【発明の詳細な説明】
ファルネシル−タンパク質転移酵素の阻害剤 発明の背景
Ｒａｓ遺伝子は、結腸直腸癌腫、膵外分泌腺癌、骨髄性白血病を含む多くのヒ
トの癌で活性化されていることが知見されている。Ｒａｓ作用の生物学的及び生
化学的研究は、ＲａｓはＧ−制御タンパク質のように機能することを示す。何故
ならば、Ｒａｓは、細胞を形質転換するために形質膜に局在化し、ＧＴＰと結合
する必要があるからである（Gibbs,J．ら、Microbiol.Rev．53: 171-286(1989)
）。癌細胞におけるＲａｓの型は、正常細胞におけるＲａｓから前者のタンパク
質を区別する変異を有する。
少なくとも３種の翻訳後修飾がＲａｓの膜局在化に関与し、３種全ての修飾が
ＲａｓのＣ末端で起こる。ＲａｓのＣ末端は“ＣＡＡＸ”即ち“Ｃｙｓ−Ａａａ1
−Ａａａ2−Ｘａａ”ボックスという配列モチーフを含む（Ａａａは脂肪族アミ
ノ酸、Ｘａａは任意のアミノ酸である）（Willumsenら、Nature310:583-586(198
4)）。このモチーフを有する他のタンパク質にはＲｈｏなどのＲａｓ関連ＧＴＰ
結合タンパク質、真菌の接合因
子、核ラミン、トランスジューシンのγサブユニットがある。
イソプレノイドファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）によるＲａｓのファルネシ
ル化はインビボでＣｙｓ上に起り、チオエーテル結合を形成する（Hancockら、C
ell 57: 1167(1989)；Caseyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:8323(1989)）
。加えて、Ｈａ−ＲａｓとＮ−Ｒａｓは、Ｃ末端Ｃｙｓファルネシル受容体の近
くのＣｙｓ残基でチオエステルの形成によりパルミトイル化される（Gutierrez
ら、EMBO J．8: 1093-1098(1989)；Hancockら、Cell 57: 1167-1177(1989)）。
Ｋｉ−Ｒａｓはパルミチン酸受容体Ｃｙｓを欠く。ＲａｓのＣ末端の最後の３個
のアミノ酸がタンパク質分解的に除去され、新しいＣ末端でメチルエステル化が
起こる（Hancockら、上記）。真菌の接合因子と哺乳動物の核ラミンは同じ修飾
過程を受ける（Andereggら、J.Biol.Chem．263: 18236(1988)；Farnsworthら、J
.Biol.Chem．264: 20422(1989)）。
インビボでのＲａｓファルネシル化の阻害は、ロバスタチン（Merck & Co.，R
ahway，NJ）とコムパクチン（Hancockら、上記；Caseyら、上記；Schaferら、Sc
ience 245: 379(1989)）で証明された。これらの薬剤は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダク
ターゼ
（ポリイソプレノイドとファルネシルピロリン酸前駆体の生産の律速酵素）を阻
害する。前駆体としてファルネシルピロリン酸を使用するファルネシル−タンパ
ク質転移酵素はＲａｓファルネシル化の原因であることが知見されてきた(Reiss
ら、Cell，62：81-88(1990)；Schaberら、J.Biol.Chem.，265: 14701-14704(199
0)；Schaferら、Science，249: 1133-1139(1990)；Manneら、Proc．Natl．Acad
．Sci．USA，87: 7541-7545(1990)）。
ファルネシル−タンパク質転移酵素の阻害、それによるＲａｓタンパク質のフ
ァルネシル化の阻害は、正常細胞を癌細胞に形質転換するＲａｓの能力を阻止す
る。本発明の化合物はＲａｓファシル化を阻害し、それにより下記に示すように
Ｒａｓ能の優勢な負の阻害剤として作用できる可溶性Ｒａｓを生成させる。癌細
胞における可溶性Ｒａｓは優勢な負の阻害剤となることができるが、正常細胞の
可溶性Ｒａｓは阻害剤ではないだろう。
胞質ゾル存在型（Ｃｙｓ−Ａａａ1−Ａａａ2−Ｘａａボックス膜ドメインは存
在しない）で且つ活性型（ＧＴＰａｓｅ活性の低下、ＧＴＰが結合したまま）の
Ｒａｓは膜結合Ｒａｓ機能の優勢な負のＲａｓ阻害剤として作用する(Gibbsら、
Proc.
Natl．Acad．Sci．USA，86: 6630-6634(1989))。正常のＧＴＰａｓｅ活性を有す
る細胞質ゾル存在型Ｒａｓは阻害剤として作用しない。Gibbsら（上記）はアフ
リカツメガエル卵母細胞と哺乳動物細胞でこの効果を示した。
Ｒａｓファルネシル化を阻止する本発明の化合物の投与は、膜におけるＲａｓ
の量を減少させるばかりでなくＲａｓの細胞質ゾルプールを産生する。活性化Ｒ
ａｓを有する腫瘍細胞で、細胞質ゾルプールは、膜結合Ｒａｓ機能の別のアンタ
ゴニストとして作用する。正常Ｒａｓを有する正常細胞で、Ｒａｓの細胞質ゾル
プールはアンタゴニストとして作用しない。ファルネシル化を完全には阻害しな
いときには他のファルネシル化タンパク質はその作用を続けることができる。
ファルネシル−タンパク質転移酵素活性を、該化合物投与量を調整することに
より減少させることができるか、又は完全に阻害することができる。該化合物投
与量を調整することによりファルネシル−タンパク質転移酵素の酵素活性を減少
させることは、この酵素を利用する他の代謝過程を妨害することから起こる望ま
しくない副作用の可能性を避けるために有用であろう。
これらの化合物とそれらのアナログはファルネシル−タンパ
ク質転移酵素の阻害剤である。ファルネシル−タンパク質転移酵素はファルネシ
ルピロリン酸を利用して、Ｒａｓ ＣＡＡＸボックスのＣｙｓチオール基をファ
ルネシル基で共有結合的に修飾する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害するこ
とによるファルネシルピロリン酸生合成の阻害は、インビボでＲａｓの膜局在化
を阻止しＲａｓ機能を阻害する。ファルネシル−タンパク質転移酵素の阻害は、
イソプレン生合成の一般的阻害剤の場合より特異的で、より少ない副作用しか伴
わない。
ＣＡＡＸ配列を有し、アミノ末端残基としてシステインを含有するテトラペプ
チドは、Ｒａｓファルネシル化を阻害することが以前に証明された(Schaberら、
上記；Reissら、上記；Reissら、PNAS，88: 732-736(1991)）。以前に記載され
たＣＡ1Ａ2Ｘ−型ＦＰＴａｓｅ阻害剤は、第２位置に非環状アミノ酸を含む。こ
のような阻害剤におけるＡ1位置へのプロリンの導入は、その位置での最も許容
されないアミノ酸置換であることが知見された（Reissら、PNAS(1991)）。この
ような阻害剤は阻害しえ、Ｒａｓファルネシル−タンパク質転移酵素の代替基質
となりうるか、又は純粋な競合阻害剤となりうる（米国特許第５，１４１，８５
１号、テキサス大学）。
ファルネシル−タンパク質転移酵素のある特定の阻害剤は選択的に、細胞内で
Ｒａｓ癌タンパク質のプロセシングを阻害する（N.E.Kohlら、Science，260,193
4-1937(1993)及びG.L.Jamesら、Science，260,1937-1942(1993)）。最近、ファ
ルネシル-タンパク質転移酵素の阻害剤はヌードマウスのｒａｓ依存性腫瘍の生
育を阻害することが示された（N.E.Kohlら、Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A.，91,9
141-9145(1994)）。
シトラコン酸誘導体であるファルネシル-タンパク質転移酵素阻害剤が、Chaet
omella acutisetaの株からの発酵産物として単離された（米国特許第５，２６０
，４７９号及び欧州特許公開第５４７６７１号）。これらの化合物の合成アナロ
グも報告された（米国特許第５，２４５，０６１号及び第５，２６０，４７９号
）。
Ｒａｓファルネシル-タンパク質転移酵素の阻害剤である非ペプチド性化合物
が、Cylindocarpon lucidumの株から単離された（米国特許第５，４２０，３３
４号）。
Ｒａｓファルネシル-タンパク質転移酵素（ＦＰＴａｓｅ）の阻害剤は２種の
大きなクラスに記載された。第１はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）のアナログ
であり、阻害剤の第２のク
ラスは酵素Ｒａｓのタンパク質基質に関連する。報告されてきたペプチド由来阻
害剤のほとんど全ては、タンパク質プレニル化のシグナルであるＣＡＡＸモチー
フに関連するシステイン含有分子である。この一般化の例外は、ペプチシナミン
と言われる天然産物の一クラスである（Omuraら、J.Antibiotics,46,222(1993)
）。
従って、ファルネシル-タンパク質転移酵素及び癌遺伝子タンパク質Ｒａｓの
翻訳後機能性化を阻害する非ペプチド性化合物を開発することが本発明の目的で
ある。本発明の化合物を含む化学療法用組成物と本発明の化合物を生産する方法
を開発することが本発明の更なる目的である。発明の概要
本発明は、ファルネシル−タンパク質転移酵素及び癌遺伝子タンパク質Ｒａｓ
のファルネシル化を阻害する化合物、本発明の化合物を含む化学療法用組成物、
並びに本発明の化合物の製造方法に関する。
本発明の化合物は、以下の式（Ｉ）
によって示される。発明の詳細な説明
本発明の化合物は、式（Ｉ）
（式中、
Ｒ1は、Ｈ、又はＣ1−Ｃ4アルキル；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ3；及び
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ4アルキル）
によって表されるか、又は医薬として許容できるその塩、水和物、もしくはプロ
ドラッグである。
本発明の一つの好適実施態様では、化合物は、式
（式中、Ｒ1は、Ｈ、又はＣ1−Ｃ4アルキル）
によって表されるか、又は医薬として許容できるその塩、水和物、もしくはプロ
ドラッグである。
本発明の第２の実施態様では、化合物は、式
（式中、
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ4アルキル、又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ3；及び
Ｒ3はＣ1−Ｃ4である）
によって表されるか、又は医薬として許容できるその塩、水和物もしくはプロド
ラグである。
以下のものは、本発明の化合物の特定の例であり、医薬とし
て許容できるその塩、水和物、もしくはプロドラッグを含む。
化合物Ａは、式
を有する。
化合物Ｂは、式
を有する。
化合物Ｈは、式
を有する。
化合物Ｉは、式
を有する。
本発明の化合物において、置換基及び／又は変化しうる基の組合せは、このよ
うな組合せにより安定な化合物が得られる場合のみ許される。
本明細書で用いる“アルキル”は、特定数の炭素原子を有する、分岐鎖と直鎖
の両方の飽和脂肪族炭化水素基を含むものとする。“アルキル”という用語には
、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、tert−ブ
チルなどが含まれる。
化合物Ａは、ホマ属の種（Phoma sp.）と同定された新規な菌ＭＦ６１１８を
用いる好気的発酵法によって製造される。この生物の使用は本明細書で特に記載
するが、上記生物の突然変異株も本発明の化合物を生産できうる。
菌ＭＦ６１１８は、ナミビア、オムデルで採集された砂漠の
灌木Zygophyllum staffiiの葉リターから分離された菌類ホマ属の種の菌であり
、この菌は、MD20852,Rockville,Parklawn Drive12301のAmerican Type Culture
CollectionにＡＴＣＣ74347として寄託された。
ホマ属の種と同定された菌ＭＦ６１１８は以下の形態学的性質を有する。
オートミール寒天（Difco Laboratories）上では、コロニーは、約２５℃、相
対湿度６７％、１２時間の蛍光照射時間で、約７日後、直径１５ｍｍに達する。
コロニーマットは、白色、羊毛状で、垂直に８ｍｍに生育する；縁は白色で、切
込みがない；裏面は淡黒色である；可溶性色素又は浸出液は無い。
ボテト−デキストロース寒天（Difco）上では、コロニーは、同一条件下で直
径１５ｍｍに達する。コロニーマットは、白色で、木綿状ないし羊毛状である；
縁は透明で、密着し、切込みがない；裏面は淡黄色で、淡橙−黄色（Pale Orang
e-Yellow）（Ridgway,R.1921からの大文字で書かれた色名、Color Standards an
d nomenclature，Washington，D.C.）である；可溶性色素又は浸出液は無い。
ＭＹＥ（１％モルトエキス、０．２％酵母エキス（両方とも
Difco））上では、コロニーは、同一条件下で７日後直径１５ｍｍに達する；コ
ロニーマットは、白色、木綿状である；縁は透明で、切込みがない；裏面は淡黄
色、淡黄色−橙（Pale Yellow-Orange）である；可溶性色素又は浸出液は無い；
３７℃、暗所では生育しない。
コーンミール寒天（Difco）上では、コロニーは、同一条件下直径１６ｍｍに
達する。コロニーマットは透明で密着し、縁近くではまばらな木綿状の房状であ
る；縁は透明で、切込みがない；可溶性色素及び浸出液は無い。
分生子殻は、黄緑色ないし黒色、１００〜３００μｍ、球形ないし亜球形、と
きには多数の孔口を有する不規則形態、普通は密でない網状構造の菌糸体に覆わ
れている。分生子形成細胞はアンプル形で、フィアライド性である。分生子浸出
物は白色クリーム状である。分生子は、楕円状が優勢で、ときには卵状、ダンベ
ル形又は円筒形；透明；各端で生育旺盛；４−５×１−２μｍである。
菌類ホマ属（不完全菌亜門・分生子果不完全菌綱）の分類学的特徴のキーは、
分生子殻；内生出芽型で、アンプル形の分生子形成細胞；透明、楕円形、ガツレ
ートで、ムコイド状の塊中
に湿潤した分生子；を含むことである（B.Sutton，1980，The Coelomycetes，Co
mmonwealth Mycological Institute，Kew，Surrey，England，p.696）。ＭＦ６
１１８は上記の属特有の特徴の全てを有するが、培養して、この菌類を確信をも
って特定の種に同定するための顕著な特徴を全く有しない。そのため、それをホ
マ属の種と命名する。
本発明の化合物は、同化可能炭素源と窒素源を含む水性栄養培地で、好ましく
は好気的条件下に上記菌類を培養して得ることができる。栄養培地はまた、無機
塩及び消泡剤をも含みうる。
栄養培地の好適な炭素源はスクロース又はフルクトースである。好適な窒素源
は、コーンミール及び酵母エキスである。
一般的に、炭素源及び窒素源は組合せて使用され、純粋形態である必要はない
。微量の、生育因子、ビタミン、及び無機栄養物を含む、より純粋でない物質も
使用できる。炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムもしくはカリウム、塩化ナトリ
ウムもしくはカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩などの（これらに限
定されない）無機塩も培地に添加することができる。マンガン、鉄、モリブデン
、亜鉛などの微量金属も含まれる。更に、必要ならば、特に培養培地がかなり泡
立つならば、ポリ
エチレングリコールもしくはシリコーンなどの消泡剤を添加することができる。
本発明の化合物の好適な生産方法は、適切な培地に生産生物の胞子又は菌糸体
を接種し、次に好気的条件下培養することからなる。
一般的に、発酵法は、最初に、栄養シード培地に保存した培養源を植菌し、と
きには２段階工程により、活性化合物の生産におけるシードとなる生物の生育を
行わせることである。植菌後、温度約２０〜３０℃、好ましくは約２２〜２５℃
で、攪拌しながらフラスコをインキュベートする。攪拌速度は最大４００ｒｐｍ
、好ましくは約２００〜２２０ｒｐｍでありうる。シードフラスコを約２〜１０
日、好ましくは約２〜４日インキュベートする。生育が十分のとき（通常約２〜
４日）、培養物を用いて、生産培地フラスコに植菌することができる。特に大容
量容器を使うときには、第２段階のシード生育物を使用できる。このことを行う
ときには、培養生育物の一部を用い、第２のシードフラスコに植菌し、より短い
時間であるが同様の条件下インキュベートする。
植菌後、発酵生産培地を、約３〜３０日、好ましくは１２〜
２１日インキュベートする。発酵は、温度約２０〜３０℃で好気的に行う。最適
な結果を得るために、温度は約２２〜２８℃、最適には約２２〜２５℃の範囲で
ある。所望化合物の生産の適切な期間後、発酵フラスコを回収し、活性化合物を
分離する。
下記のファルネシル−タンパク質転移酵素（ＦＰＴａｓｅ）阻害アッセイでは
、化合物のインビトロのＲａｓファルネシル化阻害能力を測定した。組換えヒト
ＦＰＴａｓｅを２ｎＭで使用した。本発明の化合物によるＦＰＴａｓｅ阻害能力
は濃度１０μＭ以下で実証された。Ｒａｓファルネシル−タンパク質転移酵素のインビトロ阻害
ファルネシル−タンパク質転移酵素のアッセイ。Ｒａｓペプチド（Ｒａｓ−Ｃ
ＶＬＳ，Ｒａｓ−ＣＶＩＭ及びＲＡＳ−ＣＡＩＬ）をそれぞれ、Schaberら、J.B
iol.Chem．265,14701-14704(1990)及びGibbsら、PNAS USA 86,6630-6634(1989)
によって記載されたように調製した。組換えヒトＦＰＴａｓｅ（ｒｈＦＰＴａｓ
ｅ）を、Omerら（Biochemistry 32,5167-5176(1993))によって記載されたように
調製し、１００ｍＭ Ｎ−(２−ヒドロキシ エチル)ピペラジン−Ｎ′−（２−エ
タンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ），ｐＨ７．４、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、
５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコ
ール２０，０００、１０μＭ ＺｎＣｌ2、５０ｎＭ［3Ｈ］−ファルネシル二リ
ン酸（［3Ｈ］−ＦＰＰ；７４０ＣＢｑ／ｍｍｏｌ，New England Nuclear）、１
００ｎＭ Ｒａｓ−ＣＶＩＭ、及び２ｎＭ ｒｈＦＰＴａｓｅを含む１００μＬ
容量中、３１℃で３０分間アッセイを行った。反応をＦＰＴａｓｅで開始させ、
エタノール中の３０％（ｖ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１００μＬで停止さ
せた。沈殿物を、TomTec Mach II 細胞回収器を用いてフィルター−マット上に
回収し、１００％エタノールで洗浄し、乾燥し、ＬＫＢ β−プレートカウンタ
ーで計測した。アッセイは両方の基質で直線であった。ＦＰＴａｓｅレベル及び
時間；［3Ｈ］−ＦＰＰの１０％未満が反応時間中利用された。精製化合物を１
００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、アッセイ溶液中に２０倍希
釈した。試験化合物の存在下のファルネシル導入の量を試験化合物の非存在下の
導入の量と比較して、％阻害を測定する。
本発明の化合物の阻害活性は、C.A.Omerら（Biochemistry,32,5167-5176(1993
)）に記載のように得られた組換えヒトＦＰＴａｓｅを用いるアッセイでも測定
しうる。
構造式Ｉの化合物を含む医薬組成物は、ファルネシル-タンパク質転移酵素及
び癌遺伝子タンパク質Ｒａｓのファルネシル化を阻害する。該化合物は、哺乳動
物、特にヒトのための医薬として有用である。これらの化合物は、癌治療での使
用のために患者に投与できる。本発明の化合物で治療できうる癌のタイプの例に
は、結腸直腸癌腫、膵外分泌腺癌腫、及び骨髄性白血病があるが、それらに限定
されない。
本発明の化合物は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与でき、単独か、又は好ま
しくは、標準的製薬実務に従い、医薬組成物として医薬的に許容可能な担体又は
希釈剤、必要によりミョウバンなどの公知のアジュバントと組合せて投与できる
。該化合物は、経口、又は静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、局所投与を含む非経
口で投与できる。
本発明の化学療法用化合物の経口での使用の場合、選択された化合物を、例え
ば錠剤もしくはカプセルの形態で、又は水溶液もしくは水性懸濁液として投与で
きる。経口使用用の錠剤の
場合、通常使用される担体には乳糖及びコーンスターチがあり、ステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤が通常添加される。カプセル形態における経口投与の場
合、有用な希釈剤には、乳糖及び乾燥コーンスターチがある。水性懸濁液が経口
投与用に必要の場合、活性成分を乳化剤及び懸濁剤と組合せる。所望ならば、あ
る特定の甘味料及び／又はフレーバー剤を加えることができる。筋肉内、腹腔内
、皮下、静脈内での使用の場合、通常活性成分の滅菌液を製造するが、溶液のｐ
Ｈを適切に調整し、緩衝化すべきである。静脈内使用の場合、溶質の合計濃度を
、製剤を等張にするために制御すべきである。
本発明はまた、治療上有効量の本発明の化合物を医薬的に許容可能な担体又は
希釈剤と共に、又はそれ無しで投与することを特徴とする、癌の治療に有用な医
薬組成物も包含する。本発明の適切な組成物は、本発明の化合物と薬理的に許容
可能な担体、例えばあるｐＨレベル（例えば７．４）の生理食塩水を含む水溶液
を包含する。溶液はまた、局所ボーラス注射によって患者の筋肉内血流に導入で
きる。
本発明の化合物をヒト患者に投与する場合、一日の投与量は通常は、主治医に
より決定されるが、その投与量は一般的に年
齢、体重、個々の患者の反応及び患者の症状の程度によって変わる。
一つの典型的な適用においては、適切な量の化合物を、癌の治療を受けるヒト
患者に投与する。１日当り約０．１〜約２０ｍｇ／哺乳動物の体重ｋｇ、好まし
くは０．５〜約１０ｍｇ／体重ｋｇが投与される。
本発明の化合物は、文献上公知でありうる、又は実験方法のところで例示した
、エステル加水分解、保護基の切断などの他の標準的操作に加えて、以下の反応
スキームで示す反応によっても製造できる。
本発明の化合物Ａであるメチルエステルは、メタノール水溶液中の炭酸カリウ
ム、水中の水酸化ナトリウムなどの標準的加水分解条件を用い、容易に加水分解
でき、酸Ｂを得、次に、所望のアルコールを用いるフィッシャーエステル化によ
って化合物Ｃに変換できる。ピリジン中の無水酢酸、ピリジン中の塩化アシルな
どの標準的アシル化試薬を用いる化合物Ｂのアシル化によって、化合物Ｄを得、
次に、適切なアルコールによるフィッシャーエステル化を用いエステル化し、化
合物Ｇを得ることができる。化合物Ｇはまた、上記アシル化法を用いて、化合物
Ｃから製造できる。化合物Ｂの酸基は、ベンジルエステルなどの適合性のある保
護基で保護でき、次に、水素化ナトリウム又は炭酸カリウムなどの適切な塩基、
及び例えばヨウ化メチルなどの適切なハロゲン化アルキルと反応させて、エステ
ル保護化合物Ｅを得、水素化分解又は塩基加水分解などの標準的条件を用いる脱
保護で、化合物Ｅを得る。水素化ナトリウム又は炭酸カリウムなどの適切な塩基
、及び例えばヨウ化メチルなどのハロゲン化アルキルを用いての化合物Ｃのアル
キル化により化合物Ｆを得る。
本発明の特定の化合物は、反応スキームＢで示すように誘導体化されうる。本
明細書記載の発酵によって得られる化合物Ａは、ピリジン中の無水酢酸、ピリジ
ン中の塩化アセチルなどの標準的条件下でアシル化され、アセチル化化合物Ｈを
得ることができる。ジアゾメタンなどのメチル化試薬による化合物Ａの処理によ
って、メチルエーテルメチルエステルＨを得る。メタノール水溶液中の炭酸カリ
ウム、水中の水酸化ナトリウムなどの標準的加水分解条件を用いて、メチルエス
テルＡを加水分解
でき、酸である化合物Ｂを得、それは、化合物Ｈ及びＩなどの化合物の合成の中
間体として役立ちうる。
本発明の化合物の医薬として許容できる塩には、ナトリウム、カリウム、アル
ミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、亜鉛などのカチオン、及びア
ンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルカミン、リシン、アルギニン、
オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイ
ン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチ
ルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、及び水酸化
テトラメチルアンモニウムなどの塩基から形成される塩がある。本明細書で含ま
れる塩は、当業界公知の標準的方法を用い、式Ｉの化合物のメチルエステルをカ
ルボン酸に加水分解し、次に適切な塩基と反応させ、上記塩を形成させて得た塩
を包含する。
式Ｉの化合物の水和物は本発明の範囲に含まれる。化合物は、一水和物、二水
和物、三水和物などを形成できる。
式Ｉの化合物のプロドラッグ形態も本発明の範囲内に含まれる。プロドラッグ
は、生物活性化合物の化学修飾から得られ、酵素的開裂又は加水分解的開裂によ
って、インビボで活性化合
物を遊離させる化合物である（Modern Pharmaceuticals，２版，vol.40，p.861,
1990）。本発明の化合物は、酸部分又はヒドロキシル部分のプロドラッグエステ
ルを形成できる。
本明細書に記載する実施例で、本発明の更なる理解の助けとなることを意図し
ている。使用した特定の物質、種類、及び条件は、本発明の更なる例示であり、
本発明の論理的範囲を制限するものではない。
実施例１ ７−ヒドロキシ−９−メチル−６−オキソ−６Ｈ−オキセピノ［２，３−ｂ］［ １］ベンゾピラン−５−カルボン酸メチルエステル（化合物Ａ） 工程Ａ：シード培養物ＭＦ６１１８の製造
ＭＦ６１１８培養物を滅菌土壌中の胞子と菌糸の混合物として維持し、使用直
前まで４℃に保存した。以下の組成（ｇ／Ｌ）のシード培地５０ｍＬを含む２５
０ｍＬ三角フラスコに無菌的に移した保存土壌の小部分を用いて、シード培養液
に植菌した；コーンスティープリカー，５．０：トマトペースト，４０．０；オ
ートフラワー，１０．０；グルコース，１０．０；及び微量元素溶液，１０ｍＬ
／Ｌ（０．６Ｎ ＨＣｌに溶解した、
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，１．０；ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ，１．０；ＣｕＣｌ2・２Ｈ2
Ｏ，０．０２５；ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ，０．１；Ｈ3ＢＯ3，０．０５６；（ＮＨ4
）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ，０．０１９；ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，０．２（ｇ／Ｌ）
）。滅菌前に、ＮａＯＨを添加して培地のｐＨを６．８に調整した。蒸留水を用
いてシード培地を調製し、三角フラスコに分注し、その三角フラスコに綿栓をし
、１２１℃で２０分間オートクレーブした。シード培養液を、ジャイロトリーシ
ェーカー（２２０ｒｐｍ，５．１ｃｍ動程）上、２５℃で７２−７３時間インキ
ュベートし、次に、発酵生産フラスコに植菌した。工程Ｂ：シード培養物ＭＦ６１１８からの生産培養液の調製
以下のように処方した液体生産培地４４ｍＬを含む２５０ｍＬ三角フラスコで
、生産発酵を行った：コーンミール５０．０ｇ，スクロース８０．０ｇ，酵母エ
キス１．０ｇ，及び蒸留水（合計１Ｌにする）。液体培地生産フラスコに綿栓を
し、１２１℃で１５分間滅菌した。各生産フラスコにシード生育液２．０ｍＬを
植菌した。ジャイロトリーシェーカー（220rpm,5.1cm 動程）上で１７日間、生
産フラスコの１／３を２２℃で、１／３を２５℃で、１／３を２７℃でインキュ
ベートした。回収時に、
各フラスコをメチルエチルケトン（ＭＥＫ）５０ｍＬで抽出した。全ての回収フ
ラスコからの液体を一緒にし、生成物分離のために使用した。工程Ｃ：７−ヒドロキシ−９−メチル−６−オキソ−６Ｈ−オキセピノ［２，３ −ｂ］［１］ベンゾピラン−５−カルボン酸メチルエステルの分離精製
ホマ属の種（ＭＦ６１１８）（０．７８Ｌ）の実施例１に記載の発酵液を１７
日生育させ、シェーカー上で２時間フラスコを振蕩してメチルエチルケトン各１
Ｌで２回抽出した。抽出液をセライト床の濾過で集めた。ロータリーエバポレー
ターを用いる蒸留で、メチルエチルケトンを減圧除去し、最終的に凍結乾燥し、
固体４．５ｇを得た。その固体をメタノール２００ｍＬで摩砕し、濾過し、濾液
Ａと不溶解固体を得た。不溶解固体を、酢酸エチル：アセトン １：１（２００
ｍＬ）中で加熱し、濾過して濾液Ｂと不溶性残渣を得た。濾液Ｂをゆっくりと減
圧濃縮し、化合物Ａの厚い黄色結晶を得、それを濾過で集めた。かなりの量の化
合物Ａが濾液Ａにも存在し、セファデックスＬＨ−２０カラム２．０Ｌでのクロ
マトグラフィーで精製した。
メタノールによるカラムの溶出、続いてメタノールによる摩砕、次の濾過により
、更なる量の化合物Ａを得た。1
Ｈ ＮＭＲ４００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ3）δ：２．４０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝０．４Ｈ
ｚ，ＣＨ3），３．８２（３Ｈ，ｓ，ＯＣＨ3），５．８７（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．
６Ｈｚ，＝ＣＨ），６．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，＝ＣＨ），６．６５
（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝１．６，０．８Ｈｚ，ＡｒＣＨ），６．６６（１Ｈ，ｄｑ，
Ｊ＝１．２，０．４Ｈｚ，ＡｒＣＨ），６．９４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，
＝ＣＨ），１２．０５（１Ｈ，ｓ，ＯＨ）。13
Ｃ ＮＭＲ４００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ3）δ：２２．３９（ＣＨ3），５２．５０
（ＯＣＨ3），１０４．７７（ｑＣ），１０７．２６（２×ｑＣ），１１３．２
９（ＣＨ），１１６．４４（ＣＨ），１３０．８０（ｑＣ），１３１．９３（Ｃ
Ｈ），１４６．７１（ＣＨ），１４７．４９（ｑＣ），１５３．６３（ｑＣ），
１６０．５４（ｑＣ），１６１．７２（ｑＣ），１６６．９４（ｑＣ），１８２
．２６（ｑＣ）。
ＭＳ（ＨＲＥＩ）：ｍ／ｚ３００．０６２９（Ｍ+，Ｃ16Ｈ12Ｏ6としての計算値
：３００．０６３４）。
実施例２ ７−ヒドロキシ−９−メチル−６−オキソ−６Ｈ−オキセピノ［２，３−ｂ］［ １］ベンゾピラン−５−カルボン酸メチルエステル（化合物Ａ）
標記化合物の生産方法は、実施例１工程Ａに記載のシード培養液を実施例１工
程Ｂの生産培地に植菌すること、及び次にジャイロトリーシェカー（２２０ｒｐ
ｍ，５．１ｃｍ動程）上で１５日間、２２℃で植菌された生産フラスコをインキ
ュベートすることを特徴とする。回収時に、各フラスコを、ＭＥＫ５０ｍＬで抽
出し（２７℃で４５分間２２０ｒｐｍ攪拌）、ＭＥＫ層のアッセイのための調製
を行った。この後、実施例１工程Ｃに記載の化合物の分離精製を行った。実施例
１工程Ｃの方法後、標記化合物を分離精製した。
実施例３ ７−ヒドロキシ−９−メチル−６−オキソ−６Ｈ−オキセピノ［２，３−ｂ］［ １］ベンゾピラン−５−カルボン酸（化合物Ｂ）
メタノール水溶液中の炭酸カリウムによる実施例１の生成物の加水分解、次い
で希釈酸による酸性化により、標記化合物を
製造する。
実施例４ ７−メトキシ−９−メチル−６−オキソ−６Ｈ−オキセピノ［２，３−ｂ］［１ ］ベンゾピラン−５−カルボン酸メチルエステル（化合物Ｈ）
塩化メチレン中で、実施例１の生成物をジアゾメタンと反応させて、標記化合
物を製造する。
実施例５ ７−アセチルオキシ−９−メチル−６−オキソ−６Ｈ−オキセピノ［２，３−ｂ ］［１］ベンゾピラン−５−カルボン酸メチルエステル（化合物Ｉ）
実施例１の生成物をピリジンと無水酢酸と反応させて、標記化合物を製造する
。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Inhibitors of farnesyl-protein transferase Background of the Invention
The Ras gene is found in many humans, including colorectal carcinoma, pancreatic exocrine adenocarcinoma, and myeloid leukemia.
It has been found that it is activated in cancers of cancer. Biology and life of Ras action
Chemical studies indicate that Ras functions like a G-regulated protein. why
If so, Ras localizes to the plasma membrane to transform cells and binds GTP
(Gibbs, J. et al., Microbiol. Rev. 53: 171-286 (1989)).
). The type of Ras in cancer cells differs from Ras in normal cells by the former protein.
It has mutations that distinguish quality.
At least three post-translational modifications are involved in Ras membrane localization, and all three modifications are
Occurs at the C-terminus of Ras. The C-terminus of Ras is "CAAX" or "Cys-Aaaa".1
-AaaaTwo-Xaa "box (Aaaa is an aliphatic amino acid)
Acid, Xaa is any amino acid) (Willumsen et al., Nature 310: 583-586 (198
Four)). Other proteins with this motif include Ras-related GTP such as Rho
Binding proteins, fungal mating factors
There are gamma subunits of pups, nuclear lamin, and transjucin.
Farnesi of Ras with isoprenoid farnesyl pyrophosphate (FPP)
The inactivation occurs on Cys in vivo, forming a thioether bond (Hancock et al., C
ell 57: 1167 (1989); Casey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8323 (1989))
. In addition, Ha-Ras and N-Ras are located near the C-terminal Cys farnesyl receptor.
Many Cys residues are palmitoylated by thioester formation (Gutierrez
EMBO J. et al. 8: 1093-1098 (1989); Hancock et al., Cell 57: 1167-1177 (1989)).
Ki-Ras lacks palmitate receptor Cys. Last three C-terminal of Ras
Amino acids are proteolytically removed, resulting in methyl esterification at the new C-terminus
Happens (Hancock et al., Supra). Fungal mating factor and mammalian nuclear lamin have the same modification.
Undergo a process (Anderegg et al., J. Biol. Chem. 263: 18236 (1988); Farnsworth et al., J.
.Biol.Chem. 264: 20422 (1989)).
Inhibition of Ras farnesylation in vivo is described by lovastatin (Merck & Co., R
ahway, NJ) and compactin (Hancock et al., supra; Casey et al., supra; Schafer et al., Sc)
ience 245: 379 (1989)). These drugs are HMG-CoA redac
Taze
(The rate-limiting enzyme in the production of polyisoprenoid and farnesyl pyrophosphate precursors)
Harm. Farnesyl-tampa using farnesyl pyrophosphate as precursor
Transferase has been found to be responsible for Ras farnesylation (Reiss
Cell, 62: 81-88 (1990); Schaber et al., J. Biol. Chem., 265: 14701-14704 (199).
0); Schafer et al., Science, 249: 1133-1139 (1990); Manne et al., Proc. Natl. Acad
. Sci. USA, 87: 7541-7545 (1990)).
Inhibition of farnesyl-protein transferase, thereby enhancing Ras protein
Inhibition of farnesylation blocks Ras' ability to transform normal cells into cancer cells
You. The compounds of the present invention inhibit Ras fasylation, thereby causing
Generates soluble Ras that can act as a predominant negative inhibitor of Ras capacity. Cancer
Soluble Ras in vesicles can be the predominant negative inhibitor, but
Soluble Ras would not be an inhibitor.
Cytosolic presence (Cys-Aaaa)1-AaaaTwo-Xaa box membrane domain is present
Absent) and active (reduced GTPase activity, GTP bound)
Ras acts as a predominant negative Ras inhibitor of membrane-bound Ras function (Gibbs et al.,
Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6630-6634 (1989)). Has normal GTPase activity
The cytosolic Ras does not act as an inhibitor. Gibbs et al. (Above)
This effect has been demonstrated in lyme Xenopus oocytes and mammalian cells.
Administration of a compound of the present invention that inhibits Ras farnesylation may result in Ras
Produces a cytosolic pool of Ras as well as reducing the amount of Activation R
In tumor cells with as, the cytosolic pool is another antagonist of membrane-bound Ras function.
Acts as a gonist. Normal cells with normal Ras, Ras cytosol
Pools do not act as antagonists. Do not completely inhibit farnesylation
Sometimes other farnesylated proteins can continue their action.
Farnesyl-protein transferase activity can be controlled by adjusting the dose of the compound.
It can be reduced more or completely inhibited. The compound
Adjust the dosage to reduce the enzyme activity of farnesyl-protein transferase
Is desired because it interferes with other metabolic processes that utilize this enzyme.
It may be useful to avoid the possibility of unwanted side effects.
These compounds and their analogs are farnesyl-
It is an inhibitor of protein transferase. Farnesyl-protein transferase is farnesi
The Cys thiol group of the Ras CAAX box is purified using lupyrophosphate.
It is covalently modified with a renesyl group. Inhibiting HMG-CoA reductase
Inhibition of Farnesyl Pyrophosphate Biosynthesis Causes Membrane Localization of Ras in Vivo
And inhibits Ras function. Inhibition of farnesyl-protein transferase is
More specific and with fewer side effects than general inhibitors of isoprene biosynthesis
I don't know.
Tetrapept having CAAX sequence and containing cysteine as amino terminal residue
Pide has previously been shown to inhibit Ras farnesylation (Schaber et al.,
Reiss et al., Supra; Reiss et al., PNAS, 88: 732-736 (1991)). Previously mentioned
CA1ATwoX-type FPTase inhibitors include an acyclic amino acid at the second position. This
A in an inhibitor such as1Introducing proline at a position is the most permissive at that position
It was found to be an unsubstituted amino acid substitution (Reiss et al., PNAS (1991)). this
Such inhibitors can inhibit and are alternative substrates for Ras farnesyl-protein transferase
Or a pure competitive inhibitor (US Pat. No. 5,141,85)
No. 1, University of Texas).
Certain inhibitors of farnesyl-protein transferase are selectively expressed intracellularly.
Inhibits Ras oncoprotein processing (N.E. Kohl et al., Science, 260,193).
4-1937 (1993) and G.L. James et al., Science, 260,1937-1942 (1993)). Recently,
Inhibitors of renesyl-protein transferase are capable of producing ras-dependent tumors in nude mice
(N.E. Kohl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9).
141-9145 (1994)).
Faretyl-protein transferase inhibitor, a citraconic acid derivative, is
isolated as a fermentation product from a strain of omella acutiseta (U.S. Pat.
, 479 and EP-A-547671). Synthetic analogs of these compounds
(US Pat. Nos. 5,245,061 and 5,260,479).
).
Non-peptidic compounds which are inhibitors of Ras farnesyl-protein transferase
Was isolated from a strain of Cylindocarpon lucidum (US Pat. No. 5,420,33).
No. 4).
Inhibitors of Ras farnesyl-protein transferase (FPTase)
Big class listed. The first is an analog of farnesyl diphosphate (FPP)
And the second step of the inhibitor.
Russ is related to the protein substrate of the enzyme Ras. Peptide-derived inhibitors that have been reported
Almost all of the harmful agents are CAAX mochi, which are signals of protein prenylation.
A cysteine-containing molecule associated with The exception to this generalization is pepticinamine
(Omura et al., J. Antibiotics, 46, 222 (1993)
).
Therefore, farnesyl-protein transferase and oncogene protein Ras
The purpose of the present invention is to develop non-peptidic compounds that inhibit post-translational functionalization
is there. Chemotherapeutic compositions comprising compounds of the invention and methods for producing compounds of the invention
Is a further object of the present invention.Summary of the Invention
The present invention relates to farnesyl-protein transferase and oncogene protein Ras.
A compound that inhibits farnesylation, a chemotherapeutic composition comprising the compound of the present invention,
And a method for producing the compound of the present invention.
The compound of the present invention has the following formula (I)
Indicated byDetailed description of the invention
The compounds of the present invention have the formula (I)
(Where
R1Is H or C1-CFourAlkyl;
RTwoIs H, C1-CFourAlkyl or —C (＝ O) RThree;as well as
RThreeIs C1-CFourAlkyl)
Or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, or professional salt thereof.
It is a drag.
In one preferred embodiment of the invention, the compound has the formula
(Where R1Is H or C1-CFourAlkyl)
Or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, or professional salt thereof.
It is a drag.
In a second embodiment of the present invention, the compound has the formula:
(Where
RTwoIs H, C1-CFourAlkyl or —C (＝ O) RThree;as well as
RThreeIs C1-CFourIs)
Or a pharmaceutically acceptable salt, hydrate or prod thereof
It is a lag.
The following are specific examples of compounds of the present invention, and
And its acceptable salts, hydrates, or prodrugs.
Compound A has the formula
Having.
Compound B has the formula
Having.
Compound H has the formula
Having.
Compound I has the formula
Having.
In the compounds of the present invention, combinations of substituents and / or variable groups
Such a combination is only allowed when a stable compound is obtained.
As used herein, "alkyl" refers to a branched or straight chain having the specified number of carbon atoms.
And both saturated aliphatic hydrocarbon groups. The term “alkyl”
, Methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl
Chill etc. are included.
Compound A is a new fungus, MF6118, identified as a Phoma sp.
Produced by the aerobic fermentation method used. The use of this organism is specifically described herein
However, mutant strains of the above organisms can also produce the compounds of the present invention.
Fungus MF6118 is found in a desert collected in Omdel, Namibia.
A fungus from the leaf litter of the shrub Zygophyllum staffii
This bacterium is obtained from American Type Culture of MD20852, Rockville, Parklawn Drive12301.
Deposited in the Collection as ATCC74347.
Fungus MF6118 identified as a species of the genus Homa has the following morphological properties.
On oatmeal agar (Difco Laboratories), colonies are grown at about 25 ° C.
With a fluorescent irradiation time of 12 hours at 67% relative to humidity, the diameter reaches 15 mm after about 7 days.
The colony mat is white, wool-like and grows vertically to 8 mm;
No inset; light black on back; no soluble dye or exudate.
On potato-dextrose agar (Difco), colonies are directly grown under the same conditions.
The diameter reaches 15 mm. Colony mats are white, cottony or wool-like;
Edges are clear, tight, and notched; back is pale yellow, pale orange-yellow (Pale Orang
e-Yellow) (Color names written in capital letters from Ridgway, R.1921, Color Standards an
d nomenclature, Washington, D.C.); no soluble dyes or exudates.
MYE (1% malt extract, 0.2% yeast extract (both
On Difco)), colonies reach 15 mm in diameter after 7 days under the same conditions;
Ronny mat is white, cotton-like; edges are transparent and not cut; back is pale yellow
Color, pale yellow-orange; no soluble dye or leachate;
Does not grow in the dark at 37 ° C.
On cornmeal agar (Difco), colonies grow to 16 mm in diameter under the same conditions.
Reach. The colony mat is transparent and cohesive, and has a sparse cotton-like tuft near the edges.
Edges are clear, no cuts; no soluble dyes and exudates.
Conidial shells are yellow-green to black, 100-300 μm, spherical or subspherical,
Irregular form with numerous pores when covered, usually covered with a mysterious, less dense meshwork
Have been. The conidial cells are ampoule-shaped and phialid. Conidia leaching
The object is a white cream. Conidia are predominantly elliptical, sometimes egg-shaped,
Transparent or; vigorous growth at each end; 4-5 × 1-2 μm.
The key to the taxonomic characteristics of the fungi Homa (Defective Mycota / Deficient Conidium) is
Conidium shell; endogenous budding, ampoule-shaped conidium-forming cells; transparent, oval, gut
In a mucoid-like mass
(B. Sutton, 1980, The Coelomycetes, Co.)
mmonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, p.696). MF6
118 has all of the above genus-specific features, but can be cultured to confidently identify this fungus.
Therefore, it does not have any remarkable features for identifying a particular species. Therefore,
Named the species of the genus Ma.
The compounds of the invention are preferably used in an aqueous nutrient medium containing an assimilable carbon source and a nitrogen source.
Can be obtained by culturing the above fungi under aerobic conditions. The nutrient medium is also mineral
It may also include salts and antifoams.
The preferred carbon source for the nutrient medium is sucrose or fructose. Suitable nitrogen source
Are corn meal and yeast extract.
Generally, carbon and nitrogen sources are used in combination and need not be in pure form
. Impure substances, including trace amounts of growth factors, vitamins, and mineral nutrients
Can be used. Calcium carbonate, sodium or potassium phosphate, sodium chloride
Or potassium salts, magnesium salts, copper salts, cobalt salts, etc.
(Undefined) inorganic salts can also be added to the medium. Manganese, iron, molybdenum
And trace metals such as zinc. In addition, if necessary, especially the culture medium is considerably foamy.
If you stand, poly
An antifoaming agent such as ethylene glycol or silicone can be added.
A preferred method for producing the compounds of the present invention is to use spores or mycelia of the production organism in a suitable medium.
And then culturing under aerobic conditions.
Generally, fermentation methods involve first inoculating a culture source stored in a nutrient seed medium,
In a two-step process, the growth of the seed organism in the production of the active compound is
Is to do it. After inoculation, the temperature is about 20-30 ° C, preferably about 22-25 ° C.
Incubate the flask with stirring. Stirring speed up to 400 rpm
, Preferably about 200-220 rpm. About 2-10 seed flasks
Incubate for days, preferably about 2-4 days. When growth is sufficient (usually about 2
4) The culture can be used to inoculate a production medium flask. Especially big
When using a volume container, a second stage seed growth can be used. Do this
Sometimes, a portion of the culture growth is used to inoculate a second seed flask and a shorter
Incubate for the same time but under similar conditions.
After inoculation, the fermentation production medium is allowed to grow for about 3 to 30 days, preferably 12 to 30 days.
Incubate for 21 days. The fermentation is performed aerobically at a temperature of about 20-30 ° C. Optimal
For optimal results, the temperature should be in the range of about 22-28 ° C, optimally about 22-25 ° C.
is there. After an appropriate period of production of the desired compound, the fermentation flask is recovered and the active compound is recovered.
To separate.
In the following farnesyl-protein transferase (FPTase) inhibition assay
The ability of compounds to inhibit Ras farnesylation in vitro was determined. Recombinant human
FPTase was used at 2 nM. FPTase inhibitory ability of compounds of the present invention
Was demonstrated at concentrations below 10 μM.In vitro inhibition of Ras farnesyl-protein transferase
Assay for farnesyl-protein transferase. Ras peptide (Ras-C
VLS, Ras-CVIM and RAS-CAIL), respectively, by Schaber et al., J.B.
iol. Chem. 265,14701-14704 (1990) and Gibbs et al., PNAS USA 86,6630-6634 (1989).
Prepared as described by Recombinant human FPTases (rhFPTas
e) as described by Omer et al. (Biochemistry 32, 5167-5176 (1993)).
Prepared and 100 mM N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N '-(2-E
Tansulfonic acid) (HEPES), pH 7.4, 5 mM MgClTwo,
5 mM dithiothreitol (DTT), 0.1% (w / v) polyethylene glyco
20,000, 10 μM ZnClTwo, 50 nM [ThreeH] -Farnesyl nitrile
Acid ([ThreeH] -FPP; 740 CBq / mmol, New England Nuclear), 1
100 μL containing 00 nM Ras-CVIM and 2 nM rhFPTase
The assay was performed in a volume at 31 ° C. for 30 minutes. Start the reaction with FPTase,
Stop with 100 μL of 30% (v / v) trichloroacetic acid (TCA) in ethanol
I let you. The precipitate is deposited on a filter-mat using a TomTec Mach II cell harvester.
Collect, wash with 100% ethanol, dry, LKB β-plate counter
Measured. The assay was linear for both substrates. FPTase level and
time;[ThreeLess than 10% of [H] -FPP was utilized during the reaction time. 1 purified compound
Dissolve in 00% dimethyl sulfoxide (DMSO) and dilute 20 times in assay solution
I shouted. The amount of farnesyl transfer in the presence of the test compound was determined in the absence of the test compound.
The percent inhibition is measured relative to the amount of introduction.
The inhibitory activity of the compounds of the present invention was determined by the method of C.A. Omer et al. (Biochemistry, 32, 5167-5176 (1993).
)) Also measured in an assay using the recombinant human FPTase obtained as described in
Can.
Pharmaceutical compositions comprising a compound of structural formula I include farnesyl-protein transferase and
Inhibit the farnesylation of the oncogene protein Ras. The compound is a mammal
Products, especially as pharmaceuticals for humans. These compounds are used in cancer treatment
Can be administered to patients for use. Examples of types of cancer that can be treated with the compounds of the present invention
Include, but are not limited to, colorectal carcinoma, pancreatic exocrine carcinoma, and myeloid leukemia
Not done.
The compounds of the present invention can be administered to mammals, preferably humans, alone or preferably.
Alternatively, in accordance with standard pharmaceutical practice, a pharmaceutically acceptable carrier or
Can be administered in combination with a diluent, if necessary, with a known adjuvant such as alum
. The compounds may be administered orally or non- parenterally, including intravenously, intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously, topically.
Can be administered by mouth.
For oral use of a chemotherapeutic compound of the present invention, the selected compound may be, for example,
For administration in the form of tablets or capsules, or as an aqueous solution or suspension.
Wear. Tablets for oral use
In some cases, commonly used carriers include lactose and corn starch,
A lubricant such as gnesium is usually added. Place of oral administration in capsule form
If so, useful diluents include lactose and dried corn starch. Aqueous suspension is oral
When necessary for administration, the active ingredients are combined with emulsifying and suspending agents. If you want
Certain sweetening and / or flavoring agents may be added. Intramuscular, intraperitoneal
For use subcutaneously or intravenously, a sterile solution of the active ingredient is usually prepared,
H should be adjusted appropriately and buffered. For intravenous use, reduce the total solute concentration.
Should be controlled to make the formulation isotonic.
The present invention also provides a therapeutically effective amount of a compound of the present invention in a pharmaceutically acceptable carrier or
A physician useful in the treatment of cancer, characterized in that it is administered with or without a diluent.
Also encompasses drug compositions. Suitable compositions of the present invention are pharmacologically acceptable with the compounds of the present invention.
Aqueous solution containing a possible carrier, for example saline at a certain pH level (eg 7.4)
Is included. The solution can also be introduced into the patient's intramuscular bloodstream by local bolus injection.
Wear.
When administering a compound of the present invention to a human patient, the daily dosage will generally be determined by the attending physician.
Dosage is generally determined by the year
It depends on age, weight, individual patient response and the severity of the patient's symptoms.
In one typical application, an appropriate amount of a compound is administered to a human being treated for cancer.
Administer to patients. About 0.1 to about 20 mg / kg of mammal body weight per day, preferably
Or 0.5 to about 10 mg / kg of body weight.
Compounds of the invention may be known in the literature or exemplified in the experimental methods
In addition to other standard procedures such as hydrolysis of esters, cleavage of protecting groups,
It can also be produced by the reaction shown in the scheme.
The methyl ester which is the compound A of the present invention is prepared by adding potassium carbonate in an aqueous methanol solution.
Easily hydrolyzed using standard hydrolysis conditions such as sodium hydroxide in water
To give the acid B and then by Fischer esterification with the desired alcohol.
To compound C. Acetic anhydride in pyridine, acyl chloride in pyridine
Acylation of compound B with any standard acylating reagent gives compound D,
Next, esterify using Fischer esterification with the appropriate alcohol,
Compound G can be obtained. Compound G can also be prepared using the above acylation method.
C. The acid groups of compound B are compatible with benzyl esters and other compatible
A suitable base, such as sodium hydride or potassium carbonate,
And reacting with a suitable alkyl halide, such as methyl iodide, to give an ester.
To obtain the protected compound E, and deprotection using standard conditions such as hydrogenolysis or base hydrolysis.
Upon protection, compound E is obtained. A suitable base such as sodium hydride or potassium carbonate
Of compound C using an alkyl halide such as, for example, methyl iodide.
Compound F is obtained by killing.
Certain compounds of the present invention can be derivatized as shown in Reaction Scheme B. Book
Compound A obtained by the fermentation described in the specification is acetic anhydride, pyridine in pyridine.
Aceylated compound H is acylated under standard conditions such as acetyl chloride in
Obtainable. Treatment of compound A with a methylating reagent such as diazomethane
Thus, methyl ether methyl ester H is obtained. Potassium carbonate in methanol aqueous solution
Using standard hydrolysis conditions such as sodium hydroxide and sodium hydroxide in water.
Hydrolyze Ter A
Compound B is obtained, which is an acid, which can be obtained during the synthesis of compounds such as Compounds H and I.
Can serve as an interstitial.
Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention include sodium, potassium,
Cations such as minium, calcium, lithium, magnesium, zinc, etc.
Ammonia, ethylenediamine, N-methyl-glucamine, lysine, arginine,
Ornithine, choline, N, N'-dibenzylethylenediamine, chloropropyl
, Diethanolamine, procaine, N-benzylphenethylamine, diethyl
Luamine, piperazine, tris (hydroxymethyl) aminomethane, and hydroxylated
There are salts formed from bases such as tetramethylammonium. Included herein
The salt can be converted to the methyl ester of the compound of formula I using standard methods known in the art.
A salt obtained by hydrolyzing to rubonic acid and then reacting with an appropriate base to form the above salt
Is included.
Hydrates of the compounds of formula I are included within the scope of the present invention. Compounds are monohydrate, dihydrate
Can form hydrates, trihydrates and the like.
Prodrug forms of the compounds of formula I are also included within the scope of the invention. Prodrug
Is obtained from chemical modification of a biologically active compound and is obtained by enzymatic or hydrolytic cleavage.
Activated in vivo
(Modern Pharmaceuticals, 2nd edition, vol. 40, p. 861,
1990). The compounds of the present invention can be used as prodrug esters of the acid or hydroxyl moieties.
Can be formed.
The examples described herein are intended to assist in a further understanding of the invention.
ing. The particular materials, types, and conditions used are further illustrative of the invention,
It does not limit the logical scope of the invention.
Example 1 7-hydroxy-9-methyl-6-oxo-6H-oxepino [2,3-b] [ 1] Benzopyran-5-carboxylic acid methyl ester (Compound A) Step A: Production of Seed Culture MF6118
The MF6118 culture is maintained as a mixture of spores and hyphae in sterile soil and
Stored at 4 ° C. until before. 25 containing 50 mL of seed medium with the following composition (g / L)
Using a small portion of the stored soil aseptically transferred to a 0 mL Erlenmeyer flask, use the seed culture
Corn steep liquor, 5.0: tomato paste, 40.0;
Tomato flour, 10.0; glucose, 10.0; and trace element solution, 10 mL
/ L (dissolved in 0.6N HCl,
FeSOFour・ 7HTwoO, 1.0; MnSOFour・ 4HTwoO, 1.0; CuClTwo・ 2HTwo
O, 0.025; CaClTwo・ 2HTwoO, 0.1; HThreeBOThree, 0.056; (NHFour
)6Mo7Otwenty four・ 4HTwoO, 0.019; ZnSOFour・ 7HTwoO, 0.2 (g / L)
). Prior to sterilization, the pH of the medium was adjusted to 6.8 by adding NaOH. Use distilled water
To prepare a seed medium, aliquot into an Erlenmeyer flask, and plug the Erlenmeyer flask with a cotton plug.
And autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Seed culture solution is gyrotory
Ink on a shaker (220 rpm, 5.1 cm travel) at 25 ° C for 72-73 hours
And then inoculated into a fermentation production flask.Step B: Preparation of Production Culture from Seed Culture MF6118
In a 250 mL Erlenmeyer flask containing 44 mL of liquid production medium formulated as follows
Production fermentation: corn meal 50.0 g, sucrose 80.0 g, yeast
1.0 g of kiss and distilled water (total 1 L). Insert a cotton plug into the liquid medium production flask
And sterilized at 121 ° C. for 15 minutes. 2.0 mL of seed growth solution into each production flask
Inoculated. Raw for 17 days on a gyro shaker (220rpm, 5.1cm travel)
Incubate one third of the production flask at 22 ° C, one third at 25 ° C, and one third at 27 ° C.
I was vate. At the time of collection,
Each flask was extracted with 50 mL of methyl ethyl ketone (MEK). All collections
The liquids from Lasco were combined and used for product separation.Step C: 7-hydroxy-9-methyl-6-oxo-6H-oxepino [2,3 -B] [1] Separation and purification of benzopyran-5-carboxylic acid methyl ester
The fermentation broth described in Example 1 of Homa species (MF6118) (0.78 L) was
Grow on a shaker, shake the flask for 2 hours on a shaker, and add 1
Extracted twice with L. The extract was collected by filtration through a bed of celite. Rotary evaporator
The methyl ethyl ketone was removed under reduced pressure by distillation using a filter and finally freeze-dried,
4.5 g of a solid were obtained. The solid was triturated with 200 mL of methanol, filtered and the filtrate
A and an insoluble solid were obtained. The undissolved solid was dissolved in ethyl acetate: acetone 1: 1 (200
and filtered to give filtrate B and insoluble residue. Slowly reduce filtrate B
Concentration under pressure gave thick yellow crystals of compound A, which were collected by filtration. Substantial amount of conversion
Compound A is also present in filtrate A, and chromatographed on a 2.0 L Sephadex LH-20 column.
Purified by chromatography.
Elution of the column with methanol, followed by trituration with methanol, followed by filtration
An additional amount of compound A was obtained.1
H NMR 400 MHz (CDClThree) Δ: 2.40 (3H, t, J = 0.4H)
z, CHThree), 3.82 (3H, s, OCHThree), 5.87 (1H, t, J = 5.
6 Hz, = CH), 6.36 (1H, d, J = 5.6 Hz, = CH), 6.65
(1H, dq, J = 1.6, 0.8 Hz, ArCH), 6.66 (1H, dq,
J = 1.2, 0.4 Hz, ArCH), 6.94 (1H, d, J = 5.6 Hz,
= CH), 12.05 (1H, s, OH).13
C NMR 400 MHz (CDClThree) Δ: 22.39 (CHThree), 52.50
(OCHThree), 104.77 (qC), 107.26 (2 × qC), 113.2
9 (CH), 116.44 (CH), 130.80 (qC), 131.93 (C
H), 146.71 (CH), 147.49 (qC), 153.63 (qC),
160.54 (qC), 161.72 (qC), 166.94 (qC), 182
. 26 (qC).
MS (HREI): m / z 300.0629 (M+, C16H12O6Calculated value as
: 300.0634).
Example 2 7-hydroxy-9-methyl-6-oxo-6H-oxepino [2,3-b] [ 1] Benzopyran-5-carboxylic acid methyl ester (Compound A)
The production method of the title compound was as follows.
Inoculate the production medium of step B, and then gyrotory shaker (220 rpm)
m, 5.1 cm movement) for 15 days at 22 ° C.
It is characterized in that At the time of recovery, extract each flask with 50 mL of MEK.
Dispense (220 rpm stirring at 27 ° C. for 45 minutes), prepare for assay of MEK layer
Was done. Thereafter, the compound described in Step C of Example 1 was separated and purified. Example
After the method of Step C, the title compound was separated and purified.
Example 3 7-hydroxy-9-methyl-6-oxo-6H-oxepino [2,3-b] [ 1] Benzopyran-5-carboxylic acid (compound B)
Hydrolysis of the product of Example 1 with potassium carbonate in aqueous methanol, followed by hydrolysis
The title compound by acidification with dilute acid at
To manufacture.
Example 4 7-methoxy-9-methyl-6-oxo-6H-oxepino [2,3-b] [1 Benzopyran-5-carboxylic acid methyl ester (Compound H)
The product of Example 1 was reacted with diazomethane in methylene chloride to give the title compound.
Manufacturing things.
Example 5 7-acetyloxy-9-methyl-6-oxo-6H-oxepino [2,3-b [1] Benzopyran-5-carboxylic acid methyl ester (Compound I)
React the product of Example 1 with pyridine and acetic anhydride to produce the title compound
.
─────────────────────────────────────────────────────
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99
15/01 15/00 Ｅ
//(Ｃ１２Ｐ 17/18
Ｃ１２Ｒ 1:645）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ
，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，
ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ
Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ
，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ペラエス，フエルナンド
スペイン国、エ−28027・マドリツド、ホ
セフア・バルカルセル、38
(72)発明者 ポリシユツク，ジヨン・デイー
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 シルバーマン，キース・シー
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 シンガ，シエ・ビー
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126
(72)発明者 ジンク，デボラ・エル
アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・
07065、ローウエイ、イースト・リンカー
ン・アベニユー・126──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI C12N 9/99 C12N 9/99 15/01 15/00 E // (C12P 17/18 C12R 1: 645) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU) , TJ, TM), AL, AM, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KG, KR, KZ, LK , LR, L , LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, US, UZ, VN (72) Inventor Peraes 28027 Madrid, Spain, Joshua Balcarcel, 38 (72) Inventor Poli シ sk, Jillon Day United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Silverman, Keith Sea United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Singa, Siebe United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue・ 126 (72) Inventor Zinc, Deborah El, New Jersey, United States of America · 07065, Rouei, East linker down, Abeniyu-126