JPH11511004A - Human leukocyte 12-lipoxygenase and its role in the pathogenesis of disease states - Google Patents

Human leukocyte 12-lipoxygenase and its role in the pathogenesis of disease states

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JPH11511004A
JPH11511004A JP8533570A JP53357096A JPH11511004A JP H11511004 A JPH11511004 A JP H11511004A JP 8533570 A JP8533570 A JP 8533570A JP 53357096 A JP53357096 A JP 53357096A JP H11511004 A JPH11511004 A JP H11511004A
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lipoxygenase
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patient
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ナドラー，ジェリー・エル
ナタラジャン，ラマ
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City of Hope
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Abstract

(57)【要約】 アテローム性動脈硬化症、乳癌、自己免疫性疾患および炎症性疾患、糖尿病性血管疾患および腎臓疾患並びにインスリン抵抗を含めたいくつかの主要な疾患状態または過程の病因論におけるヒト白血球型の１２−ＬＯ酵素の存在およびその役割に関する事実を記載する。ヒト白血球１２−ＬＯの発現または酵素活性化の遮断を含めた介在は、これら疾患状態を予防するまたは回復させる新規治療を提供する。   (57) [Summary] Human leukocyte-type 12-LO in the etiology of several major disease states or processes, including atherosclerosis, breast cancer, autoimmune and inflammatory diseases, diabetic vascular disease and kidney disease and insulin resistance Facts regarding the presence of the enzyme and its role are described. Mediation, including blocking human leukocyte 12-LO expression or enzyme activation, provides a novel treatment to prevent or ameliorate these disease states.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト白血球１２−リポキシゲナーゼおよび疾病状態の病因でのその役割 関連出願 本願は、米国特許出願番号０７／９３６，６６０（１９９２年８月２８に提出 ）の一部継続出願である、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０００８９（１９９４年１月４日 に提出）の一部継続出願である、米国特許出願番号０８／４３４，６８１（１９ ９５年５月５日に提出）の一部継続出願である。 政府権利供述 本発明は、国立健康研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）裁定の許可番号ＤＫ３９７２１ ＲＯ１の政府援助で 行われた。政府は、本発明について一定の権利を持つ。 技術分野 本発明は、ヒト白血球型の１２−ＬＯおよびそのいくつかの主要な疾病状態の 病因への役割に関係する。 略語 ＡＡ ＝ アラキドン酸 （Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ） ＡII ＝ アンギオテンシンII （Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ II） ＥＧＦ ＝ 表皮増殖因子 （Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｃｏｒ） ＦＮ ＝ フィブロネクチン （Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ） ＧＡＰＤＨ ＝ グリセルアルデヒド−３−リン酸デセドロゲナーゼ （Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３− ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ） ＧＦ ＝ 増殖因子 （Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ） ＨＡＥＣ ＝ ヒト大動脈内皮細胞 （Ｈｕｍａｎ Ａｏｒｔｉｃ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ） ＨＥＴＥ ＝ ヒドロキシエイコサテトラエン酸 （Ｈｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ） １２ＨＥＴＥ ＝ １２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸 （１２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｉｃｏｓａ− ｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ） ＨＧ ＝ 高グルコース （Ｈｉｇｈ Ｇｌｕｃｏｓｅ） ｈｌ １２−ＬＯ ＝ ヒト白血球１２−リポキシゲナーゼ （Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ １２−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ） ｈｌ １５−ＬＯ ＝ ヒト白血球１５−リポキシゲナーゼ （Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ １５−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ） ＨＯＤＥ ＝ ヒドロキシオクタデカジエン酸 （Ｈｙｄｒｏｘｙｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ） １２−ＨＰＥＴＥ ＝ １２−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸 （１２−ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｅｉｃｏｓａ− ｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ Ａｃｉｄ） ＨＳＭＣ ＝ ヒト大動脈平滑筋細胞 （Ｈｕｍａｎ Ａｏｒｔｉｃ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ） ＨＰＬＣ ＝ 高圧液体クロマトグラフィー （Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ） ＩＬ−１ ＝ インターロイキン−１ （Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１） ＬＤＬ ＝ 低密度リポタンパク質 （Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ） ＬＯ ＝ リポキシゲナーゼ （Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ） １２−ＬＯ ＝ １２−リポキシゲナーゼ （１２−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ） １５−ＬＯ ＝ １５−リポキシゲナーゼ （１５−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ） ＭＡＰＫ ＝ 分裂促進因子活性化キナーゼ （Ｍｉｔｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ） ｍｍＬＤＬ ＝ 最小限度修飾した低密度リポタンパク質 （Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ） ＭＯ ＝ 単球 （Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ） ＮＩＤＤＭ ＝ インスリン非依存性糖尿病 （Ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ） ＮＧ ＝ 正常グルコース （Ｎｏｒｍａｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ） ＰＤＧＦ ＝ 血小板由来増殖因子 （Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ） ＰＫＣ ＝ プロテインキナーゼＣ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ） ｐｌ １２−ＬＯ ＝ ヒト血小板１２−リポキシゲナーゼ （Ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ １２−Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ） ＰＶＳＭＣ ＝ ブタ血管平滑筋細胞 （Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ） ＲＴ−ＰＣＲ ＝ 逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応 （Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ） ＳＭＣ ＝ 平滑筋細胞 （Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ） ＴＧＦＢ ＝ トランスフォーミング増殖因子ベータ （Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ） ＴＮＦ ＝ 腫瘍壊死因子１ （Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ １） ＶＳＭＣ ＝ 血管平滑筋細胞 （Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ｃｅｌｌｓ） 発明の背景 ３種類の哺乳動物のリポキシゲナーゼは、アラキドン酸（４）に酸素添加する 炭素の位置（１、２または３）によって、名付けられる。ある種のＬＯ酵素は、 ＬＤＬからそのアテローム形への酸化を誘導すること（５、６）、および平滑筋 細胞の増殖または移動を増加させること（１、７−９）によって、アテローム性 動脈硬化の病因となりこれを促進する、という証拠が増加してきている。さらに 、証拠から、１２−ＬＯタンパク質は、アンギオテンシンII（ＡII）誘導性の血 管 および副腎の活動を仲介する役割を演ずる（１０−１２）ことが、示唆される。 最近の研究では、少なくとも２つの型の１２−ＬＯ：即ち、ヒト赤白血病細胞か らクローン化されたｐｌ １２−ＬＯ（２、１３）、ならびに；ブタ単核細胞、 脳下垂体（１４）およびウシ気管細胞（１５）より分離されクローン化されたブ タ白血球１２−ＬＯ：が存在することが、示されている。 出願者は、ヒト副腎球状層細胞内に白血球型の１２−ＬＯが存在することを示 した（３）。ヒト１５−ＬＯは、ヒトおよびウサギの網状赤血球から精製した（ １６、１７）。ヒト血小板４２ーＬＯとブタ白血球型の１２−ＬＯは、６５％の アミノ酸相同性を共有する（１３）。しかしながら、ブタ白血球型の１２−ＬＯ は、ヒト１５−ＬＯとの相同性も高い（８６％）（１４）。最近、１５−ＬＯは 、ヒトのアテローム性動脈硬化症病変のマクロファージ内で発現しているが、刺 激されていない単球内では発現していないことが示された（１８）。 発明の概要 本願は、ヒト白血球型の１２−ＬＯ酵素（ｈｌ １２−ＬＯ）の存在、ならび に、アテローム性動脈硬化症、乳癌、自己免疫病および炎症性疾病、糖尿病性血 管疾病および糖尿病性腎臓病およびインスリン耐性を含む、いくつかの主要な病 状の病因または進行へのその役割についての証拠を、記載している。このユニー クな酵素は、いくつかの外観上異なる症状を結びつけることのできるいくつかの 特徴を持つ。 １． ｈｌ１２−ＬＯは、脂肪酸としてアラキドン酸およびリノール酸を基質 に用いて、これらの疾病に共通に関係する重要なシグナル形質導入経路を活性化 することのできるヒドロペルオキシドおよびその他の脂質メディエイタを生成す ることができる。これらのメディエイタには、（ａ）プロテインキナーゼＣおよ び分裂促進因子活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ）の特定の異性体のようなキナーゼ、 （ｂ）炎症性疾病および自己免疫病、アテローム性動脈硬化、癌の増殖および転 移への関わりが明らかなＮＦｋＢおよびオンコジーンのような転写因子、が含ま れる。 ２． ｈｌ １２−ＬＯ酵素が活性化されると、それ自身が脂質およびタンパ ク 質の酸化修飾を促進することの出来るフリーラジカルプロセスの伝播を導くこと のできるスーパーオキシドアニオンを生成することができる。これらのプロセス には、炎症状態、腫瘍性状態、およびアテローム発生状態の病因が含まれる。 ３． ｈｌ １２−ＬＯ酵素は、戦略的に位置している。ヒト単球、大動脈血 管平滑筋および内皮細胞、心筋細胞、骨格筋、腎臓および乳癌細胞、およびラン ゲルハンス島のベータ細胞内に、白血球型１２−ＬＯの存在を示す証拠が存在す る。この酵素の活性のあるこれらの部位は、病的状態に導く組織に特異的な役割 を果たす。例えば、ランゲルハンス島ベータ細胞では、炎症性サイトカイン（例 えば、ＩＬ−１）によって１２−ＬＯ活住が活性化されると、膵臓のベータ細胞 またはインスリン生成細胞が選択的に機能障害を受け破壊されることを、説明す ることが出来た。さらになお、ベータ細胞内グルコースによって１２−ＬＯ経路 が活性化されるまたはその発現が増加すると、成人糖尿病の典型である型（イン スリン非依存性糖尿病）でのインスリンの分泌機能障害を受けることを、説明す ることが出来た。 ４． １２−ＬＯの発現および活性を増加させる要因は、炎症性、アテローム 性動脈硬化、腎臓および腫瘍性疾病と結びつく。 １２−ＬＯの活注および発現の増加を実証する因子としては、（ａ）自己免疫 病（糖尿病Ｉ型）アテローム性動脈硬化および腫瘍の成長に関連するインターロ イキン−１β（ＩＬ−１）のような炎症性サイトカイン、（ｂ）血管および腎臓 病の加速にかかわる血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）のような成長因子ならびに アンギオテンシンII（ＡII）、および（ｃ）微小血管（目、腎臓および神経）お よび微小血管（心臓発作、発作および末梢血管病）のＩ型II型両型の糖尿病合併 症と結びつく高血糖症、が含まれる。 ５． 出願者らは、試験した組織のすべてにおいて、糖尿病における後天的な インスリン耐性の原因となるグルコースが、１２−ＬＯの活性および発現を増加 させることを発見した。それ故、１２−ＬＯの活性化は、グルコース誘導の酸化 ストレスと終末器の機能不全または損傷の発生との間の一般的なつながりを提供 することができた。 本発明に従って、ｈｌ １２−ＬＯの発現または酵素の活性化の封鎖は、これ らの疾病状態を予防するための新規の治療を提供する。 正常なＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内での１２−ＬＯの同定 出願者らは、刺激されていないヒト大動脈平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）、内皮細胞 （ＨＡＥＣ）および単球（ＭＯ）内に存在するＬＯの詳細な型を、ここで評価し た。さらになお、ＡIIは、ヒト副腎細胞内の１２−ＬＯの発現を増加させること が出来るので、出願者らは、また、ＨＳＭＣ内での１２−ＬＯの制御にかかわる ＡIIの効果についても評価した。最終的に、出願者らは、アテローム性動脈硬化 病変の免疫組織化学的分析によって、白血球型の１２−ＬＯの存在が証明される かいなかについて決定した。ヒト副腎球状層で見いだされたのと同様の１２−Ｌ Ｏが正常なＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内で発現していることが、結果から示 された。さらに、この１２−ＬＯは、ＨＳＭＣ内ではＡIIによって顕著に亢進調 節され、ヒトアテローム性動脈硬化病変の内にも存在している。 図１から７までの簡単な説明 図１Ａおよび１Ｂは、ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内の白血球１２−ＬＯ ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析について説明している。図１Ａは、白血球に特異的な １２−ＬＯプライマーで４０サイクル増幅させたＲＮＡサンプルを示している。 膜は、ブタの白血球１２−ＬＯオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさ せた。第１列は、マーカーであり、第２、５、８列は、鋳型を加えず行ったネガ ティブコントロールであり、第３列は、ＨＡＥＣからの全ＲＮＡをブタの白血球 １２−ＬＯプライマーを加えて増幅したものであり、第４列は、ＧＡＰＤＨプラ イマーを加えて行ったものである。第６列は、ブタの白血球１２−ＬＯプライマ ーを加えて行ったＨＳＭＣからの全ＲＮＡを示し、第７列は、ＧＡＰＤＨプライ マーを加えて行ったものである。第９列は、ＭＯからの全ＲＮＡをブタの白血球 １２−ＬＯプライマーを加えて増幅したものを示す。第１０列は、ＧＡＰＤＨプ ライマーを加えて行ったものであり、第１１列は、ブタの白血球１２−ＬＯ ｃ ＤＮＡを用いたポジティブコントロールである。 図１Ｂは、ヒト特異的１５−ＬＯプライマーを加えて４０サイクル増幅させた 同じＲＮＡサンプルについて示している。膜は、ヒト１５−ＬＯオリゴヌクレオ チドとハイブリダイズさせた。１５−ＬＯ ｃＤＮＡの増幅（ポジティブコント ロール）から、３３３塩基対の生成物のみが示されている。 図２は、正常なＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内の白血球１２−ＬＯタンパク 質（７２ｋＤ）の発現を説明している。ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯからの細 胞質画分を、標準のブタ１２−ＬＯタンパク質と一緒に、電気泳動し、さらにウ エスタンイムノブロッティングを行った。 図３Ａは、ＨＳＭＣよる１２−ＨＥＴＥの遊離に関するＡIIの影響について説 明している。ＨＳＭＣは、コンフルエントになるまで増殖させた。血清は除去し 、細胞は０．４％の子牛血清（ＦＢＳ）および０．２％のＢＳＡを含む培地１９ ９で、１８時間インキュベートした。その後、細胞をＤＭＥ培養液で洗浄し、０ ．２％ＢＳＡを含むＤＭＥ培養液中で２０分間インキュベートした。１０-9およ び１０-8ｍｏｌ／Ｌの濃度で、ＡIIを、５分および１０分間、細胞に加えた。培 養液を、ＨＥＴＥアッセイのために集めた。* ｐ＜０．０５対コントロール（ｎ＝４） 図３Ｂは、ＨＳＭＣ内の細胞関連１２−ＨＥＴＥレベルへのＡIIの影響につい て説明している。上澄み液を収集した後、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、さら に、細胞関連ＨＥＴＥのアッセイを行うため、スクレーピング（ｓｃｒａｐｉｎ ｇ）によって収集した。* ｐ＜０．０２対コントロール（ｎ＝４） 図４Ａおよび４Ｂは、ＨＳＭＣ内のＡIIによる白血球１２−ＬＯタンパク質の 発現の制御について説明している。図４Ａは、ＡIIによる制御を示すイムノブロ ットである。図４Ｂは、図４Ａでのイムノブロットの濃度計分析の棒グラフ表示 である。細胞は、２０％ＦＢＳを含む培地１９９内で増殖させ、０．４％ＦＢＳ および０．２％ＢＳＡを含む培地１９９内に置くことによって、２４時間、血清 を枯渇させた。濃度２ｘ１０-7ｍｏｌ／ｌのＡIIで、２４から４８時間細胞を処 理した。細胞は、ＰＢＳで洗浄し、スクレーピングによって収集した。細胞ペレ ットを溶解し、細胞質画分を電気泳動した。 図５Ａおよび５Ｂは、ＨＳＭＣ内でのＡIIによる白血球１２−ＬＯの制御につ いて、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、説明している。図５Ａは、１２−ＬＯオリゴヌク レオチドプローブとハイブリダイズしたブロットのオートラジオグラムである。 図５Ｂは、エチジウムブロミドで染色したアガロースゲルである。全ＲＮＡは、 ＡII（２ｘ１０-7ｍｏｌ／ｌ）を含む低血清状態で、示した異なる時間の間、イ ンキュベートした培養ＨＳＭＣから抽出した。ＲＮＡサンプルは、白血球１２− ＬＯプライマーまたはＧＡＰＤＨプライマーで４０サイクル増幅させた。 図６Ａおよび６Ｂは、広範囲のアテローム性動脈硬化の患者の膝下切断標本か ら得られた動脈の組織学的切片の顕微鏡写真を示す。アビジン−ビオチン複合体 免疫組織化学技術を用いて、精製した特異的ウサギ抗血清を用いて１２−ＬＯを 検出した。強く染色された内皮細胞（矢じり印）、厚くなった内皮内に存在する 細胞（小さい矢印）、およびより少ない程度の平滑筋細胞（大きい矢印）を、図 ６Ａに示した。免疫前のウサギ血清を、ネガティブコントロールとして、同濃度 で用いた（図６Ｂ）（ｘ２００拡大）。 図７Ａおよび７Ｂは、１２−リポキシゲナーゼに対する抗体を用いたヒト冠状 動脈病変の免疫染色を示している。１２−ＬＯ抗体（図７Ａ）または免疫前抗血 清（図７Ｂ）のいずれかと反応させた、進行したアテローム性動脈硬化プラーク （コア領域のコレステロール結晶に注意の事）を持つヒトの左冠状動脈の横断切 片を示す。最も暗く染まった免疫反応性は、血管周囲細胞と関連する血管外膜に 見られる。中間平滑筋細胞もまた、免疫反応性を持つ。より明るい免疫反応性は 、プラーク領域および非プラーク領域の内膜細胞に見られる。 実験方法 リポキシゲナーゼ（ＬＯ）の経路は、加速されたアテローム性動脈硬化の誘導 にかかわっている。副腎球状層ランゲルハンス島内に発現した１２−ＬＯの正確 な型は、出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０００８９に記載されている。この出願では、 詳細な型が同様のｈｌ １２−ＬＯが、刺激されていないヒト大動脈平滑筋細胞 （ＨＳＭＣ）、内皮細胞（ＨＡＥＣ）および単球（ＭＯ）に存在することを、立 証している。この研究では、特異的な逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ− ＰＣＲ）法を用いて、正常なＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内に発現したＬＯ ｍＲＮＡの型を分析した。白血球型の１２−ＬＯに特異的なプライマーおよびプ ローブを用いると、３つの細胞の型のすべてにおいて、３３３塩基対のバンドが 認められ、これらの細胞型の内には白血球型の１２−ＬＯ型の白血球が発現して いることが示唆された。白血球型の１２−ＬＯに対するポリクローナルペプチド 抗体を用いて、培養したＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯについてウエスタンイム ノブロッティング分析を行うと、白血球型の１２−ＬＯの分子量と同一の特異的 な７２ｋＤのバンドが示された。アンギオテンシンII（ＡII）を正常なＨＳＭＣ に加えると、１２−ＬＯの活性および発現が増加した。アテローム性動脈硬化病 変の免疫組織化学分析もまた、白血球型の１２−ＬＯの存在を示した。これらの 結果から、白血球型の１２−ＬＯ ＲＮＡが、ＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内 に発現していることが示される。また、ＡIIは、ＨＳＭＣ内での１２−ＬＯの活 性および発現を亢進調節し、ヒト血管疾病でのこの１２−ＬＯ経路の役割を支持 する。 １． 細胞および培養 ＨＡＥＣおよびＨＳＭＣは、ＵＣＬＡ心臓移植プログラムにおける心臓ドナー から得られた大動脈標本から分離した。５−９継代のＨＡＥＣおよび３−７継代 のＨＳＭＣを用いた。ＨＡＥＣは、ＥＣ増殖補助剤（ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｌ ｅｍｅｎｔ）（２０ｍｇ／ｍｌ）およびヘパリン（９０μｇ／ｍｌ）を補充した ２０％ＦＢＳを含む培地１９９内で増殖させた。ＨＡＥＣは、それらの典型的な 丸石の形態、ファクターVIII−関連抗原の存在、および過塩素酸１，１’−ジオ クタデシル−１−３，３，３’，３’−テトラメチルインド−カルボシアニン（ Ｄｉｌ−アセチル−ＬＤＬ）で標識したアセチル化ＬＤＬの取り込みによって、 同定された（１９）。ＨＳＭＣは、２０％ＦＢＳを含む培地１９９内で増殖させ 、そして形態学的に免疫組織化学的に、同定した（免疫組織化学的には、ＨＨＦ ３５を用いてその後蛍光標識した二次抗体によって可視化するか、またはビオチ ン−ストレプトアビジン複合体イムノペルオキシダーゼシステムを用い可視化し た）（２０）。単球は、レカルデ（Ｒｅｃａｌｄｅ）の修飾法によって健康なド ナーの大プールから得た（２１）。 ＨＳＭＣおよびＨＡＥＣの単層培養細胞を、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、そ の後、以下に記載の方法に従ってＲＮＡ抽出またはウエスタン分析を行うために 処理した。ヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）アッセイを行うために 、実験のおおよそ２４時間前、培養液を０．４％ＦＢＳおよび０．２％ＢＳＡを 含む培地１９９で置換した。 ２． ｃＤＮＡ ヒト網状赤血球１５−ＬＯのｃＤＮＡを含む組換えＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラ スミドは、Ｅ．Ｓｉｇａｌ博士（Ｓｙｎｔｅｘ Ｃｏ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）の御好意で御提供頂いた。ブタ白血球１２−ＬＯのｃＤＮＡを含むｐＵＣ １９プラスミドは、前述の方法に従って得られた（１４）。ヒト血小板１２−Ｌ ＯのｃＤＮＡを含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドは、Ｂｅｎｇｔ Ｓａｍｕ ｅｌｓｏｎ教授（Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏ ｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）の御好意によりご提供頂いた（２）。 ３． ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ β2−マクログロブリンオリゴヌクレオチドは、Ｐｅｒｒｉｎ Ｗｈｉｔｅ博 士（Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）からの親切な贈り物である。ヒトのグリセルアルデ ヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）オリゴヌクレオチドを 含むその他のオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社 製（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＤＮＡ合成装置で合成し、さらにポリアク リルアミドゲル電気泳動によって精製した。オリゴヌクレオチドの配列を、表１ に列挙した通りであり、これらは既知遺伝子配列（２、１４、２２、２３）を基 に設計し、ブタ１２−ＬＯと１５−ＬＯとの配列の間で最も多くの相違を示す領 域（１３）から選択した。 ４． ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて逆転写したＲＮＡの増幅 培養したＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよび新鮮なＭＯからの全ＲＮＡは、ＲＮＡｚｏ ｌ（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．，Ｔｅｘａｓ）を用いてグアニジウムチオシアネート− フェノール−クロロホルムで抽出した。いくつかのＲＮＡサンプルは、ＲＮアー ゼを含まないＤＮアーゼによって処理された。全ＲＮＡの３μｍｇを、ＰＣＲバ ッファー（１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍｍｏｌ／ ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ2、および０．００１％ゼラチン） 、それぞれ２００μｍｏｌ／ｌの４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェート 、それぞれ２５ｐｍｏｌの５’−および３’−プライマー、２Ｕのアビジン骨髄 芽球ウイルス逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ． ，Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬ）および２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒ ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）と、最終容量が５０ μｌになるように、混合した。いくつかの反応では、β2ミクログロブリンまた はＧＡＰＤＨの５’−および３’−プライマー、それぞれ５ｐｍｏｌを、内部標 準として加えた。ＲＴ反応を続けるために、サンプルを３７°Ｃのサーマルサイ クラー内に８分間置いた。その後のＰＣＲに用いられた条件は、９４°Ｃに１分 間の変性段階、５０°Ｃに２分間のアニーリング、そして７２°Ｃで２分間の伸 長を、２４−４０サイクル行った。ＲＮＡ鋳型を加えないブランク反応は、ＲＴ そしてＰＣＲ段階を通して行われた。ヒトの１５−ＬＯ ｃＤＮＡ、ブタ白血球 の１２−ＬＯ ｃＤＮＡ、およびヒト血小板の１２−ＬＯ ｃＤＮＡの増幅は、 それぞれ２００μｍｏｌ／ｌの４つのデオキシヌクレオチドトリスホスフェート 、２５ｐｍｏｌの５’−および３’−プライマー、および２．５ＵのＴａｑポリ メラーゼを含む５０μｌ容量中に２−５ｎｇのｃＤＮＡプラスミドを混合するこ とによって行われた。ＰＣＲの条件は、前述の条件と同じにした。 ５． ゲル分析およびブロットハイブリダイゼーション ＰＣＲ生成物から２０μｌを分取し、Ｔｒｉｓ酢酸ＥＤＴＡバッファー内、１ ．８％アガロースゲルで電気泳動にかけられた。エチジウムブロミドで染色して 写真撮影した後、ゲルは、キャピラリーブロッティングによって、Ｚｅｔａ−プ ロ ーブ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）上に移した。プローブとし て用いたオリゴヌクレオチドは、［γ32Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチド キナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ） を用いて５’−末端を標識し、さらに６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣには０．１５ｍｏ ｌ／ｌのＮａＣｌ、０．０１５ｍｏｌ／ｌのクエン酸ナトリウムを含む）、０． ５％の脱脂粉乳および７％のＳＤＳ中、４２°Ｃで一晩、膜とハイブリダイズさ せた。膜は、室温で１５分間、６ｘＳＳＣ中で１回、さらに６０°Ｃ、１５分間 で一回、洗浄した。洗浄条件は、ブタ白血球の１２−ＬＯからのＰＣＲ生成物か らヒトの１５−ＬＯのＰＣＲ生成物を識別するように考え出された。（３）膜は 、−７０°Ｃで、増感板と一緒にしてＫｏｄａｋのＸ線フィルム（Ｅａｓｔｍａ ｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に晒した。ブロットは、 コンピューター化されたビデオデンシトメーターを用いて定量した。 ６． ウエスタンイムノブロッティング 細胞ペレットは、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、 １ｍｍｏｌ／ｌのフッ化フェニルメチルスルホニル、５０μｍｏｌ／ｌのロイペ プチン、および０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶解バッフ ァー中で、溶解させた。溶解物を、１０，０００ｘｇで１０分間、遠心分離した 。上澄み液（細胞質）の一部は、タンパク質評価のために取り、残りを、ウエス タンブロッティング分析用に、−７０°Ｃに保っておいた。 Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１ ０％泳動用ゲル、４％濃縮用ゲル）を行った（２４）。ウエスタンブロッティン グでは、ゲルは、転写バッファー（３５ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ塩基、１９２ｍ ｍｏｌ／ｌグリシンおよび２０％メタノール、ｐＨ８．３）で平衡化し、その後 、Ｔｏｗｂｉｎらに記載の方法（２５）に従って、半乾燥ポリブロット装置（Ａ ｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ ）内で４０分間、ニトロセルロース（Ｈｙｂｏｎｄ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌ ｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）に移した。非特異的部位は、４°Ｃで一 晩、１０％のＦＣＳを含むＰＢＳでブロックした。次いで、膜をＰＢＳＴ（ＰＢ Ｓ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄し、さらに１％ＢＳＡおよび２ ０％ （容量／容量）ＦＣＳを含むＰＢＳＴ中で、一次抗体と共に、２時間室温にイン キュベートした。ブタ白血球の１２−ＬＯ配列のアミノ酸６４６−６６２の配列 を持つ、ブタの１２−ＬＯペプチドに対するポリクローナル抗体が用いられた。 この抗血清は、１：１００に希釈して用いられた。いくつかの研究では、Ｅ．Ｓ ｉｇａｌ博士（Ｓｙｎｔｅｘ Ｃｏ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）の御好意に よりご提供頂いたヒト１５−ＬＯに対するポリクローナル抗体を用いた。洗浄し た膜は、その後、アルカリホスファターゼ（１：５０００；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍ ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と複合させた二次抗体（ヤギ抗ウサギ）と共に、１時間イ ンキュベートした。検出は、基質混合物［ニトロブルー（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ） テトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ Ｐｒｏｍｅｇａ）］を用いた呈色反応によって、またはＣＳＰＤ基質およびウエ スタンライト（Ｗｅｓｔｅｒｎ−Ｌｉｇｈｔ）化学発光検出システム（Ｔｒｏｐ ｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いた化学発光によってのいずれか で行った。非特異的結合は、正常なウサギの血清を用いて評価した。ウエスタン ブロットは、コンピューター化されたビデオデンシトメーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ；Ｌｙｎｘ ＤＮＡ ｖ ｉｓｉｏｎ）を用いて定量し、そして値は任意の吸光度ユニットとして示された 。 ７． １２−ＬＯ生成物の測定 これらのアッセイは、以前に報告した方法（１０、１１）を用いて行われた。 簡単に言えば、１２−および１５−ＨＥＴＥは、上澄み液および細胞より、Ｃ１ ８ミニカラム（Ａｎａｌｙｔｉｃｈｅｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＣＡ） を用いて抽出され、さらに、我々が有効にした逆相密度勾配ＨＰＬＣおよび（Ｒ ＩＡ）方法を用いて測定された。 ８． ＨＳＭＣ内のリポキシゲナーゼ活性の測定 コンフルエントになったＨＳＭＣは、実験前２４時間、培養液＋１０％ＦＣＳ 内に置いておいた。細胞を収集し、洗浄し、１ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ ー（２５ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７．７）内に懸濁し、さらに氷上で超音波処理した 。アッセイ混合物は、１．０ｍｌ中に、８００μｌの酵素（超音波処理）、１０ ０ μｌのＣａＣｌ2（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）および５０μｌのグルタチオン（０． ５ｍｍｏｌ／ｌ）を含んでいた。酵素ブランクも同時に反応させた。反応は、５ ０μｌのアラキドン酸ナトリウム（１６０μｍｏｌ／ｌ、Ｎｕ Ｃｈｅｃｋ Ｐ ｒｅｐ，Ｅｌｙｓａｉｎ，ＭＮ）または０．２５μＣｉ14［Ｃ］リノール酸（Ｎ ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を加えて、３７°Ｃで開始した。１０ 分間のインキュベーション後、反応は、２ｍｌのイソプロパノール／１．２％酢 酸、次いで２ｍｌのクロロホルムを加えて停止させた。低級有機層をろ過し、さ らに出願者の密度勾配逆相ＨＰＬＣシステム（１０、１１）を用いてＨＰＬＣを 行い、ＨＯＤＥｓまたはＨＥＴＥｓを検出した。１２−ＨＥＰＥのピークは、２ ３７ｎｍのＵＶ検出および標準との共移動（保持時間１８．３分）によって同定 された。ピークの高さは、Ｓｈｉｍａｚｕ ＣＲ５Ａ インテグレーターを用い て定量した。放射性リノール酸代謝物である14［Ｃ］ＨＯＤＥｓを同定するため に、標準の非放射性ＨＯＤＥｓと同じ保持時間で共移動するフラクション内の放 射能を定量した。このＨＰＬＣシステムでは、９−および１３−ＨＯＤＥは両方 共、同じ保持時間（１７．９分）を持つ。 ９． 免疫組織化学 用いた免疫組織化学法は、前記の通りである（２６）。簡単に言えば、末梢血 管疾病のために切断された下肢またはアテローム性動脈硬化のプラークを示す冠 状動脈から採取した組織サンプルの５ミクロン切片を、Ｓｉｌａｎｅ（３−アミ ノプロピルトリエトキシシラン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコー トしたスライド上に載せ、６０°Ｃで一晩乾燥させた。脱パラフィン化および脱 水の後、それらを１０ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸バッファー溶液（ｐＨ６．０）中 に置き、電子レンジで５分間ずつ、２回沸騰させた。冷却後、切片を蒸留水で２ 回洗浄した。１％の過酸化水素／メタノール中で２０分間インキュベーションの 後、スライドは、蒸留水で２回、さらにリン酸緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ）で２回 、洗浄した。これに続いて、ＰＢＳ中の正常なウマ血清１：２０（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）でブロッキングした。デカントした後、切片をウサギペプチド抗白 血球１２−リポキシゲナーゼ抗血清（１：１０００希釈）で覆い、湿気のある容 器内、室温で一晩インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、１：６００希釈の ビ オチニル化抗−ウサギＩｇＧ（Ｅｌｉｔｅ ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を加えて、スライドを４０分間インキュベートし た。さらに２回ＰＢＳ中で洗浄した後、１：２００希釈のＡＢ複合液（Ｅｌｉｔ ｅ ｋｉｔ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）中で、切片をさらに４０分間インキュベ ートした。次いで、発色させるために、切片をジアミノベンジジン溶液に７分間 晒した。さらに２回洗浄した後、切片を１％の硫酸銅中で５分間インキュベート することによって、発色を強化した。全段階は、自動染色器（Ｔｅｃｈｍａｔｅ １０００，Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ ，ＣＡ）を用いて行った。末梢血管からの切片を再び洗浄し、６％のＭａｙｅｒ のヘマトキシリン中で薄く対比染色し、洗浄し、脱水し、さらにカバーガラスを かけた。冠状動脈からの切片は、対比染色しなかった。コントロールのスライド は、抗−１２−リポキシゲンナーゼを同じ濃度の免疫化前ウサギ血清で置き換え る事によって、調製した。 １０．データ分析 イムノブロットおよびオートラジオグラムは、コンピューター制御のデンシト メーター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ； Ｌｙｎｘ ＤＮＡ Ｖｉｓｉｏｎ）を用いて、分析した。示したデータは、２か ら３の実験を示している。１２−ＨＥＴＥを合成するためにＨＳＭＣをＡIIで処 理して得られたデータは、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈコンピューターシステムの統計用 パッケージを用いた複数サンプルのためのＡＮＯＶＡを用いて分析した。データ は、平均±ＳＥとして示された。 実験結果 ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内での白血球型１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現 ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内での１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現は、検出レ ベルがノーザン分析の感受性を下回るため、特異的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて評価 した。図１Ａは、白血球型の１２−ＬＯ ｍＲＮＡに特異性の高い方法を用いて 、正常なＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内で白血球１２−ＬＯ ｍＲＮＡが発現 し ていることを示している。目的とする３３３塩基対のバンドが、３つの細胞の型 のすべてに認められた。 図１Ｂは、同一ＲＮＡからのヒト１５−ＬＯ ｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲ 分析を示している。これらの結果から、ヒト１５−ＬＯに特有なバンドの証拠は 示されなかった。別の実験では、ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯからのＲＮＡを 増幅させ、そして、血小板型の１２−ＬＯ ＲＮＡ用のプローブとした。ヒト血 小板１２−ＬＯが発現している証拠は認められなかった（データは示していない ）。 ＨＡＥＣ、ＨＳＭＣおよびＭＯ内でのｈｌ １２−ＬＯタンパク質の発現 白血球型の１２−ＬＯ酵素が血管内および循環血中のＭＯに発現しているかい なかを研究するために、１０，０００ｘｇの上清タンパク質を電気泳動し、ヒト 副腎球状層内で見いだされた１２−ＬＯ配列と相同性を有するブタ白血球型１２ −ＬＯ内の配列から誘導されたポリクローナルペプチド抗体を用いて、ウエスタ ン分析を行った。この抗体は、血小板型１２−ＬＯとの交差反応性が欠損してい ることが以前から示されており、ヒト副腎細胞内に白血球型１２−ＬＯが存在す ることを示すことに成功した（３）。図２は、ＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯで のウエスタン分析からの７２ｋＤの主要バンドを示している。ヒト１５−ＬＯタ ンパク質に直接対するポリクローナル抗体を用いて同様に行ったウエスタン分析 では、これらの細胞からは予想される分子量の位置にバンドは示されなかった（ データは示していない）。ＨＡＥＣおよびＭＯは、ＨＰＬＣおよびＲＩＡ分析と 照らし合わせた結果、１２−Ｓ−ＨＥＴＥを生成していた（ＨＡＥＣ２３８６、 ＭＯ８２０ｐｇ／１０6細胞）。ＨＳＭＣの結果は、以下に詳細に記載する。 その結果、ＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯは、ブタ組織およびヒト副腎球状層 内に見いだされる白血球型１２−ＬＯと同様の１２−ＬＯタンパク質を発現して いると思われる。 ＨＳＭＣおよびある種のその他の組織内での １２−ＬＯ活性ならびに発現へのＡIIの影響 本発明のもう一つの主な態様は、ＡIIがＨＳＭＣ内で１２−ＬＯのｍＲＮＡお よびタンパク質の活性ならびに発現を増加させることを発見したことである。図 ３Ａは、無血清培地内に１０-8ｍｏｌ／ｌおよび１０-9ｍｏｌ／ｌの濃度でＡII を加えてＨＳＭＣを５分間インキュベーションすると、１２−ＨＥＴＥの遊離が 刺激される（対照：５９９±１０５；ＡII １０-8Ｍ：１４６７±２７７；ＡII １０-9ｍｏｌ／ｌ：１２９６±２６２ｐｇ／ｍｇタンパク質）ことを示してい る。ＡIIを加えて１０分間インキュベーションすると、１０-8ｍｏｌ／ｌの濃度 で明らかに１２−ＨＥＴＥの遊離が刺激された。ＡIIはまた、ＨＳＭＣ内の細胞 関連１２−ＨＥＴＥレベルをも明らかに増加させた（図３Ｂ）。他の研究では、 ＡIIに応答する１２−ＨＥＴＥのレベルは、ＬＯ阻害剤バイカレイン（ｂａｉｃ ａｌｅｉｎ）１０-5ｍｏｌ／ｌによって減少させうることが、見いだされた（デ ータには示していない）。ＡIIがＨＳＭＣ内の１２−ＬＯ酵素の発現を誘導する か否かを試験するために、細胞を、２ｘ１０-7ｍｏｌ／ｌの濃度のＡIIで、２４ または４８時間処理した。１２−ＬＯタンパク質は、精製した白血球型１２−Ｌ Ｏに特異的な抗体またはヒト白血球型１２−ＬＯ内に存在する既知配列より誘導 したペプチド抗体を用いて、ウエスタンイムノブロッティングによって同定した 。ブタ白血球型１２−ＬＯの報告された分子量である７２ｋＤに近い分子量を持 つ、はっきりしたバンドが検出された（図４）。無血清培地中、ＡIIと共にＨＳ ＭＣを２４時間インキュベーションすると、７倍に近い１２−ＬＯタンパク質の 発現増加が誘導された（図４）。他の実験では、ＡIIを４８時間加えると、同様 に４−７倍の１２−ＬＯの発現が誘導された（データは示していない）。 ＨＳＭＣ内での１２−ＬＯ ｍＲＮＡの具体的な発現および制御を評価するた めに、出願者らは、白血球型１２−ＬＯを著しく増加させるＲＴ−ＰＣＲアッセ イを用いた。ＰＣＲ増幅フラグメントの大きさは、１２−ＬＯおよび１５−ＬＯ の両方とも３３３ｂｐである。それ故、厳密性を増加させさらに洗浄温度を６０ °Ｃに上昇させることによる、具体的な条件が、白血球型１２−ＬＯとヒト１５ −ＬＯとを識別するために用いられた。図５Ａに、２４時間無血清でその後指示 された時間１０-7ｍｏｌ／ｌのＡIIで処理したＨＳＭＣからのＲＴ−ＰＣＲ増幅 生成物のサザンブロット分析を示す。この実験では、１２−ＬＯの非常に低い基 礎的発現が認められた。しかしながら、様々なその他のドナーからの細胞を用い た他の実験では、基礎的な１２−ＬＯ発現は、２０−３０回のＰＣＲで検出可能 になる。ＡIIは、インキュベーション時間１２時間で１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発 現を誘導し始め、最大の誘導は、ＡIIを加えての細胞のインキュベーション時間 ３６時間で現れる。図５Ｂは、内部マーカーとしてＧＡＰＤＨの増幅を示すエチ ジウムブロミドで染色したアガロースゲルを示している。血小板型の１２−ＬＯ またはヒトの１５−ＬＯのいずれかに特異的なＰＣＲ条件を用いた場合、特異的 なＲＮＡのバンドは、検出されなかった（データは示していない）。それ故、無 血清の基本的ＨＳＭＣは、ＡIIによって明らかにアップレギュレートされる白血 球型の１２−ＬＯの低い発現を示す。 また、白血球型の１２−ＬＯは、血小板型と異なり、リノール酸を代謝するこ とが出来る。それ故、出願者らは、ＨＳＭＣは、アラキドン酸代謝生成物である １２−ＨＥＴＥに加えて、ＬＯの作用によるリノール酸代謝物である１３−ＨＯ ＤＥを形成することが出来るかいなかについて、評価した。これを成し遂げるた めに、出願者らは、ＨＳＭの適当な細胞質画分をＣ14リノール酸または非放射性 アラキドン酸で処理し、さらにＨＳＭＣのＬＯ生成物を密度勾配逆相ＨＰＬＣシ ステムで分析する別の実験を行った。非放射性アラキドン酸で標識された細胞は 、１２−ＨＥＴＥと共移動するＨＰＬＣピークを示した。細胞ブランクサンプル のピーク高は、１．５ｃｍであり、これは、ＨＳＭＣの超音波処理で３／５ｃｍ に増加した。また、Ｃ14リノール酸を加えてインキュベートした細胞もまた、１ ３−ＨＯＤＥを生成した（ブランク６９５カウント／分に対してＨＳＭＣ超音波 処理１０３８カウント）。 白血球型の１２−ＬＯがアテローム性動脈硬化病変に存在するか否かを評価す るために、ペプチド抗白血球型１２−ＬＯ抗体を用いて、免疫組織化学を行った 。図６Ａは、末梢血管疾病の患者からの下肢切断標本から作成した切片の強拡大 写真を示す。白血球型の１２−ＬＯに特異的な細胞質染色は、この病変の内皮お よび平滑筋層の両方で朋らかである。内膜新生領域もまた、白血球型の１２−Ｌ Ｏの染色を示している。図６Ｂは、免疫化前抗血清を加えて染色した同病変から の切片の強拡大写真を示す。この切片は、最小のバックグラウンド染色を示し、 図６Ａの白血球型の１２−ＬＯの染色が特異的であることを示唆している。図７ は、 進行したアテローム性動脈硬化病変を示すヒト左冠状動脈からの典型的な切片で ある。図７Ａは、平滑筋および外膜領域ならびに内皮細胞内の１２−ＬＯタンパ ク質の限定的染色を示している。図７Ｂは、免疫化前抗血清での非常に低いバッ クグラウンド染色を示す、この抗体での免疫組織化学を示す。 これらの結果は、ブタ白血球およびヒト副腎球状層（３）内で見いだされたそ れと同様の１２−ＬＯ ＲＮＡおよびタンパク質もまた、ヒト血管細胞および循 環血中単球内で発現していることを、示している。この結論を支持するために、 いくつかの研究方法を、この研究に利用した。第一に、ブタおよびヒト型の白血 球型の１２−ＬＯに共通な配列から誘導されたペプチド抗体は、ＨＳＭＣ、ＨＡ ＥＣおよびＭＯ溶解液中で特徴的な７２ｋＤのバンドを示した。この抗体は、血 小板型の１２−ＬＯと交差反応しないが、ヒト１５−ＬＯとは部分的交差反応性 を持っている（３）。第二に、特異性の高いＲＴ−ＰＣＲ法が、これらの細胞型 内の１２−ＬＯ ｍＲＮＡを検出するために用いられた。以前に行った研究では 、この技術を用いて、白血球型の１２−ＬＯがヒト副腎球状層およびＵ９３７細 胞に見られる特有な（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｔｙｐｅ）の１２−ＬＯであること を示した（３）。本研究では、適当な白血球型１２−ＬＯのプライマーおよびプ ローブを用いた場合、特異的な３３３塩基対を増幅させたｍＲＮＡ生成物が、刺 激されていないＨＳＭＣ、ＨＡＥＣおよびＭＯ内で見いだされた。第三に、３つ の細胞型のすべてにおいて、ＨＰＬＣおよび特定のＲＩＡによって照合したとこ ろによると、１２−ＬＯ生成物である１２−Ｓ−ＨＥＴＥが形成されていた。Ｈ ＳＭＣからの細胞質は、アラキドン酸およびリノール酸の両方と反応して、それ ぞれ１２−ＨＥＴＥまたは１３−ＨＯＤＥのいずれかを生成した。この反応は、 白血球型の１２−ＬＯの特徴を示しており、アラキドン酸とのみ反応して１２− ＨＥＴＥを生成する血小板１２−ＬＯの特徴を示していない。 網状白血球から独自にクローン化され且つヒト気管内で見いだされたヒトの１ ５−ＬＯは、ブタ白血球型の１２−ＬＯと相同性が高い（８６％配列相同性）（ １４）。ここで用いたＰＣＲ技術は、白血球１２−ＬＯと１５−ＬＯとを識別す ることが出来る（３）。この研究方法の特異性は、増幅のための鋳型として、１ ２−ＬＯおよび１５−ＬＯ ｃＣＮＡを用いて、証明された。それ故、白血球 １２−ＬＯプローブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションによって、 認められたバンドが１２−ＬＯの増幅生成物であり、１５−ＬＯの増幅生成物で はないことを示す最も強力な証拠が提供される。これらの結果は、基礎的または 刺激されたヒトの内皮細胞または刺激されていない単核細胞内に１５−ＬＯのｍ ＲＮＡが検出できないことを示した前研究と一致する（２７）。しかしながら、 １５−ＬＯ ｍＲＮＡおよびタンパク質は、アテローム性動脈硬化血管病変のマ クロファージに富む領域内およびＩＬ−４で刺激された単球内に見いだされ（２ ８）、このことは、１５−ＬＯが進行したアテローム性動脈硬化血管疾患および 免疫の仲介する血管疾病内で作用しうることを示唆している。 証拠の増加はまた、１２−ＬＯ酵素がいくつかのさらなる組織内でＡII誘導作 用に重要な役割を演じていることを示唆する。研究から、アラキドン酸の１２− ＬＯ経路は、ラットおよびヒトの副腎球状層細胞内のＡII誘導アルドステロン合 成を仲介できることが示唆される（１１、１２）。さらに、最近のデータは、Ａ IIの誘導する副腎細胞の増殖が、少なくとも部分的には、１２−ＬＯ酵素の活性 化によって仲介されることを指摘している。ラットでのさらなる研究では、ＡII による血管収縮およびレニン阻害作用に１２−ＬＯ経路が関係していた（２９） 。大動脈は、１２−ＨＥＴＥおよび１５−ＨＥＴＥを含むＬＯ生成物を生成する 能力を持っている（３０）。最近のデータから、ＡIIおよび高グルコースの両方 が、培養したブタ大動脈平滑筋細胞内の白血球型１２−ＬＯを亢進調節できるこ とが、示された（３１）。 ＡIIは、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）における 血管平滑筋細胞を増殖させることに主に影響している（１、７、３２−３４）。 最近の報告では、シクロキシゲナーゼの阻害剤ではなく、比較的選択的な１２− ＬＯの阻割剤が、培養したブタ血管平滑筋細胞内でのＡII誘導の異常亢進的応答 を完全に防ぎうることが認められた（３５）。さらに、これらの血管平滑筋細胞 のタンパク質およびフィブロネクチン含有量において、１２−ＨＥＴＥは、ＡII と同様の増加を誘導した（３６）。１２−ＬＯ経路およびその生成物である１２ −ＨＥＴＥもまた、血管平滑筋細胞の移動と関係していた（９）。１０-12Ｍ程 度の低い濃度の１２−ＨＥＴＥが、平滑筋細胞の移動を導くことが示された。さ ら なる研究により、１２−ＬＯ生成物は、プロテインキナーゼＣの特定の異性体な らびにｒａｓ、ｃ−ｆｏｓおよびｊｕｎを含むオンコジーンを活性化できること が、示された（３６−３８）。 それ故、ＡIIによって増加した１２−ＬＯの活性および発現は、ＡIIによって 誘導されるヒトの高血圧性およびアテローム動脈硬化血管疾病に関する、以前に は認識されていなかったメカニズムであろう。従って、本発明のもう一つの重要 な態様は、ＡIIに関連する心臓血管疾病を減少させるための新規の治療法として 、１２−ＬＯ経路の封鎖を必然的に伴う。 ヒト血管壁および単球内の１２−ＬＯの経路は、アテローム性動脈硬化血管疾 病の発生または進行に関連するその他のメカニズムに関係するであろう。最近の 証拠では、血管壁内でのＬＤＬの酸化的修飾が、ＬＯ経路とも関係していた（３ ９−４１）。現在では、ＨＡＥＣ、ＨＭＳＣまたは単球は、天然のＬＤＬを、よ り強いアテローム性動脈硬化潜在能力を有する最小限修飾したＬＤＬに転化させ る能力を持つことが、明らかになっている。マクロファージのコレステロール負 荷が、本来、１２−ＨＥＴＥの生成を増加に導くことを示すデータは興味深い（ ４２）。最近の報告で、白血球型の１２−ＬＯおよび１５−ＬＯは両方とも、同 じ様にリポタンパク質を酸化できることが、これまでに示された（４２）。興味 深いことに、この同一の報告で、血小板１２−ＬＯがリポタンパク質を酸化する 能力を欠くことも示された。 ヒト血管内の白血球１２−ＬＯの存在および局在性のためのさらなる証拠を提 供するために、２つのアテローム性動脈硬化病変の免疫組織化学分析を行った。 結果から、白血球型の１２−ＬＯがアテローム性動脈硬化病変の内皮および平滑 筋細胞内に特に発現するという免疫組織化学的証拠が提供され、アテローム性動 脈硬化血管疾病の進行の初期においてこの経路が潜在的な役割を果たしているこ とを支持している。前研究では、血管組織および単球がＬＯ活性を持つことを示 した（４２−４４）。 ＡIIおよび１２−ＨＥＰＥが機能する経路 ＡIIおよび１２−ＨＥＴＥの影響は、分裂促進性活性化タンパク質（ＭＡＰ） キナーゼ活性を刺激することによって、細胞を変化させることが、これまでに発 見された。具体的に言うと、ＡIIおよび１２−ＨＥＴＥは、ＥＲＫ（ｅｘｔｒａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ）（細胞外制御キナ ーゼ）［例えば、ＥＲＫ１（Ｐ４４MAPK）、ＥＲＫ２（Ｐ４２MAPK）およびＥＲ Ｋ３（Ｐ６２MAPK）］を介してｆｏｓの転写活性を活性化することによって、Ｊ ＮＫ（ｃＪｕｎキナーゼまたはストレス活性化キナーゼ）を介してｊｕｎを活性 化することによって、および／または、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ、例えば、 ＪＡＫ１およびＪＡＫ２）を活性化することによって、機能する。より具体的に は、ＡIIおよび１２−ＨＥＴＥは、ＪＮＫを活性化するための重要な上流シグナ ルとしてかかわる、Ｐ−２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）を活性化する。 実験方法 ＥＲＫ活性 ： ＥＲＫ活性は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８３：１３９− １４３（１９８９）に記載の基質−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル法によって 評価した。１００ｍＭの皿内のコンフルエントに達した細胞を無血清培地内で休 止状態にし、その後、様々な期間、アゴニストで処理した。次に、細胞を溶解バ ッファー（１％ＮＰ４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、 １００ｍＭ−ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ−ＥＤＴＡ、１ｍＭ−Ｅ ＧＴＡ、アプロチニン、１００ｍｇ／ｍｌロイペプチン、０．１ｍＭ−ＰＭＳＦ および１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中で溶解した。溶解物 を遠心分離して核をペレット状にし、細胞抽出物（１５−２０ｍｇタンパク質） を、ＥＲＫ基質としてミエリン塩基性タンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＳ ＤＳポリアクリルアミドゲル（１０％）の電気泳動にかけた。その後、ＳＤＳを 洗浄し、次に、変性させ、、再生させ、さらに［32Ｐ］ＡＴＰでゲル上のタンパ ク質をリン酸化した。ＪＮＫ活性 ： プラスミドｐＧＥＸ−ｃＪｕｎ１／７９（Ｄｅｐｔ．Ｐｈａｒｍ ａｃｏｌ．ＵＣＳＤ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ）は、ｃＪｕｎのアミノ酸（１−７９） をコードするＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−７９）発現ベクターである。ＧＳＴ融合タ ンパク質発現ベクターで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。タンパク質は 、０．１ｍＭ−ＩＰＴＧで誘導され、そしてグルタチオン−アガロースビーズへ のアフィニティー結合によって精製した。刺激されなかったまたは刺激された細 胞をＷＣＥＢ（２５ｍＭ−ＨＥＰＥｓ、ｐＨ７．７、０．３Ｍ−ＮａＣｌ、１５ ｍＭ−ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ−ＥＤＴＡおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ００）中で溶解した。約５０μｇのタンパク質抽出物は、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ＋Ｇ ＳＨアガロースと共に、一晩、４°Ｃでインキュベートした。リン酸化は、２０ ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ｂ−グリセロホスフェート、１０ｍ Ｍ ｐ−ニトロフェノールホスフェート、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ−Ｄ ＤＴ、５０μｇ Ｎａ3ＶＯ4、２０μＭ ＡＴＰ（非放射性）およびおおよそ０ ．５μｌの新規に購入したガンマ32Ｐ−ＡＴＰの存在下、３０°Ｃで２０分間、 行った。電気泳動サンプルバッファーと共に沸騰させた後、上澄み液を１２％の ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＪＮＫ活性もまた、抗−ＪＮＫ抗体（Ｐａｒｍｉ ｎｇｅｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いた免疫沈降法によって測定し、 次に、活性は、Ｃｅｌｌ，８１：１１４７−１１５７（１９９５）に記載の方法 に従って、基質として２μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎを用いて測定した。ＰＡＫ活性 ： 細胞の溶解およびＰＡＫ活性の測定は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９ ：２２１−２２３（１９９５）に記載の方法に従って、行われた。細胞は、プロ テアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ、ロイペプチンおよびアプロチニンを含む５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭのピロリン酸Ｎａ、１％ ＮＰ−４０、２．５％グリセロール 、および１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4（ｐＨ７．５）中、氷上で溶解させた。細胞を１０ 分間１０００ｇで遠心分離した。免疫沈降を行うために、上澄み液は、抗−ＰＡ Ｋ１または抗ＰＡＫ２抗体（１：２５）（Ｄｅｐｔ．Ｉｍｍｕｎｏ．＆ Ｃｅｌ ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓ．Ｉｎｓｔｉｔ．，Ｌａ Ｊｏｌ ｌａ，ＣＡ）と共に、４°Ｃで２時間インキュベートし、次に６０μｌの１：１ プロテインＡビーズを加えて６０分間インキュベーション、その後、１．０ｍｌ 溶解バッファーで５回洗浄し、さらにキナーゼバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥ Ｓ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭジチオスレイトール、２μ ｇミエ リン塩基性タンパク質および１４μＭ［γ−32Ｐ］ＡＴＰ）で、３０°Ｃで２０ 分間、二回洗浄した。反応はＳＤＳサンプルバッファーを加えて停止し、結果は ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフによって可視化した。 結果 ＡIIの投与は、結果としてＭＡＰキナーゼの二段階の活性化を起こすことが発 見された（ＭＡＰキナーゼの実験はすべて、ＣＨＯ−ＡＴ１ａ細胞内で行った。 これはＡIIレセプターであるＡＴ１ａ ｃＤＮＡを、チャイニーズハムスター卵 巣細胞に移入したものである）。ＡII（１０-7Ｍ）は、５分で第一の活性ピーク （２−６倍）および３−４．５時間で後のピーク（１．５−３倍）を持つ二段階 のＥＲＫ活性の刺激、ならびに、３０分でピークに達し１時間残存するＪＮＫ活 性の刺激を誘導することが見いだされた。また、ＡII（１０-7Ｍ）は、３０分に １回の主要ピーク（５倍）を持つＰＡＫの刺激を誘導することが認められた。 また、１２−ＨＥＴＥ（１０-7Ｍ）が、５分に第一のピークおよび３−４．５ 時間に第二のピークを持つ二段階のＥＲＫ活性の刺激、ならびに、３０分（２− ３倍）および３時間（２．５−５倍）にピークを持つ二段階のＪＮＫ活性の刺激 を誘導することも、発見された。１２−ＨＥＴＥは、図２９に示すように、１０-9 Ｍほどの低い濃度でＪＮＫ活性を刺激することが見いだされた。 さらに、１２−ＨＥＴＥは、ＪＡＫ活性の刺激を誘導することが発見された。 ＣＨＯ−ＡＴ1a細胞を１２−ＨＥＴＥ（１０-7Ｍ）で１０時間処理し、ホスホチ ロシン抗体で免疫沈降し、さらにＪＡＫ１およびＪＡＫ２に特異的な抗体を用い てイムノブロットした。図３０で見ることができるように、１２−ＨＥＴＥは、 ＪＡＫ活性を増加させた。 最後に、１２−ＬＯ阻害剤（例えば、ＣＤＣおよびバイカライン）は、濃度に 依存して、ＡII−および１２−ＨＥＴＥの誘導する分裂促進性活住を減少させる ことが発見された。このように、１２−ＬＯ阻害剤の投与は、ＡIIおよび／また は１２−ＨＥＴＥ誘導ＭＡＰキナーゼ活性を減少させ、それによって、ＡIIおよ び／または１２−ＨＥＴＥが細胞の増殖および発生に持つ影響を減少させる。 このデータに矛盾しないように、本発明の一つの態様は、１２−ＬＯ阻害剤の 投与を通して、ＥＲＫ、ＪＮＫおよび／またはＪＡＫ活性の減少を含む、ヒトの ＡII−または１２−ＨＥＴＥ−誘導疾病の治療法を必然的に伴う。特別な理論で 結びつけられることを望むわけではないが、１２−ＨＥＴＥは、１２−ＨＥＴＥ レセプターの亢進調節を通してＭＡＰキナーゼ活性を増加させると考えている。 このように、ＡII−または１２−ＨＥＴＥ誘導疾病の治療法もまた、例えば、Ｄ ｕＰ６５４のような、１２−ＨＥＴＥレセプターアンタゴニストの投与を通して 分裂促進性の活性を減少させることを含む。 １２−ＬＯ経路の阻害 白血球型の１２−ＬＯ活性を減少させる様々な薬学的方法、アンチセンスまた はリボザイム法の利用は、出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０００８９に記載されている 。パナキシノール、すなわち朝鮮人参から分離したポリアセチレン化合物は、白 血球１２−ＬＯの比較的選択的な阻害剤として同定されており（５５）、本発明 の目的に有効である。 乳癌細胞の増殖における１２−ＬＯ経路の役割 出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０００８９の実施例Ｖは、１２−ＬＯ経路の封鎖が有 効なヒトの乳癌治療法を提供することを示している。乳癌細胞および組織での１ ２−ＬＯ活性および発現の制御のさらなる評価から、乳癌組織の増殖は１２−Ｌ Ｏ阻害剤によって阻害されることが確認される。具体的には、白血球型の１２− ＬＯ ｍＲＮＡ発現について、６人の患者からの癌を含まない正常乳房組織と癌 を含む乳房組織のＲＮＡサンプルとを対比する、特異的逆転写酵素ＰＣＲ法によ って研究した。６人の患者のそれぞれにおいて、癌含有切片は、比較対象である 正常な切片より非常に高いレベルの１２−ＬＯ ｍＲＮＡ（３４０ｂｐ ＰＣＲ 生成物）を示した（ＰＣＲ用の内部対照、ＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡ ２８４ｂｐに よる標準化の後でも３−６倍高い）。１２−ＬＯ ｍＲＮＡのレベルもまた、正 常な乳房上皮細胞株ＭＣＦ−１０Ｆと比較して、２種類のガン細胞株、ＭＣＦ− ７およびＣＯＨ−ＢＲ１では、７倍および１１倍より高かった。 さらに、ＭＣ Ｆ−７細胞の増殖は、三種類のＬＯ阻害剤、バイカライン（１０μＭ）、ＣＤＣ （１０-5Ｍ）およびＮＤＧＡ（３０μＭ）によって明らかに阻害されたが、シク ロオキシゲナーゼ阻害剤であるイブプロフェン（１０-5Ｍ）によっては阻害され なかった。ＥＧＦで４時間、血清を枯渇させたＭＣＦ−７細胞を処理すると、１ ２−ＬＯ生成物である１２−ＨＥＴＥの形成は、濃度に依存して増加に導かれる （基準値２５７±１０ｐｇ／１０6細胞；ＥＧＦ５０ｎｇ／ｍｌでは４６２±１ ５ｐｇ；ＥＧＦ１００ｎｇ／ｍｌでは５９３±４６ｐｇ；両方共ｐ＜０．００１ 対基準値）。ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）もまた、１２−ＬＯタンパク質（７２ｋ Ｄ）ならびに１２−ＬＯ ｍＲＮＡのレベルを、２４時間で著しい増加に導いた 。これゆえ、１２−ＬＯ経路の活性化は、基準的およびＥＧＦ−誘導の乳癌細胞 の増殖および発生に重要な役割を演じるものと思われる。 乳癌におけるエストロゲンの作用への１２−ＬＯ経路の役割 乳癌細胞の増殖および発生と関連するエストロゲンは、乳癌細胞において１２ −ＬＯ経路を活性化する役割を演ずることが、これまでに発見された。 エストロゲンレセプター陽性の乳癌細胞株であるＭＣＦ−７から、無血清で且 つフェノールレッドを含まない限定培地内で４時間、１７β−エステラジオール と共に、細胞を処理すると、細胞に関連した１２−ＬＯの生成物である１２−ヒ ドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）のレベルが、濃度に依存して 増加に導かれた（基準値１６１±２９ｐｇ／１０6細胞；１７β−エストラジオ ール、５ｎＭで７８４±１５０ｐｇ；１７β−エストラジオール、１０ｎＭで１ ０５６±１８７ｐｇ；両方ともｐ＜０．００１対基準値）。この１２−ＨＥＴＥ への１７β−エステラジオールの刺激効果は、エストロゲンレセプター陰性の細 胞株であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１では発見されなかった。エストロゲンでＭＣＦ −７細胞を２２時間処理すると、同様に、１２−ＬＯペプチド抗体でのイムノブ ロッティングによる試験では、白血球型の１２−ＬＯタンパク質の発現の濃度に 依存した増加が引き起こされた（１ｎＭおよび１０ｎＭの１７β−エステラジオ ールで、それぞれ、基準値の２．１倍および３倍に増加）。このように、１７β −エステラジオールは、ＭＣＦ−７細胞における１２−ＬＯの活性および発現を 増加させた。それ故、１２−ＬＯ経路の活性化は、エストロゲンの誘導する乳癌 細胞の増殖および発生に、重要な役割を演じると考えられる。 このデータから、本発明の一つの態様は、１２−ＬＯ経路を阻害することを通 して乳癌細胞の増殖および発生を減少させる治療法を伴う。そのような１２−Ｌ Ｏ経路の阻害は、とりわけ、エストロゲンが乳癌細胞胞の増殖および発生に及ぼ す効果を減少させるであろう。 ＶＥＧＦの形成における１２−ＬＯ経路の役割 出願者らは、１２−ＬＯ経路が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の形成にも役 割を演じることを、発見した。ＶＥＧＦは、血管透過性および単球の移動性を増 加させる内皮細胞に特異的な分裂促進因子である。ＶＥＧＦは、乳癌および肺癌 を含む、多くの型の癌の主な血管新生の因子であると思われる。さらに、ＶＥＧ Ｆは、増殖性糖尿病性網膜症ならびに糖尿病としばしば関連性を持つ進行した血 管疾病の発生とも結びついていた。 図８、９および１０の簡単な説明 図８は、ＭＣＦ−７乳癌細胞内の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）タンパク質（ ４２ｋＤ）の発現への血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）の濃度依存的効果につい て説明している。ほぼコンフルエント状態のＭＣＦ−７細胞は、ＤＭＥ培地＋０ ．４％ＦＣＳおよび０．２％ＢＳＡ内に置くことによって、２４時間血清を枯渇 させた。次いで、この培養液を新鮮なものに置き換え、そして細胞をさらに２４ 時間ＰＤＧＦと共にインキュベートした。インキュベーションの終わりに、単層 の細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ内でかきとり（ｓｃｒａｐｅｄ）、そ して遠心分離によってペッレットにした。その後、細胞ペレットを溶解し、同量 のタンパク質（５０μｇ）を電気泳動にかけ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの特異的抗体を用いて、ＶＥＧＦを検出するためにイム ノブロットした。検出は、化学発光技術によって行った。ＰＤＧＦは、乳癌細胞 内でのＶＥＧＦの発現において、濃度に依存して増加する原因となることが明ら かに認められる。 図９は、乳癌細胞株ＭＣＦ−７内でのＶＥＧＦタンパク質の発現への内皮増殖 因子（ＥＧＦ）および１２−リポキシゲナーゼ生成物である１２−ＨＥＴＥの効 果を説明している。ＭＣＦ−７細胞を、ＥＧＦおよび１２−ＨＥＴＥで２４時間 処理し、図８の説明文に記載の方法に従って、ＶＥＧＦタンパク質を同定した。 図は、ＶＥＧＦタンパク質の発現が、ＥＧＦのような乳房細胞の分裂促進因子に よって誘導されるのみならず、１２−ＬＯ生成物である１２−ＨＥＴＥによって も誘導されることを示している。事実、１２−ＨＥＴＥは、ＶＥＧＦの誘導にお いて、ＥＧＦよりさらに有力であると思われ、１２−ＨＥＴＥが有力な血管新生 特性を持つことを指摘している。 図１０は、不死化したヒトの大動脈平滑筋細胞株（ＡＩＨＳＭＣ）内でのＶＥ ＧＦタンパク質（４２ｋＤ）の発現における、１２−リポキシゲナーゼ生成物で ある１２−ＨＰＥＴＥの効果について説明している。細胞は２４時間血清を枯渇 させ、その後１２−ＨＰＥＴＥを含む新しい培養液に置き換えた。細胞を５時間 インキュベートし、その後、図８の説明文に記載した方法に従って、溶解した細 胞内でＶＥＧＦタンパク質を同定した。第３列は、図で指摘されるように、第１ 列の対照と比較した場合、１２−ＬＯ生成物である１２−ＨＰＥＴＥがＰＶＳＭ Ｃ内に血管新生物質であるＶＥＧＦの発現を増加させる原因となることを示して いる。 図８および９は、１２−ＬＯ生成物である１２−ＨＥＴＥが１０-7Ｍおよび１ ０-8ＭでＶＥＧＦタンパク質の発現を増加させることを示す、二種類のヒト乳癌 細胞株ＭＣＦ−７およびＭＤＡ ＭＢのデータを報告している。図１０は、１２ −ＨＥＴＥがＨＶＳＭＣ内でＶＥＧＦタンパク質を増加させうることを示してい る。 図８−１０に表した仕事に加えて、ＡII、１２−ＨＥＴＥおよび高血糖症（Ｈ Ｇ）が、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）内のＶＥＧＦ生成を増加させることが、こ れまでに発見された。ブタおよびヒトのＶＳＭＣを、正常なグルコース（ＮＧ、 ５．５ｍＭ）条件下またはＨＧ条件下で、少なくとも二継代培養した。ＶＥＧＦ タンパク質の発現は、ウエスタンブロッティングによって、さらにＶＥＧＦ ｍ ＲＮＡはノーザンブロットによって、定量した。ＨＧは単独で、ＶＥＧＦ ｍＲ ＮＡ（２．８倍）およびタンパク質（３．２倍）のレベルを増加させた。さらに 、ＶＥＧＦタンパク質（４５Ｋ）およびｍＲＮＡ（３．７Ｋｂ）の発現は、ＡII （１０-7Ｍ）での処理を４時間行うことによって、ＨＧ中で培養した細胞内で （それぞれ２．２倍および１．４倍に）、明らかに増加した。さらに、１２−Ｈ ＥＴＥ（１０-8Ｍおよび１０-7Ｍで４時間）は、ＮＧ条件下ならびにＨＧ条件下 の両方で培養した細胞内のＶＥＧＦタンパク質およびｍＲＮＡの発現を増加させ る。さらに、ＨＧは、特異的ＥＩＡによって測定したところによると、培養液内 へのＶＥＧＦの分泌を増加させた（５６．２±４ｎｇ／ｍｌＮＧ対７３±５ＨＧ 、ｐ＜０．０２）。ＡIIおよび１２−ＨＥＴＥもまた、ＥＩＡによる測定では、 それぞれ１．２４倍および１．４倍にＶＥＧＦの分泌を増加させた。 このデータより、本発明の一つの態様は、ＶＥＧＦ生成を減少させることによ って、例えば、ｈｌ １２−ＬＯ経路の阻害を通して、乳癌およびその他の癌の 転移の可能住ならびに糖尿病に関係する苦悩（たとえば、増殖性糖尿病性網膜症 および進行した血管疾病）を減少させる治療法を含む。 糖尿病Ｉ型の病因における１２−ＬＯ経路の役割 本発明のこの態様は、膵臓ベーダ細胞の機能障害における１２−ＬＯ経路の活 性化、または糖尿病Ｉ型の病因にかかわるサイトカインに応答する細胞傷害性の 役割を含む。 図１１、１２および１３の簡単な説明 図１１は、インスリンを生成するラットのベータ細胞株であるＲＩＮｍ５Ｆに おけるＤＮＡ合成への１２−ＬＯ生成物の効果について説明している。ＤＮＡ合 成は、（１８−２４時間の実験で）最後の６時間に加えた3Ｈ−チミジンの取り 込み（１μＣｉ／ｍｌ）を用いて、研究した。ＬＯ生成物を、完全増殖培地内の 細胞に２４時間、加えた。示されているように、１２−ヒドロキシエイコサテト ラエン酸（１２−ＨＥＴＥ、１０-9Ｍ）および１２−ヒドロペルオキシエイコサ テトラエン酸（１２−ＨＰＥＴＥ）は、3Ｈ−チミジンの取り込みを減少させ、 このベータ細胞株内のＤＮＡ合成を減少させるそれらの効果を反映している。 図１２は、インスリンを生成するラットのベータ細胞株であるＲＩＮｍ５Ｆか ら分離したタンパク質のイムノブロットについて説明しており、１２−ＬＯタン パク質発現へのインターロイキン−１βの効果について示している。これらの研 究では、０．４％の血清減少含有培地単独で、またはこれにＩＬ−１β（０．１ ｎｇ／ｍｌ）を加えて、１６時間増殖させた細胞から、２５μｇのタンパク質を 分離した。結果は、ＩＬ−１で処理（第２列および４列）後、１２−ＬＯタンパ ク質の発現が２倍に増加することを示している。第７列は、１２−ＬＯ標準を示 しており、ラット、ブタおよびヒトの形の白血球型の１２−ＬＯを認識する出願 者らのペプチド抗体を用いて、特徴的な７２ｋＤの１２−ＬＯタンパク質のバン ドを示す。 図１３は、ラットのランゲルハンス島内の１２−ＨＥＴＥ生成へのＩＬ−１β の効果について説明している。 出願者らは、１２−ＬＯ生成物である１２−Ｓ−ＨＥＴＥまたは１２−ＨＰＥ ＴＥの直接添加が、ラットの純粋ベータ細胞株であるＲＩＮ−Ｍ５Ｆ内への3Ｈ チミジンの取り込みまたはＤＮＡ合成を減少させることによって確認されるよう に、直接的に細胞の増殖を減少させることを、発見した。図１１に示したように 、１０-9Ｍほどの低い濃度の１２−ＬＯ生成物でさえ、ＤＮＡ合成を減少させる 。図１２は、ヒトのＩＬ−１βが、０．２ｎｇで、これらのＲＩＮ細胞内の白血 球１２−ＬＯタンパク質の発現をおおよそ２倍に増加させることを示している。 図１３は、ＩＬ−１βが、２．５ｎｇ／ｍｌで、免疫反応性のある１２−Ｓ−Ｈ ＥＴＥの遊離を増加させる（基準値９２ｐｇ／ｍｌ／４０ランゲルハンス島対２ ５０ｐｇ／ｍｌ／４０ランゲルハンス島）ことによって確認されるように、新た に分離されたラットの膵臓ランゲルハンス島内の１２−ＬＯの活性化を明らかに 増加させることを、示している。 ヒトの自己免疫、炎症障害およびアテローム性動脈硬化障害の進行への １２−ＬＯ経路の役割 増加する証拠から、ＩＬ1、ＩＬ4およびＩＬ8のようなサイトカインが、ヒトの 自己免疫、炎症性障害およびアテローム性動脈硬化障害の発生に役割を演ずるこ とが示唆される。 図１４−２０の簡単な説明 図１４Ａは、ブタの大動脈平滑筋細胞（ＰＶＳＭＣ）内での１２−ＬＯ ｍＲ ＮＡ発現における、サイトカインであるインターロイキン−１βの濃度依存効果 について説明している。正常なグルコース培養液内でのコンフルエントのＰＶＳ ＭＣの増殖は、培地＋０．２％ＢＳＡ＋０．４％ＦＣＳ中に置くことによって、 ２４時間血清を枯渇させた。その後、この培養液を、ＩＬ−１βを含む新しいも のと置き換えて、細胞をさらに２４時間インキュベートした。インキュベーショ ンの終わりに、ＲＮＡ−ＳＴＡＴを用いて、全ＲＮＡを細胞から抽出した。その 後、このＲＮＡは、逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、十 分に確立された我々の技術を用いて、白血球型の１２−ＬＯ ｍＲＮＡ（３３３ ｂｐのＰＣＲ生成物、上方パネル）を検出し定量した。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ（ ２８４ｂｐ、下方パネル）の発現は、ＰＣＲおよび定量のための内部対照として 用いられた。図は、ＩＬ−１βでの処理が、内部対照であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮ Ａの発現を大きく変化させないのに対して、１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現（３３ ３ｂｐのＰＣＲ生成物）を濃度に依存して増加に導くことを示している。 図１４Ｂは、ＰＶＳＭＣ内での１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現におけるサイトカ インＩＬ−４の効果について説明している。細胞をＩＬ−４とともに２４時間処 理し、図１４Ａの説明文に記載の方法に従って、１２−ＬＯ ｍＲＮＡを定量し た。ＩＬ−４もまた、ＩＬ−１βと同様に１２−ＬＯ ｍＲＮＡを増加させるこ とが明らかに認められる。 図１４Ｃは、ＰＶＳＭＣ内での１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現におけるサイトカ インＩＬ−８の影響について説明している。細胞をＩＬ−８と共に２４時間処理 し、図１４Ａの説明文に記載の方法に従って、１２−ＬＯを定量した。ＰＶＳＭ ＣのＩＬ−８による処理は、１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現を濃度依存性増加へと 導くが、内部対照であるＧＡＰＤＨの発現には変化が見られないことを、図は示 している。 図１５は、内部マーカーであるＧＡＰＤＨについて分析した同一のＲＮＡにつ いて説明している。 図１６は、ＰＶＳＭＣ内での白血球型１２−ＬＯタンパク質の発現におけるＩ Ｌ−４の効果について説明している。 図１７は、ＰＶＳＭＣ内での白血球型１２−ＬＯタンパク質の発現におけるＩ Ｌ−８の効果について説明している。 図１８は、ＰＳＭＣ内での１２−ＬＯ活性へのＩＬ−４の影響について説明し ている。 図１９は、ＰＳＭＣ内での１２−ＬＯ活性へのＩＬ−８の影響について説明し ている。 図２０は、ＩＬ−１、ＩＬ−４およびＩＬ−８によるｈｌ １２−ＬＯの亢進 調節を確認している。 ランゲルハンス島についてのこの仕事に加えて、出願者らは、ＩＬ1、ＩＬ4お よびＩＬ8が、ブタおよびヒトの大動脈平滑筋細胞内の白血球型１２−ＬＯのｍ ＲＮＡの発現を増加させうることを、ここで示した。さらに、出願者らは、１２ −ＬＯタンパク質の発現がブタの血管平滑筋内で、これらのサイトカインによっ て同様に亢進調節されるという証拠を有している。細胞を、ＤＭＥ（正常グルコ ース）内で培養し、０．２％のＢＳＡおよび０．４％の血清を含む培地内で２４ 時間、サイトカインの存在下又は非存在下で処理した。細胞内の１２−ＬＯ酵素 の活性は、ＨＰＬＣによって測定し、白血球型の１２−ＬＯタンパク質の発現は イムノブロッティングによって、そして１２−ＬＯ ｍＲＮＡは特異的逆転写酵 素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した。３種類のサイトカイ ン（２．５ｎｇ／ｍｌ）はすべて、１２−ＬＯ酵素活性の明らかな増加の原因と なり、ＩＬ−１、ＩＬ−４およびＩＬ−８に対する１２−ＨＥＴＥ ＨＰＬＣの ピークで、それぞれ５１、４３および３６％増加する。さらに、３種類のサイト カインのすべて（１−５ｎｇ／ｍｌ）は、それぞれ１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現 （３４０ｂｐ ＰＣＲ生成物）を、強い濃度依存性増加（２−５倍）へと導く。 これらのサイトカインでの処理（０．５−５ｎｇ／ｍｌ）は、また、１２−ＬＯ タンパク質（７２ｋＤ）の発現を増加へと（１．４−２．５倍）導く。さらに、 三種類のサイトカイン（２．５ｎｇ／ｍｌ）はすべて、ＰＶＳＭＣのＤＮＡの合 成を明らかに増加へと誘導することができた（ＩＬ−１、ＩＬ−４およびＩＬ− ８での3Ｈチミジンの取り込みにおいて、それぞれ１．２８±０．０８、１．６ ７±０．１１および１．３±０．０７倍の増加、ｐ＜０．０１）。 ヒトの血管平滑筋細胞（ＨＳＭＣ）もまた、ＤＭＥ（正常グルコース）内で培 養され、０．２％ＢＳＡおよび０．４％血清を含む培地内、ＩＬ1、ＩＬ4および ＩＬ8で２４時間処理された。超音波処理した細胞の細胞内１２−ＬＯ酵素の活 性をＨＰＬＣで、白血球型１２−ＬＯタンパク質の発現をイムノブロッティング で、そして１２−ＬＯ ｍＲＮＡを特異的逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ −ＰＣＲ）で、測定した。ＩＬ−１、ＩＬ−４またはＩＬ−８（５ｎｇ／ｍｌ） で２４時間、低血清培地内でＨＳＭＣを処理すると、その結果、処理していない 細胞と比較して、１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現が７−１０倍に増加した。同一実 験からのＲＮＡはまた、特異的ＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト１２−ＬＯの発現に ついても分析した。１５−ＬＯ ｍＲＮＡは、基準値またはサイトカイン追加後 のいずれにおいても認められなかった。 これらの結果から、これらの炎症性サイトカインは、ＶＳＭＣ内では分裂促進 性効果を持ち、それらは、１２−リポキシゲナーゼ経路の強力な正のレギュレー ターであることが示唆される。このように、これらのサイトカインに応答して強 められた１２−ＬＯ活比および発現は、アテローム性動脈硬化で認められたサイ トカイン誘導のＶＳＭＣの移動および増殖についての鍵となるメカニズムであろ う。図１４は、正常な（５．５ｍＭ）および上昇させた（２５ｍＭ）グルコシド 中で培養したＰＶＳＭＣ内の１２−ＬＯ ｍＲＮＡ発現へのＩＬ1、ＩＬ4および ＩＬ8の効果について示している。図１５は、内部マーカー遺伝子ＧＡＰＤＨに ついて分析した同一のＲＮＡを示しており、すべての列が同量の内部標準ＲＮＡ を持つことを示している。図１６および１７は、それぞれＩＬ4およびＩＬ6によ ってＰＶＳＭＣ内での１２−ＬＯタンパク質の発現が増加することを示し、また 、図１８および１９は、それぞれＩＬ4およびＩＬ8で処理したＰＳＭＣ内の１２ −ＬＯタンパク質の活性が選択的に増加していることを示すＨＰＬＣの自己計量 器記録を示している。図２０は、ＩＬ1、ＩＬ4およびＩＬ8が、ヒト大動脈ＳＭ Ｃ内の白血球型の１２−ＬＯを著しく亢進調節することができると言う証拠を示 している。これらの同一の実験では、出願者らは、未処理またはサイトカイン処 理のＨＳＭＣ内での１５−ＬＯの発現を証明することはできず、血管平滑筋内で のサイトカインの作用の潜在的仲介物質としての１２−ＬＯの選択的役割が証明 され た。 糖尿病Ｉ型およびII型の病因における１２−ＬＯ経路の役割 インスリン依存型糖尿病または糖尿病Ｉ型は、ランゲルハンス島内のインスリ ン生成細胞またはベータ細胞の完壁な破壊の結果起こる自己免疫病である。ＩＬ −１βのようなサイトカインは、この自己免疫の進行にかかわっていると考えら れる。 ＩＬ−１βは、ＲＩＮ−Ｍ５Ｆ細胞内では１２−ＬＯタンパク質およびｍＲＮ Ａの発現を、且つラットのランゲルハンス島では１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現を 誘導することが発見された。ＩＬ−１β（２５、５０および１００ｎｇ／ｌ）で １６時間処理されたＲＩＮ−Ｍ５Ｆ細胞は、ブタの白血球型１２−ＬＯの発現を 濃度に依存して２倍に増加させることがウエスタンブロットによって証明された 。１２−ＬＯ ｍＲＮＡ発現の付随増加は、この時点で、感受性の高い競合ＰＣ Ｒアッセイを用いて認められた。これらの転写および翻訳のイベントは、１２− ＨＥＴＥのラジオイムノアッセイによって測定した１２−ＬＯ経路の活性の増加 に平行して進行した。さらに、誘導型ー酸化窒素合成酵素（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ｉＮＯＳ）の阻害剤である Ｎ−モノメチルアルギニン（ＮＭＭＡ）（Ｎ−ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｒｇｉ ｎｉｎｅ）は、ＲＩＮ Ｍ５Ｆ細胞内のＩＬ−１βによって誘導される１２−Ｌ Ｏタンパク質の発現の、増加を阻害することができず、このことは、誘導型ー酸 化窒素（ＮＯ）に依存しない経路が存在すると言う仮説を支持する。単離された Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットランゲルハンス島を用いる別実験でもまた 、１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現および酵素活住の増加が示された。 最後に、１２−ＬＯは、ＩＬ−１βなどのサイトカインによって転写および翻 訳のレベルが調節されるβ細胞に特異的な酵素である。 図２１−２４の簡単な説明 図２１は、糖尿病ラットの膵臓ランゲルハンス島内での１２−ＬＯ ｍＲＮＡ 発現の増加を表している。 図２２は、糖尿病ＺＤＦラットの骨格筋内の１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現が、 非糖尿病ＺＤＦラットのそれより高いことを示している。ＺＤＦラットモデルは 、特発性ＮＩＤＤＭ（非インスリン依存性真性糖尿病）の卓越した動物モデルと して推薦された。 図２３は、ヒトインスリンレセプターを過剰発現するラット繊維芽細胞に関す るデータを示している。 図２４は、様々な糖尿病群でのＨＥＴＥ／ＰＧＩ2比の主な変化を表している 。 ＮＩＤＤＭは、筋肉へのグルコース輸送を誘導するインスリンの能力の減少（ インスリン耐性）および膵臓ランゲルハンス島内でのグルコースの誘導するイン スリン分泌の相対的減少と関係する遺伝的複合疾病である。 本発明のもう一つの態様と一致して、１２−ＬＯ経路の活注および発現の増加 は、１２−ＬＯ経路の封鎖がＮＩＤＤＭの発生を予防することができるように、 これら異常性の両方に共通するメディエイタとして認識される。 本供述書の原理には以下の１−５の事柄が含まれる。 １． 膵臓ランゲルハンス島および骨格筋内の白血球型１２−ＬＯの存在を証 明する関連性の高いデータ。骨格筋のデータは、新しくそして関連性が高い。ラ ットの骨格筋ＲＮＡおよびヒトランゲルハンス島ＲＮＡから得られたデータは、 ＰＣＲ分析を用いて、１２−ＬＯの発現について示している。 ２． １２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現が、やせ型非糖尿病動物から肥満型前糖尿 病動物および肥満型糖尿病動物までのラットの膵臓ランゲルハンス島で漸進的に 増加するという証拠（図２１を参照のこと）。 ３． ラットの膵臓ランゲルハンス島に外因的に加えられた１２−ＬＯ生成物 は、グルコース誘導インスリン分泌を減少させることができるというデータ（４ ５）。 ４． 尿の１２−ＨＥＴＥレベルは、やせ型ＺＤＦの非糖尿病ラットと比較し て、雄の肥満型糖尿病ＺＤＦラット（ＮＩＤＤＭモデル）では、遥かに高いと言 う、生体内データ（表２を参照のこと）。興味深いことには、表現型から見ると 、前糖尿病のヒトに似た雌の肥満型ＺＤＦラットは、尿中に中間レベルの１２− ＨＥＴＥを示す。 ５． 糖尿病のＺＤＦラットの骨格筋内での１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現は、 非糖尿病のＺＤＦラットからの骨格筋内でのレベルより著しく高いことを示すデ ータ（図２２の第１１列対第２１列）。興味深いことに、骨格筋内の１２−ＬＯ ｍＲＮＡレベルは、糖尿病になりやすいメスの肥満型ＺＤＦラットにおいてよ りも高い。この図では、３１２ｂｐのバンドは、１２−ＬＯであるが、２８１ｂ ｐのバンドは、１２−ＬＯの競合剤である。このデータは、１２−ＬＯ ｍＲＮ Ａの真の競合ＰＣＲ分析を示している。出願者らは、１２−ＬＯの発現もまた、 糖尿病の心臓組織内でより高いことを示唆するＺＤＦ心臓内のデータも、保持し ている。 この仕事に加えて、二種類のＮＩＤＤＭモデルであるＺＤＦ（Ｚｕｃｋｅｒ糖 尿病性肥満）ラットおよびＧＫ（Ｇｏｔｏ Ｋｙｏｔｏ）ラット内の１２−ＬＯ ＲＮＡおよびタンパク質の発現を、評価した。特異的定量的ポリメラーゼ鎖反 応（ＰＣＲ）アッセイは、１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現を測定するために用いら れ、そして、抗１２−ＬＯペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティングは、 １２−ＬＯタンパク質の発現を評価するために用いられた。ＮＩＤＤＭのＧＫラ ットモデルは、年齢のあったＷｉｓｔａｒ対照と比較して血中グルコース濃度の 増加を証明した（８．７±０．７対４．８±０．２ｍＭ、ｐ＜０．０１）。しか しながら、血漿インスリンおよび体重は、ＧＫラットとＷｉｓｔａｒラットの間 で同様であった。１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現は、Ｗｉｓｔａｒラットと比較し てＧＫラットからの心臓内で４倍多かった［０．４８±０．１ｘ１０5分子／μ ｇＲＮＡ（Ｗｉｓｔａｒ中）対１．９±０．４ｘ１０5（ＧＫ中），ｐ＜０．０ ２］。足底（ｓｏｌｅｕｓ）筋肉内の１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現は、Ｗｉｓｔ ａｒラットに対して、ＧＫラットでは５倍以上多かった（０．６±０．１ Ｗｉ ｓｔａｒ対３．１±０．７６ ＧＫ）。肥満型ＺＤＦラットでは、やせ型ＺＤＦ 対照と比較して、血中グルコース濃度および体重の増加が証明された（それぞれ 、５５８±７５対１７０±５ｍｇ／ｄｌ、および３９０±７対３４３±７ｇ）。 １２−ＬＯ ｍＲＮＡを、糖尿病ＺＤＦラットおよびやせ型ＺＤＦラットの心臓 、赤および白四頭筋内で分析した。１２−ＬＯ ｍＲＮＡの発現は、やせ型ＺＤ Ｆ対照と比較して糖尿病の肥満型ＺＤＦラットにおいて４−７倍に増加した。１ ２−ＬＯタンパク質の発現も同様に、やせ型ＺＤＦ対照に対して糖尿病のＺＤＦ の心臓組織で増加した（５倍）。これらのデータは、筋肉での１２−ＬＯの発現 が、ＮＩＤＤＭではやせ型ラットモデルおよび肥満型ラットモデルの両方で、著 しく増加することを表している。 ６． Ｌ6筋細胞中の１２−ＨＥＴＥ濃度は、グルコースの存在下で増加する ということを示すデータ。Ｌ6筋細胞は、インスリン作用の機序を研究するのに 用いられてきたラットからの骨格筋細胞である。Ｌ6筋細胞をキシロース（５． ５ｍＭ）中でインキュベートすると、それらは、標準グルコース（５．５ｍＭ） または高グルコース（２５ｍＭ）中の細胞と比較した場合、インスリンに対して はるかに反応性である。下記の表３は、標準グルコース（Ｒｇ）または高グルコ ース（ＨＧ）条件での培地中（ｐｇ／ｍｌ）または細胞中（ｐｇ／全細胞）のよ り高い１２−ＨＥＴＥ放出濃度を示す。したがって、１２−ＨＥＴＥなどの増加 した１２−リポキシゲナーゼ産物は、高グルコースによって引き起こされる低下 したインスリン代謝作用において重要な役割を果たすと考えられる。 ７． 選択的１２−ＬＯ阻害剤バイカラインは、グルコースに誘導されたイン スリン抵抗を妨げることができる。これらの実験を行うために、出願人らは、ヒ トインスリン受容体を含有するように遺伝子操作されたラット−１−繊維芽細胞 を高グルコース（２５ｍＭ）中で１０日間培養した。最後の２４時間は、細胞を １０-6Ｍバイカラインと一緒に培養した。顕著なバンドは、ヒトインスリン受容 体のリン酸化したβサブユニットを示す（図２３）。そのバンドが薄くなるにつ れて、それは、低下したインスリン作用を示す。列１は、列５（２５ｍＭグルコ ース）での低下したインスリン作用に対して、標準グルコース（５．５ｍＭ）中 のインスリン受容体リン酸化を示す。列６は、１２−ＬＯ経路がバイカラインで 遮断された場合の２５ｍＭグルコース中のインスリン受容体リン酸化を示し、イ ンスリン受容体リン酸化の回復を示している。 この研究に加えて、出願人らは、１２−ＨＥＴＥが、インスリンに誘導された 受容体リン酸化を直接的に阻害することを発見した。図２７で示されたように、 インスリン受容体の９７ｋＤβサブユニットのリン酸化の明らかな増加は、イン スリンが存在する場合に起こる。これは、列１（対照、非インスリン処置）に対 して、列４（インスリン処置）での９７ｋＤのより濃いバンドによって示される 。１２−ＨＥＴＥ（１０-7Ｍ濃度）は、基礎インスリン受容体リン酸化を直接的 に変化させなかった（列２）。対照的に、１２−ＨＥＴＥは、ヒトインスリン受 容体のβサブユニットのインスリンに誘導された受容体リン酸化を顕著に減少さ せた。これは、列４（１２−ＨＥＴＥ無添加）に対して、列５（１０-7Ｍ １２ −ＨＥＴＥ）での低下したバンド強度によって示される。 インスリン受容体リン酸化は、インスリン作用の初期の重要な段階の一つであ るので、これらの結果は、１２−ＬＯ経路の生産物が、低下したインスリン作用 をもたらしうることを示唆する。このデータは、１２−ＬＯ経路の増加した発現 または活性が、インスリン非依存型の糖尿病でのインスリン抵抗において重要な 役割を果たしていると考えられる。 ８． 低下したインスリン作用および血管病によってグルコース毒性の主要メ ディエイタであると考えられているグルコサミンは、平滑筋細胞での１２−ＬＯ 産物生成を増加させるということを示すデータ。インスリン抵抗をもたらす場合 のグルコサミンの役割は、最近、完全な動物で（バロン（Baron）ら，J.Clin.In vest.,96:2792-2801(1995)）および in vitro のインスリン反応性組織（例えば 、筋肉−ロビンソン（Robinson）ら，Diabetes,42:1333-46(1993)；および脂肪 −マーシャル（Marshall）ら，J.Biol.Chem.,266:4706-4712(1991)）で実証され た。更に、グルコサミンは、グルコースに誘導された血管病の主要メディエイタ であると考えられる（ダニエルズ（Daniels）ら，Mol.Endocrinol.,7:1041-1048 (1993)）。特定の理論によって拘束されたくはないが、グルコサミンは、グルコ ースを輸送するインスリン能力に関連した主要グルコース輸送体Ｇｌｕｔ４の正 常な作用を阻止することによって、インスリンに誘導されたグルコース吸収を減 少させると考えられる。 ブタ血管平滑筋細胞（ＰＶＳＭＣ）を、グルコサミン（７．５ｍＭ）の存在下 で２４時間培養した。次に、新しい培地をグルコサミン（７．５ｍＭ）と一緒に 加え、２５分間培養した。細胞および培養上清を集め、そしてＲＩＡを用いて１ ２−ＨＥＴＥを測定した。グルコサミン中で培養された細胞では、標準グルコー ス中のものと比較して、培地中への１２−ＨＥＴＥ放出の極めて大きな増加（グ ルコサミン中に放出された２０．６±３．６ｐｇ／ｍｌに対して、標準グルコー ス中の１２−ＨＥＴＥ放出６．４８±１．２ｐｇ／ｍｌ，ｎ＝４）が観察された 。更に、細胞に含まれた１２−ＨＥＴＥは、グルコサミン処理された細胞中にお いてより高かった（グルコサミン中の１２２５±１１２ｐｇに対して、標準グル コースでインキュベートした場合には７３５．９±６７ｐｇ／細胞）。これらの データは、１２−ＨＥＴＥなどの１２−ＬＯ産物が、インスリン抵抗をもたらす 重要な因子でありうることを示唆する。 ９． 高脂肪供給は、筋肉中での減少したインスリン作用および１２−ＬＯタ ンパク質発現の誘導を同時にもたらすということを示すデータ。用いられたマウ スモデルは、Ｇｌｕｔ４輸送体を過発現するトランスジェニックマウスであった （ファイザー・ファーマソイティカルズ（Pfizer Pharmaceuticals））。図２８ で分かるように、高脂肪供給は、明らかに、減少したグルコース寛容性をもたら し、それは、それら動物がインスリン抵抗であったという明らかな指標である。 図２８ａは、脂肪供給されたマウスでの経口グルコース試験曲線上のあらゆる点 で、対照の場合より高いグルコース濃度を示す。図２８ｂの棒グラフは、高脂肪 供給群において、対照の場合より有意に大きいグルコース寛容曲線下面積を示す 。 高脂肪食での４匹の動物において、心筋での１２−ＬＯタンパク質発現を評価 し、そして対照食での動物における濃度と比較した。１２−ＬＯタンパク質発現 は、１２−ＬＯペプチド抗体およびウェスタン・ブロッティングを用いて測定さ れた。そのデータの概要を以下の表４で示す。顕著な結果は、（ブロットのデン シトメーター分析を用いて）高脂肪食での動物において、はるかに高い濃度の１ ２−ＬＯタンパク質を示す。これら in vivo 結果は、増加した１２−ＬＯ発現 または活性が、インスリン抵抗をもたらす場合に重要な役割を果たすことを示唆 している。 １０． 高マグネシウム（Ｍｇ）供給は、１２−ＬＯ遺伝子発現および１２− ＨＥＴＥ濃度を減少させるということを示すデータ。Ｍｇ欠乏は、実験的および ヒトインスリン抵抗に関係していた。更に、増加した規定食Ｍｇは、ＺＤＦラッ トにおいてもヒトにおいても、減少した糖尿病発症に関係しており、そしてＭｇ 添加は、ＮＩＤＤＭのヒトにおいてインスリン応答および作用を向上させること ができる。 現在、高Ｍｇ供給は、１２−ＬＯ遺伝子発現および１２−ＨＥＴＥ濃度を顕著 に減少させることが判っている。高Ｍｇ食（１％Ｍｇ含有プリナ（Purina）５０ ０８規定食）を、ＺＤＦ肥満（糖尿病性脂肪質）雄ラットの一つの群に与え、対 照食（０．２％Ｍｇを加えたプリナ５００８）を別の群に与えた。表５で判るよ うに、高Ｍｇ供給群は、ＲＩＡ（J.Clin.Endocrin.Metab.,67:584-591(1988)お よび J.Clin.Invest.,80:1763-1769(1987)で記載された方法）によって測定した ところ、対照群より有意に低い尿中１２−ＨＥＴＥ濃度を有した。高Ｍｇ供給は また、糖尿病ＺＤＦラットからの筋肉での１２−ＬＯ ｍＲＮＡ発現を減少させ た。 値は平均±ＳＥである。ｎはラット数である。ＺＤＦ痩せ型群および高マグネ シウム食でのＺＤＦ肥満型群の値は、それぞれaｐ＜０．００１およびbｐ＜０． ０５でＺＤＦ肥満型群とは異なる。 １１． ヒトのデータは、ＮＩＤＤＭの人々において、増加した尿中１２−Ｈ ＥＴＥ濃度を示す。１２−ＨＥＴＥ濃度は、タンパク尿の徴候を示した糖尿病患 者において特に高い。これらの結果は、１２−ＬＯ活性化が、糖尿病の場合の腎 疾患に関与しうることを示唆している。 糖尿病の動物およびヒトからの血管組織は、正常とは異なってアラキドン酸を 代謝する。ＰＧＩ2は、血管拡張薬、抗血栓薬およびレニン分泌促進薬であるが 、１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）は、前炎症性であ り且つシクロオキシゲナーゼ（ＣＯ）を阻害する。出願人らは、初めに、低レニ ン血症性低アルドステロン症（ＨＨ）の糖尿病患者でのプロスタサイクリン（Ｐ ＧＩ2）欠乏を報告した（４６）。出願人らは、ＣＯ産物、ＰＧＩ2およびリポキ シゲナーゼ（ＬＯ）産物、正常な腎機能（ＮＲ）を有するＮＩＤＤＭ患者での１ ２−ＨＥＴＥ、ミクロアルブミン尿症（ＭｉＡ）、マクロアルブミン尿症（Ｍａ Ａ） およびＨＨ患者でのそれらの生産を調べた。ＰＧＩ2（６ケトＰＧＦ1）および１ ２−ＨＥＴＥは、ＨＰＬＣに続いて、公表された方法を用いるＲＩＡによって尿 中で測定された。結果は、次の通りである。 ≠ 予め貯蔵された試料から採取 * 対照に対してｐ＜０．０１ ** 糖尿病患者に対してｐ＜０．０５ このデータは、（１）１２−ＬＯ産物１２−ＨＥＴＥの増加が、腎疾患と共に 進行する全てのＮＩＤＤＭで見られる；（２）アルブミン尿症を伴う糖尿病性腎 疾患は、ＰＧＩ2生産の抑制に関係している；および（３）ＨＨは、ＰＧＩ2抑制 および１２−ＨＥＴＥ過剰の障害であるということを示唆している。 出願人の更に別の実験は、様々な程度の糖尿病性腎関与がある患者でのＰＧＩ2 および１２−ＨＥＴＥ両方の尿中（腎血管）生産を測定した。 クレアチニンクリアランスおよび尿中アルブミン測定値に基づく正常な腎機能 を有するＮＩＤＤＭ患者の群において、ＰＧＩ2排出は、正常な対照と異なって いなかった。ミクロアルブミン尿症の群は、高血圧および正常血圧を有するもの に分けられた。しかしながら、ＰＧＩ2排出の差は認められなかった。それにも かかわらず、ミクロアルブミン尿症群は、有意により低いＰＧＩ2排出速度を有 した。マクロアルブミン尿症および低下したクレアチニンクリアランスを有する 患者は、同様に、ＰＧＩ2排出を減少させた。ＰＧＩ2排出速度は、マクロアルブ ミン尿症およびＨＨ群において低下した。 １２−ＨＥＴＥ値は、正常な対照と比較して、ミクロアルブミン尿症のあるま たはないＮＩＤＤＭ患者において顕著に増加した。１２−ＨＥＴＥ排出値はまた 、マクロアルブミン尿症群でもＨＨ群でも有意に増加した。 低用量カルシウム注入は、従来、ＰＧＩ2を、おそらくは組織ホスホリパーゼ の活性化によって増加させることが示されている。グルコン酸カルシウムの３時 間注入を正常対象に投与した場合、ＰＧＩ2および１２−ＨＥＴＥが両方とも極 めて有意に増加した。しかしながら、ミクロアルブミン尿症のあるＮＩＤＤＭ患 者に投与した場合、ＰＧＩ2の増加はなかったが、既に増加した１２−ＨＥＴＥ 値が更に刺激された。これは、ＮＩＤＤＭではプロスタサイクリン形成に欠陥が あるという概念を支持する。 １２−ＨＥＴＥ／ＰＧＩ2比率は、ＮＩＤＤＭの場合に、ＬＯ／ＣＯ経路の変 化が存在するかどうかを確認するための更に別のアプローチとして計算された。 図２４で示されたように、全ての糖尿病群においてＨＥＴＥ／ＰＧＩ2比率に大 きな変化が存在する。平均値は、正常な腎機能を有するＮＩＤＤＭ患者において 有意に増加し、そしてマクロアルブミン尿症のある患者およびＨＨ患者では更に 変化する。しかしながら、これらの違いは、各群内の変動のために、ＮＩＤＤＭ 群間では有意の差がなかった。 出願人らデータは、混乱したエイコサノイド排出値の原因として、腎機能自体 、ＧＦＲまたは高血圧を除外すると考えられる。尿中のＰＧＩ2および１２−Ｈ ＥＴＥの由来は充分に確定されていないが、腎外ＣＯ阻害剤並びに全身注射後の 微量のＰＧＩ2および１２／１５−ＨＥＴＥの排出の不足を用いる実験は、腎臓 が尿中のこれら化合物の主要源であることを示唆する（４７〜４９）。ＨＥＴＥ は、血管組織中でも炎症細胞からも生じることができる。（５０〜５１）。しか しながら、初期の糸球体および血管病を有するＮＩＤＤＭでは、腎臓中へのマク ロファージ／白血球浸潤の徴候がない。 初めの方で引用された in vitro および動物モデル実験に一致して、出願人ら 結果は、真性糖尿病の初期には、糖尿病性腎血管／糸球体病と共に低い値になる 一定のプロスタサイクリン生産が存在することを示唆する。これは、ＬＯ産物１ ２−ＨＥＴＥが、ミクロアルブミン尿症の発症前の真性糖尿病の初期に増加する 状況で起こる。これらの知見は、ＨＥＴＥが、分裂促進性前炎症性、血管収縮性 であり、しかも血管形成を刺激するので、糖尿病性血管病の病因においてかなり 重要でありうる（５２〜５３）。ＨＨ症候群に関して、出願人ら新規データは、 増加したＨＥＴＥ生産が、ＰＧＩ2形成並びにレニン生合成および分泌を抑制す る場合の初期の異常でありうることを示唆する。血管病を説明する糖尿病の病因 は知られていない。しかしながら、最近の研究は、高血糖自体が、プロテインキ ナーゼＣによって増加したエイコサノイド生成、およびＡＡ放出の主メディエイ タであるカルシウム依存性ホスホリパーゼの活性化を含めた多数の代謝結果を有 することを示唆している。 要約すると、原因であれ作用であれ、糖尿病での極めて初期の腎関与が、血管 毒性リポキシゲナーゼ産物１２−ＨＥＴＥの増加と共に、一定のまたは抑制され たプロスタサイクリン生産に関係している。この結論は、ここで、in vitro 実 験でもヒトでの in vivo 実験でも示唆される。これは、この混乱を阻止するた めの糖尿病状態の初期の薬理学的介入を示唆する。 ヒト大動脈内皮細胞に対するグルコースに誘導された単球結合 における１２−リポキシゲナーゼ産物の役割 アテローム性動脈硬化症の速度は、真性糖尿病（ＤＭ）のヒトにおいて促進さ れる。出願人らは、最近、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の高グルコース（Ｈ Ｇ）暴露が、単球（ＭＯ）結合を選択的に増加させるが、好中球結合は増加させ ないことを公表した（５６）。ＥＣに対するＨＧ暴露は、アラキドン酸（ＡＡ） 放出およびリポキシゲナーゼ（ＬＯ）生産形成を増加させることができる。最近 の研究において、出願人らは、ＨＡＥＣに対するＭＯ結合における１２−および １５−ＬＯ産物の役割を評価した。２継代のＨＡＥＣのＨＧ（２５ｍＭ）中の培 養物は、５．５ｍＭグルコース中で維持された細胞と比較して、ＭＯ結合を増加 させた（細胞１１１±７個に対して、２３９±３０個／ＨＧ場、ｐ＜０．０５） 。１２−ＬＯ経路の阻害剤フェニドン（１０-6Ｍ）（ＨＧに誘導された結合の５ ０ ％阻害、ｐ＜０．０５）。ＨＡＥＣのＨＧ培養物は、出願人らＨＰＬＣおよびＲ ＩＡ法を用いると、１２−および１５−ヒドロキシエイコサトリエン酸（ＨＥＴ Ｅ）Ｌ）両方を有意に増加させた。５．５ｍＭグルコース中で培養されたＨＡＥ Ｃに対して加えられた１２（Ｓ）−ＨＥＴＥは、ＭＯ結合を増加させた（細胞１ １４±４個 １０-10Ｍ１２−ＨＥＴＥに対して、６６±６個／場対照、ｐ＜０ ．０１）。もう一つの新規な１２−ＬＯ産物１２（Ｒ）−ヒドロキシエイコサト リエン酸は一層強力であり、１０-11および１０-12ＭでＭＯ結合に対する作用を 示した。対照的に、１０-6〜１０-12Ｍの範囲の濃度で加えられた１５（Ｓ）− ＨＥＴＥは、ＨＡＥＣに対するＭＯ結合を刺激しなかった。要約すると、（１） 高グルコースはＨＡＥＣに対するＭＯ結合を増加させ、そしてこの作用は、ＬＯ 経路の遮断によって減少することができ；（２）１５ではなく１２−ＬＯ産物が ＭＯ結合を増加させることができる。白血球型１２−ＬＯは、ＨＡＥＣで発現さ れるので、これらの結果は、ヒト内皮に対するグルコースに誘導されたＭＯ結合 における１２−ＬＯ活性の役割を支持する。 出願人らはまた、高脂肪「カフェテリア」食が、ラット心臓において白血球１ ２−ＬＯを増加させることおよび糖尿病（ＧＫ）ラットが正常（ウィスター（Wi star）動物と比較して、より高い心臓中１２−ＬＯを有することを実証した（図 ２５および２６を参照されたい）。 診断検定 ＰＣＴ出願／ＵＳ 94/00089 は、ｈｌ １２−ＬＯまたはＨＥＴＥ若しくは１ ２−ＨＰＥＴＥなどのその経路産物が病因物質である疾患状態を発症する危険が ある患者において、抗体が循環するであろうということを報告する。したがって 、本発明のもう一つの態様は、ｈｌ １２−ＬＯタンパク質またはＨＥＴＥなど の関連物質を免疫原として用いる、例えばＥＬＩＳＡ型の検定を包含する。この ような試験は、ｈｌ １２−ＬＯの活性化または発現によって媒介されたいずれ の疾患状態をも診断するのに有用である。 文献一覧 １． Geisterfer，A.A.，et al.，Circ ．Res.（1988）62:749-756． ２． Izumi，T.，et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA（1990）87:7477-7481 ． ３． Gu，J.，et al.，Endocrinology（1994）143:70-77． ４． Samuelsson，B.，Science（1987）237:1171-1176． ５． Sparrow，C.P.，et al.，J ．Lipid Res.（1988）29:745-753． ６． Steinberg，D.，New Eng ．J．Med.（1989）320:915-924． ７． Berk，B.C.，Hypertension（1989）13:305-314． ８． Schwartz，S.M.，Physiol ．Rev.（1990）70:1177-1209． ９． Nakao，J.，et al.，Atherosclerosis（1982）44:339-342． 10． Natarajan，R.，et al.，J ．Clin．Endocrinol．Metab.（1988）67:584-5 91． 11． Nadler，J.L.，et al.，J ．Clin．Invest.（1987）80:1763-1769． 12． Natarajan，R.，et al.，Endocrinology（1992）131:1174-1180． 13． Funk，c.D.，et al.，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA（1990）87:5638-5642 ． 14． Yoshimoto，T.，et 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No. 08 / 434,681, filed in US Pat. (Filed on May 5, 1995).                               Government affidavit   The present invention relates to the National Institute of Health (the National Institutes of Health). s of Health) Authorization No. DK39721 RO1 with Government Assistance It was conducted. The government has certain rights in the invention.                                 Technical field   The present invention relates to human leukocyte-type 12-LO and some of its major disease states. Related to its role in pathogenesis.                                   Abbreviation AA = arachidonic acid                     (Arachidonic acid) AII = Angiotensin II                     (Angiotensin II) EGF = epidermal growth factor                     (Epidermal Growth Factor) FN = fibronectin                     (Fibrontin) GAPDH = glyceraldehyde-3-phosphate desedrogenase                     (Glyceraldehyde-3-                       phosphate dehydrogenase) GF = growth factor                     (Growth Factor) HAEC = human aortic endothelial cells                     (Human Aortic Endothelial                       Cells) HETE = hydroxyeicosatetraenoic acid                     (Hydroxyeicosatratenoic                       Acid) 12HETE = 12-hydroxyeicosatetraenoic acid                     (12-Hydroxyeicosa-                       tetranoic Acid) HG = high glucose                     (High Glucose) hl 12-LO = human leukocyte 12-lipoxygenase                     (Human Leukocyte                       12-Lipoxygenase) hl 15-LO = human leukocyte 15-lipoxygenase                     (Human Leukocyte                       15-Lipoxygenase) HODE = hydroxyoctadecadienoic acid                     (Hydroxyoctadecadienenoic                       acid) 12-HPETE = 12-hydroperoxyeicosatetraenoic acid                     (12-hydroxyoxyeicosa-                       tetranoic Acid) HSMC = human aortic smooth muscle cells                     (Human Aortic Smooth                       Muscle Cells) HPLC = High pressure liquid chromatography                     (High Pressure Liquid                       Chromatography) IL-1 = interleukin-1                     (Interleukin-1) LDL = low density lipoprotein                     (Low Density Lipoprotein) LO = lipoxygenase                     (Lipoxygenase) 12-LO = 12-lipoxygenase                     (12-Lipoxygenase) 15-LO = 15-lipoxygenase                     (15-Lipoxygenase) MAPK = mitogen-activated kinase                     (Mitogen Activated Kinase) mmLDL = minimally modified low density lipoprotein                     (Minimally Modified Low                       Density Lipoprotein) MO = monocyte                     (Monocycles) NIDDM = non-insulin dependent diabetes                     (Non-insulin Dependent                       Diabetes Mellitus) NG = normal glucose                     (Normal Glucose) PDGF = platelet-derived growth factor                     (Platelet Derived Growth                       Factor) PKC = protein kinase C                     (Protein Kinase C) pl 12-LO = human platelet 12-lipoxygenase                     (Human platelet                       12-Lipoxygenase) PVSMC = porcine vascular smooth muscle cells                     (Porcine Vascular Smooth                       Muscle Cells) RT-PCR = reverse transcriptase polymerase chain reaction                     (Reverse Transcriptase                     Polymerase Chain Reaction) SMC = smooth muscle cell                     (Smooth Muscle Cells) TGFB = transforming growth factor beta                     (Transforming Growth                       Factor Beta) TNF = tumor necrosis factor 1                     (Tumor Necrosis Factor 1) VSMC = vascular smooth muscle cells                     (Vascual Smooth Muscle                       Cells)                                Background of the Invention   Three mammalian lipoxygenases oxygenate arachidonic acid (4) It is named by the position of the carbon (1, 2 or 3). Certain LO enzymes are Inducing oxidation of LDL to its atherogenic form (5,6), and smooth muscle Atherosclerosis by increasing cell proliferation or migration (1,7-9) There is increasing evidence that it causes and promotes atherosclerosis. further From evidence, the 12-LO protein is angiotensin II (AII) -induced blood tube And play a role in mediating adrenal activity (10-12). Recent studies have shown that at least two types of 12-LO: human erythroleukemia cells or Pl12-LO (2,13) cloned from E. coli, and; porcine mononuclear cells; Clones isolated from the pituitary gland (14) and bovine tracheal cells (15) It is shown that the leukocyte 12-LO: is present.   Applicants have shown that leukocyte-type 12-LO is present in human adrenal gland stroma cells. (3). Human 15-LO was purified from human and rabbit reticulocytes ( 16, 17). Human platelet 42-LO and porcine leukocyte 12-LO are 65% Share amino acid homology (13). However, pig leukocyte-type 12-LO Has a high homology with human 15-LO (86%) (14). Recently, 15-LO Is expressed in macrophages of human atherosclerotic lesions, It was shown not to be expressed in unstimulated monocytes (18).                                Summary of the Invention   The present application relates to the presence of the human leukocyte-type 12-LO enzyme (hl 12-LO), as well as Atherosclerosis, breast cancer, autoimmune and inflammatory diseases, diabetic blood Several major diseases, including ductal and diabetic kidney disease and insulin resistance Evidence for its role in the etiology or progression of the condition is described. This uny Enzymes are able to combine several apparently different symptoms Has features.   1. hl12-LO uses arachidonic acid and linoleic acid as fatty acids as substrates Used to activate important signal transduction pathways commonly associated with these diseases To produce hydroperoxides and other lipid mediators Can be These mediators include (a) protein kinase C and Kinases, such as certain isomers of mitogen-activated kinase (MAPK), (B) inflammatory and autoimmune diseases, atherosclerosis, cancer growth and transformation Includes transcription factors such as NFkB and oncogenes that are clearly involved in translocation It is.   2. When the hl 12-LO enzyme is activated, it itself becomes lipid and protein K Guiding the propagation of free radical processes that can promote oxidative modification of quality Can be formed. These processes Includes the etiology of inflammatory, neoplastic, and atherogenic conditions.   3. The hl 12-LO enzyme is strategically located. Human monocytes, aortic blood Ductal smooth muscle and endothelial cells, cardiomyocytes, skeletal muscle, kidney and breast cancer cells, and Evidence exists for the presence of leukocyte type 12-LO in beta cells of the islets of Gelhans You. These sites of activity for this enzyme play a tissue-specific role in leading to pathological conditions Fulfill. For example, in islet beta cells, proinflammatory cytokines (eg, For example, activation of 12-LO living by IL-1) causes pancreatic beta cells Or explain that insulin-producing cells are selectively impaired and destroyed. I was able to. Still further, the 12-LO pathway by beta intracellular glucose When is activated or its expression is increased, a type (in Explain that insulin secretion dysfunction in non-surin dependent diabetes I was able to.   4. Factors that increase 12-LO expression and activity include inflammatory, atherogenic Associated with atherosclerosis, kidney and neoplastic disease.   Factors demonstrating live injection and increased expression of 12-LO include (a) autoimmunity Disease (diabetic type I) interrogation associated with atherosclerosis and tumor growth Inflammatory cytokines such as Ikin-1β (IL-1), (b) vascular and kidney Growth factors such as platelet-derived growth factor (PDGF), Angiotensin II (AII), and (c) microvessels (eyes, kidneys and nerves) and Type I and type II diabetic complications of heart and microvasculature (heart attack, stroke and peripheral vascular disease) Hyperglycemia, which is associated with the disease.   5. Applicants found that in all of the tissues tested, acquired Glucose responsible for insulin resistance increases 12-LO activity and expression I found it to be. Therefore, the activation of 12-LO is mediated by glucose-induced oxidation. Provides a general link between stress and the occurrence of terminal dysfunction or injury We were able to.   According to the present invention, blockade of expression of hl 12-LO or activation of the enzyme Novel therapies for preventing these disease states are provided.         Identification of 12-LO within normal HSMC, HAEC and MO   Applicants have shown that unstimulated human aortic smooth muscle cells (HSMC), endothelial cells The detailed types of LO present in (HAEC) and monocytes (MO) were evaluated here. Was. Furthermore, AII increases the expression of 12-LO in human adrenal cells Applicants are also involved in controlling the 12-LO within the HSMC. The effect of AII was also evaluated. Eventually, applicants will find that atherosclerosis Immunohistochemical analysis of lesions demonstrates the presence of leukocyte-type 12-LO It was decided about the country. 12-L similar to that found in the human adrenal globular layer The results show that O is expressed in normal HSMC, HAEC and MO. Was done. Furthermore, this 12-LO is markedly upregulated by HS in HSMC. It is nodular and is also present in human atherosclerotic lesions.                        Brief description of FIGS. 1 to 7   1A and 1B show leukocyte 12-LO in HAEC, HSMC and MO. Describes RT-PCR analysis of RNA. FIG. 1A shows leukocyte specific The RNA sample amplified for 40 cycles with the 12-LO primer is shown. The membrane was hybridized with a porcine leukocyte 12-LO oligonucleotide probe. I let you. The first row is the marker, and the second, fifth and eighth rows are the negatives without template. The third column shows total RNA from HAEC as porcine leukocytes. The amplification was carried out with the addition of the 12-LO primer. This was done with the addition of an immer. Column 6 is the porcine leukocyte 12-LO primer. Shows total RNA from HSMC performed with the addition of a GAPDH primer. It was done by adding a marker. The ninth column shows the total RNA from the MO as porcine leukocytes. The results obtained by adding and adding the 12-LO primer are shown. Column 10 shows the GAPDH program Column 11 shows pig white blood cells 12-LOc. This is a positive control using DNA.   FIG. 1B shows that the human-specific 15-LO primer was added and amplified for 40 cycles. Shown for the same RNA sample. The membrane is made of human 15-LO oligonucleo Hybridized with Pide. Amplification of 15-LO cDNA (positive control (Roll), only the product of 333 base pairs is shown.   FIG. 2 shows leukocyte 12-LO protein in normal HAEC, HSMC and MO. 9 illustrates the expression of quality (72 kD). Details from HAEC, HSMC and MO The cytoplasmic fraction was electrophoresed with standard porcine 12-LO protein and Estane immunoblotting was performed.   FIG. 3A illustrates the effect of AII on the release of 12-HETE by HSMC. Clear. HSMC were grown to confluence. Remove the serum Cells were cultured in medium 19 containing 0.4% calf serum (FBS) and 0.2% BSA. 9, and incubated for 18 hours. Thereafter, the cells were washed with DME medium, and . Incubation was performed for 20 minutes in a DME culture medium containing 2% BSA. 10-9And And 10-8At a concentration of mol / L, AII was added to the cells for 5 and 10 minutes. Culture The nutrient solution was collected for the HETE assay.* p <0.05 vs control (n = 4)   FIG. 3B shows the effect of AII on cell-associated 12-HETE levels in HSMC. Has been explained. After collecting the supernatant, the cells are washed with ice-cold PBS and further washed. In order to perform cell-related HETE assay, scrapin g).* p <0.02 vs control (n = 4)   4A and 4B show leukocyte 12-LO protein by AII in HSMC. Control of expression is described. FIG. 4A is an immunoblo showing the control by AII. It is. FIG. 4B is a bar graph representation of the densitometer analysis of the immunoblot in FIG. 4A. It is. Cells are grown in medium 199 containing 20% FBS and 0.4% FBS For 24 hours by placing in medium 199 containing and 0.2% BSA. Was depleted. Concentration 2 × 10-7The cells were treated with mol / l AII for 24 to 48 hours. I understood. Cells were washed with PBS and collected by scraping. Cell pellet The cells were lysed and the cytoplasmic fraction was electrophoresed.   5A and 5B illustrate the control of leukocyte 12-LO by AII in HSMC. The description is made using RT-PCR. FIG. 5A shows a 12-LO oligonucleotide. It is an autoradiogram of the blot hybridized with the reotide probe. FIG. 5B is an agarose gel stained with ethidium bromide. Total RNA is AII (2x10-7mol / l) for a different serum time Extracted from incubated HSMC. The RNA sample was leukocyte 12- Forty cycles were amplified with LO or GAPDH primers.   FIGS. 6A and 6B show an infra-knee amputee of a patient with extensive atherosclerosis. The micrograph of the histological section of the obtained artery is shown. Avidin-biotin complex Using immunohistochemistry techniques, 12-LO was purified using purified specific rabbit antiserum. Detected. Intensely stained endothelial cells (arrowheads), present in thickened endothelium The cells (small arrows) and to a lesser extent smooth muscle cells (large arrows) 6A. Rabbit serum before immunization was used as a negative control at the same concentration. (FIG. 6B) (x200 magnification).   Figures 7A and 7B show human coronary with antibodies against 12-lipoxygenase. Figure 3 shows immunostaining of arterial lesions. 12-LO antibody (FIG. 7A) or pre-immune anti-blood Advanced atherosclerotic plaque reacted with any of Qing (FIG. 7B) Transection of human left coronary artery with (note cholesterol crystals in core region) Show a piece. The darkest-stained immunoreactivity is in the outer vascular membrane associated with perivascular cells. Can be seen. Intermediate smooth muscle cells are also immunoreactive. Brighter immunoreactivity , Found in intimal cells in plaque and non-plaque areas.                                 experimental method   Lipoxygenase (LO) pathway induces accelerated atherosclerosis Are involved in Accuracy of 12-LO expressed in Langerhans islets The different types are described in the application PCT / US94 / 00889. In this application, Similar type of hl12-LO, unstimulated human aortic smooth muscle cells (HSMC), endothelial cells (HAEC) and monocytes (MO). Testify. In this study, a specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT- PCR) using normal HSMC, HAEC and LO expressed in MO. The type of mRNA was analyzed. Primers and primers specific for leukocyte-type 12-LO With lobes, a 333 bp band appears in all three cell types. Among these cell types, leukocyte type 12-LO type leukocytes were expressed. It was suggested that Polyclonal peptide against leukocyte-type 12-LO Western immunoassay for HSMC, HAEC and MO cultured using antibodies No blotting analysis showed that the specific mass was the same as the molecular weight of leukocyte-type 12-LO. A 72 kD band. Angiotensin II (AII) for normal HSMC Increased the activity and expression of 12-LO. Atherosclerosis Immunohistochemical analysis of the variant also showed the presence of leukocyte-type 12-LO. these The results show that leukocyte-type 12-LO RNA was found in HSMC, HAEC and MO. Is expressed. AII is the activity of 12-LO in HSMC. Upregulates sex and expression and supports the role of this 12-LO pathway in human vascular disease I do.   1. Cells and culture   HAEC and HSMC are the heart donors in the UCLA heart transplant program From aortic specimens obtained from HAEC at passages 5-9 and passages 3-7 HSMC was used. HAEC is an EC growth adjuvant (growth suppl). ) (20 mg / ml) and heparin (90 μg / ml) The cells were grown in medium 199 containing 20% FBS. HAEC is their typical Cobblestone morphology, presence of Factor VIII-related antigens, and 1,1'-dithioperchlorate Cutadecyl-1-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo-carbocyanine ( By incorporation of acetylated LDL labeled with (Dil-acetyl-LDL), Identified (19). HSMC were grown in medium 199 containing 20% FBS. And morphologically and immunohistochemically (HHF 35 and subsequently visualized by a fluorescently labeled secondary antibody or biotin. -Streptavidin complex immunoperoxidase system for visualization (20). Monocytes are converted to healthy cells by the method of Modification of Recalde. Obtained from Nah's large pool (21).   The HSMC and HAEC monolayer cells were washed twice with ice-cold PBS, and then washed. After, to perform RNA extraction or Western analysis according to the method described below Processed. To perform a hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE) assay Approximately 24 hours before the experiment, the culture was supplemented with 0.4% FBS and 0.2% BSA. Medium 199 containing the medium.   2. cDNA   Recombinant Bluescript plasmid containing cDNA for human reticulocyte 15-LO Sumid is available from E.I. Dr. Sigal (Syntex Co., Palo Alto, (CA) courtesy of: PUC containing porcine leukocyte 12-LO cDNA The 19 plasmid was obtained according to the method described above (14). Human platelet 12-L The Bluescript plasmid containing the cDNA for O was from Bengt Samu. Professor Elson (Karolinska Institute, Stockholm) lm, Sweden) (2).   3. Oligonucleotide primers and probes for PCR   βTwo-Macroglobulin oligonucleotides are available from Perrin White Expo (Cornell University Medical College) , New York, NY). Human glyceralde Hyd-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) oligonucleotide Other oligonucleotides, including Applied Biosystems (Foster City, CA) DNA synthesizer. Purified by rilamide gel electrophoresis. The oligonucleotide sequences are shown in Table 1. These are based on known gene sequences (2, 14, 22, 23). And the regions that show the most differences between the sequences of pig 12-LO and 15-LO. Selected from region (13).   4. Amplification of reverse transcribed RNA using polymerase chain reaction (RT-PCR)   Total RNA from cultured HSMC, HAEC and fresh MO was from RNAzo l (Cinna / Biotecx Laboratories International) Tional Inc. , Texas) using guanidium thiocyanate- Extracted with phenol-chloroform. Some RNA samples are Treated with lyase-free DNase. 3 μmg of total RNA was Buffer (10 mmol / l Tris-HCl, pH 8.3, 50 mmol / l l KCl, 1.5 mmol / l MgClTwo, And 0.001% gelatin) , 4 deoxynucleotide triphosphates of 200 μmol / l each , 25 pmol each of 5'- and 3'-primers, 2U avidin bone marrow Blast virus reverse transcriptase (20 U / μl, Life Sciences, St. , Petersburg, FL) and 2.5 U of Taq polymerase (Per Kin Elmer Cetus, Norwalk, CT) and a final volume of 50 The mixture was mixed to a volume of μl. In some reactions, βTwoMicroglobulin or Are 5'- and 3'-primers of GAPDH, each 5 pmol, internal standard Added as standard. To continue the RT reaction, heat the sample at 37 ° C. Placed in the clar for 8 minutes. The conditions used for the subsequent PCR were 1 minute at 94 ° C. During the denaturation step, annealing at 50 ° C for 2 minutes, and extension at 72 ° C for 2 minutes. The length was run for 24-40 cycles. The blank reaction without addition of RNA template And it was done through the PCR step. Human 15-LO cDNA, porcine leukocyte Amplification of the 12-LO cDNA of human platelets and the 12-LO cDNA of human platelets 4 deoxynucleotide trisphosphates of 200 μmol / l each , 25 pmol of 5'- and 3'-primers, and 2.5 U of Taq poly Mix 2-5 ng of cDNA plasmid in a 50 μl volume containing merase. And made by. The PCR conditions were the same as those described above.   5. Gel analysis and blot hybridization   Aliquot 20 μl from the PCR product and place in Tris acetate EDTA buffer . Electrophoresis was performed on an 8% agarose gel. Stain with ethidium bromide After taking a photo, the gel was Zeta-pumped by capillary blotting. B The membrane was transferred onto a membrane (Bio-Rad, Richmond, CA). As a probe The oligonucleotide used was [γ32P] ATP and T4 polynucleotide Kinase (New England Biolabs, Beverly, MA) Is used to label the 5'-end, and 6xSSC (0.15mo for 1xSSC) l / l NaCl, 0.015 mol / l sodium citrate). Hybridized with membrane in 5% nonfat dry milk and 7% SDS at 42 ° C. overnight. I let you. The membrane was grown once in 6 × SSC at room temperature for 15 minutes, then at 60 ° C. for 15 minutes Once. The wash conditions were the PCR products from the porcine leukocyte 12-LO. Have been devised to identify the human 15-LO PCR product. (3) The membrane X-ray film (Eastma) from Kodak at −70 ° C. n Kodak Co. , Rochester, NY). The blot is Quantification was performed using a computerized video densitometer.   6. Western immunoblotting   The cell pellet was PBS (pH 7.3), 1% Triton X-100, 1 mmol / l phenylmethylsulfonyl fluoride, 50 μmol / l leupe Lysis buffer containing putin and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) In the gel. Lysate was centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes . A portion of the supernatant (cytoplasm) is taken for protein evaluation and the rest is It was kept at -70 ° C for tan blotting analysis.   According to the method of Laemmli, SDS polyacrylamide gel electrophoresis (1 (0% electrophoresis gel, 4% concentration gel) (24). Western Blottin In gels, the gel was transferred to a transfer buffer (35 mmol / l Tris base, 192 m mol / l glycine and 20% methanol, pH 8.3) , Semi-dry polyblot apparatus (A) according to the method described in Towbin et al. American Bionetics, Inc. , Emeryville, CA ) For 40 minutes in nitrocellulose (Hybond, Amersham, Arl). inton Heights, IL). Non-specific sites at 4 ° C In the evening, it was blocked with PBS containing 10% FCS. Then, the membrane was washed with PBST (PB S + 0.05% Tween-20) twice, further with 1% BSA and 2% 0% (Volume / volume) In PBST with FCS, incubate with primary antibody for 2 hours at room temperature. Cubbed. Sequence of amino acids 646-662 of the 12-LO sequence of porcine leukocytes A polyclonal antibody against the porcine 12-LO peptide was used. This antiserum was used at a dilution of 1: 100. In some studies, E. S courtesy of Dr. igal (Syntex Co., Palo Alto, CA) A polyclonal antibody against human 15-LO provided by us was used. Wash The membrane was then washed with alkaline phosphatase (1: 5000; Promega, M. adison, WI) with a secondary antibody (goat anti-rabbit) conjugated for 1 hour. Incubated. Detection is performed using the substrate mixture [Nitroblue] Tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate ( Promega)] or by a CSPD substrate and wafer. Stan-Light chemiluminescence detection system (Trop ix, Inc. , Bedford, MA) by chemiluminescence I went in. Non-specific binding was assessed using normal rabbit serum. Western Blots were run on a computerized video densitometer (Applied   Imaging, Santa Clara, CA; Lynx DNA v quantification using the standard method and the values are given as arbitrary absorbance units .   7. Measurement of 12-LO product   These assays were performed using previously reported methods (10, 11). Briefly, 12- and 15-HETE are more likely than supernatants and cells to C1 8 mini columns (Analytichem International, CA) And, furthermore, we have enabled reversed phase density gradient HPLC and (R IA) was measured using the method.   8. Measurement of lipoxygenase activity in HSMC   The confluent HSMC was cultured for 24 hours before the experiment with the culture solution + 10% FCS. I left it inside. Cells are collected, washed and 1 ml of Tris-HCl buffer (25 mmol / l, pH 7.7) and sonicated on ice. . The assay mixture contains 800 μl of enzyme (sonication), 1.0 ml in 1.0 ml. 0 μl CaClTwo(1.5 mmol / l) and 50 μl of glutathione (0. 5 mmol / l). An enzyme blank was also reacted at the same time. The reaction is 5 0 μl of sodium arachidonic acid (160 μmol / l, NuCheck P rep, Elysin, MN) or 0.25 μCi14[C] Linoleic acid (N ew England Nuclear) was added and started at 37 ° C. 10 After incubation for 2 minutes, the reaction is performed with 2 ml of isopropanol / 1.2% vinegar. The reaction was stopped by adding the acid followed by 2 ml of chloroform. Filter the lower organic layer, HPLC using the applicant's density gradient reverse phase HPLC system (10, 11). Performed to detect HODEs or HETEs. The peak of 12-HEPE is 2 Identified by 37 nm UV detection and co-migration with standard (retention time 18.3 min) Was done. The peak height was determined using a Shimazu CR5A integrator. And quantified. Is a radioactive linoleic acid metabolite14[C] To identify HODEs The release in the co-migrating fraction with the same retention time as standard non-radioactive HODEs Emission was quantified. In this HPLC system, 9- and 13-HODE are both Both have the same retention time (17.9 minutes).   9. Immunohistochemistry   The immunohistochemistry used was as described above (26). Simply put, peripheral blood Crown showing lower limb or atherosclerotic plaque amputated due to duct disease A 5-micron section of a tissue sample taken from the aortic artery was Nopropyltriethoxysilane, Sigma, St. Louis, MO) And dried overnight at 60 ° C. Deparaffinization and deparaffinization After water, they are placed in a 10 mmol / l citrate buffer solution (pH 6.0). And boiled twice in a microwave for 5 minutes each. After cooling, cut the sections with distilled water. Washed twice. Incubation for 20 minutes in 1% hydrogen peroxide / methanol Later, slides were washed twice with distilled water and twice with phosphate buffered saline (PBS). , Washed. This was followed by a normal horse serum 1:20 in PBS (Vector   Labs). After decanting, the sections were purified with rabbit peptide anti-white. Covered with blood cell 12-lipoxygenase antiserum (1: 1000 dilution) and Incubated overnight at room temperature in the vessel. After washing twice with PBS, a 1: 600 dilution Bi Otinylated anti-rabbit IgG (Elite kit, Vector Labs, (Burlingame, CA) and incubate the slides for 40 minutes. Was. After washing twice more in PBS, a 1: 200 dilution of AB complex solution (Elit The sections were incubated for an additional 40 minutes in an e kit, Vector Labs). I did it. The sections were then placed in a diaminobenzidine solution for 7 minutes for color development. Exposed. After two additional washes, sections were incubated in 1% copper sulfate for 5 minutes By doing so, color development was enhanced. All steps were performed using an automatic dyeing machine (Techmate   1000, Biotek Solutions, Santa Barbara , CA). Sections from peripheral vessels were washed again and 6% Mayer Counterstain, wash, dehydrate in hematoxylin and remove coverslips. I took it. Sections from the coronary arteries were not counterstained. Control slide Replaces anti-12-lipoxygenase with the same concentration of pre-immune rabbit serum Was prepared.   10. Data analysis   Immunoblots and autoradiograms are computer-controlled Meter (Applied Imaging, Santa Clara, CA; (Lynx DNA Vision). The data shown is 2 3 show three experiments. Process HSMC with AII to synthesize 12-HETE Data obtained from statistical processing of the Macintosh computer system Analyzed using ANOVA for multiple samples with package. data Are shown as mean ± SE.                                 Experimental result   Expression of leukocyte-type 12-LO mRNA in HAEC, HSMC and MO   Expression of 12-LO mRNA in HAEC, HSMC and MO was detected by detection level. Bells are less sensitive to Northern analysis and are evaluated using specific RT-PCR did. FIG. 1A shows a method using a method highly specific for leukocyte-type 12-LO mRNA. Expresses leukocyte 12-LO mRNA in normal HAEC, HSMC and MO I It indicates that. The 333 bp band of interest has three cell types Was recognized by all.   FIG. 1B shows RT-PCR of expression of human 15-LO mRNA from the same RNA. An analysis is shown. From these results, evidence of a band specific to human 15-LO is Not shown. In another experiment, RNA from HAEC, HSMC and MO was Amplified and used as a probe for platelet-type 12-LO RNA. Human blood No evidence of platelet 12-LO expression was found (data not shown) ).    Expression of hl 12-LO protein in HAEC, HSMC and MO   Is leukocyte-type 12-LO enzyme expressed in intravascular and circulating blood MO? To study the inside, 10,000xg of supernatant protein was electrophoresed and human Porcine leukocyte type 12 with homology to the 12-LO sequence found in the adrenal globular layer -Using a polyclonal peptide antibody derived from sequences in the LO, Analysis was performed. This antibody lacks cross-reactivity with platelet type 12-LO. Has been shown previously and the presence of leukocyte-type 12-LO in human adrenal cells (3). Figure 2 shows HSMC, HAEC and MO Shows the major band at 72 kD from Western analysis of. Human 15-LOta Western analysis performed similarly using polyclonal antibodies directed against the protein Did not show a band at the expected molecular weight from these cells ( Data not shown). HAEC and MO are compatible with HPLC and RIA analysis. As a result of comparison, 12-S-HETE was generated (HAEC2386, MO820pg / 106cell). The HSMC results are described in detail below.   As a result, HSMC, HAEC and MO were converted to porcine tissue and human adrenal globular layer. Expressing a 12-LO protein similar to the leukocyte type 12-LO found in Seems to be.                 Within HSMC and certain other organizations                 Effect of AII on 12-LO activity and expression   Another main aspect of the invention is that the AII has a 12-LO mRNA or And increased activity and expression of proteins. Figure 3A is 10% in serum-free medium.-8mol / l and 10-9AII at a concentration of mol / l And the incubation of HSMC for 5 minutes, the release of 12-HETE Stimulated (control: 599 ± 105; AII 10-8M: 1467 ± 277; AII   10-9mol / l: 1296 ± 262 pg / mg protein) You. After adding AII and incubating for 10 minutes, 10-8mol / l concentration Clearly stimulated the release of 12-HETE. AII is also a cell in HSMC Related 12-HETE levels also clearly increased (FIG. 3B). In other studies, The level of 12-HETE in response to AII is determined by the LO inhibitor baicalein (baic arein) 10-FiveIt has been found that it can be reduced by mol / l (de Data is not shown). AII induces expression of 12-LO enzyme in HSMC To test if-7AII at a concentration of mol / l, 24 Alternatively, the treatment was performed for 48 hours. The 12-LO protein is purified leukocyte type 12-L Derived from an antibody specific for O or a known sequence present in human leukocyte type 12-LO Identified by Western immunoblotting using the purified peptide antibody . It has a molecular weight close to the reported molecular weight of porcine leukocyte type 12-LO, 72 kD. Finally, a distinct band was detected (FIG. 4). HS with AII in serum-free medium When MC was incubated for 24 hours, nearly 7-fold of 12-LO protein Increased expression was induced (FIG. 4). In other experiments, adding AII for 48 hours Induced 4-7 fold expression of 12-LO (data not shown).   To evaluate the specific expression and regulation of 12-LO mRNA in HSMC For example, the applicants have proposed an RT-PCR assay that significantly increases leukocyte type 12-LO. I was used. The sizes of the PCR amplified fragments were 12-LO and 15-LO Are 333 bp. Therefore, increasing the stringency and increasing the cleaning temperature by 60 The specific conditions by raising to ° C are leukocyte type 12-LO and human 15 Used to distinguish between -LO. In FIG. 5A, indicated for 24 hours without serum Time spent 10-7RT-PCR amplification from HSMC treated with mol / l AII 2 shows a Southern blot analysis of the product. In this experiment, the very low 12-LO A fundamental expression was observed. However, using cells from various other donors In other experiments, basal 12-LO expression was detectable in 20-30 PCRs become. AII indicates the release of 12-LO mRNA at an incubation time of 12 hours. Begin induction of induction, the largest induction is the incubation time of cells with AII Appears in 36 hours. FIG. 5B shows an etch showing GAPDH amplification as an internal marker. An agarose gel stained with diium bromide is shown. Platelet-type 12-LO Or when using PCR conditions specific to either human 15-LO, No RNA band was detected (data not shown). Therefore, nothing Serum basic HSMC is clearly leukemia upregulated by AII Shows low expression of globular 12-LO.   Leukocyte-type 12-LO, unlike platelet-type, metabolizes linoleic acid. Can be. Applicants therefore believe that HSMC is an arachidonic acid metabolite In addition to 12-HETE, 13-HO which is a linoleic acid metabolite by the action of LO It was evaluated whether DE could be formed. To accomplish this To this end, applicants filed the appropriate cytoplasmic fraction of HSM with C14Linoleic acid or non-radioactive Treated with arachidonic acid and further purified the LO product of HSMC by density gradient reverse phase HPLC Another experiment was performed in which the stem was analyzed. Cells labeled with non-radioactive arachidonic acid , Showed an HPLC peak co-migrating with 12-HETE. Cell blank sample Has a peak height of 1.5 cm, which is 3/5 cm with sonication of HSMC. Increased. Also, C14Cells incubated with linoleic acid were also 3-HODE was generated (HSMC ultrasound for 695 counts / min blank) Process 1038 count).   To assess whether leukocyte-type 12-LO is present in atherosclerotic lesions For this, immunohistochemistry was performed using a peptide anti-leukocyte type 12-LO antibody. . FIG. 6A shows a close-up of a section made from an amputated lower limb from a patient with peripheral vascular disease. A photograph is shown. Cytoplasmic staining specific for the leukocyte-type 12-LO indicates the endothelium and He is good at both the smooth muscle layer. Intimal neoplasia is also a leukocyte-type 12-L O staining is shown. FIG. 6B shows the same lesion stained with pre-immunization antiserum. The high magnification photograph of the section of FIG. This section shows minimal background staining, 6A suggests that the leukocyte-type 12-LO staining is specific. FIG. Is Typical section from human left coronary artery showing advanced atherosclerotic lesion is there. FIG. 7A shows 12-LO protein in smooth muscle and adventitia areas and endothelial cells. Indicating limited staining of the matrix. FIG. 7B shows very low buffer with pre-immunization antiserum. Figure 5 shows immunohistochemistry with this antibody showing background staining.   These results are similar to those found in porcine leukocytes and human adrenal globular stratum (3). Similar 12-LO RNAs and proteins are also found in human vascular cells and circulating cells. This shows that it is expressed in monocytes in peripheral blood. To support this conclusion, Several methods of study were utilized in this study. First, porcine and human leukemia Peptide antibodies derived from sequences common to globular 12-LO include HSMC, HA It showed a characteristic 72 kD band in EC and MO lysates. This antibody is Not cross-reactive with platelet-shaped 12-LO but partially cross-reactive with human 15-LO (3). Second, the highly specific RT-PCR method is used for these cell types. Used to detect the 12-LO mRNA within. In a previous study, Using this technique, leukocyte-type 12-LO was used to transform human adrenal globular layer and U937 cells. Exclusive type 12-LO found in vesicles (3). In this study, appropriate leukocyte type 12-LO primers and When lobes were used, the mRNA product that amplified the specific 333 base pairs was Found in non-intensified HSMC, HAEC and MO. Third, three All cell types were matched by HPLC and a specific RIA. According to the filtration, a 12-LO product, 12-S-HETE, had been formed. H Cytoplasm from SMC reacts with both arachidonic acid and linoleic acid Either 12-HETE or 13-HODE was produced, respectively. This reaction is It shows the characteristics of leukocyte-type 12-LO and reacts only with arachidonic acid to produce 12-LO. The characteristics of platelets 12-LO that produce HETE are not shown.   One of the humans cloned uniquely from reticulocytes and found in the human trachea 5-LO is highly homologous to porcine leukocyte-type 12-LO (86% sequence homology) ( 14). The PCR technique used here distinguishes between leukocytes 12-LO and 15-LO. (3). The specificity of this approach is that 1 Proven using 2-LO and 15-LO cCNA. Therefore, white blood cells By Southern blot hybridization using a 12-LO probe, The band observed was the amplification product of 12-LO and the amplification product of 15-LO. Provided the strongest evidence that there is no These results are fundamental or 15-LO m in stimulated human endothelial cells or unstimulated mononuclear cells Consistent with previous studies that showed no detectable RNA (27). However, 15-LO mRNA and protein are useful in atherosclerotic vascular lesions. It is found in the clophage-rich region and in monocytes stimulated with IL-4 (2 8) This indicates that 15-LO has progressed atherosclerotic vascular disease and It suggests that it may act in immune-mediated vascular diseases.   The increased evidence also indicates that the 12-LO enzyme has AII-induced effects in some additional tissues. Suggests that it plays an important role in Studies have shown that arachidonic acid 12- The LO pathway is dependent on AII-induced aldosterone synthesis in rat and human adrenal gland stroma cells. Suggest that it can mediate growth (11, 12). Furthermore, recent data shows that A II-induced adrenal cell proliferation is at least partially due to the activity of the 12-LO enzyme. Is pointed out by mediation. In further studies in rats, AII 12-LO pathway has been implicated in vasoconstriction and renin inhibitory effects by nicotine (29) . The aorta produces LO products including 12-HETE and 15-HETE Has the ability (30). Recent data indicate that both AII and high glucose Can up-regulate leukocyte type 12-LO in cultured porcine aortic smooth muscle cells. Was shown (31).   AII is available in vitro and in vivo. It mainly affects proliferation of vascular smooth muscle cells (1, 7, 32-34). Recent reports have shown that rather than inhibitors of cycloxygenase, a relatively selective 12- LO blockers inhibit AII-induced hyperactive responses in cultured porcine vascular smooth muscle cells (35). In addition, these vascular smooth muscle cells In terms of protein and fibronectin content of 12-HETE, (36). 12-LO pathway and its product 12 -HETE was also associated with vascular smooth muscle cell migration (9). 10-12About M Lesser concentrations of 12-HETE have been shown to lead to smooth muscle cell migration. Sa La Some studies have shown that the 12-LO product is a specific isomer of protein kinase C. Capable of activating oncogenes including rabii, ras, c-fos and jun Was shown (36-38).   Therefore, the activity and expression of 12-LO increased by AII Previously on induced human hypertensive and atherosclerotic vascular disease May be an unrecognized mechanism. Therefore, another important aspect of the present invention A novel embodiment is a novel therapy for reducing cardiovascular disease associated with AII. , 12-LO pathway.   The 12-LO pathway in the human vascular wall and monocytes is responsible for atherosclerotic vascular disease. It may be related to other mechanisms involved in the development or progression of the disease. Recent Evidence suggests that oxidative modification of LDL within the vessel wall has also been associated with the LO pathway (3 9-41). At present, HAECs, HMSCs or monocytes are able to produce natural LDL, Converted to a minimally modified LDL with a strong atherosclerotic potential Has the ability to Macrophage cholesterol negative It is interesting to show that loading naturally leads to increased production of 12-HETE ( 42). In a recent report, both leukocyte-type 12-LO and 15-LO were the same. It has previously been shown that lipoproteins can be oxidized similarly (42). Interest Deeply, in this same report, platelet 12-LO oxidizes lipoproteins Lack of ability was also shown.   Provide further evidence for the presence and localization of leukocyte 12-LO in human blood vessels To serve, immunohistochemical analysis of two atherosclerotic lesions was performed. The results show that the leukocyte-type 12-LO was found to be endothelial and smooth in atherosclerotic lesions. Immunohistochemical evidence that it is specifically expressed in muscle cells was provided, This pathway plays a potential role early in the development of pulse sclerosis vascular disease. And support. Previous studies have shown that vascular tissue and monocytes have LO activity (42-44).                  Pathways through which AII and 12-HEPE function   The effects of AII and 12-HETE are mitogenically activated proteins (MAP) Altering cells by stimulating kinase activity has never before been discovered. Was seen. Specifically, AII and 12-HETE are compatible with ERK (extra   cellular regulated kinases (extracellular regulated kina) Ase) [for example, ERK1 (P44MAPK), ERK2 (P42MAPK) And ER K3 (P62MAPK)] To activate the transcriptional activity of fos Activates jun via NK (cJun kinase or stress activated kinase) And / or JAK (Janus kinase, eg, It functions by activating JAK1 and JAK2). More specifically Indicate that AII and 12-HETE are important upstream signals for activating JNK Activates P-21 Activated Kinase (PAK), which is involved in                                 experimental method ERK activity : ERK activity was determined according to Anal. Biochem. , 183: 139- 143 (1989) by the substrate-SDS-polyacrylamide gel method. evaluated. Confluent cells in 100 mM dishes are rested in serum-free medium. They were stopped and subsequently treated with the agonist for various periods of time. Next, lyse cells Buffer (1% NP40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 100 mM-NaCl, 50 mM Tris, 10 mM-EDTA, 1 mM-E GTA, aprotinin, 100 mg / ml leupeptin, 0.1 mM-PMSF And 1 mM sodium orthovanadate, pH 7.4). Melt Is centrifuged to pellet the nuclei and the cell extract (15-20 mg protein) Was converted to S containing myelin basic protein (0.5 mg / ml) as an ERK substrate. The sample was subjected to electrophoresis on DS polyacrylamide gel (10%). After that, SDS Washed, then denatured, regenerated, and then [32P] ATP to tamper on gel The substrate was phosphorylated.JNK activity : Plasmid pGEX-cJun1 / 79 (Dept. Pharm acol. UCSD, La Jolla) is the amino acid (1-79) of cJun. GST-cJun (1-79) expression vector. GST fusion E. coli was transformed with the protein expression vector. Protein Induced with 0.1 mM IPTG and onto glutathione-agarose beads Was purified by affinity binding. Unstimulated or stimulated fine The cells were washed with WCEB (25 mM-HEPEs, pH 7.7, 0.3 M NaCl, 15 mM-MgClTwo, 0.2 mM EDTA and 0.1% Triton X-1 00). Approximately 50 μg of the protein extract is GST-cJun + G Incubated with SH agarose overnight at 4 ° C. Phosphorylation is 20 mM-HEPES, pH 7.5, 20 mM b-glycerophosphate, 10 m Mp-nitrophenol phosphate, 10 mM-MgClTwo, 10 mM-D DT, 50 μg NaThreeVOFour, 20 μM ATP (non-radioactive) and approximately 0 . 5 μl of newly purchased gamma3220 minutes at 30 ° C. in the presence of P-ATP went. After boiling with electrophoresis sample buffer, the supernatant was Analysis was performed by SDS-PAGE. JNK activity is also measured by anti-JNK antibody (Parmi). ngen Co. , San Diego). Next, the activity is determined by the method described in Cell, 81: 1147-1157 (1995). Was measured using 2 μg of GST-cJun as a substrate.PAK activity : Cell lysis and measurement of PAK activity is described in Science, 269. : 221-223 (1995). Cells are professional 50m containing the protease inhibitors PMSF, leupeptin and aprotinin M Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 50 mM NaF, 10 mM Na pyrophosphate, 1% NP-40, 2.5% glycerol , And 1 mM NaThreeVOFour(PH 7.5) and melted on ice. 10 cells Centrifuged at 1000g for 1 minute. To perform immunoprecipitation, the supernatant was used for anti-PA K1 or anti-PAK2 antibody (1:25) (Dept. Immuno. & Cel) l Biology, Scripts Res. Insit. , La Jol la, CA) for 2 hours at 4 ° C., then 60 μl of 1: 1 Add protein A beads and incubate for 60 minutes, then add 1.0 ml Wash 5 times with lysis buffer and add kinase buffer (50 mM HEPE S, pH 7.5, 10 mM MgClTwo, 0.2 mM dithiothreitol, 2μ gmier Phosphate basic protein and 14 μM [γ-32P] ATP) at 30 ° C. Washed twice for minutes. The reaction was stopped by adding SDS sample buffer and the result was Visualized by SDS-PAGE and autoradiography.                                   result   The administration of AII results in a two-step activation of MAP kinase. (All MAP kinase experiments were performed in CHO-AT1a cells. It uses the AII receptor, AT1a cDNA, to transform Chinese hamster eggs. Nest cells). AII (10-7M) is the first activity peak at 5 minutes (2-6 times) and two steps with later peaks (1.5-3 times) at 3-4.5 hours Stimulation of ERK activity and JNK activity peaking at 30 minutes and remaining for 1 hour It has been found to induce sexual stimulation. AII (10-7M) in 30 minutes It was found to induce stimulation of PAK with one major peak (5-fold).   Also, 12-HETE (10-7M) shows the first peak and 3-4.5 at 5 minutes A two-step stimulation of ERK activity with a second peak at time and 30 minutes (2- Two-stage stimulation of JNK activity with peaks at 3 times) and 3 hours (2.5-5 times) It has also been found to induce. 12-HETE is 10 as shown in FIG.-9 It was found to stimulate JNK activity at concentrations as low as M.   In addition, 12-HETE was found to induce stimulation of JAK activity. CHO-AT1aCells were cultured in 12-HETE (10-7M) for 10 hours, Immunoprecipitation with rosin antibody, and using antibodies specific for JAK1 and JAK2 And immunoblotted. As can be seen in FIG. 30, 12-HETE is: JAK activity was increased.   Finally, 12-LO inhibitors (e.g., CDC and baicalin) are added to the concentration Dependently reduces AII- and 12-HETE-induced mitogenic survival It was discovered. Thus, administration of a 12-LO inhibitor will provide AII and / or Reduces 12-HETE-induced MAP kinase activity, thereby reducing AII and And / or reduces the effect of 12-HETE on cell growth and development.   Consistent with this data, one embodiment of the present invention relates to the use of 12-LO inhibitors. Through administration, including reducing ERK, JNK and / or JAK activity, It entails treatment of AII- or 12-HETE-induced disease. With a special theory Although we do not want to be tied, 12-HETE is It is believed that MAP kinase activity is increased through receptor upregulation. Thus, methods of treating AII- or 12-HETE-induced diseases are also described, for example, by D Through administration of a 12-HETE receptor antagonist, such as uP654 Including reducing mitogenic activity.                           Inhibition of the 12-LO pathway   Various pharmacological methods of reducing leukocyte-type 12-LO activity, antisense or The use of the ribozyme method is described in application PCT / US94 / 00089. . Panaxinol, a polyacetylene compound isolated from ginseng, is white The present invention has been identified as a relatively selective inhibitor of blood cell 12-LO (55) and It is effective for the purpose of.                Role of the 12-LO pathway in breast cancer cell proliferation   Example V of application PCT / US94 / 00089 has blockage of the 12-LO pathway. It has been shown to provide an effective human breast cancer treatment. 1 in breast cancer cells and tissues Further evaluation of the regulation of 2-LO activity and expression indicates that the growth of breast cancer tissue is 12-L It is confirmed that it is inhibited by O inhibitors. Specifically, leukocyte-type 12- Cancer-free normal breast tissue and cancer from 6 patients for LO mRNA expression Specific reverse transcriptase PCR compared to RNA samples of breast tissue containing I studied. In each of the six patients, the cancer-containing section is a control Much higher levels of 12-LO mRNA than normal sections (340 bp PCR Product) (internal control for PCR, GADPH mRNA 284 bp) 3-6 times higher even after standardization by The level of 12-LO mRNA was also positive. Compared to the normal breast epithelial cell line MCF-10F, two types of cancer cell lines, MCF- 7 and COH-BR1 were higher than 7- and 11-fold. Furthermore, MC Proliferation of F-7 cells was determined by three LO inhibitors, baicaline (10 μM), CDC (10-FiveM) and NDGA (30 μM). Ibuprofen, a rhoxygenase inhibitor, (10-FiveIs inhibited by M) Did not. Treatment of serum-starved MCF-7 cells with EGF for 4 hours resulted in 1 The formation of the 2-LO product, 12-HETE, leads to an increase depending on the concentration (Reference value: 257 ± 10 pg / 106Cells; 462 ± 1 at 50 ng / ml EGF 5 pg; 593 ± 46 pg at 100 ng / ml EGF; both p <0.001 Vs. reference). EGF (50 ng / ml) also contains 12-LO protein (72 k D) as well as levels of 12-LO mRNA led to a significant increase at 24 hours. . Therefore, activation of the 12-LO pathway is not normal and EGF-induced breast cancer cells Appear to play an important role in the growth and development of E. coli.          Role of the 12-LO pathway on estrogen action in breast cancer   Estrogen, which is associated with the growth and development of breast cancer cells, is It has previously been discovered to play a role in activating the LO pathway.   Serum-free and free from estrogen receptor-positive breast cancer cell line MCF-7 17β-estelladiol for 4 hours in a limited medium containing no phenol red In addition, when the cells are treated, 12-HI, the product of 12-LO associated with the cells, The level of droxyeicosatetraenoic acid (12-HETE) depends on the concentration (Reference value 161 ± 29 pg / 106Cells; 17β-estradio 784 ± 150 pg at 5 nM; 17β-estradiol, 1 at 10 nM 056 ± 187 pg; both p <0.001 vs. baseline). This 12-HETE The stimulatory effect of 17β-estelladiol on estrogen receptor It was not found in the cell strain MDA-MB-231. MCF with estrogen Treatment of -7 cells for 22 hours also resulted in immunoblot with 12-LO peptide antibody. In the rotting test, the concentration of leukocyte-type 12-LO protein expression was Dependent increases were induced (1 nM and 10 nM of 17β-esteradio 2.1 and 3 times the baseline value, respectively). Thus, 17β -Estelladiol enhances the activity and expression of 12-LO in MCF-7 cells Increased. Therefore, activation of the 12-LO pathway is associated with estrogen-induced breast cancer It is thought to play an important role in cell growth and development.   From this data, one embodiment of the present invention suggests that one inhibits the 12-LO pathway. And treatments that reduce the growth and development of breast cancer cells. Such 12-L Inhibition of the O pathway indicates, inter alia, that estrogen affects the growth and development of breast cancer cell vesicles. Will reduce the effect of                Role of the 12-LO pathway in VEGF formation   Applicants believe that the 12-LO pathway also plays a role in the formation of vascular endothelial growth factor (VEGF). I found out that it plays a role. VEGF increases vascular permeability and monocyte mobility A mitogen specific for endothelial cells to be added. VEGF is used in breast and lung cancer It appears to be a major angiogenic factor in many types of cancer, including: Furthermore, VEG F indicates proliferative diabetic retinopathy as well as advanced blood that is often associated with diabetes It was also linked to the development of tube diseases.                      Brief description of FIGS. 8, 9 and 10   FIG. 8 shows that vascular endothelial growth factor (VEGF) protein in MCF-7 breast cancer cells ( 42kD) expression of platelet-derived growth factor (PDGF) Has been explained. Nearly confluent MCF-7 cells were in DME medium + 0 . Serum depleted for 24 hours by placing in 4% FCS and 0.2% BSA I let it. The culture was then replaced with fresh one and the cells were replaced for another 24 hours. Incubated with PDGF for hours. At the end of the incubation, a monolayer The cells were washed with ice-cold PBS, scraped in PBS, and And pelleted by centrifugation. Then, lyse the cell pellet and mix Electrophoresis of the protein (50 μg) from the kit, Santa Cruz Biot Using a specific antibody from technology to detect VEGF Noblot was performed. Detection was by chemiluminescent technology. PDGF is a breast cancer cell Causes a concentration-dependent increase in VEGF expression in E. coli. Crab is recognized.   FIG. 9 shows endothelial proliferation to VEGF protein expression in breast cancer cell line MCF-7. Effect of factor (EGF) and 12-HETE, a 12-lipoxygenase product The result is explained. MCF-7 cells were incubated with EGF and 12-HETE for 24 hours After processing, the VEGF protein was identified according to the method described in the legend in FIG. The figure shows that the expression of VEGF protein becomes a mitogen for breast cells such as EGF. Not only induced, but also by the 12-LO product 12-HETE Is also induced. In fact, 12-HETE is not able to induce VEGF. 12-HETE appears to be even more potent than EGF Point out that it has characteristics.   FIG. 10 shows VE in immortalized human aortic smooth muscle cell line (AIHSMC). With the 12-lipoxygenase product in the expression of the GF protein (42 kD) The effect of a certain 12-HPETE is described. Cells deplete serum for 24 hours And then replaced with a fresh culture containing 12-HPETE. Cells for 5 hours Incubate and then dissolve the cells according to the method described in the legend to FIG. VEGF protein was identified in the vesicle. The third column is the first, as noted in the figure. When compared to the row controls, the 12-LO product, 12-HPETE, was PVSM Showing that it causes the expression of VEGF which is an angiogenic substance to be increased in C I have.   8 and 9 show that the 12-LO product, 12-HETE,-7M and 1 0-8Two types of human breast cancer show increasing VEGF protein expression in M Data for cell lines MCF-7 and MDA MB are reported. FIG. -Shows that HETE can increase VEGF protein in HVSMC You.   In addition to the work depicted in FIGS. 8-10, AII, 12-HETE and hyperglycemia (H G) increases VEGF production in vascular smooth muscle cells (VSMCs). It was discovered by now. Porcine and human VSMCs are converted to normal glucose (NG, (5.5 mM) or HG conditions for at least two passages. VEGF Protein expression was further determined by Western blotting using VEGF RNA was quantified by Northern blot. HG alone, VEGF mR The levels of NA (2.8-fold) and protein (3.2-fold) were increased. further , VEGF protein (45K) and mRNA (3.7Kb) expression (10-7The treatment in M) for 4 hours allows the cells cultured in HG (2.2-fold and 1.4-fold, respectively). Further, 12-H ETE (10-8M and 10-7M for 4 hours) under NG and HG conditions Increased expression of VEGF protein and mRNA in cells cultured in both You. In addition, HG was detected in the culture as determined by specific EIA. Increased secretion of VEGF into the cells (56.2 ± 4 ng / ml NG vs. 73 ± 5HG , P <0.02). AII and 12-HETE are also measured by EIA, VEGF secretion increased 1.24-fold and 1.4-fold, respectively.   From this data, one aspect of the present invention is to reduce VEGF production. Thus, for example, the inhibition of breast and other cancers through inhibition of the hl 12-LO pathway. Possible metastasis and distress associated with diabetes (eg, proliferative diabetic retinopathy) And advanced vascular disease).               Role of the 12-LO pathway in the pathogenesis of diabetes type I   This aspect of the invention relates to the activation of the 12-LO pathway in pancreatic Vedic cell dysfunction. Sex, or cytotoxicity in response to cytokines involved in the pathogenesis of diabetes type I Including roles.                    Brief description of FIGS. 11, 12 and 13   FIG. 11 shows RINm5F, a rat beta cell line that produces insulin. FIG. 3 illustrates the effect of the 12-LO product on DNA synthesis in DNA. DNA synthesis Naru was added in the last 6 hours (in an 18-24 hour experiment)ThreeH-thymidine removal (1 μCi / ml). LO products are grown in complete growth medium. Cells were added for 24 hours. As shown, 12-hydroxyeicosate Raenoic acid (12-HETE, 10-9M) and 12-hydroperoxyeicosa Tetraenoic acid (12-HPETE)ThreeReduce H-thymidine incorporation, This reflects their effect in reducing DNA synthesis in the beta cell line.   FIG. 12 shows RINm5F, a rat beta cell line that produces insulin. Describes an immunoblot of proteins isolated from The effect of interleukin-1β on protein expression is shown. These laboratories Investigations revealed that medium containing 0.4% serum reduction alone or with IL-1β (0.1 ng / ml) and from the cells grown for 16 hours, 25 μg of protein was separated. Results were treated with IL-1 (columns 2 and 4) followed by 12-LO tamper. This indicates that the expression of the protein is increased two-fold. The seventh column shows the 12-LO standard. US Patent Application for Recognition of leukocyte-type 12-LO in rat, pig and human form Using our peptide antibodies, a characteristic 72 kD 12-LO protein van Indicates   FIG. 13 shows IL-1β on 12-HETE production in rat islets of Langerhans. Is explained.   Applicants believe that the 12-LO product 12-S-HETE or 12-HPE Direct addition of TE was performed into rat pure beta cell line RIN-M5F.ThreeH As confirmed by reducing thymidine incorporation or DNA synthesis It was discovered that they directly reduced cell proliferation. As shown in FIG. , 10-912-LO at a concentration as low as MLivingEven products reduce DNA synthesis . FIG. 12 shows that leukemia in these RIN cells was 0.2 ng in human IL-1β. It shows that expression of sphere 12-LO protein is increased approximately 2-fold. FIG. 13 shows that IL-1β is 2.5 ng / ml and immunoreactive 12-SH Increase the release of ETE (baseline 92 pg / ml / 40 islets of Langerhans vs. 2 50 pg / ml / 40 islets of Langerhans) Of 12-LO in pancreatic islets of Langerhans isolated from rat Is to increase.     To the development of human autoimmunity, inflammatory disorders and atherosclerotic disorders                           Role of the 12-LO pathway   From increasing evidence, IL1,ILFourAnd IL8Cytokines like humans Play a role in the development of autoimmunity, inflammatory disorders and atherosclerotic disorders Is suggested.                         Brief Description of Figures 14-20   FIG. 14A shows 12-LO mR in porcine aortic smooth muscle cells (PVSMC). Concentration-dependent effect of cytokine interleukin-1β on NA expression Is explained. Confluent PVS in normal glucose culture MC growth was achieved by placing in medium + 0.2% BSA + 0.4% FCS. Serum was depleted for 24 hours. Subsequently, the culture was replaced with a new medium containing IL-1β. And the cells were incubated for a further 24 hours. Incubation At the end of the procedure, total RNA was extracted from the cells using RNA-STAT. That Thereafter, this RNA was subjected to reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) to Using our established technique, 12-LO mRNA of the leukocyte type (333 bp PCR product, upper panel) was detected and quantified. GAPDH mRNA ( 284 bp, lower panel) was used as an internal control for PCR and quantification. Used. The figure shows that the treatment with IL-1β shows that the internal control GAPDH mRN A does not significantly alter the expression, whereas the expression of 12-LO mRNA (33 3 bp PCR product) in a concentration dependent manner.   FIG. 14B shows cytokines in the expression of 12-LO mRNA in PVSMC. The effect of In-IL-4 is described. Treating cells with IL-4 for 24 hours 14A, and quantified 12-LO mRNA according to the method described in the legend to FIG. 14A. Was. IL-4 also increases 12-LO mRNA, similar to IL-1β. Is clearly recognized.   FIG. 14C shows cytokines in the expression of 12-LO mRNA in PVSMC. The effect of In-IL-8 is explained. Treat cells with IL-8 for 24 hours Then, 12-LO was quantified according to the method described in the explanatory note of FIG. 14A. PVSM Treatment of C with IL-8 leads to a concentration-dependent increase in 12-LO mRNA expression The figure shows that there was no change in the expression of the internal control GAPDH. doing.   FIG. 15 shows the same RNA analyzed for the internal marker GAPDH. Is explained.   FIG. 16 shows I-type expression of leukocyte 12-LO protein in PVSMC. The effect of L-4 has been described.   FIG. 17 shows I-expression of leukocyte-type 12-LO protein in PVSMC. The effect of L-8 has been described.   FIG. 18 illustrates the effect of IL-4 on 12-LO activity in PSMC. ing.   FIG. 19 illustrates the effect of IL-8 on 12-LO activity in PSMC. ing.   FIG. 20 shows enhancement of hl 12-LO by IL-1, IL-4 and IL-8. Check the adjustment.   In addition to this work on the island of Langerhans, Applicants1, ILFourYou And IL8Shows the m of leukocyte type 12-LO in porcine and human aortic smooth muscle cells. It has now been shown that RNA expression can be increased. In addition, the Applicants -LO protein expression in pig vascular smooth muscle by these cytokines. As well as evidence that it is upregulated as well. Cells are transferred to DME (normal gluco And 24% in a medium containing 0.2% BSA and 0.4% serum. The treatment was performed for a time in the presence or absence of the cytokine. 12-LO enzyme in cells Activity was measured by HPLC, and the expression of leukocyte-type 12-LO protein was By immunoblotting, and 12-LO mRNA is a specific reverse transcriptase. It was measured by elementary polymerase chain reaction (RT-PCR). Three types of cytokai (2.5 ng / ml) were all responsible for the apparent increase in 12-LO enzyme activity. And 12-HETE HPLC for IL-1, IL-4 and IL-8 Peak increases by 51, 43 and 36% respectively. In addition, three types of sites All of the cytokines (1-5 ng / ml) expressed 12-LO mRNA, respectively. (340 bp PCR product) leads to a strong concentration-dependent increase (2-5 fold). Treatment with these cytokines (0.5-5 ng / ml) also resulted in 12-LO Leads the expression of the protein (72 kD) to an increase (1.4-2.5 fold). further, All three cytokines (2.5 ng / ml) were synthesized from PVSMC DNA. Was clearly induced to increase (IL-1, IL-4 and IL- At 8Three1.28 ± 0.08, 1.6 for H-thymidine incorporation, respectively. 7 ± 0.11 and 1.3 ± 0.07 fold increase, p <0.01).   Human vascular smooth muscle cells (HSMC) are also cultured in DME (normal glucose). Cultured in a medium containing 0.2% BSA and 0.4% serum, IL1, ILFourand IL8For 24 hours. Activity of intracellular 12-LO enzyme in sonicated cells By HPLC and expression of leukocyte 12-LO protein by immunoblotting And 12-LO mRNA by specific reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT -PCR). IL-1, IL-4 or IL-8 (5 ng / ml) Treatment of HSMC in low serum medium for 24 hours resulted in no treatment Compared to the cells, the expression of 12-LO mRNA increased 7-10-fold. Same fruit RNA from experiments was also used to express human 12-LO by specific RT-PCR. It was also analyzed. 15-LO mRNA at baseline or after cytokine addition Was not recognized in any of the above.   These results indicate that these inflammatory cytokines are mitogenic within VSMC Have a sexual effect, which is a strong positive regulation of the 12-lipoxygenase pathway. Is suggested. Thus, in response to these cytokines, The 12-LO activity ratio and expression determined were similar to those observed in atherosclerosis. A key mechanism for tocaine-induced VSMC migration and proliferation U. FIG. 14 shows normal (5.5 mM) and elevated (25 mM) glucosides. To 12-LO mRNA expression in PVSMC cultured in1, ILFourand IL8The effect of is shown. FIG. 15 shows the internal marker gene GAPDH. Identical RNA analyzed for all columns, with all columns showing the same amount of internal standard RNA Has been shown. FIGS. 16 and 17 show ILFourAnd IL6By Indicates increased expression of the 12-LO protein in PVSMC, , FIGS. 18 and 19 show ILFourAnd IL812 in PSMC processed by -HPLC self weighing showing selective increase in activity of LO protein FIG. FIG.1, ILFourAnd IL8But human aorta SM Shows evidence that leukocyte-type 12-LO in C can be significantly upregulated doing. In these same experiments, applicants determined that untreated or cytokine-treated Expression of 15-LO cannot be demonstrated in the control HSMC, and in vascular smooth muscle Selective Role for 12-LO as Potential Mediator of Cytokine Action Is Was.          Role of the 12-LO pathway in the pathogenesis of diabetes type I and II   Insulin dependent diabetes mellitus or diabetes type I An autoimmune disease that results from the complete destruction of syngeneic or beta cells. IL It is thought that cytokines such as -1β are involved in the progression of this autoimmunity. It is.   IL-1β is expressed in 12-LO protein and mRN in RIN-M5F cells. A and expression of 12-LO mRNA in the islets of Langerhans in rats. It was found to induce. With IL-1β (25, 50 and 100 ng / l) RIN-M5F cells treated for 16 hours show porcine leukocyte 12-LO expression. A 2-fold increase in concentration was demonstrated by Western blot . A concomitant increase in 12-LO mRNA expression indicates that, at this point, the sensitive PC Approved using the R assay. These transcription and translation events are 12- Increased activity of the 12-LO pathway as measured by HETE radioimmunoassay Proceeded in parallel. Furthermore, inducible nitric oxide synthase (inducible)   It is an inhibitor of nitric oxide synthase (iNOS) N-monomethylarginine (NMMA) (N-monomethyl argi) nine) is a 12-L induced by IL-1β in RIN M5F cells. The increase in the expression of the O protein cannot be inhibited, which means that the inducible acid Supports the hypothesis that a pathway exists that does not depend on nitrogen iodide (NO). Isolated In another experiment using Sprague-Dawley rat islets of Langerhans, , 12-LO mRNA expression and increased enzymatic residence.   Finally, 12-LO is transcribed and translated by cytokines such as IL-1β. It is an enzyme specific to beta cells whose level is regulated.                         Brief Description of Figures 21-24   FIG. 21 shows 12-LO mRNA in pancreatic islets of Langerhans of diabetic rats. Shows increased expression.   FIG. 22 shows that the expression of 12-LO mRNA in skeletal muscle of diabetic ZDF rats was It is higher than that of non-diabetic ZDF rats. ZDF rat model , An outstanding animal model of idiopathic NIDDM (non-insulin dependent diabetes mellitus) Was recommended.   FIG. 23 shows rat fibroblasts overexpressing human insulin receptor. Shows the data.   FIG. 24 shows HETE / PGI in various diabetes groups.TwoRepresents a major change in the ratio .   NIDDM reduces the ability of insulin to induce glucose transport into muscle ( Insulin-induced) and glucose-induced insulin in pancreatic islets of Langerhans It is a complex genetic disease associated with a relative decrease in surin secretion.   Consistent with another embodiment of the present invention, increasing the activity and expression of the 12-LO pathway Is such that blockade of the 12-LO pathway can prevent the development of NIDDM, It is recognized as a mediator common to both of these abnormalities.   The principles of this affidavit include the following 1-5.   1. Demonstration of leukocyte type 12-LO in pancreatic islets of Langerhans and skeletal muscle Relevant data to reveal. Skeletal muscle data is new and relevant. La Data obtained from rat skeletal muscle RNA and human Langerhans islet RNA PCR analysis has been used to demonstrate expression of 12-LO.   2. Expression of 12-LO mRNA is reduced from lean non-diabetic animals to obese Gradual pancreatic islets of the rat up to diseased and obese diabetic animals Evidence of increase (see FIG. 21).   3. 12-LO product exogenously added to rat pancreatic islets of Langerhans Reported that glucose-induced insulin secretion could be reduced (4 5).   4. Urinary 12-HETE levels were compared to lean ZDF non-diabetic rats. In male obese diabetic ZDF rats (NIDDM model), In vivo data (see Table 2). Interestingly, when viewed from the phenotype Female obese ZDF rats similar to pre-diabetic humans have intermediate levels of 12- Indicates HETE.   5. Expression of 12-LO mRNA in skeletal muscle of diabetic ZDF rats is Data showing significantly higher levels in skeletal muscle from non-diabetic ZDF rats (11th column vs. 21st column in FIG. 22). Interestingly, 12-LO in skeletal muscle   mRNA levels are higher in obese female ZDF rats susceptible to diabetes. High. In this figure, the 312 bp band is 12-LO, but 281 b The p band is a competitor for 12-LO. This data is the 12-LO mRN A shows a true competitive PCR analysis of A. Applicants also note that expression of 12-LO also Data in the ZDF heart suggesting higher in diabetic heart tissue was also retained. ing.   In addition to this work, two NIDDM models, ZDF (Zucker sugar) 12-LO in uremic obese) and GK (Goto Kyoto) rats   RNA and protein expression was evaluated. Specific quantitative polymerase chain reaction Response (PCR) assay was used to measure the expression of 12-LO mRNA. And Western blotting using an anti-12-LO peptide antibody Used to assess the expression of 12-LO protein. GK La of NIDDM The cut model provides a measure of blood glucose concentration as compared to an aged Wistar control. An increase was demonstrated (8.7 ± 0.7 vs 4.8 ± 0.2 mM, p <0.01). Only Meanwhile, plasma insulin and body weight between GK and Wistar rats Was similar. 12-LO mRNA expression was compared to Wistar rats. 4 times more in the heart from GK rats [0.48 ± 0.1 × 10FiveMolecule / μ gRNA (in Wistar) versus 1.9 ± 0.4 × 10Five(During GK), p <0.0 2]. Expression of 12-LO mRNA in soleus muscle was determined by Wist. GK rats were more than 5-fold higher than ar rats (0.6 ± 0.1 Wi star vs. 3.1 ± 0.76 GK). In obese ZDF rats, lean ZDF Increased blood glucose levels and body weight were demonstrated compared to controls (each 558 ± 75 vs 170 ± 5 mg / dl, and 390 ± 7 vs 343 ± 7 g). 12-LO mRNA was isolated from diabetic and lean ZDF rat hearts. , Red and white quadriceps. The expression of 12-LO mRNA is There was a 4-7 fold increase in diabetic obese ZDF rats compared to the F control. 1 The expression of 2-LO protein was similarly observed in diabetic ZDF versus lean ZDF control. (5 fold). These data indicate the expression of 12-LO in muscle However, in NIDDM, in both lean and obese rat models, It shows that it increases.   6. L612-HETE concentration in muscle cells increases in the presence of glucose Data indicating that. L6Muscle cells are used to study the mechanism of insulin action Skeletal muscle cells from rats that have been used. L6Muscle cells were converted to xylose (5. 5 mM), they produce standard glucose (5.5 mM). Or when compared to cells in high glucose (25 mM) Much more responsive. Table 3 below shows standard glucose (Rg) or high glucose Medium (pg / ml) or in cells (pg / whole cells) under source (HG) conditions. A higher 12-HETE release concentration is shown. Therefore, increase of 12-HETE etc. The reduced 12-lipoxygenase product is reduced by high glucose. It is thought to play an important role in insulin metabolism.   7. The selective 12-LO inhibitor baicalin provides glucose-induced Surin resistance can be prevented. To carry out these experiments, Applicants concluded that Rat-1-fibroblasts engineered to contain a tosulin receptor Was cultured in high glucose (25 mM) for 10 days. For the last 24 hours, 10-6Cultured with M baicaline. Prominent band is human insulin receptor The body phosphorylated β subunit is shown (FIG. 23). As the band gets thinner In addition, it shows reduced insulin action. Row 1 is row 5 (25 mM glucose For reduced insulin action in standard glucose (5.5 mM). 3 shows phosphorylation of insulin receptor. Column 6 shows that the 12-LO path is Shows insulin receptor phosphorylation in 25 mM glucose when blocked. 9 shows restoration of insulin receptor phosphorylation.   In addition to this study, Applicants noted that 12-HETE was induced by insulin It was found to directly inhibit receptor phosphorylation. As shown in FIG. The apparent increase in phosphorylation of the 97 kD β subunit of the insulin receptor was Occurs when surin is present. This corresponds to row 1 (control, non-insulin treatment). As shown by the darker band at 97 kD in row 4 (insulin treatment) . 12-HETE (10-7M concentration) directly affects basal insulin receptor phosphorylation. (Column 2). In contrast, 12-HETE is a human insulin receptor. Significantly reduced insulin-induced receptor phosphorylation of the beta-subunit of the receptor I let you. This is compared to row 5 (10-HETE free) versus row 5 (10-7M12 -HETE).   Insulin receptor phosphorylation is one of the key early steps in insulin action. Thus, these results indicate that the product of the 12-LO pathway has reduced insulin action. Suggest that This data indicates increased expression of the 12-LO pathway Or activity is important in insulin resistance in non-insulin dependent diabetes It is considered to play a role.   8. A major mechanism of glucose toxicity due to reduced insulin action and vascular disease Glucosamine, which is believed to be a diator, has 12-LO in smooth muscle cells. Data indicating increased product production. When insulin resistance occurs The role of glucosamine has recently been demonstrated in intact animals (Baron et al., J. Clin. In vest., 96: 2792-2801 (1995)) and in vitro insulin-responsive tissue (eg, Muscle-Robinson et al., Diabetes, 42: 1333-46 (1993); and fats. -As demonstrated in Marshall et al., J. Biol. Chem., 266: 4706-4712 (1991)). Was. In addition, glucosamine is a key mediator of glucose-induced vascular disease. (Daniels et al., Mol. Endocrinol., 7: 1041-1048). (1993)). While not wanting to be bound by any particular theory, glucosamine is Positive for the major glucose transporter Glut4 associated with its ability to transport glucose Blocking insulin-induced effects reduces insulin-induced glucose absorption. It is thought to decrease.   Porcine vascular smooth muscle cells (PVSMC) were incubated in the presence of glucosamine (7.5 mM). For 24 hours. Next, a fresh medium is added together with glucosamine (7.5 mM). In addition, the cells were cultured for 25 minutes. The cells and culture supernatant are collected and 1 2-HETE was measured. For cells cultured in glucosamine, standard glucose Very large increase in 12-HETE release into the medium compared to that in For 20.6 ± 3.6 pg / ml released in lucosamine, the standard glucose 6.48 ± 1.2 pg / ml of 12-HETE release in water, n = 4) . In addition, 12-HETE contained in the cells is present in the cells treated with glucosamine. (1225 ± 112 pg in glucosamine versus standard glue). 735.9 ± 67 pg / cell when incubated in a course). these The data show that 12-LO products such as 12-HETE lead to insulin resistance Suggests that this can be an important factor.   9. A high fat supply can result in reduced insulin action in muscle and 12-LO Data showing simultaneous induction of protein expression. Mau used Model was a transgenic mouse overexpressing the Glut4 transporter. (Pfizer Pharmaceuticals). FIG. As can be seen, a high-fat supply clearly leads to reduced glucose tolerance It is a clear indicator that the animals were insulin resistant. FIG. 28a shows all points on the oral glucose test curve in mice fed fat. Indicates a higher glucose concentration than the control. The bar graph in FIG. In the fed group, shows a significantly larger area under the glucose tolerance curve than in the control .   Assess 12-LO protein expression in myocardium in four animals on a high fat diet And compared to the concentration in animals on a control diet. 12-LO protein expression Is measured using a 12-LO peptide antibody and Western blotting. Was. An overview of the data is shown in Table 4 below. Remarkable results are shown in the blot densities. Much higher concentrations of 1 in animals on a high fat diet (using cytometer analysis) 2 shows the 2-LO protein. These in vivo results indicate increased 12-LO expression Or suggest that activity plays a key role in causing insulin resistance doing.   10. High magnesium (Mg) supply provides 12-LO gene expression and 12-LO gene expression. Data indicating that HETE concentration is reduced. Mg deficiency is experimental and Related to human insulin resistance. In addition, the increased dietary Mg is In both humans and humans, it is associated with a reduced incidence of diabetes Addition enhances insulin response and action in humans with NIDDM Can be.   Currently, high Mg supply significantly enhances 12-LO gene expression and 12-HETE concentration It has been found to reduce High Mg diet (Purina 50% containing 1% Mg) 08 diet) to one group of ZDF obese (diabetic fat) male rats An erosion (Prina 5008 with 0.2% Mg) was given to another group. See Table 5 As described above, the high Mg supply group is based on RIA (J. Clin. Endocrin. Metab., 67: 584-591 (1988)). And J. Clin. Invest., 80: 1763-1769 (1987)). However, it had a significantly lower urine 12-HETE concentration than the control group. High Mg supply It also reduced 12-LO mRNA expression in muscle from diabetic ZDF rats. Was.   Values are means ± SE. n is the number of rats. ZDF lean group and high magne The values of ZDF obesity group on calcium diet were respectivelyap <0.001 andbp <0. 05 differs from the ZDF obesity group.   11. Human data show increased urinary 12-H in NIDDM people. The ETE concentration is shown. 12-HETE concentration is a diabetic patient who showed signs of proteinuria. Especially high in the elderly. These results indicate that 12-LO activation was associated with renal disease in the case of diabetes. It suggests that it may be involved in the disease.   Vascular tissue from diabetic animals and humans contains arachidonic acid differently than normal. Metabolize. PGITwoAre vasodilators, antithrombotics and renin secretagogues , 12-Hydroxyeicosatetraenoic acid (12-HETE) is a proinflammatory And inhibits cyclooxygenase (CO). Applicants initially started with low Prostacyclin (P) in diabetic patients with ischemic hypoaldosteronism (HH) GITwo) Reported deficiency (46). Applicants have identified CO products, PGITwoAnd Lipoki Cigenase (LO) product, 1 in NIDDM patients with normal renal function (NR) 2-HETE, microalbuminuria (MiA), macroalbuminuria (Ma A) And their production in HH patients. PGITwo(6 keto PGF1) And 1 2-HETE was purified from urine by RIA using published methods following HPLC. Measured in The results are as follows.   採取 Sampling from previously stored samples    *  P <0.01 relative to control   **  P <0.05 for diabetic patients   The data show that (1) increased 12-LO product 12-HETE was associated with renal disease. Found in all advanced NIDDM; (2) diabetic kidney with albuminuria The disease is PGITwoAnd (3) HH is associated with PGITwoSuppression And 12-HETE-excess disorder.   Applicants' further experiments have shown that PGI in patients with varying degrees of diabetic renal involvementTwo Urinary (renal vascular) production of both and 12-HETE was measured.   Normal renal function based on creatinine clearance and urinary albumin measurements In the group of NIDDM patients withTwoEmissions differ from normal controls did not exist. Microalbuminuria group with hypertension and normotensive Was divided into However, PGITwoNo difference in emissions was observed. And also Regardless, the microalbuminuria group had significantly lower PGITwoWith discharge speed did. Has macroalbuminuria and reduced creatinine clearance Patients also receive PGITwoEmissions were reduced. PGITwoThe discharge speed is Minuria and decreased in the HH group.   The 12-HETE value is higher in patients with microalbuminuria compared to normal controls. Significantly increased in NIDDM patients who did not. 12-HETE emission values are also , Significantly increased in both the macroalbuminuria group and the HH group.   Low dose calcium infusion has traditionally beenTwoAnd possibly tissue phospholipase Has been shown to be increased by activation. 3 o'clock for calcium gluconate Infusion of PGI when administered to normal subjectsTwoAnd 12-HETE are both polar Significantly increased. However, NIDDM patients with microalbuminuria PGITwoHas not increased, but already increased 12-HETE The value was further stimulated. This is because NIDDM has a defect in prostacyclin formation. I support the notion of being.   12-HETE / PGITwoThe ratio is the change in LO / CO path for NIDDM. Calculated as yet another approach to determine if the presence of any As shown in FIG. 24, HETE / PGI in all diabetic groupsTwoGreat for ratio There is a big change. Mean values are in NIDDM patients with normal renal function Significantly increased and further in patients with macroalbuminuria and HH patients Change. However, these differences are due to variations within each group, due to NIDDM There were no significant differences between the groups.   Applicants' data suggest that renal function itself may be , GFR or hypertension. PGI in urineTwoAnd 12-H Although the origin of ETE is not fully determined, extrarenal CO inhibitors and A small amount of PGITwoExperiments with a lack of excretion of 12 / 15-HETE and Is a major source of these compounds in urine (47-49). HETE Can also arise from inflammatory cells in vascular tissue. (50-51). Only However, in NIDDM with early glomerular and vascular disease, No signs of lophage / leukocyte infiltration.   Consistent with the in vitro and animal model experiments cited earlier, Applicants Results fall low along with diabetic renal vascular / glomerular disease early in diabetes mellitus Suggests that there is some prostacyclin production. This is LO product 1 2-HETE increases early in diabetes mellitus before the onset of microalbuminuria Happens in the situation. These findings indicate that HETE is mitogenic, pro-inflammatory, and vasoconstrictive. And stimulates angiogenesis, which is a significant factor in the pathogenesis of diabetic vascular disease. Can be important (52-53). With respect to HH syndrome, Applicants new data: Increased HETE production isTwoInhibits formation and renin biosynthesis and secretion Suggest that this may be an early anomaly if Pathogenesis of diabetes explains vascular disease Is not known. However, recent research has shown that hyperglycemia Eicosanoid production increased by Nase C and the main mediator of AA release Has numerous metabolic consequences, including the activation of calcium-dependent phospholipase Suggest that you   In summary, very early renal involvement in diabetes, whether due to effects or With increasing toxic lipoxygenase product 12-HETE, Has been implicated in prostacyclin production. This conclusion is now in vitro. And in vivo experiments in humans. This prevents this confusion Suggest early pharmacological intervention for diabetic conditions.         Glucose-induced monocyte binding to human aortic endothelial cells                 Of 12-lipoxygenase product in rice   The rate of atherosclerosis is accelerated in people with diabetes mellitus (DM) It is. Applicants have recently shown that human aortic endothelial cells (HAEC) have high glucose (H G) Exposure selectively increases monocyte (MO) binding, but increases neutrophil binding. (56). HG exposure to EC is similar to arachidonic acid (AA) Release and lipoxygenase (LO) production can be increased. Recently In their work, Applicants found that 12- and The role of the 15-LO product was evaluated. Culture of HAEC at passage 2 in HG (25 mM) Nutrition increases MO binding compared to cells maintained in 5.5 mM glucose (239 ± 30 cells / HG field for 111 ± 7 cells, p <0.05) . The inhibitor of the 12-LO pathway, phenidone (10-6M) (5 of HG induced binding) 0 % Inhibition, p <0.05). HG cultures of HAEC are available from Applicants' HPLC and R Using the IA method, 12- and 15-hydroxyeicosatrienoic acid (HET E) L) Both were significantly increased. HAE cultured in 5.5 mM glucose 12 (S) -HETE added to C increased MO binding (cell 1 14 ± 4 10-TenFor M12-HETE, 66 ± 6 / field control, p <0 . 01). Another novel 12-LO product 12 (R) -hydroxyeicosato Lienoic acid is more powerful,-11And 10-12The effect on the MO bond with M Indicated. In contrast, 10-6-10-1215 (S)-added at concentrations in the range of M HETE did not stimulate MO binding to HAEC. To summarize, (1) High glucose increases MO binding to HAEC, and this effect is Can be reduced by blocking the pathway; (2) 12-LO product but not 15 MO coupling can be increased. Leukocyte type 12-LO is expressed in HAEC These results indicate that glucose-induced MO binding to human endothelium Support the role of 12-LO activity in   Applicants also note that a high-fat “cafeteria” diet can reduce leukocyte 1 Increasing 2-LO and diabetic (GK) rats are normal (Wistar star) demonstrated higher 12-LO in the heart compared to animals (Figure 25 and 26).                                 Diagnostic test   PCT application / US 94/00089 describes hl 12-LO or HETE or 1 Risk of developing disease states whose pathway products such as 2-HPETE are etiological agents In some patients, we report that antibodies will circulate. Therefore , Another embodiment of the present invention relates to hl 12-LO protein or HETE or the like. , As an immunogen, for example, assays of the ELISA type. this Such tests are mediated by activation or expression of hl 12-LO. It is also useful for diagnosing the disease state of                                 List of references 1. 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５Ｂ ６３７ ６３７ 31/045 31/045 31/155 31/155 31/20 ６０１ 31/20 ６０１ ６０２ ６０２ 33/06 33/06 38/00 45/00 38/46 48/00 45/00 Ｃ１２Ｎ 9/99 48/00 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/573 37/54 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 31/00 635 A61K 31/00 635B 637 637 31/045 31/045 31/155 31/155 31/20 601 31/20 601 602 602 33/06 33/06 38/00 45/00 38/46 48/00 45/00 C12N 9/99 48/00 G01N 33/573 A C12N 9/99 A61K 37/02 G01N 33/573 37/54

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． ヒト組織から単離され且つ精製されたヒト１２−リポキシゲナーゼであ って、ヒト血小板中で見出されるものとは異なる且つヒト１５−リポキシゲナー ゼとは異なる上記単離され且つ精製されたヒト１２−リポキシゲナーゼ。 ２． 前記１２−リポキシゲナーゼが、ヒト血管平滑筋細胞、副腎細胞、内皮 細胞または単球に由来する請求項１に記載の単離され且つ精製されたヒト１２− リポキシゲナーゼ。 ３． 請求項１〜２に記載の１２−リポキシゲナーゼまたは１２−ＨＥＴＥが 病因物質である患者の疾患状態を診断する方法であって、 （ｉ）該患者から生理学的検体を入手し；そして （ii）該病因物質または該病因物質に対する抗体が該検体中に存在しているか どうかを確認することを含む上記方法。 ４． 前記疾患状態が、炎症若しくは自己免疫症状、アテローム性動脈硬化症 、癌増殖、癌転移、インスリン非依存型糖尿病での機能障害性インスリン分泌、 グルコース誘導酸化性ストレスまたは終末器官機能障害若しくは損傷の発生であ る請求項３に記載の方法。 ５． 前記疾患状態が、アテローム性動脈硬化血管病、ヒト乳癌またはII型糖 尿病である請求項４に記載の方法。 ６． ｈｌ １２−リポキシゲナーゼまたは１２−ＨＥＴＥが病因物質である 疾患状態に苦しむ患者を治療する方法であって、該ヒト患者に対して、該ｈｌ １２−リポキシゲナーゼの発現を遅らせるまたは阻害する有効量のｈｌ １２− リポキシゲナーゼ阻害剤を投与することを含む上記方法。 ７． 前記疾患状態が、II型糖尿病または乳癌である請求項６に記載の方法。 ８． 前記疾患状態が、インスリン非依存型真性糖尿病であり、そしてヒト１ ２−リポキシゲナーゼ阻害剤を、筋肉内でグルコース輸送を誘導するインスリン の能力およびランゲルハンス島でのインスリンの分泌を増加させる治療的有効量 で投与する請求項６に記載の方法。 ９． 前記阻害剤が、ＮＤＧＡ、ＣＤＣ、パナキシノール（panaxynol）、ビ アカライン（biacalein）、ピオグリタゾン（pioglitazone）、アミノグアニジ ン（aminoguanidine）、またはｈｌ １２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを切断す るリボザイムである請求項６に記載の方法。 １０．ヒト患者での血管内皮成長因子生産を阻害するまたは減少させる方法で あって、該患者に対して、ｈｌ １２−リポキシゲナーゼの発現を遅らせるまた は阻害する有効量のｈｌ １２−リポキシゲナーゼ阻害剤を投与することを含む 上記方法。 １１．サイトカインに媒介された自己免疫性疾患、炎症性疾患またはアテロー ム性動脈硬化疾患に苦しむヒト患者の治療方法であって、該患者に対して、ヒト 血管平滑筋に対する該サイトカインの作用を媒介する治療的有効量のヒト１２− リポキシゲナーゼ阻害剤を投与することを含む上記方法。 １２．前記サイトカインが、インターロイキン１、インターロイキン４または インターロイキン８である請求項１１に記載の方法。 １３．ヒト内皮細胞に対して結合する単球を減少させる方法であって、それを 必要としている患者に対して、治療的有効量のヒト１２−リポキシゲナーゼ阻害 剤を投与することを含む上記方法。 １４．前記阻害剤が、ＮＤＧＡ、ＣＤＣ、パナキシノール、バイカライン（ba icalein）、ピオグリタゾン、アミノグアニジン、またはｈｌ １２−リポキシ ゲナーゼｍＲＮＡを切断するリボザイムである請求項１０、１１、１２または１ ３に記載の方法。 １５．炎症性疾患および自己免疫性疾患、アテローム性動脈硬化症、癌増殖お よび転移に関係したシグナル伝達経路を活性化する脂質メディエイタを発生させ る方法であって、該脂質メディエイタが、ヒドロペルオキシド、キナーゼ、マイ トジェン活性化キナーゼ、転写因子および癌遺伝子であり、それを必要としてい る哺乳動物に対して、治療的有効量のアラキドン酸またはリノール酸を投与する ことを含み、ここにおいて、前記ヒト１２−リポキシゲナーゼが該酸を用いてこ のような脂質メディエイタを発生させる上記方法。 １６．前記脂質メディエイタが、ヒドロペルオキシド、マイトジェン活性化キ ナーゼまたはＮＦｋＢである請求項１５に記載の方法。 １７．ヒト１２−リポキシゲナーゼの活性および発現を増加させる方法であっ て、ヒト患者に対して、治療的有効量の炎症性サイトカイン、成長因子またはア ンギオテンシンIIを投与することを含む上記方法。 １８．前記炎症性サイトカインがインターロイキン−１である請求項１７に記 載の方法。 １９．前記成長因子が血小板由来成長因子である請求項１７に記載の方法。 ２０．ヒト大動脈平滑筋細胞での１２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡおよびタン パク質の活性および発現を増加させる方法であって、該活性および発現を増加さ せる有効量のアンギオテンシンIIを用いる該細胞の処置を含む上記方法。 ２１．アンギオテンシンIIに関係した心臓血管病の減少方法であって、それを 必要としているヒト患者に対して、ヒト１２−ＬＯ経路を遮断するのに有効な薬 物の治療的有効量を投与することを含む上記方法。 ２２．ヒト患者の乳癌組織の増殖を阻害する方法であって、該患者に対して、 ヒト１２−ＬＯ発現または活性化を阻害する薬物の治療的有効量を投与すること を含む上記方法。 ２３．前記ヒト１２−リポキシゲナーゼ阻害剤が、ＮＤＧＡ、ＣＤＣ、パナキ シノール、バイカライン、ピオグリタゾン、アミノグアニジン、またはｈｌ １ ２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを切断するリボザイムである請求項２２に記載の 方法。 ２４．乳癌細胞増殖および発生が、自然発生的（basal）、表皮成長因子に誘 導されるまたはエストロゲンに誘導される請求項２２に記載の方法。 ２５．乳癌細胞増殖および発生に介在する方法であって、それを必要としてい る患者に対して、治療的有効量のヒト１２−リポキシゲナーゼ経路阻害剤を投与 することを含む上記方法。 ２６．前記ヒト１２−リポキシゲナーゼ阻害剤が、ＮＤＧＡ、ＣＤＣ、パナキ シノール、バイカライン、ピオグリタゾン、アミノグアニジン、またはｈｌ １ ２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡを切断するリボザイムである請求項２５に記載の 方法。 ２７．乳癌細胞増殖および発生が、自然発生的、表皮成長因子に誘導されるま たはエストロゲンに誘導される請求項２５に記載の方法。 ２８．アテローム性動脈硬化症で見られるサイトカインに誘導された血管平滑 筋細胞移動および増殖を監視する方法であって、サイトカインでの処置で該細胞 によるヒト１２−リポキシゲナーゼｍＲＮＡまたはタンパク質発現の変化を測定 することを含み、ここにおいて、該発現の増加が該細胞移動および増殖を示す上 記方法。 ２９．１２−ＨＥＴＥが病因物質である疾患状態を有する患者を治療する方法 であって、該患者のマイトジェン活性を低下させることを含む上記方法。 ３０．マイトジェン活性の低下が、前記患者でのＥＲＫ、ＪＡＫおよび／また はＪＮＫ活性を低下させることに起因する請求項２９に記載の方法。 ３１．ＪＮＫ活性が、ＰＡＫ活性を低下させることによって低下する請求項３ ０に記載の方法。 ３２．マイトジェン活性が、患者に対してマイトジェン活性を低下させるのに 充分な治療的有効量の１２−ＬＯ阻害剤を投与することによって低下する請求項 ２９に記載の方法。 ３３．疾患状態が、II型糖尿病または乳癌である請求項２９に記載の方法。 ３４．ＶＥＧＦが病因物質である疾患状態を有する患者を治療する方法であっ て、該患者のＶＥＧＦの量を減少させることを含む上記方法。 ３５．疾患状態が、増殖性糖尿病網膜症または糖尿病に関係した進行性血管病 である請求項３４に記載の方法。 ３６．ＶＥＧＦの量が、患者に対して患者のＶＥＧＦを減少させるのに充分な 治療的有効量の１２−ＬＯ阻害剤を投与することによって減少する請求項３４に 記載の方法。 ３７．II型糖尿病を有する患者でのインスリン受容体リン酸化を増加させる方 法であって、該患者に対して、インスリン受容体リン酸化を阻害することから１ ２−ＬＯ経路産物を阻害するのに充分な治療的有効量の１２−ＬＯ阻害剤を投与 することを含む上記方法。 ３８．患者の１２−ＬＯ遺伝子発現および１２−ＨＥＴＥ濃度を減少させる方 法であって、該患者に対して治療的有効量のＭｇを投与することを含む上記方法 。[Claims]   1. Human 12-lipoxygenase isolated and purified from human tissue Thus, a human 15-lipoxygener different from that found in human platelets The isolated and purified human 12-lipoxygenase described above, which is different from zeolites.   2. The 12-lipoxygenase is used for human vascular smooth muscle cells, adrenal cells, endothelium 2. The isolated and purified human 12- according to claim 1, which is derived from cells or monocytes. Lipoxygenase.   3. The 12-lipoxygenase or 12-HETE according to claim 1 or 2, A method of diagnosing a disease state of a patient who is an etiological agent,   (I) obtaining a physiological sample from the patient;   (Ii) whether the pathogen or an antibody against the pathogen is present in the sample The above method comprising determining whether or not.   4. The disease state is inflammation or autoimmune symptoms, atherosclerosis Dysfunctional insulin secretion in non-insulin dependent diabetes, cancer growth, cancer metastasis, Glucose-induced oxidative stress or the development of terminal organ dysfunction or injury 4. The method according to claim 3, wherein   5. The disease state is atherosclerotic vascular disease, human breast cancer or type II sugar 5. The method according to claim 4, wherein the disease is urine.   6. hl 12-lipoxygenase or 12-HETE is the etiological agent A method of treating a patient suffering from a disease condition, comprising: An effective amount of hl 12- to slow or inhibit the expression of 12-lipoxygenase Such a method, comprising administering a lipoxygenase inhibitor.   7. 7. The method of claim 6, wherein said disease state is type II diabetes or breast cancer.   8. The disease condition is non-insulin dependent diabetes mellitus and human 1 Insulin that induces glucose transport in muscle by using 2-lipoxygenase inhibitor Effective dose to increase insulin capacity and insulin secretion in islets of Langerhans 7. The method of claim 6, wherein the method is administered.   9. The inhibitor may be NDGA, CDC, panaxynol, Red line (biacalein), pioglitazone (pioglitazone), aminoguanidine Cleaves aminoguanidine or hl12-lipoxygenase mRNA 7. The method according to claim 6, which is a ribozyme.   10. In a way to inhibit or reduce vascular endothelial growth factor production in human patients To delay the expression of hl 12-lipoxygenase for said patient; Comprises administering an inhibitory effective amount of an hl 12-lipoxygenase inhibitor. The above method.   11. Cytokine-mediated autoimmune disease, inflammatory disease or athero A method for treating a human patient suffering from atherosclerosis A therapeutically effective amount of human 12- which mediates the effects of the cytokine on vascular smooth muscle Such a method, comprising administering a lipoxygenase inhibitor.   12. The cytokine is interleukin 1, interleukin 4 or The method according to claim 11, which is interleukin 8.   13. A method of reducing monocytes binding to human endothelial cells, comprising: For a patient in need thereof, a therapeutically effective amount of human 12-lipoxygenase inhibition The above method comprising administering an agent.   14． The inhibitor may be NDGA, CDC, panaxinol, baicalin (ba icalein), pioglitazone, aminoguanidine, or hl 12-lipoxy A ribozyme that cleaves genenase mRNA. 3. The method according to 3.   15. Inflammatory and autoimmune diseases, atherosclerosis, cancer growth and Of lipid mediators that activate signal transduction pathways involved in metastasis and metastasis Wherein the lipid mediator is a hydroperoxide, a kinase, Togen-activated kinases, transcription factors and oncogenes that require A therapeutically effective amount of arachidonic acid or linoleic acid to a mammal Wherein the human 12-lipoxygenase uses the acid to The above method for generating a lipid mediator such as   16. The lipid mediator comprises hydroperoxide, mitogen-activated 16. The method according to claim 15, which is a Nase or NFkB.   17． A method for increasing the activity and expression of human 12-lipoxygenase. To treat a human patient with a therapeutically effective amount of an inflammatory cytokine, growth factor or antigen. Such a method, comprising administering ngiotensin II.   18. The method according to claim 17, wherein the inflammatory cytokine is interleukin-1. The method described.   19. 18. The method according to claim 17, wherein said growth factor is a platelet-derived growth factor.   20. 12-lipoxygenase mRNA and tannin in human aortic smooth muscle cells A method of increasing the activity and expression of a protein, said method comprising increasing said activity and expression. The above method comprising treating the cells with an effective amount of angiotensin II.   21. A method for reducing cardiovascular disease associated with angiotensin II, comprising: Drugs effective in blocking the human 12-LO pathway for human patients in need Such a method, comprising administering a therapeutically effective amount of the substance.   22. A method for inhibiting the growth of breast cancer tissue in a human patient, for the patient, Administering a therapeutically effective amount of a drug that inhibits human 12-LO expression or activation The above method comprising:   23. The human 12-lipoxygenase inhibitor may be NDGA, CDC, Panaki Sinol, baicalin, pioglitazone, aminoguanidine, or hl 1 23. The ribozyme according to claim 22, which is a ribozyme that cleaves 2-lipoxygenase mRNA. Method.   24. Breast cancer cell growth and development is spontaneously (basal) induced by epidermal growth factor 23. The method of claim 22, which is induced or estrogen induced.   25. A method of mediating breast cancer cell growth and development that requires it A therapeutically effective amount of a human 12-lipoxygenase pathway inhibitor to a patient The above method comprising:   26. The human 12-lipoxygenase inhibitor may be NDGA, CDC, Panaki Sinol, baicalin, pioglitazone, aminoguanidine, or hl 1 26. The ribozyme that cleaves 2-lipoxygenase mRNA according to claim 25. Method.   27. Breast cancer cell growth and development is spontaneous, until epidermal growth factor is induced. 26. The method of claim 25, wherein the method is induced by estrogen.   28. Cytokine-induced vascular smoothness seen in atherosclerosis A method of monitoring muscle cell migration and proliferation, comprising treating said cells with treatment with a cytokine. Changes in human 12-lipoxygenase mRNA or protein expression due to Wherein said increased expression is indicative of said cell migration and proliferation. Notation.   29. Method for treating a patient having a disease state in which 12-HETE is the etiological agent Wherein said method comprises reducing mitogenic activity of said patient.   30. Decreased mitogen activity is associated with ERK, JAK and / or 30. The method of claim 29, which results from reducing JNK activity.   31. 4. The method according to claim 3, wherein JNK activity is reduced by reducing PAK activity. The method according to 0.   32. Mitogen activity reduces mitogen activity in patients Claims: Decreased by administering a sufficient therapeutically effective amount of a 12-LO inhibitor. 29. The method according to 29.   33. 30. The method according to claim 29, wherein the disease state is type II diabetes or breast cancer.   34. A method for treating a patient having a disease state in which VEGF is the etiological agent. And reducing the amount of VEGF in said patient.   35. If the disease state is proliferative diabetic retinopathy or progressive vascular disease associated with diabetes 35. The method of claim 34, wherein   36. The amount of VEGF is sufficient for the patient to reduce the patient's VEGF. 35. The method according to claim 34, wherein the amount is reduced by administering a therapeutically effective amount of a 12-LO inhibitor. The described method.   37. How to increase insulin receptor phosphorylation in patients with type II diabetes A method of inhibiting insulin receptor phosphorylation for said patient. Administer a therapeutically effective amount of a 12-LO inhibitor sufficient to inhibit a 2-LO pathway product The above method comprising:   38. Methods of reducing 12-LO gene expression and 12-HETE levels in patients A method comprising administering to said patient a therapeutically effective amount of Mg. .
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