JPH11513115A

JPH11513115A - Ｍｈｃクラスｉの発現の評価方法及びクラスｉの発現を調節することが可能なタンパク質

Info

Publication number: JPH11513115A
Application number: JP9509576A
Authority: JP
Inventors: コーン，レオナード; シンガー，ディナー・エス; サジ，モトヤス; ジュリアーニ，セシディオ; ション，ミンホー; スズキ，コーイチ; オオモリ，マサユキ
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-08-21
Filing date: 1996-08-21
Publication date: 1999-11-09
Also published as: CA2229938A1; AU6860096A; AU726441B2; WO1997007404A1; EP0880701A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、哺乳動物における自己免疫疾患を治療するための方法並びに移植レシピエントにおける移植拒絶を予防または治療するための方法に関する。治療方法には、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制することができる医薬の使用が含まれる。特には、自己免疫疾患の治療並びに移植レシピエントにおける拒絶の予防および治療における、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制する医薬メチマゾールの使用が開示される。さらに、ＭＨＣクラスＩ分子を抑制することができる医薬の評価および開発のためのインビボおよびインビトロアッセイが提供される。さらに、本発明は、ＭＨＣクラスＩ発現を調節することができるタンパク質の核酸およびアミノ酸の配列に関する。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ＭＨＣクラスＩの発現の評価方法及びクラスＩの発現を調節することが可能なタンパク質これは、1995年６月７日に出願されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.08／480,525号の一部継続出願であり、この出願は1993年６月７日に出願されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.08／073,830 号の継続であって、参照することによりその全体がここに組込まれる。発明の分野本発明の分野は哺乳類動物における自己免疫疾患及び移植拒絶の治療である。より具体的には、本発明は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の発現を抑制することが可能な薬物を用いるこれらの疾患の治療及び予防方法、並びにＭＨＣクラスＩの発現を抑制することが可能な薬物を開発又は評価する方法に関する。また、本発明は、ＭＨＣクラスＩの発現を調節することが可能な遺伝子及びそれに対応するタンパク質にも関する。発明の背景免疫応答の主な機能は、自己を非自己抗原と区別し、後者を排除することである。免疫応答には複雑な細胞−細胞相互作用が関与し、胸腺由来の（Ｔ）リンパ球、骨髄由来の（Ｂ）リンパ球及びマクロファージの３種類の主要細胞型に依存する。免疫応答には、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によってコードされる分子が介在する。ＭＨＣ分子の２種類の主要なクラス、クラスＩ及びクラスIIは、各々一組の細胞表面糖タンパク質を含む（"Ｂasic and Ｃlinical Ｉmmunology"(1 991)Ｓtites,Ｄ.Ｐ.and Ｔerr,Ａ.Ｉ.(eds),Ａppelton and Ｌange,Ｎorwalk,Ｃ onnecticut/Ｓan Ｍateo,Ｃalifornia）。ＭＨＣクラスＩ分子は、異なる細胞型では水準が異なるものの、事実上全ての体性細胞型で見出される。対照的に、ＭＨＣクラスII分子は、通常、リンパ球、マクロファージ及び樹枝状細胞のような僅かな細胞型にのみ発現する。抗原は、クラスＩもしくはクラスII細胞表面分子に関して免疫系で処理される。ＣＤ4⁺ヘルパーＴリンパ球はクラスIIＭＨＣ分子との関わりで抗原を認識し、ＣＤ8⁺ 細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）はクラスＩ遺伝子産生物との関わりで抗原を認識する。現在、ＭＨＣクラスＩ分子は主として細胞性免疫応答の標的として機能し、これに対してクラスII分子は液性及び細胞性免疫応答の両者を調節するものと信じられている（Ｋlein,Ｊ.and Ｇutze,Ｅ.,(1977)"Ｍajor Ｈistocompatibility Ｃomplex"Ｓpringer Ｖerlarg,Ｎew Ｙork；Ｒoitt,Ｉ.Ｍ.(1984)Ｔriangle,( Ｅngl Ｅd)23:67-76；Ｕnanue,Ｅ.Ｒ.(1984)Ａnn.Ｒev.Ｉmmunology,2:295-428 ）。ＭＨＣクラスＩ及びクラスII分子は、免疫応答の媒介物質又は阻害物質としてのそれらの役割のために、自己免疫疾患の研究に関わる多くの研究の焦点となっている。ＭＨＣ−クラスII抗原は自己免疫疾患の原因の研究の主な焦点であり、これに対して、ＭＨＣ−クラスＩは歴史的に移植拒絶における研究の焦点である。グレーブス病は比較的普通の甲状腺の自己免疫障害である。グレーブス病においては、甲状腺抗原、特には甲状腺刺激ホルモン受容体に対する自己抗体が甲状腺の機能を変化させ、甲状腺機能亢進症を生じる（"Ｂasic and Ｃlinical Ｉmm unology"(1991)Ｓtites,Ｄ.Ｐ.and Ｔerr,Ａ.Ｉ.(eds),Ａppelton and Ｌange, Ｎorwalk,Ｃonnecticut/Ｓan Ｍateo,Ｃalifornia:pages 469-470）。グレーブス病患者からの甲状腺細胞はＭＨＣ−クラスIIの異常な発現及びＭＨＣクラスＩの発現の増加を示す。（Ｋohn et al.,(1992)Ｉn"Ｉnternational Ｒeviews of Ｉmmunology,"Ｖol.912:135-165）。歴史的に、チオナミド療法がグレーブス病の治療に用いられている。最も一般的に用いられるチオナミドは、メチマゾール（ＭＭＩ）、カルビマゾール（ＣＢＺ）及びプロピルチオウラシル（ＰＴＵ）である。これらのチオナミドはチオ尿素基を有し、最も効力が高いのはチオウレイレンである（Ｗ.Ｌ.Ｇreen(1991)Ｉ n Ｗerner and Ｉngbar's" Ｔhe Ｔhyroid":ＡＦundamental Ｃlinical Ｔext"6 ht edition,Ｌ.Ｂraberman and Ｒ.Ｕtiger(eds),Ｊ.Ｂ.Ｌippincott Ｃo.page 324）。チオナミドは、甲状腺刺激自己抗体が刺激した甲状腺によって生じる、甲状腺ペルオキシダーゼが触媒する甲状腺ホルモンの形成を阻害することにより、甲状腺機能正常状態を回復する（Ｓolomon,Ｄ.Ｈ.(1986)Ｉn"Ｔreatment of Ｇraves's Ｈyperthyroidism".Ｉngbar,Ｓ.Ｈ.,Ｂraverman,Ｌ.Ｅ.(eds)Ｔhe Ｔ hyroid :ＪＢＬippincott Ｃo.,Ｐhiladelphia,Ｐennsylvania,p.987-1014;Ｃoo per,Ｄ.Ｓ.(1984)Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed., 311:1353-1362；Ｃooper,Ｄ.Ｓ.(1991)Ｔreatment Ｏf Ｔhyrotoxicosis.Ｉn Ｗ erner Ａnd Ｉngbar's Ｔhe Ｔhyroid:ＡＦundamental and Ｃlinical Ｔext," 6th edition.Ｌ.Ｂraverman and Ｒ.Ｕtiger(eds),Ｊ.Ｂ.Ｌippincott Ｃo.page s 887-916）。ＭＭＩ及びＰＴＵが腎臓内のペルオキシダーゼ依存性酵素を阻害することが可能であり、かつＭＭＩがラットの胃粘膜中の胃ペルオキシダーゼを阻害することができることが報告されている（Ｚelman,Ｓ.Ｊ.et al.,(1984)Ｊ. Ｌab.Ｃlin.Ｍed. 104:185-192；Ｂandyopadhyay,Ｕ.et al.,(1992)Ｂiochem Ｊ. 284:305-312）。また、ＰＴＵは、アルコール依存症に関連する肝毒性を阻害することも報告されている(Ｏrrego,Ｈ.et al.,(1987)Ｎ.Ｅngl.Ｊ.of Ｍed.317:1 421-1427)。チオナミドはグレーブス病の治療に長期間用いられており、患者の大部分にはこの治療に関連する合併症は見られない（Ｃooper,Ｄ.Ｓ.(1991)Ｔre atment Ｏf Ｔhyrotoxicosis.Ｉn Ｗerner Ａnd Ｉngbar's Ｔhe Ｔhyroid:ＡＦundamental and Ｃlinical Ｔext,"6th edition.Ｌ.Ｂtaverman and Ｒ.Ｕtig er(eds),Ｊ.Ｂ.Ｌippincott Ｃo.pages 887-916）。発熱、発疹、蕁麻疹のような症状を含むアレルギー性反応が1−5％の患者で生じる。チオナミド療法に対する毒性反応は希であり、患者の0.2ないし0.5％にのみ生じる（Ｃooper,Ｄ.Ｓ.(1 991)Ｔreatment Ｏf Ｔhyrotoxicosis.Ｉn Ｗerner Ａnd Ｉngbar's Ｔhe Ｔhyr oid :ＡＦundamental and Ｃlinical Ｔext,"6th edition.Ｌ.Ｂraverman and Ｒ.Ｕtiger(eds),Ｊ.Ｂ.Ｌippincott Ｃo.pages 887-916）。チオナミドの甲状腺ホルモン合成に対する効果に加えて、グレーブス病におけるチオナミド療法は甲状腺自己抗体の低減に関連することが認められた(Ｃooper ,Ｄ.Ｓ.(1982)Ｎ.Ｃlin.Ｅndocrinol.Ｍetab.29:231-238；Ｋuzuya,Ｎ.et al.,Ｊ.Ｃlin.Ｅndocrinol.Ｍetab. 48:706-714；Ｂech,Ｋ.and Ｍadsen,Ｓ.Ｎ.(1980 )Ｃlin Ｅncocrinol(Ｏxf)13:417-26；Ｈallengren,Ｂ.et al.(1980) Ｊ.Ｃlin. Ｅndocrinol.Ｍetab 51:298-301；Ｃooper,Ｄ.Ｓ.(1991)Ｔreatment Ｏf Ｔhyro toxicosis.Ｉn Ｗerner Ａnd Ｉngbar's" Ｔhe Ｔhyroid:ＡＦundamental and Ｃlinical Ｔext,"6th edition.Ｌ.Ｂraverman and Ｒ.Ｕtiger(eds),Ｊ.Ｂ.Ｌi ppincott Ｃo.pages 887-916)。チオナミドがこの効果を発揮する機序に関する研究は矛盾したものである。仮説の１つは、チオナミドが甲状腺濾胞細胞に直接作用し、続く甲状腺活性の調節が免疫効果を生じることを示唆する（Ｖolpe et al.,(1986)Ｃlin.Ｅndocrinol. 25:453-462）。第２の仮説は、チオナミドがリンパ球、特には甲状腺リンパ球に直接作用することを示唆する（Ｗeetman,Ａ.Ｐ.(1992) Ｃlin Ｅndocrinol.37:31 7-318；ＭcＧregor,Ａ.Ｍ.(1980)Ｂrit.Ｍed.Ｊ.,281:968-969）。また、ＭＭＩが補助細胞による抗原の処理を妨げることも示唆されており、これは、これらの細胞がペルオキシダーゼ酵素系を有することによるものである（Ｗeetman,Ａ.Ｐ .(1983)Ｃlin.Ｉmmuno.and Ｉmmunopath,28:39-45）。現在の総意は、免疫抑制効果を含むチオナミドの治療作用が甲状腺特異的かつ甲状腺内のものであるというものである(Ｄ.Ｓ.Ｃooper(1991)Ｔreatment Ｏf Ｔhyrotoxicosis.Ｉn Ｗern er Ａnd Ｉngbar's Ｔhe Ｔhyroid:ＡＦundamental and Ｃlinical Ｔext,"6th edition.Ｌ.Ｂraverman and Ｒ.Ｕtiger(eds),Ｊ.Ｂ.Ｌippincott Ｃo.pages 8 88-889)。糖尿病の治療におけるＭＭＩの使用に関する研究の結果も矛盾している。Ｈib be,Ｔ.et al.,(1991);Ｄiabetes Ｒes.and Ｃlin.Ｐractice 11:53-58には、ＭＭＩがマウスにおけるストレプトゾトシン介在糖尿病の発症を高めることが報告されている。対照的に、Ｗaldhausl,Ｗ.et al.(1987)Ａkt.Ｅndokrin.Ｓtoffw.8 ,119(abstract)には、Ｉ型糖尿病の診断の少し後にＭＭＩで処置した11名の患者の54％で寛解が高められ、それらの治療がＴヘルパー細胞に対するＭＭＩの有名な効果に基づくことが報告されている。これらの著者は、クラスＩ及びクラスII 抗原の水準には変化がなく、この効果がＭＭＩによるものなのか、あるいは９ヶ月の“蜜月”期間にわたる疾患の自然寛解によるものなのかは明らかではないと報告した。ＢＢラットにおいては、ＭＭＩは甲状腺炎の自発的発症を抑制したが、糖尿病の発生を低減することはなかった（Ａllen,Ｆ.Ｍ.et al.,(1986)Ａm.Ｊ .Ｍed.Ｓci. ,292:267-271；Ｂraverman,Ｌ.Ｅ.et al.,(1987)Ａcta.Ｅndocrinol . (Ｃoppenhagen)Ｓuppl.281:70-76）。Ｓaji,Ｍ.et al.(1992a);Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.89:1944-1948には、ラット甲状腺細胞系ＦＲＴＬ−5におけるＭＨＣクラスＩ遺伝子のホルモン調節が記述されている。甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）でのＦＲＴＬ−5細胞系の処理の結果、ＭＨＣクラスＩＤＮＡの転写が減少し、ＭＨＣクラスＩ抗原細胞表面レベルが減少した。近年、Ｓaji,Ｍ.et al.,(1992b)Ｊ.Ｃlin.Ｅndocrino l.Ｍetab. 75:871-878の報告により、血清、インシュリン、インシュリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−1）、ヒドロコルチゾン及びグレーブス病患者に由来する甲状腺刺激ホルモン受容体自己抗体のような作用物質がＦＲＴＬ−5細胞におけるＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現を低減させることが示された。加えて、ＭＭＩ又は高用量のヨウ化物でのＦＲＴＬ −5細胞の処理の結果、ＭＨＣクラスＩ遺伝の発現が低減した。このＭＨＣクラスＩの発現の低減に対するＭＭＩの効果は転写のレベルであることが示され、かつ甲状腺刺激ホルモン及び通常これらの細胞においてクラスＩを抑制する他のホルモンに付加的なものであった。Ｓaji,Ｍ.et al.(1992b)Ｊ.Ｃlin.Ｅndocrinol .Ｍetab. 75:871-878には、グレーブス病の治療の間甲状腺においてＭＭＩが作用するであろう新規の機序が示唆されている。これには、他のいかなる自己免疫疾患に対しても推定はなされていない。これらの研究以前には、ラウス肉腫ウイルス、アデノウィルス12及び２並びに特定のグロスウイルスはＭＨＣクラスＩの発現を減少させるが、ＳＶ40、Ｒad ＬＶ及びＭo ＭuＬＶウイルスはクラスＩＭＨＣの発現を増大させることが知られていた（Ｓinger＆Ｍaguire(1990)Ｃrit. Ｒev.in Ｉmmun. 10:235-257）。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、グレーブス病と同様に比較的出現率が高い慢性自己免疫疾患である。ＳＬＥは女性で優勢に発症し、その出現率は20ないし60歳の女性700名に１名である（"Ｃellular and Ｍolecular Ｉmmunology"( 1991)Ａbbus,Ａ.Ｋ.,Ｌichtman,Ａ.Ｈ.,Ｐober,Ｊ.Ｓ.(eds);Ｗ.Ｂ.Ｓaunders Ｃompany,Ｐhiladelphia:page 360-370）。ＳＬＥは、様々な自己抗体の形成及び多臓器系の関与を特徴とする（"Ｂasic and Ｃlinical Ｉmmunology"(1991)Ｓ tites,Ｄ.Ｐ.and Ｔerr,Ａ.Ｉ.(eds),Ａppelton and Ｌange,Ｎorwalk,Ｃonnect icut,Ｓan Ｍateo,Ｃalifornia;pages 438-443）。ＳＬＥの治療のための現在の治療には、コルチコステロイド及びシクロスポリンのような細胞毒性薬物の使用が含まれる。シクロスポリン、ＦＫ506、又はラパマイシンのような免疫抑制剤は、Ｔ細胞の数及び機能を低下させることにより免疫系を抑制する（Ｍorris,Ｐ .Ｊ.(1991)Ｃurr.Ｏpin.in Ｉmmun.,3:748-751）。これらの免疫抑制療法はＳＬＥ及び他の自己免疫疾患の症状を緩和するが、多くの副作用をもたらす。実際、これらの薬剤を広範に用いる治療はその基層をなす疾患よりも高い罹患率を引き起こすことがある。乳癌を患うＳＬＥに罹患した女性は特に困難に直面する。彼女達各人はＳＬＥのコルチコステロイド及び細胞毒性薬物治療の結果として免疫が抑制されており、癌の治療のための放射線療法により免疫抑制状態がさらに高められる。さらに、現在選択されている方法である放射線療法は疾患の発現を悪化させ、又は深刻な放射線合併症を誘発することがある。彼女達各人に対しては、ＳＬＥ及び癌の同時治療を可能にする代替療法の必要性が非常に高い。一般には、代替治療又は自己免疫疾患の治療のための薬物の治療効力を評価する新規方法の必要性が非常に高い。自己免疫疾患について当てはまるのと同様に、移植拒絶の治療又は予防の異なる方法に対する高い必要性が存在する。移植拒絶はホストとドナーとの組織適合性の結果として生じ、組織の移植を成功させる上での主な障害である。現在の移植拒絶の治療は、自己免疫疾患の治療と同様に、様々な免疫抑制薬及びコルチコステロイド治療の使用を含む。Ｆaustmanら（ＰＣＴ国際出願92／04033号）は、移植組織の表面上に存在する抗原を修飾、除去又はマスクすることによる、レシピエント動物における移植組織の拒絶を阻止する方法を確認している。とりわけ、この出願はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ抗原の修飾、マスキング又は除去を示唆する。好ましいマスキング又は修飾剤は、ＨＬＡクラスＩ抗原に対する抗体のＦ（ab）′断片である。しかしながら、このような治療の有効性は、マスキング又は修飾剤としての機能を果たす抗体に対するホストの免疫応答によって制限される。加えて、臓器移植においては、マスキング抗体の灌流制限のためにこの治療は全ての細胞には影響を及ぼさない。Ｆaustmanらは、ホストへの移植に先立ってドナー細胞にウイルスの断片又は全体を形質導入し、ＨＬＡクラスＩの発現を抑制することを開示している。ウイルス全体又はその断片の使用は、そのような移植組織のレシピエントに潜在的な合併症をもたらす。これは、幾つかのウイルス、特にＳＶ40がクラスＩの発現を増加させるためである（Ｓinger and Ｍaguire(1990)Ｃrit.Ｒev Ｉn Ｉmmunol. 10:235-237,ＴＡＢＬＥ2）。Ｄurantら（英国特許592,453号）は、自己免疫疾患及び宿主対移植片（ＨＶＧ）疾患の治療において有用であり得るイソチオ尿素組成物及びこれらの化合物の免疫抑制の可能性を評価するための検定を確認している。しかしながら、この研究は、ＭＭＩ又は自己免疫疾患の治療におけるＭＨＣクラスＩ分子の抑制を記述していない。米国特許5,010,092号及び5,097,441号には、抗生物質とＭＭＩ又はＣＢＺのいずれかとの同時投与による、哺乳類動物において抗生物質投与の結果生じる腎毒性を低減させる方法が記述されている。これらの特許には、自己免疫疾患の治療又は移植拒絶の治療及び予防におけるＭＨＣクラスＩの発現を抑制するためのＭＭＩの使用、並びに自己免疫疾患及び移植拒絶の治療において用いられる薬剤の治療上の指標としてのクラスＩ分子の抑制は示唆も教示もされていない。発明の要約本発明は、哺乳類動物における自己免疫疾患治療の治療、及び移植レシピエントにおける移植拒絶の予防又は治療の方法に関する。これらの方法は、治療を必要とする哺乳類動物にＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制することが可能な薬剤を投与することを包含する。また、本発明は、レシピエントへの移植に先立って、移植可能な細胞、組織又は臓器をＭＨＣクラスＩ分子を抑制することが可能な薬剤で前処理することにも関する。特には、本発明は、哺乳類動物での自己免疫疾患の治療における及び移植レシピエントにおける移植拒絶の予防又は治療のためＭＭＩの使用に関する。加えて、本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制することが可能な薬剤を開発及び評価するためのイン・ビボ及びイン・ビトロ検定方法をさらに包含する。イン・ビボ法の１つは３工程を含んでなることが可能である。第１に、ＭＨＣクラスＩ欠損マウスを用いて特定の実験的自己免疫疾患におけるＭＨＣクラスＩの重要性を評価する。第２に、実験的に誘発され、もしくは自発的な特定の自己免疫疾患のモデルとして有用な動物を評価される薬剤に露出する。第３に、処置動物における自己免疫疾患の症状又は徴候の緩和を基準にその薬剤の治療上の効力を評価する。別のイン・ビボ法も３工程を含んでなることが可能である。第１に、哺乳類動物の細胞系、組織又は臓器を薬剤で処理する。第２に、処理した細胞、組織又は臓器を哺乳類動物に移植する。この哺乳類動物は、同様にその薬剤で処置されていてもよい。第３に、そのレシピエント哺乳類動物から細胞を取り出し、細胞の生存率を評価する。ここでは、様々な方法がイン・ビトロ検定のために提供される。それらの方法の１つにおいては、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制する薬剤の能力を、哺乳類動物の細胞を候補薬剤で処理し、処理細胞からの細胞抽出物をＭＨＣクラスＩ調節核酸配列と合わせ、この核酸配列と抽出物からのタンパク質との間での複合体の形成を検出し、かつ処理及び非処理細胞からの抽出物での複合体形成における変化を比較することにより評価する。別のイン・ビトロ法においては、細胞中でクラスＩの転写をダウン制御するその能力により薬剤の治療上の効力を評価することが可能である。例として、ＭＨＣクラスＩの転写のダウン制御はレポーター遺伝子検定によって評価することができる。さらに別のイン・ビトロ検定においては、ＭＨＣクラス分子の発現を調節することが可能なタンパク質の発現を変化させるその能力により、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制する薬剤の能力を評価する。本発明のさらに別の目的は、ＭＨＣクラスＩの発現を調節することが可能なタンパク質をコードする核酸配列を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、ベクター及びクラスＩの発現を調節することが可能なここに提供される核酸配列の全て又はその一部を含む組換え分子を提供することにある。本発明のさらに別の目的は、ＭＨＣクラスＩを調節することが可能なタンパク質をコードする核酸配列の全て又はその一部によってコードされる組換えタンパク質を産生させることにある。本発明のさらなる目的は、これらのタンパク質、ペプチド又はそれらの一部と反応するモノクローナル又はポリクローナル抗体を提供することにある。本発明の目的は、自己免疫疾患を患う哺乳類動物の治療方法を提供することにある。本発明の別の目的は、移植レシピエントにおける組織の拒絶を予防又は治療する方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、遺伝子治療を必要とする哺乳類動物に移植された、組換え遺伝子を含む細胞の拒絶を予防する方法を提供することにある。本発明の別の目的は、ＭＨＣクラスＩ分子を抑制することが可能な薬剤を評価及び開発するためのイン・ビボ及びイン・ビトロ検定を提供することにある。本発明のさらなる目的は、候補薬剤の治療上の有用性を予想するイン・ビボ及びイン・ビトロ検定を提供することにある。図面の説明図1Ａ−1Ｄは、クラスＩ欠損マウスが抗−16／6Id抗体は産生するものの、抗 −ＤＮＡ又は抗−核抗原抗体は産生しないことを示す。血清の連続２倍希釈をＥＬＩＳＡにより免疫の10週間後に検定した。結果は５匹の別個の動物の測定の平均であり、405nm×10³でのＯＤで、連続血清希釈の関数として表されている。標準偏差値は平均の10％を超えなかった。16／6Id−免疫対照１２９マウス（○）、16／6Id−免疫クラスＩ欠損マウス（◆）、及び卵白アルブミン免疫クラスＩ欠乏マウス（●）の血清。 1Ａ.免疫マウスの血清中の16／6Id；プレート上に固定された精製16／6Idの結合の滴定。 1Ｂ.免疫マウスの血清中の一本鎖ＤＮＡ；プレート上に固定された一本鎖ＤＮＡの結合の滴定。 1Ｃ.免疫マウスの血清中の核抗原；プレート上に固定された核抽出物の結合の滴定。 1Ｄ.免疫クラスＩ欠損マウスの血清中の卵白アルブミン（●）；プレート上に固定された卵白アルブミンの結合の滴定。卵白アルブミンで免疫されていないク図2Ａ−2Ｄは、クラスＩ欠損マウスがモノクローナル抗−16／6Id抗体での免疫に応答しないことを示す。血清の連続２倍希釈をＥＬＩＳＡにより免疫の７週間後に分析した。結果は６匹の動物の測定の平均である。標準偏差値は平均の10 ％を超えなかった。抗−16／6Id免疫対照129（■）及び抗−16／6Id免疫クラスＩ欠損マウス（●）の血清。 2Ａ.免疫マウスの血清中の抗−16／6Id；プレート上に固定された精製ウサギポリクローナル抗−16／6Id免疫グロブリンの結合の滴定。 2Ｂ.免疫マウスの血清中の一本鎖ＤＮＡ；プレート上に固定された一本鎖ＤＮＡの結合の滴定。 2Ｃ.免疫マウスの血清中の16／6Id；プレート上に固定された16／6Idの結合の滴定。 2Ｄ.免疫マウス血清中の核抗原；プレート上に固定された核抽出物の結合の滴定。図3Ａ−3Ｂは、16／6Idを注射したクラスＩ欠損（3Ｂ）及び対照129（3Ａ）マウスの腎切片の免疫組織学的実験を示す。凍結腎切片(5μm厚)を固定し、ＦＩＴＣ結合γ鎖特異的ヤギ抗−マウスＩgＧで染色した（倍率×200）。示される腎切片は各群の１匹の個体からのものであり、その群を代表するものである。図4Ａ−4Ｄ。図4Ａ及び4Ｂは、１回免疫し、かつ16／6Idを有するヒトモノクローナル抗−ＤＮＡ抗体で追加免疫したマウスにおける抗−16／6Id及び抗−ＤＮＡ抗体の出現を示す。図4Ｃ及び4Ｄは、ＭＭＩでの処置の２１ 1／2週間後のマウスにおける抗−16／6Id及び抗−ＤＮＡ抗体の力価を示す。 4ＡはＭＭＩでの処置の前のマウスにおける抗−16／6Id抗体の力価を示す。免ルモン、とりわけチロキシン（Ｔ₄）で処置され、又は処置されない16／6Id免疫マウス（◇、◆、□）。 4ＢはＭＭＩでの処置の前のマウスにおける抗−ＤＮＡ抗体の力価を示す。表示は（Ａ）と同じである。 4ＣはＭＭＩ又はＭＭＩ及びチロキシン（Ｔ₄）での処置の後のマウスにおける抗16／6Id抗体の力価を示す。16／6Idで免疫はされてはいるが処置は受けていなＴ₄で60日（◇）処置した動物；16／6Idでは免疫されていないがＭＭＩで60日処置された動物（■）又はＭＭＩ及びＴ₄で60日処置された動物（□）。 4ＤはＭＭＩ又はＭＭＩ及びチロキシン（Ｔ₄）で処置した後のマウスにおける抗ＤＮＡ抗体の力価を示す。表示は（Ｃ）と同じである。図５は、ＭＭＩ又はチロキシン（Ｔ₄）に露出していない16／6Id処置対照動物（■）；ＭＭＩに晒した16／6Id処置動物（○）；及びＭＭＩ及びＴ₄（□）に露出した16／6Id処置動物における、追加免疫の３ヶ月、５ヶ月及び８ヶ月後の相対白血球（ＷＢＣ）数をＷＢＣのパーセンテージとして示す。図6Ａ−6Ｂは、ＭＭＩで処置した16／6Id処置マウス（6Ｂ）対ＭＭＩで処置していない16／6Id処置動物の腎臓における免疫複合体の発生を示す。図7Ａ−Ｄは、実験的ＳＬＥ疾患の間のリンパ球集団に対するＭＭＩ処置の効果を示す。この実験的ＳＬＥ疾患は16／6Id処理の結果生じたものである。びチロキシン（Ｔ₄）で処置したマウス（■）；16／6Idで免疫し、かつＴ₄で処球集団の分布を示す。で処置したマウス（■）における全期間でのＴ細胞上のクラスＩのレベルを示す。で処置したマウス（■）における全期間でのＢ細胞上のクラスＩのレベルを示す。で処置したマウス（■）における全期間でのＢ細胞上のクラスIIのレベルを示す。図８は、ＮＺＢxＮＺＷＦ1マウスにおける抗−ＤＮＡ抗体の力価に対する２ヶ月のＭＭＩ治療（ペレットの埋め込みにより15mgを30日間にわたって放出）の効果を示す。対照動物（ＢxＷＦ1）（□）及びＭＭＩで処置したＢxＷＦ1動物（○ ）。ＮＺＢxＮＺＷＦ1マウスは、自発性ＳＬＥを発症するＳＬＥのマウスモデルである。図9Ａ−9Ｂは、ＰＤ１プロモーター5′部分の151（ボールド体）（配列番号１の塩基54ないし220）、114（ボールド体及び下線）（配列番号１の塩基221ないし320）、140(ボールド体及び矩形囲み)（配列番号１の塩基321ないし455）及び 238（ボールド体及び波形矩形囲み）（配列番号１の塩基456ないし692）領域又は断片を含むＰＤ1プロモーター(配列番号1)の配列を示す。238領域(配列番号１の塩基456ないし692)はＡＴに富む105領域（下線）（配列番号１の塩基588ないし692）を含む。ＡＴＧ開始部位はＭetで始まるアミノ酸３文字暗号で示されている。右側の数字は最上列の第１ヌクレオチドから数えた塩基対の数を示す。図10は、140断片（配列番号2）のサイレンサー及びエンハンサー領域を、ゲル移動度シフト検定における活性についてのこの領域のマッピングに用いられるオリゴヌクレオチドと共に示す。移動度ゲルシフト検定における複合体形成に対するＭＭＩ効果に関連するサイレンサー領域は、インシュリン感受性である甲状腺転写因子−2（ＴＴＦ−2）様結合要素によって分離されている反対の矢印で示される。サイレンサー及びエンハンサー結合部位のマッピングは様々な二本鎖（ds ）−オリゴヌクレオチドによる複合体形成の阻害によって行った。140-bp Ａva ＩＩ-ＤdeＩＤＮＡ断片にまたがる一連のds−オリゴヌクレオチドをエンハンサー及びサイレンサー複合体と競合する能力について試験した。それらのうち、競合したものは示される96-bpのうちに含まれるものだけであった。結合に重要な残基を決定するため、様々なds−オリゴヌクレオチドを合成し、サイレンサー及びエンハンサー複合体形成を阻害するそれらの能力について試験した。矩形で囲った領域は複合体の形成に重要であるds−オリゴヌクレオチドを用いる阻害研究によって決定された配列を示し、点は本来の配列と同じ残基を示す。簡単にするため、競合研究において用いたds−オリゴヌクレオチド配列の一方の鎖のみを示す。図10（上）はサイレンサー結合部位のマッピングに用いられたオリゴヌクレオチドを示す。矢印はサイレンサーの構成要素との境界を示す。図10（下）はエンハンサー結合部位のマッピングに用いられたオリゴヌクレオチドを示す。矢印はエンハンサーの断続的な逆転反復を示す。図11は、配列の相同性を示すため、238断片（配列番号１の塩基456ないし692 ）の114断片（配列番号36）、140断片（配列番号37）及び105断片（配列番号35 ）の整列を示す。サイレンサー領域は、図10と同様に矢印により、140（配列番号37）内に輪郭が示されている。151と同様に、全てＭＭＩに応答する。図10と同様に、ＴＴＦ−2様配列も同定されている。（^*）は140断片との一致を示し、（●）は少なくとも他の１つの断片における140断片との相同性を示し、（_--）は最良の一致を導き出すためにコンピュータによって挿入されたギャップを示す。右側の数字は、各々が１番から開始して連続的に番号がふられた場合の、図９において定義される各断片における残基を示す。図12Ａ−Ｄは、図９に示される放射標識140（配列番号１の塩基321ないし455 ）、114（配列番号１の塩基221ないし320）及び151（配列番号１の塩基54ないし 220）断片並びにＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞の細胞抽出物の移動度シフト検定を示す。処理もしくは非処理ＦＲＴＬ−5細胞からの細胞抽出物を放射標識ＤＮＡ断片と共にインキュベートし、得られたＤＮＡ断片−タンパク質複合体をポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させてオートラジオグラフィにより可視化した。ＭＭＩによって影響を受けた複合体をＡで示す。 12Ａは140放射標識断片（配列番号１の塩基321ないし455）のゲル移動度シフト検定を示す：レーン１は140放射標識断片（配列番号１の塩基321ないし455）を単独で含み；レーン２は6Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン３は6Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されていないＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン４は5Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ −5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン５は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン６は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）で処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；及びレーン７は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩ及びＴＳＨで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含む。 12Ｂは114放射標識断片（配列番号１の塩基221ないし320）のゲル移動度シフト検定をＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞抽出物と共に示す。レーン１は114放射標識断片（配列番号１の塩基221ないし320）を単独で含み；レーン２は6Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン３は6Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されていないＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン４は5Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン５は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されたＦＲＴＬ −5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン６は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）で処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；及びレーン７は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩ及びＴＳＨで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含む。 12Ｃは151放射標識断片のゲル移動度シフト検定をＦＲＴＬ−5細胞抽出物と共に示す。レーン１は151放射標識断片を単独で含み；レーン２は6Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン３は6Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されていないＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン４は5Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン５は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されたＦＲＴＬ −5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み;レーン６は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）で処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の抽出物を含む。図12Ｃのレーンa−dは、151放射活性断片（配列番号１の塩基54ないし220）とＦＲＴＬ−5細胞抽出物とのゲルシフト移動度検定におけるＡ複合体の形成が、非標識105（配列番号１の塩基588ないし692）、140 （配列番号１の塩基321ないし455）、151（配列番号１の塩基54ないし220）及び 114（配列番号１の塩基221ないし320）断片による競合を受け得ることを示す。レーン（a）のインキュベーション混合物は151放射標識断片（配列番号１の塩基 54ないし220）、5Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物、及び非標識105断片（配列番号１の塩基588ないし692）を含み；レーン（b）は151放射標識断片（配列番号１の塩基54ないし220）、5Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物、及び非標識140断片（配列番号１の塩基321ないし455）を含み；レーン（c）は151放射標識断片（配列番号１の塩基54ないし220）、5Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物、及び非標識151断片（配列番号１の塩基54ないし220）を含み；レーン（d）は放射標識151断片（配列番号１の塩基54 ないし220）、5Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物及び非標識114断片（配列番号１の塩基221ないし320）を含む。 12Ｄは放射標識140断片（配列番号１の塩基321ないし455）のゲル移動度シフト検定を3Ｈ培地中に維持された処理及び非処理ＦＲＴＬ−5細胞に由来する抽出物と共に示す。５Ｈ培地と異なり、３Ｈ培地はインシュリンを含まない。レーン（j）のインキュベーション物は140放射標識断片（配列番号１の塩基321ないし4 55）を単独で含み；レーン（e）は3Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン（f）は3Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み;レーン(g)は3Ｈ培地の存在下に維持され、かつＴＳＨで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン（h）は3Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩ及びＴＳＨで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；並びにレーン（i）は非標識105断片を3Ｈ培地の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の抽出物と共に含む。図13はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）キメラでの形質移入データを示し、これは、ＭＭＩが完全長のＭＨＣクラスＩＰＤ1プロモーターの活性を阻害することを示す。ＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞に完全長のＰＤ1プロモーター、ＣＡＴキメラ構築体を形質移入し、これらの細胞に何も処理を施さで処理した。図14Ａ−Ｂは放射標識238断片（配列番号１の塩基456ないし692）（図14（Ａ））又は放射標識Ｋオリゴヌクレオチド（配列番号38）（図14（Ｂ））のゲルシフト移動度検定を、5Ｈ培地中に維持された処理もしくは非処理ＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の抽出物と共に示す。ＭＭＩによって影響を受けた複合体をＡで示す。 14Ａは、5Ｈ培地中に維持した処理もしくは非処理ラット甲状腺ＦＲＴＬ−5細胞由来の抽出物及び図10に示される非標識二本鎖(ds)オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした放射標識238断片（配列番号１の塩基456ないし692）のゲル移動度シフト検定を示す。レーン１のインキュベーション物は238放射標識断片（配列番号１の塩基456ないし692）を単独で含み；レーン２は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されないＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み;レーン３は5Ｈ培地及び非標識105断片(配列番号１の塩基588 ないし692)の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン４は5Ｈ培地及び非標識114断片（配列番号１の塩基221ないし3 20）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン５は5Ｈ培地及び非標識140断片（配列番号１の塩基321ないし455）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン６は5Ｈ培地及び非標識151断片（配列番号１の塩基54ないし220）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン７は5Ｈ培地及び非標識Ｋ−オリゴヌクレオチド（配列番号38）中に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン８は5Ｈ培地及び非標識ds−オリゴヌクレオチドＳ2（配列番号4）（図10に図示）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン９は5Ｈ培地及び非標識ds−オリゴヌクレオチドＳ3（配列番号10）（図10に図示）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン10 は5Ｈ培地及び非標識ds−オリゴヌクレオチドＳ8（配列番号8）（図10に図示）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン11は5Ｈ培地及び非標識ds−オリゴヌクレオチドＳ6（配列番号6）（図10 に図示）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン12は5Ｈ培地及び非標識ds−オリゴヌクレオチドＳ1（配列番号3 ）（図10に図示）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン13は5Ｈ培地及び非標識ds−オリゴヌクレオチドＳ7（配列番号7）（図10に図示）の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン14は5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩ及びＴＳＨで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含み；レーン15は非標識Ｋ−オリゴヌクレオチド（配列番号38）と5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩ及びＴＳＨで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物とを含む。 14Ｂは、5Ｈ培地中に維持された処理もしくは非処理ラット甲状腺細胞由来の抽出物と共にインキュベートした放射標識Ｋ−オリゴヌクレオチド（配列番号38 ）のゲル移動度シフト検定を示す。レーン16において、インキュベーション物は、放射標識Ｋオリゴヌクレオチド（配列番号38）を5Ｈ培地単独の存在下に維持されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物と共に含む。レーン17において、インキュベーション物は、放射標識Ｋオリゴヌクレオチド（配列番号38 ）を5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物と共に含み；レーン18は放射標識Ｋオリゴヌクレオチド（配列番号38）を5Ｈ培地の存在下に維持され、ＴＳＨで処理されたＦＲＴＬ −5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物と共に含み；レーン19は放射標識Ｋオリゴヌクレオチド（配列番号38）、並びに5Ｈ培地の存在下に維持され、かつＭＭＩ及びＴＳＨで処理されたＦＲＴＬ−5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物を含む。図15Ａ−15Ｂは、インシュリン及び5％血清を含む（図15Ａ）、又はインシュリンを含まずに0.2％血清だけを含む(図15Ｂ)培地中に維持されたＦＲＴＬ−5甲状腺細胞における、ＭＨＣクラスＩの転写率に対するＭＭＩ及びＴＳＨの効果を示す。5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地（図15Ａ）又は0.2％血清を加えた4Ｈ培地 (図15Ｂ)に７日間維持したＦＲＴＬ−5甲状腺細胞を1×10^-10ＭＴＳＨ、5mＭＭＭＩ、又はその両者に露出した。24時間後、核を単離し、[³²Ｐ]ＵＴＰと共にインキュベートした後核ＲＮＡを精製し、次いで過剰のクラスＩ cＤＮＡ及びβ −アクチンとハイブリダイズさせた(Ｓaji,Ｍ.,Ｍoriarty,et al.,(1992b)Ｊ.Ｃ lin.Ｅndocrinol.Ｍetab. 75,871-878;Ｉsozaki,Ｏ.,et al.,(1989)Ｍol.Ｅndocr inol. 3,1681-1692)。オートラジオグラフィー及び濃度測定の後、ＴＳＨ又はＭＭＩに露出していない対照細胞におけるアクチンＲＮＡに対する放射標識クラスＩの比を１に設定し、処理細胞からの値を比較した。β−アクチンＲＮＡ転写のレベルは処理の影響を受けなかった。値は３回の実験の平均であり、Ｐ＜0.05（^* ）又はＰ＜0.01（^**）で有意の増加又は減少が認められる。0.2％血清を加えた 4Ｈ培地中の対照細胞（図15Ｂ）におけるクラスＩ転写率は5％血清を加えた5Ｈ培地中におけるもの（図15Ａ）より約3.2倍高く、これは、それぞれの条件下におけるクラスＩＲＮＡレベルでの約４倍の高さと一致する（Ｓahi,Ｍ.,Ｍoriarty,et al.,(1992b)Ｊ.Ｃlin .Ｅndocrinol.Ｍetab. 75,871.878）。図16Ａ−16Ｂは、ＦＲＴＬ−5細胞における、ブタクラスＩプロモーターの5′ −欠失変異体のＣＡＴキメラのプロモーター活性に対するＭＭＩ及びＴＳＨの効果を示す。（図15Ａ）6Ｈ培地（＋ＴＳＨ）中で成長させたＦＲＴＬ−5細胞に電気穿孔法によりＰＤ15′−隣接領域の異なる構築体を形質移入した。12時間後、培地を新鮮な6Ｈ培地（＋ＴＳＨ）、5mＭＭＭＩを加えた新鮮な6Ｈ培地（＋ＴＳＨ／＋ＭＭＩ）、又はＴＳＨもしくはＭＭＩを含まない新鮮な5Ｈ培地に変え、36時間後にＣＡＴ活性を測定した。変換率をルシフェラーゼレベル及びタンパク質に対して標準化し、6Ｈ培地中に維持した細胞における−1100bp構築体の活性（最初の黒棒）に100％の対照値を割り当てた。異なる構築体の発現の基礎レベルにおける相違は、Ｗeissman,Ｊ.Ｄ.and Ｓinger,Ｄ.Ｓ.(1991)Ｍol.Ｃell. Ｂiol. 11,4217-4227；Ｇiuliani,Ｃ.,et al.,(1995)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.270,11453- 11462；Ｅhrlich,Ｒ.,et al.,(1988)Ｍol.Ｃell Ｂiol.8,695-703；Ｍaguire,Ｊ .Ｅ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,3078-3086;Ｈowcroft,Ｔ.Ｋ.,et al., (1993)ＥＭＢＯＪ.12,3163-3169に既に記述されている異なる調節要素の活性を反映しており、その幾つかは(図16Ｂ)にまとめられている。値は、各々２回繰り返した３回の異なる実験の平均±Ｓ.Ｅ.である。（図15Ｂ）異なる構築体のグラフ表示。示される調節要素には、（a）異なる組織における構造クラスＩレベルの調節に重要なサイレンサー／エンハンサー領域；（b）エンハンサーＡ；（c）インターフェロン応答要素；（d）38bp構造サイレンサーであって、（e）この構造サイレンサー要素内のＣＲＥ様配列を含む構造サイレンサーが含まれる。（f ）転写の開始に重要なＣＣＡＡＴボックスも示される。これらの要素及び後の図の全てにおける番号付けは、＋1、図９におけるヌクレオチド1091である転写の始点(Ｇiuliani,Ｃ.,et al.,(1995)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.270,11453-11462)から決められる。図17Ａ−17Ｂは、ＭＭＩ及びＴＳＨによって調節されるＦr140タンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を妨げるオリゴヌクレオチドの能力を示す（図12Ａ）。（図17 Ｂ）は、それが複合体の形成に関与するサイレンサー領域、−724ないし−697bp であることを示す（図17Ａ）；形成は、Ｆr140に対して5′及び3′の関連サイレンサー要素配列を含むクラスＩプロモーター断片によっても阻害され、この関連サイレンサーのうちの２つは図11に示されている。図17Ａにおいては、細胞をＴＳＨを含まない5Ｈ培地において７日間培養した。細胞抽出物を調製し、ＰＤ1プロモーターのＦr140放射標識プローブ、−770ないし−636bpと共にインキュベートした。矢印（Ａ）は、ＭＭＩ及びＴＳＨによって減少し、Ｅ9オリゴヌクレオチド（図10）ではなく250倍過剰のＳ2（配列番号4）及びＳ6（配列番号6）による阻害に基づいてサイレンサー要素と同定されるタンパク質／ＤＮＡ複合体を示す。矢印（b）は、サイレンサー要素を部分的にのみ阻害するＳ6（配列番号6）オリゴヌクレオチド及びエンヘンサーのみを阻害するＥ−9による阻害に基づいてエンハンサー要素として同定されるタンパク質／ＤＮＡ複合体を示す。Ｓ3（配列番号10）オリゴヌクレオチドは対照であり、効果はない。矢印（c）が示すタンパク質／ＤＮＡ複合体の機能は現時点では不明である。図17Ｂにおいては、同じ抽出物を、100倍過剰の、Ｆr140：Ｆr151（−1047ないし−881bp）、Ｆr114 （−880ないし−771bp）及びＦr105（−503ないし−399bp）に対して5′及び3′ の非標識断片と共にインキュベートした。これらのクラスＩ領域は、Ｆr140(配列番号37)（図11及び12Ａ−Ｄ）中のサイレンサーとかなりの相同性を有する領域を含む。図18Ａ−18Ｃは、Ｆr140（配列番号37）と共に形成されるサイレンサー複合体に対する塩濃度の上昇（図18Ａ）及びＮＦ−κＢのp50もしくはp65サブユニット（図18Ｂ）又はc−fos群の構成要素（図18c）に対する抗血清の効果を示す。ＦＲＴＬ−5細胞をＴＳＨを含まない5Ｈ培地において７日間培養した。細胞抽出物を調製し、ＰＤ1プロモーターのＦr140（配列番号37）放射標識プローブ−770〜 −636bpと共にインキュベートして複合体の形成をＥＭＳＡにより測定した。図1 2Ａ−Ｄ、14Ａ−Ｂ、及び17Ａ−Ｂにおいて特徴付けられるサイレンサー複合体を矢印で示す。（図18Ａ）においては、濃度が増加するＫＣlをインキュベーション混合物に添加した。（図18Ｂ）及び（図18Ｃ）においては、プローブを添加する前に、示される抗血清又は正常血清（レーン3、図18Ｃ）を抽出物と共に予備インキュベートした。断続線は“超シフト”複合体の位置を示す。fosＢ、c− fos、fra−1、及びfra−2に対する抗血清は、それぞれ、Ｓanta Ｃruzから入手したsc−48、 sc−413、sc−183、及びsc−57である。これらの結果は、サイレンサー複合体( 矢印)が１を上回るタンパク質／ＤＮＡ複合体（図18Ａ−Ｃ）を含んでなり、かつそれらのタンパク質のうちの１つがＮＦ−κＢのp65サブユニット（図18Ｂ）で、他のものがc−fos群の構成要素（図18Ｃ）、おそらくfra−1、fra−2又はfo sＢ以外であることを示す。図19Ａ−19Ｃは、オリゴＫ（配列番号38）、サイログロブリン（ＴＧ）、インシュリン応答性要素（ＩＲＥ）、又はオリゴＫＭ、インシュリン応答性を失ったそれらの変異体（Ｓantisteban,Ｐ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,1310-13 17；Ａza-Ｂlanc,Ｐ.,et al.,(1993)Ｍol.Ｅndocrinol.7,1297-1306）の配列を有するオリゴヌクレオチドを含むプラスミドによる同時形質移入を伴う、もしくは伴わない、ＦＲＴＬ−5細胞に形質移入されたp（−1100）ＣＡＴ（図19Ａ）、 p（−127）ＣＡＴ（図19Ｂ）、又はp（−127ＮＰ）ＣＡＴ（図19Ｃ）のＣＡＴ活性を示す。5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地中で成長させたＦＲＴＬ−5細胞に、ＰＤ15′−隣接領域の異なる構築体及びオリゴＫの配列を有するオリゴヌクレオチドを含む20もしくは40μgのプラスミド（それぞれ、オリゴＫ1、及びオリゴＫ 2）を同時形質移入した。あるいは、40μgのオリゴＫＭ、前に記述されるオリゴＫの変異形態（Ｓantisteban,Ｐ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,1310-1317 ；Ａza-Ｂlanc,Ｐ.,et al.,(1993)Ｍol.Ｅndocrinol.7,1297-1306）を同時形質移入した。p(−127ＮＰ)ＣＡＴは、ＣＲＥの非パリンドローム変異（図25Ａを参照）を下流サイレンサーの中に有するp（−127）ＣＡＴキメラ（図16Ａ）である。36時間後にＣＡＴ活性を測定し、変換率を成長ホルモンレベルに対して標準化した。オリゴＫ配列が挿入されたベクターでの対照形質移入の活性に100％の値を割り当てた（各枠における最初の白抜きの棒）。オリゴＫ（配列番号38）又はその変異体を同時形質移入した細胞のＣＡＴ活性における相違を対照値と比較した。値は、各々２回行った３回の異なる実験の平均±Ｓ.Ｅ.である。（図19Ａ）において、星印１つ（^*）はオリゴＫ1によって引き起こされた活性の有意の（Ｐ＜0.05）の増加を示し；星印２つ（^**）はオリゴＫ2による有意の増加（Ｐ＜0.0 1）を示す。（図19Ｃ）において、オリゴＫ1の存在下における増加は有意（Ｐ＜ 0.01）である。図20Ａ−20Ｂは、オリゴヌクレオチドＫ（配列番号38）、サイログロブリンプロモーターのインシュリン応答性要素（これは、メチマゾール（ＭＭＩ）及びＴＳＨの能力を阻害してクラスＩプロモーターのＦr140とのサイレンサー複合体を減少させることが可能である（図12Ａ−Ｄ及び14Ａ−Ｂを参照））でのラットＦＲＴＬ−5細胞発現ライブラリーのスクリーニングにより得られる、Ｓox−4と呼ばれるクローンのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を示す。この配列は1422ヌクレオチドを含み、そのオープンリーディングフレームは分子量約53,040の442 アミノ酸残基のタンパク質をコードする。マウスＳox−4とのアミノ酸残基の相違は特定の置換残基によりラット配列の下に示されている。ヒトＳox−4（Ｖan de Ｗetering,Ｍ.,et al.,(1993)ＥＭＢＯＪournal 12,3847-3854）との相違は断続線で示されている。ラット及びマウスＳox−4はヒトＳox−4より32残基小さい(Ｆarr,Ｃ.Ｊ.,et al.,(1993)Ｍammalian Ｇenome 4,577-584)。ヒトＳox−4 における余分の残基の全て（示さず）は、示されるマウス及びヒトＳox−4とのアミノ酸相違を含むタンパク質の１領域内のクラスターであり、それらは大部分がグリシン及びアラニン残基である（Ｆarr,Ｃ.Ｊ.,et al.,(1993)Ｍammalian Ｇenome 4,577-584）。矩形で囲まれている残基はラット、マウス及びヒトＳox −4遺伝子で同じアミノ酸である。Ｓox−4タンパク質は配列特異的な様式でＤＮＡに結合する転写レギュレーターのＨＭＧ(高移動度群)クラスの構成要素であり、ＨＭＧボックスはボールド体で矩形に囲まれている。ＨＭＧボックスに加えて、３種類のＳox−4タンパク質全てに共通の特徴は、複数の推定カゼインキナーゼ及びヒストンキナーゼリン酸化部位を有するセリンに富むカルボキシ末端テールである（Ｖan de Ｗetering,Ｍ.,et al.,(1993)ＥＭＢＯＪournal 12,3847-3 854；Ｆarr,Ｃ.Ｊ.,et al.,(1993)Ｍammalian Ｇenome 4,577-584）。図21は、放射標識オリゴヌクレオチドＫ（配列番号38）、オリゴヌクレオチドＺ（甲状腺ペルオキシダーゼプロモーターの等価インシュリン応答性要素）、又はＥＭＳＡにおいて甲状腺転写因子−2(ＴＴＦ−2)の結合と競合する能力を失ったそれらの変異体（Ｓantisteban,Ｐ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,1310- 1317;Ｆrancis-Ｌang,Ｈ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,576-588;Ａza Ｂ lanc,Ｐ.,et al.,(1993)Ｍol.Ｅndocrinol.7,1297-1306）と共にインキュベートした場合の、タンパク質−ＤＮＡ複合体を形成する組換えラットＳox−4タンパク質、50ngの能力を示す。対照オリゴヌクレオチド、サイログロブリンプロモーター由来のオリゴヌクレオチドＣも用いられており、これはオリゴヌクレオチドＫ部位に隣接し、かつＴＴＦ−2とは結合しないが甲状腺転写因子−1（ＴＴＦ−1）又はＰax −8と結合することが可能である（Ｇuazzi,Ｓ.,et al.,(1990)ＥＭＢＯＪ.,9,3 631-3639；Ｆrancis-Ｌang,Ｈ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,576-588；Ｓantisteban,Ｐ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,1310-1317；Ｚannini,Ｍ. ,et al.,(1992)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,4230-4241；Ａza Ｂlanc,Ｐ.,et al.,(199 3)Ｍol.Ｅndocrinol.7,1297-1306）。合成二本鎖オリゴヌクレオチドを[γ³²Ｐ] ＡＴＰ及びＴ4ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識した後、使用前に8％未変性ポリアクリルアミドゲルで精製した。結合反応を30μlの容積で20分間室温で行った。反応混合物には、組換えタンパク質１μg並びに10mＭトリス−Ｃl(pＨ7.9 )、1mＭＭgＣl₂、1mＭジチオトレイトール、1mＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、5％グリセロール、及び200mＭＫＣl中のポリ（dＩ−dＣ）0.5μgが含まれていた。標識プローブ50,000cpmを添加し、インキュベーションを室温でさらに20分続けた。ＤＮＡ−タンパク質複合体を5％未変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。図22Ａ−22Ｂは、異なるラット組織（図22Ａ）及び様々なホルモン混合物で示される期間、24時間又は１週間、処理したラットＦＲＴＬ−5甲状腺細胞(図22Ｂ )のノーザン分析を示す。図21Ａにおいては、示されるラット組織に由来するmＲＮＡを含むラットＭultiple Ｔissue Ｎorthern Ｂlot(Ｃlontech、Ｐalo Ａlto 、ＣＡ)をノーザン分析に用いた。図21Ｂにおいては、ＱＤ^TM迅速ポリ（Ａ）⁺m ＲＮＡ単離システム（5Ｐrime→3Ｐrime Ｉnc.、Ｂoulder，ＣＯ）を用いて培養非機能性ＦＲＴ（フィッシャーラット甲状腺）、ＢＲＬ（バッファローラット肝臓）、及び機能性ＦＲＴＬ−5（フィッシャーラット甲状腺Ｌ−5系）細胞から、又はヒト甲状腺もしくは胸腺及びラット卵巣組織からmＲＮＡを調製した。ノーザン分析では、レーン当り1.5μgのＲＮＡ、2％ホルムアルデヒドを含む1％アガロースゲル、及びナイロンフィルター（Ｎytran、Ｓchleicher and Ｓchuell、Ｋeene，ＮＨ）を用いた。図21Ａ及び21Ｂの両者について、完全長のラットＳＯＸ−4又はラットβ−アクチンcＤＮＡ（Ｄr.ＢＰaterson、ＮＣＩ、Ｂethesda 、ＭＤより入手）をランダムプライミングにより放射標識した。予備ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション（1.0×10⁶cpm／ml）はＱuickhyb Ｈybridization Ｓolution(Ｓtratag ene、ＬaＪolla、ＣＡ)中で行った。洗浄は前に記述される通りに行った（Ｉsoz aki,Ｏ.,et al.,(1989)Ｍol.Ｅndocrinol.3,1681-1692）。図23は、Ｆr140とＦＲＴＬ−5細胞抽出物との間でのサイレンサー及びエンハンサー複合体形成を阻害する、Ｓox4に対する抗体の能力を示す。ＦＲＴＬ−5細胞をＴＳＨを含まない5Ｈ培地中で７日間培養した。細胞抽出物を調製し、ＰＤ1 プロモーターのＦr140放射標識プローブ、−770ないし−635bpと共にインキュベートして複合体形成をＥＭＳＡにより測定した。図12、14、17及び18において特徴付けられるサイレンサー及びエンハンサー複合体が示されている。予備免疫した、又は免疫したウサギからの血清のＩgＧ画分（それぞれ、レーン2及び3）を、プローブを添加する前に、抽出物と共に予備インキュベートした。標準プロトコル（Ｇenosys Ｂiotechnologies,Ｉnc.、Ｔhe Ｗoodlands、Ｔexas）に従い、ラットＳox−4（図20）のＫＬＨ−結合ペプチド359ないし373（ＧＳＳＳＳＤＤＥＤＤＬＬＤ）でウサギを免疫することにより抗体を作製した。プロテインＡ− セファロースＣＬ−4Ｂカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーによってＩgＧを精製し、リン酸緩衝生理食塩水、pＨ7.4で平衡化したＰierce（Ｒockf ord、ＩＬ）脱塩カラムで脱塩した。このＩgＧ溶出液を100容量のリン酸緩衝生理食塩水、pＨ7.4に対して4℃で18時間透析し、Ｃentricon10ユニット（Ａmicon 、Ｂeverly ＭＡ）において500×g、4℃で3.5時間遠心することにより濃縮した。ＩgＧは検定まで−20℃で保存することが可能であった。ここで用いられるウサギ抗体は１：10,000希釈で合成ペプチドと反応し、ペプチド特異的、すなわち残基226ないし239(図20)を模倣するＳox−4由来の別の親水性ペプチドは認識せず、かつＥＬＩＳＡによる測定でウェスタンブロット処理された組換えＳox−4 を検出することが可能である。図24Ａ−24Ｂは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製されたクラスＩＰＤ−1ゲノム断片、−800ないし−605に対するＤＮＡaseＩ保護分析を示す( Ｓaiki,Ｒ.Ｋ.,et al.,(1988)Ｓcience 239,487-491,46)。テンプレートは140断片を含むＰＤ−15′−隣接領域であった（Ｅhrlich,Ｒ.,et al.,(1988)Ｍol.Ｃe ll Ｂiol. 8,695-703；Ｍaguire,Ｊ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,3078-3 086）。正プライマーは5′末端のＢamＨＩ部位（下線）、ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＧＧＡＧＴＡＴＡＣＴＧＡＴＴＣＡＧを有し、ＰＤ−1配列の−800から−770bpまで広がっていた。逆プライマーはＨindIII部位（下線）、ＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＡＧＧＴＴＴＡＴＧＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧを有し、−605から−634bpまで広がっていた。この断片をＢamＨＩ及びＨindIIIで消化し、記述されるようにＣＡＴキメラに挿入した（Ｅhrlich,Ｒ.,et al.,(1988)Ｍol.ＣellＢiol.8,695-703；Ｍaguire, Ｊ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,3078-3086；Ｇiuliani,Ｃ.,et al.,(19 95)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.270,11453-11462）。必要に応じて、これを制限酵素消化により単離し（Ｅhrlich,Ｒ.,et al.,(1988)Ｍol.Ｃell Ｂiol.8,695-703；Ｍagui re,Ｊ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,3078-3086）、ＱＩＡＥＸ抽出キット（Ｑuiagen、Ｃhatsworth、ＣＡ）を用いて2％アガロースゲルから精製した。コーディング鎖のデータは図24Ａに示し、非コーディング鎖の結果は図24Ｂに示す。この断片を［α32Ｐ］dＣＴＰ及びクレノウ断片で末端標識した後、8％未変性ポリアクリルアミドゲルで精製した。ＤＮＡaseＩフットプリント法(Ｉkuyama ,Ｓ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,1701-1715；Ｓhimura,Ｈ.,et al.,(199 3)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.268,24125.24137)では1、5又は10μgの精製組換えタンパク質を用いた。初期インキュベーションは、室温で20分間、20μl反応容積で、ＫＣl を除いて10mＭトリス−Ｃl、pＨ7.6、5mＭＭgＣl₂、0.1％トリトンＸ−100、及び１μgのポリ（dＩ−dＣ）と共に行った。プローブ（50,000cpm）を添加した後、反応混合物を室温で20分間インキュベートした。次に、ＤＮＡプローブを0.5 単位のＤＮＡaseＩ（Ｐromega、Ｍadison、ＷＩ）を用いて室温で１分間消化した。80μlの停止溶液（20mＭトリスＨＣl、pＨ8.0、250mＭＮaＣl、20mＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、1 0μgプロテイナーゼＫ、及び４μg超音波処理仔ウシ胸腺ＤＮＡ）で反応を停止させた。37℃で15分間インキュベートした後、消化産生物をフェノール抽出してエタノール沈澱させ、8％配列決定ゲルで分離した。マクサム及びギルバートＡ＋Ｇ及びＣ＋Ｔ配列決定反応（Ｍaxam,Ａ.Ｍ.,et al.,(1980)Ｍethod Ｅnzymol. 65,499-560）を用いてフットプリントが付けられた領域の位置を定めた。Ｓox− 4及び対照組換えタンパク質、ＮＦ−κＢのp50サブユニット、によってフットプリントが付けられた領域は各枠の右に示されており、これをクラスＩプロモーターのサイレンサー及びエンハンサー領域と比較する（図10を参照）。図25Ａ−25Ｂは、p（−127）ＣＡＴプロモーターの活性に対するＣＲＥ様要素の修飾の効果及び異種プロモーターの活性に対するＣＲＥ様要素の効果を示す。図25Ａにおいては、p（−127）ＣＡＴプロモーター構築体中のＣＲＥ様要素を欠失させ（ΔＣＲＥ）、又は示されるように非パリンドローム配列に変異させた（ＮＰＣＲＥ）。これらの誘導構築体のＣＡＴ活性を、ＦＲＴＬ−5細胞に形質移入して5％仔ウシ血清を加えた3Ｈ培地中で２日間インキュベートした後、親のp （−127）ＣＡＴ活性と比較した。変換率をhＧＨレベル及びタンパク質に対して標準化した。ＣＡＴ活性を、pＳＶ0対照キメラよりも平均して２倍ＣＡＴ活性が高い親のp（−127）ＣＡＴと相対的に表す。データは３回の別々の実験の平均± Ｓ.Ｅ.である。p（−127）ＣＡＴより統計的に有意の増加（Ｐ＜0.05）を星印で示す。図25Ｂにおいては、−127と−90bpの間のクラスＩＤＮＡ配列（ＣＲＥと呼ぶ）を、ＣＡＴ遺伝子にライゲートして記述されるように（Ｓhimura,Ｙ.et a l.(1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.269,31908-31914）ＦＲＴＬ−5細胞に形質移入したＳＶ40プロモーターを含む構築体の3′末端に導入した。これらの細胞を5％仔ウシ血清を加えた3Ｈ培地中に２日間維持した後ＣＡＴ活性を測定し、変換率をhＧＨレベル及びタンパク質に対して標準化した。ＣＲＥを含む構築体を図の左に図示する。矢印は存在するＣＲＥの方向及びコピー数を示す。ＣＲＥ部位が欠失している（ΔＣＲＥ）か、又は非パリンドローム（ＮＰＣＲＥ）形態（図25Ａ）に変異されている２種類の変異構築体も示す。ＣＡＴ活性は、最小ＳＶ40プロモータを含み、平均で44±5％である親のプロモーター構築体、pＣＡＴ、に対して相対的に示す。値は３回の別々の実験の平均±Ｓ.Ｅ.である。統計的に有意の減少をＰ＜0.05（^*）又はＰ＜0.01（^**）として示す。図26Ａ−26Ｂは、ＦＲＴＬ−5細胞のＴＳＨ処理が細胞抽出物と−168ないし− 1bp（Ｆr168;図９におけるヌクレオチド923ないし1190）のクラスＩプロモーターの5′−隣接領域との間での新規タンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を誘発することを示す。図26ＡはクラスＩ遺伝子プロモーターの5′隣接領域を図示するものである。全ての数字は、Ｇiuliani Ｃ.,et al(1995)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.270:1145 3-11462（これは、参照することによりここに組込まれる）に定義されるように＋1と命名される転写の出発点に対して相対的なものである。ＣＲＥ様配列は、ＣＡＡＴ及びＴＡＴＡボックス、エンハンサーＡ(ＥnＨ)、及びインターフェロン応答要素（ＩＲＥ）の位置と同様に、−107ないし−100塩基対（bp）に示される。電気泳動移動度シフト検定（ＥＭＳＡ）において用いられるＤＮＡ断片が示されている。図26Ｂにおいては、ＥＭＳＡを放射標識Ｆr168プローブを用いて行う。この放射標識Ｆr168は、5％血清を加えた3Ｈ培地中で６日の後、1×10^-10ＭＴＳＨが存在しない条件下（−）又は存在下（＋）において48時間維持されたＦＲＴＬ −5細胞に由来する抽出物と共にインキュベートしたものである。Ｆr168プローブを、抽出物単独(レーン1及び5)又は100倍過剰の非標識Ｆr168（レーン2及び6 ）、Ｆr127（図９におけるヌクレオチド964ないし1090）（レーン3及び7）、又はＣＲＥ−1、ＣＲＥ様部位を含む38bpサイレンサー（図９におけるヌクレオチド964ないし1001）（レーン4及び8）のいずれかの存在下においてインキュベートした。この実験及び記述すべきＣＲＥ−1を含む他の全ての実験においては、結果を違えることなく、それを3′末端の10ヌクレオチドまで広がる48塩基対（b p）の配列で置き換えることができる。タンパク質／ＤＮＡ複合体は文字ＡないしＧで示し、Ｆ及びＧはＴＳＨ処理細胞の抽出物にのみ存在する複合体を表す。図27Ａ−27Ｂは、ＭＨＣ5′−隣接領域の放射標識Ｆr168とタンパク質／ＤＮＡ複合体を形成する細胞抽出物の能力に対するＦＲＴＬ−5細胞のＭＭＩ及び／又はＴＳＨ処理の効果を示すものであり、このタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成は、(図27Ａ)ＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）インシュリン応答要素（図28Ｃ；Ｓhimu ra,Ｙ.,et al.(1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.269,31908-31914）の配列を有する非標識オリゴヌクレオチド（オリゴＴＩＦ）が存在しない条件下もしくは存在下におけるものであるか、又は（図27Ｂ）ＣＲＥの非パリンドローム変異を有する（ＮＰＣＲＥ）もしくは変異がない（ＣＲＥ−1）38bpの下流サイレンサーを含む非標識オリゴヌクレオチドが存在しない条件下もしくは存在下におけるものである。細胞を5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地（ＴＳＨ非含有）中に７日間維持し（レーン1；5Ｈ基本）、その時点で5mＭＭＭＩ（レーン2）、1×10^-10ＭＴＳＨ（レーン5）、又はその２つを一緒に（レーン4）添加して36時間後に抽出物を調製し、ＭＨＣ5′−隣接領域、−168bpないし＋1、の³²Ｐ−放射標識Ｆr168と共にインキュベートした。図27Ａにおいては、非標識競合体が存在しない条件下（レーン1、2、4、5）又は250倍過剰の、ＴＳＨＲインシュリン応答要素（オリゴＴＩＦ）もしくはＴＧインシュリン応答要素（オリゴＫ）の配列を有するオリゴヌクレオチドの存在下において、複合体の形成をＥＭＳＡによって評価した。図27Ｂにおいては、ＭＭＩ処理細胞に由来する抽出物との複合体の形成を、非標識競合体が存在しない条件下（レーン2）又は250倍過剰の、下流38bpサイレンサー（ＣＲＥ−1；レーン3）もしくはその非パリンドローム対応物（図25Ａに示されるＮＰＣＲＥ；レーン4）の配列を有するオリゴヌクレオチドの存在下において評価した。図27Ｂのレーン１はプローブ単独である。矢印は、その形成が細胞のＴＳＨ／ＭＭＩ処理によっては増大するが、オリゴＴＩＦ又はＣＲＥ−1のイン・ビトロ添加によっては阻害される複合体を示す。図28Ａ−28Ｃは、インシュリン応答性を失ってはいないＴＳＨＲインシュリン受容体要素の変異配列（Ｓhimura,Ｙ.,et al.,(1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.269:31908 -1914）（ＴＩＦ変異体2）を有するオリゴヌクレオチドを含むプラスミドによる同時形質移入を伴い、もしくは伴わずに、ＦＲＴＬ−5細胞に形質移入されたp（ −1100）ＣＡＴ又はp（−127）ＣＡＴのプロモーター活性に対するＭＭＩの効果を示す。ＤＥＡＥ−デキストラン法を用い、6Ｈ培地(＋ＴＳＨ)において成長させたＦＲＴＬ−5にＰＤ15′−隣接領域の異なる構築体とオリゴＴＩＦの変異体2 、ＴＳＨＲインシュリン応答要素（Ｓhimura,Ｙ.,et al.,(1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem . 269,31908-31914）の配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、もしくは含まないプラスミドとを同時形質移入した。12時間後、5mＭＭＭＩ（ＭＭＩ）を加えた、もしくは差し引いた新鮮な6Ｈ培地に培地を変え、36時間後にＣＡＴ活性を測定した。変換率及びタンパク質値を標準化した後、6Ｈ培地において維持し、オリゴヌクレオチドを含まないプラスミドを同時形質移入した細胞における−11 00（図28Ａ）又は127bp（図28Ｂ）の活性に100％の対照値を割り当てた（各枠における最初の白抜きの棒）。オリゴＴＩＦ変異体を含むオリゴヌクレオチドを同時形質移入した細胞の発現の差（各パネルの第２の白抜きの棒）を、ＭＭＩの存在しない条件下（白抜きの棒）又は存在下（点を打った棒）の両者において評価した。図28Ｃにおいて、変異体の配列及び活性がまとめられている。オリゴＴＩＦ変異体２は、野性型ＴＳＨＲと比較した場合、一本鎖結合活性は失っているがインシュリン応答性は保持している変異を有する(図28Ｃ;Ｓhimura,Ｙ.,et al.,(1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem . 269,31908-31914)。値は、各々２回行われた３回の異なる実験の平均±Ｓ.Ｅ. である。図28Ａ及び28Ｂにおいて、星印１つ（^*）はＭＭＩによって引き起こされた活性の有意の減少（Ｐ＜0.01）を示し、星印３つ（^***）はプロモーターの活性を減少させるＭＭＩの能力の有意の損失（Ｐ＜0.01）を示す。図28Ａにおいて、星印２つ（^**）はＭＭＩが存在しない条件下におけるオリゴヌクレオチドの同時形質移入によって引き起こされた基本プロモーター活性の増加（Ｐ＜0.05）を示す。図29Ａ−29Ｂは、ＴＳＨが存在しない条件下において、ＣＲＥ様配列、−127 ないし−90bpを含む38bpサイレンサー領域がＦＲＴＬ−5細胞に由来する抽出物と複数のタンパク質／ＤＮＡ複合体を形成し、そのうちの１つはＣＲＥＢであるものと思われることを示す。図29Ａは、さらに、それらの形成がＣＲＥ様配列、 −107ないし−100bp、及びＣＲＥに隣接する配列に依存することを示す。放射標識されたＣＲＥ−1と呼ばれる二本鎖38bpＤＮＡ断片、−127ないし−90bpを、5 ％仔ウシ血清を加えた3Ｈ培地において６日間維持したＦＲＴＬ−5細胞に由来する抽出物と共にインキュベートし、ＥＭＳＡにより複合体を分析した。図26Ａにおいては、複合体の形成を、示される非標識二本鎖オリゴヌクレオチド：ＣＲＥ −1、ＣＲＥ様配列を欠くΔＣＲＥ−1、及びコンセンサスＣＲＥ及びソマトスタチンプロモーターに由来する隣接残基を有するＰromega ＣＲＥの存在下もしくは存在しない条件下において評価した。競合体の量がプローブを上回る倍数で、その競合体の構造の図と共にゲルの組の各々の頂部に示されている。図26Ｂにおいては、示されるように、ＣＲＥＢ2、mＸＢＰ、ＡＴＦ2、又はＣＲＥＢ−327（それぞれ、レーン1−4）に対するウサギ抗血清２μlの存在下においてインキュベーションを行った。断続線は、ＣＲＥＢ−327抗体とのインキュベーションの結果生じた超シフト複合体を示す。文字は抽出物によって形成された複合体の群を表す。図26Ｂの実験におけるＡ複合体領域の分離の改善は、分離中に低ゲル濃度を用いることで達成した。図30Ａ−30Ｃは、ＣＲＥ様配列を有する38bpサイレンサー領域が、ＣＲＥＢに加えて、甲状腺転写因子−1（ＴＴＦ−1）及びＰax−8の両者と複合体を形成することを示し、さらに、それらの形成がポリ（dＩ−dＣ）濃度には依存しないことを示す。二本鎖の放射標識38bpＤＮＡ断片、−127ないし−90bp（ＣＲＥ−1）を、5 ％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地に６日間維持したＦＲＴＬ−5細胞に由来する抽出物と共にインキュベートし、3.0（図30Ｂ）及び0.5（図30Ａ）μg／mlポリ（dＩ −dＣ）においてＥＭＳＡにより複合体を分析した。図30Ａにおいては、複合体の形成を、示される非標識二本鎖オリゴヌクレオチド：CRE−1、ＣＲＥ様配列を欠くΔＣＲＥ−1、ＴＳＨＲ内にＴＴＦ−1要素を有するオリゴヌクレオチド、並びにＦＲＴＬ−5細胞におけるＴＴＦ−1結合及び活性を失ったそれらの変異体の存在下又は存在しない条件下において評価した。ＴＳＨＲＴＴＦ−1要素を含むオリゴヌクレオチド及びその変異体の配列は図30Ｃに示されている（Ｓhimura, Ｈ.,et al.,(1994)Ｍol.Ｅndocrinol.8,1049-1069;Ｏhmori,Ｍ.,et al.,(1995)Ｅndocrinology ,136,269-282）。このＴＳＨＲＴＴＦ−1部位はＰax−8を結合しない(Ｓhimura,Ｈ.,et al.,(1994)Ｍol.Ｅndocrinol.8,1049-1069；Ｏhmori, Ｍ.,et al.,(1995)Ｅndocrinology,136,269-282；Ｃivitareale,Ｄ.,et al.,(19 93)Ｍol.Ｅndocrinol.7,1589-1595)。図30Ｂにおいては、ＣＲＥ−1、ＴＳＨＲ内にＴＴＦ−1要素を有するオリゴヌクレオチド、及びＦＲＴＬ−5細胞におけるＴＴＦ−1結合及び活性を失ったそれらの変異体の存在下又は存在しない条件下において複合体の形成を再度評価した。加えて、ＴＴＦ−1及びＰax−8との相互作用が可能な部位（ＴＧオリゴＣと呼ぶ）を有するサイログロブリンプロモーター由来の二本鎖オリゴヌクレオチド、及びＦＲＴＬ−5細胞におけるＴＴＦ−1及びＰax−8結合及び活性を失ったそれらの変異体の存在下においてインキュベーションを行った。ＴＧオリゴＣ要素を含むオリゴヌクレオチド及びその変異体の配列は図30Ｃに示されている（Ｃivitareale,Ｄ.,et al.,(1989)ＥＭＢＯＪ.,2 537-2542；Ｇuazzi,Ｓ.,et al.,(1990)ＥＭＢＯＪ.9,631-3639；Ｆrancis-Ｌan g,Ｈ.,et al.,(1992)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,576-588；Ｚannini,Ｍ.,et al.,(199 2)Ｍol.Ｃell Ｂiol.12,4230-4241；Ｓhimura,Ｈ.,et al.,(1994)Ｍol.Ｅndocri nol. 8,1049-1069；Ｏhmori,Ｍ.,et al.,(1995)Ｅndocrinology,136,269-282）。各々の競合体の量はプローブの100倍過剰であった。文字は抽出物によって形成された複合体の群を表し、38bpサイレンサーとのＴＴＦ−1及びＰax−8含有複合体は阻害データに基づいて示す。図31Ａ−31Ｃは、ＣＲＥ様配列を含む38bpサイレンサー領域と共に形成されたＣ複合体がそのコーディング又は非コーディング鎖のいずれかと結合することが可能なタンパク質を含むものと思われることを示す（図31Ａ）。加えて、これらの図は、これらがＦＲＴＬ−5甲状腺細胞におけるＴＳＨＲ遺伝子の発現のＴＳＨ／cＡＭＰ抑制に重要な一本鎖結合タンパク質を含むように思われることを示す（図31B）。ＣＲＥ−1と呼ばれる、二本鎖放射標識38bpＤＮＡ断片、−127ないし−90bpを、5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地中に６日間維持したＦＲＴＬ−5 細胞に由来する抽出物と共にインキュベートし、0.5μg／mlポリ(dＩ−dＣ)中でＥＭＳＡにより複合体を分析した。(図31Ａ)においては、プローブの100倍過剰の、ＣＲＥ−1のコーディング及び非コーディング鎖を含む非標識一本鎖オリゴヌクレオチドの存在下又は存在しない条件下において複合体の形成を評価した。（図31Ｂ）においては、ＳＳＢＰと呼ばれる一本鎖結合タンパク質(Ｓhimura,Ｈ .,et al.(1995)Ｍol.Ｅndocrinol.,9,527-539)と結合するＴＳＨＲの非コーディング鎖に由来するオリゴヌクレオチド、及び甲状腺刺激ホルモン受容体サプレッサー要素タンパク質−1（ＴＳＥＰ−1）と呼ばれるＹ−ボックスタンパク質（図 38及び実施例11を参照）と結合するＴＳＨＲのコーディング鎖に由来する一本鎖オリゴヌクレオチドの存在下又は存在しない条件下において複合体の形成を評価した。これらはそれぞれオリゴＳＳＢＰ及びオリゴＴＳＥＰ−1と呼ばれ、それらの配列は図31Ｃに示されている。各々の非標識オリゴヌクレオチドの量がプローブを上回る倍数で示されている。記述されている方法(Ｄignam,Ｊ.,et al.,(1 983)Ｎucleic Ａcids Ｒes.11,1475-1489)の変形により細胞抽出物を作製した。反応混合物は、10mＭトリス−Ｃl（pＨ7.9）、1mＭＭgＣl₂、1mＭジチオトレイトール、1mＭエチレンジアミン四酢酸及び5％グリセロール中に1.5フェムトモルの［³²Ｐ］ＤＮＡ、３μgの細胞抽出物、及び0.5μgのポリ（dＩ−dＣ）を含むものであった。非標識二本鎖もしくは一本鎖オリゴヌクレオチドもこの結合反応物に競合体として添加し、標識ＤＮＡを添加する前に抽出物と共に20分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、反応混合物を、160Ｖ、1×ＴＢＥ中、4℃での４もしくは5％未変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に処した。図32Ａ−32Ｂは、ＣＲＥ様配列を含む38bpサイレンサー領域（ＣＲＥ−1）の一本鎖成分が、ＴＳＨＲ最小プロモーターのＹ−ボックスもしくはＴＳＨＲサプレッサー要素タンパク質−1(ＴＳＥＰ−1)(図32Ａ)及び一本鎖結合タンパク質(ＳＳＢＰ)（図32Ｂ）部位と結合するＦＲＴＬ−5甲状腺細胞抽出物中のタンパク質と複合体を形成することを示す。放射標識されたＣＲＥ−1と呼ばれる38bpＤＮＡ断片、−127ないし−90bpの一本鎖成分を、5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地中に６日間維持したＦＲＴＬ−5細胞に由来する抽出物と共にインキュベートし、図30 Ａ−Ｃに説明されるように0.5μg／mＬポリ（dＩ−dＣ）中でＥＭＳＡにより複合体を分析した。図32Ａにおいては、複合体の形成を、ＣＲＥ−1の放射標識コーディング鎖を用いて、プローブの100倍過剰の、ＴＳＨＲの３つのＴＳＥＰ−1 結合部位の各々の野性型(ＷＴ)及び変異配列を含む非標識一本鎖オリゴヌクレオチドの存在下又は存在しない条件下において評価した（実施例11を参照）。競合体オリゴヌクレオチドの配列及びＴＳＨＲ5′−隣接領域におけるそれらの位置はゲルの下に示されており、黒塗りの棒はＴＳＨＲにおける各部位によるＴＳＥＰ−1結合に重要であるものと思われるＣＣＴＣモチーフを表す（実施例11を参照）。各々の場合において、変異体１（ＭuＴ.1）オリゴヌクレオチドがＴＳＥＰ−1と結合するのに対して、変異体２（ＭuＴ.2）形態は結合活性を失っている（実施例11を参照）。オリゴＴＳＥＰ−1部位は、ＴＳＨＲＣＲＥの構造的エンハンサー活性を抑制することが知られているＴＳＨＲの直列型反復（ＴＲ）における5′の10ヌクレオチドの活性を説明する(Ｉkuyama,Ｓ.,et al.,(1992)Ｍol. Ｅndocrinol. 6,1701-1715;Ｓhimura,Ｈ.,et al.,(1993)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.268,241 25-24137)。ＴＳＨＲ5′−隣接領域のＴＲ及びＣＲＥ部位が示されている。（図 32Ｂ）においては、ＣＲＥ−1の放射標識非コーディング鎖を用いて、プローブの100倍過剰の、ＴＳＨＲ5′−隣接領域の非コーディング鎖上のＳＳＢＰ結合部位の野性型（ＷＴ）及び変異配列を含む非標識一本鎖オリゴヌクレオチドの存在下又は存在しない条件下において複合体の形成を評価した。ＳＳＢＰは、ＴＳＨＲ5′の非コーディング鎖上のＴＴＦ−1部位に隣接する二本鎖の部位に結合し、示される変異はＳＳＢＰ結合及び活性を排除するが、ＴＴＦ−1結合及び活性は排除しない(Ｓhimura,Ｈ.,et al.,(1994)Ｍol.Ｅndocrinol.8,1049-1069;Ｏhmor i,Ｍ.,et al.,(1995)Ｅndocrinology,136,269-282;Ｓhimura,Ｈ.,et al.,(1995)Ｍol.Ｅndocrinol. ,9,527.539)。図33は、ＦＲＴＬ−5細胞のＴＳＨ処理がＣＲＥ様配列を含むクラスＩ 38bpサイレンサー領域へのＣＲＥＢ及びＴＴＦ−1の結合を減少させ、ＴＳＥＰ−1及びＳＳＢＰとのタンパク質／ＤＮＡ複合体を含むＣ複合体の形成の相対的な増加を引き起こすことを示す。放射標識されたＣＲＥ−1と呼ばれる二本鎖38bpＤＮＡ断片、−127ないし−90bpを、5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地中に６日間維持したＦＲＴＬ−5細胞に由来する抽出物と共にインキュベートし、次いで同じ培地又は1×10^-10ＭＴＳＨを加えた同じ培地でさらに16時間処理した。インキュベーションは、ＣＲＥＢ−327に対するウサギ抗血清２μlの存在下又は存在しない条件下において行った。図29、30、31及び32に説明される通りではあるが３μg／m lポリ（dＩ−dＣ）の存在下において、ＥＭＳＡにより複合体を分析した。Ａ、Ｂ、及びＣ複合体領域が示されており（図29、30、31及び32）、Ａ領域はＣＲＥＢ及びＰax−8との、ＢはＴＴＦ−1との、並びにＣはＴＳＥＰ−1及びＳＳＢＰとの複合体を含む（図29、30、31及び32）。図34Ａ−34Ｂは、放射標識Ｆr168、−168ないし＋1bp（図34Ａ）又は放射標識 Fr127、−127ないし＋1bp（図34Ｂ）とのＴＳＨ誘発タンパク質／ＤＮＡ複合体の形成に対するオリゴＴＩＦ（Ｓhimura,Ｙ.et al.,(1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.,269 :31908-3194；図32）、ＴＳＨＲ上のＴＳＥＰ−1結合部位の１つ、の効果を示す。ＦＲＴＬ−5細胞を5％仔ウシ血清を含む5Ｈ培地中に６日間維持し、その時点で新鮮な5Ｈ培地又は1×10^-10ＭＴＳＨを含む5Ｈ培地（6Ｈ）を36時間添加した。細胞抽出物を調製し、ＭＨＣ5′−隣接領域の³²Ｐ−放射標識Ｆr168（図34Ａ）又はＦr127（図34Ｂ）と共にインキュベートしてＥＭＳＡにより評価した。二本鎖オリゴＴＩＦ、ＴＳＨＲ上のＴＳＥＰ−1結合部位又はそれらの変異体（図3 2）の存在下又は存在しない条件下においてさらにインキュベーションを行った。この変異体のうちの１つ、ＴＩＦＭut−2は、ＣＣＴＣ結合モチーフにおける変異生成のためにＴＳＥＰ−1結合活性を失っている。（図34Ｂ）において、我々はさらに、ＴＴＦ−1又はＰax−8と結合することが可能なＴＧプロモーターに由来するオリゴヌクレオチドはＴＳＨ誘発複合体（陰性対照）の形成を妨げることがなく、これに対してＣＲＥ−1はＴＳＨ誘発複合体の形成を阻害することを示す。図35Ａ−35Ｃは、異種プロモーターに結合する際の、5′隣接配列(Ａ)の1100b pにわたる一連の欠失変異体又はＣＲＥを含む38bpサイレンサー領域のクラスＩ遺伝子プロモーター活性に対する10μmフォルスコリンの効果を示す。（図35Ａ）においては、ＦＲＴＬ−5細胞を75％集密まで成長させた後、5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地に６日間維持した。細胞を6Ｈ培地に12時間戻し、電気穿孔法により、ブタクラスＩプロモーターp（−1100）ＣＡＴの5′−隣接領域の1100bpを含むＣＡＴキメラ又はp（−1100）ＣＡＴの5′−欠失を形質移入した。各々の欠失はその5′残基の位置で示される。さらに12時間後、10μＭフォルスコリンの存在下又は存在しない条件下において培地を新鮮な5Ｈ培地に替えた。36時間後にＣＡＴ活性を検定し、変換率をhＧＨレベル及びタンパク質に対して標準化した。結果はpＳＶ0に対して相対的に表す。このpＳＶ0はプロモータがなく培地中にフォルスコリンを含まない親ＣＡＴベクターであり、その活性は100％に設定されている。値は３回の実験の平均±Ｓ.Ｅ.であり、Ｐ＜0.05（^*）又はＰ＜0.01（^* ^* ）での統計的に有意の増加又は減少が示されている。（図35Ｂ）においては、細胞を同様に扱いはしたが、図35Ｃに示されるように１もしくは２コピーの38bp サイレンサーを含むpＣＡＴプロモーターを形質移入した。さらに12時間後、10 μＭフォルスコリンの存在下又は存在しない条件下において培地を新鮮な5Ｈ培地に替え、ＣＡＴ活性を36時間後に検定し、上述の通り変換率を標準化して結果を親pＣＡＴプロモーターに対して相対的に表した。このpＣＡＴプロモーターは、インサートを含まず、かつ培地中にフォルスコリンを含まないベクターであり、その活性は100％に設定されている。値は３回の実験の平均±Ｓ.Ｅ.であり、Ｐ＜0.05（^*）でのフォルスコリンの統計的に有意の効果が示されている。図35 Ｂにおいて、フォルスコリンの作用は1×10^-10ＭＴＳＨ及び5mＭＭＭＩのいずれかにより繰り返されている。図36は、ＴＳＨ誘発複合体の形成が−90ないし−1bpの要素のＤＮＡ配列に依存することを示す。ＦＲＴＬ−5細胞を5％仔ウシ血清を含む5Ｈ培地中に６日間維持し、その時点で新鮮な5Ｈ培地又は1×10^-10ＭＴＳＨを含む5Ｈ培地（6Ｈ）を36時間添加した。細胞抽出物を調製し、³²Ｐ−放射標識されたＭＨＣ5′−隣接領域のＦr127と共にインキュベートしてＥＭＳＡにより評価した。プローブを示される倍数上回る濃度での非標識Ｆr127、Ｆr89、又はＣＲＥ−1（陽性対照）の存在下又は存在しない条件下において、さらにインキュベーションを行った。図37Ａ−37Ｄは、ＭＨＣ5′−隣接領域の放射標識Ｆr168とのＭＭＩ誘発タンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を妨げる非標識Ｆr140の能力（図37Ａ）及び38bp下流サイレンサーとの複合体形成を妨げるオリゴヌクレオチドＥ9、上流エンハンサー（図17Ａ）の特異的インヒビターの能力（図37Ｂ）を示す。図37Ａにおいては、ＦＲＴＬ−5細胞を5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地（ＴＳＨ非含有）中に７日間維持し、その時点で5mＭＭＭＩ（5ＨＭＭＩ＋）又は1×10^-10ＭＴＳＨを加えた5mＭＭＭＩ（5ＨＭＭＩ／ＴＳＨ＋）を36時間添加した。細胞抽出物を調製して放射標識されたＭＨＣ5′−隣接領域のＦr168、−168bpないし転写の開始点(＋1)と共にインキュベートし、非標識競合体が存在しない条件下（第１及び第３レーン）又は250倍過剰の非標識Ｆr140の存在下（第２レーン）においてＥＭＳＡにより複合体の形成を評価した。矢印は、その形成が細胞のＴＳＨ／ＭＭＩ処理によって増加するが、オリゴＴＩＦ又はＣＲＥ−1のイン・ビトロ添加によって阻害される複合体を示す（図34を参照）。（図37Ｂ）においては、5％仔ウシ血清を加えた5Ｈ培地（ＴＳＨ非含有）中に７日間維持されたＦＲＴＬ−5 細胞に由来する抽出物を放射標識38bp下流サイレンサー（ＣＲＥ−1、図37Ｃに図示）と共にインキュベートした。インキュベーションは250倍過剰の示される非標識オリゴヌクレオチドの存在下又は存在しない条件下において行った。a及びbを示す矢印は、それぞれ、下流サイレンサーとのＴＴＦ−1及びＴＳＥＰ−1 ／ＳＳＢＰ複合体を同定する。サイレンサー及びエンハンサーの両者の形成を阻害するオリゴヌクレオチドＳ6（図17Ａ）及びエンハンサーのみの形成を阻害するＥ9（図17Ａ）は、ＣＲＥ−1と同様に、両複合体の形成を低減させる(それぞれ、レーン４及び８対３;図37Ｂ)。図３８Ａ−３８Ｂ’は、ＴＳＨＲの５’デカヌクレオチドのタンデムリピート（ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ）と反応するサプレッサータンパク質について、甲状腺細胞発現ライブラリーをスクリーニングすることによって得られたクローン９、３１および４０から誘導されたＴＳＥＰ−１ヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を示している。ラットのＴＳＥＰ−１ｃＤＮＡおよびそれぞれのクローンの起源を図３８Ａに示しており；四角囲いはコード領域を示す。ＴＳＥＰ−１のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を、図３８Ｂに示す。ヌクレオチド配列は、ＴＳＥＰ−１タンパク質の開始コドンから番号付けされている。実線の下線は、６つの可能な核局在化シグナル（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ）を示す。ラットのＴＳＨＲ最小プロモーター内の５’ −デカヌクレオチドのコード配列と結合でき、さらにそれと結合することによってサプレッサーとして機能するであろう、タンパク質をコードするｃＤＮＡ（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．，ら、１９９２、ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２４１２５−２４１３７）を単離するために、サウスウエスタン法（Ｖｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．ら、１９８８、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，２，８０１−８０６）およびＴＲ２、ｓｓＴＲ２（＋）のコード鎖を示す放射標識した合成オリゴヌクレオチド（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２４１２−２４１３７）を用いて、ラットのＦＲＴＬ−５細胞発現ライブラリーをスクリーニングした（Ａｋａｍｉｚｕ，Ｔ．ら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７，５６７７−５６８１）。ＴＲ２は、ラットのＴＳＨＲプロモーターの−１７７から−１３ｂｐに及び、５’−及びび３’−の両側にタンデムリピート（ＴＲ）のデカヌクレオチドを含み、さらにＴＲの５’側のＣＴに富むドメイン内にまでおよぶ（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２４１２５−２４１３７）。タンパク質は、ＴＳＨＲの遺伝子発現においてそのタンパク質が持つ機能的役割に従って、ＴＳＨＲサプレッサーエレメント−結合タンパク質−１またはＴＳＥＰ−１と命名された（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：２４１２５−２４１３７）。オーバーラップする配列を持つ３つのクローンを、ＴＳＥＰ−１の候補として同定した。クローン４０（１４０５ｂｐ）は、３２２アミノ酸からなるオープンリーディングフレームを持つタンパク質をコードしていた（図３８Ａ）。クローン９（８６４ｂｐ）は、１１７ｂｐの５’−フランキング領域、ＡＴＧ開始コドン、およびクローン４０（図３８Ａ）に示したオープンリーディングフレームのＮ−末端部分を含んでいた。クローン３１（１３９０ｂｐ）は、全長に近いオープンリーディングフレームおよびポリ（Ａ）シグナルを含むクローン４０の３’−非コード領域を含んでいた（図３８Ａ）。ｃＤＮＡをクローン９から誘導し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子と融合させ、さらに、ＩＰＴＧによって形質転換された細菌宿主内に導入した。得られたｃＤＮＡは、ＴＲ２のコード鎖［sｓＴＲ２（＋）］と非常に強くハイブリダイズしたが、非コード鎖である［ｓｓＴＲ２（−）］または二本鎖のＴＲ２とは非常に弱くしかハイブリダイズしなかった。このｃＤＮＡは、−１５３から−１１４におよび、ＴＲの３’−デカヌクレオチド＋ＣＲＥ様配列（−１３９から− １３２ｂｐ）を包含する、一本鎖または二本鎖のＴＲ１ＣＲＥとはハイブリダイズしなかった（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２４１２５−２４１３７）。クローン化されたｃＤＮＡが、甲状腺レセプター（ＴＲ）の５’デカヌクレオチドのコード鎖と相互作用するタンパク質をコードすることは、精製された組換えタンパク質を用いた実験により確認される。このｃＤＮＡがサプレッサーであることは、トランスフェクション実験によって立証される。図３９Ａ−３９Ｃは、ラットのＹ−ｂｏｘタンパク質をコードするｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１と共にＴＲＦ甲状腺細胞内にコトランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した後の、ＴＲのそれぞれのデカヌクレオチドの突然変異によるＣＡＴ活性への影響を示している。ＴＲのデカヌクレオチドの突然変異は、野生型のプロモーター配列ならびにそれぞれのデカヌクレオチドおよびＴＳＨＲのＣＲＥ様部位の位置と同様に、図３９Ａに示されている。図３９Ｂは、代表的実験でのラットのデータを示し；図３９Ｃは、ＣＡＴ活性がｐ８ＣＡＴプロモーター−レスコントロール（ｌｅｓｓｃｏｎｔｒｏｌ）の活性と比例することを示し、その活性は、任意に一体化される。すべての細胞は、ｐＳＶＧＨと共にコトランスフェクトし、転化速度（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅ）は成長ホルモン（ＧＨ）レベルで標準化した。プラスｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１（黒色棒）またはその対照、ＴＳＥＰ−１発現ベクターを構築するために用いられるｐＲｃ／ＣＭＶ（白色棒）、を示すＴＳＨＲプロモーター−ＣＡＴキメラでトランスフェクションした後４８時間に、細胞溶菌液を調製した。図３９Ｃの活性は、別々に行った４回の実験から得られた平均値±Ｓ．Ｅ．である。Ｙ−ｂｏｘ（ＴＳＥＰ−１）誘導による有意のＣＡＴ活性の減少（ｐ＜０．０１）を、２つ星で示す。５’デカヌクレオチドの変異は、Ｍｔ−１またはＭｔ−２であり、結果としてＴＳＥＰ−１によるＴＳＨＲの抑制が失われる。図４０Ａ−Ａ’−４０Ｄ−Ｄ’は、ＦＲＴＬ−５またはＦＲＴ細胞内で、下流（Ｓ−ｂｏｘ）または上流（ＴＩＦ−関連）Ｙ−ｂｏｘ結合部位を含むＴＳＨＲプロモーター−ＣＡＴキメラの発現を抑制するｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１の能力を示す。図４０Ａでは、ＴＳＨＲプロモーターキメラ、ｐＴＲＣＡＴ５’−２２０（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３１９０８−３１９１４）を、ｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１（白色棒）またはその対照プラスミドであるｐＲｃ／ＣＭＶのいずれかと共にＦＲＴＬ−５細胞内にコトランスフェクトした。すべての細胞は、プラスミドｐＳＶＧＨと共にコトランスフェクトされ；細胞溶解液をトランスフェクション後７２時間で調製し、そして転化速度をＧＨレベルで標準化した。パネル上部では、ＣＡＴ活性がｐ８ＣＡＴプロモーターの活性と比例することを示し（レスコントロール）、その活性は任意に一体化される；下部では、ＣＡＴ活性を、ＴＳＥＰ−１ベクター／対照ベクター［ＴＳＥＰ（＋）／ＴＳＥＰ（−）］の存在下での活性比率として示している。ｐ８ＣＡＴ対照と比較した場合のＹ−ｂｏｘ（ＴＳＥＰ−１）の誘導による有意のＣＡＴ活性の減少を一つ星（ｐ＜０．０５）で示す。図４０Ｂおよび図４０Ｃでは、コトランスフェクションをＦＲＴＬ−５（図４０Ｂ）またはＲＦＴ細胞（図４０Ｃ）に行った場合の、ｐＴＲＣＡＴ５’−１７７、５’−１４６、５’−１３１、５’−９０またはｐ８ＣＡＴ対照のＣＡＴ活性を、ｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１またはそのｐＲｃ／ＣＭＶ対照［ＴＳＥＰ（＋）／ＴＳＥＰ（−）］と共にコトランスフェクトされた細胞内での活性比率として示している。すべての細胞は、プラスミドｐＳＶＧＨと共にコトランスフェクションした。細胞溶解液は、ＦＲＴ細胞の場合には、トランスフェクション後４８時間、ＦＲＴＬ− ５細胞ではトランスフェクション後７２時間に調製され；転化速度をＧＨレベルに標準化した。ｐ８ＣＡＴ対照と比較した場合の、ＴＳＥＰ−１誘導による有意のＣＡＴ活性の減少を、一つ星で示す（ｐ＜０．０５）。図４０Ｄでは、ＰｒｏｍｅｇａからのｐＣＡＴ−プロモータープラスミドへのＴＳＨＲインスリン応答エレメントの配列、−２２０から−１８８ｂｐ（Ｓｈｉｍｕｒａａ，Ｙ．ら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，３１９０８−３１９１４）、を含むオリゴヌクレオチドＴＩＦを連結することによって、キメラを作り出した。構築物は、インスリン応答因子配列の方向および数を示す矢印および（＋）印で、図式に示す。ＴＩＦキメラ又はｐＣＡＴ対照は、ＦＲＴＬ−５細胞内にｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１又はそのｐＲｃ／ＣＭＶ対照と共にコトランスフェクションし、そしてＣＡＴ活性を上記の方法に従って分析した。図４０Ｄ底部では、Ｙ− ｂｏｘ（ＴＳＥＰ−１）活性［ＴＳＥＰ−１（＋）］は、ｐＲｃ／ＣＭＶ対照トランスフェクション［ＴＳＥＰ−１（−）］の活性に比例して発現する。ｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１によって影響を受ける減少は、有意である（ｐ＜０．０２）。ＣＡＴ比活性を示す全実験で活性は、別々に行われた３回の実験から得られた平均値±Ｓ．Ｅ．で示される。図４１Ａ−４１Ｄは、ＭＨＣクラスＩプロモーターの下流サイレンサー（図４１Ａ）、インターフェロン応答エレメントとの関係（図４１Ａ）、その役割ならびに下流サイレンサー活性のモジュレーターとしての転写因子、ＴＴＦ−１およびＴＳＥＰ−１の作用との関係におけるＴＳＨおよび／またはＭＭＩによる抑制（図４１Ｂ−４１Ｄ）を示す。ＣＲＥを含む下流サイレンサーを図４１Ａに示す。サイレンサーとしてのその活性は、図２６Ａ−Ｂに示すように、ＣＲＥが変異または欠失する場合には失われる。図２６および２７に示すように、ＥＭＳＡは、ラットのＦＲＴＬ−５細胞のＴＳＨおよび／またはＭＭＩ処理が、図４１Ｂに示すようなクラスＩプロモーターの１６８ｂｐのプローブ、−１６８から＋１ｂｐ、との特異的なＤＮＡ複合体（矢印）の形成を増加させることを示す。複合体の形成は、インビトロでの結合反応にＴＳＨＲインスリン応答要素、オリゴＴＩＦ（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、１９９４、Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２６９，３１９０８−３１９１４）を含む（列５）ことによって、妨げられるが、チログロブリンインスリン応答要素、オリゴＫを含むことによっては妨げられない（図４１Ｂに示す；図２７Ａも参照のこと）。複合体は、ＣＲＥの非回文式変異（ｎｏｎｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｍｕｔａｔｉｏｎ）、ＮＰＣＲＥを有する１６８ｂｐのプローブを用いては、形成されない（図４１Ｂ、列６；図２７Ｂ）。下流サイレンサーを含む１２７ｂｐのクラスＩプロモーター−ＣＡＴキメラのプロモーター活性は、ＭＭＩによって減少する（図４１Ｃ）。ＭＭＩの影響は、オリゴＴＩＦがｐ（−１２７）ＣＡＴキメラと共にコトランスフェクトされた場合には失われるが、オリゴＫがコトランスフェクトされた場合には失われない（図４１Ｃに示す；図１９Ｂおよび２８Ｂも参照のこと）。ＴＴＦ−１をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドと共にコトランスフェクションすると、活性が増加するが、ＴＳＥＰ−１をコードするｃＤＮＡを持つプラスミドと共にコトランスフェクションすると、プロモーター活性が減少する（図４１Ｃ）。サイレンサーは、図４１Ｄに要約したように、図２９、３０、３１および３３での複合体形成によって証明されるように、多数のタンパク質と相互作用し；これらのそれぞれは、下流サイレンサーと結合するために完全なＣＲＥを必要とする（図４１Ｄ）。これらは、純粋タンパク質との直接結合反応による、またはそれらを結合することが知られているオリゴヌクレオチド：ＴＴＦ−１、ＣＲＥＢ、Ｐａｘ−８、ＳＳＢＰ、およびＴＳＥＰ−１（Ｙ−ｂｏｘタンパク質）：との競合による、抗体シフト分析を用いて同定される。これらの内の二つ、ＴＴＦ−１およびＴＳＥＰ− １、との複合体形成は、それぞれ、ＴＳＨによって増加、またはＴＳＨによって減少する（図３３）。このように、ＴＴＦ−１複合体形成の減少により、ＴＳＨは、ＴＴＦ−１のエンハンサー作用を減少させることによクラス１の発現を減少させるであろう（図４１Ｃ）。ＴＳＥＰ−１複合体形成の増加により、ＴＳＨは、そのサプレッサー機能を増加させ（図４１Ｄ）、そしてクラスＩの発現を減少させるであろう。ＭＭＩは、ＴＳＨと同様に、これらの転写因子のそれぞれに影響を与える。発明の詳細な説明本発明をより完璧に理解する目的のために、以下の定義をここに記載する。哺乳動物とは、限定するわけではないが、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジおよびヤギを含む。薬剤とは、限定するわけではないが、ＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体、ＣＢＺ、ＰＴＵ、チオウレイレン（ｔｈｉｏｕｒｅｙｌｅｎｅ）、チオンおよびチオンアミドを含む。その他の候補薬剤には、アミノチアゾール、１，１，３−トリシアノ−２−アミノ−１−プロペン、フェナゾン、チオウレア、チオウレア誘導体、ゴイトリン（ｇｏｉｔｒｉｎ）誘導体、チオウラシル誘導体、スルホンアミド、アニリン誘導体、過塩素酸誘導体、ヨウ化物、チオシアネート、カルブタミド、パラ−アミノ安息香酸、パラ−アミノサリチル酸、アムフェノン（ａｍｐｈｅｎｏｎｅ）Ｂ、レゾルシノール、フロログルシノール、および２−４−ジヒドロ安息香酸が含まれ、それらのすべてがゴイトリノーゲン活性を持ち、甲状腺機能を抑制することは注目に値する。当業者らは、実施例２から１１に記載のインビボおよびインビトロでのアッセイで、それ以外の薬剤が開発されることもまた、理解するであろう。これらの薬剤は、その起源が天然のものであっても、合成または組み換えによるものであっても良い。クラス１ＭＨＣ分子の発現を抑制する能力を持つ薬剤とは、薬剤で処理していない哺乳動物細胞と比較して、薬剤で処理した哺乳動物細胞上のＭＨＣクラスＩ細胞表面分子を減少させるまたは排除する能力を持つ薬剤を意味する。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）とは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む異なる種に記載された組織適合性抗原システムを包含することを意味する一般名称である。組織とは、限定するわけではないが、単一細胞、細胞、器官全体およびその部分を含む。移植拒絶反応とは、限定するわけではないが、対宿主性移植片病（ｇｒａｆｔｖｅｒｓｕｓｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅ）および対移植片性宿主病（ｈｏｓｔｖｅｒｓｕｓｇｒａｆｔｄｉｓｅａｓｅ）を含む。自己免疫疾患は、これらに限定されるわけではないが、自己免疫機能不全および自己免疫障害を含む。機能的均等物とは、均等である物質として、実質的に同一の活性を持つ任意の物質を意味する。例として、物質には、限定するつもりはないが、核酸配列、遺伝子、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質が含まれて良い。本発明は、自己免疫疾患を治療する方法、および移植レシピエント内での組織の拒絶反応を予防するまたは治療する方法を提供する。さらに具体的には、本発明は、クラスＩＭＨＣ分子の発現を制御する能力を持つ一つの薬剤または複数の薬剤を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する方法に関する。この方法で治療できる自己免疫疾患の例としては、これらに限定されるわけではないが、慢性関節リューマチ、乾癬、若年型糖尿病、原発性特発性粘液水腫（ｐｒｉｍａｒｙｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｍｙｘｅｄｅｍａ）、全身性エリテマトーデス、ド・ケルヴァン甲状腺炎、甲状腺炎、自己免疫性ぜん息、重症筋無力症、強皮症、慢性肝炎、アディソン病、性機能低下症、悪性貧血、白斑、円形脱毛症、異所性皮膚炎（ｅｃｏｐｉｃｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、コエリアック病（Ｃｏｅｌｉａｃｄｉｓｅａｓｅ）、自己免疫性腸炎症候群（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙｓｙｎｄｒｏｍｅ）、特発性トロンボシチン性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｉｃｐｕｒｐｕｒａ）、後天性脾萎縮症（ａｃｑｕｉｒｅｄｓｐｌｅｎｉｃａｔｒｏｐｈｙ）、特発性尿崩症、抗精子抗体による不妊症、突然の聴力損失、感覚神経性聴力損失、シェーグレン症候群、筋炎、多発性筋炎、多発性硬化症のような自己免疫性脱髄疾患、横断骨髄炎、失調性硬化症（ａｔａｘｉｃｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、天疱瘡、進行性全身性硬化症、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎、慢性肝炎、溶血性貧血、進行性全身性硬化症、糸球体腎炎および特発性顔面神経麻痺が含まれる。この方法によって自己免疫疾患を治療するための望ましい薬剤は、ＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体、ＣＢＺ、およびＰＴＵである。望ましい実施態様では、自己免疫疾患に罹患した哺乳動物、望ましくはヒトに、クラスＩＭＨＣ抑制薬剤、ＭＭＩ、を投与する。治療に適当なＭＭＩ量は、一日当たり約０．０１ｍｇから約５００ｍｇの範囲である。望ましい投与量は、一日当たり約０．１ｍｇから約１００ｍｇであり、より望ましい投与量は、一日当たり約２．５−５０ｍｇである。治療に適当なＣＢＺ量は、ＭＭＩと同じ範囲である。投薬は、毎日、８時間間隔で、または朝食、昼食およびタ食と共に、おおよそ等量に分割した量で投与することができる。大人での望ましい維持投薬量は、最大で１年間、一日当たり５−１５ｍｇである。治療は、最大で１年間、例えば一日当たり約２．５−３０ｍｇ、続けることができる。別の方法として、治療は、例えば、開始時には一日当たり５０−１００ｍｇ、その後、個体が受容したそのような治療での甲状腺ホルモン［チロキシン（Ｔ₄）またはトリヨウ素チロニン（Ｔ₃）］または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のレベルに応じて、４から１０週間内、一日当たり５−１０ｍｇに減らして、続けることができる。代わりに、ＰＴＵを、自己免疫疾患に罹患した哺乳動物、望ましくはヒトに投与する。治療に適当なＰＴＵ量は、一日当たり０．１ｍｇ−２０００ｍｇの範囲でもよい。望ましいＰＴＵ投与量は、ＭＭＩに関して上に記載した投与量の範囲より１０倍高い範囲の内である。望ましいＰＴＵの維持投与量は、子供では、０．４ｍｇ／ｋｇであり、最初は８時間間隔で毎日３回に分けて投与され、その後は、望ましく維持するために初期投与の半量である。当業者は、自己免疫疾患に罹患した哺乳動物に投与する投与量は、哺乳動物の年齢、病気の重さ、および治療経過に応じて変えることができることを理解している。当業者らは、罹患した哺乳動物に適当な投与量を決定する数値を求めるための臨床パラメータを知るであろう。その他の望ましい実施態様では、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に罹患した、哺乳動物、望ましくはヒトに、ＭＭＩを投与する。治療に望ましい量は、約２．５−５０ｍｇ／日の範囲であり、６−１２月以上投与されるが、さらに、投与期間と同期間投与を中止する不連続治療で、５年以上の期間または必要な限り、投与することができる。別の方法として、ＳＬＥの最近の治療法、ハイドロコルチゾンおよび細胞毒性薬剤と共に、ＭＭＩを投与し、疾病を抑えることもできる。乳癌を持つＳＬＥ患者は、継続中のＳＬＥ治療によってすでに免疫抑制されているので、放射能治療で治療することは容易にはできない。また、ＳＬＥは、放射線合併症に対する異常な感受性を伴い、それ故、放射能治療は病気を悪化させるであろう。乳癌を持つＳＬＥ個体の治療にＭＭＩを用いると、患者の病状の悪化または放射線合併症を伴わずに、それぞれの患者に放射線治療を行うことが可能になるであろうと、期待される。その他の実施態様では、クラスＩＭＨＣ抑制薬剤は、動物の血清中の甲状腺自己抗体の発生に関連する自己免疫疾患に罹患した哺乳動物、望ましくはヒトに投与される。その他の実施態様では、クラスＩＭＨＣ抑制薬剤は、レセプター自己抗体の発生を特徴とする自己免疫疾患に罹患した哺乳動物、望ましくはヒトに投与される。例えば、自己免疫性ぜん息は、β−アドレナリンレセプター自己抗体と関連する。クラスＩＭＨＣ抑制剤、望ましくはＭＭＩ、での治療は、病気を緩和するであろう。そのような自己免疫病のその他の例として、重症筋無力症がある。重症筋無力症は、アセチルコリンレセプター自己抗体と関連する。重症筋無力症に罹患した個人は、甲状腺自己免疫症の頻度がより高い。ＴＳＨとアセチルコリンのレセプターの間の構造的および機能的関係故に、重症筋無力症に罹患した動物、望ましくはヒトのクラスＩＭＨＣ抑制剤での治療は、病気の抑制を助けるであろう。哺乳動物の種の全ＭＨＣ座は、多数の遺伝子を含み、多型性が高い。ヒトのＨＬＡ複合体には、クラスＩＨＬＡ分子をコードするＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ならびにクラス11分子をコードするＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰ遺伝子を含む。異なるＨＬＡ分子は、別々の抗原と結合する。特定のＨＬＡ抗原は、特定の病気にかかりやすい体質と関連していた。例えば、強直性脊椎炎はＨＬＡ−Ｂ２７と関連し、慢性関節リウマチはＨＬＡ −ＤＲ４と、そしてインスリン−依存性糖尿病はＨＬＡ−ＤＲ３およびＨＬＡ− ＤＲ４と関連する（”ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｐ．およびＴｅｒｒ，Ａ．Ｉ．編、ＡｐｐｅｌｔｏｎａｎｄＬａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ／ＳａｎＭａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。インスリン−依存性糖尿病は、ＨＬＡ−ＤＲ２とは関連しない（”ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｐ．およびＴｅｒｒ，Ａ．Ｉ．編、ＡｐｐｅｌｔｏｎａｎｄＬａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｄ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ／ＳａｎＭａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が、病気の発現は、ＨＬＡ複合遺伝子に近いその染色体塩基ゆえに、インスリン応答要素− Ａ結合タンパク質（ＩＲＥ−ＡＢＰ）に連結している。ＨＬＡ−Ｂ３５（−）、クラスＩハプロタイプ、の個人は、強皮症を発症する危険性が低い。強皮症を発症するＨＬＡ−Ｂ３５（＋）の個人の内、８０％は、甲状腺自己免疫病を発症する、および／または甲状腺抗体を発生するであろう。さらに、これらの個人は、急速に病気の進行するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症に特に罹りやすい（Ｋａｐｌａｎ，Ｃ．ら、１９９０、Ｈｕｍ．Ｈｅｒｅｄ．，４０：２９０−２９８；Ｃｒｕｓｅ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９１、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，５９：３２４−３２８；Ｉｔｅｓｃｕ，Ｓ．ら、１９９１、Ｊ．ｏｆＡｃｑｕｉｒｅｄＩｍｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙｎｄｒｏｍｅ，５：３７−４５；Ｓｃｏｒｚａ，Ｒ．ら、１９８８、ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２：７３−７９）。クラスＩＭＨＣ抑制剤は、強皮症症候群を緩和するのみならず、ＨＩＶの進行をもまた緩和し、これらの個人のより良い予後を可能にするはずである。望ましい実施態様では、ＨＩＶに罹患した個人を治療するために用いられるクラスＩＭＨＣ抑制剤は、ＭＭＩである。治療に望ましい量は、約５−５０ｍｇ／日の範囲である。その他の実施態様では、ＭＭＩは、自己免疫疾患の治療の補助療法として、自己免疫疾患に罹患した哺乳動物、望ましくはヒトに、投与される。例えば、ド・ケルヴァン甲状腺炎は、最近では、ハイドロコルチゾンまたはサリチル酸塩で治療され；ハイドロコルチゾンまたはサリチル酸塩にＭＭＩを加えることは、病気をより効率的に抑制するであろうと予想される。その他の実施態様では、ＭＭＩおよび甲状腺ホルモンを、そのような治療を必要とする哺乳動物に共に投与し、そうすることによって、ＭＭＩによる甲状腺ホルモン生成の抑制を補う。甲状腺ホルモンチロキシン（Ｔ₄）またはトリヨードチロニン（Ｔ₃）をＭＭＩと共に投与することができる；チロキシンをＭＭＩと共に投与することが望ましい。望ましいチロキシン投与量は約０．０１から０．５ｍｇ／日、より望ましい投与量は約０．１から０．３ｍｇ／日である。また、本発明の方法は、レシピエントの哺乳動物、望ましくはヒト内の移植組織の拒絶反応を予防または治療するためにも適当である。移植することのできる組織の例としては、限定するつもりはないが、心臓、肺、腎臓、骨髄、皮膚、膵臓ランゲルハンス島細胞、甲状腺、肝臓および全内分泌組織、神経組織、筋肉、繊維芽細胞、脂肪細胞、および造血肝細胞が含まれる。望まし実施態様では、膵臓ランゲルハンス島細胞は、ドナーから単離され、そして糖尿病に罹患したレシピエント内に移植する前に、ＭＭＩで処理される。糖尿病は、自己免疫疾患の結果として、ランゲルハンス島細胞の損失を原因として起こる。ランゲルハンス島細胞の移植は、そのような欠失を修正するであろう。ランゲルハンス島細胞は、約０．１から約５０ｍＭのＭＭＩで処理することができる。ランゲルハンス島細胞は、ランゲルハンス島細胞上のクラスＩＭＨＣ分子の発現を抑制するために、２４から７２時間または必要に応じてそれより長く、水溶液の形の約０．１から約１０ｍＭのＭＭＩで処理することが望ましい。移植後、レシピエントを、ＭＭＩ、またはＭＭＩおよびハイドロコルチゾン、またはＭＭＩおよび免疫抑制剤で、さらに治療することができる。ある組織の癌は、その組織および関連する癌の全体を破壊することによって治療することができる。例えば、甲状腺癌を放射性ヨウ素で処理すると、正常組織と病気組織の両方が破壊され、病気の進行が停止する。現在では、正常なヒトの甲状腺細胞の連続培養が、入手できる。本発明のその他の実施態様では、これらのヒト細胞を、ＭＭＩで処理すると、クラスＩＭＨＣの発現を抑制することができ、甲状腺細胞を必要とするレシピエントに移植することができた。この技術は、細胞を培養液中で維持し、ＭＭＩで処理し、さらにレシピエント内に移植することができるため、移植用のヒトのドナー細胞を要求に応じて提供するであろう。さらにもう一つの実施態様では、Ｓｏｘ−４タンパク質あるいはそれと機能的に均等なタンパク質、またはＹ−Ｂｏｘタンパク質あるいはそれと機能的に均等なタンパク質の核酸配列は、限定するわけではないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ウイルストランスダクション、リポフェクション、リン酸カルシウム、ジーンボンバードメント（ｇｅｎｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を仲介する粒子、Ｓｏｘ−４あるいはＹ−ｂｏｘタンパク質あるいはそれと機能的に均等なタンパク質をコードする核酸配列のジーントランスファーまたはダイレクトインジェクション、または当業者に既知の任意のその他の方法を含む、慣用的方法論によって、ヒト細胞内に導入することができる。Ｓｏｃ−４またはＹ−ｂｏｘタンパク質またはそれと機能的に均等なタンパク質を発現させるために用いることのできるベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはプラスミドが含まれる。そのようなベクターは、当業者に既知の組織特異的プロモーターまたは遍在（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）プロモーターを持つであろう。Ｓｏｘ−４またはＹ−ｂｏｘタンパク質またはそれと均等なタンパク質を発現する哺乳動物細胞は、クラスＩ分子の発現を抑制し、それによって移植拒絶反応を予防または阻害するであろう。さらに、ＭＭＩによるクラスＩＭＨＣの抑制は、レシピエントの免疫系統がこれらの細胞を「非自己（ｎｏｎｓｅｌｆ）」と認識する可能性を減少させるであろうため、これらのヒトの細胞は、非共通遺伝子系（ｎｏｎｃｏｇｅｎｅｉｃ）の個体からのものであっても良い。本発明のその他の実施態様では、クラスＩＭＨＣの発現を抑制するために、器官全体を、ＭＭＩのかん流によって、前処理することができる。低分子量の薬剤ゆえに、ＭＭＩは、器官、十字血管関門に容易にかん流し、それ故、器官内の大多数またはすべての細胞上に作用するであろう。このことから、移植におけるドナーとレシピエントの正確な適合必要性が減少するか、または排除されるであろう。その他の実施態様では、移植後、個体をＭＭＩおよびヒドロコルチゾンで処理する。移植後の個体の治療として、最近では、ヒドロコルチゾンを用いるか、または他の免疫抑制剤と共にヒドロコルチゾンを用いる。ヒドロコルチゾンおよびその他のホルモンは、クラスＩＭＨＣレベルへの影響において、ＭＭＩと共に付加的である。従って、ＭＭＩでの前処理、さらにＭＭＩおよびヒドロコルチゾン、またはＭＭＩ、ヒドロコルチゾンおよびその他の免疫抑制剤での移植後の処理は、自己寛容（ｓｅｌｆｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を強化するであろうと予想される。本発明のその他の実施態様では、ＭＭＩは、組み換え遺伝子を含む細胞を前処理するために用いられ、そうすることによって、遺伝子治療を必要とする哺乳動物、望ましくはヒトに、細胞を移植することができる。個体への遺伝子治療を提供するために、所望のタンパク質をコードする遺伝子配列をベクター内に挿入し、そして宿主細胞内に導入する。遺伝子治療に適するであろう病気の例としては、これらに限定されるわけではないが、鎌状赤血球貧血、膵嚢胞性線維症、β−サラセミア、血友病ＡおよびＢ、グリコシルトランスフェラーゼ酵素欠損症、および癌が含まれる。遺伝子治療に用いることのできるベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、欠陥レトルウイルス、アデノウイルス、またはその他のウイルスベクターが含まれる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：９２６−９３２）。遺伝子を運搬するベクターを細胞内に導入することのできる手段としては、これらに限定されるわけではないが、エレクロトポレーション、トランスダクション、あるいはＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムを用いたトランスフェクションまたは当業者に既知のその他の方法が含まれる（Ｓａｍｂｒｏｃｋ，Ｊ．ら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。遺伝子を運搬するベクターを導入することのできる細胞の例としては、限定するわけではないが、ヒト膵臓ランゲルハンス島あるいは甲状腺の細胞のようなヒトの正常細胞の連続培養物、またはラットＦＲＴＬ−５細胞のような哺乳動物の正常細胞の連続培養が含まれる。望ましい実施態様では、甲状腺特異的プロモーター下に組換え遺伝子を含むＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞を、ＭＭＩで処理し、クラスＩＭＨＣを抑制する。処理した細胞は、哺乳動物、望ましくはヒト内に移植され、そして病気を抑制する能力を持つ因子を分泌する。そのような細胞は、延長培養内で、機能増殖状態（ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｇｇｒｏｗｉｎｇｓｔａｔｅ）に維持することができ、さらに、ＭＭＩまたはホルモンを補足したＭＭＩで処理すると、クラスＩを抑制することができる。様々な組み換え遺伝子を持つ細胞は、要求に応じて容易に入手することができた。自己由来細胞の必要性の除去は、移植に大きな進歩を許すであろう。本発明のその他の実施態様では、クラスＩＭＨＣの発現を抑制するための薬剤候補の可能性を評価するために、インビボでのアッセイが用いられる。アッセイの第一段階では、特定の自己免疫疾患の症状または信号をクラスＩＭＨＣ− 欠失マウス内に誘発させることができるか否かを決定することによって、その特定の自己免疫疾患でのクラスＩＭＨＣの役割が、評価される。クラスＩＭＨＣ欠失マウスで自己免疫疾患の誘発能力が欠如していることは、この病気におけるクラスＩＭＨＣの役割を示唆しているであろう。用いることのできるクラスＩＭＨＣ欠失マウスの例としては、これらに限定されるわけではないが、同族組換えによって作り出されるクラスＩＭＨＣ−欠失マウス、トランス遺伝子の挿入によって作り出されたクラスＩＭＨＣ−欠失マウス、および染色体の欠損によって作り出されたクラスＩＭＨＣ欠失マウス、が含まれる。クラスＩＭＨＣ欠失マウスもまた、市販されている。これらのマウスに自己免疫疾患を再生成させることのできる方法としては、これらに限定されるわけではないが、ウイルス感染、抗体による誘発、および化学薬品またはその他の環境作因による誘発、が含まれる。別の方法として、クラスＩ欠失動物を自発性自己免疫の動物モデルとつがわせ、その結果得られた子孫を、自己免疫疾患について分析することもできる。望ましい実施態様では、クラスＩＭＨＣ欠失マウスは、１６／６Ｉｄと命名された主要イディオタイプを持つヒトのモノクローナル抗ＤＮＡ抗体で、免疫化される（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｙ．ら、１９８３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：７１８−７３０）。この実施態様の次の段階では、自己免疫病の動物モデルをクラスＩＭＨＣ抑制剤に露出する。自己免疫動物モデルの例としては、これらに限定されるわけではないが、トランスジェニック動物、同族組み換えまたは染色体欠損により作り出された動物、自然発生（ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）または自発性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の疾病を持つ動物が含まれる。望ましい実施態様では、ＳＬＥを、実験的にマウス内で誘発させる。ＳＬＥを実験的に誘発させる方法の例としては、これらに限定するつもりはないが、モノクローナル１６／６イディオタイプ（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｙ．ら、１９８３）、モノクローナル抗１６／６Ｉｄ抗体（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１９：７２９−７３４）、および１６／６イディオタイプに特異的なＴ細胞系（Ｆｒｉｃｋｅ，Ｈ．ら、１９９１、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７３：４２１−４２７）での免疫化が含まれる。用いることのできるマウス系としては、これらに限定するつもりはないが、Ｂａｌｂ、１２９、Ｃ３Ｈ．ＳＷ、ＳＪＬ、ＡＫＲ、およびＣ３ＨＳＷが含まれる。望ましい方法は、ヒト抗ＤＮＡモノクローナル抗体である１６／６Ｉｄ抗体でのマウスの免疫化である（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｙ．ら、１９８３）。次に、免疫化された動物を、薬剤、望ましくはＭＭＩ類似体に露出し、そして病気の症状の緩和について評価する。１６／６Ｉｄ処理マウスで評価されるパラメーターとしては、これらに限定されるわけではないが、白血球減少、蛋白尿、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）上の細胞表面マーカーのレベル、および腎臓内の免疫複合体沈着が含まれる。これらのパラメーターを評価する方法の例としては、これらに限定されるわけではないが、血液細胞、血清、組織生検または抽出物の分析、尿分析、ならびに抗体生成および免疫活性化細胞の分析が含まれる。当業者らは、これらのパラメーターを評価するために、慣用の方法を用いることができることを理解するであろう。これらのパラメーターの評価に用いることのできる慣用法の例としては、これらに限定されるわけではないが、細胞数計測、ＥＬＩＳＡ（Ｈｅｉｎｅｍａｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８７、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ，３２：３４５−３９３）、タンパク質定量アッセイ（Ａｕｓｅｂｅｌ，Ｊ．ら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）、免疫組織学（”ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ｓｔｉｔｅｓ，Ａ．Ｐ．およびＴｅｒｒ，Ａ．Ｉ．編、ＡｐｐｅｌｔｏｎａｎｄＬａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔＳａｎＭａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびリンパ球上の細胞表面マーカーの分析（”ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｐ．およびＴｅｒｒ，Ａ．Ｉ．編、ＡｐｐｅｌｔｏｎａｎｄＬａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ／ＳａｎＭａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が含まれる。本発明のその他の実施態様では、クラスＩＭＨＣ分子の発現を抑制する能力を持つ薬剤を評価および開発するために、もう一つのインビボでのアッセイが用いられる。このインビボでの方法では、動物に移植される組織は、クラスＩＭＨＣ抑制剤で前処理される。移植することのできる組織の例としては、これらに限定されるわけではないが、甲状腺細胞（ｔｈｙｒｏｃｙｔｅ）、肝細胞、神経細胞、筋肉、繊維芽細胞、脂肪細胞、およびランゲルハンス島細胞、内分泌腺細胞および組織、甲状腺、肝臓、皮膚、骨髄、腎臓、肺ならびに心臓が含まれる。望ましい実施態様では、ラットの甲状腺ＦＲＴＬ−５細胞は、ラットまたはマウスに移植する前に、クラスＩＭＨＣ抑制剤で前処理される。組織を移植することができる手段の例としては、これらに限定されるわけではないが、一般的外科手術法、静脈注射および皮下注射が含まれる。望ましい実施態様では、ラットの甲状腺ＦＲＴＬ−５細胞は、ラットまたはマウスの背中下方に皮下注射される。前処理した移植組織は、レシピエントの動物内に、３０−１００日の間の期間、留まっている。移植した組織の状態は、移植後６０日に評価するのが望ましい。当業者は、移植した組織を評価するために用いうる慣用法を理解しているであろう。望ましい実施態様では、前処理した移植ＦＲＴＬ−５細胞を注射した部位を、レシピエントの動物から切除する。切除した組織は、ＦＲＴＬ−５細胞の存在について、顕微鏡で評価する。さらに、ＦＲＴＬ−５細胞は、正常なＦＲＴＬ− ５機能の指標となるｃＡＭＰレベルの増加およびヨウ素摂取の増加の原因となるＴＳＨの能力について評価される。移植前に候補薬剤で処理された、切除組織内の、およびＴＳＨが仲介するｃＡＭＰレベルまたはヨウ素摂取で増加を示す、ＦＲＴＬ−５細胞が存在することは、移植拒絶反応の予防または治療に関する候補薬剤の有用性を予言する。本発明のその他の実施態様では、クラスＩＭＨＣ分子の発現を抑制する能力を持つ候補薬剤を評価し開発するために、インビトロでのアッセイが用いられる。本発明の一つのインビトロでのアッセイは、候補薬剤で処理したまたは処理しなかった細胞からの哺乳動物細胞抽出物中の一つのタンパク質または複数のタンパク質と、クラスＩＭＨＣの核酸調節配列またはそれと機能的に均等な配列との、結合の変化を検出することによって、クラスＩＭＨＣ分子の発現を抑制する候補薬剤の能力を評価する方法に関する。候補薬剤で処理した哺乳動物細胞からの抽出物を、クラスＩＭＨＣの核酸調節配列と合わせ、そして、前記の配列と抽出物からの複数のタンパク質または一つのタンパク質との間の複合体の存在を検出する。哺乳動物細胞のタンパク質または複数のタンパク質と前記の核酸配列との結合の変化は、未処理細胞からの抽出物中で、タンパク質または複数のタンパク質と同一のクラスＩＭＨＣの核酸調節配列との結合と比較することによって、評価することができる。調節核酸配列とは、クラスＩＭＨＣ遺伝子またはそれと機能的に均等な遺伝子の転写を調節する配列を包含するつもりである。変化とは、処理抽出物対未処理抽出物中で検出された複合体シグナルの強化あるいは出現、または、処理抽出物対未処理抽出物中で検出された複合体シグナルの減少または欠如を意味する。タンパク質抽出物は、核抽出物かまたは細胞抽出物のいずれであっても良いが；細胞抽出物が望ましい。哺乳動物細胞からの細胞タンパク質または核タンパク質の抽出物は、慣用の方法によってできる（Ａｕｓｕｅｂｅｌ，Ｊ．ら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。このインビトロでのアッセイに用いることのできる核酸配列の例としては、これらに限定されるわけではないが、クラスＩＭＨＣプロモーターの調節配列またはそれと機能的に均等な配列を含む核酸フラグメントが含まれる。例として、そのようなフラグメントは、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドを含んでいて良い。上流および下流サイレンサーのようなＰＤ１サイレンサーエレメントの調節領域をコードする配列を、この方法に用いることができる。ＰＤ１プロモーターでは、上流サイレンサーは、ＰＤ１開始部位の５’側、約−７２４から約 −６９７塩基対に位置し、下流サイレンサーは約−１２７から約−９０塩基対に位置する。ＰＤ１プロモーターの２つのサイレンサー配列と機能的に均等な核酸配列もまた、本発明に包含するつもりである。望ましい実施態様では、ＣＲＥ上の中心に位置する−１０７から−１００ｂｐの下流サイレンサー配列またはそれと機能的に均等な配列が、ここに記載されたインビトロでのアッセイに用いられる。インビトロでのアッセイに用いることのできるさらなる核酸配列の例としては、これらに限定されるわけではないが、エンハンサー領域をコードするクラスＩＭＨＣプロモーターの調節配列が含まれる。例として、ＰＤ１クラスＩＭＨＣプロモーターの上流および下流のエンハンサーを含む配列またはそれと機能的に均等な配列を、この発明のインビトロでのアッセイに用いることができる。ＰＤ１プロモーター内では、上流エンハンサーは、上流サイレンサーとオーバーラップし（図９を参照のこと）；下流エンハンサーは、インターフェロン応答エレメントの５’末端である（図１６Ｂ）。上流サイレンサーおよびエンハンサーと複合体を形成することのできるタンパク質の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｓｏｘ−４、Ｃ−ｊｕｎ族構成タンパク質（ｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ）、ｃ−ｆｏｓ族構成タンパク質（ｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ）、ＮＦ−κＢおよびそのサブユニットまたはそれらと機能的に均等なタンパク質が含まれる。下流エンハンサー（エンハンサーＡ）と複合体を形成することのできるタンパク質の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｓｏｘ４、ＮＦ κ−Ｂおよびそのサブユニット、ｃ−ｆｏｓファミリーメンバー、Ｐａｘ８、ＴＴＦ−１タンパク質、ＴＳＥＰ−１のようなＹ−ｂｏｘタンパク質、またはそれらと機能的に均等なタンパク質が含まれる。クラスＩＭＨＣ分子を抑制する能力を持つ候補薬剤は、上流または下流エンハンサー配列との複合体の形成を減少または排除するはずである。このインビトロでのアッセイに用いることのできる哺乳動物細胞の例としては、これらに限定されるわけではないが、哺乳動物細胞の甲状腺細胞、肝細胞、神経組織、筋肉、繊維芽細胞、脂肪細胞、およびＨＥＬＡ細胞が含まれる。ラットのＦＲＴＬ−５甲状腺細胞が望ましい（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＡＴＣＣ−ＣＲＬ８３０５）。一つの実施態様では、このアッセイで用いられる核酸配列は、クラスＩＭＨＣ遺伝子のＤＮＡ調節配列、ＰＤ１と相同の配列から誘導される。望ましい実施態様では、これらの核酸配列は、図９に示すように、ＤＮＡフラグメント１１４（配列番号１の塩基２２１から３２０）、１４０（配列番号１の塩基３２１から４５５）および２３８（配列番号１の塩基４５６から６９２）である。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５−８（配列番号３、配列番号４、配列番号１０、配列番号５−配列番号８）と命名した、図１０に示す二本鎖オリゴヌクレオチド、または、二本鎖のオリゴヌクレオチド（Ｋ）（配列番号３８）もまた、用いることができる。Ｋオリゴヌクレオチド（配列番号３８）は、チログロブリンプロモーター内にあり（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．ら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，６：１３１０−１３１７）、サイレンサー複合体内のＳｏｃ−４様結合部位の配列に関連する（図１０）、ＴＴＦ−２／Ｓｏｘ−４反応エレメント、または核酸調節配列である。望ましい実施態様では、クラスＩＭＨＣ分子の発現を抑制する薬剤の能力は、上記のクラスＩＭＨＣ核酸調節配列、または一本鎖あるいは二本鎖のオリゴヌクレオチドまたはそれと機能的に均等なものと、抽出物中の一つのタンパク質または複数のタンパク質との結合の減少または増加によって、測定される。結合の減少とは、処理抽出物対未処理抽出物内で検出された複合体のシグナルの減少あるいは損失、またはシグナルの欠如を意味する。結合の増加とは、処理細胞対未処理細胞内での複合体のシグナルの出現または増加を意味する。複合体とは、核酸配列に結合したタンパク質または複数のタンパク質を意味する。核酸配列と複合体を形成するタンパク質または複数のタンパク質は、至る所に現れるか、または組織特異的であることができる。そのような複数のタンパク質は、核酸配列と直接的に結合できるか、またはこの核酸配列を結合する能力を持つタンパク質と相互作用する、あるいは複合体を形成することができる。この定義には、一本鎖または二本鎖核酸配列と結合する能力を持つタンパク質も、包含するつもりである。例として、クラスＩＭＨＣ遺伝子の上流サイレンサーエンハンサーと細胞内で複合体を形成するタンパク質には、これらに限定されるわけではないが、ＮＦ−ＫＢおよびそのサブユニット（ｐ６５／５０サブユニット）、ｃ−ｆｏｓ関連タンパク質またはその族構成タンパク質、Ｃ−ｊｕｎ関連タンパク質またはその族構成タンパク質、Ｓｏｘ−４タンパク質またはそのようなタンパク質と実質的に均等な生物学的活性を持つそれと機能的に均等なタンパク質を含んでいて良い（実施例８；Ｋｉｅｒａｎ，Ｍ．ら、１９９０、Ｃｅｌｌ，６２，１００７−１０１８；Ｇｈｏｓｈ，Ｓ．ら、１９９０、Ｃｅｌｌ，６２，１０１９−１０２９；Ｒｙｓｅｃｋ，Ｒ．−Ｐ．ら、１９９２、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１２，６７４−６８４；Ｓｔｅｉｎ，Ｂ．ら、１９９３、ＥＭＢＯＪ．，１２，８７９−３８９１；Ｓｔｅｉｎ，Ｂ．ら、１９９３、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１３，３９６４−３９７４；Ｎｉｓｈｉｎａ，Ｈ．ら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７，３６１９ −３６２３；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ａ．ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，７２３−７２７；Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．ら、１９９２、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐ．，６，７７５−７８７；Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１１４５３−１１４６２）。当業者は、細胞または組織の型と言ったような様々な因子が、複合体と相互作用しているまたは複合体を形成しているタンパク質の正確な組立を決定付けることを、正確に認識しているであろう。例として、細胞の下流サイレンサーと複合体を形成するタンパク質には、これらに限定されるわけではないが、甲状腺転写因子−１（ＴＴＦ−１）、Ｐａｘ８、Ｙ−ｂｏｘタンパク質、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、およびサイクリックＡＭＰ結合調節タンパク質（ＣＲＥＢ）またはそのようなタンパク質と実質的に均等な生物活性を持つそれと機能的に均等なタンパク質を含んでいて良い（実施例９、１１を参照のこと；Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．ら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７，１５８９−１５９５；Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．ら、１９８９、ＥＭＢＯＪ．，２５３７−２５４２；Ｇｕａｚｚｉ，Ｓ．ら、１９９０、ＥＭＢＯＪ．，９，６３１−３６３９；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．ら、１９９２、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１２，５７６−５８８；Ｚａｎｎｉｎｉ，Ｍ．ら、１９９２、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１２，４２３０−４２４１；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら、１９９５、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９−２８２；Ｄａｖｉｓ，Ｔ．Ｌ．ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，９６８２−９６８６；Ｋｉｎｎｉｂｕｒｇｈ，Ａ．Ｊ．、１９８９、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１７，７７７１−７７７８；Ｐｏｓｔｅｌ，Ｅ．Ｈ．ら、１９８９、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，９，５１２３−５１３３；Ｋｏｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら、１９９２、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，１１１−１１６；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｃ．ら、１９８８、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，８，４１７４−４１８４；Ｐｅｓｔｏｖ，Ｄ．Ｇ．ら、１９９１、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９，６５２７−６５３２；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｅ．Ｋ．ら、１９９０、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７，２７０５−２７０９；Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｐ．ら、１９９２、ＮｅｗＢｉｏｌ．，４，２９０−２９８；Ｋｏｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら、１９９１、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９，４７７１；Ｏｚｅｒ，Ｊ．ら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２２１４３−２２１５２；Ｆａｂｅｒ，Ｍ．ら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２２２４３−２２２５４；Ｐｅｔｔｙ，Ｋ．Ｊ．ら、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｉｏｎＮｕｍｂｅｒＭ６９１３８；Ｄｉｄｉｅｒ，Ｄ．Ｋ．ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，７３２２−７３２６；Ｓａｋｕｒａ，Ｈ．ら、１９８８、Ｇｅｎｅ，７３，４９９−５０７；Ｓｐｉｔｋｏｖｓｋｙ，Ｄ．Ｄ．ら、１９９２、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０，７９７−８０３；Ｓａｂａｔｈ，Ｄ．Ｅ．ら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１２６７１−１２６７８；Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１１４５３−１１４６２；Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．ら、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８３，６６８２−６６８６；Ａｎｇｅｌ，Ｐ．ら、１９８７、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，７；２２５６−２２６６；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，６２４７−６２５１；Ｖａｌｌｅｊｏ，Ｍ．ら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，１２８６８−１２８７５；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．ら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７，１２７５−１２８３；Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，６，１７０１−１７１５；Ｈａｂｅｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．、１９９０、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４，１０８７−１０９４）。複合体の検出は、当業者に既知の様々な技術によって、行うことができる。単一増幅による複合体の検出は、放射標識および酵素を含む様々な慣用の標識技術によって成し遂げることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｔ．ら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。放射標識のキットもまた、市販されている。ＤＮＡ配列を標識する望ましい方法は、クレノウ酵素またはポリヌクレオチドキナーゼを用いて³²Ｐで行われる。さらに、ピリミジンおよびプリン環に化学基（ｃｈｅｍｉｃａｌｍｏｉｅｔｙ）を結合させる方法（Ｄａｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｋ．ら、１９７３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７０：２２３８−２２４２；Ｈｅｃｋ，Ｒ．Ｆ．、１９６８、Ｓ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９０：５５１８ −５５２３）、化学発光によって検出する方法（Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋ．ら、１９９２、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４：８７３６−８７４０）およびビオチニル化した核酸プローブを用いる方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｋ．ら、１９８３、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３：１２６−１３１；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．ら、１９８２、Ｊ．ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＭｅｔｈｏｄｓ，５１：２４１−２４９；Ｍａｔｔｈａｅｉ，Ｆ．Ｓ．ら、１９８６、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７：１２３−１２８）および市販の生成物を用いて蛍光による検出を可能にする方法を含む、単一増幅による非放射技術が知られている。非放射標識のキットもまた、市販されている。ＤＮＡフラグメントまたは二本鎖オリゴヌクレオチドと結合したタンパク質抽出物の複合体を検出するのに有効な方法には、移動度−シフト分析、サザンウエスタン、および免疫沈降が含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｊ．ら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。望ましい方法は、放射標識した二本鎖核酸配列を用いたゲル移動度シフト分析である。また、移動度シフト分析では、タンパク質抽出物−オリゴマー複合体は、³⁵Ｓまたはトリチル化されたチミジンで細胞を代謝により標識できる、標識タンパク質抽出物を用いることによっても検出することができる。また、別の方法として、¹²⁵Ｉでの標識またはビオチンおよび様々な蛍光標識を用いる非放射標識を、タンパク質抽出物を調製する前に用いることもできる。本発明のその他のインビトロでのアッセイは、クラスＩＭＨＣプロモーターおよびその調節配列またはそれと機能的に均等な配列の下流に機能するように連結されたレポーター遺伝子の活性を測定することによって、クラスＩＭＨＣの発現を抑制する薬剤の能力を評価する方法に関係する。クラスＩＭＨＣプロモーターおよびその調節配列に機能するように連結されたレポーター遺伝子を、哺乳動物細胞に導入し、前記哺乳動物細胞を候補薬剤で処理し、さらに処理済および未処理の哺乳動物細胞の溶解物中のレポーター遺伝子の活性を測定する。処理済対未処理細胞の細胞溶解物中のレポーター遺伝子の活性が減少すると、クラスＩＭＨＣの発現を抑制する候補薬剤は有効であると予測される。レポーター遺伝子に機能するように連結することのできる望ましい調節配列は、クラスＩＭＨＣ、ＰＤ１遺伝子のサイレンサーおよびエンハンサー領域に相当する配列である。例として、これらの配列は、これらに限定されるわけでないが、１１４（配列番号１の塩基２２１から２３０）、１４０（配列番号１の塩基３２１から４５５）、１５１（配列番号１の塩基５４から２２０）および２３８（配列番号１の塩基４５６から６９２）の配列またはそれと機能的に均等な配列（図９Ａ−９Ｂ）を、それらの同種（ｃｏｇｎａｔｅ）のプロモーターと共に含んでいて良い。さらに、下流サイレンサー領域−１２７から−９０ｂｐまたは−１２７から−８０ｂｐまたはそれと機能的に均等な領域に相当する配列もまた、用いることができる。当業者は、他のクラスＩ遺伝子の調節ドメインおよびプロモータードメイン内に認められる配列的および機能的に相同な領域もまた使用することができ、本発明に包含するつもりであることを、理解するであろう。レポーター遺伝子の例としては、これらに限定されるわけではないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、増補１４版、９．６節、１９９０、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。このインビトロでのアッセイに用いることのできる哺乳動物細胞の例としては、これらに限定するつもりはないが、哺乳動物細胞甲状腺細胞、肝細胞、神経組織、筋肉、繊維芽細胞、脂肪細胞、およびＨＥＬＡ細胞が含まれる。レポーター遺伝子に機能するように連結された調節配列を細胞内に導入することのできる手段は、上記の手段と同一の手段である。望ましい実施態様では、ＣＡＴ遺伝子は、上記のＰＤＩ配列の一つと機能するように連結され、そしてＦＲＴＬ−５細胞内に導入される。クラスＩＭＨＣ分子の発現を抑制する候補薬剤の能力もまた、候補薬剤で処理した哺乳動物細胞と候補薬剤で処理しなかった哺乳動物細胞内での細胞内ｍＲＮＡのレベルを比較することによって、評価することができる。細胞内ｍＲＮＡのレベルを測定する方法の例としては、これらに限定するつもりはないが、ノーザンブロッティング（Ａｌｗｉｎｅ，Ｊ．Ｃ．ら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５３５０−５３５４）、ドットおよびスロットハイブリダイゼーション（Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．ら、１９７９，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，７：１５４１−１５２２）、フィルターハイブリダイゼーション（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．ら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：１７４−１７９）、ＲＮアーゼ保護（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９２、”ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ”、第二版、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）および核ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）アッセイ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら、１９８９、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、増補９版、１９９０、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）が含まれる。当業者に既知の慣用の方法論を、ｍＲＮＡレベルまたは与えられた遺伝子の転写速度を評価するために用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）。さらなるその他のインビトロでのアッセイでは、クラスＩＭＨＣの発現を抑制する候補薬剤の能力は、クラスＩＭＨＣの発現を調節する能力を持つ一つあるいはそれより多くのタンパク質またはそれらに相当するＲＮＡの発現を変化させる薬剤の能力を評価することによって評価される。例として、そのようなタンパク質には、これらに限定されるわけではないが、Ｓｏｘ−４タンパク質またはそれと機能的に均等なタンパク質、ＴＴＦ−１甲状腺転写因子またはそれと機能的に均等なタンパク質、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）の様なＳＳＢＰまたはそれと均等なタンパク質、およびＹ−ｂｏｘタンパク質またはそれと機能的にと均等なタンパク質が含まれる。望ましい実施態様では、Ｓｏｘ−４タンパク質およびＹ−ｂｏｘタンパク質（本明細書中に記載されたＴＳＥＰ−１を指す）のｍＲＮＡの発現のレベルは、候補薬剤に露出した細胞内で、評価される。望ましくは、ラットＦＲＴＬ−５細胞が用いられる。慣用的方法論は、細胞内に存在するこれらの遺伝子の転写速度またはｍＲＮＡレベルを評価するために用いることができる（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら、１９８９、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、１９８７、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。そのような方法の例としては、これらに限定されるわけではないが、ノーザンブロット分析、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。クラスＩＭＨＣの発現を抑制する能力を持つ薬剤もまた、ＳＳＢＰメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、Ｓｏｘ− ４ｍＲＮＡ、またはＴＴＦ−１ｍＲＮＡのレベルを抑制または減少させるはずである。代わりに、Ｓｏｘ４またはＴＴＦ−１タンパク質のレベルを、候補薬剤の治療への可能性の指標として評価することもできる。クラスＩＭＨＣ分子を抑制する能力を持つ薬剤は、ＳＳＢＰまたはＴＴＦ−１タンパク質のレベルを減少させるはずである。タンパク質レベルの評価は、これらに限定されるわけではないが、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡを含む当業者に既知の慣用的方法論によって、評価することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ” 、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｗｉｅｗ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。代わりの方法として、Ｙ−ｂｏｘタンパク質のＲＮＡまたはタンパク質またはそれと機能的に均等なものの発現のレベルは、候補薬剤の治療への可能性を評価することができる。Ｙ−ｂｏｘタンパク質のＲＮＡまたはタンパク質レベルは、もし薬剤がクラスＩＭＨＣ分子を抑制する能力を持つならば、増加するはずである。当業者らに既知のまたは本明細書中に記載の慣用的方法論は、このアッセイに用いることができる。さらにその他の実施態様では、クラスＩＭＨＣへの候補薬剤能力による治療の可能性は、クラスＩの発現を調節する能力を持つタンパク質の酸化／還元の状態を評価する薬剤の能力によって、評価することができる。例として、そのようなタンパク質は、ＳＳＢＰ、ＴＴＦ−１タンパク質、ＴＳＥＰ−１のようなＹ− Ｂｏｘタンパク質、Ｐａｘ８タンパク質、ＣＲＥＢタンパク質，ＮＦ−κＢおよびそのサブユニット、ｆｏｓ族構成タンパク質またはそれと機能的に均等なタンパク質であって良い。例として、クラスＩＭＨＣの発現をも調節する能力を持つタンパク質の酸化／還元状態を調節するまたは変化させる能力を持つ細胞内の酵素への薬剤の影響を、評価することができる。別の方法として、クラスＩＭＨＣを調節する能力を持つタンパク質の酸化／還元状態を調節する原因の酵素活性を、評価することができる。そのような酵素の例としては、これらに限定されるわけではないが、チオレドキシン、スーパーオキシドジスムターゼ、またはそれと機能的に均等な酵素が含まれる。例として、この方法に用いることのできるアッセイには、これらに限定されるわけではないが、Ｎｏｉｖａ，Ｒ．、１９９４、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ，５，１−１３；Ｔｏｎｉｓｓｅｎ，Ｋ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２４８５−２２４８９；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１１３８０−１１３８８；Ｏｋａｍａｔｏ，Ｔ．ら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４，８１１−８１９、に記載のアッセイが含まれ、ここに参照として組み入れられる。また、本発明は、クラスＩＭＨＣ発現を調節する能力を持つタンパク質をコードする核酸配列をも、提供する。特に、本発明は、Ｓｏｘ−４タンパク質（実施例８）およびＴＳＥＰ−１と名付けられたＹ−ｂｏｘタンパク質（実施例１１）の核酸およびアミノ酸配列を提供する。図２０に示すＳｏｘ−４タンパク質の核酸配列、および図３８に示すＴＳＥＰ −１と名付けられたＹ−Ｂｏｘタンパク質の核酸配列は、本発明の望ましい実施態様を表している。しかしながら、遺伝子コードの縮重により、図２０および３８に示すｃＤＮＡ配列を変異させても、結果として、Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ −１それぞれのタンパク質をコードする能力を持つＤＮＡ配列になるであろうことを、当業者は理解するであろう。それ故、そのようなＤＮＡ配列は、図２０および２８に示す配列と機能的に均等であり、本発明に包含するつもりである。さらに、当業者は、図２０および２８に示す核酸配列の与えられた種に、対立変異が自然発生すること、およびこれらの変異もまた本発明により包含されるつもりであること、を理解するであろう。予想されるＳｏｘ−４タンパク質は約５３キロダルトンであり、予想されるＴＳＥＰ−１タンパク質は約４２キロダルトン（ｋｄ）である。さらに、本発明は、Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１タンパク質と実質的に同一の機能を持つタンパク質またはペプチドまたはその類似体を含む。そのようなタンパク質またはポリペプチドには、限定するわけではないが、Ｓｏｘ−４あるいはＴＥＳＰ−１タンパク質のタンパク質フラグメント、または置換、付加、あるいは欠失変異体が含まれる。また、本発明は、これらのタンパク質と実質的に相同なタンパク質またはペプチドも包含する。用語「類似体」は、一つまたはそれより多くの残基が機能的に類似した残基と保存的に置換され、および本明細書に記載したようなＳｏｘ−４またはＴＳＥＰ −１タンパク質抗原の機能的特色を示す、本明細書中の図２０および３８に具体的に示したＳｏｘ−４またはＴＥＳＰ−１配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を持つ任意のポリペプチドを含む。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（疎水性）残基を互いに置換すること、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、グリシンとセリン間を互いに置換するように一つの極性（親水性）残基を互いに置換すること、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような一つの塩基性残基を互いに置換すること、または、アスパラギン酸またはグルタミン酸のような一つの酸性残基を互いに置換すること、が含まれる本明細書中に記載のＳｏｘ−４およびＴＳＥＰ−１タンパク質の保存的に置換された変異も、本発明に含むつもりである。また、慣用句「保存的置換」には、非誘導残基の代わりに化学的に誘導された残基を用いることも含まれる。「化学誘導」とは、官能側鎖の反応によって化学的に誘導された一つまたはそれより多くの残基を持つ従属ポリペプチド（ｓｕｂｊｅｃｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を指す。そのように誘導された分子の例としては、例として、遊離アミノ基を誘導して、塩酸アミン、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するそれらの分子が含まれる。遊離カルボキシル基を誘導すると、塩、メチルおよびエチルエステルまたはその他の型のエステルあるいはヒドラジドを形成することができる。遊離の水酸基を誘導すると、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導すると、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また、化学誘導体として、２０の標準アミノ酸の一つまたはそれより多くの天然発生のアミノ酸誘導体を含むそれらのタンパク質またはペプチドが含まれる。例えば：４−ヒドロキシプロリンはプロリンの代わりに置換されていて良い；５−ヒドロキシリジンはリジンの代わりに置換されていて良い；３−メチルヒスチジンはヒスチジンの代わりに置換されていて良い；ホモセリンはセリンの代わりに置換されていて良い；また、オルニチンはリジンの代わりに置換されていて良い。また、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、必要な活性が維持されている限り、Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ− １タンパク質のＤＮＡによりコードされているポリペプチドの配列と比較して、一つまたはそれより多くの残基の付加および／または欠失を持つ任意のポリペプチドを含む。また、本発明は、Ｓｏｘ−４核酸配列およびベクターの全体あるいは部分、またはＴＳＥＰ−１核酸配列およびベクターの全体あるいは部分を含む組換えＤＮＡ分子を提供する。本発明に用いるに適当な発現ベクターは、核酸配列に機能するように連結された少なくとも一つの発現調節要素を含む。発現調節要素は、核酸配列の発現を調節および抑制するために、ベクター内に挿入される。発現調節要素の例としては、これらに限定されるわけではないが、ｌａｃシステム、ファージラムダのオペレーターおよびプロモーター領域、酵母のプロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスまたはＳＶ４０から誘導されたプロモーターが含まれる。さらなるの望ましいまたは必要とされる機能エレメントには、これらに限定されるわけではないが、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよび宿主系内で核酸配列の適切な転写そしてそれに続いて起こる翻訳に必要または望ましい任意のその他の配列が含まれる。当業者は、必要なまたは望ましい発現調節要素の適正な組み合わせが選ばれた宿主系に依存することを、理解するであろう。さらに、発現ベクターは、宿主系内で核酸配列を含む発現ベクターの輸送そしてそれに続いて起こる複製に必要なさらなるエレメントを含むはずであることが、理解されるであろう。そのようなエレメントの例としては、これらに限定されるわけではないが、複製開始点および選択マーカーが含まれる。さらに、当業者らは、そのようなベクターが、慣用の方法（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｎｅｗｙｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）を用いて容易に構築される、または市販されていることを、理解するであろう。本発明のその他の態様は、Ｓｏｘ−４核酸配列あるいはＴＳＥＰ−１核酸配列の全体または部分、またはその組み合わせを含む組換え発現ベクターが挿入された宿主生物体に関する。本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞には、動物、植物、昆虫および酵母細胞のような真核生物ならびに大腸菌のような原核生物が含まれる。遺伝子を運搬するベクターを細胞内に導入することができる手段として、これらに限定するつもりはないが、マイクロインジェクション、エレクロトポレーション、トランスダクション、あるいはＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムを用いるトランスフェクション、または当業者に既知のその他の方法が含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ” ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。望ましい実施態様では、真核生物細胞内で機能する真核生物の発現ベクターが用いられる。そのようなベクターの例としては、これらに限定されるわけではないが、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、細菌発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）の様なプラスミド、バキュロウイルストランスファーベクターが含まれる。望ましい真核生物細胞系には、これらに限定するつもりはないが、ＦＲＴＬ−５またはＦＲＴ細胞のような甲状腺細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、またはＢＲＬ細胞が含まれる。特に望ましい実施態様では、組み換え発現ベクターが、ＦＲＴＬ−５ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ、またはＣＨＯのような哺乳動物細胞内に導入され、組換えタンパク質の適切なプロセシングおよび修飾を確実なものにする。一つの実施態様では、発現した組換えＴＳＥＰ−１またはＳｏｘ−４タンパク質は、ＴＳＥＰ−１またはＳｏｘ−４タンパク質に特異的な抗体を用いたクマシーブルー染色およびウエスタンブロッティングを含むこの技術分野で既知の方法に従って、検出することができる。さらなる実施態様では、宿主細胞で発現する組換えタンパク質は、粗溶解物として得られるか、または沈降差、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、アフィニティー、およびイムノアフィニティークロマトグラフィーならびにその類似法等を含んで良いこの技術分野で既知の標準的なタンパク質精製方法によって精製することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。イムノアフィニティークロマトグラフィーの場合、組換えタンパク質は、Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１タンパク質に特異的な抗体をそれと結合する樹脂を含むカラムを通過させることによって、精製することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７，”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。本発明の核酸配列またはその部分は、生物サンプル内のＳｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。サンプルの例としては、これらに限定されるわけではないが、組織細胞、ホモジネート、抽出物、生検、微細な（ｆｉｎｅ）針生検、または組織スライスが含まれる。それ故、本発明のもう一つの態様は、生物サンプル内でＳｏｘ−４またはＴＳＥＰ− １のいずれかのタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡを検出するためのバイオアッセイであって、前記の生物サンプルと、本発明の核酸配列の全体または部分とを、前記の核酸配列と前記のメッセンジャーＲＮＡとの間での複合体の形成を許す条件下で接触させる段階、前記の複合体を検出する段階、および前記メッセンジャーＲＮＡのレベルを検出する段階を含む、前記のバイオアッセイに関する。ＲＮＡは、慣用の方法論によって、全体細胞ＲＮＡとして、またはポリ（Ａ）⁺ＲＮＡとして単離することが出来る。その他の実施態様では、Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１ｍＲＮＡをそれぞれ検出するために、図２０および３８のＳｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１配列に基づくオリゴヌクレオチド対の組み合わせを、プライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いる。また、これらのプライマーは、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”１５章、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋに詳細に記載された、選択されたＲＮＡ核酸配列を増幅するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法に従う方法に用いることができる。オリゴヌクレオチドは、様々な製造者から販売されている自動装置によって合成することができるか、または本発明の核酸配列に基づいて商品として製造することが出来る。当業者は、サンプル内で、Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１のＲＮＡをそれぞれ増幅するための、Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ −１核酸配列に基づくＰＣＲプライマーを選択する方法を知るであろう。本発明のさらなるその他の実施態様では、Ｓｏｘ−４あるいはＴＳＥＰ−１核酸配列の全体またはその部分は、トランスジェニック動物を作り出すために用いることができる。望ましくは、Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１遺伝子は、胎芽期、望ましくは一細胞期、一般的には約八細胞期より前に、動物または動物の先祖内に導入される。Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１遺伝子を運搬するトランスジェニック動物を作り出すことのできるいくつかの方法がある。一つの方法は、細胞配列の全体または部分を運搬するレトロウイルスを用いることを含む。トランスジーンを含むレトロウイルスは、トランスフェクションによって胎芽期の動物内に導入される。もう一つの方法は、胚内にトランスジーンを直接インジェクションすることを含む。さらにもう一つの方法では、当業者に既知の胎芽幹細胞法または相同組換え法を用いる。トランスジーンを導入することのできる動物の例としては、これらに限定するつもりはないが、霊長類、マウス、ラットまたはその他の齧歯類が含まれる。そのようなトランスジェニック動物は、自己免疫、移植拒絶反応、または癌を研究するための、そして自己免疫、癌または移植拒絶反応の診断法または治療法を評価するための、生物モデルとして有用である。さらに、本発明は、図２０および３８に定義したアミノ酸配列またはその唯一の部分を持つＳｏｘ−４あるいはＴＳＥＰ−１のタンパク質またはペプチドのいずれかと反応する一つの抗体または複数の抗体を含む。本発明のこの実施態様では、抗体はその起源においてモノクローナルまたはポリクローナルである。抗体を作り出すために用いられるＳｏｘ−４あるいはＴＳＥＰ−１タンパク質またはペプチドは、天然起源または組換え起源からのものであって良く、化学合成によって作られても良い。天然のＳｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１タンパク質は、ラット甲状腺のような哺乳動物の生物サンプルから単離することが出来る。天然タンパク質は、組換えタンパク質に関して上記したのと同一の方法によって単離することが出来る。組換えＳｏｘ−４あるいはＴＳＥＰ−１タンパク質またはペプチドは、慣用の方法に従って製造し、精製することができる。合成Ｓｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１ペプチドは、本発明が提供するまたは当業者に既知の方法によって合成されるそれぞれのタンパク質の予想されるアミノ酸配列に基づいて、特別注文によってまたは商品として作り出すことができる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．、１９６３、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９）。もしペプチドが抗原として短すぎるならば、ペプチドの抗原性を強めるキャリヤー分子と結合させることができる。キャリヤー分子の例としては、これらに限定されるわけではないが、ヒトのアルブミン、ウシのアルブミン、およびキーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンが含まれる（”ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、１９９１、Ｓｔｉｔｅｓ，Ｄ．Ｐ．およびＴｅｒｒ，Ａ．Ｉ．編、ＡｐｐｌｅｔｏｎａｎｄＬａｎｇｅ，ＮｏｒｗａｌｋＣｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＳａｎＭａｔｅｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。本発明の検出法に用いられる模範的な抗体分子は、完全なイムノグロブリン分子、実質的に完全なイムノグロブリン分子、または抗原結合部位を含むイムノグロブリン分子のそれらの部分であり、Ｆ（ａｂ）；Ｆ（ａｂ’）；Ｆ（ａｂ’）₂ およびＦ（ｖ）としてこの技術分野で既知のイムノグロブリン分子のそれらの部分を含む。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、この技術分野で既知の方法によって作り出すことができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，” ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＲｏｄｅｎｔａｎｄＨｕｍａｎＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｂｕｒｄｏｎら編、１９８５、”ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、１３巻、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。抗体または抗原結合フラグメントもまた、遺伝子工学によって作り出すことができる。大腸菌内で重鎖および軽鎖の両方の遺伝子を発現させる技術は、ＰＣＴ特許出願：公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４号公報：およびＨｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１の主題である。本発明の抗体は、未変性または変性させたＳｏｘ−４あるいはＴＳＥＰ−１のタンパク質またはペプチドまたはその類似体と反応できる。抗体が用いられるはずの特異的イムノアッセイは、どの抗体が望ましいかを指図するであろう。抗体は、Ｓｏｘ−４あるいはＴＳＥＰ−１のいずれかのタンパク質またはその部分に対して、または、Ｓｏｘ−４あるいはＴＳＥＰ−１のいずれかのアミノ酸配列に相同な合成ペプチドに対して、作製できる。一つの実施態様では、本発明の抗体は、生物サンプル内のＳｏｘ−４またはＴＳＥＰ−１のいずれかのタンパク質を検出するためのイムノアッセイに用いられる。この方法では、本発明の抗体を生物サンプルと接触させ、ＴＳＥＰ−１またはＳｏｘ−４のいずれかのタンパク質と抗体との間の複合体の形成を検出する。本発明のイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイおよびその類似アッセイであって良い（”ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”、１９９１、ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＰ．ＰｒｉｃｅおよびＤａｖｉｄＪ．Ｎｅｏｍａｎ編、ＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７、”ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ）。ＥＬＩＳＡに関するこの技術分野で既知の標準技術は、”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＩｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ”、第二版、ＲｏｓｅおよびＢｉｇａｚｚｉ編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８０、ならびに、Ｃａｍｐｂｅｌｌら，”ＭｅｃｈｏｄｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４、に記載されており、両方とも参照として本書に取り入れられる。本発明に従って投与されるクラスＩＭＨＣ抑制薬は、これらに限定されるわけではないが、食塩水、緩衝液、デキストロース、エタノールおよび水を含む生物学的に受け入れうるキャリヤーをさらに含む無菌の薬剤組成物として、投与することができる。投与されるクラスＩＭＨＣ抑制薬は、単独でまたはその他の薬剤、ホルモンまたは抗体と組み合わせて、投与することができる。薬剤の例としては、これらに限定されるわけではないが、クラスＩＭＨＣ抑制薬、免疫抑制薬、細胞毒性薬、および抗炎症薬が含まれる。ホルモンの例としては、これらに限定されるわけではないが、コルチコステロイド、ステロイドおよびステロイド誘導体、エストロゲン、アンドロゲン、インスリン様成長因子Ｉの様な成長因子、グリコプロテインホルモン、サイトカインおよびリンホカインが含まれる。抗体の例としては、これらに限定されるわけではないが、クラスＩＭＨＣ抗原に対する抗体、クラスII ＭＨＣ抗原に対する抗体、および感染性抗原に対する抗体が含まれる。クラスＩＭＨＣ抑制薬を投与する手段としては、これらに限定されるわけではないが、経口、舌下、静脈内、腹腔内、経皮、鼻腔内、硬膜下腔内、皮下、皮内、または腸内が含まれる。罹患した部位への局所投与は、これらに限定されるわけではないが、局所適用、注射、点滴およびクラスＩＭＨＣ抑制薬を含む多孔性装置の皮下投入（移植）を含む、この技術分野に既知の手段を通して成し遂げることができる。自己免疫疾患および移植拒絶反応の治療でクラスＩＭＨＣ抑制薬を投与する望ましい手段は、経口である。移植するための組織を前処理する望ましい手段は、インビトロでの水溶液でのかん流による。本明細書中に引用した書籍、論文、または特許はすべて、参照として本明細書に取り入れられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に説明するものであって、その範囲を制限するつもりのものではない。実施例１クラスＩＭＨＣ欠損マウスにおける実験的ＳＬＥ誘発の欠如マウスでの実験的ＳＬＥの誘発全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、抗ＤＮＡ、抗核抗原、および抗ＲＮＰ抗体を含む、自己抗体のアレーの存在を特徴とする自己免疫疾患である（Ｔａｌａｌ，Ｎ．ら、１９７７、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：Ｇｅｎｅｔｉｃ，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＶｉｒｏｌｏｇｙａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ；ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ）。ヒトでの疾病の進行は、白血球減少症、蛋白尿、ならびに腎臓およびその他の器官の免疫複合体沈査と互いに関連する。ＳＬＥの実験モデルは、１６／６Ｉｄと命名された共通のイディオタイプを発現するヒトのモノクローナル抗ＤＮＡ抗体での免疫化によって、マウス内に誘発させることができる。一回の免疫化およびそれに続いて起こる１６／６Ｉｄでの追加免疫の後、マウスは、１６／６Ｉｄ、ＤＮＡおよび核抗原に対する抗体を生成する。４−６ヶ月間の後、免疫化されたマウスは、白血球減少症および蛋白尿を発症し、免疫複合体が、それらマウスの腎臓内に認められる（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２２６０−２２６４）。この実験モデルは、自己抗体の生成およびその臨床的明示に関して、ヒトの疾病と密接に近似している。いくつかのその他の研究室では、マウス内でＳＬＥを誘発するためにこれらの抗体を用いている。１６／６Ｉｄで免疫化したマウスで病気が誘発される免疫学的根拠は知られていない。細胞表面クラスＩＭＨＣ分子を欠損したマウスは、クラスＩ分子の正しい組立および細胞表面での発現に必要とされる、β₂ミクログロブリンの遺伝子を不活性化することによって、作り出された（Ｚｉｊｌｓｔｒａ，Ｍ．ら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ，３４４：７４２−７４６；Ｋｏｌｌｅｒ，Ｂ．ら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１２２７−１２３０；マウスは、Ｂ．Ｋｏｌｌｅｒに提供して頂いた）。これらのクラスＩ−欠損マウスもまた、ＣＤ４^-ＣＤ８⁺Ｔ細胞サブセットを作らない。クラスＩ欠損マウスは、一般的に健康であり、抗体応答を生ずる能力、および様々なウイルス感染にもかかわらず生存する能力を持つ；しかしながら、そのようなマウスは、正常な同腹子仲間（ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓ）より細胞内寄生物により感受性である。クラスＩ分子が実験的ＳＬＥの誘発または伝播に一役を演ずるか否かを決定するために、この疾病を発症する能力について、クラスＩ欠損マウスを試験した。マウス（４−６グループ、１２９系統−クラスＩ欠損）を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中、アフィニティーで精製した１μｇのヒトモノクローナル１６／６Ｉｄを後足皮内に注射して免疫化し、そして３週間後、リン酸緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）中の１μｇの１６／６Ｉｄで追加免疫した（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２２６０−２２６４）。ニワトリのオバルブミン（ＧｒａｄｅＶ、ＳｉｇｍａＣｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ０）での１２９系統−クラスＩ欠損マウスの免疫化は、２０μｇで行い、１６／６Ｉｄと同じレジメンに従った。クラスＩ−欠損動物内の抗−１６／６Ｉｄおよび抗−ＤＮＡ抗体の分析対照のクラスＩ⁺１２９系統マウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）内、抗−１６／６Ｉｄおよび抗−ＤＮＡ応答を、ＥＬＩＳＡによって、血清内で検出した。ＥＬＩＳＡは、Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８５：２２６−２２６４；Ｈｅｉｎｅｍａｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８７、ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ，３２：３４５−３９３）に記載の方法に従って、１６／６Ｉｄおよび抗−１６／６Ｉｄを用いて行われた。抗−１６／６Ｉｄおよび抗−ＤＮＡ応答は、追加免疫後１０日以内に検出され、少なくとも６ヶ月間持続した；追加免疫後１０週の動物からの結果を示している（図１Ａおよび１Ｂ）。１６／６Ｉｄで免疫化した動物からの血清は、有意の抗 −ヒトイムノグロブリン反応性を含んでいなかった。クラスＩ−欠損マウスは、対照の１２９系統マウスと同時に、抗−１６／６Ｉｄ抗体を作り出す１６／６Ｉｄで免疫化され、対照マウス１２９系統と有意には違わない力価を有していた（図１Ａ）。対照的に、クラスＩ−欠損マウスの血清は、有意の抗−ＤＮＡ抗体を含んでいなかった（図１Ｂ）；有意の抗−ＤＮＡ応答は、最大で少なくとも６ヶ月の間、クラスＩ−欠損動物内では検出されなかった。この期間、抗−１６／６Ｉｄの力価は、クラスＩ欠損動物および対照の１２９系統動物の両方の血清内で、高いままである。さらに、抗−核抗原抗体は、クラスＩ−欠損動物の血清内では検出されなかったが、１６／６Ｉｄで免疫化した１２９系統動物の血清内には見出された（図１Ｃ）。クラスＩ−欠損マウスは、オバルブミンでの免疫化が正常マウスの抗体応答と著しくは異ならない抗体応答を引き出すため、一般的に抗原に対する応答は貧弱ではない（図１Ｄ）。以前は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、１６／６Ｉｄに対して応答しないと、報告されていた（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９９０、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６９：２２８−２３６）。Ｃ７ＢＬ／６マウスは、抗−１６／６Ｉｄ抗体を生成することが出来ないため、この非応答は、抗−１６／６Ｉｄ抗体を作り出すが、抗−ＤＮＡまたは抗−核抗原抗体を作らないクラスＩ欠損マウスの応答とは異なる。さらに、Ｃ５７ＢＬ／６ＸクラスＩ−欠損Ｆ１マウスは、１６／６Ｉｄに正常に応答した。モノクローナル抗−１６／６Ｉｄ抗体での免疫化に対するクラスＩ−欠失動物の応答１６／６Ｉｄで免疫化した正常マウスの抗−ＤＮＡ抗体の発生は、抗−抗−１６／６Ｉｄ抗体の生成と相関する（Ｍｅｎｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：７１８−７３０）；抗−１６／６Ｉｄでの免疫化は、ＤＮＡおよび核抽出物に対する抗体ならびに実験的ＳＬＥの誘因となる（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９：２２６０−２２６４）。クラスＩ−欠損マウスが、１６／６Ｉｄでの免疫化に応答して抗−ＤＮＡ抗体を発生できないことは、それらマウスが抗−１６／６Ｉｄに応答しない可能性を上昇させた。この可能性は、クラスＩ−欠損マウスをネズミのモノクローナル抗−１６／６Ｉｄで免疫化することによって、評価された。マウス（６グループ）は、ＣＦＡ中の２０μｇのモノクローナル、抗−１６／６Ｉｄ１Ａ３−２（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９：７２９−７３４）を後足に注射して免疫化し、そして３週間後、同量のモノクローナル抗体／ＰＢＳで追加免役した。対照となる抗−Ｉｄ抗体（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ，Ｓ．ら、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９：７２９−７３４）を注射したマウスは、応答を発生しなかった。対照の１２９系統マウスがすべて、抗−１６／６Ｉｄイディオタイプに応答したにもかかわらず、クラスＩ−欠損マウスはすべてに応答しなかった（図２Ａ−２Ｄ）。このように、クラスＩ−欠損マウスは、オバルブミンおよび１６／６Ｉｄに応答する能力を持つが、それらのマウスは、抗−１６／６Ｉｄ抗体に対する応答を欠く（図１Ａ−１Ｄおよび２Ａ−２Ｄ）。１６／６Ｉｄで免疫化した正常およびクラスＩ欠失のマウスにおける白血球減少、蛋白尿および免疫複合疾病の分析１６／６Ｉｄでの対照１２９マウスの免疫化は、広範囲の抗体応答を引き出すだけでなく、白血球減少、蛋白尿、および腎臓の免疫複合疾病もまた誘発する（表１、図３Ａ）。クラスＩ−欠損マウスは、１６／６Ｉｄ免疫化後、全範囲の抗体応答をマウントしなかったため、これらの疾病の臨床的出現へのそれらの感受性をモニターした。全血液をマウスの尾静脈からヘパリン内に収集し、ＰＢＳで１：１０に希釈し、次いで、蒸留水中の１％酢酸で１：１０に希釈して、赤血球を溶解した。その後、白血球を、慣用の方法を用いて、顕微鏡を用いて血球計測器でカウントした。尿中のタンパク質レベルは、Ａｍｅｓ２８５５Ｕｒｉｓｔｉｘ（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ）を用いた慣用の比色アッセイで測定した。クラスＩ欠損マウスのいずれもが、白血球減少または蛋白尿のどちらの証拠も示さなかった（表１）。対照およびクラスＩ−欠損動物の腎臓での免疫複合疾病の評価は、前記したようなＦＩＴＣ−結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ガンマ鎖特異的：ＳｉｇｍａＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．；Ｆｒｉｃｋｅ，Ｈ．ら、１９９１、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｂｙ，７２：４２−４２７）で固定し染色した冷凍腎臓切片、厚さ５μｍを用いて、免疫組織学的に決定した。免疫複合体沈査は、１６／６Ｉｄ−免疫化対照マウスの腎臓内に容易に検出されたが；そのような沈査は、クラスＩ−欠損動物の腎臓内には見出されなかった（図３Ｂ）。合わせて、これらのデータは、クラスＩ−欠損マウスが実験的ＳＬＥを発症しないことを示している。表Ｉの説明。免疫してから５ヵ月または６ヵ月後、クラスＩ欠損マウスおよび対照の129マウスから血液を採取した。白血球数は、個々の動物について計測した。結果は平均±標準誤差を表わしている。16/6Idによって免疫したクラスＩ欠損マウスおよび対照の129動物の白血球数は、顕著に異なる(p<0.002)；16 /6Idまたは卵白アルブミンによって免疫したクラスＩ欠損動物の白血球数は、顕著に違わず(p<0.2)、正常範囲にある。尿中のタンパク質はエイムス2855ユリスティックス(Ａmes 2855 Ｕristix)（マイルズ・インコーポレーション(Ｍiles ,Ｉnc.)）を用いて測定した；正常マウスは陰性であった。実施例２ＳＬＥマウスにおける治療薬としてのＭＭＩ実施例１において述べたように、実験的ＳＬＥを誘導するために、完全フロイントアジュバントに加えた、ヒトのモノクローナル抗ＤＮＡ抗体である16/6 Idを用いて、Ｂalb/cマウスの皮内へ免疫し、３週間後に生理食塩水中の16/6Id によって追加抗原刺激した。追加抗原刺激後２週間以内に、すべてのマウスにおいて抗16/6Id抗体が検出された(図4Ａ)。２週間後、マウスはペレット状のＭＭＩを皮内に接種され、その結果この薬剤が３０日間にわたって放出された。これらの実験のペレットは15mgのＭＭＩを含んでいた（１日あたり0.5mg放出；イノベーティブ・リサーチ・オブ・アメリカ、トレド、オハイオ(Ｉnnovative Ｒese arch of Ａmenca,Ｔoledo,Ｏhio))。３０日後に、処置を繰り返した。16/6Id免疫したマウスのいくつかのグループ、すなわち：ＭＭＩのみで処置したマウスまたは、甲状腺機能不全を避けるためにＭＭＩとチロキシン（1.5mg/ペレット、３０日間放出：イノベーティブ・リサーチ・オブ・アメリカ、トレド、オハイオ）で処置したマウス、あるいはＭＭＩ偽薬（イノベーティブ・リサーチ・オブ・アメリカ、トレド、オハイオ）で処置したマウスを評価した。これに加え、16/6Id で免疫しなかった正常マウスを、同等の薬物処方で処置した。マウスから一定の間隔で採血を行い、種々の指数についてモニターした。血清は、実施例１で述べたようにＥＬＩＳＡ法を用い、抗16/6Id抗体および抗ＤＮＡ抗体の存在についてアッセイした。末梢血細胞数を計数し、標識された市販の特異的抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＭＨＣクラスＩおよびクラスIIを含む、さまざまな細胞表面マーカーの発現について分析した。これに加え、実施例１で述べたようにして尿中のタンパク質を測定した。最後に、６ヵ月たった後、マウスを屠殺し、免疫複合体蓄積物について腎臓を調べた。免疫組織学的観察は、実施例１で述べたようにして行った。抗16/6Idおよび抗ＤＮＡ抗体形成におけるＭＭＩの効果 16/6Idによる追加抗原刺激を行ってから２週間以内に、免疫したマウスすべてにおいて、抗16/6Idおよび抗ＤＮＡ抗体の検出を行った(図4Ａ-4Ｂ)。無処置の対照マウスでは、抗16/6Id抗体価は追加抗原刺激後４週間から８週間の間増加し、また抗ＤＮＡ抗体価は追加抗原刺激後４週間の間増加し；いずれも実験期間中安定であった。16/6Id免疫マウスをＭＭＩで処置することにより、処置期間後４ヵ月にわたって、少量ではあるが、再現性のある抗16/6Id抗体価レベルの低下が起こった(表II-Ａ、図4Ｃ)。抗ＤＮＡ抗体価は、ＭＭＩ処置した動物において、無処置の16/6Id免疫動物よりも顕著に低下していた(表II-Ｂ；図4Ｄ)。ＭＭＩとともにチロキシン（Ｔ₄）処置することにより、部分的には抗16/6Id抗体価の低下を回復することができたが(表II；図4Ｃ)、抗ＤＮＡ抗体価については、顕著な効果はなかった(表II；図4Ｄ)。偽薬のみでは、抗体価の穏やかな阻害が起こったが、ＭＭＩの阻害と同等になることはなかった。総合すると、これらのデータは、ＭＭＩ処置によって、抗ＤＮＡ抗体の生成が低下することを示している。 a：Ｒxの列は動物が受けた処理を示す。 a：Ｒxの列は動物が受けた処理を示す。白血球減少症およびタンパク尿症の発症におけるＭＭＩの効果このＳＬＥモデルの特徴的性質は、16/6Id抗体で処置したマウスが時間相関的にかつ、発症しつつある病気の臨床的な発現の一つとして、白血球減少症を発症させることである(図５)。16/6Idで免疫し、ＭＭＩで処置したマウスは白血球減少症を発症しなかった(図５)。ＭＭＩの効果は、チロキシンで同時に処置することによって妨げられず(図５)、また偽薬処置によって繰り返されることもなかった。ＭＭＩ処置後、少なくとも４ヵ月継続したＭＭＩの保護作用は消失した。さらに、16/6Idで免疫したマウスにおける臨床的発現であるタンパク尿症は、ＭＭＩ処置により回避された。腎臓における免疫複合体の発生におけるＭＭＩの効果４から６ヵ月後、16/6Idで免疫したマウスは腎臓機能不全によって死に至る、腎臓における免疫複合体蓄積物を生じた(図６、左)。腎臓は、ＭＭＩ処置が終了してから５ヵ月後のマウスから単離され、実施例１で述べたようにして、凍結および染色された。16/6Idで免疫した動物の腎臓において観察される免疫複合体のパターンは、ＳＬＥ患者由来のヒト腎臓におけるものと似ていた(図６Ａ)。 16/6Id免疫マウスをＭＭＩで処置すると、腎臓傷害の発生が顕著に減少した(図６Ｂ)。ＭＭＩの効果は、チロキシンで同時に処置することによって妨げられず、また偽薬処置によって繰り返されることもなかった。この効果は、ＭＭＩ処置後、少なくとも５ヵ月間見られた。実験的疾患過程における、リンパ球集団へのＭＭＩの効果ＭＭＩが自己免疫甲状腺疾患の治療に広く用いられているが、種々のリンパ球集団へのその効果、および細胞表面へのＭＨＣ抗原の呈示への効果については、これまで検討されてこなかった。ＭＭＩはin vitroにおいてＭＨＣクラスＩの転写を抑制することが示されており(サジ(Ｓaji)ら、1992b)、またそれが実験的なＳＬＥの発生を緩和する能力を持つため、in vivoにおけるリンパ球に対する効果を評価した。エーリッヒ、Ｒ.（Ｅhrlich,Ｒ.）ら、(1989)Ｉmmunogenetics 30: 18-26 、において述べられた方法によると、ＭＭＩ処置された16/6Id免疫マウスまたはＭＭＩ処置されていない16/6Id免疫マウスからの抹消血リンパ球（ＰＢＬ）は、ＭＭＩ処置後のＴ細胞およびＢ細胞の比率について、フローサイトメトリーによって分析した。Ｔ細胞は細胞表面マーカーであるＴhy1の発現によって、またＢ細胞はＢ220またはＭＨＣクラスIIの発現によって、これらマーカーに対する特異的抗体によって検出することにより同定された。これらのＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスII表面マーカー、ならびに他のものに対する抗体は、市販されている(ファーミンゲン、ベーリンガー-マンハイム；エーリッヒ,Ｒ.ら、(1989)Ｉ mmunogenetics30: 18-26)。16/6Id免疫マウス由来のＰＢＬは、15-20％のＢ細胞および25-30％のＴ細胞を一貫してに含んでいた(図7Ａ)。Ｂ細胞でもＴ細胞でもない残りのものは、ナル（null）細胞と名付けられている(図7Ａ)。この分布は６ヵ月の期間に渡って顕著に変動しなかった。ＭＭＩ処置がＴ細胞の比率に殆どもしくは全く効果を示さなかったにもかかわらず、ＭＭＩ処置はＰＢＬにおけるＢ細胞の画分を顕著に低下させた(図7Ａ)。染色されなかった細胞の画分において、付随的な増加が見られた。これらの細胞集団における変化は、ＭＭＩ処置の直後に最も顕著であったが、ＭＭＩ処置が打ち切られてから最大２ヵ月まで継続した。ＭＭＩと組み合わせて行うチロキシン処置は、これらの効果を部分的に逆転する傾向があった。Ｔ細胞およびＢ細胞集団のＭＨＣ細胞表面発現のレベルは、２色フローサイトメトリーによって評価した(エーリッヒ，Ｒ.ら、(1989))。16/6Id処置した動物由来のＰＢＬは、免疫していない対照と顕著に異なるレベルのＭＨＣクラスＩまたはクラスIIを発現しなかった。ＭＭＩ処置は、Ｔ細胞およびＢ細胞の表面における、ＭＨＣクラスＩの発現を低下させた(図7Ｂ、7Ｃ)。これに加え、Ｂ細胞におけるＭＨＣクラスIIレベルもまた低下した(図7Ｄ)。これらの効果は、16/ 6Id追加抗原刺激後の初期、およびＭＭＩ処置後１週間以内に最も増強された。フローサイトメトリーによって評価されたように(エーリッヒ，Ｒ.ら、(1989)) 、他の細胞表面マーカーは、ＭＭＩによって影響を受けなかった。実施例３ＮＺＢマウスにおける治療薬としてのＭＭＩＮＺＢxＮＺＷＦ1マウス(ジャクソン・ラボズ、バー・ハーバー、メイン( Ｊackson Ｌabs,Ｂar Ｈarbor,Ｍaine))は、ＳＬＥを自然に発症する(スタインバーグ(Ｓteinberg)、Ａ.Ｄ.ら(1990)Ｉmmunological Ｒeviews 118: 129-163;" Ｃellular and Ｍolecular Ｉmmunology"アバス、リヒトマンとルーバー(Ａbbas ,Ｌichtman,Ｒuber)編(1992)、360ページ)。これらのマウスはまた、腎臓傷害を発症し、抗ＤＮＡ自己抗体を生産する。６週齢のＮＺＢxＮＺＷＦ1マウスは、この時点ではＳＬＥの症状を示さないが、ＭＭＩ治療を開始された。１錠の３０日用ＭＭＩペレット（15mg ＭＭＩ）を、実施例１において述べたように、皮下に毎月接種した。血清中の抗ＤＮＡ抗体については、実施例１および実施例２で述べたように、毎月ＥＬＩＳＡ法で抗体価を調べた。図８に示すように、ＭＭＩは16/6Idモデルにおけるように、この自然発生した疾患モデルにおいても、２ヵ月後に抗ＤＮＡ抗体価を顕著に減少させた(実施例１および実施例２；図1Ａ-1Ｄ、図2Ａ-2Ｄ、および図4Ａ-4Ｄ)。抗ＤＮＡ抗体に対するＭＭＩの効果は、処置後３ヵ月でも、さらに増強された。実施例４ヒトにおけるＳＬＥ治療としてのＭＭＩＳＬＥにかかっているヒトを治療するために、ＭＭＩは経口投与される。初めは１日あたり最大で100mgの投与量で行う。これに続いて、最大２０日間まで50mg、最大２０日間まで40mg、連続的に最大３０日間から６０日間まで5mgから30mgへと減少させていくような、段階的なプログラムを行うこともできる。最大１年あるいはそれ以上の間、１日あたり5mgから10mgの継続投与も行うことができる。ＴＳＨレベルは、ＳＬＥ患者に必要なＭＭＩの治療レベルを評価するために、モニターすることができる。ＴＳＨレベルが正常域よりも顕著に上昇した場合、ＭＭＩ投与量は次の投与レベルまで低下させることができる。それ以外にとるべき方法としては、ＭＭＩ投与量の変更を決めるために、甲状腺ホルモンレベルを用いることもできる。正常域からの顕著な低下は、投与量がより低いという指標として使うことができる。甲状腺機能正常状態を維持するために、患者を甲状腺ホルモン（Ｔ₄またはＴ₃）とＭＭＩで処置することができるため、ＴＳＨレベルはより良い指標である。同様な指数は、子供においても評価に用いてよい。患者は、臨床的兆候および活発な疾患の症状の緩和についてモニターすることができる。特に、モニターされる指数は、自己抗体、特にＤＮＡ抗体、ＰＢＬ細胞表面マーカー、白血球減少症、タンパク尿症、高免疫グロブリン血症および、穿孔生検による腎臓における免疫複合体レベルを含むことができる。実施例５ウィスターラット（Ｗister rat）またはＢalb/cマウスへの移植のための、メチマゾール（Ｍethimazole）を用いた、in vitroにおけるＦＲＴＬ-5の処置ラットＦＲＴＬ-5(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Ａme ncan Ｔype Ｃulture Ｃollection)、ロックヴィル、ＭＤ；ＣＲＬ 8305；ＵＳ 4,609,622；ＵＳ 4,608,341）細胞は、完全6Ｈ培地中でほぼコンフルエントとなるまで培養し、次に正常な完全6Ｈ培地存在下で、5mＭのメチマゾールに対して７２時間さらしたものと、さらさなかったものを用意した(サジら(1992b)) 。次に、４プレートからトリプシン処理によって細胞を移動、および掻き取ることによって、または 2mＭのＥＤＴＡを加えた冷ＨＢＳＳ（ハンクスバランス生理食塩水(Ｈanks Ｂa lanced Ｓaline Ｓolution)）を用いて採取した。細胞を分けるために遠心し、完全培地に再懸濁して再び遠心沈殿させ、0.1mlから0.2mlの培地に懸濁した。次に、細胞を正常のＢalb/cマウス(ＮＩＨ；ジャクソン・ラボズ、バー・ハーバー、メイン)、またはウィスターラット(ＮＩＨ；ジャクソン・ラボズ、バー・ハーバー、メイン)の背中下部の皮下に注入した。６０日後、注入部の細胞を、移植部全体を外科的に切除し、個々の細胞を単離するために、コラゲナーゼとトリプシン混合液および、ニワトリ血清（ＣＴＣ；コーン(Ｋohn)、Ｌ.Ｄ.ら、米国特許第4,609,622号、アンベシ-インピオンベイト(Ａmbesi-Ｉmpiombato)、米国特許第4,608,341号；コーン、Ｌ.Ｄ.とＷ.Ａ.ヴァレンテ(Ｖalente)、ＦＲＴＬ- 5 Ｔoday、アンベシ-インピオンベイトとＨ.ペリルト(Ｐerrild)編、(1989):244 -273)）にさらすことにより注入部より細胞を単離し、次に正常の6Ｈ培地の入ったペトリ皿に蒔いた。甲状腺細胞の存在は顕微鏡によって評価したが；しかしすべての場合において細胞はコンフルエントまで培養し、6Ｈ培地を加えた２４ウエルプレート内で副培養し、次にＴＳＨによって誘導したヨウ素の取り込み、あるいはＴＳＨによって誘導したcＡＭＰレベルを測定する前に、ＴＳＨなしで５日間維持した(コーンら、米国特許第4,604,622号)。ＴＳＨによって誘導された増加は、ＴＳＨで処置していない対照細胞と比較した。甲状腺細胞（ＦＲＴＬ-5 ）は、細胞がＭＭＩで前処理された注入部位由来の培養においてのみ見い出された(表III)。これらの甲状腺細胞を含む培養は、ＴＳＨによるcＡＭＰレベルの上昇と、ＴＳＨによるヨウ素取り込みの上昇も示した(表III)。それと対照的に、ＦＲＴＬ-5細胞がＭＭＩで前処理されていない注入部位由来の培養は、繊維芽細胞しか含んでいなかった(表III)。これに加え、ＴＳＨによるcＡＭＰレベルの上昇と、ＴＳＨによるヨウ素取り込みの上昇は見られなかった。これらの結果は、ＭＭＩによるＦＲＴＬ-5細胞の前処理は、移植後の拒絶を阻害することを示している。同時に培養されたＦＲＴＬ-5細胞を、陽性の対照として用いた。それぞれのグループは、４個体の動物からなっていた。この実験は繰り返して行い、同様な結果を得た。２番目の実験では、それぞれ２匹の動物は、0.2％血清および3Ｈ（インシュリン、ハイドロコルチゾン、ＴＳＨを含まず）で６日間処理し、ＭＭＩ存在下あるいは非存在下で７２時間処理した細胞を与えた。顕微鏡で評価すると、６０日後にはどの動物も甲状腺細胞を持たず、またどのアッセイにおいてもＴＳＨ反応を示さなかった。これは、ＭＭＩの作用が血清を必要とし、またクラスＩが、 in vitroでは血清およびインシュリン、およびハイドロコルチゾン、ＴＳＨがなくてもこれらの条件下で最高に発現されるため、予想されたことである(サジら、(1992b))。第３番目の実験では、ＦＲＴラット甲状腺細胞、すなわちＴＳＨ受容体m ＲＮＡをもたず、甲状腺機能を持たない細胞系列（アンベシ-インピオンベイト、Ｆ.Ｓ.、クーン(Ｃoon)、Ｈ.Ｇ.、(1979)、Ｉnt Ｒev Ｃytol Ｓuppl.10:163- 171；アカミズ(Ａkamizu)Ｔ、ら(1990)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,87:5677 -5681）が、ネオマイシン選択法を用いて、ヒトＴＳＨＲ cＤＮＡで安定にトランスフェクションされた(ファンサンデ(Ｖan Ｓande)Ｊ.ら、(1990)Ｍol.Ｃell. Ｅndocrinol,74:Ｒ1-Ｒ6)。トランスフェクションしたＦＲＴ甲状腺細胞は、ＦＲＴＬ-5細胞と同様に、5mＭのＭＭＩで７２時間処置し、上述のように、Ｂalb/cマウスの背中に移植した。６０日後、細胞を単離し、上述のようにＴＳＨによるcＡＭＰ反応の上昇が示された。ＭＭＩで処置されない、ＴＳＨＲ cＤＮＡでトランスフェクションした対照細胞、あるいはＴＳＨＲ cＤＮＡを持たない対照ＦＲＴ細胞は、同様に移植して評価した場合、ＴＳＨによるc ＡＭＰ反応の上昇を示さなかった。これは、トランスフェクションした遺伝子が、移植された細胞に対するＭＭＩ法に耐えられることを示している。実施例６ゲルシフトアッセイ法による、ＭＨＣクラスＩ発現におけるＭＭＩの効果の評価材料精製したウシＴＳＨは、ＮＩＨプログラム由来(ＮＩＤＤＫ-bＴＳＨ-Ｉ-1 ，30Ｕ/mg)、あるいは以前に述べられたようにして調製した(コーン、Ｌ.Ｄ.とウィナンド(Ｗinand)、Ｒ.Ｊ.(1975)Ｊ.Ｂiol,Ｃhem.,250:6503-6508)。インシュリン、ハイドロコルチゾン、ヒトのトランスフェリン、ソマトスタチン、グリシル-Ｌ-ヒストジル-Ｌ-リジンアセテートは、（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）から入手した。［¹²⁵Ｉ］cＡＭＰラジオイムノアッセイキット、［α -³²Ｐ］dＣＴＰ(3000Ｃi/mmol)、および［³²Ｐ］ＵＴＰ（3000Ｃi/mmol）はデュポン／ニューイングランドニュークレアー（ＤuＰont/Ｎew Ｅngland Ｎuclear ）（ボストン、ＭＡ）から入手した。細胞培養ＦＲＴＬ-5ラット甲状腺細胞（コーンら、米国特許第4,609,622号、アンベシ-インピオンベイト、ＥＳ、米国特許第4,608,341号）は述べたようにして増殖させる。これらの細胞は、ＴＳＨがなければ増殖しないが、ＴＳＨがなくても長期間生存したままでいる。それらの世代時間は約３６±６時間であり；ＴＳＨ（5Ｈ）を含まず、5.0％の血清を含む培地中で６日後では、1x10^-10mol/ＬのＴＳＨは８から１０倍にヨウ素の取り込みを増加させ、チミジンの取り込みを１０倍以上増加させた。細胞は２倍体であり、大部分の実験においてその５から２５回の植え継ぎを行ったもので、５％の子ウシ血清、1mmol/Ｌの非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）および６種のホルモン混合物(6Ｈ培地)：すなわち、ＴＳＨ(1x10^-10mol/Ｌ)、インシュリン(10mg/Ｌ)、ハイドロコルチゾン(1nmol/Ｌ)、ヒトのトランスフェリン(5mg/ Ｌ)、ソマトスタチン(10μg/Ｌ)、およびグリシル-Ｌ-ヒスチジル-Ｌ-リジンアセテート（10μg/Ｌ）を添加した、クーンの修飾Ｆ12培地において日常的に培養された(コーン、Ｌ.Ｄ.ら、米国特許第4,609,622号、アンベシ-インピオンベイト、Ｅ.Ｓ.、米国特許第4,608,341号)。それらは７−１０日ごとに植え継がれ、２日または３日ごとに新鮮な培地が与えられた。それぞれの実験において、使用前４−６日の間、細胞は５％または０．２％の血清を加えたＴＳＨを含まない培地(5Ｈ)、ＴＳＨおよびインシュリンを含まない培地(4Ｈ)、またはＴＳＨとインシュリンを含まず、またハイドロコルチゾンを含まない培地（3Ｈ）にシフトされた。細胞抽出物細胞は５％の子ウシ血清を添加した６Ｈ培地中で、６−７日間、７０−８０％コンフルエントまで培養され、次に５％の子ウシ血清を添加した５Ｈ培地に５日間シフトされた。ＴＳＨ（1x10^-10Ｍ）および／またはＭＭＩ（5mＭ）が、適当な濃度になるように４０−４４時間添加された。次に細胞を採取し、ディグナム,Ｊ.(Ｄignam)らの方法、Ｍethods in Ｅnzymology,101:582-598、の変法によって抽出物を調製した。簡単に述べると、細胞を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗った後、掻きとることによって採取した。続いて、それらを沈殿させ、冷ＰＢＳで洗い、次に再び沈殿させた。沈殿をディグナム緩衝液Ｃ（20m ＭＨepes緩衝液、pＨ7.9、1.5mＭＭgＣl₂、0.42ＭＮaＣl、25％グリセロール、0.5mＭジチオスレイトール、0.5mＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド、１μg/mlロイペプチン、１μg/mlペプスタチン）に再懸濁した。最終的なＮa Ｃl濃度は、細胞ペレットの容量に基づいて0.42Ｍに調整し、細胞を凍結融解を繰り返すことによって溶解した。次にこの抽出物を、４℃で２０分間、10,000xg で遠心分離した。上清を回収し、小分けして−７０℃で保存した。ゲル・モビリティー・シフト・アッセイ結合反応は、20μlの容量で、室温で３０分間行った。典型的な反応混合液は1.5fmolの³²ＰＤＮＡ、３μgの細胞抽出物、10mＭＴris-Ｃl(pＨ7.9)中の３μgのポリ(dＩ-dＣ)、1mＭＭgＣl₂、1mＭジチオスレイトール、1mＭＥＤＴＡおよび5％グリセロールを含む。特異性を確かめるために、標識していない競合物（１００倍から１０００倍過剰量の２本鎖オリゴヌクレオチド、または２００倍過剰量のＰＤ１プロモーター断片）を、³²Ｐを加える２０分前に、適当な対照結合反応液に添加した。インキュベーションした後、反応混合液を0.5xＴＢＥ中４％ポリアクリルアミドゲルで９０分から１２０分間、160Ｖで電気泳動し(サムブルック( Ｓambrook)、Ｊ.、ら、(1989))、次に乾燥させてオートラジオグラフィーを行った。プローブは、製造社の指示にしたがってクレノー酵素（インビトロ・ラベリングキット、アマシャム(Ｉn Ｖitro labeling kit,Ａmersham)）によって標識し、Ｇ-50カラムで精製した(5'末端→3'末端)。正の調節および負の調節(それぞれエンハンサーまたはサイレンサー領域) 因子は、ブタのＭＨＣクラスＩ遺伝子、すなわちＰＤ１のプロモーターにおいて同定されている(シンガー(Ｓinger)とマグアイアー(Ｍaguire)(1990))。これらのエンハンサーおよびサイレンサー領域は、トランス因子によって仲介されている(シンガーとマグアイアー(1990)Ｃirt.Ｒev.Ｉmmunol.10:235-257)。２つの調節ドメインが、ＰＤ１遺伝子の５’隣接領域において同定されている。一つの調節ドメインは、転写開始部位から約-1塩基から-300塩基の間に存在する。この領域はインターフェロン応答エレメントおよび主要エンハンサーを含み、また、サイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）と相同的な部位を含む。ゲル・モビリティー・シフト・アッセイを用いた研究は、ＴＳＨ/ＣＡＭＰにより誘導されたか、または修飾されたタンパク質が、この領域と相互作用し、また転写開始を調節できることを示している(サジら、(1992a))。もう一つの複合的調節領域は、サイレンサーとエンハンサー活性の重複を示すが、プロモーターの上流−６９０塩基から−７６９塩基対の間にマップされている(ワイスマン(Ｗeissman)、Ｊ .Ｄ.とシンガー、Ｄ.Ｓ.(1991)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.11:4217-4227)。エンハンサーおよびサイレンサーエレメントは、クラスＩ遺伝子の組織特異的発現と、組織特異的レベルに関連している(ワイスマン、Ｊ.Ｄ.とシンガー、Ｄ.Ｓ.(1991))。サジら、(1992b)の研究は、ＭＭＩで処置したラットＦＲＴＬ-5細胞において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現が低下することを示した。この研究はまた、ＭＨＣクラスＩの発現におけるＭＭＩの効果が転写レベルで起こることを示した。したがって、ＦＲＴＬ-5甲状腺細胞の系は、ＭＭＩの効果に関わる、調節性のＤＮＡ配列エレメントおよびトランス作用因子を同定するための良い系である。ＰＤ１ゲル・シフト・モビリティー・アッセイは、ＰＤ１遺伝子の５’隣接領域および、ＭＭＩ、ＴＳＨ、ならびにＭＭＩとＴＳＨで処理したＦＲＴＬ-5細胞からの細胞抽出物を用いて行った。図9Ａ-9Ｂは、図に示されているようにＰＤ１プロモーター(ＳＥＱＩＤＮＯ:1)の５’部分の１５１領域(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５４塩基から２２０塩基)、１１４領域(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第２２１塩基から３２０塩基)、１４０領域(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第３２１塩基から４５５塩基)、および２３８領域（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第４５６塩基から６９２塩基）を含むＰＤ１プロモーター配列を示している(ワイスマン、Ｊ.Ｄ.とシンガー、Ｄ.Ｓ．(1991))。図１０は、１４０領域のサイレンサーおよびエンハンサー領域（ＳＥＱＩＤＮＯ:2）を、ゲルシフト活性についてその領域をマップするために用いたオリゴヌクレオチドとともに示している。関連するサイレンサー領域は、ＴＴＦ-2様の、インシュリン感受性エレメントによって分離された反対向きの矢印で示してある。図１１は、配列の相同性を示すために、ＰＤ１プロモーターの１１４領域(ＳＥＱＩＤＮＯ:36)、１４０領域(ＳＥＱＩＤＮＯ:37)、および２３８領域の１０５領域（ＳＥＱＩＤＮＯ:35）を並べたものを示している。サイレンサー領域は、ＴＴＦ-2様の領域によって分離された矢印で示してある。これらの断片は、ＰＤ１クラスＩＭＨＣ遺伝子のＰＤ１プロモーター由来である(シンガーＤ.Ｓ.ら、(1 982)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ,79:1403-1407)。図12Ａ-12Ｄは、図９に示されている、放射性標識した１４０領域（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第３２１塩基から４５５塩基）(図12Ａと図12Ｄ)、１１４領域（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第２２１塩基から３２０塩基）(図12Ｂ)、および１５１領域(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５４塩基から２２０塩基)（図12Ｃ）断片を用いたゲルシフトを示している。ＭＭＩによって影響を受ける複合体はＡという印をつけてある。図12Ａ、図12Ｂおよび図12Ｃにおいて、レーン４はサイレンサー領域（図１０と以下を参照のこと）と、5Ｈ培地（ＴＳＨ無添加）と５％の血清存在下で維持したＦＲＴＬ-5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物との間で形成された複合体を示している。5Ｈ培地中で維持した細胞から調製物を抽出する前に、２４時間5mＭのＭＭＩを添加した効果は、図12Ａから図12Ｄのレーン５に示されている。5Ｈ培地中で維持した細胞から調製物を抽出する前に、２４時間1x10^-10ＭのＴＳＨを添加した効果は、図12Ａから図12Ｃのレーン６に示されている。5Ｈ培地中で維持した細胞から調製物を抽出する前に、２４時間5mＭのＭＭＩおよび1x10^-10ＭのＴＳＨを添加した効果は、図12Ａと図12Ｂのレーン７に示されている。抽出物を調製する前に、７日間1x10^-10ＭのＴＳＨを添加した効果（6Ｈ，ＭＭＩ-）は、図12Ａから図12Ｃのレーン３に示されている。抽出物を調製する前に、２４時間5mＭのＭＭＩおよび1x10^-10ＭのＴＳＨを添加した効果（6Ｈ，ＭＭＩ+）は、それぞれの場合のレーン２に示されている。図12Ａから図12Ｃのレーン１は、放射性標識したプローブのみを含む。２００倍過剰濃度の、非標識の１５１断片（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５４塩基から２２０塩基）が、標識した１５１断片（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５４塩基から２２０塩基）による複合体Ａの形成を競合する能力は、図 12ＣのレーンＣに示されている。ＭＭＩ感受性のＡ複合体形成を阻害するための、２００倍過剰濃度の非標識の１０５（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５８８塩基から６９２塩基）(図12Ｃのレーンａ)、１４０領域（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第３２１塩基から４５５塩基）(図12Ｃのレーンｂ)、および１１４領域（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第２２１塩基から３２０塩基）(図12Ｃのレーンｄ)がしめされており、これらはそれぞれの複合体で形成される複合体Ａが、同一のものであることを示している。パネルＤでは、レーンｅはサイレンサー領域（図１０および下記を参照）と、0.2％子ウシ血清を含む3Ｈ培地存在下で維持したＦＲＴＬ-5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物との間で、基本的なＡ複合体が形成されることを示している。5％血清を加えた5Ｈ中で維持された細胞に比べ(図１２Ａ)、ＭＭＩ(レーンｆ)、ＴＳＨ(レーンｇ)、あるいはその両者を一緒に（レーンｈ）２４時間加えても、3Ｈ培地中でのＡ複合体の形成には影響なかった(図１２Ｄ)。３Ｈ培地はインシュリンもＴＳＨも含まない。２００倍過剰濃度の非標識の１０５（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５８８塩基から６９２塩基）(レーンｉ)が３Ｈ培地におけるＭＭＩ非感受性のＡ複合体の形成を阻害する能力は、同じ複合体が関与するかも知れないことを示すが、３Ｈ培地にインシュリンおよび／または血清が含まれないことが、ＴＳＨとＭＭＩの阻害効果を妨げている。３Ｈ細胞抽出物非存在下で、Ａ複合体が形成されないことは、レーンｊに示してある。図１４（Ａ）は、図９に示される放射性標識した２３８断片(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第４５６塩基から６９２塩基)と、５％血清を加えた５Ｈホルモン混合液(ＴＳＨを含まず)（５Ｈ基本培地）中で維持されたＦＲＴＬ-5ラット甲状腺細胞抽出物とを用いて行ったゲルシフトを示している(レーン２)。ＭＭＩによって影響される複合体をＡとして示した；5mＭのＭＭＩと、1x10^-10ＭのＴＳＨで２４時間処置したＦＲＴＬ-5細胞由来の細胞抽出物による、この複合体形成の阻害は、レーン１４に示されている。２３８コンストラクト（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第４５６塩基から６９２塩基）は、１０５コンストラクト（ＳＥＱＩＤＮＯ:1 の第５８８塩基から６９２塩基）を含む(図９参照)；放射性標識した２３８（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第４５６塩基から６９２塩基）の２００倍過剰濃度の非放射性標識の１０５（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５８８塩基から６９２塩基）が、複合体Ａの形成を阻害する活性をもつことによって明らかなように、複合体Ａは２３８コンメトラクト（第４５６塩基から６９２塩基）の１０５部分（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５８８塩基から６９２塩基）で形成される(レーン３)。レーン２のＡ複合体はサイレンサー領域の間で形成され(図１０と上を参照)、また以下によって明らかなように、１１４(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第２２１塩基から３２０塩基) 、１４０(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第３２１塩基から４５５塩基)、および１５１（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５４塩基から２２０塩基）コンストラクト（図１２）と形成されるものと同じである。第一に、放射性標識した２３８（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第４５６塩基から６９２塩基）に比べ、２００倍過剰濃度の非放射性標識の１１４（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第２２１塩基から３２０塩基）(レーン４)および１４０（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第３２１塩基から４５５塩基）(レーン５)がＡ複合体形成を阻害し；２００倍過剰濃度の151（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５４塩基から２２０塩基）は部分的にしか阻害しない(レーン６)。第二に、放射性標識した２３８に比べ、１０００倍濃度のサイレンサー領域の配列をもつ２本鎖オリゴヌクレオチド（図１０のＳ２(ＳＥＱＩＤＮＯ:4)）が、Ａ複合体の形成を阻害し；エンハンサーエレメントの配列に似せた、同じ濃度の２本鎖オリゴヌクレオチド(図１０のＥ１(ＳＥＱＩＤＮＯ:20))はＡ複合体形成になんの影響ももたなかった。サイレンサー配列を修飾したオリゴヌクレオチド（図１０のＳ１( ＳＥＱＩＤＮＯ:3)、Ｓ３(ＳＥＱＩＤＮＯ:10)、Ｓ６(ＳＥＱＩＤＮＯ:6)、Ｓ７(ＳＥＱＩＤＮＯ:7)およびＳ８(ＳＥＱＩＤＮＯ:8)）は、１０００倍濃度で部分的な阻害作用を示した(レーン９−１３)。Ｓ１（ＳＥＱＩＤＮＯ:3）による阻害（レーン１２）は、図１０中の矢印で示された末端反復部分の一つのみの変異が、阻害作用を低下させるために十分であることを示唆しており；Ｓ８（ＳＥＱＩＤＮＯ :8）による部分的な阻害（レーン１０）は、チログロブリン（thyroglobulin）プロモーター（サンティステーバン(Santisteban)、Ｐ.ら、およびＭol.Ｅndocr inol.6: 1310-1317,1992）のＴＴＦ-2と反応する配列に類似し、また逆方向反復配列（図１０）の間にあるエレメントもまた、Ａ複合体の形成に重要であることを示唆した。この結論は、レーン７の結果によって支持される。１０００倍濃度の、チログロブリンプロモーター（サンティステーバン、Ｐら、Ｍol.Ｅndocrin ol.6: 1310-1317,1992）の甲状腺転写因子-2(ＴＴＦ-2)反応性エレメントの配列に類似したＫオリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ:38）が存在することがＡ複合体形成を増強し、またレーン１５の結果は、１０００倍濃度の、非標識のＫオリゴヌクレオチド（ＳＥＱＩＤＮＯ:38）が、ＭＭＩ/ＴＳＨの作用を逆転することができたことを示す。したがって、ＭＭＩ感受性Ａ複合体形成の低下は、ＴＴＦ-2とインシュリンを必要とし、これは図１２Ｄのデータと一致する。Ｋオリゴヌクレオチド(ＳＥＱＩＤＮＯ:38)はインシュリンによって誘導されたＴＴＦ-2と「結び付き」、これは複合体形成の増加とＭＭＩ効果の低下をまねき、これはすなわちインシュリンの必要性があるということである。図１４（Ｂ）はさらに、ＭＭＩの作用に対するＴＴＦ-2の重要性を示し、またＭＭＩの効果をアッセイするもう一つの手段を提供する。図１４（Ｂ）は、放射性標識したＫオリゴヌクレオチド(ＴＧＡＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡ)（ＳＥＱＩＤＮＯ:38）および、５％血清を含む５Ｈホルモン混合液(ＴＳＨを含まず)（５Ｈ基本培地）の存在下で維持された、ＦＲＴＬ-5ラット甲状腺細胞由来の細胞抽出物とを用いたゲルシフトを示している(レーン１６) 。形成された上部のＦＲＴＬ-5細胞タンパク質／ＤＮＡ複合体は、5mＭのＭＭＩ (レーン１７)、1x10^-10ＭのＴＳＨ(レーン１８)、および5mＭのＭＭＩと1x10^-10 ＭのＴＳＨ（レーン１９）によって、２４時間細胞を処置することによって阻害される。したがって、ＴＴＦ-2上部タンパク質／ＤＮＡ複合体は、ＭＭＩの作用に必須であり、また図１４Ａで示されたＡ複合体形成に重要である。その形成阻害はＭＭＩの影響をアッセイする手段であり、またＭＭＩ作用のインシュリン依存性を支持するものである。図１２ＡからＤ、および図１４ＡからＢにいてＡ複合体の下に検出される複合体は、エンハンサー複合体（Ａ複合体の下で、最も上のバンド）または非特異的複合体であると考えられている。図１２ＡからＤ、および図１４ＡからＢにおいて、オートラジオグラフィーの最も下にある強いシグナルは、結合しなかったプローブである。これらの結果を総合すると、複合体形成阻害は、ＭＭＩまたは他の薬がＭＨＣクラスＩ転写を負に調節することの指標として使うことができる。Ａ複合体は、異なるタンパク質から構成されると考えられている。異なるタンパク質は、組織間の組織特異的複合体のレベルを決定するために重要である。ＴＳＨはＰＤ１プロモーターの-200から-1領域において、新たな甲状腺特異的複合体の形成を誘導した。この複合体はまた、5mＭのＭＭＩによって増加し、これにはＴＴＦ-2様の転写因子が関与した。この複合体はＡ複合体が減少するにつれて増加した。その形成は、ＴＡＴＡＡボックス活性と関連していた。われわれは、この甲状腺特異的タンパク質／ＤＮＡ複合体が組織特異的サイレンサー／エンハンサー複合体をしのぎ(図１０)、クラスＩ遺伝子の転写開始を低下させることによって、遺伝子発現を低下させるという考えを提案する。実施例７ＣＡＴアッセイを用いた、ＭＨＣクラスＩの発現におけるＭＭＩの効果の評価プラスミド構造、ＤＮＡプローブおよびオリゴヌクレオチド pＳＶ3ＣＡＴのマルチクローニングサイトに挿入した、全長のＰＤ１プロモーターおよびＰＤ１ＣＡＴコンストラクトpＨ(-38)は、以前説明されている( エーリッヒ、Ｒ.ら(1989)Ｉmmunogenetics 30: 18-26)。pＳＶ3ＣＡＴのマルチクローニング部位に挿入した、全長のＰＤ１プロモーターの連続的欠失突然変異については、以前説明されている(シンガーとワイスマン(1991)；サジら(1992a) ；サジら(1992b))。簡単に述べると、ＰＤ１遺伝子の上流制御領域の５’内部欠失シリーズは、Ｂal31消化によって作成した；５’末端シリーズは-1012塩基対から-68塩基対に渡り；すべては+15塩基対のところで、共通な３’境界を持っていた。この欠失シリーズはまた、プロモーター活性を評価するために、pＳＶ3ＣＡＴレポーターコンストラクトにもクローン化された(シンガーとワイスマン(1991)；マグアイアー(Ｍaguire)、Ｊ.ら、(1992)Ｍol.Ｃell.Ｂiol 12 3078-3086)。図１３は、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ) キメラを用いたトランスフェクションデータを示しており、これはＭＭＩが全長ＰＤ１プロモーター活性を阻害することを示している。ラットＦＲＴＬ-5甲状腺細胞は、以前述べられたエレクトロポレーション法（サジら、1992b）によってトランスフェクションする１２時間前に、５％子ウシ血清を含む新鮮な６Ｈ培地に加えられた。簡単に述べると、ＦＲＴＬ-5細胞は８０％コンフルエントまで増殖させ、採取し、洗浄し、0.8mlのエレクトロポレーション緩衝液(272mＭショ糖、7mＭリン酸ナトリウム,pＨ74、および1mＭＭ gＣl₂)中に、1.5x10⁷細胞/mlで懸濁した。20μgの全長ＣＡＴコンストラクトを、５μgのpＳＶＧＨとともに添加した。次に、細胞に電気パルスをあたえ(３３０ボルト、電気容量25μＦＤ)、そしてプレートにまき(プレートあたり約6x10⁶ 細胞)、５％の子ウシ血清培地を含む６Ｈ培地中で１２時間培養した。このとき、細胞は５％子ウシ血清を加えた５Ｈ培地(対照)、５％子ウシ血清と5mＭＭＭＩを加えた５Ｈ培地(ＭＭＩ+)、５％子ウシ血清を加えた６Ｈ培地(ＴＳＨ+)、もしくは５％子ウシ血清と5mＭＭＭＩを加えた６Ｈ培地(ＭＭＩ/ＴＳＨ)内に置かれた。４０時間後、それらを採取する。細胞生存率は約８０％であった。トランスフェクション効率を調べるためのhＧＨ放射免疫アッセイに用いるために、培地を採取し(ニコルス研究所、Ｓan Ｊuan Ｃapstrano,ＣＡ)、そして細胞をＣＡＴアッセイ用に採取し、これには130μlの終容量中で20-50μgの細胞を用いた。インキュベーションは３７℃で２時間から４時間行い；アセチル化されたクロラムフェニコールは、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分離し、ＴＬＣプレートの陽性反応を示した部分を切り取り、シンチレーションカウンターで定量した。データは、ＧＨ活性に対するＣＡＴ活性の比として示されている。全長ＰＤ１プロモーターは、１５１（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第５４塩基から２２０塩基）および、１１４(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第２２１塩基から３２０塩基)、および１４０(ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第３２１塩基から４５５塩基)、および２３８（ＳＥＱＩＤＮＯ:1の第４５６塩基から６９２に比べてＣＡＴ活性を低下させる。連続的欠損突然変異体のキメラ型ＣＡＴコンストラクトのＣＡＴ活性は、クラスＩプロモーター活性に対する、ＭＭＩの効果をアッセイするために、ＣＡＴアッセイに用いることができる。したがって、ＣＡＴ活性はクラスＩプロモーター活性に対する、ＭＭＩの効果をアッセイするもう一つの方法であり、また自己免疫疾患の治療または移植療法に関連する治療作用に関して、ＭＭＩをまねることができる他の薬剤を評価するために用いることができる。実施例８上流サイレンサー／エンハンサーを制御する転写因子の同定と、これらの因子に対するＭＭＩ/ＴＳＨの効果。材料と方法材料。ＴＳＨおよび他のホルモンは、実施例６と同様である。ＭＭＩとインシュリンはシグマケミカル社（セントルイス、ＭＯ）から入手し、またＮＦ-_KＢのｐ５０およびｐ６５サブユニットに対するウサギポリクローナル抗体、ｃ−ｆｏｓファミリーおよびｃ−ｊｕｎ／ＡＰ１は、サンタクルーズ・バイオテクノロジー、Ｉnc.（Ｓanta Ｃruz Ｂiotechnology）(サンタクルーズ、ＣＡ)から入手した。［α-³²Ｐ］デオキシＣＴＰ（3000Ｃi/mmol）および、［¹⁴Ｃ］クロラムフェニコール（50mＣi/mmol）はデュポン／ニューイングランドニュークレアー（Ｄu Ｐont/Ｎew Ｅngland Ｎuclear）（ボストン、ＭＡ）から入手し；[γ-³²Ｐ]ＡＴＰ（6000Ｃi/mmol）はアマシャム社（アーリントンハイツ、ＩＬ）から入手した。子ウシ血清は、ＧＩＢＣＯラボラトリーズ・ライフ・テクノロジー、Ｉnc. （グランドアイランド、ＮＹ）の加熱処理した、マイコプラズマを含まない製品であった。他のすべての材料は、特にことわりのない限りシグマケミカル社のものを用いた。細胞培養。ＦＲＴＬ-5ラット甲状腺細胞（インターシル・リサーチ・ファウンデーション(Ｉnterthyr Ｒesearch Ｆoundation)、ボルチモア、ＭＤ；ＡＴＣＣＮo. ＣＲＬ8305）は、以前詳細に報告されたすべての性質を保った、新鮮なサブクローン（Ｆ１）であった(実施例６；サジ、Ｍ.ら、(1992a))。新鮮な培地を２日または３日毎に加え、細胞を７日から１０日ごとに継代した。個々の実験において、細胞をＴＳＨを含まない培地(５Ｈ培地)、またはＴＳＨと、インシュリンを含まず、0.2％の血清を含む培地（４Ｈ培地）に６日から８日間シフトされ；示したように他の試薬を添加した。プラスミドの構造、ＤＮＡプローブおよびオリゴヌクレオチド。クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）リポーター遺伝子と連結した、ブタのＭＨＣクラスＩＰＤ１プロモーターの、５’隣接領域の1100塩基対をコードする全長のＰＤ１プロモーターキメラは、クラスＩ配列の-1100塩基対の連続的な欠失突然変異を持つキメラを有するとして述べられてきた（実施例７を参照）(ワイスマン、Ｊ.Ｄ.とシンガー、Ｄ.Ｓ.(1991)Ｍol. Ｃell.Ｂiol.11,4217-4227;ジュリアーニ(Ｇiuliani)、Ｃ.、ら、(1994)Ｊ.Ｂio l.Ｃhem.270,11453-11462；エーリッヒ、Ｒ.、ら、(1988)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.8,6 95-703；マグアイア、Ｊ.Ｅ.ら、(1992)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.12,3078-3086；ハウクロフト(Ｈowcroft)、Ｔ.Ｋ.ら、(1993)ＥＭＢＯＪ.12,3163-3169)。５’末端シリーズは、-1100から-89塩基対に渡り；すべては、＋１５塩基対の位置に共通の境界部分を有した。異なるキメラの番号は＋１、すなわち転写開始点から決定され、本明細書に参考文献として取り入れらている番号を付したヌクレオチドに拡張されている(ジュリアーニ、Ｃ.、ら、(1995)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.270，1453-114 62)。転写開始点は図９のヌクレオチド1091である。ＸbaＩリンカーを付加した後、pＳＶ0ＣＡＴのＮdeＩ部位にマルチクローニング部位を持つ、pＳＶ3ＣＡＴのＸbaI/ＨindIII部位にＰＤ１断片をサブクローニングした。他のＣＡＴコンストラクトは５’末端にＢamＨＩ部位を持つ適当なフォワードプライマーと、３’ 末端にＨindIII部位を持つ転写開始点の-13から+1塩基を持つＰＤ１配列のアンチセンス・リバースプライマーをそれぞれ100pmol用いた、ポリメラーゼ連鎖反応によって作成した。p(-127)ＣＡＴおよびp(-89)ＣＡＴの突然変異は２段階組換ＰＣＲ法によって作成した（サイキ(Ｓaiki)、Ｒ.Ｋ.ら、(1988)Ｓcience239, 487-491；ヒグチ、Ｒ. (1990)ＰＣＲプロトコル：方法と応用法ガイド(ＰＣＲＰrotocols: ＡＧuide to Ｍethods and Ａpplications) (イニス(Ｉnnis)、Ｍ.Ａ.、ゲルファント(Ｇ elfand)、Ｄ.Ｈ.、スニンスキー(Ｓninsky)、Ｊ.Ｉ.、およびホワイト(Ｗhite) 、Ｔ.Ｊ.編、アカデミックプレス社、サンディエゴ、177-183)。第一段階では、重複した配列を持つ２つのＰＣＲ産物を作成し、これらはどちらもＰＣＲプライマーの一部として導入された同じ突然変異を含んでいる。第二段階のＰＣＲはこれらの重複するＰＣＲ産物を鋳型とし、最終産物の５’末端または３’末端のＤＮＡ配列をプライマーとして用いて行った。このＰＣＲ産物を上述のpＳＶ3ＣＡＴまたはプロメガ社（マディソン、ＷＩ）から購入したpＣＡＴ-エンハンサー欠失ベクターおよびpＣＡＴ対照ベクターのマルチクローニング部位に挿入した。p ＣＡＴベクターの場合、ＣＲＥ様配列とその突然変異型を、プライマーの両端にあるＢamＨＩ部位を用いて作成した。本明細書で用いられているブタのクラスＩ（ＰＤ１）遺伝子の、異なる長さの５’隣接領域の下流にＣＡＴ遺伝子を含む、 pＳＶ0系列のコンストラクトは、p(-1100)ＣＡＴ、p(-400)ＣＡＴ、p(-294)ＣＡＴ、p(-203)ＣＡＴ、p(-127)ＣＡＴ、およびp(-89)ＣＡＴと命名され；５’末端から＋１塩基、すなわち転写開始点までのヌクレオチドに基づいて番号を付けている。本明細書で用いるＰＤ１プロモーター領域に対するＤＮＡプローブは、以前報告されたようにして得た(実施例６；ワイスマン、Ｊ.Ｄ.とシンガー、Ｄ.Ｓ .(1991)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.11,4217-4227;ジュリアーニ、Ｃ.、ら、(1994)Ｊ.Ｂi ol.Ｃhem.270,11453-11462；エーリッヒ、Ｒ.、ら、(1988)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.8, 695-703；マグアイア、Ｊ.Ｅ.ら、(1992)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.12.3078-3086；ハウクロフト、Ｔ.Ｋ.ら、(1993)ＥＭＢＯＪ．12，3163-3169)。異なる組織において、ＭＨＣクラスＩのレベルを一定に調節するサイレンサーおよびエンハンサー配列を含む２本鎖オリゴヌクレオチド、およびこれらの部位の突然変異を持つオリゴヌクレオチドは記載されたものである(ワイスマン、Ｊ.Ｄ.とシンガー、Ｄ. Ｓ.(1991)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.11,4217-4227)。同様に、チログロブリン(ＴＧ)のインシュリン応答エレメント(ＩＲＥs)の配列、およびＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）プロモーター、オリゴＫおよびＴＩＦをそれぞれ含む２本鎖オリゴヌクレオチドは、記載された通り合成した(サンティステーバン、Ｐ.ら、(1992)Ｍol.Ｅndo crinol.6,1310-1317；シムラ(Ｓhimura)、Ｙ.ら、(1994)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.269, 31908-31914)。オリゴＫまたはオリゴＴＩＦはまた、トランスフェクション実験のためにアニーリングされ、pＵＣ19プラスミドに挿入した。簡単に述べると、p ＵＣ19プラスミドはＸbaＩで直鎖化し、アルカリホスファターゼによって脱リン酸化し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼを用いて平滑末端をもつオリゴヌクレオチドと連結した。精製した後、方向の信頼性を確かめ、またコピー数を確認するために、プラスミドの配列を決定した(サンガー、Ｆ.、ら、(1977)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci .ＵＳＡ 74,5463-5467)。すべてのプラスミド標品は、ＣsＣl勾配遠心分離法によって２回精製した(デイビス、Ｌ.Ｇ.、ら、(1986)Ｂasic Ｍethods in Ｍolec ular Ｂiology、Ｅlsevier,Ｎew Ｙork,93-98)。トランスフェクションクラスＩプロモーター-ＣＡＴキメラによって安定にトランスフェクションしたＦＲＴＬ-5細胞は、すでに記載されている(ジュリアーニ、Ｃ.、ら、(199 5)Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．270，11453-11462)。ＴＳＨまたはＭＭＩの効果を調べるために、細胞を６Ｈ培地中で７０％から８０％コンフルエントまで生育させ、５日間ＴＳＨなしで(５Ｈ培地)維持し、この間細胞はＣＡＴ活性を測定する前に４０時間、1x10^-10ＭのＴＳＨまたは5mＭＭＭＩにさらされた。同じクラスＩ-ＣＡＴキメラを用いた、一過的トランスフェクションは、２つの方法のうち一方を用い、エレクトロポレーション法（イクヤマ、Ｓ.ら、(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6, 793-804；イクヤマ、Ｓ.ら、(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,1701-1715）を用いて行った。６Ｈ培地中で維持されたＦＲＴＬ-5細胞にトランスフェクションし、１２時間後次の３つの方法の一つで処置された：5mＭのＭＭＩが新鮮な６Ｈ培地とともに添加されるか；６Ｈ培地が新鮮な５Ｈ培地と置換されるか；または細胞が新鮮な６Ｈ培地中で維持された。それ以外の方法としては、ＦＲＴＬ-5細胞は、ＴＳＨなしで（５Ｈ）５日間維持され、トランスフェクションに先立ち、１２時間ＴＳＨを含む培地（６Ｈ）に戻した。次にそれらを６Ｈ培地にまき、次にこの培地を、示したように5mＭのＭＭＩを含む５Ｈ培地またはＭＭＩを含まない５Ｈ培地、およびＴＳＨを含む５Ｈ培地またはＴＳＨを含まない５Ｈ培地と交換した。エレクトロポレーション法（ジーンパルサー(Ｇene Ｐulser)、バイオラッド、リッチモンド、ＣＡ）には、次に述べる例外を含む、実施例７およびすでに述べられた方法で行った(イクヤマ、Ｓ.ら、(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,793-8 04；イクヤマ、Ｓ.ら、(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,1701-1715)。20μgのp(-1100 )ＣＡＴまたは等モル量の欠失突然変異体、またはpＳＶ0ＣＡＴ（陰性対照）のいずれかを用い；これらの量はプラスミド濃度の関数として、トランスフェクション条件を最適化する予備実験において決めた。３６時間から４４時間後に細胞を回収し、20μgの細胞溶解物を用い、３７℃で４時間インキュベーションすることでＣＡＴ活性を測定した(イクヤマ、Ｓ.ら、(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,793 -804；イクヤマ、Ｓ.ら、(1992)Ｍol.Ｅndocrinol.6,1701-1715；ゴルマン(Ｇor man)、Ｃ.Ｍら、(1982)Ｍol.Ｃell Ｂiol.2,1044-1051)。アセチル化したクロラムフェニコールは薄層クロマトグラフィーによって分離し、オートラジオグラフィーを行い；陽性を示す点を切り取り、シンチレーションカウンターで定量した。 20μgずつのキメラクラスＩプロモーター-ＣＡＴコンストラクトとpＵＣ1 9プラスミドを、オリゴＫ、オリゴＴＩＦ、またはそれぞれの突然変異型の存在下、または非存在下で共トランスフェクションするために、ＤＥＡＥ-デキストラン法(ロペタ、Ｍ.Ａ.ら、(1984)Ｎucleic Ａcids Ｒes.12,5707-5717)を用いた。細胞は６Ｈ培地中で８０％コンフルエントとなるまで生育させ、トランスフェクション前に５Ｈ培地に１２時間シフトし、リン酸緩衝生理食塩水、pＨ7.4( ＰＢＳ)で２回洗い、プラスミドＤＮＡと250μgのＤＥＡＥ-デキストラン（５プライム−３プライム社(5Ｐrime-3 Ｐrime,Ｉnc.)）を含む５mlの無血清５Ｈ培地で、１時間インキュベーションした。次に、細胞はＰＢＳに加えた１０％ジメチルスルフォキシドに３分間さらし、ＰＢＳで２回洗い、１２時間５Ｈ培地で培養し、そして、示したように、その中でＭＭＩまたはＴＳＨ存在下、または非存在下でさらに３６時間維持した。ＣＡＴアッセイは上述のようにして行った(実施例７も参照のこと)。トランスフェクション効率は、カリフォルニア大学、ラホヤのＳ.スブラマニ(Ｓubramani)博士によって、快く提供された５μgのpＲＳＶＬucを用いた共トランスフェクションによって決めた。ＣＡＴ値、すなわち３つの実験の平均± 標準誤差は、プロメガのアッセイシステム、およびモノライト2010ルミノメーターを用い、ルシフェラーゼ活性とタンパク量に対して標準化した。細胞の生存率は、すべての実験において約８０％であった。抽出物。細胞抽出物は、次の追加または例外を含め、実施例６に述べたように、すでに記載された方法の修飾法（ディグナム、Ｊ.、ら、(1983)Ｎucleic Ａcids Ｒes.11,1475-1489）によって調製した。同じ実験において、細胞は８０％コンフルエントとなるまで６Ｈ培地中で生育させ、次に５％子ウシ血清を含む５Ｈ培地(-ＴＳＨ)、あるいはわずか０．２％の血清を含む４Ｈ培地(-ＴＳＨ、-インシュリン)において７日間維持した。実験は、細胞を1x10^-10ＭのＴＳＨまたは5mＭのＭＭＩにさらすことで開始した。冷ＰＢＳ、pＨ7.4で２回洗浄した後、５００ｇで遠心することによって沈殿させた。このペレットを２倍量のディグナム緩衝液Ｃ（ディグナム、J.、ら、(1983)Ｎucleic Ａcids Ｒes.11,1475-1489）中に再懸濁し、細胞ペレットの体積に基づいて、最終ＮaＣl濃度を0.42Ｍに調整した。細胞は、凍結融解を繰り返すことによって溶解した。抽出物は４℃、２０分間、35,000rpm（100,000xg）で遠心した。上清を回収し、小分けにして−７０℃で保存した。核抽出物を用い、複数の実験点をとって、たとえば経時的に行う実験などでゲルモビリティーシフト実験あるいはウェスタンブロットアッセイを行うために、１つまたは２つの培養皿から核タンパク質を抽出するための、迅速で効果的な技術を用いた。この方法は、造血細胞核を単離する方法（バンス(Ｂunce)、Ｃ .Ｍ.ら(1988)Ａnal.Ｂiochem.175,67-73）を修飾したものであり、次いで高塩濃度緩衝液を用いて核からタンパク質を抽出する(ヘニングハウゼン(Ｈenninghaus en)、Ｌ.ら、(1987)Ｍethoods in Ｅnzymology 152,721-735)。この方法では、すべての試料および試薬は氷上に保っておく。遠心分離には、微量遠心機を、その最高回転数の設定で用いる。緩衝液Ａならびに緩衝液Ｂは、0.5mＭＤＴＴ、0 .5mＭＰＭＳＦ、2ng/mlペプスタチンＡ、および2ng/mlロイペプチンを含む。典型的なものでは、5x10⁵またはそれ以上の細胞を、Ｍg²⁺とＣa²⁺を含まない１０m lのダルベッコ修飾リン酸緩衝生理食塩水(ＤＰＢＳ)、pＨ7.4を用いて洗浄し、掻きとって１mlのＤＰＢＳを入れた微量遠心管に回収する。室温で３０秒間遠心して細胞を沈殿させ、緩衝液Ａ(10mＭＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、pＨ7.9、10mＭＫＣ l、1.5mＭＭgＣl2、0.1mＭＥＤＴＡ)中、0.3Ｍショ糖、２％トゥイーン４０（Ｔween40）を含む溶液の５倍量に再懸濁し、トライアイス-エタノール中で凍結し、必要であれば、さらに分析するために、−８０℃に保存する。細胞は３７℃の水浴槽で解凍し、黄色いチップを付けた微量ピペットを用いて、核を遊離させるために、５０回から１００回（細胞数および試料の容量に応じて）ピペッティングする。試料を緩衝液Ａ中1.5Ｍショ糖１mlを含む溶液に重層し、４℃で１０分間遠心分離する。核は遠心管の底に沈殿し、細胞質オルガネラおよび細胞膜残査は中間層に位置する。核沈殿物を１mlの緩衝液Ａ中で、３０秒遠心することによって洗浄し、次に１０mlの緩衝液Ｂ(20mＭＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、pＨ7.9、420mＭＮaＣl、1.5mＭＭgＣl₂、0.2mＭＥＤＴＡ、25％グリセロール)に再懸濁する。時々ボルテックスによって撹拌しながら、試料を２０分間氷上に置き、それに続いて４℃で２０分間遠心分離する。核タンパク質を含む上清画分を小分けにし、−７０℃で保存する。ショ糖遠心分離を行う前に、細胞膜を破壊して核を遊離するために適したピペッティング操作は、良い結果を得るために重要である。このショ糖遠心分離を行う前後に、核の純度および／または他の細胞構成要素の分布は、トリパンブルー染色により試料を、位相差顕微鏡のもとで観察することによって調べることができる。電気泳動ゲル・モビリティー・シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）ＰＤ１プロモータープローブは、以前報告されたように、制限酵素切断によって得られ(実施例６および実施例７；ワイスマン、Ｊ.Ｄ.とシンガー、Ｄ.Ｓ .(1991)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.11,4217-4227；ジュリアーニ、Ｃ.、ら、(1995)Ｊ.Ｂ iol.Ｃhem.270:11453-11462；エーリッヒ、Ｒ.、ら、(1988)Ｍol.Ｃell Ｂiol.8 ,695-703；マグアイア、Ｊ.Ｅ、ら、(1992)Ｍol.Ｃell.Ｂiol.12,3078-3086；ハウクロフト、Ｔ.Ｋ.、ら、(1993)ＥＭＢＯＪ.12,3163-3169)、ＱＩＡＥＸ抽出キット(キアジェン社(Ｑiagen)、チャッツワース、ＣＡ)を用い、２％アガロースゲルから精製した。これらは、クレノー断片を用い、[α-³²Ｐ]dＣＴＰで標識し、一方、オリゴＫはＴ4キナーゼを用いて［γ-³²Ｐ］ＡＴＰで放射性標識した。放射性標識したプローブは、１２０Ｖで１時間から２時間、８％非変成ポリアクリルアミドゲル電気泳動することによって精製した(サムブルック、Ｊ.、フリッシュ、Ｅ.Ｆ.およびマニアティス、Ｔ.(1989)Ｍolecular Ｃloning: a labora tory manual，第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラトラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク)。細胞抽出物を用いた結合反応は、室温で３０分間、20μlの容量で行い；反応混合液は、いくつかの実験で示したように、10mＭＴris-Ｃl(pＨ7.9)、1mＭＭgＣl₂、1mＭジチオスレイトール、1mＭエチレンジアミン・四酢酸(ＥＤＴＡ)、５％グリセロール、およびＫＣl中、1.5fmolの［³²Ｐ］ＤＮＡ、および３μgの細胞抽出物、3.0μgのポリ(dＩ-dＣ)を含んでいた。特にふれてあるところでは、標識していない２本鎖オリゴヌクレオチドを競合物質として結合反応に加え、標識したＤＮＡを加える前に、細胞抽出物とともに２０分間インキュベーションした。同様に、抗血清を用いるスーパーシフト実験では、細胞抽出物を、標識したＤＮＡを加える前に、免疫したウサギ血清または正常のウサギ血清いずれかを含む同様の緩衝液中で、室温で２０分間インキュベーションした。インキュベーション後、反応混合液を、室温で、0.5xＴＢＥ中、160Ｖにおいて、１時間から２時間、４％または５％の非変成ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーを行った。転写伸長アッセイ。Ｉn vitroの転写伸長（ラン-オン(run-on)）アッセイは、すでに記載されたようにして行った(サジ、Ｍ.、モリアーティ(Ｍoriarty)ら、(1992)Ｊ.Ｃlin. Ｅndocrinol.Ｍetab.75,871-878；イソザキ、Ｏ.、ら(1989)Ｍol.Ｅndocrinol.3 ,1681-1692)。精製した［³²Ｐ］ＵＴＰ-放射性標識した核ＲＮＡを小分けしたものを、ナイロンメンブレンに固定化した、過剰量のクラスＩ、ＴＧ、およびβ- アクチンcＤＮＡ挿入物、または対照のpＳＧ5（ストラタジーン）またはpＢＲ32 2（ニューイングランドバイオラボ）プラスミドＤＮＡとハイブリッド形成した。Ｓox-4のクローニングと組換え型Ｓox-4タンパク質ラットＳox-4をクローニングするために、８つの反復したチログロブリン・インシュリン応答エレメントをもつ、重合したオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＫ；ＴＧＡＣＴＡＧＴＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＡ）を用い、サザンブロッティング法の変法(ヴィンソン(Ｖinson)、Ｃ.Ｒ.、ら、(1988)Ｇen es Ｄev．2，801-806)によって、λgt11 ＦＲＴＬ-5甲状腺細胞のcＤＮＡ発現ライブラリー（アカミズ、Ｔ.ら、(1990)Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ 87,56 77-5681）をスクリーニングした。最初のスクリーニングでは、ライブラリーを143cm²あたり40,000プラーク形成単位の密度でプレートした。４２℃で４時間置いた後、プレートに10mＭのイソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を染み込ませたニトロセルロースフィルターを重層し、３７℃で１２時間インキュベーションした。培養プレートからニトロセルロースフィルターを取り除き、室温で１５分間風乾した。タンパク質の結合した、乾燥したフィルターは、6Ｍ塩酸グアニジンを含む結合緩衝液（10mＭＴris-ＨＣl、pＨ7.6、200mＭＫＣl、5mＭＭgＣl₂、1mＭＥＤＴＡ、 1mＭジチオスレイトール）中、４℃で１０分間、プラットフォーム型の振盪機を用いて変成させた。このステップを繰り返した後、変成溶液を塩酸グアニジンを含まない等量の結合緩衝液で希釈し、４℃で５分間振盪し続けた。フィルターを塩酸グアニジンの２倍希釈液で５分間、４回繰り返して洗浄し、そしてなにも添加していない結合緩衝液を用いて５分間、２回洗浄し、続いて結合緩衝液に溶かした５％のカーネーション脱脂粉乳を含む、ブロッキング溶液に移した。穏やかに３０分間振盪した後、フィルターを50μg/mlのポリ(dＩ-dＣ)、20μg/mlの変成したウシ胸腺ＤＮＡ、0.62mＭＺnＳＯ₄、および0.25％脱脂粉乳を含む結合緩衝液中で、1x10⁶cpmの³²Ｐ-標識したＤＮＡプローブにさらした。それに続き、オートラジオグラフィーを行う前に、フィルターを４℃で、0.25％の脱脂粉乳を含む結合緩衝液中で１０分間、３回洗浄した。スクリーニングに用いたプローブは、アニーリングし、リン酸化したオリゴヌクレオチドを、Ｔ4リガーゼで連結することによって作成した。ライゲーション産物をアガロースゲル電気泳動で単離し、pＣＡＴ-プロモータープラスミド（プロメガ社、マディソン、ＷＩ）の、平滑化したＸbaＩ部位にクローン化した。必要がある場合は、８回反復したオリゴＫを含むＤＮＡ断片を、保存してあるプラスミドから単離し、ニックトラスレーションし、スクリーニングのプローブとして使用した。クローン化したcＤＮＡはpＵＣ19のＥcoＲＩ部位にライゲーションし、すでに記載されているようにして配列決定を行った(イソザキ、Ｏ.、ら(1989)Ｍol.Ｅndocrinol．3，1681-16 92 41)。塩基配列の整列と比較は、ＰＣ-ＧＥＮＥおよびＧＥＮＥＷＯＲＫＳソフトウェア（インテリジェネティクス(ＩntelliＧenetics)、マウンテンビュー、ＣＡ）を用いて行った。精製した組換え型タンパク質を得るため、ラットＳox-4 cＤＮＡのＮcoＩ -ＥcoＲＩ断片（-1から1411塩基対）を、pＥＴ30a(+)(ノバジェン(Ｎovagen)、マディソン、ＷＩ)のＮcoＩとＥcoＲＩ部位にライゲーションした。Ｎ-末端が６個連続したヒスチジン残基に連結された、組換え型タンパク質は、細菌株ＢＬ21(ＤＥ3)中で作成した。単一のコロニーを、30μg/mlのカナマイシンを含む50mlのＬＢ培地に接種し、３７℃で振盪培養した。ＯＤ₆₀₀が0.6に達した時点で、イソプロピル -β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、1mＭとなるように加えた。1m ＭのＩＰＴＧによる誘導を３時間行った後、細胞を遠心（5,000xg、５分間、４ ℃）によって回収し、４mlの氷冷した結合緩衝液（5mＭイミダゾール、0.5ＭＮ aＣl、20mＭＴris-ＨＣl,pＨ7.9）に再懸濁し、次に粘性がなくなるまで超音波処理した。Ｎi²⁺結合樹脂（ノヴァジェン、マディソン、ＷＩ）を用い、親和性により精製したタンパク質が得られた。細胞抽出物は遠心分離（39,000xg、２０分間、４℃）によって得られ；上清を樹脂-固定化されたＮi²⁺を含むＨis結合カラムにかけ；このカラムを２５mlの結合緩衝液で洗浄した。結合しなかったタンパク質は、１５mlの洗浄緩衝液で洗い；Ｓox-4はイミダゾールを含む、１５mlの溶出緩衝液で回収した。Ｈis結合カラムは５mlの樹脂を含み、7.5mlの脱イオン水、12.5mlのチャージ緩衝液(50mＭＮiＳＯ₄)、ならびに12.5mlの結合緩衝液によって、続けて洗浄した。１／３量のストリップ緩衝液を添加した後、溶出画分を20mＭＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ，pＨ7.9、100mＭＫＣl,0.1mＭＥＤＴＡ,20％グリセロール、0.5mＭジチオスレイトール(ＤＴＴ)、0.5mＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド(ＰＭＳＦ)、２μg/mlロイペプチン、２μg/mlペプスタチンＡに対して透析し、次に電気泳動ゲル・モビリティー・シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）で用いるために、セントリコン１０（アミコン、ビヴァリー、ＭＡ）で濃縮した。その他の方法および統計的有意性タンパク質濃度はブラッドフォード法（バイオラッド）により、結晶化した子ウシ血清アルブミンを標準物質として用いて決定した。すべての実験は、異なるバッチの細胞を用い、少なくとも３回繰り返し行った。測定値は、とくに断わりのない限り、平均±標準誤差である。値どうしの有意性は、分散の二元分析を用いて決定し；もしＰ値が0.05以下である場合、その値は有意であるとした。結果ラン−オン分析では、インスリン（５Ｈ）プラス５％血清を含有する培地中に維持されたＦＲＴＬ−５甲状腺細胞のＭＭＩとＴＳＨ処理は、クラスＩ遺伝子の転写速度を独立的にかつ加算的に減ずる（図１５Ａ；実施例７における図１３と一致）。ＭＭＩとＴＳＨがクラスＩ遺伝子の転写を減ずる能力は培地中のインスリン及び／又は血清の存在を必要とする。したがって、ＭＭＩとＴＳＨは、単独で又は一緒に、培地中にインスリンなしに、０．２％のウシ血清のみを加えて７日間維持された細胞からの核を用いて試験したときに、クラスＩ転写速度を減ずるそれらの能力を失う（図１５Ｂ）。これらのデータは、ＭＭＩによるクラスＩの転写抑制がＴＳＨによって加算的にかつ独立的に調節される因子を必要とするのみでなく、インスリン及び／又は血清の成分によって調節される因子をも必要とすることを示唆した。ＴＳＨ作用はＧｒａｖｅｓのＩｇＧ産生におけるＴＳＨ受容体自己抗体を刺激することによってデュプリケートされる(duplicated)ことができる（データ示さず）。ラン−オン分析において最大に有効である同じ濃度において（図１５Ａ）、ＭＭＩとＴＳＨは、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞中に一時的にトランスフェクトされた、クラスＩ５’−フランキング領域、ｐ（−１１００）ＣＡＴの１１００ｂｐを含有するクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）キメラの活性を独立的にかつ加算的に減ずる（図１６Ａと１６Ｂ）。したがって、ＭＭＩとＴＳＨは甲状腺細胞における外因性並びに内因性クラスＩプロモーター活性を加算的にかつ独立的に調節する。ＴＳＨ作用はＧｒａｖｅｓ・ＩｇＧ産生におけるＴＳＨ受容体自己抗体を刺激することによって再びデュプリケートされる可能性がある。ＭＭＩが作用しうる調節要素をさらに局在するために、ＦＲＴＬ−５細胞中に安定に（表ＩＶ）又は一時的に（図１６Ａ〜１６Ｂ）トランスフェクトされた１１００ｂｐクラスＩブタプロモーター−ＣＡＴキメラの一連の５’欠失構築体に対するＭＭＩの効果。甲状腺細胞と非甲状腺細胞とにおいて示されるように（図１６Ａ；表ＩＶ；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｄ．とＳｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２１７〜４２２７；Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．等（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１４５３〜１１４６２；Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｒ．等，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，６９５〜７０３；Ｍａｇｕｉｒｅ，Ｊ．Ｅ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，３０７８〜３０８６；Ｈｏｗｃｒｏｆｔ，Ｔ．Ｋ．等（１９９３）ＥＭＢＯＪ．１２，３１６３〜３１６９）、−１１００、−４００、−２９４及び−２０３ｂｐ間の５’欠失はクラスＩプロモーター活性を増強し、このことは−１１００〜−２０３ｂｐ間の一連の負の調節要素の存在を実証する（図１６Ａ）。−１２７ｂｐまでの欠失はプロモーター活性を低下させるが、−８９ｂｐまでの短縮はプロモーター活性を増強した（図１６Ａ）。これらのデータは−２０３〜−１２７ｂｐの間におけるエンハンサーＡの存在（ＴｉｎｇとＢａｌｄｗｉｎ（１９９３）ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．５，８〜１６）、及び−１２７〜−８９ｂｐ間の保存サイレンサーの存在（実施例９）と一致する。ＭＭＩとＴＳＨは試験した全てのキメラにおける外因性プロモーター活性を加算的に低下させた（表ＩＶ，図１６Ａ）。転写開始の８９ｂｐ内のキメラに活性が持続したので、−８９ｂｐより下の要素の機能は両方の作用剤によって影響された。しかし、これらのデータは、ＭＭＩ／ＴＳＨが上流要素と相互作用するタンパク質の活性を調節する可能性と、これらの機能が転写開始の−８９ｂｐ内の要素に関連している可能性を排除しなかった。この可能性は２つの観察により支持された。表ＩＶの説明．ＦＲＴＬ−５細胞は６Ｈ培地（ＴＳＨ添加）においてほぼ集密にまで増殖させ、５Ｈ培地（ＴＳＨ含まず）中に７日間維持してから、ＴＳＨ又はＭＭＩによって４０時間処理した。対照細胞は５Ｈ培地中に同じ４０時間維持した細胞であった。ＣＡＴ活性を上述したように（実施例７；実施例８；材料と方法）測定した。ＭＭＩ処理又はＴＳＨ処理はｐＳＶ０対照を除いて全てのＣＡＴプラスミドによってトランスフェクトした細胞中でＣＡＴ活性を有意に低下させた（ｐ＜０．０５又は０．０１）。図１６Ｂは用いた各キメラＣＡＴ構築体の構造を表す。第一に、ＭＭＩとＴＳＨの付加効果はｐ（−１１００）ＣＡＴの外因性クラスＩプロモーター活性をｐＳＶ０対照のレベルまで低下させた（図１６Ａ）。これは、クラスＩＲＮＡレベルを低下させるそれらの付加能力（Ｓａｊｉ等（１９９２ｂ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔａｂｏｌ．７５：８７１〜８７８）と、クラスＩプロモーター配列との複合体形成（実施例６）と、ラン−オン分析（図１５）とを相当する最小レベルに一致させる。−４００ｂｐまでの欠失は、プロモーター活性をｐＳＶ０対照の活性の方向に減ずる両作用剤の付加能力を除去したが；この現象は−２０３〜−１２７ｂｐ領域の欠失後にｐ（−１２７）ＣＡＴキメラに復帰し、−８９ｂｐＣＡＴキメラ中で再び失われた。それ故、内因性クラスＩ遺伝子発現の最大のＴＳＨ／ＭＭＩ誘導低下に匹敵した、外因性プロモーターに対する最大の加算的ＴＳＨ／ＭＭＩ活性は、−１１００〜−４００ｂｐ間と−１２７〜−８９ｂｐ間の欠失で失われたサイレンサー要素の活性に関連すると思われた。第二に、実施例９に示すように、−１２７〜−８９ｂｐ間のサイレンサーの機能は、公知のｃＡＭＰ反応性要素（ＣＲＥ）に対して相同な、オクトマー配列、 −１０７〜−１００ｂｐに依存する（図９）（Ｓａｊｉ，Ｍ．等，１９９２ａ，１９９２ｂ；Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．等（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，６６８２〜６６８６；Ａｎｇｅｌ，Ｐ．等（１９８７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２２５６〜２２６６；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，６２４７〜６２５１；Ｖａｌｌｅｊｏ，Ｍ．等（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１２８６８〜１２８７５；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．等（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２７５〜１２８３；Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１〜１７１５；Ｈａｂｅｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，１０８７〜１０９４）。さらに、ＦＲＴＬ−５細胞のＴＳＨ／ｃＡＭＰ処理が３８ｂｐサイレンサーのＣＲＥ様要素との新規なタンパク質／ＤＮＡ複合体の出現を誘導し、この形成が−８９〜＋１ｂｐ間のクラスＩプロモーター領域中の要素によって阻止されることが、実施例９に示される（実施例９）。下流のサイレンサーと相互作用するタンパク質の２つ、甲状腺転写因子−１とＹ−ボックスタンパク質（ＴＳＥＰ−１（ＴＳＨＲサプレッサー要素タンパク質−１）と呼ばれる）は＋８９〜＋１ｂｐ範囲内の要素とも相互作用する（図４３）。これらのデータは実際に下流サイレンサー並びに−８９ｂｐより下の要素と相互作用する因子の活性を調節し得ることを示唆した。実施例８の残りでは、−７２４〜−６９７ｂｐ間の上流サイレンサーの活性を加算的にかつ独立的に調節するＭＭＩ／ＴＳＨの能力を特徴付ける。実施例９では、下流サイレンサー（−１２７〜−８９ｂｐ）の活性を調節するＭＭＩ／ＴＳＨの能力を示す。さらに、それぞれに対するＭＭＩ／ＴＳＨ作用が、異なる因子にも拘わらず、インスリン及び／又は血清によって調節される因子を必要とすること、及び下流サイレンサーに対するＭＭＩ／ＴＳＨ効果が機能的に顕著であることは、これらが相互作用性であることを示す（実施例８、９、１０及び１１）。 −７２４〜−６９７ｂｐ間のサイレンサー要素が重複エンハンサー要素と共に機能して、種々な組織におけるクラスＩ発現の構成的レベルを調節することが判明している（実施例６；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｄ．とＳｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２１７〜４２２７）。５Ｈ培地のみに維持された対照ＦＲＴＬ−５細胞からの抽出物と比較することによって、ＭＭＩとＴＳＨによる２４時間の細胞処理（それぞれ、図１２Ａ，レーン５と６）は、−７７０〜−６３６ｂｐ間の残基を包含するクラスＩプロモーター・フラグメントとのタンパク質／ＤＮＡ複合体（矢印Ａ）の形成を低下させた。このフラグメントは１４０断片と名付けられ（図９と１１）、上流サイレンサーとその重複エンハンサーの両方を包含する（図１０）。ＭＭＩ／ＴＳＨ効果は加算的であった（図１２Ａ，レーン７）。さらに、６日間の細胞のＴＳＨ処理は２４時間のＴＳＨ処理（図１２Ａ，レーン６）よりも大きい減少を生じた（図１２Ａ，レーン３）が；２４時間のＭＭＩ処理はまた加算的であった（図１２Ａ、レーン２対３）。１４０断片との複合体形成のＴＳＨ／ＭＭＩ誘導低下は、ラン−オン分析におけるＴＳＨ又はＭＭＩ作用へのインスリン／血清の機能的必要性と一致して、インスリン／血清を必要とした（図１５Ａ〜１５Ｂ）。したがって、ＦＲＴＬ−５細胞のＴＳＨとＭＭＩ処理は、インスリンなしで０．２％血清のみを添加した培地中に維持されたＦＲＴＬ−５細胞中でＡ複合体の形成を低下させなかった（図１２Ｄ）。非標識１４０断片の２００倍過剰との自己競合によって実証されるように、複合体形成は特異的であった。１４０断片はサイレンサーと重複エンハンサーの両方を包含する（図１０）。ゲルの頂部のＭＭＩ／ＴＳＨ感受性複合体（図１２Ａ〜１２Ｄ、複合体Ａ）は、その移動度と複合体の顕著さに基づいて、サイレンサーであると思われた（実施例６；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｄ．とＳｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２１７〜４２２７）。したがって、サイレンサー複合体はゲルの頂部近くに移動し（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｄ．とＳｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２１７〜４２２７）；さらに、高レベルのサイレンサーと低レベルのエンハンンサー複合体とは甲状腺細胞に見られる低レベルのクラスＩ発現と一致する（Ｓａｊｉ，Ｍ．，Ｍｏｒｉａｒｔｙ等（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５，８７１〜８７８；Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，１９４４〜１９４８；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｄ．とＳｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２１７〜４２２７）。高レベルの発現を有する組織、即ち、リンパ球では逆のことがいえる（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｄ．とＳｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２１７〜４２２７）。ＭＭＩ／ＴＳＨ効果がサイレンサー複合体に対するものであることを明確に確立するために、サイレンサー複合体の形成を阻害することができるオリゴヌクレオチドの存在下（図１７Ａ，Ｓ２とＳ６）、エンハンサー複合体のみの存在下（図１７Ａ、Ｅ９）又はいずれの存在下でもなく（図１７Ａ、Ｓ３）（Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｄ．とＳｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２１７〜４２２７）その形成を評価した。Ｓ３又はＥ９によってではなく、Ｓ２とＳ６による阻害によって実証されるように（図１７Ａ、レーン２および４対１、３および５）、その形成がＭＭＩとＴＳＨによって減ぜられる（図１７Ａ）複合体ａはサイレンサーである。複合体ｂはサレンサーに対するＥ９効果の不存在下でのＥ９による阻害によって実証されるようにエンハンサーである（図１７Ａ、レーン５）。これらの関連配列を含むクラスＩプロモーターからの非標識フラグメント、フラグメント１０５（−５０３〜−３９９ｂｐ）、フラグメント１１４（−８７０〜−７７０ｂｐ）並びにフラグメント１５１（−１０３６〜−８７１ｂｐ）を用いて、それぞれが放射性標識１４０フラグメントによって形成されるサイレンサー複合体の形成を阻害することができることを発見した（図１７Ｂ、レーン７〜９対６）。さらに、これらのフラグメントの各々をインスリンと血清の存在下で維持した細胞からの抽出物と共にインキュベートしたときに、ＭＭＩとＴＳＨを単独に又は一緒にしたＦＲＴＬ−５細胞の処理は、１４０フラグメントにおけるサイレンサーと同じ移動度を有する複合体の形成を同様に阻害したが、インスリンと血清の不存在下では阻害しなかった（図１２Ｄ）。これらの結果は、サイレンサー要素が−１１００〜−３９９ｂｐ間の複数の部位に存在するが、各々がＴＳＨ／ＭＭＩによって同じように調節されることを示唆する。このことは、−１１００〜−２９４ｂｐ間のクラスＩプロモーターの５’欠失による活性の漸次増加と、クラスＩプロモーター活性をｐＳＶ０対照のレベルにまで低下させるＭＭＩ／ＴＳＨの能力の漸次喪失とに一致する（図１６Ａ）。クラスＩ５’−フランキング配列（−１９０〜−１８０ｂｐ）のエンハンサーＡはインターフェロン応答要素とＣＲＥの上流である（図１６Ｂ）。インターフェロン作用がクラスＩレベルを高め、ヒドロコルチゾン作用がそれらを低下させることが重要である（Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．等（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１４５３〜１１４６２）。甲状腺細胞におけるエンハンサーＡとのタンパク質複合体は塩調節され、Ｍｏｄ−１と名付けられ、この複合体はヒドロコルチゾン、インスリン／血清、又はインターフェロンによって調節され、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットとｆｒａ−２を包含する（Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．等（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１４５３〜１１４６２）。１４０フラグメントとＦＲＴＬ−５細胞抽出物とによって形成される、サイレンサーとエンハンサーとの複合体は塩感受性である（図１８Ａ）。したがって、塩が増加すると、サイレンサーが両方ともＴＳＨ／ＭＭＩによって調節される２つの分離したタンパク質／ＤＮＡ複合体によって構成されることが認められた（データ示さず）。シフト分析に高い塩濃度（１００μＭＫＣｌ）を用いて、下側の複合体が、この下側の複合体を上側の複合体のレベル又はそれよりやや高いレベルまでスーパーシフトさせる、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットに対する抗血清の能力によって実証されるように、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットではなく、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットとのアダクツであるように思われることを示すことができた（図１８Ｂ，それぞれ、実線とダッシュ線）。上側複合体はｃ−ｆｏｓファミリー・メンバー(fomily member)又は関連タンパク質とのアダクツであるように思われる（図１８Ｃ）。したがって、ｃ−ｆｏｓファミリー・メンバーと反応する抗血清はスーパーシフトを生じたが（図１８：レーン２および４）、ｆｒａ−１、ｆｒａ−２、ｆｏｓＢ、ｃ−ｊｕｎ又はｊｕｎＢに特異的な抗血清（図１８Ｃ、レーン５〜９）も対照の標準血清も（図１８Ｃ、レーン３）生じなかった。これらの結果は、初めて、上流サイレンサー複合体のタンパク質成分を同定し、それとエンハンサーＡとの関係を支持する。ＭＭＩとＴＳＨがサイレンサー複合体の形成を増加するのではなく減少したという観察は、サイレンサー活性の増加に関連して反対のことが予想されていたので、意外であった。これの説明と、クラスＩレベルに対するＭＭＩ／ＴＳＨ作用におけるその役割とは下記実験から明らかになった。第一に、上流サイレンサーに対するＭＭＩ／ＴＳＨ効果のインスリン／血清感受性が、ＴＳＨＲのインスリン応答要素ではなく、チログロブリン（ＴＧ）プロモーターのインスリン応答要素（ＩＲＥ）と相互作用するタンパク質に関連することが判明した。したがって、ｉｎｖｉｔｒｏでは、オリゴＫ、ＴＧ−インスリン応答要素の配列を有するオリゴヌクレオチドの添加がＭＭＩ／ＴＳＨ処理細胞からの抽出物中に明らかな上流サイレンサーとの複合体形成の低下を阻害することができた（図１４Ａ、レーン７と１５）。これに反して、ＴＳＨＲインスリン応答要素のオリゴＴＩＦは上流サイレンサーによる複合体形成に影響しなかった（データ示さず）。第二に、上流サイレンサー複合体に対するＭＭＩ／ＴＳＨ作用はＴＧインスリン応答要素と相互作用するタンパク質を直接必要とすることが判明した。したがって、オリゴＫ自体を放射性標識プローブとして用いた場合に、用いた条件下でＦＲＴＬ−５細胞からの細胞抽出物によって２つの主要タンパク質複合体が形成された（図１４Ｂ、レーン１６）。非標識オリゴヌクレオチドの２５０倍過剰を用いた競合によって実証され、オリゴＫの突然変異形の２５０倍過剰によって（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）又はオリゴＴＩＦの２５０倍過剰によって（データ示さず）は実証されなかったように、両方はオリゴＫに特異的であった。より重要なことには、ＭＭＩ又はＴＳＨによる２４時間の細胞処理はオリゴＫとの上側タンパク質複合体の形成を低下させ、加算的に複合体形成を阻害した（図１４Ｂ、レーン１７〜１９対４、矢印Ａ）。ＭＭＩの加算的効果は、まさに１４０フラグメント中のサイレンサー複合体の場合におけるように、ＴＳＨ（６Ｈ培地）に６日間暴露された細胞中で明らかであった。さらに、オリゴＫとのＴＳＨ／ＭＭＩ調節複合体はその形成にインスリン／血清の存在を必要とした。したがって、インスリンなしに、０．２％血清と共に（４Ｈ培地）維持された細胞からの抽出物中には複合体が存在せず、ＴＳＨ／ＭＭＩはこの複合体の形成の不存在に明確な影響を有さなかった。第三に、クラスＩプロモーターの１４０フラグメント中でＴＧインスリン応答要素とサイレンサーとを結合するタンパク質が上流サイレンサー活性と、複合体形成を低下させるＭＭＩ能力とのために必要であった。オリゴＫを含有するプラスミドと、クラスＩプロモーターのｐ（−１１００）ＣＡＴキメラとのＦＲＴＬ −５細胞中へのコトランスフェクション(cotransfection)は、プロモーター活性を有意に増加させた（図１９Ａ、オリゴＫ１とオリゴＫ２）。この増加は、ＦＲＴＬ−５細胞抽出物によってオリゴＫ複合体と競合させるその能力を有さないオリゴＫの突然変異体とのコトランスフェクションによっては、デュプリケートされなかった（図１９Ａ、オリゴＫＭ）（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８〜３１９１４；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）。オリゴＫのこの効果は、ｐ（−１２７）ＣＡＴキメラを用いた場合は、この効果が下流サイレンサーではなく上流サイレンサーを必要とする効果であるという説明に一致して、デュプリケートされなかった（図１９Ｂ）。したがって、インスリン誘導タンパク質を、細胞中にトランスフェクトされたオリゴＫへの結合によって除去すると、サイレンサー活性は機能的に弱められるか又は除去され、エンハンサー活性の発現が生じた。最後に、オリゴＫと相互作用するインスリン誘導タンパク質がサイレンサー活性（図１９）と、ＭＭＩ／ＴＳＨ作用がサイレンサー複合体形成を低下させる可能性（図１４）とのために必要であるが、ＭＭＩによるクラスＩ遺伝子発現低下におけるその役割は、下流サイレンサー及びＴＳＨＲインスリン応答要素と相互作用するインスリン誘導タンパク質の作用によって顕著になる。したがって、オリゴＴＩＦコトランスフェクションはｐ（−１１００）ＣＡＴプロモーターキメラに対するＭＭＩ効果を喪失させるが（実施例９）、オリゴＫとのコトランスフェクションはｐ（−１１００）ＣＡＴ活性のＭＭＩ低下を防止しなかった（表Ｖ）。 ★ 活性の有意な増加、Ｐ＜０．０５又はこれより良好 ★★ 活性の有意な低下、Ｐ＜０．０５又はこれより良好、ＭＭＩの不存在下の活性との比較による。表Ｖの説明．ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ方法を用いて、５％ウシ血清を加えた５Ｈ培地中で増殖させたＦＲＴＬ−５細胞を図１６Ａにおけるようにｐ（−１１００）ＣＡＴ、又は２０若しくは４０μｇのオリゴＫオリゴヌクレオチド含有プラスミド（それぞれ、オリゴＫ１とオリゴＫ２）、又は４０μｇのオリゴＫＭ含有プラスミド（既述されたオリゴＫの突然変異体）によってコトランスフェクトして（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８〜３１９１４）、図１９Ａに用いた。細胞は５ｍＭＭＭＩを含む又は含まない培地に維持した。ＣＡＴ活性を３６時間後に測定し、転化速度(conversion rate)を成長ホルモンレベルに均一化した(normalized)；ｐ（−１１００）ＣＡＴと、オリゴＫ配列が挿入されたベクターとによる対照トランスフェクションの活性に１００％の値を割り当てた。オリゴＫ又はその突然変異体によってコトランスフェクトされた細胞のＣＡＴ活性の差異を対照値と比較した。数値はそれぞれ２通りにおこなわれた３種類の異なる実験の平均値±Ｓ．Ｅ．であった。これらのデータの要約は以下のことを示唆した。上流サイレンサーは減少し、下流サイレンサーをエンゲージさせ(engaged)機能的に顕著であるようにさせるためには上流サイレンサーをディスエンゲージさせ(disengaged)なければならないと思われる。上流サイレンサー要素によって形成された、ｐ６５及びｃ−ｆｏｓの複合体は、それらがオリゴＫに結合することができるインスリン誘導タンパク質とも相互作用するときにのみ、サイレンサー機能を示す。ＴＳＨ／ＭＭＩ作用はインスリン誘導タンパク質へのその作用によって上流サイレンサー複合体形成を減ずる。上流サイレンサー複合体形成の減少は上流サイレンサー活性の喪失に関連すると推定されるが、このことはそのＭＭＩ／ＴＳＨ誘導活性が顕著である下流サイレンサーへのＭＭＩ／ＴＳＨ作用に必然的に付随すると考えられる。したがって、上流サイレンサー部位の漸次欠失は下流サイレンサー活性の減衰を生じるが、全ての上流サイレンサー部位が欠失したときに、それらの優勢は回復する（図１６Ａ；表ＩＶ）。本明細書中で得られ、特徴付けられたクローンは、上流サイレンサー及びＴＧ −インスリン応答要素と相互作用するインスリン誘導タンパク質であり、上記仮説を支持する。これらの研究は、上流エンハンサーが、サイレンサーと同様に、我々がＳｏｘ−４と名付けたＴＧ−インスリン応答要素反応性因子と相互作用することをさらに実証する。５３，０４０の分子量を有する４４２アミノ酸残基タンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームを含む１４２２ヌクレオチド含有クローンが得られた（図２０Ａ〜２０Ｂ）。このタンパク質はマウスＳｏｘ−４と９８％類似し（ＶａｎｄｅＷｅｔｅｒｉｎｇ等，ＥＭＢＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９３）１２：３８４７〜３８５４）、ヒトＳｏｘ−４と類似する（Ｆａｒｒ，Ｃ．Ｊ．等（１９９３）ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ，４，５７７〜５８４）。マウスＳｏｘ−４は、転写トランス活性化の要因であった、Ｔ−リンパ球からのＳＲＹ関連遺伝子としてクローン化され、配列ＡＡＣＡＡＡＧを結合することができる。その機能はまだ知られていない（ＶａｎｄｅＷｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．等，ＥＭＢＯ．Ｊ．（１９９３）１２：３８４７〜３８５４）。ラットとマウスのＳｏｘ−４はヒトＳｏｘ−４よりも３２残基小さい（Ｆａｒｒ等，（１９９３）ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ，５７７〜５８４）。ヒトＳｏｘ−４の追加残基の全てと、マウスＳｏｘ−４の異なる残基の大部分はタンパク質の１領域内に集中し、主としてグリシンとアラニン残基である。マウスＳｏｘ−４とヒトＳｏｘ−４の両方の差異がこの領域に集中するので、ヒトＳｏｘ−４中のこのインサート領域が中性スペーサー領域であることは明らかではない（Ｆａｒｒ等，（１９９３）ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ，５７７〜５８４）。Ｓｏｘ− ４タンパク質は転写調節因子のＨＭＧ（高速移動群）クラスのメンバーであり、配列特異的形式でＤＮＡを結合し、Ｔ−細胞発達に重要な遺伝子を調節する精巣発達決定遺伝子（ＴＣＦ−１α）を調節するＳＲＹと、脂質生成組織における多様な遺伝子群の転写に対するインスリンの組織特異的効果の仲介に役割を果たすように思われるインスリンによる正負の調節を受ける遺伝子を調節するＩＲＥ− ＡＢＰ（インスリン応答要素Ａ結合タンパク質）とを包含する（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−ＢｒｉｄｇｅｓＭ．等（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：１２９〜１３５）。３種類のＳｏｘ−４タンパク質の全てに共通の特徴はＨＭＧボックス（図２０、太線）と、複数の推定カゼインキナーゼとヒストンキナーゼリン酸化部位を有するセリン富化カルボキシ末端(terminal tail)とを包含する（ＶａｎｄｅＷｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．等，ＥＭＢＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９３）１２：３８４７〜３８５４；Ｆａｒｒ等，（１９９３）ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ，５７７〜５８４）。ＨＭＧボックスは、クロマチンに結合し、ＤＮＡの構造的組織化(structural organization)に重要である、ＨＭＧ −１と関連タンパク質へのその配列類似性によって定義されるドメインである。例えばＳｏｘ−４のような転写調節因子のＨＭＧクラスでは、ＨＭＧボックスはＤＮＡの副溝への配列特異性ＤＮＡ結合を示し、ＤＮＡヘリックスの強い屈曲を誘導する（ＶａｎｄｅＷｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．等，ＥＭＢＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ（１９９３）１２：３８４７〜３８５４；Ｆａｒｒ等，（１９９３）ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ，５７７〜５８４；Ｆｅｒｒａｒｉ等，ＥＭＢＯＪ．１１：４４９７〜４５０６）。本明細書中で述べ、特徴付けるＳｏｘ−４組換えタンパク質はオリゴｋ、ＴＧインスリン応答要素に、又は関連オリゴヌクレオチド（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）、甲状腺ペルオキシダーゼ・プロモーター上の関連インスリン応答要素の配列を模倣するオリゴＺに結合することができる（図２１）。競合研究に報告されるデータと一致して、ＴＴＦ−２、ＴＧインスリン応答要素と相互作用する予定結合因子(presumptive binding f actor)と相互作用するその能力を失うオリゴＫの突然変異体とは、Ｓｏｘ−４は結合しない（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）。オリゴＺ突然変異体への結合も、ＥＭＳＡ研究においてＴＰＯインスリン応答要素と競合するその能力の低下と一致して、低下する。Ｓｏｘ−４はＴＧプロモーターのオリゴＣと弱く結合する（図２１）、これは２種類の異なる転写因子：甲状腺転写因子１とＰａｘ−８を識別する、チログロブリン（ＴＧ）又は甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）インスリン応答要素近くの部位を模倣する（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６；Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．等（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１５８９〜１５９５；Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．等（１９８９）ＥＭＢＯＪ．２５３７〜２５４２；Ｇｕａｚｚｉ，Ｓ．等（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９，６３１〜３６３９；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ｚａｎｎｉｎｉ，Ｍ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，４２３０〜４２４１；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９〜１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．等（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９〜２８２）。これらのデータはＴＴＦ−２に与えられたオリゴヌクレオチド結合特異性と一致して、単独でＳｏｘ−４がＴＴＦ−２であることを示唆することができる。しかし、Ｓｏｘ−４はＤＮＡアーゼ−１保護実験においてＴＧ−プロモーターのインスリン応答要素領域をフットプリントすることができるとしても、このフットプリントはＦＲＴＬ−５細胞抽出物中のＴＴＦ−２に割り当てられたＴＧインスリン応答要素部位よりもはるかに広範囲である。ＴＧインスリン応答要素の保護が存在するが、この保護はＴＴＦ−２とｐａｘ−８を結合することができるオリゴＣ部位と、オリゴＡ領域にも及ぶ。この広範囲なフットプリントはＴＴＦ −２を定義する今までの研究で予測された範囲を越える（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）。ノーザン分析もＳｏｘ−４がＴＴＦ−２であることに一致したパターンに適合しない。以前の研究によると、ＴＴＦ−２は甲状腺特異性転写因子である（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６；Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．等（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１５８９〜１５９５；Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．等（１９８９）ＥＭＢＯＪ．２５３７〜２５４２；Ｇｕａｚｚｉ，Ｓ．等（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９，６３１〜３６３９；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ｚａｎｎｉｎｉ，Ｍ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，４２３０〜４２４１；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９〜１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．等（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９〜２８２）。したがって、ラット組織によるＳｏｘ−４のノーザン分析はマウス又はヒトＳｏｘ−４による以前のデータを実証し（Ｆａｒｒ，Ｃ．Ｊ．等，（１９９３）ＭａｍｍａｌｉａｎＧｅｎｏｍｅ，４，５７７〜５８４；ＶａｎｄｅＷｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．（１９９３）ＥＭＢＯＪ．１２，３８４７〜３８５４）、即ち、これらの分析はＳｏｘ−４が偏在する発現遺伝子であることを示す（図２２Ａ）。ノーザン分析はさらに、ＴＴＦ−２に関して予測されるように、インスリンによってＳｏｘ−４を増加させることができるとしても（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｆｒａｍｉｃｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．，他、（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６−５８８；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）、この増加はＦＲＴＬ−５細胞の２４時間以上のインスリン／血清処理を必要とし；これとは対照的に、ＴＴＦ− ２によるオリゴＫ複合体形成のインスリン誘導増加は２４時間目に既に顕著である（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）。ＴＴＦ−２による複合体形成は、０．２％血清含有４Ｈ培地中で、即ち、インスリン、インスリン様増殖因子又はＴＳＨなしに数時間維持した後にインスリン又はＴＳＨで処理した細胞からの抽出物中で増加する（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）。このことはＳｏｘ−４に該当する（図２２Ｂ）。しかし、インスリン又は血清の存在下で、即ち、５％血清を加えた５Ｈ培地中の細胞において、ＴＴＦ−２複合体形成は変化しない（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）。これとは対照的に、Ｓｏｘ−４ＲＮＡレベルはＴＳＨを加えた５Ｈ培地中に１週間の細胞ではＴＳＨによって劇的に低下する（図２２Ｂ、レーン６）。それ故、ノーザン分析は以前の研究に基づいてＴＴＦ−２に関して予想されるようなＲＮＡ発現パターンに適合しない。ＦＲＴ細胞におけるＳｏｘ−４の過剰発現はＴＧ−ＣＡＴ活性を変化させないが、ＴＴＦ−１はコトランスフェクション実験に影響を及ぼすことが判明している（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９〜１０６９）。さらに、５％ウシ血清を加えた６Ｈ培地中に維持されたＦＲＴＬ−５細胞中では、Ｓｏｘ−４ＲＮＡレベルが消滅的に低くなり、Ｓｏｘ −４／ＤＮＡ複合体形成が非常に低くなり（図２２Ｂ）、Ｓｏｘ−４の過剰発現が全長プロモーター上のＴＧ−ＣＡＴ活性をやや増加させることができるが、ＴＧ−ＩＲＥ部位が配置されたｐ（−１７０）には影響を及ぼさない（表ＶＩ）。本明細書中で同定したＳｏｘ−４タンパク質の性質はＴＴＦ−２に予測された幾つかの性質に適合せず、ＴＴＦ−２ではない。その代わりに、Ｓｏｘ−４はＭＨＣクラスＩ上流サイレンサー／エンハンサー複合体の成分であり、甲状腺及びその他の組織におけるクラスＩ発現を調節する。インスリンは上流サイレンサーとオリゴＫによる複合体形成を増加させる。インスリンの存在下では、ＴＳＨは上流サイレンサー複合体を減少させ（図１２と１４Ａ）、オリゴＫによる複合体形成を低下させる。これの根拠はインスリンの存在下でのＳｏｘ−４ＲＮＡレベルを低下させるＴＳＨの能力である（図２２Ｂ）。Ｓｏｘ−４中のＭＭＩ作用の根拠はインスリンの存在下でＳｏｘ−４ｍＲＮＡを低下させるＭＭＩの効果ではなく、チオレドキシン活性の変化である（表ＶＩＩ）。したがって、Ｓｏｘ−４活性はフリーラジカル・スキャベンジャーとしてのその作用を介してのＭＭＩによる調節を必要とする可能性がある（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．等（１９８８）Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．２８：３８９〜３９７；Ｗｉｅｎｚｅｌ，Ｎ．等（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．５８：６２〜６９）。Ｓｏｘ−４によって調節されるサイレンサー成分はＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニットである（図１８）。したがって、Ｓｏｘ−４への抗血清はｐ６５上流サイレンサー複合体をスーパーシフトさせ（図２３）、サイレンサー複合体形成を低下させる。Ｓｏｘ−４又はＦＲＴＬ−５細胞抽出物の存在下で１４０フラグメントによって同様なサイズの複合体を形成するｃ−ｊｕｎの能力と、ｃ−ｊｕｎへの抗血清添加がエンハンサー複合体形成を阻害することによって実証されるように、抗血清はまたｃ−ｊｕｎから成るエンハンサー複合体の形成を排除する（データ示さず）。それ故、Ｓｏｘ−４はサイレンサーとエンハンサーの両方の形成に重要である。Ｓｏｘ−４はエンハンサーとサイレンサーの両方にオーバーラップする領域をフットプリントし（図２４）、Ｓｏｘ−４をコードするｃＤＮＡをクラスＩプロモーター−ＣＡＴキメラとコトランスフェクトした場合に、クラスＩ発現を抑制することができる（表ＶＩ）。この効果は、チログロブリンプロモーター−ＣＡＴキメラとコトランスフェクトした場合にＳｏｘ−４の効果がない又はＴＧ−ＣＡＴ活性が増加するので（表ＶＩ）、特異的である。上流サイレンサー／エンハンサーのクラスＩ調節のために重要なオリゴＫ反応性タンパク質はＳｏｘ−４である。Ｓｏｘ−４はコトランスフェクション研究において実証されるようにクラスＩのサプレッサーである。オリゴヌクレオチド（オリゴＫ）のコトランスフェクションでは、Ｓｏｘ−４と反応するオリゴＫは、サイレンサーとのＳｏｘ−４相互作用をブロックし、それを非機能的にし、エンハンサー複合体形成を増加させることによって、クラスＩを増加させる。ＴＳＨはＳｏｘ−４ｍＲＮＡレベルとサイレンサー複合体形成を低下させるので、Ｓｏｘ−４に対するその作用を評価する手段の１つは、サイレンサー複合体形成を測定することの他にノーザン分析によってＳｏｘ−４を評価することである（実施例６）。ＭＭＩ作用を測定する他の機構は、例えばチオレドキシン（表ＶＩＩ）又はスーパーオキシドディスムターゼ（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．等（１９８８）Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２８：３８９〜３９７）のような、転写因子の酸化−還元状態において重要な酵素の作用に対する、そのフリーラジカルスキャベンジイング効果を介する、ＭＭＩの効果によって調節されるＳｏｘ−４活性の増加を測定することである。これらの酵素はシステイン転写因子の酸化−還元状態を調節することによって、それらの活性をモジュレートすることができる（Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｆ．（１９９３）ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３３２，２０３〜２０７；Ｓｔｏｒｚ，Ｇ．等（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１８９〜１９４；Ｔｏｌｅｄａｎｏ，Ｍ．Ｂ．等，（１９９４）Ｃｅｌｌ，７８，８９７〜９０９；Ｇａｌａｎｇ，Ｃ．Ｋ．等（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３，４６０９〜４６１７；Ｐｏｇｎｏｎｅｃ，Ｐ．等（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２４５６３〜２４５６７；Ｒｉｇｏｎｉ，Ｐ．等（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１７３，１４１〜１４６；Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｗ．Ｊ．（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：４７８〜５２６）。太線数値はＳｏｘ−４による有意な抑制を示す（Ｐ＜０．０５又はより良好）。太線のイタリック体数値は有意な強化を示す。 ★★ このクローンはＴＧプロモーターのインスリン応答要素であるオリゴＫ部位を含有する（Ｓａｎｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６〜５８８；Ａｚａ−Ｂｌａｎｃ，Ｐ．等，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２９７〜１３０６）。表ＶＩの説明．ＦＲＴＬ−５細胞を６Ｈ培地（ＴＳＨ添加）においてほぼ集密にまで増殖させ、次に５Ｈ培地（ＴＳＨ含まず）中に７日間維持してから、実施例７と８及び図１６Ａに述べたように、ＤＥＡＥＤｅｘｔｒａｎを用いて、記載キメラによってトランスフェクトした。対照細胞はベクターのみによってトランスフェクトした。ＣＡＴ活性を上述したように（実施例７；実施例８；材料と方法）測定した。ｐ（−１２７）に対して効果がなく、ｐ（−１２７ＮＰ）ＣＲＥに有意な効果があることは、図１９Ｃ対１９Ｂのデータと一致する。太線数値は、ＭＭＩなしＳｏｘ−１よりも大きな、ＭＭＩ添加Ｓｏｘ−４による有意な抑制を示す（Ｐ＜０．０５）。太線の下線付き数値はトランスフェクションによる有意な効果がないことを示す。太線のイタリック体数値はＭＭＩによる有意な効果を示す。表ＶＩＩの説明．ＦＲＴＬ−５細胞を６Ｈ培地（ＴＳＨ添加）においてほぼ集密にまで増殖させ、次に５Ｈ培地（ＴＳＨ含まず）中に７日間維持してから、対照プラスミド又はＳｏｘ−４ＤＮＡ含有プラスミドによってトランスフェクトした。次に、細胞を５ｍＭＭＭＩによって又は５ｍＭＭＭＩなしで４０時間処理した。ＣＡＴ活性を上述したように（実施例７；実施例８；材料と方法）測定した。ＭＭＩ処理はＳｏｘ−４トランスフェクタント(transfectant)のＣＡＴ活性を、対照ベクターによってトランスフェクトした細胞におけるよりもさらに低下させた（ｐ＜０．０５）。図１６Ｂは、用いた各キメラＣＡＴ構築体の構造を示す。実施例９下流サイレンサーとホルモンにおけるその役割との同定、及びクラスＩレベルのＭＭＩ低下材料と方法材料．ＴＳＨ、ホルモン及び他の材料は実施例６と８と同じである。細胞培養物．ＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞（ＩｎｔｅｒｔｈｒＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ；ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ８３０５）は、全ての性質が今までに詳述されている新しいサブクーロン（Ｆ１）であった（Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２ａ）；Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２ｂ）；Ｋｏｈｎ，Ｌ．Ｄ．等（１９９２）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｌ．９，１３５〜１６５；Ｋｏｈｎ，Ｌ．Ｄ．等（１９９５）Ｉｎ：ＶｉｔａｍｉｎｓａｎｄＨｏｒｍｏｎｅｓ（Ｌｉｔｗａｃｋ，Ｇ．編集）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ５０，２８７〜３８４；Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，７９３〜８０４；Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１〜１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９〜１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．等（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９〜２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７〜５３９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８〜３１９１４；Ｋｏｈｎ，Ｌ．Ｄ．等（１９８６）９月２日，米国特許第４，６０９，６２２号）（実施例６と８）。上述した種々な実験では、細胞をＴＳＨを含有しない５Ｈ培地、又はＴＳＨを含有せず、インスリン又はヒドロコルチゾンを含有する３Ｈ培地に維持した。ＭＨＣクラスＩプロモーター−ＣＡＴキメラプラスミドの構築．ＰＤＩブタ５ ’−フランキング配列ＣＡＴキメラ、ｐ（−１１００）ＣＡＴ、ｐ（−５４９）ＣＡＴ、ｐ（−４００）ＣＡＴ、ｐ（−２０３）ＣＡＴ及びｐ（−１２７）ＣＡＴの構築は既述されている（実施例６、７、８；Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｒ．等（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，６９５〜７０３；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｄ．とＳｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４２１７〜４２２７；Ｍａｇｕｉｒｅ，Ｊ．Ｅ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，３０７８〜３０８６；Ｈｏｗｃｒｏｆｔ，Ｔ．Ｋ．等（１９９３）ＥＭＢＯＪ．１２，３１６３〜３１６９；Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１４５３〜１１４６２）（実施例７と８）。トランスフェクション効率を評価するために構築されたプラスミドｐＳＶＧＨ（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１〜１７１５）はｐ０ＧＨ（ＮｉｃｈｏｌｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＳａｎＪｕａｎＣａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ）から単離され、ｐＳＧ５発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ部位に挿入された、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子をコードするＢａｍＨＩ −ＥｃｏＲＩフラグメントであった。一過性発現分析−ＦＲＴＬ−５細胞を用いた一過性トランスフェクションは今までに述べられている（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１〜１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９〜１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．等（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９〜２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７〜５３９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８〜３１９１４；Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．等（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１４５３〜１１４６２．実施例７と８）。ＣＡＴ分析を既述されたように、１３０μｌの最終量で１０〜３０μｇの細胞溶解物を用いておこなった（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１〜１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９〜１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．等（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９〜２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７〜５３９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８〜３１９１４；Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１４５３〜１１４６２．Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．等（１９８２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２，１０４４〜１０５１．実施例７と８）。インキュベーションは２時間後にアセチルＣｏＡ（２０μｌの３．５ｍｇ／ｍｌ溶液）を補充して、３７℃において４時間おこなった。細胞抽出物．細胞抽出物はＤｉｇｎａｍ等の方法の改変によって調製した（Ｄｉｇｎａｍ，Ｊ．等（１９８３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１，１４７５〜１４８９；実施例６と８）。用いた核抽出物も実施例８の方法によって調製した。電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）−ＥＭＳＡに用いたオリゴヌクレオチドは、上記キメラＣＡＴ構築体の制限酵素処理後にＱＩＥＡＸ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて２％アガロースゲルから合成したか又は精製した（実施例６と８）。電気泳動移動度シフト分析は基本的には以前に既述されたようにおこなった（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１〜１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９〜１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．等（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９〜２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７〜５３９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８〜３１９１４；Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．等（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１４５３〜１１４６２；Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ，Ｌ．とＬｕｂｏｎ，Ｈ．（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２，７２１〜７３５，実施例６、８、１０及び１１）。ＣＲＥＢと他の抗血清を用いた実験では、抽出物を抗血清又は正常ラビット血清を含有する同一緩衝液中で２０℃で１時間インキュベートした後、上記のように処理した。１，１０−フェナントロリン−銅イオンを用いたフットプリント法：１，１０ −フェナントロリン−銅イオンを用いたフットプリント法を本質的にＫｕｗａｂａｒａとＳｉｇｍａｎによって述べられているようにおこなった（Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｍ．Ｄ．とＳｉｇｍａｎ，Ｄ．Ｓ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，７２３４〜７２３８）。ＰＤＩプロモーターの−１６８〜−１ｂｐを含む末端標識フラグメント（Ｆｒ１６８）を用いて、ＥＭＳＡをスケールアップ (scaling up)した後に、ゲルを２００ｍｌの５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に浸漬して、２０ｍｌの各下記溶液を加えた：０．４５ｍＭＣｕＳＯ₄を含有する２ｍＭ１，１０−オルトフェナントロリンと５８ｍＭ３−メルカプトプロピオン酸。室温における１５分間後に、２８ｍＭ２，９−ジメチルオルトフェナントロリン（２０ｍｌ）を加えて、反応を停止させ；２分間後に、ゲルを蒸留水中で徹底的にすすぎ洗いし、遅延した帯(retarded band)が目視可能になるまで、４℃において４０分間オートラジオグラフィーした。問題のタンパク質／ＤＮＡ複合体による帯を切断し、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と１０ｍＭ酢酸マグネシウムとを含有する０．５Ｍ酢酸アンモニウム中で３７℃において一晩溶出させた。溶離したＤＮＡをエタノールによって沈殿させ、蒸留水中に再懸濁させた。同じカウント数の各サンプルを乾燥させ、１０ｍＭＥＤＴＡと、０．０２５％ブロモフェノールブルーと、０．０２５％キシレンシアノールとを含有する９８％ホルムアミド中に再懸濁させ、同じプローブを用いておこなったＧ＋Ａ及びＣ＋ＴＭａＸａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシークエンス反応（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．とＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．（１９８０）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．６５，４９９〜５６０）と共に８％シークエンシングゲル上で分離させた。オートラジオグラフィーは−８０℃において一晩おこなった。結果 −１０７〜−１００ｂｐのＣＲＥ様配列は構成的サイレンサー要素として機能する。甲状腺細胞におけるＭＨＣクラスＩ遺伝子転写はＴＳＨによって、そのｃＡＭＰシグナルを介して表される（Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２ａ）、Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２ｂ））。これらの研究の１つ（Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，１９４４〜１９４８）はＴＳＨ応答を転写開始の１２７ｂｐ内にマッピングした(mapped)。このＤＮＡセグメントにおける配列検査（図９）は、特徴付けられたＣＲＥに対して相同性を有する８ｂｐ配列（−１０７〜−１００ｂｐ）の存在を明らかにした（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．等Ｈ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，６６８２〜６６８６；Ｈａｂｅｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，１０８７〜１０９４）。このＣＲＥ様要素がクラスＩプロモーター活性を調節するように機能するかどうかを判定するために、５’−フランキング配列ｐ（−１２７ＣＡＴ）の１２７ｂｐを含有する親構築体から１セットの誘導構築体を作製した。１つの誘導体では、８ｂｐＣＲＥ様配列を単に欠失させた；他の誘導体では、ＣＲＥオクタマーの非パリンドローム突然変異をＣＲＥ様配列の代わりに用いた。両方の構築体は５％ウシ血清を加えた３Ｈ培地中（図２５Ａ）又は５％ウシ血清を加えた５Ｈ培地中（データ示さず）に維持されたＦＲＴＬ−５細胞中にトランスフェクトしたときに、親構築体に比べて増大したプロモーター活性を示した。異種プロモーターを抑制するＣＲＥ様要素の能力を、ＳＶ４０最小プロモーターの下流、−１２７〜−９０ｂｐの範囲の３８ｂｐＤＮＡセグメントを導入することによって評価した（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６：１７０１〜１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：１０４９〜１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．等（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６：２６９〜２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０９〜３１９１４）（図２５Ｂ）。５’から３’方向に配置したときに、このＤＮＡセグメントの単一コピーはＳＶ４０プロモーター活性を有意に減ずることができ、その効果の大きさは挿入された３８ｂｐセグメントのコピー数と共に増大した（図２５Ｂ）。３’から５’方向に配置したときに、このＤＮＡセグメントの２コピーはＳＶ４０プロモーター活性を有意な減少できなかった。ＣＲＥ様要素の欠失または非パリンドローム変異のいずれかを含有する３８ｂｐセグメントの誘導体はＳＶ４０プロモーター活性に有意な影響を与えなかった（図２５Ｂ）。これらのデータ（図２５Ｂ）は５％ウシ血清を加えた３Ｈ培地に維持された細胞中で得られた；同じ結果が５％ウシ血清を加えた５Ｈ培地に維持された細胞によって得られた（データ示さず）。これらのデータから、ＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞ではクラスＩ５’−フランキング領域の３８ｂｐ（転写の開始点から−１２７〜−９０ｂｐ）内に配置された構成的サイレンサーの機能に関して８ｂｐＣＲＥ様部位が重要であると結論された。さらに、このＣＲＥ様部位に関連したサイレンサー活性の発現はヒドロコルチゾンの有無によって影響されないと、我々は結論する；我々は別に（Ｇｉｕｌｉａｎｉ，Ｃ．等（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１４５３〜１１４６２）、ＦＲＴＬ−５細胞におけるクラスＩ遺伝子発現を抑制するヒドロコルチゾン作用を異なる要素、エンハンサーＡ、転写の開始点から−１８０〜−１７００ｂｐに位置付けている。ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞のＴＳＨ又はフォルスコリン処理は新規なタンパク質／ＤＮＡ複合体を誘導し、その形成は、サイレンサー活性と同様に、ＣＲＥ様部位に依存する。ＦＲＴＬ−５細胞のＴＳＨ／フォルスコリン処理はクラスＩプロモーターからの転写を低下させるので（Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，１９４４〜１９４８；Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５，８７１〜８７８）、ＴＳＨ／フォルスコリンがＣＲＥ依存性サイレンサー活性を有する領域による任意の新規なタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を変化させるか又は誘導するかを知ることは重要であった。−１６８ｂｐ〜＋１ｂｐに及ぶＤＮＡフラグメント（Ｆｒ１６８；図２６Ａ）を、１ｘ１０^-10ＭＴＳＨを加えて又はなしで４８時間培養したＦＲＴＬ−５細胞に由来する抽出物と共に、ゲル移動度シフト分析に用いた（図２６Ｂ）。いずれの抽出物によっても多数のタンパク質／ＤＮＡ複合体が形成された。タンパク質／ＤＮＡ複合体Ａ〜Ｄが両方の抽出物に共通であり、細胞のＴＳＨ処理によって変化せず、−８９〜＋１に配置されたＤＮＡ配列とのタンパク質相互作用に由来するように思われた。このことは、１００倍過剰な非標識フラグメント１２７（Ｆｒ１２７）、−１２７〜＋１ｂｐがこれらの複合体に関して競合するが、ＣＲＥ−１と名付けられた−１２７〜−９０ｂｐに及ぶＣＲＥ様サイレンサー要素（図２６Ｂ、レーン６と７）はこれらのタンパク質／ＤＮＡ複合体に影響を及ぼさなかったという事実によって示唆された（図２６Ｂ、レーン４と８）。Ｅと標識された複合体は如何なる競合ＤＮＡフラグメントによっても排除されないので、非特異性であると思われる。しかし、ＦＲＴＬ−５細胞のＴＳＨ処理が２つの新規な複合体ＦとＧの形成を誘導したことは注目に値した（図２６Ｂ、レーン５対レーン１）。下記によって実証されるように、これらの形成は特異的であり、サイレンサー活性のために重要なＣＲＥ様部位を必要とした。ＴＳＨ誘導ＦとＧ複合体の形成は、−１６８〜＋１ｂｐ又は−１２７〜＋１ｂｐの範囲である非標識ＤＮＡフラグメント（図２６Ｂ、＋ＴＳＨ、レーン６及び７対５）によってのみでなく、ＣＲＥ−１と名付けられた、ＣＲＥ様部位を含有する−１２７〜−９０ｂｐフラグメント（図２６Ｂ、＋ＴＳＨ、レーン８対５）によっても防止することができた。さらに、Ｇ複合体による研究で説明されたように、１／１０フェナントロリン−銅イオンを必要とする方法を用いる、ＴＳＨ誘導複合体のＤＮＡフットプリント分析は２つの強度の過敏性部位（−１３１〜 −９６ｂｐ）が結合した保護領域を同定した。ＣＲＥ様部位（−１０７〜−１００ｂｐ）はこの保護領域内にあり、−１１０ｂｐのあまり顕著でない過敏性帯と −９５ｂｐの顕著な過敏性帯とによって境界を画定される。ＣＲＥ様部位の中央にある−１０３ｂｐの過敏性部位も観察された。同様なデータが複合体Ｆによっても得られた。これらのデータは、ＴＳＨ誘導ＦおよびＧ複合体が、ＣＲＥ様部位に依存するサイレンサー活性を有する３８ｂｐ領域を包含することを確立した。しかし、これらのデータは下流サイレンサー領域をこの３８ｂｐセグメントに限定しない；このセグメントのサイレンサー活性はＰＤＩクラスＩ５’−フランキング領域の−８０ｂｐまで３’方向の１０ヌクレオチドに及ぶことができる。したがって、４８ｂｐセグメント（−１２７〜−８０ｂｐ）はこの実験と以後の実験において３８ｂｐサイレンサーの全ての活性をデュプリケートし、その活性はＣＲＥ依存性である。ＴＳＨの代わりにフォルスコリン（１０μＭ）を用いて、Ｆ複合体とＧ複合体の形成を誘導することができ、両方の形成はＣＲＥ様部位を含む−１２７〜−９０ｂｐＣＲＥ−１ＤＮＡフラグメントによって阻止された。さらに、フォルスコリン処理細胞とＴＳＨ処理細胞（データ示さず）からの抽出物を用いて、これらの形成が共通(consensus)ＣＲＥ配列がＣＲＥ様配列に置換した−１２７〜−９０ｂｐ断片によっても阻止されたが、ＣＲＥ様要素が欠失（△ＣＲＥ）又は非パリンドローム（ＮＰ−ＣＲＥ）置換によって除去された誘導体オリゴヌクレオチドによっては阻止されないことを我々は実証した。ＣＲＥの５’側の３８ｂｐサイレンサーの領域はＴＳＨ／ｃＡＭＰ誘導複合体の形成を阻止することができず、ＣＲＥオクタマーのいずれの側にも６塩基対のみを有する、ＣＲＥ−２と呼ばれる、ＣＲＥ−１の短縮形でもなかった。これらのデータは、新規なＦ複合体とＧ複合体のＴＳＨ誘導形成が、クラスＩＲＮＡレベルのＴＳＨ誘導抑制と丁度同じように、ＴＳＨのｃＡＭＰシグナルによって仲介されることと（Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，１９４４〜１９４８；Ｓａｊｉ，Ｍ．等（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５，８７１〜８７８）、ＴＳＨ／ｃＡＭＰ誘導複合体の形成がサイレンサー活性に重要なＣＲＥ様配列を必要とすることを確立した。これらはさらに、ＣＲＥ様部位に隣接する配列が複合体形成に関与することを、延長したＤＮＡフットプリント及び他のＣＲＥ部位による複合体の研究に一致して示唆する（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．等Ｈ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，６６８２〜６６８６；Ｈａｂｅｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，１０８７〜１０９４；Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１〜１７１５）。同様なＥＭＳＡデータがＴＳＨを添加して又はＴＳＨなしでインキュベートしたＦＲＴＬ−５細胞に由来する抽出物と共に放射性標識したＦｒ１２７（−１２７〜＋１ｂｐ）を用いて得られた。Ｆｒ１６８と同様に、ＴＳＨ処理細胞又は非処理細胞からの抽出物を用いて一連の複合体を形成し、これらの全ては非標識Ｆｒ１２７又はＦｒ１６８によって競合されることができる。その上、ＴＳＨ又はフォルスコリンは新規なタンパク質／ＤＮＡ複合体の出現を誘導した。ＴＳＨ誘導複合体は非標識ＣＲＥ−１、−１２７ｂｐから−９０ｂｐまでの範囲である３８ｂｐＤＮＡフラグメントによって特異的に競合されることができる。これとは対照的に、欠失（△ＣＲＥ）又は置換（ＮＰ−ＣＲＥ）のいずれかによって、ＣＲＥ様要素が除去された誘導体オリゴヌクレオチドはＴＳＨ誘導帯と競合する又はＴＳＨ誘導帯を形成することができなかった。共通の基準ＣＲＥ部位(conse nsus canonical CRE site)が導入された誘導体（ＣＯＮ−ＣＲＥ）はネイティブ配列（ＣＲＥ−１）と同様に競合において有効であった。ＣＲＥ様要素の５’側配列（−１２７〜−１０８ｂｐ）のみを含有するＤＮＡフラグメントはＴＳＨ誘導帯に競合することができなかった。ＭＭＩとＴＳＨは、３８ｂｐ下流サイレンサー（−１２７〜−８９ｂｐ）のＣＲＥ様配列とのタンパク質複合体の形成を誘導し；その形成と機能はＴＳＨ受容体（ＴＳＨＲ）のインスリン応答要素と相互作用するタンパク質に依存する。上記結果（図２６）において、我々は電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）と、 −１６８ｂｐ又は−１２７ｂｐから＋１ｂｐまでの範囲である放射性標識ＤＮＡフラグメントとを用いて、３８ｂｐサイレンサーのＣＲＥ部位と相互作用するＴＳＨ／ｃＡＭＰ増強タンパク質／ＤＮＡ複合体を同定した。５ｍＭＭＭＩ（図２７Ａ、レーン２対１、矢印）並びにＴＳＨ（図２７Ａ、レーン５対１、矢印）によるＦＲＴＬ−５細胞の処理は、放射性標識１６８ｂｐフラグメントによる同様な大きさのタンパク質ＤＮＡ複合体の形成を誘導した。ＴＳＨプラスＭＭＩによる処理は、いずれかの単独の処理よりも、タンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を増加させた（図２７Ａ、レーン４対２又は５）；この増加をデンシトメーターで測定した、７回の実験において、ＴＳＨ又はＭＭＩ又は両方によって誘導された複合体の比は、それぞれ、１±０．２、０．８±０．３及び２．２±０．３であった。放射性標識１６８ｂｐフラグメントとのＴＳＨ誘導複合体を形成するＦＲＴＬ −５細胞抽出物の能力は、サイレンサー要素の３８ｂｐ配列（−１２７〜−９０ｂｐ）を有する非標識オリゴヌクレオチドによって妨害されるが（図２６Ｂ）、サイレンサー内のＣＲＥ様部位が欠失した若しくはＣＲＥ様部位が非パリンドローム突然変異によって置換されたオリゴヌクレオチドによっては妨害されなかった。ＭＭＩによって誘導された複合体は、ＣＲＥ−１と呼ばれる非標識３８ｂｐサイレンサーの２５０倍過剰量によっても妨害されるが（図２７Ｂ、レーン３対２）、ＣＲＥ様部位の非パリンドローム置換を有する同量のサイレンサー・オリゴヌクレオチドによっては妨害されなかった（図２７Ｂ、レーン４対２）。したがって、ＭＭＩ増強並びにＴＳＨ増強サイレンサー複合体の形成は完全なＣＲＥ様配列を必要とする。ＭＭＩ、ＴＳＨ又は両方によって誘導されたタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成はインスリン／血清感受性因子を必要とする。したがって、ＴＳＨＲのインスリン応答要素（ＩＲＥ）の配列を有するオリゴヌクレオチド（オリゴＴＩＦ（ＴＳＨ受容体インスリン応答要素））（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．等（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８〜３１９１４）の２００倍過剰量もＭＭＩによって（図２７Ａ、レーン３対２）、ＴＳＨによって（図２７Ａ、レーン９対５）及びＭＭＩプラスＴＳＨによって（図２７Ａ、レーン８対４）誘導された複合体形成を、ｉｎｖｉｔｒｏで結合混合物に加えたときに、阻止することができた。ＴＧプロモーターのインスリン応答要素の配列を有するオリゴヌクレオチド（オリゴＫ）（Ｓａｔｉｓｔｅｂａｎ，Ｐ．等（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１３１０〜１３１７）は、ＴＳＨによって（図２７Ａ、レーン７対５と９）又はＭＭＩプラスＴＳＨによって（図２７Ａ、レーン６対４と８）誘導された複合体形成を妨害しなかったので、オリゴＴＩＦの効果は特異的であった。ＴＳＨ誘導複合体又はＭＭＩ誘導複合体中に、オリゴＫと反応するタンパク質であるＳｏｘ−４が関与しないことは、下流ＣＲＥ含有サイレンサーの優勢と一致する。しかし、ＣＲＥが欠失するか又は突然変異する場合には、Ｓｏｘ−４はｐ（−１２７ＮＰ）ＣＡＴのＣＡＴ活性を増大させるオリゴＫの能力によって図１９Ｃにおいて実証されるように、下流で作用することができる。このことは２つのＳｏｘ−４反応性部位（約−１６１ｂｐのインターフェロン応答要素と−１２７ｂｐの下流サイレンサーとの間の１部位と、−８９ｂｐと−６８ｂｐの間の他方の部位）の存在を表す。これらはＣＲＥ（−１０７〜−１００ｂｐ）が突然変異するか又は欠失する場合にのみ発現される（図１９Ｃと表ＶＩ）。 −１２７〜＋１ｂｐフラグメントを用いて、同じデータが見られた。したがって、フラグメント１２７を放射性標識プローブとして置換した場合に、細胞の５ｍＭＭＭＩ処理は複合体の形成を誘導した。この複合体はＴＳＨ誘導複合体と同じ移動度を有した。ＭＭＩプラスＴＳＨは加算的に複合体形成を増加させ；ｉｎｖｉｔｒｏで加えたオリゴＴＩＦはＭＭＩ／ＴＳＨ誘導複合体形成を妨害したが、オリゴＫは妨害しなかった。ＴＳＨ／ＭＭＩ誘導複合体の形成は２５０倍過剰量の非標識３８ｂｐサイレンサー、ＣＲＥ−１をインキュベーション中に含めることによって妨害された。最後に、放射性標識１２７ｂｐフラグメントがＣＲＥ様部位の非パリンドローム置換を有する場合に、ＭＭＩ処理抽出物は新しい複合体を形成せず、このことはＭＭＩ誘導複合体を形成するためにＣＲＥ様オクタマーが必要であることを示唆した。 −２２０〜−１８８ｂｐのＴＳＨＲインシュリン応答エレメントは、ＦＲＴＬ −５細胞抽出物とタンパク質／ＤＮＡ複合体を形成することが可能な２つの領域をもつことが分かっている（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８−３１９１４）。３’側領域（図２８Ｃ、黒線）の突然変異体である突然変異体１（図２８Ｃ）は最小ＴＳＨＲプロモーターのＣＡＴキメラをＦＲＴＬ−５細胞にトランスフェクトした後にインシュリン応答性を失うので、この領域と相互作用するタンパク質はインシュリン応答性に関連する。突然変異体１はＹボックスタンパク質反応性も失う（実施例１１）。５’領域（図２８、網状陰影領域）と相互作用するタンパク質は１本鎖結合タンパク質であり、突然変異体２（図２８Ｃ）のようなこの領域の突然変異体は、インシュリン応答性を維持するが、１本鎖結合タンパク質と結合する能力を失う（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８−３１９１４）。一方もしくは他方のオリゴＴＩＦ突然変異体又はオリゴＫの配列をもつオリゴヌクレオチドを含むプラスミドと共にブタクラスＩプロモーター−ＣＡＴキメラをＦＲＴＬ−５細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞の各組の半数をＭＭＩで処理した。ＴＩＦ突然変異体２オリゴヌクレオチドをｐ（−１２７）ＣＡＴとコトランスフェクトすると、ＭＭＩにより低下したプロモーター活性の有意（Ｐ＜０．０１）損失が生じた（図２８）が、基底又は構成的活性の有意変化は生じなかった。以下の記載から明らかなように、ＴＧインシュリン応答エレメントであるオリゴＫを含むプラスミドをコトランスフェクトした細胞ではＭＭＩ活性に何の効果もなかった。オリゴＴＩＦ突然変異体１を含むプラスミドをコトランスフェクトしても倍増しなかった（データは示さず）。オリゴＴＩＦ突然変異体２を含むプラスミドをコトランスフェクトすると、ｐ（−１１００）ＣＡＴキメラに明白なＭＭＩにより誘導される低下がなくなり（図２８Ａ）、下流サイレンサーに及ぼすその効果はプロモーター活性を低下させるようにＭＭＩ作用に働きかける主効果であることが示唆された。以下に記載するように（実施例１０）、ＭＭＩの不在下でｐ（−１１００）ＣＡＴの基底活性を増加させるオリゴＴＩＦの能力（図２８Ａ）は下流サイレンサーと上流サイレンサーに関連するエンハンサーの相互作用関係に起因すると思われる。オリゴＴＩＦ突然変異体２は、細胞にトランスフェクトすると、ＭＭＩ／ＴＳＨにより誘導されるタンパク質ＤＮＡと下流サイレンサーの複合体の形成に重要なインシュリン応答因子と結合する。その結果、ＭＭＩ／ＴＳＨにより誘導されるクラスＩプロモーター活性の低下を阻止する。オリゴＫ又はオリゴＴＩＦ突然変異体１はＭＭＩにより誘導されるプロモーター活性の低下を阻止することができないので、その効果はＴＳＨＲインシュリン応答エレメントと相互作用する因子に特異的となり、１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）よりもむしろインシュリン感受性因子及び／又はＹボックスタンパク質ＴＳＥＰ−１がオリゴＴＩＦ配列と相互作用することができる（実施例１１参照）。これらのデータは、ＭＭＩとＴＳＨが−１２７〜−８９ｂｐの３８ｂｐサイレンサーエレメントとのタンパク質複合体の形成を独立して付加的に誘導し、各場合の複合体の形成にはサイレンサーの内側のＣＲＥ様部位の存在が必要であるという結論を裏付けるものである。その形成には更に、同様にＴＳＨＲ最小プロモーター内のインシュリン応答エレメントと相互作用するインシュリン／血清応答因子も必要である。ＭＭＩ／ＴＳＨにより増加されるサイレンサー（図２６及び２７）との複合体の形成はクラスＩ遺伝子発現に及ぼすＭＭＩ／ＴＳＨ効果に機能的に結び付けられる（図２８）。ＣＲＥ依存性サイレンサーエレメントを含む３８ｂｐクラスＩ領域は複数のタンパク質と複合体を形成し、その一部はｃＡＭＰにより誘導されるＴＳＨＲの負の調節に関与する。３８ｂｐサイレンサーエレメントと相互作用することが可能なタンパク質を特徴付けるために、セグメント−１２７〜−９０ｂｐの２本鎖オリゴヌクレオチドを放射性標識し、ＦＲＴＬ−５細胞抽出物と共にゲルシフトアッセイで使用した（図２９）。４組の複合体が観察され（Ａ〜Ｄ）、それらの形成は異なる親和性で非標識プローブとの競合により阻止された（図２９Ａ、レーン３〜６と２を比較）ので、全複合体は特異的であると思われた。ＴＳＨ／ＭＭＩにより誘導されるＦｒ１６８（図２６及び２７）又はＦｒ１２７との複合体と同様に、全複合体の形成はＣＲＥ様エレメントに依存性であった。従って、それらの形成はＣＲＥを欠失（図２９Ａ、ΔＣＲＥ−１、レーン７〜９と２を比較）又はその非パリンドローム形態に突然変異させた３８ｂｐサイレンサーにより阻害されなかった。Ａ領域の３８ｂｐサイレンサーと形成されるタンパク質／ＤＮＡ複合体の１種は、コンセンサスＣＲＥ（下線）を含むが、９〜１０個の他の無関係なフランキングヌクレオチドがソマトスタチンＣＲＥに由来するＰｒｏｍｅｇａ社オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＡＧＡＴＴＧＣＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧ− ３’により阻害された（図２９Ａ、レーン１０〜１２を２と比較）。同一複合体はＣＲＥ結合タンパク質−３２７（ＣＲＥＢ）（Ｗａｅｂｅｒ，Ｇ．ら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５，１４１８−１４３０）に対する抗体を用いると上位シフトできた（図２９Ｂ、レーン４）が、抗ＣＲＥＢ２、抗ｍＸＢＰ又は抗活性化転写因子２（ＡＴＦ２−ＢＲ）ではできなかった（図２９Ｂ、レーン１〜３）。従って、−１２７〜−９０ｂｐの３８ｂｐサイレンサー内のＣＲＥ様部位と相互作用するあるタンパク質はＣＲＥＢ（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｈ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３，６６８２−６６８６；Ｈａｂｅｎｅｒ，Ｊ．Ｆ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，１０８７−１０９４；Ｗａｅｂｅｒ，Ｇ．ら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．５，１４１８−１４３０；Ｈｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｐ．ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２，１４３０−１４３３；Ｄｅｕｔｃｈ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１８４６６−１８４７２）又は免疫学的に関連するＣＲＥ結合タンパク質であると同定することができる。ＣＲＥＢ以外に図２９ＡのＡ及びＢ複合体における２本鎖結合タンパク質の２種は甲状腺転写因子１（ＴＴＦ−１）とＰａｘ−８である。ＴＴＦ−１はＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるＴＳＨＲの完全発現に重要な甲状腺特異的転写因子である（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９−２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７−５３９；Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１５８９−１５９５）。ＴＴＦ−１とＰａｘ−８はチログロブリン及び甲状腺ペルオキシダーゼ遺伝子の甲状腺特異的発現に必要である（Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌ，Ｄ．ら（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８，２５３７−２５４２；Ｇｕａｚｚｉ，Ｓ．ら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９，６３１−３６３９；Ｆｒａｎｃｉｓ−ＬａｎｇＨ．ら（１９９２）ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ１２：５７６−５８８；Ｋｉｋｋａｗａ，Ｆ．ら（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０，６２１６−６２２４；Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ．ら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，４９２７−４９３３；Ｌａｚｚａｒｏ，Ｄ．ら（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１３，１０９３−１１０４；Ｚａｎｎｉｎｉ，Ｍ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，４２３０−４２４１）。ＴＴＦ−１は甲状腺分化の開始から発現されるホメオドメインを含むＤＮＡ結合タンパク質である（Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．ら（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８，２５３７−２５４２；Ｇｕａｚｚｉ，Ｓ．ら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９，６３１−３６３９；Ｆｒａｎｃｉｓ−ＬａｎｇＨ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５７６−５８８；Ｌａｚｚａｒｏ，Ｄ．ら（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１３，１０９３−１１０４）。Ｐａｘ−８はチログロブリン及び甲状腺ペルオキシダーゼ遺伝子中のＴＴＦ−１認識部位の１つにオーバーラップする配列と結合する対合ドメインを含むタンパク質であり、同様に甲状腺分化に関与する（Ｚａｎｎｉｎｉ，Ｍ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，４２３０−４２４１）。３８ｂｐクラスＩサイレンサーと形成される図２９ＡのＢ複合体はタンパク質／ＤＮＡのＴＴＦ−１付加物を含み、図２９ＡのＡ複合体はＣＲＥＢ以外にＰａｘ−８付加物を含む。これは以下のように立証される。３８ｂｐクラスＩサイレンサーとのＢ複合体（図２９Ａ）の形成は、ＴＳＨＲからのＴＴＦ−１結合エレメントの配列をもつオリゴヌクレオチドにより阻害される［図３０Ｂ、レーン５（ＴＳＨＲオリゴＴＴＦ−１）と２を比較］が、ＴＴＦ−１に対するその反応性を失うオリゴヌクレオチドの突然変異形では阻害されない（図３０Ｂ、レーン６と２を比較）。ＴＳＨＲＴＴＦ−１結合部位はＰａｘ−８と相互作用しない（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９−２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７−５３９；Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１５８９−１５９５）。３（図３０Ｂ）又は０．５μｇのポリｄＩ−ｄＣの存在下でも同一のデータが得られた。各オリゴヌクレオチドの配列は図３０Ｃに示す通りであり、それらの特性、ＴＴＦ−１特異性及びＰａｘ−８と結合できないことは個々に詳細に記載されている（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９ −２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７−５３９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８−３１９１４）。ＴＴＦ−１又はＰａｘ−８と相互作用するチログロブリンプロモーター上の部位に似たオリゴヌクレオチドをオリゴＣと呼ぶ（Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．ら（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８，２５３７−２５４２；Ｇｕａｚｚｉ，Ｓ．ら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９，６３１−３６３９；Ｆｒａｎｃｉｓ−ＬａｎｇＨ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５７６−５８８）。オリゴＣの配列と、ＴＴＦ−１又はＰａｘ−８と反応しなくなることが示されているオリゴＣの突然変異体（Ｃｉｖｉｔａｒｅａｌｅ，Ｄ．ら（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８，２５３７−２５４２；Ｇｕａｚｚｉ，Ｓ．ら（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９，６３１−３６３９；Ｆｒａｎｃｉｓ −ＬａｎｇＨ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５７６−５８８）の配列を図３０Ｃに示す。予想通り、オリゴＣはＴＴＦ−１と相互作用するので、３又は０．５μｇのポリｄＩ−ｄＣの存在下で図２９ＡのＢ複合体の形成を阻止することができる［図３０Ｂ又は３０Ａ、レーン４（ＴＧオリゴＣ）と２を比較］。他方、オリゴＣ突然変異体（ＴＧオリゴＣＭｕｔ）はＢ複合体の形成を阻止しない（図３０Ａ、レーン５と２、図８Ｂ、レーン３と２を比較）。これは、複合体ＢがＴＴＦ−１を含むことをＴＴＦ−１に特異的なＴＳＨＲオリゴＣで立証した上記データに一致する。他方、図２９ＡのＡ複合体の一部はオリゴＣにより阻害される（図３０Ａ又は３０Ｂ、レーン４と２を比較）が、その突然変異体（図３０Ａ、レーン５と２、図３０Ｂ、レーン３と２を比較）や、ＴＴＦ−１のみに反応性のＴＳＨＲオリゴヌクレオチド（図３０Ｂ、レーン５と４又は２を比較）では阻害されないことに注目すべきである。このことから明らかなように、図２９ＡのＡ複合体の一部はＣＲＥＢに加え、Ｐａｘ−８と３８ｂｐサイレンサーのＣＲＥ依存性相互作用を示す。ＣＲＥ依存的に３８ｂｐＣＲＥ−１オリゴヌクレオチドと相互作用する他の２種のタンパク質は、（ａ）すぐ５’側でＴＴＦ−１部位に隣接するＴＳＨＲプロモーターの非コーディング鎖と結合する１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７−５３９）と、（ｂ）最小ＴＳＨＲプロモーター内の−１６３〜−１４１ｂｐのデカヌクレオチドタンデムリピートの存在により同定される部位でＴＳＨＲのコーディング鎖と結合するＹボックスタンパク質ＴＳＥＰ−１（ＴＳＨＲサプレッサーエレメントタンパク質１）である（実施例１１）。これは、（ａ）結合アッセイで高濃度のポリ（ｄＩ−ｄＣ）（図３０Ｂ）の存在下におけるＣ複合体（図２９Ａ）の出現の低下が、１本鎖結合タンパク質により示される低ストリンジェントな配列特異的結合反応に起因する可能性と、（ｂ）ＳＳＢＰとＴＳＥＰ −１の両者が関与する可能性を評価した際に立証された。まず、結合反応で非標識競合剤としてＣＲＥ−１のコーディング又は非コーディング鎖を加えると、ＣＲＥ−１と呼ぶ２本鎖３８ｂｐサイレンサーと図２９ＡのＡ及びＢ複合体でなくＣ複合体の形成が低下した（図３１、夫々レーン２及び３と１を比較）。このことから、Ｃ複合体は１本鎖ＤＮＡとも結合できるタンパク質の結合を含むと思われた。第２に、ＴＳＨＲ非コーディング鎖上に−１９４〜−１６９ｂｐ（図３１Ｃ）のＳＳＢＰ結合部位を含む１本鎖オリゴヌクレオチドと、ＴＳＨＲのコーディング鎖上に−１７７〜−１３８ｂｐ（図９Ｃ）のＴＳＥＰ−１結合部位を含む１本鎖オリゴヌクレオチドは、各々−１２７〜−９０ｂｐの２本鎖３８ｂｐクラスＩＣＲＥ−１サイレンサーエレメントとのＣ複合体の形成を阻害した（図３１Ｂ、夫々レーン３、４及び６、７と２及び５を比較）。これらのデータから、ＣＲＥ依存的に３８ｂｐサイレンサーと相互作用する１本鎖結合タンパク質はＴＴＦ−１以外に、ＴＳＨ／ｃＡＭＰにより誘導されるＴＳＨＲの抑制に重要な２種のタンパク質を含むと思われた。第３に、放射性標識プローブとして３８ｂｐＣＲＥ−１サイレンサーのコーディング及び非コーディング鎖を使用した競合試験（図３２）において、ＴＳＨＲ上の３部位（図３２Ａ、下段）と相互作用するＹボックスタンパク質であるＴＳＥＰ−１はＣＲＥ−１のコーディング鎖との特異的タンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を阻害する（図３２Ａ）。各ＴＳＨＲＹボックス結合部位はＣＣＴＣモチーフを含む（実施例１１）。このモチーフを突然変異させると（Ｍｕｔ２）、ＴＳＨＲとＴＳＥＰ−１の結合が消滅又は減少し、ＣＣＴＣモチーフを含まない野生型配列又は別の突然変異体（Ｍｕｔ１）に比較してＴＳＥＰ−１抑制活性が低下する（図３２Ａ、下段）。放射性標識プローブとしてＣＲＥ−１コーディング鎖を使用した場合、過剰の野生型又はＭｕｔ１オリゴヌクレオチドを加えることによりゲルの上部の主要タンパク質複合体の形成は阻止されるか又は低下した（図３２Ａ、夫々レーン２とレーン３〜４、６〜７及び９〜１０を比較）が、Ｍｕｔ２オリゴヌクレオチドではそうではなかった（図３２Ａ、夫々レーン２とレーン５、８及び１１を比較）。ＴＳＨＲ上のＳＳＢＰ結合ドメイン（図３２Ｂ、下段、黒線）は５’側でＴＳＨＲの非コーディング鎖上のＴＴＦ−１結合ドメインと隣接しており、２個のＧヌクレオチド（図３２Ｂ、下段、下線）を突然変異させると、ＴＳＨＲＳＳＢＰ部位を含む１本鎖オリゴヌクレオチドとＳＳＢＰの結合が低下するが、同一突然変異をもつ２本鎖オリゴヌクレオチドとＴＴＦ− １の結合は低下しない（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９−２８２）。放射性標識プローブとしてＣＲＥ−１非コーディング鎖を使用した場合、ＳＳＢＰと結合することが可能な過剰の野生型１本鎖オリゴを加えることにより、主要タンパク質複合体の形成は低下した（図３２Ｂ、レーン２とレーン３及び５を比較）が、突然変異ＳＳＢＰオリゴヌクレオチドでは低下の程度が著しく少なかった（図３２Ｂ、レーン２とレーン４及び６を比較）。ＣＲＥ依存性サイレンサー活性を示し、同様にＣＲＥ依存性のＴＳＨ／ｃＡＭＰにより誘導される新規タンパク質複合体の形成に関与するクラスＩ５’フランキング領域の−１２７〜−９０ｂｐの３８ｂｐＣＲＥ−１領域は、ＣＲＥ依存的に複数のタンパク質と相互作用する。本発明ではこれらのタンパク質の５種類、ＣＲＥＢ、ＴＴＦ−１、Ｐａｘ−８、ＴＳＥＰ−１及びＳＳＢＰを同定できる。ＣＲＥＢ、ＴＴＦ−１、ＴＳＥＰ−１及びＳＳＢＰの４種はＦＲＴＬ−５甲状腺細胞でＴＳＨＲ最小プロモーターと相互作用する。ＴＴＦ−１、ＳＳＢＰ及びＴＳＥＰ−１の３種はＦＲＴＬ−５甲状腺細胞でＴＳＨ／ｃＡＭＰにより誘導されるＴＳＨＲの負の調節に重要であることが知られている（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，７９３−８０４；Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９−２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７−５３９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８−３１９１４；実施例１１）。１種ＴＳＥＰ−１はＹボックスタンパク質である。ヒトＹボックスタンパク質ＹＢ−１もＭＨＣクラスＩＩプロモーターと相互作用し、リンパ球でＴＳＨ／ｃＡＭＰにより誘導されるクラスＩＩ遺伝子の抑制に重要である（Ｉｖａｓｈｋｉｖ，Ｌ．Ｂ．ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，１５８３−１５９２；Ｖｉｌｅｎ，Ｂ．Ｊ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２３７２８−２３７３４；Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｍ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２６３２８−２６３３３；Ｉｖａｓｈｋｉｖ，Ｌ．Ｂ．ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ２７，６７−７７；Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９，１６０５−１６１１；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｋ．Ｌ．ら（１９９４）ＥＭＢＯＪ．１３，４０４２−４０５３；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｇ．Ｈ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，３５２７−３５３３）。ＣＲＥ依存性３８ｂｐクラスＩサイレンサーエレメントと相互作用する複数のタンパク質のＴＳＨ調節。ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞をＴＳＨ／フォルスコリンで１２〜１８時間処理すると、クラスＩＲＮＡレベルの最大限の低下が生じる（Ｓａｊｉ，Ｍ．ら（１９９２ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，１９４４−１９４８；Ｓａｊｉ，Ｍ．ら（１９９２ｂ）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７５，８７１−８７８）。この期間にＴＳＨで処理した細胞からの抽出物は、活性と結合がＣＲＥに依存する３８ｂｐサイレンサー領域と形成されるタンパク質／ＤＮＡ複合体の量及び組成を変化させる（図３３）。即ち、ＴＳＨ処理の結果、図２９ＡのＡ及びＢ複合体の形成が著しく低下するが、Ｃ複合体の形成は増加する（図３３、レーン４とレーン２を比較）。Ａ複合体では、ＴＳＨはＣＲＥＢ相互作用を有意に低下させ、これは抗ＣＲＥＢ−３２７がＡ複合体を上位シフトさせる能力の低下により立証される。ＴＴＦ−１Ｂ複合体も有意に減少する。ＣＲＥ結合タンパク質とホメオドメインタンパク質はＴＳＨＲ（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９４４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９）及びソマトスタチンレセプター（Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，６２４７−６２５１；Ｖａｌｌｅｊｏ，Ｍ．ら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，１２８６８−１２８７５；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．ら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．７，１２７５−１２８３）で相乗的に作用することが知られているので、両者が同時に減少することは注目に値する。ｉｎｖｉｖｏＴＳＨ処理に似せて抗ＣＲＥＢ−３２７をｉｎｖｉｔｒｏ付加すると、同様にＣ複合体形成を増加する（図３３、レーン３と２をレーン４と２に比較）が、Ａ又はＢ複合体の形成は変わらない。従って、ＴＳＨにより誘導されるＣ複合体の増加はＴＴＦ−１の減少とＣＲＥＢとのその相乗作用に起因すると思われる。ＴＳＨ処理はＴＴＦ−１とＴＳＨＲの結合を低下させると同時に、ＳＳＢＰとＴＳＨＲの相互作用も低下させる（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７−５３９）が、ＴＳＥＰ−１とＴＳＨＲの結合は低下させない（実施例１１）。これは、ＴＳＨ又は抗ＣＲＥＢ−３２７により誘導されるＣ複合体形成の見かけの増加がＳＳＢＰ複合体の増加に起因しないことを示唆するものであると思われる。従って、ＴＳＥＰ−１は３８ｂｐサイレンサーとのＣＲＥ依存性相互作用の相対増加を示すタンパク質であると思われるので、ＴＳＥＰ−１がＴＳＨにより誘導されるＦＲ１６８又はＦｒ１２７との新規複合体の増加の重要な成分であるか否かを調べた。ＴＳＥＰ−１と結合できるが、ＳＳＢＰ、ＴＴＦ−１、ＣＲＥＢ又はＰａｘ−８とは結合しないオリゴヌクレオチドは、ＴＳＨにより増加するＦＲ１６８との複合体の形成を低下させることができた（図３４Ａ）ため、この可能性が確認された。この実験で使用したＴＳＥＰ−１結合オリゴは最小ＴＳＨＲプロモーターの−２２０〜−１８８ｂｐ（図３２Ｂ）のインシュリン感受性エレメントに由来する。ＣＲＥ様部位は構成的サイレンサーの必須成分であり（本実施例、図２５Ａ〜Ｂ）、ＴＳＨにより誘導される複合体の形成に関与する（本実施例、図２６Ａ〜Ｂ、２７Ａ〜Ｂ）ことが分かっているので、ＴＳＨ／ｃＡＭＰ又はＭＭＩによるクラスＩ遺伝子発現の負の調節におけるその役割を調べることが重要であった。ＳＶ４０最小プロモーターの下流の−１２７〜−９０ｂｐの２個の３８ｂｐＤＮＡセグメントを含むｐＣＡＴプロモーター構築物をＦＲＴＬ−５細胞に一過性トランスフェクトした。上述のように（図２５Ｂ）、５’→３’の向きに配置すると、このＤＮＡセグメントの単一コピーはＳＶ４０プロモーター活性を有意に低下させることができ、効果の大きさは挿入した３８ｂｐセグメントのコピー数と共に増加した（図３５Ｂ、Ｃ）。トランスフェクトした細胞をフォルスコリンで処理すると、単一コピーが存在する場合にはプロモーター活性は更に低下した（Ｐ＜０．０５）が、２個のコピーが存在する場合には低下しなかった（図３５Ｂ）。細胞を１×１０^-10ＭＴＳＨ又は５ｍＭＭＭＩで処理すると、フォルスコリン活性は倍増する（データは示さず）。このように、ＴＳＨ／ｃＡＭＰ及びＭＭＩはサイレンサーの活性を増加することができた。ＣＡＴに連結したクラスＩプロモーターの一連の５’欠失構築物（図１６Ａ、図３５Ａ）として、全て共通の３’末端をもつが、上流配列の長さが異なる構築物をＦＲＴＬ−５細胞に一過性トランスフェクトした処、ＴＳＨはＣＲＥを含む −１０７〜−１００ｂｐの３８ｂｐサイレンサー領域を欠失するｐ（−８９）ＣＡＴ（図１６Ａ、３５Ａ）のプロモーター活性を依然として低下させることができた。従って、ＣＲＥ様エレメントが構成的サイレンサーとして機能し、ＴＳＨにより誘導されるタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成に必要であり、ｐＣＡＴプロモーター構築物でＴＳＨ／ｃＡＭＰ応答性を示すという事実にも拘わらず、クラスＩプロモーター活性のｃＡＭＰ抑制には−８９ｂｐの下流の他のエレメントが関与している。８９ｂｐ内の任意の転写開始ＤＮＡ配列が３８ｂｐＣＲＦ−１サイレンサーとＴＳＨにより誘導されるＦｒ１６８とのタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成に関係するか否かを調べるために、−８９〜＋１ｂｐフラグメント（Ｆｒ８９）がＴＳＨにより誘導されるＦｒ１６８との複合体形成に関して競合する能力を試験した。図３６、レーン３及び４とレーン１１を比較すると明らかなように、この９０ｂｐフラグメントはＦＲ１２７（図３６、レーン２）又はＣＲＥ−１（図３６、レーン１）と同様に、ＴＳＨにより誘導されるバンドの形成に関して競合することができた。複合体形成に関して競合する９０ｂｐフラグメント中の正確な残基はまだ同定されていないし、３８ｂｐサイレンサー領域とＣＲＥ依存性結合を示すどの因子が９０ｂｐフラグメントと結合するかも不明である。ＴＳＥＰ−１はＣＲＥ−１と結合するＹボックス（実施例１１）であり、ＴＳＨにより誘導されるＦｒ１６８とのバンド形成に関与し、ＴＳＨＲＹボックスタンパク質からのＴＳＥＰ−１と結合するオリゴヌクレオチドとの競合により立証されるように、クラスＩプロモーターの−８９ｂｐ内の配列を含むＭＨＣクラスＩ５’フランキング領域の多重部位で相互作用することが知られている（実施例１１）。実施例１０上流サイレンサー／エンハンサーと下流サイレンサーの相関調節図１９Ａ〜Ｃに示すように、オリゴＫをｐ（−１２７）ＣＡＴキメラとコトランスフェクトしても活性に何の効果もなかった。他方、オリゴＫをｐ（−１２７）ＣＡＴの非パリンドロームＣＲＥ突然変異体であるｐ（−１２７ＮＰ）ＣＡＴとコトランスフェクトすると、プロモーター活性に顕著な刺激効果があった（図１９Ｃ）。これらのデータから、オリゴＫ（Ｓｏｘ−４、図２０）と相互作用し、上流サイレンサー機能に重要なタンパク質は下流で相互作用できるが、その相互作用は下流サイレンサーが不活性化されたときにしか明白ではないと思われた。上流サイレンサーに対して反応性のインシュリン誘導タンパク質を除去すると、通常はｐ（１２７）ＣＡＴキメラでは機能的下流サイレンサーの存在により無効なエンハンサー活性が発現する。従って、上流領域と下流領域は相関しているが、下流サイレンサーは機能的に優性であり、オリゴＫ反応性タンパク質に関連するエンハンサー活性を抑制する（Ｓｏｘ４、図２０）。上流及び下流プロモーターの相関はＥＭＳＡでも立証される。即ち、１６８ｂｐ構築物が放射性標識プローブである場合には、高濃度の非標識１４０フラグメントは、ＭＭＩ又はＭＭＩ／ＴＳＨにより誘導される下流サイレンサーのＣＲＥとの複合体を形成を妨げた（図３７Ａ、レーン２と１及び３を比較）。ＴＳＨ／ＭＭＩによる下流サイレンサー複合体の形成の増加に関与するタンパク質と相互作用する１４０フラグメント上の１部位はエンハンサーエレメントであると思われる。即ち、１４０フラグメントのエンハンサー複合体のみの形成を阻害するオリゴＥ９（図１７）は、下流３８ｂｐサイレンサーにより形成されるタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を阻害する（図３７Ｂ、レーン８）。ＡＰ−１又はＯｃｔ −１コンセンサス配列をもつオリゴヌクレオチドは同様に下流サイレンサーとの複合体形成を阻害せず（図３７Ｂ、レーン６及び７）、ソマトスタチンＣＲＥ配列に相当するＰｒｏｍｅｇａＣＲＥオリゴヌクレオチドも阻害しない（図３７Ｂ、レーン７）ので、阻害は特異的であると思われる。更に、非標識３８ｂｐサイレンサーの配列をもつオリゴヌクレオチド（図３７Ｂ、レーン３、ＣＲＥ−１）はＥ９により阻害される全複合体の形成を阻止する。従って、上流エンハンサー及び下流サイレンサーと結合するタンパク質、特に下流サイレンサー及びＴＳＨＲの負の調節に重要なタンパク質間に相互作用があると思われる。実施例１１Ｙボックスタンパク質ＴＳＥＰ−１はＭＨＣクラスＩの重要な調節剤であり、その活性はＴＳＨ及びＭＭＩにより調節される材料と方法ＴＳＥＰ−１のクローニング − ＴＳＨＲ最小プロモーター内の−１６２〜 −１４０ｂｐのタンデムリピート（ＴＲ）配列の２つのデカヌクレオチドを含む³² Ｐ標識コーディング鎖オリゴヌクレオチドｓｓＴＲ２（＋）（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５−２４１３７）を使用したサウスウェスタンブロッティング（Ｖｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．ら（１９８８）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２，８０１−８０６）によりλｇｔ１１ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Ａｋａｍｉｚｕ，Ｔ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，５６７７−５６８１）をスクリーニングした。他の手順は実施例８のＳｏｘ−４のクローニングと同一手順に従った。細胞 − ５％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を補充したクーンの改変ハムＦ−１２でバッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）を培養した。ＦＲＴＬ−５（ＡＴＣＣＣＲＬ８３０５）及びＦＲＴラット甲状腺細胞を同一培地で培養した（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，７９３ −８０４；Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５−２４１３７；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８−３１９１４；Ａｍｂｅｓｉ−Ｉｍｐｉｏｍｂａｔｏ，Ｆ．Ｓ．（１９８６）Ｆａｓｔ−ｇｒｏｗｉｎｇｔｈｙｒｏｉｄｃｅｌｌｓｔｒａｉｎ．米国特許第４，６０８，３４１号；Ａｍｂｅｓｉ−Ｉｍｐｉｏｍｂａｔｏ，Ｆ．Ｓ．とＣｏｏｎ，Ｈ．Ｇ．（１９７９）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．（増補）１０，１６３−１７１；実施例６、７及び８）。大腸菌におけるタンパク質生産 − ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して組換えタンパク質を製造した。ＴＳＥＰ−１ｃＤＮＡインサートを発現ベクターｐＥＴ−３０（＋）のＥｃｏＲＩ部位に連結し、Ｈｉｓタグ配列をそのＮ末端に連結させた。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して形質転換後、Ｓｏｘ−４について実施例８に記載した手順を実施した。ＥＭＳＡ − アッセイでは、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識後に８％天然ポリアクリルアミドゲル上で精製した合成１本鎖又は２本鎖オリゴヌクレオチドを使用した（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５ −２４１３７；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８−３１９１４；実施例６及び８）。ＦＲＴＬ−５核抽出物１μｇ又は組換えＴＳＥＰ−１５０ｎｇを実施例６及び８に記載したように非標識競合オリゴヌクレオチドの存在下又は不在下でインキュベートした。ＤＮＡ−タンパク質複合体を５％天然ポリアクリルアミドゲル上で分離した。核抽出物は従来の記載通り（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５−２４１３７；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３１９０８−３１９１４）又は実施例８に記載の手順により調製した。大規模調製物では、６Ｈ培地でほぼコンフルエントまで増殖させた後に５Ｈ培地（−ＴＳＨ）で７日間保存した細胞からＦＲＴＬ−５抽出物を得た。細胞を掻き取って回収し、Ｍｇ⁺⁺Ｃａ⁺⁺を含まないダルベッコの改変ＰＢＳ（ＤＰＢＳ），ｐＨ７．４で洗浄し、５００×ｇで遠心分離後に２％Ｔｗｅｅｎ−４０、１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７．９、１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭＥＧＴＡ、０．５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペプスタチンＡを含む０．３Ｍスクロース５ペレット容量に懸濁した。凍結、融解及び温和な均質化後、同一緩衝液を含む１．５ｍＭスクロースクッション上で２５，０００×ｇで遠心分離して核を分離し、１０ｍＭＥＧＴＡ、１０％グリセロール、０．５ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペプスタチンＡに溶解した。１００，０００×ｇで１時間遠心分離後、上清を透析し、ゲル移動度シフト分析に用いた。結果ＴＳＨレセプター（ＴＳＨＲ）プロモーターの−１６２〜−１４０ｂｐのタンデムリピート（ＴＲ）における５’デカヌクレオチドはプロモーターのＣＴリッチなＳ１ヌクレアーゼ感受性領域である（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，７９３−８０３；Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５−２４１３７）。非甲状腺特異的因子は５’デカヌクレオチドのコーディング鎖と結合し、−１３９〜−１３２ｂｐのｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）の構成的エンハンサー活性を抑制することによりＴＳＨＲ遺伝子発現を低下させる（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２４１２５−２４１３７）。ここでは、５’デカヌクレオチドと相互作用する１本鎖ＤＮＡ結合タンデムをコードするｃＤＮＡ（図３８Ａ〜Ｂ）をクローニングし、ＴＳＥＰ−１と命名した。即ち、１４０５ｂｐのクローン４０（図３８Ａ）は３２２アミノ酸のオープンリーディングフレームをもつタンパク質をコードした（図３８Ｂ）。配列比較の結果、オープンリーディングフレームによりコードされるタンパク質はサプレッサーとしてでなくむしろエンハンサーとして特徴付けられるラット肝臓タンパク質であるエンハンサー因子１_A即ちＥＦ１_A（Ｏｚｅｒ，Ｊ．ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２２１４３−２２１５２；Ｆａｂｅｒ，Ｍ．ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２２２４３−２２２５４）又はラットＣＢＢＦ／ＣＤＳ（Ｐｅｔｔｙ，Ｋ．Ｊ．ら，ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｍ６９１３８）に似ていることが判明した。ＥＦＩ_Aは２つの逆方向ＣＣＡＡＴボックスモチーフでラウス肉腫ウイルスの長い末端反復エンハンサー及びプロモーターと相互作用する能力により同定された（Ｏｚｅｒ，Ｊ．ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２２１４３−２２１５２；Ｆａｂｅｒ，Ｍ．ら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２２２４３−２２２５４）。ラットＣＢＢＰ／ＣＤＳは肝臓におけるリンゴ酸酵素遺伝子の構成的発現にその結合が必要とされるタンパク質としてクローニングされた。ＴＳＥＰ−１は３種のヒトＹボックスタンパク質と約９５％相同である。第１番目はＹＢ−１であり、ファミリーの名称の由来であるＹボックスと呼ぶ主要組織適合性複合体クラスＩＩ逆方向ＣＣＡＡＴモチーフとの結合因子としてリンパ芽球細胞系から単離されたタンパク質である（Ｄｉｄｉｅｒ，Ｄ．Ｋ．ら，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，７３２２−７３２６）。第２番目はＤｂｐＢであり、ＹＢ−１とほぼ相同配列であり、ＥＧＦＲエンハンサー及びヒトｃ−ｅｒｂＢ−２エンハンサー内の逆方向ＣＣＡＡＴモチーフと結合する能力によりクローニングされたタンパク質である（Ｓａｋｕｒａ，Ｈ．ら（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３，４９９−５０７）。第３番目はＤｂｐＢＮＳＥＰ−１と同族又は相同であり（Ｋｉｎｎｉｂｕｒｇｈ，Ａ．Ｊ．（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１７，７７７１−７７７８；Ｋｏｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，２０，１１１−１１６；Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｐ．，（１９９２）ＮｅｗＢｉｏｌ．，４，２９０−２９８；Ｋｏｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，（１９９１）ＮｕｅｌｃｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９，４７７１）、ｃ−ｍｙｃ、ＥＧＦＲ及びＫｉ−ｒａｓのＣＴリッチなヌクレアーゼ感受性１本鎖結合エレメントと結合する能力によりクローニングされたタンパク質である。これらのデータが示すように、クローンはＹボックスファミリーのタンパク質のメンバーであるタンパク質をコードした（Ｗｏｌｆｆｅ，Ａ．Ｐ．，（１９９２）ＮｅｗＢｉｏｌ．，４，２９０−２９８）。このファミリーの１員であるヒトＮＳＥＰ−１はＴＲの５’デカヌクレオチドに関連するタンパク質と同様に、ＣＴリッチな１本鎖Ｓ１ヌクレアーゼ感受性プロモーター領域と結合する能力に基づいて既にクローニングされている。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子のサプレッサーであるヒトＹＢ−１を除き（Ｉｖａｓｈｋｉｖ，Ｌ．Ｂ．ら，（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４，１５８３−１５８２；Ｉｖａｓｈｋｉｖ，Ｌ．Ｂ．ら，（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７，６７−７７；Ｖｉｌｅｎ，Ｂ．Ｊ．ら，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２３７２８−２３７３４；Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｍ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２６３２８−２６３３３；Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｐ−Ｙら，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９，１６０５−１６１１；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｋ．Ｌ．ら，（１９９４）ＥＭＢＯＪ．，１３，４０４２−４０５３；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｇ．Ｈ．ら，（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，３５２７−３５３；Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．ら，（１９９０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ．，８，６８１−７１５；Ｄｉｄｉｅｒ，Ｄ．Ｋ．ら，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５，７３２２−７３２６）、Ｙボックスタンパク質はサプレッサー活性よりもむしろエンハンサーに関連付けられている。無傷のＴＲ配列を含むプロモータークロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）キメラをコトランスフェクトするか又は各デカヌクレオチドの突然変異を不活性化することにより、本発明者らはタンパク質が３’デカヌクレオチドでなく５’デカヌクレオチドの機能を調節することを示す（図３９Ａ〜３９Ｃ）。これは、クローニングしたｃＤＮＡ（図３８Ｂ〜３８Ｂ’）を発現ベクターｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１に挿入し、無傷のＴＲ配列ｐＴＲＣＡＴ５’−１７７又は３’、５’もしくは両者のデカヌクレオチドの突然変異体（図３９Ａ）夫々ｐＴＲＣＡＴ５’−１７７ｍｔ１、ｐＴＲＣＡＴ５’−１７７ｍｔ２及びｐＴＲＣＡＴ５’−１７７ｍｔ１＋２を含むＴＳＨＲＣＡＴキメラのコトランスフェクションによりＴＳＨＲ遺伝子転写を低下させる能力を試験した際に調べた（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５−２４１３７）。ＴＲ内の各デカヌクレオチドを突然変異させると、ｐＴＲＣＡＴ５’−１７７よりもＣＡＴ活性が有意増加し（図３９Ｂ及び３９Ｃ）、両末端を突然変異させると、ＣＲＥを含むがＴＲは含まないｐＴＲＣＡＴ５’− １４６と同等レベルまでプロモーター活性は更に増加する（図３９Ｂ及び３９Ｃ）（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５−２４１３７）。従って、各デカヌクレオチドはサプレッサーエレメントとして作用する。４回の実験で、ＴＲの５’ 及び３’デカヌクレオチドの両者をその野生型形態で含むｐＴＲＣＡＴ５’−１７７とｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１をコトランスフェクトすると、ＣＡＴ活性はｐＲｃ／ＣＭＶ対照ベクターをコトランスフェクトした場合のレベルの５０±７％まで低下した（図３９Ｂ及び３９Ｃ）。ｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１発現ベクター又はｐＲｃ／ＣＭＶはｐＴＲＣＡＴ５’−１７７を構築するために使用したベクターｐ８ＣＡＴに何の効果もなかった。従って、既にクローニングされているＹボックスタンパク質はＴＳＨＲのサプレッサーであった。しかし、より重要な点として、ｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１のコトランスフェクションにより無傷の５’デカヌクレオチド配列を含むｐＴＲＣＡＴ５’−１７７ｍｔ１活性は有意（Ｐ＜０．０１）に低下し、４回の実験で平均して対照値の４５±５％まで低下した。コトランスフェクションは突然変異５’デカヌクレオチド配列をもつｐＴＲＣＡＴ５’−１７７ｍｔ２の活性には有意な効果がなかった（図３８Ｂ及び３９Ｃ）。更に、突然変異ＴＲ配列の５’及び３’デカヌクレオチドの両者をもつｐＴＲＣＡＴ５’−１７７ｍｔ１＋２（図３９Ａ）とｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ− １をコトランスフェクトしても、ｐＲｃ／ＣＭＶのコトランスフェクションと同様にＣＡＴ活性は低下しない（図３９Ｂ及び３９Ｃ）。これらのデータが示すように、図３８のｃＤＮＡによりコードされるＹボックスタンパク質ファミリーメンバーはＴＲ部位の３’デカヌクレオチドではなく５’デカヌクレオチドと相互作用することによりＴＳＨＲ遺伝子発現を抑制し、肝臓でのエンハンサートとしての役割にも拘わらず、ＴＳＥＰ−１に予想される機能的サプレッサー特性をもつ。同一突然変異をもつオリゴヌクレオチドを使用して、本発明者らはＴＳＥＰ− １と呼ぶ組換えタンパク質（ＴＳＨＲサプレッサーエレメントタンパク質１）が非コーディング又は２本鎖ＤＮＡ配列でなく５’−ＴＲのコーディング鎖と特異的タンパク質−ＤＮＡ複合体を形成することを示す。即ち、機能データを確認すると、図３８の全長クローンによりコードされる組換えＹボックスタンパク質はＴＲの５’デカヌクレオチドのコーディング配列と特異的に結合することが分かった。大腸菌で生産させてアフィニティー精製した組換えＨｉｓタグタンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（データは示さず）によると約４５ｋＤａであり、Ｙボックスタンパク質の４２ｋＤａ寸法（Ｓｐｉｔｋｏｖｓｋｙ，Ｄ．Ｄ．ら，（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０，７９７−８０３）にＨｉｓタグを加えた寸法に一致する。³²Ｐ標識１本鎖及び２本鎖プローブを用いたＥＭＳＡによると、組換えタンパク質はクローニング用プローブとして使用した１本鎖オリゴヌクレオチドであるＴＲのコーディング鎖ｓｓＴＲ２（＋）と結合した。しかし、ＴＲの非コーディング［ｓｓＴＲ２（−）］即ち２本鎖に相当するオリゴヌクレオチドには結合しなかった。更に、組換えタンパク質はＴＳＨＲプロモーターのＣＲＥ様配列と共にＴＲの３’デカヌクレオチド（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，１７０１−１７１５；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５−２４１３７）を機能的形態で含む１本鎖又は２本鎖ＴＲ１ＣＲＥプローブｓｓＴＲ１ＣＲＥ（＋）、ｓｓＴＲＩＣＲＥ（−）及びｄｓＴＲ１ＣＲＥにも結合しなかった。これらのデータは、図３８のクローンによりコードされるＹボックスファミリーのメンバーがＴＲの３’デカヌクレオチドでなく５’デカヌクレオチドのコーディング鎖と相互作用することによりＴＳＨＲ遺伝子発現のサプレッサーとして作用するという結論を裏付けるものである。ノーザン分析によると、ＴＳＥＰ−１は甲状腺特異的ではなく、ＴＳＨ又はインシュリンにより調節されない。即ち、クローン３１（図３８Ａ）からの放射性標識インサートをプローブとして使用したノーザン分析によると、ＦＲＴＬ−５細胞、バッファローラット肝（ＢＲＬ）細胞及び非機能的ラット甲状腺ＦＲＴ細胞からのＲＮＡ調製物で１．５ｋｂ転写物が検出された。従って、ｍＲＮＡ寸法はｒｔＣＢＢＦ／ＣＤＳ（Ｐｅｔｔｙ，Ｋ．Ｊ．ら，ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ番号Ｍ６９１３８３１）により肝臓で同定された寸法と同一である。これらのデータは、５’デカヌクレオチドと結合するタンパク質がＢＲＬ細胞に存在し、従って甲状腺特異的ではないという本発明者らの従来の考察（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２４１２５−２４１３７）に一致し、Ｙボックスタンパク質としてのＴＳＥＰ−１の同定に一致する。ＴＳＨの存在下又は不在下で保存したＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ調製物はＹボックス転写物レベルに有意差がなかった。細胞培地からインシュリン／血清を除去してもＹボックスｍＲＮＡレベルは変わらなかった。従って、ＴＳＥＰ−１は主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ遺伝子のＹボックスに結合するヒトＹＢ−１と、ＴＳＨＲと同様にＧＣリッチなプロモーターをもつ遺伝子、ｃ−ｍｙｃ、上皮成長因子レセプター、インシュリンレセプター及びＫｉ−ｒａｓのＣＴリッチな１本鎖ヌクレアーゼ感受性エレメントに結合するヒトＮＳＥＰ−１（ヌクレアーゼ感受性エレメントタンパク質１）との両者に９５％相同のＹボックスタンパク質である（Ｉｋｕｙａｍａ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，７９３−８０３）。ＴＳＥＰ−１は最小ＴＳＨＲプロモーターの他の２部位と１本鎖特異的に結合する。一方は最小ＴＳＨＲプロモーターのインシュリン応答エレメントに関連し、明白にＣＴリッチな領域には存在しない。他方はＴＳＨＲのＳボックスの３’ 末端の−１２０〜−１１３ｂｐに位置し、ＣＴリッチな領域に存在し、ＴＳＥＰ −１はこれらの２部位の各々で機能的サプレッサーである（図４０Ａ〜Ｃ）。ＥＭＳＡ及びオリゴヌクレオチド競合アッセイを使用し、ＴＳＥＰ−１が相互作用すると思われるＴＳＨＲ上の他の部位を決定した。放射性標識ｓｓＴＲ２（＋）とＦＲＴＬ−５細胞からの核抽出物のタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成は相同非標識オリゴヌクレオチドにより阻止され、その特異性を裏付けた。下流では、放射性標識ｓｓＴＲ２（＋）をプローブとして使用した場合には、−１５３〜 −１１４ｂｐの非標識ＴＲ１ＣＲＥは１本鎖又は２本鎖、コーディング又は非コーディングのいずれも複合体形成を阻止しなかった（データは示さず）。他方、ｓｓＳ（＋）と呼ぶ−１３１〜−１００ｂｐのＴＳＨＲのコーディング鎖配列に相当する非標識１本鎖オリゴヌクレオチドは放射性標識ｓｓＴＲ２（＋）複合体形成の有効な阻害剤であった。ｓｓＳ（＋）の非コーディング鎖に相当する非標識オリゴヌクレオチドｓｓＳ（−）もその形成を阻害せず、ＴＳＨＲのこの領域に相当する２本鎖オリゴヌクレオチドも同様に阻害しなかった。上流では、放射性標識ｓｓＴＲ２（＋）とのタンパク質−ＤＮＡ複合体の形成は−１９４〜−１６９ｂｐのＴＳＨＲ配列に相当するコーディング、非コーディング又は２本鎖オリゴヌクレオチドにより阻害されなかった。この領域は甲状腺転写因子１（ＴＴＦ−１）部位と、５’側でＴＴＦ−１部位に隣接する非コーディング鎖上の１本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）エレメントを含み、これらの部位はいずれもＴＳＨＲの最大発現とＴＳＨ−ｃＡＭＰによるＴＳＨＲ遺伝子発現の低下に結び付けられている（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら，（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９−２８２；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９，５２７−５３９）。他方、ＴＳＨＲインシュリン応答エレメントのコーディング鎖でなく非コーディング鎖の配列をもつ−２２０〜−１８８ｂｐのオリゴヌクレオチド（オリゴＴＩＦ）はｓｓＴＲ２（＋）複合体形成の有効な阻害剤であった。２本鎖オリゴヌクレオチドも競合剤ではなかった。これらのデータから、ＴＳＨＲには２つの付加的なＹボックスタンパク質結合部位が存在し、両者とも１本鎖特異性を示すと思われた。一方はＣＲＥの下流の −１３１〜−１００ｂｐに位置する。他方はインシュリン応答エレメントの領域である−２２０〜−１８８ｂｐに位置する。これを確認し、それらの機能的役割を確定し、部位を決定するために、以下の実験を実施した。まず、これらの他の部位を含むオリゴヌクレオチドを放射性標識プローブとして使用してオリゴヌクレオチド競合を実施した。即ち、−２２０〜−１８８ｂｐの領域に相当する非コーディング鎖オリゴヌクレオチド［オリゴｓｓＴＩＦ（− ）］を放射性標識プローブとして使用した処、主要タンパク質−ＤＮＡ複合体が形成され、その移動度は同一甲状腺細胞抽出物と形成されたｓｓＴＲ２（＋）複合体と同一であることが判明した。更に、その形成はＴＲ２［ｓｓＴＲ２（＋）］及びＳ領域［ｓｓＳ（＋）］の両者の非標識コーディング鎖により阻止されるが、非コーディング鎖であるｓｓＴＲ２（−）又はｓｓＳ（−）では阻止されないことが判明した。放射性標識プローブとしてｓｓＳ（＋）と非標識ｓｓＴＲ２（＋）又はｓｓＴＩＦ（−）を使用した競合実験でも同一の結果が得られ、非標識ｓｓＴＲ２（−）又はｓｓＴＩＦ（＋）も競合剤ではなかった（データは示さず）。そこで、同一細胞抽出物を使用し、これらの部位の存在、それらの結合特異性及び同一寸法の複合体を形成する能力を逆競合実験により確認した。第２に、放射性標識オリゴヌクレオチドを使用し、組換えＹボックスタンパク質が放射性標識ｓｓＳ（＋）及びｓｓＴＩＦ（−）と複合体を形成するが、放射性標識ｓｓＳ（−）又はｓｓＴＩＦ（＋）とは複合体を形成しないことを直接結合により示した。また、放射性標識２本鎖オリゴヌクレオチドであるｄｓＳ又はｄｓＴＩＦもＴＳＥＰ−１タンパク質と複合体を形成しなかった。こうして、組換えタンパク質による直接結合実験の結果、これらは１本鎖のＹボックスタンパク質結合部位であることが立証された。更に、放射性標識プローブを加える前に組換えタンパク質をタンパク質キナーゼＡの触媒サブユニット及びＡＴＰと共にプレインキュベートした場合には複合体形成を強化できないことも立証された。ＰＫＡ効果は放射性標識プローブとしてｓｓＳ（＋）、ｓｓＴＲ２（＋）又はｓｓＴＩＦ（−）を用いると倍増した（データは示さず）。使用前に酵素を煮沸した場合には効果は失われ、アルブミンでなくバレイショ酸ホスファターゼに暴露すると効果は逆行し、ＴＴＦ−１に報告されている結果と同様であった（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら，（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９−２８２）。第３に、ｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１のコトランスフェクション実験の結果、どちらの部位もサプレッサーエレメントとして機能することが判明した（図４０Ａ−Ａ’〜４０Ｄ−Ｄ’）。ｐＴＲＣＡＴ５’−２２０をＦＲＴＬ−５細胞にコトランスフェクトすると、対照ベクター単独のコトランスフェクションに比較してＣＡＴ活性を有意に（ｐ＜０．０５）低下させることができる（図４０Ａ−Ａ ’）。しかし、この構築物は３個のＹボックス部位を全て含んでいるので、−２２０〜−１８８ｂｐの領域が機能的Ｙボックスサプレッサー部位であるかどうかはこれらのデータでは立証できない。これを示すために、ＴＳＨＲのインシュリン応答エレメントの１又は２コピーを含むＳＶ４０に結合したプロモーター構築物とｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ−１又はｐＲｃＣＭＶ対照をコトランスフェクトした（図４０Ｄ）。いずれの場合もＹボックスタンパク質をコードするベクターのコトランスフェクションはｐＲｃＣＭＶのコトランスフェクションに比較してプロモーター活性を有意に抑制した（Ｐ＜０．０２）。ｐＲｃＣＭＶ−ＴＳＥＰ− １をＦＲＴＬ−５（図４０Ｂ）又はＦＲＴ（図４０Ｃ）細胞にコトランスフェクトすると、−１３１〜−１００ｂｐの下流Ｙボックスタンパク質結合部位しかもたないｐＴＲＣＡＴ５’−１４６及びｐＴＲＣＡＴ５’−１３１の活性は低下した（Ｐ＜０．０５）。他方、コトランスフェクションはＹボックスタンパク質結合部位をもたないｐＴＲＣＡＴ５’−９０又はｐ８ＣＡＴ対照の活性には効果がなかったＹボックスコトランスフェクションがｐＴＲＣＡＴ５’−１７７ｍｔ１＋２を抑制できず、ＴＲを欠失するｐＴＲＣＡＴ５’−１４６又はｐＴＲＣＡＴ５’− １３１を抑制できるという事実から明らかなように、Ｙボックスタンパク質が５ ’デカヌクレオチドと結合後まで下流Ｓボックス部位はＴＲの存在下で非機能的である。従って、Ｙボックスタンパク質と５’デカヌクレオチドの結合は主要な調節イベントであると思われ、Ｙボックスタンパク質ＮＳＥＰ−１はＧＣリッチなプロモーターをもつ遺伝子上のＣＴリッチなＳ１−ヌクレアーゼ感受性領域と結合後に１本鎖三重ＤＮＡ構造を促進すると示唆されているが、Ｓボックス及びインシュリン応答エレメントに関連する他のＹボックスタンパク質結合部位はこのような１本鎖三重ＤＮＡ構造で有効になると思われる（Ｋｏｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，（１９９２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０，１１１−１１６）。突然変異分析によると、各ＴＳＥＰ−１部位の保存ＣＣＴＣ配列はＴＳＥＰ− １結合及び機能に重要である。各遺伝子座におけるＹボックスタンパク質の結合部位をより十分に確定するために、ｓｓＳ（＋）又はｓｓＴＩＦ（−）オリゴヌクレオチドの種々の部分に突然変異を導入した。ｓｓＳ（＋）ｍｔ１オリゴヌクレオチドはｓｓＳ（＋）の５’側半分に突然変異を含み、ｓｓＳ（＋）ｍｔ２は３’側半分に突然変異を含む（図３２及び３４）。ｓｓＴＩＦ（−）ｍｔ１は野生型ｓｓＴＩＦ（−）の５’側３分の１に突然変異を含み、ｓｓＴＩＦ（−）ｍｔ２はｓｓＴＩＦ（−）の中央部分に突然変異を含む（図３２及び３４）。放射性標識後にプローブとして使用した処、各ｍｔ１オリゴヌクレオチドは組換えＹボックスタンパク質と複合体を形成し、その移動は放射性標識野生型プローブにより形成される複合体と同一であった。他方、ｓｓＳ（＋）及びｓｓＴＩＦ（−）の両者のｍｔ２突然変異をもつ放射性標識オリゴヌクレオチドは組換えＹボックスタンパク質とタンパク質−ＤＮＡ複合体を形成する能力を失った。非標識ｍｔ２突然変異オリゴヌクレオチドは、放射性標識野生型オリゴヌクレオチドと組換えＹボックスタンパク質の間の複合体形成を阻止する能力も失った（データは示さず）。突然変異によってＹボックスタンパク質と結合できなくなったｓｓＳ（＋）及びｓｓＴＩＦ（−）領域とｓｓＴＲ２（＋）配列を整列させると、全位置で保存ＣＣＴＣエレメントが認められる。各部位のＣＣＴＣ配列をＧＴＡＧに突然変異させると、組換えＹボックスタンパク質結合の顕著な低下がＥＭＳＡにより検出された。これらのデータが示すように、各Ｙボックスタンパク質結合部位即ちＴＳＨＲの５’デカヌクレオチド、インシュリン応答エレメント領域及びＳボックス領域内のＣＣＴＣモチーフはＹボックスタンパク質の１本鎖結合活性に必須である。ラットＴＳＨＲのＳボックスをこう呼ぶのは、マウスＡαクラスＩＩＭＨＣ遺伝子のＳボックスと１塩基しかミスマッチがなく、Ｘ及びＹボックスと共に構成的なクラスＩＩ遺伝子発現の抑制に重要であるからである。全てのクラスＩＩＳボックスの機能的に重要なコンセンサス配列はＣＣＴＣ／Ｔである。つまり、ＴＳＥＰ−１はラットＴＳＨＲプロモーターの１本鎖ＤＮＡ結合部位と相互作用することにより構成的ＴＳＨＲ遺伝子発現を抑制するＹボックスタンパク質であり、このような部位の１つがＴＲの５’デカヌクレオチドであり、ＴＳＨＲ最小プロモーターのＣＴリッチなＳ１ヌクレアーゼ感受性領域に存在する。別の部位はこの遺伝子の抑制に関与するＭＨＣクラスＩＩプロモーター内の部位に関連すると思われる。ＭＨＣクラスＩの発現は発生中に調節され、組織によって異なり（Ｔｉｎｇ，Ｊ．Ｐ−Ｙら（１９９３）ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５，８−１６）、発現レベルが異常に高いと自己免疫甲状腺疾患（ＡＴＤ）や糖尿病に結び付けられるので、発現の正確な調節は免疫応答の制御に不可欠である（Ｔｏｄｄ，Ｉ．ら，（１９８６）ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，４７５，２４１−２４９）。ＴＴＦ−１は甲状腺発生と甲状腺特異的機能に関連する遺伝子即ちＴＳＨレセプター（ＴＳＨＲ）及びチログロブリン（ＴＧ）の発現を調節するホメオドメインタンパク質である（Ｇｕａｚｚｉ，Ｓ．ら，（１９９０）ＥＭＢＯＪ．９，６３１−３６３９；Ｆｒａｎｃｉｓ−Ｌａｎｇ，Ｈ．ら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，５７６−５８８；Ｚａｎｎｉｎｉ，Ｍ．ら，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，４２３０−４２４１；Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら，（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９−２８２；Ｋｏｈｎ，Ｌ．Ｄ．ら，（１９９５）ＶｉｔａｍｉｎｓａｎｄＨｏｒｍｏｎｅｓ５０，２８７−３８４）。そのＲＮＡレベルは甲状腺細胞でＴＳＨによりダウンレギュレートされる（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８，１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら，（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，２６９ −２８２）。ＭＨＣクラスＩプロモーターの−１２７〜−８９ｂｐに位置し、− １０７〜−１００ｂｐの環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）に依存する機能と、ＴＳＨ又はメチマゾール（ＭＭＩ）により調節される活性（実施例９）をもつ下流３８ｂｐサイレンサーが同定された。ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用すると、このサイレンサーにより形成されるタンパク質／ＤＮＡ複合体はラット甲状腺に存在し、肝細胞には存在せず、その形成はＴＳＨＲ上のＴＴＦ−１結合部位及びＴＧプロモーターに似た非標識オリゴヌクレオチドにより阻害されるので、この複合体はＴＴＦ−１を含むことが判明した（図３０）。ＥＭＳＡ、組換えＴＴＦ−１、並びにクラスＩプロモーターの−１２７〜−１０４ｂｐ及び− １０５〜−８０ｂｐに似たオリゴヌクレオチドを使用し、本発明者らはＣＲＥの下流及び上流の２つのＴＴＦ−１結合部位（図４１Ａ）を同定し、一方はＴＴＦ−１特異的であり、他方はＰａｘ−８とも相互作用することができる。ＴＴＦ −１とＣＲＥ結合タンパク質ＣＲＥＢは夫々−１２０〜−８９ｂｐ及び−１１３〜−９５ｂｐの領域にフットプリントし、フットプリントのオーバーラップはＴＴＦ−１とＣＲＥＢの結合が相互に競合的であることを示す。ラット甲状腺細胞でＴＴＦ−１を過剰発現させると、ＴＴＦ−１部位とＣＲＥを含むクラスＩリポーター遺伝子キメラｐ（−２０９）ＣＡＴ又はｐ（−１２７）ＣＡＴ（図４１Ｃ）の活性が増加するが、これらの部位を含まないキメラｐ（ −６８）ＣＡＴや、非パリンドロームＣＲＥ突然変異をもつキメラｐ（−２０９ＮＰＣＲＥ）の活性は増加しない。他方、ＴＳＥＰ−１又はＹボックスｃＤＮＡを過剰発現させると、クラスＩプロモーター活性が低下する（図４１Ｃ）。ＴＳＨはクラスＩレベルを低下させるときにこれに相関してＴＴＦ−１とサイレンサーの複合体形成を低下させ、２個のＹボックスタンパク質（ＴＳＥＰ−１）サプレッサー部位との複合体形成を増加し、その一方は各ＴＴＦ−１エレメントの近傍に位置する（図４１Ａ）。ＭＭＩはＴＴＦ−１ｍＲＮＡレベルも低下させ（表ＶＩＩＩ）、ＭＭＩは更にインターフェロンがＴＳＥＰ−１ＲＮＡレベルを低下させる能力も逆行させる（表ＩＸ）。クラスＩプロモーター−リポーター遺伝子キメラをコトランスフェクトした場合に、ＴＳＥＰ−１はクラスＩ活性のサプレッサーである（図４１Ｃ）。ゲルシフトアッセイとＴＳＨＲ遺伝子からのオリゴヌクレオチド競合剤を使用し、本発明者らはＣＲＥを囲むクラスＩプロモーターのコーディング鎖上の２つのＴＳＥＰ−１部位を同定する。一方はＣＲＥの３’側で４８ｂｐサイレンサーの内側に位置し、他方は上流でインシュリン応答エレメントとＣＲＥの間に位置する。ＴＳＥＰ−１部位は各場合に甲状腺転写因子１（ＴＴＦ−１）エレメントに関連する。突然変異データは、夫々の部位とのＴＴＦ−１／ＴＳＥＰ−１結合が相互に排他的であることを示す。インターフェロン（ＩＦＮ）は甲状腺細胞におけるクラスＩ発現を増加し、ＭＭＩはこれを逆行させる（Ｍ．Ｓａｊｉら，（１９９２ｂ））。ＩＦＮはＴＳＥＰ−１ＲＮＡレベル（表ＩＸ）とクラスＩプロモーターのこの領域との複合体形成を低下させ（データは示さず）、ＭＭＩはこれを逆行させる（表ＩＸ）。つまり、ＴＳＥＰ −１はＭＨＣクラスＩ及びＴＳＨＲ遺伝子発現の負のレギュレーターである。表VIIIの注：ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞を８０％コンフルエントまで増殖後にＴＳＨを含まない培地に６日間維持した。実験の開始時に５ｍＭＭＭＩを含むか又は含まない新鮮な培地に細胞を暴露した。２４時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを分離し、記載通りにＴＴＦ−１のｃＤＮＡを使用してノーザン分析を実施した（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら，（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３６：２６９−２８２）。デンシトメトリーにより定量し、未処理細胞のＴＴＦ−１レベルを１００％とした。表IXの注：ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞を８０％コンフルエントまで増殖後にＴＳＨを含まない培地に６日間維持した。実験の開始時にインターフェロン及び／又は５ｍＭＭＭＩを含むか又は含まない新鮮な培地に細胞を暴露した。２４時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを分離し、クローン４０インサートを使用してノーザン分析を実施した（図３８）。表ＶＩＩＩと同様に分析を行った（Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．ら，（１９９４）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：１０４９−１０６９；Ｏｈｍｏｒｉ，Ｍ．ら，（１９９５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３６：２６９−２８２）。デンシトメトリーにより定量し、未処理細胞のＴＥＳＰ−１レベルを１００％とした。要約すると、ＴＴＦ−１は下流３８ｂｐサイレンサーに及ぼすその作用により、甲状腺細胞におけるＭＨＣクラスＩ遺伝子発現の正のレギュレーターである。ＴＳＨ及びＭＭＩはＴＴＦ−１ＲＮＡ及びタンパク質レベルを低下させてＴＴＦ−１の正の調節を低下させることにより、クラスＩ発現を低下させる。従って、ＴＴＦ−１及びクラスＩ発現は通常はＴＳＨとＭＭＩにより同時調節される。ＴＴＦ−１とこのサイレンサーの相互作用は通常はＴＳＥＰ−１と相関される。ＴＳＥＰ−１は通常はＭＨＣクラスＩを抑制し、抑制はインターフェロンにより解除される。ＴＳＥＰ−１結合、活性及び抑制はＭＭＩにより正常に戻すことができる。即ち、下流サイレンサーは通常はＴＳＥＰ−１／ＴＴＦ−１により調節されるが、自己免疫甲状腺疾患では異常調節の対象となる組織特異的制御領域であり、ＭＭＩの作用部位である。以上、平明な理解を目的として本発明を図面と実施例により説明したが、請求の範囲内で多少の変更や変形を実施してもよいことは言うまでもない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｑ 1/26 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＧ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シンガー，ディナー・エスアメリカ合衆国メリーランド州20815，チェビー・チェイス，ラッフィン・ロード 6404 (72)発明者サジ，モトヤスアメリカ合衆国メリーランド州20852，ロックヴィル，ロックヴィル・パイク 10228，アパートメント 401 (72)発明者ジュリアーニ，セシディオアメリカ合衆国メリーランド州20817，ベセスダ，グリーン・ツリー・ロード 5618 (72)発明者ション，ミンホーアメリカ合衆国メリーランド州20852，ロックヴィル，コングレッショナル・レーン 204，ティー−２ (72)発明者スズキ，コーイチアメリカ合衆国メリーランド州20852，ロックヴィル，ストーンウッド・レーン 11708 (72)発明者オオモリ，マサユキアメリカ合衆国メリーランド州20852，ロックヴィル，カリフォルニア・サークル 6020，ナンバー 309

Claims

【特許請求の範囲】１．ＭＨＣクラスＩ調節核酸配列またはその機能的均等物に対する哺乳動物細胞タンパク質抽出物の結合の変化を測定することによる、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制する医薬の能力を評価する方法であって：（ａ）哺乳動物細胞を上記医薬で処理し；（ｂ）工程（ａ）の上記細胞からタンパク質抽出物を入手し、上記抽出物をＭＨＣクラスＩ調節核酸配列と混合して上記タンパク質と上記配列との間に少なくとも１つの複合体を形成させ；そして（ｃ）上記複合体を検出する工程を含み、ここで上記複合体の形成の変化が自己免疫疾患または移植拒絶の治療における上記薬剤の効力を示している上記の方法。２．自己免疫疾患が非甲状腺自己免疫疾患である、請求の範囲第１項記載の方法。３．複合体を形成するタンパク質が、ＮＦ−κＢおよびそのサブユニット、ｃ −ｆｏｓファミリー構成要素または関連タンパク質、Ｓｏｘ−４タンパク質、Ｙ −ボックスタンパク質、Ｐａｘ８タンパク質、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢＰ）、および環状ＡＭＰ調節結合タンパク質（ＣＲＥＢ）またはｃ−ｊｕｎファミリー構成要素、またはそれらの機能的均等物から成る群から選択される少なくとも１種のタンパク質を含む、請求の範囲第１項記載の方法。４．調節核酸配列が、エンハンサー配列、サイレンサー配列またはそれらの機能的均等物から成る群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。５．調節核酸配列が、ＰＤ１調節ドメインの約−１２７〜約−９０塩基対、約 −１２７〜約−８０塩基対、約−７２４から約−６９７塩基対またはそれらの機能的均等物から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。６．調節核酸配列が、１４０（配列番号１の塩基３２１から４５５）、１１４（配列番号１の塩基２２１から３２０）、１５１（配列番号１の塩基５４から２２０）、２３８（配列番号１の塩基４５６から６９２）と命名されるＰＤ１プロモーターフラグメントまたはそれらの機能的均等物から成る群から選択される、請求の範囲第５項記載の方法。７．核酸配列が二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求の範囲第１項記載の方法。８．調節核酸配列が、Ｓ１（配列番号３）、Ｓ２（配列番号４）、Ｓ３（配列番号１０）、Ｓ５（配列番号５）、Ｓ６（配列番号６）、Ｓ７（配列番号７）、Ｓ８（配列番号８）と命名されるオリゴヌクレオチドおよびそれらの機能的均等物から成る群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。９．オリゴヌクレオチドＫを工程（ｂ）に添加する工程をさらに含む、請求の範囲第１項記載の方法。１０．ＭＨＣクラスＩ調節核酸配列に機能的に結合したリポーター遺伝子の活性の減少を測定することによる、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を抑制する医薬の能力を評価する方法であって：（ａ）上記ＭＨＣクラスＩ調節配列に機能的に結合した上記リポーター遺伝子を哺乳動物細胞の集団に導入し；（ｂ）上記細胞を上記抑制医薬で処理し；そして（ｃ）上記ＭＨＣクラスＩ調節配列に結合した上記リポーター遺伝子の活性を測定することを含み；それによって活性の減少が、ＭＨＣクラスＩ分子を抑制する上記医薬の能力を示している上記の方法。１１．調節核酸配列がエンハンサーまたはサイレンサー配列である、請求の範囲第１０項記載の方法。１２．調節核酸配列がＰＤ１遺伝子の上流または下流のサイレンサー、またはＰＤ１遺伝子の上流または下流のエンハンサー、またはそれらの機能的均等物である、請求の範囲第１０項記載の方法。１３．リポーター遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子またはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはそれらの機能的均等物である、請求の範囲第１０項記載の方法。１４．試料中のＭＨＣクラスＩの発現を調節することができる遺伝子のメッセンジャーＲＮＡを検出することによる、候補医薬の治療効力を評価する方法であって：（ｉ）細胞を上記候補医薬で処理し；（ii）ＭＨＣクラスＩの発現を調節することができるタンパク質をコードする核酸配列の全部または一部を上記試料と、上記核酸配列と上記処理された細胞からのメッセンジャーＲＮＡとの間で複合体を形成させる条件下で接触させ、（iii）上記複合体を検出し；そして（iv）上記メッセンジャーＲＮＡのレベルを決定する工程を含み；それによって上記ｍＲＮＡの変化が、自己免疫疾患または移植拒絶を治療するための上記医薬の治療効力を示している上記の方法。１５．レベルの変化がｍＲＮＡのレベルの減少または増加である、請求の範囲第１４項記載の方法。１６．上記ｍＲＮＡが、Ｓｏｘ−４タンパク質、ＴＴＦ−１タンパク質、ＳＳＢＰタンパク質、Ｙ−ボックスタンパク質またはそれらの機能的均等物をコードしている請求の範囲第１４項記載の方法。１７．ＭＨＣクラスＩの発現を調節することができるタンパク質を検出することによる、自己免疫疾患または移植拒絶を治療するための候補医薬の治療効果を評価するための方法であって：（ｉ）上記細胞を候補医薬で処理し；（ii）特異的に反応して複合体を形成する試薬をＭＨＣクラスＩの発現を調節することができる上記の処理された細胞からのタンパク質と接触させ；そして（iii）上記処理された細胞からのタンパク質と上記試薬との複合体の形成を検出する工程を含み；それによってＭＨＣクラスＩの発現のレベルの変化が、自己免疫疾患または移植拒絶を治療する上での上記医薬の治療評価を示している、上記の方法。１８．ＭＨＣクラスＩ分子を抑制する候補医薬の能力を評価することによる、自己免疫疾患または移植拒絶を治療するための候補医薬の治療効力を評価するための方法であって：（ａ）細胞を上記候補医薬で処理し；そして（ｂ）ＭＨＣクラスＩ発現を調節することができる上記処理された細胞からのタンパク質の酸化／還元状態を評価することを含み、上記タンパク質の酸化／還元状態の変化が、自己免疫疾患または移植拒絶を治療する際の上記医薬の治療評価を示している、上記の方法。１９．ＭＨＣクラスＩ発現を調節することができる上記タンパク質が、ＴＴＦ −１、Ｓｏｘ−４、Ｙ−ボックス、ＳＳＢＰ、ＮＦ−κＢ、ｅ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、またはそれらの機能的均等物である、請求の範囲第１８項記載の方法。２０．ＭＨＣクラスＩ分子を抑制する候補医薬の効力を評価することによる、自己免疫疾患または移植拒絶を治療するための候補医薬の治療効果を評価するための方法であって：（ａ）細胞を上記候補医薬で処理し；そして（ｂ）ＭＨＣクラスＩを調節することができるタンパク質の酸化／還元の原因となる酵素の活性を評価することを含み；ここで上記酵素の活性の変化が、自己免疫疾患または移植拒絶を治療する際の上記医薬の治療効力を示している、上記方法。２１．上記酵素がチオレドキシン、スーパーオキシドジスミューターゼまたはそれらの機能的均等物である、請求の範囲第２６項記載の方法。２２．図２０に示されるＳｏｘ−４核酸配列を含む、単離された核酸。２３．図３８に示されるＹ−ボックスタンパク質核酸配列を含む、単離された核酸配列。２４．請求の範囲第２２項の核酸配列によってコードされる組み換えタンパク質。２５．請求の範囲第２３項の核酸配列によってコードされる組み換えタンパク質。２６．図２０または図３８に示されるアミノ酸配列を含む、単離かつ精製されたタンパク質。２７．請求の範囲第２２項または第２３項の核酸配列の全部または一部を含む組み換え発現ベクター。２８．組み換え発現ベクターによってコードされるタンパク質を発現させるような方法で、請求の範囲第２６項記載の組み換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトした宿主生物体。２９．請求の範囲第２４項または第２５項記載のタンパク質またはそれらの一部分と反応性である抗体。３０．哺乳動物における移植拒絶を予防または治療するための方法であって、（ａ）ドナーからドナー細胞または組織を単離し；（ｂ）上記細胞または組織を遺伝学的に修飾して、ＭＨＣクラスＩを抑制できる核酸配列を発現させ；（ｃ）工程（ｂ）からの上記細胞または組織をレシピエントに移植することを含む方法。３１．上記核酸配列が、Ｙ−ボックスタンパク質またはＳｏｘ−４タンパク質またはそれらの機能的均等物をコードする、請求の範囲第３０項記載の方法。