られた試料自体とを#1と標識付けしてもよい。同じドナーから次に得られた試
料、及びこの試料から得たアリクォットを#2、等々と標識付けしてもよい。
ある特定のドナーの提供した全アリクォットを次にテストし、「高い妊娠能力
を有する」精液試料(例えば、卵母細胞と接触したとき50%を越える確率で妊
娠を引き起こすことのできる精液)を判別する。この高い妊娠能力を有するとし
て判別された精液試料をここでARTに用いてもよく、残りの、妊娠能力の低い
試料は廃棄してもよい。
後述の例2は、体外授精(IVF)を行った33組の夫婦、及び、配偶子卵管
内注入(GIFT)を行った11組の夫婦に対する盲検予測コホート群研究の結
果を示したものであるが、ストレステストの得点が約0.8未満だった精液試料
では妊娠は成功しなかった。対照的に、ストレステストの得点が約0.8以上の
精液試料をARTに用いた場合の妊娠成功率は55%だった。従って、脂質過酸
化の指標が運動性の欠如の場合、ストレステストの得点が約0.8未満であれば
妊娠応力が低いことを示し、ストレステストの得点が約0.8以上であれば妊娠
能力が高く、ARTでの使用に適していることを示している。
表3は、同じ男性から得られた精液のストレステストの得点、従って、妊娠能
力が、時間によってどのように変化し得るかを示す。
加えて、図4から、ストレステストの得点が約0.8を越える精液試料は、た
とえ冷凍保存後でも、高い運動回復率を有することが分かる。従って、ARTに
、高い妊娠能力を有すると判明した精液試料を用いたとき、このような試料は妊
娠能力の低い精液ほどは冷凍保存で損傷を受けないため、さらに有利であると思
われる。
妊娠能力の高い精液試料とは対照的に、さらに妊娠能力の低い精液試料の判別
を用いて、例えば不妊の可能性のある男性を検出するスクリーニング資料として
用いることができる。加えて、授精能のある男性でも時には妊娠能力の低い射精
液を生じることがあるため、妊娠能力の低い精液資料を判別することで、この試
料をARTに用いてしまうことを避けることができる。さらに妊娠能力の低い精
液試料を判別することで、ある特定の男性避妊法の使用者がその避妊法に効果が
ある、又は効果が出てきたかどうかを判定することができる。例えば、精管切除
術は一般に効果が出るまでに一定の期間を要する。妊娠能力の低い精液試料を判
別する検定を用いれば、従って、ここで開示したように、男性避妊法の効能を確
認することができる。
妊娠能力の低い精液試料は、上述のように脂質の過酸化テストで判別すること
ができる。さらに妊娠能力の低い精液試料は、精子含有試料(射精液)中の精子
(非運動性及び運動性)の数量化に基づいて判別することができる。得られた数
が約2000万精子/mL未満であれば、その精液試料は低い妊娠能力を有して
いると見なされる。
精子含有試料中に存在する精子数の指標として数量化できる精子のターゲット
又は精子の構成成分の例には、精子のたんぱく質(例えば精子のべん毛のたんぱ
く質、解糖作用性酵素、抗酸性酵素(例えばグルタチオンペルオキシダーゼ又は
スーパーオキシドジスムターゼ)、核たんぱく質、先体たんぱく質、α−チュー
ブリン、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH−X)、プロタミン、アクロシン又はミ
トコンドリアのたんぱく質)、又は精子の脂質(例えばコレステロール、ホスホ
リピド、糖脂質、トリグリセリド、脂肪酸、ホスファチジルグリセロール、セミ
ノリピド、及びドコサヘキサエン酸)が含まれる。精子数量化のための好適なタ
ーゲットは精子細胞に応じてかつ多種選択される。
好ましくは精子の試薬(例えば、精子抗体、リガンド、レクチン又は基質)を
用いて精子を数量化するとよい。好適な精子試薬には標識付けされた(例えば酵
素、トレーサ(例えば放射性の)、染料又は着色粒子で標識付けされた)又は標
識付けされていない抗精子抗体(例えば、ニューヨーク州ニューヨーク市チェロ
キー ステーションのアーネル プロダクツ社製、又はカリフォルニア州テメキ
ュラのケミコン インターナショナル社製の抗ヒト精子ポリクローン性抗体)あ
るいは精子構成成分(例えば精子たんぱく質又は精子脂質)に対する、標識付け
された又は標識付けされていない抗体が含まれる。さらに好適な精子の試薬には
、標識付けされた(例えば染料又はトレーサで標識付けされた)、又は標識付け
されていない試薬で、精子たんぱく質(例えばプロテイン リエージェント(コ
ネチカット州のマイルズ サイエンティフィック社製、0.3%のテトラブロモ
フェノール)又は、精子のミトコンドリアで蓄積するローダミン123がある。
もしくは、標識付けされた試薬(例えばローダミン)を精子の脂質と相互作用さ
せてもよい。
精子数を計測するのに好適な方法は、精子抗原と特定的に結合する、検出可能
に標識付けされた抗体(例えば抗ヒト精子ポリクローン性抗体、及び、精子のべ
ん毛、核たんぱく質、解糖作用酵素、先体等々のエピトープに特定の抗体)を用
いるものである。精子の数量化の一方法は、精子試料を、抗精子抗体を含んだ着
色粒子で適当な時間インキュベーションして、精子抗原を、抗体を結合させた着
色粒子と反応させるステップと、i)精子/着色粒子/抗体の複合体がフィルタ
に留められ、未結合の着色粒子/抗体及び精子の血漿たんぱく質はそのフィルタ
を通過するように、ii)試料にフィルタ処理を施すステップと、iii)色彩
の強度を視覚化するステップとを含む。
例えば、着色粒子を用いた場合では、精子/着色粒子/抗体の複合体は、フィ
ルタの色を、様々な精子量に応じて様々な色を示したカラーチャートと比較する
ことで数量化することができる。精子量が約2000万精子/mL未満の場合、
妊娠能力が低いことを示す。あるいは、このフィルタ膜は、このフィルタ膜に留
められた精子/検出可能な粒子/抗体の複合体が充分な量のときには「+」(つ
まり授精能有り)を示してその試料が妊娠を引き起こすには適切であること(2
000万精子/mLより大)を示し、このフィルタ膜に留められた精子/検出可
能な粒子/抗体の複合体が不充分な量のときには「−」(つまり生殖力なし)(
2000万精子/mL未満)を示すよう構成することも可能である。
精子含有試料(例えば射精液)中にある精子血漿成分とも反応する可能性のあ
る抗体又は試薬を利用するためには、精子を最初に分離することができる。精子
血漿を除かれた精子を次に、抗精子抗体で被膜形成された着色粒子と接触させて
もよい。抗体及び抗原が反応するよう十分な時間をおいた後、この混合物から、
未結合の抗体で被膜形成された着色粒子を取り除き、精子/着色粒子/抗体の複
合体を検出して数量化することができる。例えば試料中の精子の量は、カラーチ
ャート又は上述の「+」又は「−」フィルタで数量化することができる。あるい
は、結合ラテックス粒子と一緒に抗精子抗体を加えた後の試料一滴中の凝集反応
の様子を検出することで、精子を数量化することも可能である。
あるいは、精液試料中の運動精子のみを数量化すれば低妊娠能力を判定するこ
とができる。精子含有試料中の運動精子は、例えば上述の装置及び方法を用いて
分離することが可能である。精子を数量化する好適な方法は、精子抗原と特定的
に結合する検出可能に標識付けされた抗体を用いるものである。運動精子は、検
出可能に標識付けされた、精子に特定の抗体、例えば抗グルタチオンペルオキシ
ダーゼ(GPx)抗体を用いて数量化できる。精子SODの場合と同様、精子G
Px又はその他の精子抗原の免疫学的検出は、数多くの競合的又は非競合的検定
法のうちいずれを用いても行うことができる。加えて、精子の特定の抗体には(
例えば酵素的に)標識付けを行うことができ、そして必要な場合には、本分野で
公知の方法を用いて、又はSOD抗体について上に述べたように、固定するこ
とができる。
さらなる観点から、本発明は、一箱に梱包された数多くの簡単な試薬及び装置
を含む精子診断器具又はシステムを特徴としている。本器具の構成要素には、一
つ又はそれ以上の装置と、あるいは図1−3で示される構成要素と、精液試料の
妊娠能力を判定するための試薬とを含むことが考えられる。好適な器具には、精
液を液化する試薬(例えばキモトリプシン又はプロナーゼ)が含まれる。高い妊
娠能力を有する精液試料を判別するためには(つまり男性用授精能用器具)、好
適な器具は、脂質過酸化の指標の計測、又は、規定された条件下で一定時間経過
後に観察された指標変化の計測に基づいたものであるとよい。あるいは、さらに
以下の例で述べるように、器具は、精液試料中の精子数の判定に基づいていても
よいが、この場合、約4000万運動精子/mLを越えれば高い妊娠能力、約2
000万運動精子/mL朱満であれば低い妊娠能力、そして約2000万を越え
、かつ約4000万未満であれば境界線上の妊娠能力を示すこととなる。
妊娠能力の低い精液試料を判別する(例えば、男性避妊法の効果を確認するた
め)器具として好適なものは、試料中の精子/mL数の判定に基づくものであり
、この場合、約5万精子/mL未満であれば低妊娠能力又は避妊の成功を示すこ
ととなる。精子の妊娠能力を判定するために用いる試薬及び装置には、規定量の
分離した精子を採集容器から取って試料の妊娠能力判定手段を含む容器へ移し替
えるための小出し器具(例えば毛管又はピペット)が含まれ、この判定は、例え
ば、ストレスによる精子の脂質過酸化又は脂質過酸化の変化の程度を数量化する
こと、及び/又は精子数を数量化することによって行われる。
好適な実施例においては、精子の脂質過酸化を検出する手段は精子のスーパー
オキシドジスムターゼ(SOD)活性に基づいており、及び/又は、精子数を検
出する手段は精子たんぱく質の濃度に基づいている。特に好適な実施例では、精
子のSOD活性を検出する手段は比色分析的に標識付けされたSOD抗体を用い
ており、精子たんぱく質を検出する手段は金粒子を用いている。本器具にはまた
、
SOD及び/又はたんぱく質の濃度を公知の値と比較できるカラーチャートを含
めると好ましい。また本器具は、約5万精子/mL以上の精子濃度に相当するた
んぱく質レベルに基づいて発色するよう最適化することができる。
精液試料の妊娠能力を家庭で判定するために好適な器具は、i)採集容器(選
択的には、射精液を補足するような形状とされ、及び/又は、精液の液化を促す
溶液(例えば酵素)を含んでいる)と、ii)低張性溶液中で着色粒子に共有結
合した抗精子抗体を含んだ第二容器と、iii)精子/着色粒子、又は、精子/
着色粒子/抗体の複合体を補足し、かつ未結合の着色粒子又は着色粒子/抗体は
通過させる膜又はフィルタと、iv)得られた結果をフィルタの色に基づいて解
釈するチャートとを含む。男性授精能法を用いている場合は約2000万精子/
mL未満、男性避妊法を用いている場合は約5万精子/mL未満であれば、それ
ぞれ妊娠能力の低いことを示すものである。
本発明は以下の例でさらに説明されるが、以下の例はより詳細としてのみ意図
されたものであって、限定的に捉えられるべきではない。本出願を通じて引用さ
れる全参考物件(文献、発行特許、公開特許出願及び同時係属中の特許出願を含
む)の内容はすべて、参照としてここに編入されていることを明示する。
例1: 精液試料から運動精子を分離する器具器具の構成要素
1)(1)等張液中に30mg/mLのデキストラン及び5mg/mLのキモト
リプシンを含んだ射精液を採集し、かつ液化する容器(試験管#1)
2)(1)低位(1mL)、中位(1.5mL)及び上位(2mL)の三種類の
量を示す透視性容器(試験管#2)。この三種類の量は、黒及び赤の印で示すこ
とができる(最上段及び最下段のマークは同じ色とする)。
3)等張液の0.5mL容器(試験管#3)
3)(1)等張液中に0.2mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)を含ん
だ0.5mLの容器(試験管#4)
4)(1)空の容器
5)(少なくとも三個の)使い捨ての滅菌済ピペット及び毛管
6)(1)運動精子を採取して移すための毛管ピペット
7)(少なくとも一枚の)精子を数量化する手段(例えばたんぱく質の試薬)を
含んだ試験紙
8)使用上の指示
9)(1)摂氏37度の加熱用ブロック(オプション)手続
射精液を、等張液中に5mg/mLのキモトリプシン及び30mg/mLのデ
キストランを含んだ採集用試験管(試験管#1)に採集した。この混合物を室温
で約5分ほど放置した。
1mLアリクォットの精液/デキストラン/キモトリプシンの混合物を、スポ
イトを用いて、この混合物が一番目のマークの高さに至るまで目盛り付き透視性
容器(試験管#2)に加えた。ピペットは廃棄した。
適量の等張液(容器#3)を、精液/デキストラン/キモトリプシンの混合物
上に、各透視性容器の上位マークまで第二のスポイトを用いて注ぎ、低い方の層
は精液/デキストラン/キモトリプシンの混合物から成り、高い方の層は等張液
から成る二つの層を成す密度勾配を形成させた。スポイトは廃棄した。
この混合物を少なくとも5分間、室温又は選択によっては摂氏37度の加熱用
ブロックで放置した。
滅菌済毛管ピペットを容器の中位マークに至るまで挿入した後、例えばたんぱ
く質の試薬、脂質の試薬などの精子を数量化する手段を含ませた試験紙に滴下し
た。
例2:精液試料の妊娠能力を予測する温度ストレス
体外授精(IVF)(n=33)又は配偶子卵管内注入(GIFT)(n=1
1)を行っている44組の夫婦の男性側からヒトの精子(HS)試料を得た。男
性はすべて従来の分析によれば正常な精液を有していた(従来、正常な精液試料
とは、1mL当り2000万を越えるセル数、60%を越える運動率、(1から
4までの段階評価で)2を越える前進率、60%を越える正常形、1.5mLか
ら5.0mLの射精、著しい精子の凝集が見られないこと、正常な数の白血球数
、及び過粘稠度のないことを条件として規定されている)。精液試料は、標準的
なパーコール法を用いて分離した後、10%のプラズマネートを含んだHTF媒
質で再懸濁させた。精子懸濁液の一定アリクォットを人工授精技術(ART、例
えばIVF及びGIFT)に用い、同じ精液懸濁液の100μLアリクォットを
摂氏40度で4時間インキュベートした(ストレステスト)。ストレステストの
得点は、最終的な運動率の当初の運動率に対する比で表した。段階的多重回帰分
析によって分析を行った。独立変数は、女性の年齢、ストレステストの前後のH
S運動率、ストレステストの得点、及び各IVFサイクル毎に注入される胎芽の
数であった。依存変数は妊娠及び授精という結果であった。
盲検コホート研究では、44ARTサイクルのうち、11(25%)が妊娠と
いう結果を生んだ。研究に用いられた44の精液試料のうち、24(55%)が
ストレステストの得点<0.8及び20(45%)>0.8であった。すべての
変数について調整すると、ストレステストは妊娠結果と著しく相関関係にあった
(P=0.0001)。甚だしく対照的に、ストレステスト前の運動率は妊娠結
果と相関関係にはなかった。妊娠はすべて、ストレステストの得点>0.8の精
液試料で起きていた。従って、カットオフ値>0.8を妊娠結果を予測するため
に選択した。ストレステストの感応性は100%であり、特異性は73%だった
。ストレステストの得点<0.8のときに妊娠能力なしと定義される、テストの
マイナス予測値は100%であり、ストレステストの得点>0.8のときに妊娠
の発生として定義されるプラス予測値は55%であった。ストレステストの得点
は
妊娠結果を高い確率で予測するものであるが、受精率は、ストレステスト後の運
動率による方がより良好に予測していた(P=0.007)。
例3:精液試料の妊娠能力を予測するための酸化ストレス
例4で述べるのと同様なテストが行われたが、その方法における例外は、PB
S(リン酸塩食塩水)中に加えた10μLの0.125mM第一鉄と、同じくP
BS中に加えた0.6mMのアスコルビン酸塩とを30μLの精子懸濁液に加え
て合計50μLとし、この混合物を摂氏37度で弱く揺らしながら0.5時間、
インキュベーションすることでストレスを加えたことである。結果として得られ
た値は、摂氏40度で4時間行ったストレステストと相関関係にあることを示し
ている。
例4:精子のスーパーペルオキシドジスムターゼ(SOD)活性は妊娠率と相関
関係にある
ヒトの精子は酸素ラジカルを放出して自発的な脂質の過酸化を行い、精子の血
漿及び先体膜に大きな損傷を起こすと共に妊娠能力を失う。Cu/Zn−スーパ
ーオキシドジスムターゼ(SOD)は、酸素ラジカルが媒介する毒性と、内因性
の脂質過酸化とから精子を保護する。表面SODの免疫反応性はヒト精子の中間
片及び赤道後部域において表れる(参照として、アルバレス及びストーリー、(
1992)J.男性病学 13(3):232−241の内容をここに編入する
)。
SOD活性が精子の妊娠能力及び妊娠率と関係があるかどうかは、体外授精(
IVF)を行っている夫婦の27人の男性側から採取した精液試料を用いて研究
を行った。女性側の年齢は24歳から49歳までであった。媒製した卵母細胞の
数は3から20であり、注入した胎芽の数は1から7であった。精液試料は標準
的なミニパーコール法を用いて分離し、10%のプラズマネートを含むHTF
媒質で再懸濁させた。精子懸濁液の一定アリクォットをIVFに用い、別の一定
アリクォットを用いてその特定の試料のSOD活性を計測した。
検査した精液試料のSOD活性の幅は1.5から12U/108セル(P<0
.001)であった。SOD活性が3.3U/108セル以下であった六つの精
液試料はすべて受精に失敗した(P<0.001)。4.7から7.1U/108
セルの間では、16の卵母細胞のうち15が受精したがその後妊娠には一つも
結びつかなかった。
これらの結果から、SOD活性の高い(つまり約9単位/108セルよりも大
きい)精液試料は高い妊娠能力を有し、SOD活性の低い(つまり約7単位/1
08セルよりも小さい)試料は妊娠能力の低いことが分かる。SOD活性が約7
単位/108セル以上約9単位/108セル未満の範囲である試料は境界線上の妊
娠能力を有する。
例5:妊娠能力の高い精液試料を判別するための検定
5mg/mLのキモトリプシンを含んだ採集用試験管(試験管#1)に射精液
を採取した。約3分から5分(この間にこの精液は液化する)後に、液化した精
液の一定アリクォット(約50μL)を、別の試験管(試験管#2)に加えたが
、この試験管#2には、セイヨウワサビのペルオキシダーゼと共役させたヒツジ
抗ヒトスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)IgGのポリクローン性抗体(
92121 カリフォルニア州、サン ディエゴ、オバーリン ドライブ、58
89、バインディング サイト社製)、及び、セイヨウワサビのペルオキシダー
ゼと共役させたヒツジの抗ヒトグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)IgG
のポリクローン性抗体(92121 カリフォルニア州、サン ディエゴ、オバ
ーリン ドライブ、5889、バインディング サイト社製)が、低張液中に溶
解させた状態で入れられていた。5分後に、結合ヒツジ抗ヒトSOD及び抗ヒト
GPxIgGのポリクローン性抗体(92121 カリフォルニア州、サン デ
ィ
エゴ、オバーリン ドライブ、5889、バインディング サイト社製)を含ん
だ浸漬試験紙を試験管#2に挿入した。5分後、この試験紙を試験管から取り出
し、水道水ですすいだ。
この試験紙は次に、ペルオキシダーゼ基質、過酸化水素(H2O2)及びジアミ
ノベンジジン(DAB)(63178 ミズーリ州、セント ルイス、シグマケ
ミカル社製)を入れた別の試験管(試験管#3)に浸した。SOD/GPxの色
の比率を、器具に添付のチャートと比較すれば妊娠能力が判定できる。GPx用
紙の色は約2000万精子/mL以上を示す。SOD用紙の色がGPx用紙の色
よりも高ければ、精液の妊娠能力が高いことを示す。SOD用紙の色がGPx用
紙の色と同等又は低い場合は、妊娠能力が低いことを示す。
例6:男性避妊法の効果を観察するための検定(カラーチャート法)
精子形成を抑える男性避妊薬(例えばGnRH拮抗物質)を適量使用した、又
は、精管切除術を受けた男性の射精液を、等張液中5mg/mLのキモトリプシ
ンを含んだ採集用試験管(試験管#1)に採取した。3から5分(この間に精液
は通常液化する)後に、約500μLの液化した精液を別の試験管(試験管#2
)に加えたが、この試験管#2には、低張性又は等張性溶液中で、(本来ピンク
色を有する)金粒子又は(青色又は黄色の)着色ラテックス粒子に共有結合した
抗ヒト精子ポリクローン性抗体(ニューヨーク州ニューヨーク市、チェロキー
ステーション、アーネル プロダクツ社製、カリフォルニア州、テメキュラ、ケ
ミコン インターナショナル社製)が含まれていた。この混合物を約10分間ま
でインキュベートし、低張処理後に現れた精子抗原を抗体と反応させた。インキ
ュベーション後、試験管#2の内容物をフィルタ膜に移し、精子/着色粒子/抗
体の複合体をフィルタに保持させ、未結合の着色粒子/抗体はフィルタを通過さ
せてレザバーに受けた。この後、フィルタの色を、この器具に含まれたチャート
に示された様々な色見本と比較して試料中に存在する精子数を判定し、またそれ
によってその男性避妊法の効果を判定した。この方法を用いれば精液の、少なく
と
も5万精子/mL密度を検出することができる。この感応性は、男性学研究室で
普通に用いられる通常の光顕微鏡で得られる感応性に匹敵する。
例7:男性避妊法の効果を観察するための検定(プラス(+)又はマイナス(−
)法)
等張液中に5mg/mLのキモトリプシンを含む採集用試験管(試験管#1)
に射精液を採取した。約3から5分(この間に精液は通常液化する)後に、一滴
(50μL)(男性授精能用器具の場合)又は0.5mL(男性避妊法用器具の
場合)の液化精液を、低張液を含んだ別の試験管(試験管#2)に加えた。5分
間インキュベートした後、一滴(約50μL)(男性授精能用器具の場合)又は
全内容量(男性避妊法用器具の場合)を、二つの窓を設けた膜に移した。この窓
#1を用いて試料を滴下したところで試料を塗布したが、可溶性の精子抗原が、
膜内でレザバーに含まれた金又は着色ラテックス粒子と共役の抗ヒト抗体と反応
し、他方、窓#2は水平方向に着色した線を有していた。この精子抗原/抗体/
粒子の複合物が膜を通過して移動するにつれ、(抗体を捕捉した)窓#2の下方
の膜に対して垂直位置に結合した第二の抗ヒト精子抗体が、精子抗原/抗体/粒
子の複合物と反応し、精液中の精子密度が5万精子/mLを越える場合には着色
した縦線を生じ、このときプラス(+)の記号が表れた。精液中の精子密度が5
万精子/mL未満の場合には、マイナス(−)記号が表れた。
例8:男性の授精能及び避妊法スクリーニング器具(フィルタ法)器具の構成要素
1)(1)目盛り付き精液採取用試験管
2)(1)キモトリプシン溶液を含んだスクィーズボトル
3)(1)等張液又は低張液を含んだ試験管
4)(2)スポイト
5)(1)液体レザバーに取り付けたフィルタ
6)(1)抗精子抗体で被膜形成した着色ラテックス又は金粒子溶液を含んだス
クィーズボトル
7)使用上の指示手続
スクィーズボトルを用いて、キモトリプシン溶液(デキストランなし)を精液
採取用試験管に精液量と同量加えた。この混合物を室温で約5分間放置し、精液
を液化した。
スポイトを用いて、この精液採取用試験管中の精液/キモトリプシン混合物を
、一滴(男性授精能用器具の場合)又は0.5mL(男性避妊法用器具の場合)
、等張液(例えばリン酸塩緩衝食塩水又はアール媒液)又は低張液(例えば蒸留
水)を含んだ別の試験管(試験管#2)に加えた。
試験管#2の一滴(50μL)(男性授精能用器具の場合)又は0.5mL(
男性避妊法用器具の場合)を、液体レザバーに取り付けられたフィルタ(例えば
細孔の大きさが5μmのブロックトニトロセルロース、細孔の大きさが2.7μ
mのミクロファイバガラス繊維)に加えた。大きさは約10−20nmである精
液の血漿たんぱくはフィルタを通過し、約1000倍の大きさ(大きさ50μm
)である精子細胞は留められた。
抗精子抗体の被膜を形成された着色粒子(例えば、本来の色がピンクである金
粒子、又は着色ラテックス粒子)を一滴、このフィルタに加えると、フィルタの
呈した色から、おそらく授精能のある精子試料であると判明した。このフィルタ
法を用いたことで、ラテックス粒子に被膜形成するのに用いた抗体を、精子細胞
にさほど特定されることなく(精液の血漿たんぱくにある程度の交差反応性を呈
すればよい)決めることができた。
例9:男性の授精能及び避妊法のスクリーニング器具(抗体及び精子抗原のプレ
インキュベーションを伴うフィルタ法)器具の構成要素
1)(1)目盛り付き精液採取用試験管
2)(1)キモトリプシン溶液を含んだスクィーズボトル
3)(1)等張液又は低張液を含んだ試験管
4)(2)スポイト
5)(1)液体レザバーに取り付けたフィルタ
6)(1)抗精子抗体で被膜形成された着色ラテックス又は金粒子の溶液を含ん
だスクィーズボトル
7)使用上の指示手続
スクィーズボトルを用いて、キモトリプシン溶液(デキストランなし)を、精
液と同量、精液採取用試験管に加えた。この混合物を室温で約5分間放置して精
液を液化させた。
スポイトを用い、精液採取用試験管内のこの精液/キモトリプシン混合物を、
一滴(約50μL)(男性授精能用器具の場合)又は0.5mL(男性避妊法用
器具の場合)取り、等張液(例えばリン酸塩緩衝食塩水又はアール媒液)又は低
張液(例えば蒸留水)中に、抗精子抗体で被膜形成した着色粒子(例えば本来ピ
ンク色の金粒子、又は着色ラテックス粒子)を含んだ別の試験管(試験管#2)
に加えた。
試験管#2の内容物である、一滴(50μL)(男性授精能用器具の場合)又
は0.5mL(男性避妊法用器具の場合)を液体レザバーに取り付けられたフィ
ルタ(例えば、細孔の大きさが5μmのニトロセルロース、又は細孔の大きさが
2.7μmであるミクロファイバガラス繊維)に加えた。大きさが約10−20
nmである精液の血漿たんぱく/着色粒子抗体/混合物はフィルタを通過したが
、約1000倍の大きさ(大きさ50μm)である精子細胞/着色粒子抗体/混
合物は留められた。このフィルタ法を用いることで、使用する抗体を精子細胞に
さほど特定されることなく決めることができた(つまり、精液の血漿たんぱくに
ある程度の交差反応性を呈すればよいのである)。
例10:男性の授精能&避妊法のスクリーニング器具(凝集法)器具の構成要素
1)(1)目盛り付き精液採取用試験管
2)(1)キモトリプシン溶液を含んだスクィーズボトル
3)(1)等張液又は低張液、及び精子に特定の抗体で被膜形成された粒子(未
着色又は着色)を含んだ試験管
4)(2)スポイト
5)(1)抗精子抗体で被膜形成された粒子と対照的な色を有するスライド
6)使用上の指示手続
スクィーズボトルを用いて、キモトリプシン溶液(デキストランなし)を、精
液と同量、精液採取用試験管(試験管#1)に加えた。この混合物を室温で約5
分間放置して精液を液化させた。
スポイトを用い、この精液/キモトリプシン混合物を、一滴(50μL)(男
性授精能用器具の場合)又は0.5mL(男性避妊法用器具の場合)取り、等張
液(例えばリン酸塩緩衝食塩水又はアール媒液)又は低張液(例えば蒸留水)、
及び、精子に特定の抗体で被膜形成した粒子(未着色又は着色)を含んだ別の試
験管(試験管#2)に加えた。
試験管#2の一滴を取り、精子に特定の抗体で被膜形成されたラテックス粒子
とは対照的な色を有したスライドにのせ、授精能のある精子の存在を示す凝集を
スライド上で認識できるようにした。男性授精能検定法であれば、凝集がなけれ
ば約2000万精子/mL末満であり、境界線上程度の凝集があれば約2000
万精子/mLより大きくかつ4000万精子/mL未満であり、高レベルの凝集
があれば約4000万精子/mLを越えていることを示した。男性避妊法を用い
ているときに凝集が見られなければ、約5万精子/mL未満を示していた。
例11:男性の授精能&避妊法のスクリーニング器具(非免疫反応/フィルタ法
)器具の構成要素
1)(1)目盛り付き精液採取用試験管
2)(1)キモトリプシン溶液を含んだスクィーズボトル
3)(1)等張液又は低張液を含んだ試験管
4)(2)スポイト
5)(1)液体レザバーに取り付けられたフィルタ
6)(1)例えばピンク色の金粒子(たんぱく質と反応)又は赤色のローダミン
(脂質と反応)など、精子細胞成分と非特定的に反応する着色試薬を含んだスク
ィーズボトル
7)使用上の指示手続
スクィーズボトルを用いて、キモトリプシン溶液(デキストランなし)を、精
液と同量、精液採取用試験管(試験管#1)に加えた。この混合物を室温で約5
分間放置して精液を液化させた。
スポイトを用い、この液化精液を、一滴(50μL)(男性授精能用器具の場
合)又は0.5mL(男性避妊法用器具の場合)取り、低張液又は等張液中に金
粒子(本来の色はピンク)を含んだ別の試験管(試験管#2)に加えた。試験管
#2の内容物である、一滴(男性授精能用器具の場合)又は0.5mL(男性避
妊法用器具の場合)をフィルタ(細孔の大きさが5μmのニトロセルロース、又
は細孔の大きさが2.7μmであるミクロファイバガラス繊維)上に加えた。金
粒子は本来ピンク色をしており、生体分子(例えばたんぱく質又は脂質)に対し
て高い親和性を有しているため、精子及び精液の血漿たんぱくの両方に結合する
ことができる。このフィルタ法を用いることで、未結合の金粒子、及び、精液の
血漿たんぱくに結合した金粒子はフィルタを通過してレザバに受け止められるが
、金粒子と結合した精子細胞はフィルタに留められてピンク色を呈する。男性授
精能法に用いた場合にピンク色を呈していれば約2000万精子/mLを越える
精子が存在することを示し、男性避妊法に用いた場合には約5万精子/mLを越
える精子が存在していることを示すものであった。
例12:妊娠能力の高い精液試料を判別するための検定
射精液は、等張液中に5mg/mLのキモトリプシンを含んだ採取用試験管(
試験管#1)に採取された。約3分から5分(この間に精液は通常液化する)後
に、液化した精液のうちの一滴(約50μL)を取って、試験管(試験管#2)
に加えたが、この試験管#2は、低張液又は等張液中に、黄色に着色された粒子
に結合した抗グルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)抗体と、青色に着色され
た粒子に結合した抗スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)抗体とを含んだも
のである。この混合物を約10分間までインキュベートして低張処理後に露出し
た精子抗原を抗体と反応させた。インキュベーションに続いて、試験管#2の内
容物をフィルタ膜に移し、精子/着色粒子/抗体の複合物をフィルタ上で留めさ
せ、未結合の着色粒子/抗体はフィルタを通過させてレザバで受け止めた。フィ
ルタが緑色を呈していれば、SOD/GPx比は1:1であり、試料が境界線上
の妊娠能力を有し、フィルタが青みがかっていれば、SOD量が高く、試料が高
い妊娠能力を有し、そしてフィルタが黄みがかっていれば、SOD量が低く、試
料の妊娠能力が低いことを示していた。
例13:男性の授精能&避妊法のスクリーニング器具器具の構成要素
1)(1)目盛り付き精液採取用試験管
2)(1)液化酵素(例えば、5mg/mlのキモトリプシン又はプロナーゼ)
を含んだスクィーズボトル(スクィーズボトル#1)
3)(1)150μLの等張液又は低張液を含んだスクィーズボトル(上部が取
り外し可能)(スクィーズボトル#2)
4)(1)蒸留水中に0.5mg/mLのローダミン−123(オレゴン州、ユ
ージーン、モラキュラー プローブス社製)溶液を含んだスクィーズボトル(ス
クィーズボトル#3)
5)(1)スポイト
6)(1)液体レザバに取り付けられた多孔性フィルタ
7)使用上の指示手続
備え付けのスクィーズボトル(スクィーズボトル#1)を用い、アール媒液中
の(精液1ミリリットル当り)プロナーゼ溶液(ミズーリ州、セント ルイス、
シグマ ケミカル社製)の溶液を2滴(5mg/mL)取り、採取用試験管中の
射精液に加えた。この混合物を室温で約5分間放置して精液を液化させた。
スポイトを用い、一滴(男性授精能用器具の場合)又は四滴(男性避妊法用器
具の場合)の液化精液を取り、上部を取り外した、150μL(男性授精能用器
具の場合)又は250μL(男性避妊法用器具の場合)の低張液を含んだ別のス
クィーズボトル(スクィーズボトル#2)に加えた。次に、スクィーズボトル#
3内のローダミン−123(オレゴン州、ユージーン、モラキュラー プローブ
ズ社製)を一滴(男性授精能用器具の場合)又は四滴(男性避妊法用器具の場合
)取り、スクィーズボトル#2に加えて上部を元に戻した。次に内容物を指で軽
く
たたいて混合した。
スクィーズボトル#2の全内容物から二滴(男性授精能力器具の場合)取り、
液体レザバに取り付けられた多孔性フィルタ(細孔の大きさは約2.7μm)に
加えて色を視覚化した。色が付かなければ約2000万精子/mL未満の濃度、
かすかに色が付けば約2000万精子/mLを越え、かつ約4000万精子/m
L未満の濃度、そして色が付いていれば約4000万精子/mLを越える濃度を
示すものであった。
当業者であれば、ここで説明された本発明の具体的実施例の等価物を数多く認
識し、またごく通常の実験を用いて確認することが可能であろう。このような等
価物は以下の請求項の範囲に含まれるものと意図されている。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Tests, equipment and instruments for determining male fertility
Background of the Invention
Judgment of fertility of semen sample
According to a recent study, about 40% of married couples have no children if they cannot have children.
It is said that the cause is due to infertility. In addition, the use of contraceptives by men has increased.
It is rising. For example, recent estimates show that more than half a million vasectomies in the United States
It is held annually, and the number is about 2 million worldwide. In addition to vasectomy
Various types of oral contraceptives for use on the male side have been developed. For male contraception
More fertile men are less likely to cause pregnancy, but 100% effective
There is no effective male contraception method. In addition, many male contraceptives are still effective
Requires a certain period.
According to World Health Organization standards, semen is considered fertile
One man ejaculates at least twice in the range of 1.5 to 5.0 milliliters
The resulting semen has a sperm density of more than 20 million sperm / mL, and / or
Must have a 60% rate of movement with more than two forward movements (in steps 1-4)
I have to. In addition, the semen sample must be free of aggregation, pus, and hyperviscosity.
No (1991, Mozby Year Book, 2nd Edition, Lip Schulz
LI and SS Howards, "Male Infertility", 184 pages, Sigman, M
. Others evaluate low-fertility men).
Typically, male infertility is diagnosed based on low sperm motility and / or number
. However, they are still alive due to damage during the process.
Analytics by kinetic rate are falsely negative because some sperm appear to be not exercising
Target
May produce results. Regarding sperm count, sperm concentration of 20 million sperm / mL or more
If there is a degree of insemination, it is regarded as an inseparable area, but it does not exercise, survives
Unexpected sperm may be included in this number. Sperm count and motility
Use commercially available instruments, such as light microscopes or computer video analysis systems.
Has been evaluated.
U.S. Pat. No. 5,068,089 is based on the action of sperm to lighten the color of a dye.
Describes a household appliance for testing the fertility of human sperm. (Appears colorimetrically
It is said that the degree of color dilution indicates sperm insemination ability. However,
This test is time consuming and requires incubation at temperatures above room temperature.
Yes, it may be diluted by sperm cells, or may be contained in the semen sample.
Can't tell if it's a sparse cell.
U.S. Pat. No. 5,219,729 discloses a binding parent to sperm oocyte zona pellucida.
Describes a laboratory assay for determining fertility based on compatibility. The stronger the bond,
The insemination ability of the semen sample is high. However, this assay does not include
Cell debris is required, and semen is contacted with the oocyte debris for at least 4 hours.
Must be kept.
U.S. Pat. No. 5,434,057 discloses a method for males based on the detection of fumarase activity.
Describes assays and instruments for determining fertility. However, fumarase is a cell
Cells (epithelium, leukocytes) that may be present in semen samples
And bacteria or mold), and as this patent claims,
It is doubtful that zee activity is an accurate indicator of sperm count and motility.
A simple, fast test to test the insemination capacity of semen samples in the laboratory, consultation room or at home
There is a need for an accurate test method.Increased effect of artificial insemination technology
In vitro fertilization (IVF), gamete intratubal infusion (GIFT), intrauterine insemination (IUI)
And artificial insemination technology (ART) such as sperm intracytoplasmic injection (ICSI)
A method is provided to encourage pregnancy when the pregnancy cannot be completed in the proper process. These skills
Surgery can also be used to breed animals and produce transgenic animals
.
However, artificial insemination techniques do not always lead to pregnancy. example
For example, the success rate of in vitro insemination has been calculated to be about 25%, while the success of gamete intratubal injection
The efficiency is calculated to be about 31%. The key to unsuccessful attempts with artificial insemination technology
One possible cause is that not all semen samples are fertile.
Sometimes. According to a recent study, about 40% of married couples have no children.
However, it is said that male infertility is the cause.
Furthermore, the probability that a semen sample cannot cause pregnancy depends on the semen sample
It goes high when it has been stored for a period of time or has been frozen.
This finding has significant implications for artificial insemination technology that has used frozen semen
There is. Cryopreservation can cause sublethal cold damage, in which case
The vesicle viability decreases rapidly over time after thawing compared to fresh cells.
Good. Sublethal cold damage causes membrane embrittlement due to phase shifts during freezing and thawing
Has been found to be partly due to this (Alvarez, JG and BT
Torrey, (1993) J. Mol. Andrology 14 (3): 199-209). Less than
To a lesser extent, sublethal cold injury is due to spontaneous lipids in the semen phospholipids.
It has been found to be caused by peroxidation (SLP) (Alvarez, J. et al.
G. FIG. And B. T. Story, (1993) J.M. Male Oncology 14 (3): 199
-209 and J.I. G. FIG. Alvarez and B.A. T. Story (1992) Man
Stomatology 13 (3): 232-241). Spontaneous lipid peroxidation should not be stored frozen.
This is considered to be a major factor that limits the kinetic life of sperm (Alvare)
Su, J. G. FIG. And B. T. Story, (1988) Gamete Study 23: 77-9
0, as well as Alvarez, J.M. G. FIG. And B. T. Story, (1985) Biology
Reproductive function, 32: 342-351). Phospho caused by spontaneous lipid peroxidation
The selective oxidation of the unsaturated fatty acid component bound to lipids is dependent on the sperm plasma and acrosome membrane and
It extends to the major damage of DNA oxidation.
However, cryopreservation of semen samples is very common in artificial insemination.
And in fact the donor does not have a contagious source of infection (eg AIDS)
Or, it is necessary to test before insemination. For example, donors are often identified
6 months after the sample has been provided and tested only if the result is negative,
The stored sample is used for insemination.
An increasing number of couples rely on artificial insemination to have children. In addition, outside the body
Use of fertilization techniques by livestock breeders or to produce transgenic animals
Increasingly. There is a need for ways to increase the success rate of artificial insemination
You.
Summary of the Invention
Broadly speaking, the present invention separates motile sperm from sperm-containing samples (eg, semen).
For quantifying and / or determining the fertility of a semen sample
And instruments. Briefly, the device separates sperm-containing samples
Includes a container that can be configured to sort sperm based on motility
preferable. If desired, the container is easier to collect (eg, funnel-shaped, etc.)
Such a shape can be adopted. In a preferred embodiment, motile sperm in a sperm-containing sample
A capture device is provided inside the container that allows only ingress and migration and prohibits non-motile cells.
Is placed. The appropriate position of the trap is for the pregnancy of sperm migrating into the trap.
It is preferable to arrange means for determining pregnancy ability. Or, separated motile sperm
Can also be removed from this trap and inspected separately.
In one embodiment, the capture device is a compartment (eg, a test tube) in fluid communication with a sperm-containing sample.
)
It is. In another embodiment, the capture device is a less concentrated fluid than the sperm-containing sample.
, So that motile sperm can pass easily, but non-motile cells cannot.
It is assumed. In yet another embodiment, the capture device comprises a porous membrane, which can be
Separation of the sperm-containing sample from the separation zone by
Block the passage of non-motile sperm and other cells
It is possible to enter.
From a second viewpoint, the present invention is characterized by an assay for discriminating a semen sample having high fertility.
This assay can be used to indicate and indicate the fertility status of male donors,
It is also possible to choose to use for artificial insemination technology (ART). Good fruit
In an embodiment, the process is: 1) multiple semen samples from one donor at different times.
Collecting; 2) collecting a fixed aliquot from each semen sample;
3) examining each aliquot to determine fertility; 4) high pregnancy
At least one semen sample with the ability is used for artificial insemination to cause pregnancy
Steps. In a preferred embodiment, this test is performed under stress.
It is based on quantifying the indicator of lipid peroxidation, or the change in indicator. Spirit
A particularly suitable indicator of liquid lipid peroxidation is sperm superoxide dioxide.
Smutase (SOD) activity, which can be measured, for example, using an anti-SOD antibody.
Can be
From a third aspect, the present invention provides a method for detecting the fertility of a semen sample,
Identify potentially infertile men, or after vasectomy or certain contraceptives
It features a screening assay that evaluates men after administration of. Suitable
In an embodiment, the screening assay is based on determining the number of motile sperm.
I have. In one embodiment, motile sperm are first separated and counted. As a result of quantification,
Less than 50,000 motile sperm / mL is effective for contraceptives, and the pregnancy ability of the semen sample
Is low. In another embodiment, sperm quantification is performed on sperm-containing samples.
Directly (without separating motile and non-motile spermatozoa), resulting in quantification
Is less than about 20 million sperm / mL, the fertility of the sample is low and about 2
If it is more than 10 million sperm / mL and less than about 40 million sperm / mL, the sample
Pregnancy ability is on the borderline, and if it exceeds about 40 million sperm / mL, the sample
It turns out that the pregnancy ability is high. The lower limit of 20 million sperm / mL is motility and non-motile.
Contains both motile sperm. This value is not very useful for diagnosing infertility
However, it is intended for use as part of a screening test. This
In this way, a male examines her insemination ability using this device, and
If it is less than / mL, it can be known that there is a possibility of infertility.
From a fourth point of view, the present invention provides a number of simple reagents and
Features sperm diagnostic tools and systems, including devices. Semen with high pregnancy ability
In one embodiment used to determine the sample, the device provided a means for separating sperm and fertility.
Means for discriminating a strong semen sample can be included. This sperm depending on your choice
The separation means will be of a suitable shape (eg, funnel-shaped) to facilitate collection. Further
Depending on the selection, reagents that liquefy semen for use in sperm separation (eg,
Zemo or chymotrypsin) is included in this device. Preferably, this high fertility
The means of discriminating semen samples are based on lipid peroxidation and
The means of screening (effect of infertility or male contraceptives) is based on sperm count
It is good.
The assays, devices and instruments of the present disclosure are easy to implement and take less than about 15 minutes.
be able to. The information obtained by this test, the device and the equipment includes, for example, meals, sleep,
Factors such as physical activity, exposure to carcinogens such as smoking, and alcohol consumption
Observe the effects on the insemination ability of semen samples
Can be used to guess. Further, using the present apparatus, apparatus and method,
The infertility treatment or contraceptive surgery for certain men was effective or
Whether sperm obtained from the same man causes pregnancy when contacted with oocytes
Can be shown. In addition, the assays, devices and instruments may
Also used to determine whether a sample is suitable for use in artificial insemination
Can be.
Some of the assays, devices and instruments are suitable for use in laboratories, while
Some can be used in the consultation room and / or at home. Other features and advantages include:
It will be readily apparent from the following detailed description and the appended claims.
BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
FIG. 1 shows an embodiment of a sperm separation apparatus including a test tube for containing and capturing motile sperm.
It is a perspective view.
FIG. 2 includes a less concentrated fluid membrane in contact with a more concentrated sperm-containing sample.
FIG. 7 is a perspective view of another embodiment of a sperm separation device.
FIG. 3 shows a sperm separation apparatus in which a porous membrane separates a semen sample from a motile sperm collection area.
FIG. 11 is a perspective view of still another embodiment.
Fig. 4 shows the results of the semen sample and the stress test in which the score of the stress test exceeded about 0.8.
A graph showing the recovery of the motility when the sample with the score of less than 0.8 was frozen and stored.
is there.
Detailed description of the invention
The present invention is directed to the rapid recovery of motile sperm from sperm-containing samples (eg, semen).
A simple device that can be used and discriminates semen samples with high fertility using the device
It relates to the assay and the instrument to be tried. The present invention also screens male infertility
Check to see if male contraceptives are effective or effective
Tests and instruments.
A preferred sperm separation device is based on sperm motility and contains
And separating means selectively disposable within the housing means for separating motile sperm;
Means for examining motile sperm to determine pregnancy ability. One embodiment is shown in FIG.
The container 10 contains a sample receiver 2 for containing a sample 30 containing ejaculate from a male donor.
1 having side walls 12, 14, 16 and 18 and a bottom 20. Illustrated
Although the one is cubic, the container 10 is suitable for capturing and holding a sperm-containing sample.
Any shape or size may be selected. The capturing device 24 is a sample receiver for the container.
Although it can be located within 21, it is preferred that it be in fluid communication with sample 30. This
Those skilled in the art will recognize that the capture device 24 can be made using a number of known methods, including the use of adhesives.
It can be attached to the bottom 20 of the container 10 and by any suitable support means
It can be supported in the container 10. The capturing device 24 has a cylindrical shape.
Although it is shown in the figure, it is not suitable if it is suitable for separating and retaining motile sperm.
Shape or size, and for example, test tubes, capillaries, straws, pipettes
And other commercially available devices, such as receptacles with internal conduits. In addition
The container 10 has a substantially rectangular parallelepiped shape.
Any convenient shape for collecting and capturing the sample, such as a funnel,
May be selected. The container 10 and the catcher 24 are made of, for example, glass or
It can be made of any suitable biocompatible material, such as tics.
No.
The sample 30 shown is believed to contain both motile and non-motile sperm.
You. According to a preferred embodiment, the capture device 24 is located in the sample receiver 21 or
, So that motile sperm can migrate to the conduit 22 of the receptor 24. Receptor 2
4. Capture the motile sperm at 4 and then analyze the captured motile sperm to analyze the semen sample
Determine pregnancy ability. For example, the motile sperm in the sample 30 surely swims in the trap 24.
After a sufficient time has elapsed to complete the movement, the catcher is removed from the container 10 and the sample is removed.
34 containing a means for testing motile sperm to determine fertility
, For example, in a test tube.
Alternatively, the detection mechanism 36 can be mounted within the conduit 22 of the capture device 24.
. Preferably, the motile sperm migrating into the conduit 22 contacts this detection mechanism 36.
Yo
No. This detection mechanism detects motile sperm to determine the fertility of a sperm-containing sample.
It is preferred to include a suitable membrane or substrate containing the means for inspecting.
Alternatively, the motile sperm is contacted with a mechanical or fluid barrier or based on a gradient.
It can also be separated from non-motile cells in a semen sample. For example, as shown in FIG.
Contact a relatively dense sperm-containing sample with a less dense fluid layer
However, the fluid layer should be at the same temperature and pH as the sperm-containing sample.
And a salt concentration. In FIG. 2 and all subsequent drawings,
Similar parts are indicated by the same reference numerals with a superscript prime. Illustrated
Container 10 # includes a first fluid layer 40 and a second fluid layer 46. The first fluid layer 40 is a man
Semen sample from a sexual donor and, optionally, suitable reagents for liquefying the semen sample
For example, pronase or chymotrypsin. Layer 40 typically contains motile sperm and
And / or non-motile sperm. Second fluid layer 46 is preferably denser than first fluid layer 40.
It is a fluid with a low degree, so that a density gradient is generated in the height direction of the container 10 '.
You. Due to the reduced density between layers 40 and 46, sample fluid layer 40
Electrophoresis of motile sperm into the collection fluid layer 46 is promoted. This vertical of fluids 40 and 46
Directional layered structures allow fluids that are emissible or partially emissive to each other.
Obtained by appropriate choice.
In a preferred embodiment, the semen sample is placed in a container or
Before being injected, it is mixed with a reagent to liquefy the ejaculate. Low density second fluid layer 4
6 into the container 10 'is then separated vertically from the first fluid layer 40 and
Is placed on the side. After a sufficient time, the density gradient in the height direction in the container 10 °
The motile sperm contained in the sample layer 40 migrates to the second fluid layer 46 due to the decrease in
You. Thus, the motile sperm is separated from the second fluid layer 46. A predetermined time (for example,
(For example, 5 minutes), a fluid sample is collected from the fluid layer 46 with, for example, a pipette 50 or the like.
The test solution 54 is charged into the test tube 52 containing the test solution. This test solution is a peroxidase conjugate
Includes hypotonic solution with anti-SOD and / or anti-GPxIgG polyclonal antibodies
Preferably, it is Bound sheep anti-SOD and / or anti-GPxIgG
A test paper containing a polyclonal antibody is immersed in this test solution, taken out, and then removed.
Soak in a final solution containing a sidase substrate (eg, hydrogen peroxide and DAB). Motile sperm
The test paper changes to a predetermined color in response to the presence of. Compare this color to the color chart
To determine the fertility of the semen sample. Or from a pipette containing motile sperm
Alternatively, it may be dropped directly on the test paper containing the sperm reagent.
In a modified example, as shown in FIG. 3, the second collection fluid layer 46 is replaced with a porous membrane 60.
You can also. The non-motile sperm can be removed from the sample layer 40 ‘by the permeable porous membrane 60.
Physical resistance occurs or occurs when migrating into or through membrane 60
available. However, in this porous membrane 60, the motile sperm
Does not prevent the migration and separation of motile sperm in the separation layer 10 '.
Be easy. The porous membrane 60 allows motile sperm to pass through without being damaged.
If so, it may be composed of any suitable biocompatible material.
From another viewpoint, the present invention provides a suitable method for determining the fertility of a semen sample.
About the law. A semen sample with “high pregnancy ability” here is in contact with an oocyte.
A sample that can cause pregnancy with a probability of more than about 50% when touched. Pregnancy ability
High semen samples are more likely to cause pregnancy, but have higher fertility
Contact of a semen sample with an oocyte does not guarantee successful pregnancy. Other factors,
For example, oocytes fail to release human sperm chromatin
If the DNA of the mother cell is defective (eg, due to aging), a two-cell embryo mass
Or prematurely killed embryos can cause pregnancy even with highly fertile semen samples
May not be possible.
On the other hand, "poor fertility" semen samples have very little or no contact with oocytes.
Is unlikely to cause pregnancy. Collected from a specific man
Even if the semen sample is found to be of low fertility, the semen sample collected thereafter will still be
It is not a sample with low fertility. Pregnancy of semen sample obtained from any man
Performance changes over time, exposure to diet, sleep, exercise, smoking and other carcinogens
,
It may also be altered by alcohol or drug intake, so certain semen tests
The fertility of the fee is generally correct only for about 48 hours.
Suitable sperm-containing samples (eg, semen) used in the disclosed assays can be human or animal.
(Eg, livestock such as cattle, horses, sheep, and endangered animals)
. For accurate results, test on freshly collected ejaculate
Is preferred.
A suitable test for the purpose of identifying semen samples with high fertility is lipid peracid
This test is an indicator of lipid peroxidation or
It measures the change of the index at a fixed time. Next, the obtained numerical values are
The pregnancy ability of the semen sample is determined by comparing with a reference value of a certain index.
In a stress test, certain indicators of lipid peroxidation
Measure how much changes occur within the test (stress test). Stress test scores
Is the value measured after stressing the lipid peroxidation index and before stressing
Divided by the measured value. The stress or stress that is appropriate to get the test score
Examples of stress substances include radiant energy (heat rays (eg, as shown in Example 2).
), Electromagnetic waves), freeze-thaw, oxidation or chemicals (e.g., as described in Example 3).
Exposure to oxidizing agents such as the ferrous / ascorbate system).
Indicators of lipid peroxidation that change in response to stress include, for example,Exercise rate
: Use of exercise rate as an indicator of lipid peroxidation and heat (eg,
(Incubate for at least 1 hour in the range of about 27 to 45 degrees)
Then, if the score of the test exceeds about 0.8, it indicates that the pregnancy ability is high.
A test score of less than about 0.8 indicates poor performance.Lipid peroxidation degradation products
: Lipid peroxidation degradation products (eg, lipid hydroperoxides)
,
(Malonaldehyde, pentane, ethane, etc.)
Samples that are relatively high (test score <0.5) relative to the values before giving
Is less likely to cause pregnancy, but a test score of about 0.5 or higher can cause pregnancy.
Likely to rub. Lipids can also be analyzed by spectrophotometry. For example
, Lipid hydroperoxides were extracted with hexane and detected at 233 nm.
Can also be. At 532 nm after reacting malonaldehyde with thiobarbituric acid
It can also be measured (Tapel, AL et al., (1959) "Biochemistry,
Material Physics, 80: 326). Pentane and ethane are headspace gas chromatography
It can be measured by chromatography.Membrane phospholipid ratio
: The sample that oxidizes at high rate is phosphatidylethanolamid
(PE) to phosphatidylcholine (PC) ratio is less than about 0.5
The sample oxidizing at (test score> 0.8 when expressed in motility loss) is PE / P
The C ratio is greater than about 0.7. Therefore, sperm with high fertility have a PE / PC ratio of about
Spermatozoa that are greater than 0.7 and less than about 1.5 and have some fertility are P
The E / PC ratio is greater than about 0.5 and less than about 0.7, and
Low sperm have a PE / PC ratio of less than about 0.5. PE and PC are, for example, high performance
It can be measured using thin film chromatography (Alvarez, JG.
Et al., (1987) J Liquid Chromatography 10: 3557).
An example of an indicator of lipid peroxidation that can be directly measured as an index of fertility
Includes the following:Oxidation of DNA
: The sample which oxidizes at a high rate has a high level of oxo-8-deoxyguano.
Shin (Oxo8dG), this oxo-8-deoxyguanosine is an example
For example, high pressure liquid chromatography (HPLC) using electrochemical detection.
(Fraga, CG, et al., (1991) Scientific Methods National
Academy 88: 11003). Oxo of sperm DNA with high fertility8dG / μ
g is less than about 20 fmoles, but the oxo8dG /
μg
Greater than about 40 fmol.Superoxide dismutase (SOD) activity
: Solid phase bonded anti-Cu / Zn-S
Example using OD antibody and enzyme-labeled anti-Cu / Zn-SOD antibody
As shown in FIG. 3, SOD activity can be detected. SOD activity is about 9U / 1
08More semen samples than cells are associated with high pregnancy rates (ie high fertility) after IVF.
It turns out that there are reams, 7U / 108Subcellular activity is associated with low pregnancy rates (ie
(Low pregnancy ability).Surface SOD immunofluorescence test
: Samples that oxidize at a high rate have low surface SOD immunofluorescence
And the total SOD activity is also low. Surface SOD immunofluorescence can be determined, for example, using sheep anti-Cu /
Rabbit anti-sheep of Zn-SODIgG polyclonal antibody and FITC-conjugated
It can be measured by flow cytometry using a secondary antibody (Alvale
Su, J. G. FIG. , Tampa, Florida, 18th Annual American Society of Male Pathology, 1993,
Abstract 170). Those exceeding about 300 FITC units indicate high fertility
However, less than about 300 FITC indicates a low fertility.Ratio of unsaturated fatty acids to saturated fatty acids
: Unsaturated fatty acids are susceptible to oxidation
Saturated fatty acids are less prone to this change. Docosahexaene, an unsaturated fatty acid
The ratio of the acid (22: 6) to the saturated fatty acid palmitic acid (16: 0),
Or to determine the ratio of other unsaturated fatty acids to saturated fatty acids to predict fertility
Is possible. Docosahexaenoic acid versus palmitin in highly oxidizing samples
The acid ratio will be low. Unsaturated / saturated fatty acids are 1N in 1 hour at 40 degrees Celsius
Gas chromatography following alkaline methanolysis using ium methoxide.
(Alvarez, JG and JC Touchstone, grease
Practical guide to quality analysis, papers: I-fatty acids, Norrell Press (New Jersey
-State), 1991). Fertility if the ratio of unsaturated to saturated fatty acids is above about 1.0
If the ratio is about 0.5 or more and less than about 1.0, the fertility
Being on the border, a ratio less than about 0.5 indicates poor fertility.Creatine kinase activity
: The concentration of creatine kinase in semen is the final stage of spermatogenesis
It reflects the extent of cytoplasmic protrusion in the floor. Unusually high levels of
Samples exhibiting atin kinase activity also have a PE / PC ratio (PE / PC ratio <0.5
And malonic aldehyde formation are high).
It turns out to be. This correlation allows detection of creatine kinase activity
Is used as a means for determining the fertility of a semen sample. Claire of human semen
The activity of creatine kinase is determined by the fact that creatine kinase reacts with ADP to produce creatine and A.
TP is produced, followed by hexokinase reacting with ATP and glucose to produce glucose.
To produce glucose-6-phosphate and glucose-6-phosphate dehydrogenase
Resulting from the process of reacting with S-6-phosphate and NADP to produce NADPH
By performing spectrophotometric analysis at 365 nm on the NADPH
NADPH produced under these conditions can produce creatine kinase in human semen.
Activity (Huser, G. (1988) Gametes study 19:67). K
Reatin kinase (CK) takes the form of two isoforms, MM and BB
. Sperm with high fertility has a CK-MM / CK-MM + CK-BB ratio of about 10% or more.
Having.
The value or change in the index of lipid peroxidation with respect to stress can be determined by a technique known to those skilled in the art.
And quantification using a device. Which lipid peroxidation index to choose
Will depend on the accuracy required and the availability of a device to detect the result.
Will.
A preferred embodiment for use as an instrument, as described in detail in Example 4 below,
In addition, the indicator of sperm lipid peroxidation is that of sperm superoxide dismutase (SO
D) Based on activity. In a particularly preferred embodiment, the SOD activity of the sperm is
It is examined using the body. Test for indicators of sperm lipid peroxidation as used individually
The antibody used to generate the antibody can be any material that binds to the antigen.
(Eg, polyclonal, monoclonal or single chain antibodies or antibody fragments, such as
FabTwoFab, etc.).
Immunodetection of indicators of lipid peroxidation by sperm SOD or other antigens has been
It can be achieved using either competitive or non-competitive assays. generally,
In competitive immunoassays, SOD is added to a sperm-containing sample and a limited number of antibody binding sites
Sperm and SOD compete for position, resulting in sperm and antibody and labeled SOD antibody
Form a complex with the body. Keep the concentration of labeled SOD and SOD antibody constant
Therefore, the amount of the complex of the labeled SOD antibody formed is inversely proportional to the amount of sperm in the sample.
And Therefore, the quantitative determination of sperm SOD is based on the complex of the labeled SOD antibody.
Can do it. Competitive assays may be performed homogeneously (ie, antibody binding).
There is no need to separate the combined tracer (eg, labeled SOD) from the free tracer.
Because of the antigen-antibody interaction, directly or indirectly, the labeling of the tracer
This is because a measurable change occurs in the signal obtained from the group. ). Or
, Competitive assays may be performed heterogeneously (ie, determining the amount of ligand in a sample)
It is necessary to separate the bound tracer from the free tracer before doing so).
In contrast to competitive immunoassays, non-competitive assays involve the formation of antibody-sperm conjugates.
Incubate the sperm-containing sample with the immobilized SOD antibody for a time sufficient for the
Including publishing. SOD antibodies may be labeled directly or indirectly.
No. For example, indirect labeling may be performed after a separation step to remove unbound sperm,
The immobilized antibody-sperm complex is contacted with a second labeled antibody specific to the antibody-sperm complex.
It can be done by touching. Second separation step to remove unbound second antibody
Subsequently, the amount of the bound second antibody is detected and measured as an indicator of bound sperm.
Can be. One example of this method is described in Example 5 below.
Representative competitive and non-competitive immunoassays include fluorescence polarization immunoassay (FPIA)
),
Fluorescent immunoassay (FIA), enzyme immunoassay (EIA), turbidimetric inhibition immunoassay
Method (NIA), enzyme-linked immunoassay (ELISA) and radioimmunoassay (
RIA). General techniques for performing these various immunoassays are known to those of skill in the art.
It is known. In addition, a schematic description of most methods is provided in US Pat. No. 5,051,3.
No. 61, which patent is hereby incorporated by reference. antibody
May be labeled in any manner that facilitates detection. Suitable labels are
, Enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase,
Rease, β-galactosidase), enzyme cofactors, radioisotopes (eg,Three
H,14C,125I,32P,131I and35S), fluorescent compounds (eg fluorescein
, Rhodamine, allophycocyanin, phycoerythrin, erythrosin, euro
Pian, luminol, luciferin and coumarin) and colored or uncolored beads or
Means particles (eg silica gel, adjusted pore glass, magnetic material, Sephadex / Sepha
Rose, cellulose, metal (eg, gold) or latex). Immobilize antibodies
Suitable support materials for membranes include membranes (eg, polyethylene, polypropylene, polyarene).
Amide, polyvinylidene difluoride, glass fiber, paper), beads or particles and samples
Test tubes (eg, glass, plastic or metal capillaries, straws or pipettes)
)including.
Based on the method described above for identifying semen samples with high fertility, the present invention
Artificial Insemination Technique (ART) (that is, causing pregnancy by contacting sperm with astigmatism)
Method to increase the success rate when inducing pregnancy by using
You. Examples of ART include in vitro insemination (IVF), gamete intratubal injection (GIFT), child
Includes Miyauchi Insemination (IUI) and Sperm Intracytoplasmic Injection (ICSI). Perform ART
Procedures are known to practitioners. Expect ART to improve over time
Is done.
The preferred process of the invention involves the use of a donor (e.g.
Side) and taking multiple semen samples at different times. For example, one donor
New semen samples may be provided every other day. Next, a fixed aliquot from each sample
(For example, 1 × 106Cell) for testing and the rest for future use in ART
Store (eg, freeze) for future use. Preferably, this process
Means for correlating a given aliquot with the stored sample from which it was taken.
Good. For example, an aliquot taken from a sample on the first day and
The sample itself may be labeled # 1. The next sample obtained from the same donor
And aliquots obtained from this sample may be labeled # 2, and so on.
All aliquots provided by a particular donor were then tested and identified as "high fertility
"With" a semen sample (eg, more than 50% of
Semen that can cause pregnancy). If you have this high fertility
The semen sample determined in this manner may be used for ART here, and the remaining
The sample may be discarded.
Example 2 described below shows 33 couples who had undergone in vitro insemination (IVF) and a gamete oviduct.
Results of a blinded, prospective cohort study of 11 couples who received intramuscular infusion (GIFT)
The semen sample which showed the result, but scored less than about 0.8 in the stress test
The pregnancy was not successful. In contrast, a stress test score of about 0.8 or more
The pregnancy success rate when the semen sample was used for ART was 55%. Therefore, lipid peracid
If the indices of mobilization are lack of mobility, if the stress test score is less than about 0.8
Pregnancy stress is low, and if the stress test score is about 0.8 or more,
The ability is high, indicating that it is suitable for use in ART.
Table 3 shows the scores of the semen stress tests obtained from the same men, and thus the fertility.
Shows how force can change over time.
In addition, from FIG. 4, semen samples with a stress test score of more than about 0.8
Even after frozen storage, it can be seen that it has a high exercise recovery rate. Therefore, in ART
When using semen samples that have been found to have high fertility,
Semen with lower pregnancy ability is more advantageous because it is not damaged by cryopreservation.
Will be
Discrimination of semen samples with lower fertility in contrast to semen samples with higher fertility
As a screening material for detecting, for example, men with possible infertility using
Can be used. In addition, even fertile men sometimes have poor pregnancy
Semen may be produced.
It is possible to avoid using the fee for ART. Even those with lower fertility
By discriminating a liquid sample, a specific male contraceptive user can benefit from that contraceptive method.
It can be determined whether or not there is an effect. For example, vasectomy
Surgery generally requires a certain period of time to be effective. A semen sample with low fertility is determined.
Using a separate assay, therefore, confirms the efficacy of the male contraceptive method as disclosed herein.
Can be recognized.
Semen samples with low fertility should be identified by the lipid peroxidation test as described above.
Can be. Sperm samples with even lower fertility are the sperm in sperm-containing samples (ejaculate).
The determination can be made based on the quantification of (non-motor and motor). Number obtained
Is less than about 20 million sperm / mL, the semen sample has low fertility
Is considered to be
Sperm target quantifiable as an indicator of the number of sperm present in sperm-containing samples
Alternatively, examples of sperm constituents include sperm proteins (eg, sperm flagellar proteins).
Protein, glycolytic enzymes, acid-fast enzymes (eg glutathione peroxidase or
Superoxide dismutase), nuclear protein, acrosome protein, α-Chu
Bryn, lactate dehydrogenase (LDH-X), protamine, acrosin or
Tochondrial proteins) or sperm lipids (eg, cholesterol, phospho-
Lipids, glycolipids, triglycerides, fatty acids, phosphatidylglycerol, semi
Nolipid, and docosahexaenoic acid). Suitable tags for sperm quantification
Targets are selected in various ways depending on sperm cells.
Preferably a sperm reagent (eg, sperm antibody, ligand, lectin or substrate)
It may be used to quantify sperm. Suitable sperm reagents are labeled (eg, yeast)
Element, tracer (eg, radioactive), dye or labeled with colored particles) or marker
Unidentified anti-sperm antibodies (eg, cello, New York, NY)
Key Station Arnel Products or Temeki, CA
Anti-human sperm polyclonal antibody manufactured by Chemicon International, Inc.
Or labeling of sperm components (eg, sperm proteins or sperm lipids)
Antibodies that are labeled or unlabeled. More suitable sperm reagents
, Labeled (eg, labeled with a dye or tracer), or labeled
Unreagented reagents, such as sperm proteins (eg, protein
0.3% Tetrabromo, manufactured by Miles Scientific, N.C.
Phenol) or rhodamine 123 which accumulates in the mitochondria of sperm.
Alternatively, a labeled reagent (eg, rhodamine) can interact with sperm lipids.
You may let it.
The preferred method for counting sperm is a detectable, specifically binding sperm antigen
Antibodies (eg, anti-human sperm polyclonal antibodies and sperm total)
Using specific antibodies for epitopes such as hair, nuclear protein, glycolytic enzyme, acrosome, etc.)
Is what it is. One method of quantifying sperm is to transfer a sperm sample to a dressing containing anti-sperm antibodies.
After incubation with the colored particles for an appropriate time, the sperm antigen is
Reacting with the colored particles; i) filtering the complex of sperm / colored particles / antibody with a filter
Unbound colored particles / antibodies and sperm plasma proteins are filtered
Ii) filtering the sample so that it passes through
Visualizing the intensity of the
For example, when using colored particles, the complex of sperm / colored particles / antibody is
Compare the color of rutha with a color chart showing different colors for different sperm amounts
Can be quantified. If the amount of sperm is less than about 20 million sperm / mL,
Indicates low fertility. Alternatively, the filter membrane is fastened to the filter membrane.
When the number of sperm / detectable particle / antibody complexes obtained is sufficient,
That the sample is suitable for inducing pregnancy (2)
Greater than 100,000 sperm / mL), and the sperm retained on this filter membrane / detectable
"-" (Ie no fertility) when there is an insufficient amount of functional particle / antibody complex (
(Less than 20 million sperm / mL).
It may also react with sperm plasma components in sperm-containing samples (eg, ejaculate).
To utilize antibodies or reagents, sperm can be separated first. sperm
The plasma-free sperm is then contacted with colored particles coated with an anti-sperm antibody.
Is also good. After allowing enough time for the antibody and antigen to react, from this mixture:
The colored particles coated with the unbound antibody are removed, and the sperm / colored particle / antibody complex is removed.
Coalescence can be detected and quantified. For example, the amount of sperm in a sample
Quantification with a chart or the "+" or "-" filter described above. There
Shows the agglutination reaction in one drop of sample after adding anti-sperm antibody together with bound latex particles
It is also possible to quantify sperm by detecting the state of
Alternatively, quantification of only motile sperm in a semen sample can be used to determine low pregnancy ability.
Can be. The motile sperm in the sperm-containing sample can be analyzed using, for example, the above-described apparatus and method.
It is possible to separate. The preferred method of quantifying sperm is to use sperm antigen-specific
Using a detectably labeled antibody that binds to. Motile sperm
Removably labeled, sperm specific antibodies, such as anti-glutathione peroxy
It can be quantified by using a protease (GPx) antibody. As with sperm SOD, sperm G
Immunological detection of Px or other sperm antigens is available in a number of competitive or non-competitive assays
It can be performed using any of the methods. In addition, certain antibodies in sperm (
Labeling can be performed (eg, enzymatically) and, if necessary,
Immobilization can be performed using known methods or as described above for SOD antibodies.
Can be.
From a further aspect, the present invention provides a number of simple reagents and devices packaged in a box.
A sperm diagnostic instrument or system comprising: The components of this instrument include:
One or more devices, or components shown in FIGS. 1-3,
And a reagent for determining fertility. Suitable equipment includes
A reagent for liquefying the liquid (for example, chymotrypsin or pronase) is included. High pregnancy
For discriminating a semen sample with pregnancy ability (ie, a male insemination device),
A suitable instrument is to measure lipid peroxidation indicators or to elapse over time under specified conditions.
It may be based on the measurement of the index change observed later. Or even more
As described in the examples below, the instrument may be based on determining the number of sperm in a semen sample.
Good, but in this case, higher than about 40 million motile sperm / mL, high pregnancy ability, about 2
20 million sperm / mL Zhu Man has low pregnancy ability and about 20 million
, And less than about 40 million, indicates a borderline pregnancy ability.
Identify semen samples with low fertility (eg, to confirm the effectiveness of male contraception)
D) The preferred instrument is based on the determination of sperm / mL in the sample.
In this case, less than about 50,000 sperm / mL may indicate low pregnancy ability or successful contraception.
And Reagents and equipment used to determine sperm fertility
Take the separated sperm from the collection container and transfer it to a container containing means for determining the fertility of the sample
Dispensing equipment (eg, a capillary or pipette) is included.
Quantifies the degree of lipid peroxidation or changes in lipid peroxidation of sperm due to stress
And / or by quantifying the sperm count.
In a preferred embodiment, the means for detecting sperm lipid peroxidation is
Based on oxidic dismutase (SOD) activity and / or
The means of delivery is based on sperm protein concentration. In a particularly preferred embodiment,
A means for detecting SOD activity of offspring uses a colorimetrically labeled SOD antibody.
The means for detecting sperm proteins use gold particles. This instrument also
,
Includes a color chart that allows comparison of SOD and / or protein concentration with known values.
Is preferred. In addition, this device is equivalent to a sperm concentration of about 50,000 sperm / mL or more.
Colors can be optimized to develop based on protein level.
Suitable instruments for determining the fertility of semen samples at home include i) collection containers (selection).
Alternatively, it may be shaped to supplement ejaculate and / or promote liquefaction of semen
A solution (e.g., an enzyme)) and ii) a covalent bond to the colored particles in a hypotonic solution.
A second container containing the combined anti-sperm antibodies; iii) sperm / colored particles or sperm /
The colored particle / antibody complex is supplemented and the unbound colored particle or colored particle / antibody is
A membrane or filter to be passed, and iv) solving the obtained result based on the color of the filter.
And charts to read. Approximately 20 million sperm /
less than 50,000 sperm / mL if using male contraception
This indicates that their fertility is low.
The present invention is further described in the following examples, which are intended only in more detail.
It has been done and should not be considered limiting. Cited throughout this application
All referenced properties (including literature, issued patents, published patent applications and co-pending patent applications)
(M) is explicitly incorporated herein by reference.
Example 1: Instrument for separating motile sperm from semen sampleInstrument components
1) (1) 30 mg / mL dextran and 5 mg / mL Kimoto in an isotonic solution
A container for collecting and liquefying ejaculate containing lipsin (test tube # 1)
2) (1) Three types of low (1 mL), medium (1.5 mL) and high (2 mL)
Transparent container indicating volume (test tube # 2). These three quantities are indicated by black and red marks.
(The uppermost and lowermost marks have the same color).
3) 0.5mL container of isotonic solution (test tube # 3)
3) (1) 0.2 mg / mL bovine serum albumin (BSA) in isotonic solution
0.5 mL container (test tube # 4)
4) (1) Empty container
5) (at least three) disposable sterile pipettes and capillaries
6) (1) Capillary pipette for collecting and transferring motile sperm
7) Means (eg, protein reagents) for quantifying (at least one) sperm
Test paper included
8) Instructions for use
9) (1) 37 ° C heating block (optional)procedure
The ejaculate was mixed with 5 mg / mL chymotrypsin and 30 mg / mL in isotonic solution.
The sample was collected in a collection test tube containing kisstran (test tube # 1). Bring this mixture to room temperature
For about 5 minutes.
A 1 mL aliquot of the semen / dextran / chymotrypsin mixture was
The mixture is graduated to the height of the first mark using a light source.
Added to container (test tube # 2). The pipette was discarded.
Add an appropriate amount of isotonic solution (vessel # 3) to a mixture of semen / dextran / chymotrypsin
On top, pour using a second dropper to the upper mark of each transparent container, lower layer
Consists of a mixture of semen / dextran / chymotrypsin, the upper layer isotonic
A two-layer density gradient was formed. The dropper was discarded.
Heat the mixture for at least 5 minutes at room temperature or, optionally, 37 degrees Celsius.
Left in the block.
After inserting a sterile capillary pipette up to the middle mark of the container, for example, dandelion
Drop on test paper containing means for quantifying sperm such as quality reagents and lipid reagents.
Was.
Example 2: Temperature stress predicting fertility of semen sample
In vitro fertilization (IVF) (n = 33) or gamete intratubal injection (GIFT) (n = 1
Human sperm (HS) samples were obtained from the male side of 44 couples performing 1). Man
All sexes had normal semen according to conventional analysis (conventionally, normal semen samples
Means more than 20 million cells per mL, more than 60% motility, (from 1
Progression rate of more than 2 (on a scale of up to 4), normal form of more than 60%, 1.5 mL
5.0 mL ejaculation, no significant sperm aggregation, normal number of white blood cells
, And on condition that there is no excessive consistency). Semen samples are standard
HTF medium containing 10% plasmanate after separation using a simple Percoll method
And resuspended. Artificial insemination techniques (ART, eg
100 μL aliquots of the same semen suspension were used for IVF and GIFT).
Incubated for 4 hours at 40 degrees Celsius (stress test). Stress test
The score was expressed as a ratio of the final exercise rate to the initial exercise rate. Stepwise multiple regression
The analysis was performed by precipitation. The independent variables are female age, H before and after stress test.
S motility, stress test scores, and embryos injected at each IVF cycle
Was a number. The dependent variable was the result of pregnancy and insemination.
In a blinded cohort study, 11 (25%) of 44 ART cycles were pregnant.
The result was that. Of the 44 semen samples used in the study, 24 (55%)
The stress test scores <0.8 and 20 (45%)> 0.8. All
Adjusted for variables, stress tests correlated significantly with pregnancy outcome
(P = 0.0001). In sharp contrast, pre-stress test exercise rates are
There was no correlation with the fruit. All pregnancies were stress test scores> 0.8
It was happening with a liquid sample. Therefore, a cutoff value of> 0.8 is required to predict pregnancy outcome
Selected. The sensitivity of the stress test was 100% and the specificity was 73%
. Defined as incapacitated when stress test score <0.8
The negative predictive value is 100%, and when the stress test score> 0.8,
The positive predictive value, defined as the occurrence of, was 55%. Stress test scores
Is
Fertility predicts pregnancy outcome with a high probability.
The prediction was better with the kinetic rate (P = 0.007).
Example 3: Oxidative stress to predict the fertility of semen samples
Tests similar to those described in Example 4 were performed, with the exception that PB
10 μL of 0.125 mM ferrous iron in S (phosphate saline) and P
0.6 mM ascorbate in BS was added to 30 μL of sperm suspension.
The mixture was brought to a total of 50 μL, and the mixture was shaken lightly at 37 ° C. for 0.5 hour,
The stress was added by the incubation. Resulting
Values are correlated with stress tests performed at 40 degrees Celsius for 4 hours.
ing.
Example 4: Sperm superperoxide dismutase (SOD) activity correlates with pregnancy rate
In a relationship
Human sperm release oxygen radicals and spontaneously peroxidize lipids, resulting in sperm blood
Causes major damage to the plasma and acrosome membrane and loss of fertility. Cu / Zn-super
-Oxide dismutase (SOD) is an oxygen radical mediated toxicity and endogenous
Protects sperm from lipid peroxidation and. Surface SOD immunoreactivity is intermediate to human sperm
Appears in one-sided and equatorial areas (for reference, Alvarez and the Story, (
1992) J. Male Pathology 13 (3): The contents of 232-241 are incorporated here.
).
Whether SOD activity is related to sperm fertility and pregnancy rate is determined by in vitro insemination (
Study using semen samples collected from 27 males of a couple performing IVF)
Was done. The female age ranged from 24 to 49 years. Of the oocyte
The number was 3 to 20, and the number of embryos injected was 1 to 7. Semen sample is standard
HTF containing 10% plasmanate by using a conventional mini-Percoll method
Resuspended in medium. A constant aliquot of sperm suspension is used for IVF and another constant
An aliquot was used to measure the SOD activity of that particular sample.
The range of SOD activity of the semen sample tested is 1.5 to 12 U / 108Cell (P <0
. 001). SOD activity is 3.3U / 108The six spirits that were below the cell
All liquid samples failed to fertilize (P <0.001). 4.7 to 7.1 U / 108
Among the cells, 15 out of 16 oocytes were fertilized, but none of them subsequently became pregnant.
Did not tie.
These results indicate that the SOD activity is high (that is, about 9 units / 108Greater than cell
Semen samples have high fertility and low SOD activity (ie, about 7 units / 1).
08The sample (smaller than the cell) has a low fertility. SOD activity is about 7
Unit / 108About 9 units / 10 cells or more8Samples that fall below the cell are
Have pregnancy ability.
Example 5: Assay for discriminating semen samples with high fertility
Ejaculate into collection tube containing 5 mg / mL chymotrypsin (test tube # 1)
Was collected. After about 3 to 5 minutes (during which time the semen liquefies), the liquefied semen
An aliquot of the liquid (about 50 μL) was added to another tube (tube # 2).
In this test tube # 2, sheep conjugated to horseradish peroxidase
Polyclonal antibody of anti-human superoxide dismutase (SOD) IgG (
92121 Oberlin Drive, San Diego, California, 58
89, binding site) and horseradish peroxider
Sheep anti-human glutathione peroxidase (GPx) IgG conjugated with
Polyclonal antibody (Oba, San Diego, CA 92121)
Dissolves in hypotonic solution.
It was put in a state of being solved. After 5 minutes, conjugated sheep anti-human SOD and anti-human
Polyclonal antibodies to GPxIgG (92121 Sande, CA
I
Ego, oberlin drive, 5889, binding site)
The immersion test paper was inserted into test tube # 2. After 5 minutes, remove the test strip from the test tube
And rinsed with tap water.
This test strip is then used as a peroxidase substrate, hydrogen peroxide (HTwoOTwo) And diami
Novensidine (DAB) (63178, Sigma, St. Louis, MO)
(Mikaru Co., Ltd.) in another test tube (test tube # 3). SOD / GPx colors
By comparing this ratio with the chart attached to the device, the fertility can be determined. For GPx
The paper color indicates about 20 million sperm / mL or more. SOD paper color is GPx paper color
A higher value indicates that the semen is fertile. Color of SOD paper is for GPx
A color equal to or lower than the paper color indicates a low fertility.
Example 6: Test to observe the effect of male contraception (color chart method)
Used an appropriate amount of male contraceptives (eg, GnRH antagonists) to suppress spermatogenesis,
Shows a 5 mg / mL chymotrypsin solution in an isotonic solution from a male who underwent vasectomy.
The sample was collected in a collection test tube (test tube # 1) containing the sample. 3 to 5 minutes (during this time the semen
Is usually liquefied), and about 500 μL of the liquefied semen is transferred to another test tube (test tube # 2).
) Was added to tube # 2 in a hypotonic or isotonic solution (generally pink).
Covalently attached to gold particles (having a color) or colored latex particles (blue or yellow)
Anti-human sperm polyclonal antibody (Cherokee, New York, NY)
Station, manufactured by Arnel Products, Inc., Temecula, CA
Mikon International). Let this mixture stand for about 10 minutes.
And the sperm antigen appearing after the hypotonic treatment was reacted with the antibody. ink
After the incubation, the contents of test tube # 2 were transferred to a filter membrane, and sperm / colored particles / anti-
The body complex is retained on the filter and unbound colored particles / antibodies pass through the filter.
Let it go to the reservoir. After this, change the color of the filter to the chart included in this instrument.
Determine the number of spermatozoa present in the sample by comparing with the various color samples shown in
The effect of the male contraceptive method was determined. With this method, less semen
When
50,000 sperm / mL density can also be detected. This sensitivity is
It is comparable to the sensitivity obtained with commonly used ordinary light microscopes.
Example 7: Test for observing the effect of male contraception (plus (+) or minus (-
) Law)
Collection test tube containing 5 mg / mL chymotrypsin in isotonic solution (test tube # 1)
The ejaculate was collected. After about 3 to 5 minutes (during this time the semen usually liquefies), a drop
(50 μL) (in the case of a male insemination device) or 0.5 mL (for a male contraceptive device)
The liquefied semen of (Case) was added to another test tube containing the hypotonic solution (test tube # 2). 5 minutes
After incubating for 1 drop (about 50 μL) (for a male insemination device) or
The entire contents (for male contraceptive devices) were transferred to a membrane with two windows. This window
The sample was applied when the sample was dropped using # 1, but the soluble sperm antigen was
Reacts with anti-human antibodies conjugated to gold or colored latex particles contained in the reservoir in the membrane
On the other hand, window # 2 had a horizontally colored line. This sperm antigen / antibody /
Below window # 2 (captured antibody) as the particle complex moves through the membrane
The second anti-human sperm antibody bound in a vertical position to the membrane of
Reacts with the complex of the sperm, coloring when the sperm density in the semen exceeds 50,000 sperm / mL
A vertical line was generated, at which time a plus (+) sign appeared. Sperm density in semen is 5
In the case of less than 10,000 sperm / mL, a minus (-) sign appeared.
Example 8: Male insemination ability and contraceptive screening device (filter method)Instrument components
1) (1) Scaled test tube for semen collection
2) (1) Squeeze bottle containing chymotrypsin solution
3) (1) Test tube containing isotonic or hypotonic solution
4) (2) Dropper
5) (1) Filter attached to liquid reservoir
6) (1) A solution containing a colored latex or gold particle solution coated with an anti-sperm antibody
Queens bottle
7) Instructions for useprocedure
Using a squeeze bottle, chymotrypsin solution (without dextran)
The same amount of semen was added to the collection test tube. The mixture is left at room temperature for about 5 minutes,
Was liquefied.
The semen / chymotrypsin mixture in this semen collection test tube is dropped using a dropper.
, One drop (in case of male insemination device) or 0.5 mL (in case of male contraceptive device)
, Isotonic solutions (eg, phosphate buffered saline or Earle's medium) or hypotonic solutions (eg, distillation)
Water) was added to another test tube (test tube # 2).
One drop (50 μL) of test tube # 2 (for a male insemination device) or 0.5 mL (
For male contraceptive devices, a filter (eg,
Blocked nitrocellulose with a pore size of 5 μm, pore size of 2.7 μm
m microfiber glass fibers). The size is about 10-20 nm
The liquid plasma protein passes through the filter and is approximately 1000 times as large (50 μm in size).
) Sperm cells were retained.
Colored particles coated with anti-sperm antibody (for example, gold whose original color is pink)
Particles or colored latex particles) to the filter,
The color exhibited was probably a sperm sample capable of insemination. This filter
The antibody used to form the film on the latex particles was converted to sperm cells
Less specific (exhibits some degree of cross-reactivity to semen plasma proteins)
Just do it).
Example 9: Screening device for male fertility and contraception (antibody and sperm antigen
Filter method with incubation)Instrument components
1) (1) Scaled test tube for semen collection
2) (1) Squeeze bottle containing chymotrypsin solution
3) (1) Test tube containing isotonic or hypotonic solution
4) (2) Dropper
5) (1) Filter attached to liquid reservoir
6) (1) Including a solution of colored latex or gold particles coated with an anti-sperm antibody
Da squeeze bottle
7) Instructions for useprocedure
Clean the chymotrypsin solution (without dextran) using a squeeze bottle.
The same amount as the liquid was added to a semen collection test tube. The mixture is left at room temperature for about 5 minutes to
The liquid was liquefied.
Using a dropper, this semen / chymotrypsin mixture in a semen collection tube is
One drop (approx. 50 μL) (for a male insemination device) or 0.5 mL (for male contraception)
For instruments), take isotonic solution (eg phosphate buffered saline or Earle's medium) or low
Colored particles coated with an anti-sperm antibody (e.g.
Another test tube containing test-colored gold particles or colored latex particles) (test tube # 2)
Added.
One drop (50 μL) of the contents of test tube # 2 (for a male insemination device) or
Weigh 0.5 mL (for male contraceptive device) into the filter attached to the liquid reservoir.
Ruta (for example, nitrocellulose with a pore size of 5 μm, or pore size
(Microfiber glass fibers that are 2.7 μm). About 10-20 in size
nm plasma protein / mixed particle antibody / mixture of semen passed through the filter
, Sperm cells approximately 1000 times in size (size 50 μm) / colored particle antibody / mixed
The compound was fastened. By using this filter method, the antibody used can be
Could be decided without being specified too much (ie,
It only needs to exhibit some degree of cross-reactivity).
Example 10: Male insemination ability & contraceptive screening device (agglutination method)Instrument components
1) (1) Scaled test tube for semen collection
2) (1) Squeeze bottle containing chymotrypsin solution
3) (1) Isotonic or hypotonic solutions, and particles coated with a specific antibody on sperm (not yet
Test tubes containing colored or colored)
4) (2) Dropper
5) (1) Slides with a color contrasting to the particles coated with the anti-sperm antibody
6) Instructions for useprocedure
Clean the chymotrypsin solution (without dextran) using a squeeze bottle.
The same amount as the solution was added to a semen collection test tube (test tube # 1). The mixture is left at room temperature for about 5
The semen was liquefied by standing for minutes.
Using a dropper, apply one drop (50 μL) of this semen / chymotrypsin mixture (male
Take 0.5mL (for male contraceptive device) or isotonic
Liquids (eg, phosphate buffered saline or Earle's medium) or hypotonic solutions (eg, distilled water),
And another test involving sperm particles (uncolored or colored) coated with a specific antibody.
Added to test tube (test tube # 2).
Take a drop of test tube # 2, latex particles coated with specific antibodies on sperm
Agglutination indicating the presence of fertile sperm on a slide with a contrasting color.
Added recognition on slides. If it is a male insemination ability test, there must be no aggregation
About 20 million sperm / mL, and about 2,000 if there is aggregation on the borderline.
High levels of aggregation greater than and less than 40 million sperm / mL
Indicates that it exceeds about 40 million sperm / mL. Using male contraception
If no agglutination was seen during the test, it indicated less than about 50,000 sperm / mL.
Example 11: Screening device for male fertility and contraception (non-immune reaction / filter method)
)Instrument components
1) (1) Scaled test tube for semen collection
2) (1) Squeeze bottle containing chymotrypsin solution
3) (1) Test tube containing isotonic or hypotonic solution
4) (2) Dropper
5) (1) Filter attached to liquid reservoir
6) (1) Pink gold particles (react with protein) or red rhodamine
(Reacts with lipids) and contains a coloring reagent that reacts nonspecifically with sperm cell components.
Ease bottle
7) Instructions for useprocedure
Clean the chymotrypsin solution (without dextran) using a squeeze bottle.
The same amount as the solution was added to a semen collection test tube (test tube # 1). The mixture is left at room temperature for about 5
The semen was liquefied by standing for minutes.
Using a dropper, apply one drop (50 μL) of this liquefied semen (for a male insemination
) Or 0.5 mL (in case of male contraceptive device), and add gold in hypotonic or isotonic solution
Added to another test tube (tube # 2) containing the particles (natural color pink). Test tube
One drop (in the case of a male insemination device) or 0.5 mL (for male
Use a filter (nitrocellulose with a pore size of 5 μm)
Was added on microfiber glass fibers with a pore size of 2.7 μm. Money
Particles are originally pink in color and are not biomolecules (eg, proteins or lipids)
Binds to both sperm and semen plasma proteins
be able to. By using this filter method, unbound gold particles and semen
Gold particles bound to the plasma protein pass through the filter and are received by the reservoir,
Then, the sperm cells bound to the gold particles are pinned to the filter and become pink. Male teacher
Over 20 million sperm / mL if it is pink when used in the insemination method
It indicates that spermatozoa is present, and when used for male contraception, exceeds about 50,000 sperm / mL.
This indicates that spermatozoa are present.
Example 12: Assay for discriminating semen samples with high fertility
The ejaculate was collected in a test tube containing 5 mg / mL chymotrypsin in an isotonic solution (
Collected in test tube # 1). After about 3 to 5 minutes (during this time the semen usually liquefies)
Take one drop (approximately 50 μL) of the liquefied semen into a test tube (test tube # 2).
The test tube # 2 contains yellow colored particles in a hypotonic or isotonic solution.
Anti-glutathione peroxidase (GPx) antibody conjugated to
Anti-superoxide dismutase (SOD) antibody conjugated to the particles
It is. The mixture is incubated for up to about 10 minutes to expose after hypotonic treatment.
The sperm antigen was reacted with the antibody. Following incubation, in test tube # 2
The contents are transferred to a filter membrane and the sperm / colored particle / antibody complex is retained on the filter.
Unbound colored particles / antibodies were passed through the filter and received in a reservoir. Fi
If the filter is green, the SOD / GPx ratio is 1: 1 and the sample is on the border.
If the filter is bluish, the SOD level is high and the sample is high.
If the filter has good fertility and the filter is yellowish, the SOD level is low and
The fee indicated that the fertility was low.
Example 13: Screening device for male fertility and contraceptionInstrument components
1) (1) Scaled test tube for semen collection
2) (1) Liquefaction enzyme (eg, chymotrypsin or pronase at 5 mg / ml)
Bottle containing squeeze (squeeze bottle # 1)
3) (1) Squeeze bottle containing 150 μL of isotonic or hypotonic solution
Can be removed) (squeeze bottle # 2)
4) (1) Rhodamine-123 at 0.5 mg / mL in distilled water (U, Oregon)
Gene, Molecular Probes) squeeze bottle containing solution
Queens bottle # 3)
5) (1) Dropper
6) (1) Porous filter attached to liquid reservoir
7) Instructions for useprocedure
Using the provided squeeze bottle (squeeze bottle # 1),
Pronase solution (per milliliter of semen) (St. Louis, Mo., USA)
Take two drops (5 mg / mL) of a solution of Sigma Chemical Co., Ltd.
Added to the ejaculate. The mixture was left at room temperature for about 5 minutes to liquefy the semen.
Using a dropper, drop one (in the case of a device for male insemination) or four drops (a device for male contraception)
Liquefied semen was taken, and the upper part was removed.
Another solution containing 250 μL (for male contraceptive device) or hypotonic solution
Added to the squeeze bottle (squeeze bottle # 2). Next, squeeze bottle #
Rhodamine-123 in 3 (Molecular Probes, Eugene, Oreg.)
One drop (for a male insemination device) or four drops (for a male contraceptive device)
), And the top was replaced in addition to squeeze bottle # 2. Next, lightly light the contents with your finger
Ku
Tap and mix.
Take 2 drops from the entire contents of squeeze bottle # 2 (for male insemination equipment)
To a porous filter (pore size is about 2.7μm) attached to the liquid reservoir
In addition, the colors were visualized. If not colored, the concentration is less than about 20 million sperm / mL,
Over 20 million sperm / mL and 40 million sperm / m if faintly colored
Concentrations below L and above 40 million sperm / mL if colored
It was shown.
One skilled in the art will recognize many equivalents to the specific embodiments of the invention described herein.
And it will be possible to confirm using routine experimentation. Such as
Valuations are intended to be within the scope of the following claims.
【手続補正書】
【提出日】1998年6月5日
【補正内容】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
[Procedure amendment] [Submission date] June 5, 1998 [Content of amendment] [Fig. 1] FIG. 2 FIG. 3 FIG. 4
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
G01N 33/573 G01N 33/68
33/68 33/92 Z
33/92 A61D 7/02 Z
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,SZ,U
G),AL,AM,AT,AU,BB,BG,BR,B
Y,CA,CH,CN,CZ,DE,DK,EE,ES
,FI,GB,GE,HU,IS,JP,KE,KG,
KP,KR,KZ,LK,LR,LT,LU,LV,M
D,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL
,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,
TJ,TM,TT,UA,UG,UZ,VN──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI G01N 33/573 G01N 33/68 33/68 33/92 Z 33/92 A61D 7/02 Z (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, LV, MD, MG, MK , MN MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA, UG, UZ, VN