JPH11509404A

JPH11509404A - トランスジェニック動物における、蛋白質の翻訳後修飾の作出

Info

Publication number: JPH11509404A
Application number: JP8533476A
Authority: JP
Inventors: ヘンリケラボン; ウィリアムエヌ．ドロハン; レッカケイ．ペイルヤンダ
Original assignee: アメリカンレッドクロス
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-06
Publication date: 1999-08-24
Also published as: CA2220109A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、翻訳後修飾を変化させる蛋白質の発現のためのポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック非ヒト多細胞生物に関する。特に、本発明は、第一の外来遺伝子が第一の蛋白質をコードし、第二の外来遺伝子が第二の蛋白質をコードし、生物の細胞内において第二の蛋白質の発現が第一の蛋白質の翻訳後修飾に影響を与える、多重トランスジェニック動物を提供する。好ましい態様において、発現は特定の細胞内で行われ、修飾された蛋白質は体液中に分泌される。本発明は、関連する方法、蛋白質、および産物を提供する。一例として、乳腺においてヒトプロテインＣおよびプロセシングプロテアーゼPACE/フリン（furin）を発現し、両蛋白質を乳汁中に分泌するトランスジェニック動物が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック動物における、蛋白質の翻訳後修飾の作出本発明は、翻訳後修飾について改変された能力を有する細胞を含む、トランスジェニック非ヒト多細胞生物に関する。本発明は、トランスジェニック生物、この生物を作出するための方法、およびこの生物によって産生される物質に関する。本発明の一つの局面は、特に、トランスジェニック生物において、細胞の蛋白質翻訳後修飾能力を改変することによって、導入遺伝子の物質産生を最適化することに関する。別の局面において、本発明は、特に、翻訳後修飾に関して改変された能力を有するトランスジェニック動物によって産生された物質に関する。別の局面において、本発明は、特に、トランスジェニック生物の細胞における翻訳後蛋白質修飾を改変することによって、その生物の生理学的区画、組織、器官、または体液の構成を改変することに関する。これに関して、本発明はまた、トランスジェニック生物の細胞の翻訳後蛋白質修飾の改変によって変更された細胞、細胞産物、組織、器官、および体液にも関する。好ましい局面において、本発明は特に、トランスジェニック生物の細胞中でプロセシングプロテアーゼを発現させることにより、蛋白質分解された蛋白質の成熟を促進することに関する。この局面において、本発明は特に、PACE/フリン（furin）の発現に関し、さらに、血液凝固および血塊溶解に関与する、前駆体蛋白質の成熟に関する。発明の背景トランスジェニック生物における、クローニングされた遺伝子または意図的に改変された遺伝子の発現は、トランスジェニック「バイオリアクター」による物質の産生およびその他の応用における改良された動物および植物の作出にとって非常に有望であるとみなされてきた。しかし、この希望を実現する上での障害がある。特に、トランスジェニック動物の中で、適正に修飾された有用な物質を高効率で発現させることができないままである。本発明は、この問題を克服する方法およびトランスジェニック動物、ならびに、とりわけトランスジェニック生物によって産生された産物に関する。異種蛋白質、ペプチド、および他の物質を産生するために、多くのDNAが培養細胞の中でクローニングされ、発現されてきた。また、異種蛋白質、ペプチド、および他の物質を産生するために、いくつかの遺伝子が、植物または動物に導入されてきた。クローニングされた遺伝子を発現させて、細胞、動物および植物の中で、蛋白質および他の物質の発現および産生が起きるようにすることは、一般的には可能であったが、それによって得られる産生レベルは大抵低く、このようにして産生される蛋白質の翻訳後のプロセシングは、不完全であるか非効率であった。特に、これらの障害が、適正に翻訳後修飾された蛋白質を産生するために、動物および植物のバイオリアクターの利用を制約し妨げてきた。培養細胞における産生レベルの低さと特異的活性の低さは、適切な形に修飾された発現蛋白質の産生に必要な特定の酵素が、限られた量でしか発現しないことに起因すると考えられている。制約された酵素活性の量を増加させるために、クローニングされた遺伝子を培養細胞で発現させることによって、適正に修飾された蛋白質の細胞における産生を増加させようとする試みが行われてきた。例えば、増幅されたプロテインＣ遺伝子からのヒト・プロテインＣ（「HPC」）を発現する、生後間もないハムスターの腎臓（「BHK」）細胞で、酵母のKex2 cDNAをトランスフェクションし発現させると、単鎖のチモーゲン型から成熟２本鎖型への転換が上昇した（Fosterら、 Biochemistry 30: 367〜372(1991)）。別の実施例において、チャイニーズハムスター卵巣細胞（「CHO」）で、トランスフェクションされたDNAによって高レベルで発現されたPACE/フリン（furin ）は、同時発現させた第IX因子前駆体のプロペプチドの適正な切断を、明らかに促進した（Wasleyら、J．Biol．Chem．269: 8458〜8465(1993)）。しかし、これらの実験において、PACE/フリン（furin）遺伝子の発現により、明らかに発生するプロセシング活性は、識別することが困難であり、多様であった。さらに、プロテアーゼ活性の明らかな上昇は、細胞毒性、細胞変性効果、および細胞分化のマーカーの変化の原因になると考えられた。実際、例えば、「シャルケン（Shalken）ら、J．Clin．Invest．80: 1545〜1549(1987)」、「アヨウビ（Ayoubi）ら、J．Biol．Chem．269: 9298〜9303(1994)」および「デクローリ（Decroly）ら、J．Biol．Chem．269: 12240〜12247(1994)」に記載されているように、PACE/フリン（furin）および類似のプロセシング酵素は、培養液中でも、不適切に発現されると、細胞にとって有害または致死的であるかもしれないことが示唆されてきた。このように、細胞による物質産生の改良の可能性は、培養中に観察された有害な効果の影に隠れてしまった。このような結果から見ると、トランスジェニック生物において蛋白質、ポリペプチド、および他の物質の産生を改良しようとするこの方法は、有望なものとは考えられていなかった。一例として、細胞における翻訳後修飾を変更する酵素の発現は、これまで、正常でない培養細胞の中だけで行われてきた。これらの細胞は、一般的に、異常な増殖を示すため、人工培地の中で無限に増殖できる。主に、このような細胞は、腫瘍に由来するものか、不死化ウイルスを形質導入した結果生じたものである。このような細胞においては、特に、分化および増殖因子が変化している。したがって、これらの細胞の、翻訳後修飾能力を改変された場合の応答は、健康な生物の細胞で予想される応答と同じではない。実際、これらの細胞は、本来の生物よりも、翻訳後修飾に影響する酵素の発現を変更することによって生じる有害な効果に対する耐性が強いと考えられてきた。酵素カスケードの調節、ならびに本来の生物でのみ一般的に起こる過程を含む、増殖、有糸分裂、および分化を調節する、因子の活性の調整における、翻訳後修飾の役割を考えると、翻訳後修飾能力の改変は、たとえそれが、培養液中で増殖した細胞に対しては有害な影響を与えないとしても、本来の生物に対して非常に有害となるようなより大きな危険性をもたらす。発生途中にある生物は、不適正な発現、特に、細胞変性効果の原因となる発現に対する感受性が特に強い。例えば、決定的な段階で１個の細胞を失うことにより、発生中の胚は、絶望的に無能力になるか発生が停止する。さらに、生物は、細胞内の効果だけでなく、その生物の他の部位への、発現細胞からの活性の生理学的な伝達によっても有害な影響を受けることがある。その上、循環蛋白質の移動と代謝に関係する複合的な生理学的過程はしばしば、許容できる細胞内の効果を増幅して、その生物体全体として許容できないほどの損傷を与える効果に変えてしまう可能性もある。例えば、翻訳後修飾を行なう酵素の発現の中には、毒素を活性化できるものがあることが報告されている。このように毒素を活性化するような翻訳後修飾の改変は、例えば、弱い感染によって生み出される毒素レベルのような、通常は許容できる毒素レベルを、生物にとって非常に有害で致死的なレベルにまで増幅する可能性がある（Chironら、J．Biol．Chem．269: 18167〜18176(1994)）。その上、蛋白質の翻訳後修飾に関与するさまざまな酵素は、生物体の異なる組織の細胞中で、異なる発現をする。さらに、このような蛋白質の、細胞における発現は、しばしば、胚発生の過程を通じて非常に多様である。例えば、PACE/フリン（furin）など、いくつかの蛋白質の成熟に関する蛋白質分解段階を行なうと考えられているスブチリシン（subtilisin）様PACEが、この場合にあてはまる。実際、これらのプロセシングプロテアーゼによって仲介される蛋白質分解的な切断などの翻訳後修飾は、細胞分化の過程に関与するだけでなく、調節する役割を担っている（Zhengら、J.Neuroscience，14: 4656〜4673(1994)）。したがって、発生中の胚細胞における、これらの酵素の不適正な発現は、広範に有害で致死的な効果を有しうる。インビボにおける有害効果を考慮すると、トランスジェニック生物の細胞において、蛋白質の翻訳後修飾を大幅に改変できる可能性は低いと考えられる。したがって、細胞の翻訳後修飾特性を変更するという考えは、有用物質を産生するための、トランスジェニック生物の能力を改良するには、有望な方法とは考えられなかった。このような動物が有用物質を産生する可能性を考えれば、これらの障害を克服して、効果的なバイオリアクターを作出するための方法を考え出すことは依然として重要な目的である。略語および定義以下の略語および用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって理解されているところの意味に従って、本明細書中で用いられる。しかし、以下の定義は、例示的なものであって、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。略語 B-OH：β-ヒドロキシル基 BHK：生後間もないハムスターの腎臓細胞 CH0：（１）チャイニーズハムスター卵巣細胞；（２）普遍的な蛋白質の翻訳後修飾である配糖体または糖部分、 ELISA：固相酵素免疫測定法 HC:158-420：アミノ酸158〜420を含む、ヒト・プロテインＣの重鎖 HPC：ヒト・プロテインＣ HRP：ホースラディシュ・パーオキシダーゼ GlaまたはGLA：血液凝固、血塊溶解、骨、肺に関係する、ビタミンＫ依存型蛋白質の中で顕著な、蛋白質の翻訳後修飾であるガンマ-カルボキシ・グルタミン酸 GPI：グリコシルホスファチジルイノシトール KR：ヒト・プロテインＣの成熟過程で解離されるLys¹⁵⁶〜Arg¹⁵⁷ジペプチド LC:1-155：アミノ酸１から155を含む、ヒト・プロテインＣの軽鎖 Mab：モノクローナル抗体 PACE：対合塩基性アミノ酸切断酵素 PACEM：変異PACE PAGE：ポリアクリルアミドゲル電気泳動 PC：プロホルモンコンバターゼ PCR：ポリメラーゼ連鎖反応 PRO：プロテインＣの24アミノ酸プロペプチド SDS：ドデシル硫酸ナトリウム S-S：ジスルフィド結合 SP：シグナルペプチド t-PA：組織プラスミノーゲン活性化因子 WAP：乳漿酸性蛋白質 rHFIX：組換えヒト第IX因子 rHPC：組換えヒト・プロテインＣ例示的な定義成熟：mRNAまたはmRNAの一領域にコードされたポリペプチドが、リボソーム上で連続的にアミノ酸付加される過程でまたは付加された後に改変されるプロセス。このポリペプチドが最終的に成熟すると、生理学的な形状の蛋白質が産生される。このように、例えば、前駆体型からプロセシングされた型へ転換させる蛋白質分解作用により、成熟が行われる。実際、本明細書において定義されているように、一般的に、蛋白質のあらゆる翻訳後修飾は成熟に影響を与える。フリン（FURIN）：本明細書においてPACE/フリン（furin）と名づけられた、プロホルモンコンバターゼ（PCs）または対合塩基性アミノ酸切断酵素の一種。多細胞生物：細胞が組織を形成するよう分化する、すべての多細胞動植物。動物では、原生動物を除くすべての動物を含む後生動物。翻訳後修飾：非修飾型の蛋白質のポリペプチド鎖を構成する、天然の20アミノ酸に対する共有結合的改変。翻訳後修飾は、蛋白質のバックボーンおよび構成アミノ酸の側鎖で起こる。一般的に、翻訳後修飾は、酵素-触媒反応による共有結合の形成または切断によって起こる。蛋白質の合成が完成する前に修飾が起こることもあり、新しく合成された蛋白質がリボソームから解離した後に起こることもある。さまざまな蛋白質で、非常に多様な翻訳後修飾の特徴が調べられている。本発明において有用な修飾のすべてを、本明細書では「翻訳後修飾」という用語を用いて包含することとする。発明の概要したがって、本発明の一つの局面により、第一の蛋白質をコードする第一のポリヌクレオチド、および第二の蛋白質をコードする第二のポリヌクレオチドが発現可能に組み込まれた細胞を含むトランスジェニック非ヒト多細胞生物が提供される。該生物においては、細胞内における第二の蛋白質の発現が、第一の蛋白質の翻訳後修飾に影響する。本発明のこの局面の好ましい態様において、トランスジェニック生物は、後生動物である。別の好ましい態様において、トランスジェニック生物は、植物である。本発明のこの局面の一定の好ましい態様において、ポリヌクレオチドおよび蛋白質は、生物の特定の細胞で発現される。いくつかの好ましい態様において、第一の蛋白質は、生物の体液の中に分泌される。また、いくつかの好ましい態様において、翻訳後修飾は第一の蛋白質の成熟に必要とされるものである。さらに、いくつかの好ましい特定の態様において、第二の蛋白質は、アセチル化、ADPリボシル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的付加、ヘムの共有結合的付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的付加、脂質または脂質誘導体の共有結合的付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合的付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化（myristoylation）、酸化、蛋白質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、アルギニル化のような転移RNAが介在する蛋白質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化からなる群より選択される翻訳後修飾に影響を与えるものである。特に好ましい態様において、ポリヌクレオチドおよび蛋白質は、生物の特定の細胞で発現され、第一の蛋白質は体液の中に分泌される。本発明のこの局面における好ましい体液は、血液、乳汁、尿、および唾液である。これに関して、本発明の別の局面において、好ましい態様では、第一のポリヌクレオチドは前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドはプロテアーゼをコードし、前駆体蛋白質は生物の細胞内においてプロテアーゼによってプロセシングされる。これに関して、一定の好ましい態様において、第一の蛋白質はビタミンK依存型蛋白質であるか、または第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII因子、プロテインＳ、骨のGla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-PA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、もしくはアルブミンである。本発明のこの局面における、さらに好ましい態様において、細胞は、乳腺の分泌細胞であり、第一の蛋白質は、この生物の乳汁の中に分泌される。これに関して、一定の好ましい態様において、第一のポリヌクレオチドは前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドはプロテアーゼをコードし、前駆体蛋白質はプロテアーゼによってプロセシングされる。本発明のこの局面の好ましい特定の態様において、第一の蛋白質は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII 因子、プロテインＳ、骨のGla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-PA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンである。これに関して、特に好ましい態様において、プロテアーゼは、対合塩基性アミノ酸切断酵素である。これに関する、いくつかの特に好ましい態様において、第一のポリヌクレオチドは、プロテインＣをコードする。これに関して、最も好ましい態様において、プロテアーゼはPACE/フリン（furin）である。本発明のこの局面における好ましい別の態様において、蛋白質のガンマ-カルボキシル化に影響する第三の蛋白質をコードする第三のポリヌクレオチドを含み、第一の蛋白質が成熟するためにガンマ-カルボキシル化が必要で、第三の蛋白質が、生物の細胞における第一の蛋白質のガンマ-カルボキシル化に影響を与える。これに関して、第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードし、プロテアーゼがPACE/フリン（furin）である態様が特に好ましい。別の局面において、本発明は、翻訳後修飾された蛋白質を産生するための方法を提供する。該方法は、トランスジェニック非ヒト多細胞生物に、第一の蛋白質をコードする第一のポリヌクレオチド、および第二の蛋白質をコードする第二のポリヌクレオチドを発現可能に組み込む段階、第二の蛋白質が細胞の中で第一の蛋白質の翻訳後修飾に影響を与えるよう、この生物の細胞の中で第一の蛋白質および第二の蛋白質を発現させる段階、および、次に、その生物から、翻訳後修飾された第一の蛋白質を分離する段階を含む。本発明のこの局面における好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、生物の特定の細胞の中で発現される。さらに、好ましい態様において、第一の蛋白質は、生物の体液の中に分泌される。特に好ましい体液は、血液、乳汁、尿、および唾液である。また、第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、また、この前駆体蛋白質が、生物の細胞の中で、プロテアーゼによってプロセシングされるという態様が好ましい。本発明のこの局面の極めて好ましい態様において、細胞は、乳腺の分泌細胞であり、第一の蛋白質は、この生物の乳汁の中に分泌される。これに関し、第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ、前駆体蛋白質が、細胞の中でプロテアーゼによってプロセシングされるという態様が特に好ましい。このタイプの極めて好ましい態様において、第一の蛋白質は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII因子、プロテインＳ、骨のGla蛋白質、基質 Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-PA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンである。さらに、本発明のこの局面の特に好ましい態様において、プロテアーゼは、対合塩基性アミノ酸切断酵素である。これに関し、第一のポリヌクレオチドが、プロテインＣをコードしているという態様が極めて好ましい。また、極めて好ましいのは、プロテアーゼがPACE/フリン（furin）である態様である。特に極めて好ましいのは、第一のポリヌクレオチドが、プロテインＣをコードし、プロテアーゼが、PACE/ フリン（furin）であるという態様である。本発明のこの局面のさらに好ましい態様において、第三のポリヌクレオチドは、蛋白質のガンマ-カルボキシル化に影響する第三の蛋白質をコードし、第一の蛋白質が、成熟のためにガンマ-カルボキシル化を必要とし、第三の蛋白質が、生物の細胞における、第一の蛋白質のガンマ-カルボキシル化に影響を与える。これに関して、特に好ましいのは、第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードし、プロテアーゼがPACE/フリン（furin）という態様である。さらに別の局面において、本発明は、第二の蛋白質の発現が、生物の細胞の中で第一の蛋白質の翻訳後修飾に影響を与えるように、トランスジェニック非ヒト多細胞生物に、第一の蛋白質をコードする第一のポリヌクレオチド、および第二の蛋白質をコードする第二のポリヌクレオチドを、発現可能に組み込む段階、およびその後、その生物から、修飾された蛋白質を分離する段階を含む方法によって作出された翻訳後修飾された蛋白質を提供する。本発明のこの局面の好ましい態様には、ポリヌクレオチドが、生物の特定の細胞の中で発現されるという態様、第一の蛋白質が、生物の体液の中に分泌されるという態様、特に、体液が、血液、乳汁、尿、および唾液からなる群より選択される態様がある。また、本発明のこの局面において好ましくは、第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ、前駆体蛋白質が、細胞の中でプロテアーゼによってプロセシングされる。本発明のこの局面において特に好ましくは、細胞は乳腺の分泌細胞であり、第一の蛋白質が、この生物の乳汁の中に分泌される。これに関し、第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ、前駆体蛋白質が、細胞の中でプロテアーゼによってプロセシングされるという態様が極めて好ましい。特に好ましいのは、第一の蛋白質が、第 VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第 XIII因子、プロテインＳ、骨Gla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-PA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンであるという態様である。本発明のこの局面において、好ましいプロテアーゼには、対合塩基性アミノ酸切断酵素が含まれる。特に、極めて好ましいのは、第一のポリヌクレオチドが、プロテインＣをコードしているという態様である。これに関して、特に極めて好ましいのは、プロテアーゼが PACE/フリン（furin）であるという態様である。本発明のこの局面の、別の好ましい態様には、第三のポリヌクレオチドが、蛋白質のガンマ-カルボキシル化に影響する第三の蛋白質をコードし、第一の蛋白質が、成熟のためにガンマ-カルボキシル化を必要とし、かつ、第三の蛋白質が、生物の細胞において、第一の蛋白質のガンマ-カルボキシル化に影響を与えるという態様が含まれる。これに関して、特に好ましいのは、第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードし、プロテアーゼがPACE/フリン（furin）であるという態様である。さらに本発明の別の局面において、トランスジェニック非ヒト多細胞生物の産物が提供される。この局面において、この生物は、第一の蛋白質をコードする第一のポリヌクレオチド、および第二の蛋白質をコードする第二のポリヌクレオチドが発現可能に組み込まれているという特徴を有する。ここで、第二の蛋白質の発現により、その生物の細胞内での第一の蛋白質の翻訳後修飾が変化し、それにより、その生物により産生される産物の天然の組成が変化する。本発明のこの局面の一定の好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、生物の特定の細胞で発現される。また、好ましい態様は、第二の蛋白質、または第一および第二の蛋白質が、生物の体液、特に、血液、乳汁、尿、および唾液の中に分泌される態様である。産物が乳汁であるか、または乳汁に由来するものであり、細胞が乳腺の分泌細胞であり、また、第一の蛋白質、第二の蛋白質、もしくは第一および第二の蛋白質が生物の乳汁中に分泌され乳汁を変化させるという態様が特に極めて好ましい。第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ、前駆体蛋白質が、細胞の中でプロテアーゼによってプロセシングされるという態様も極めて好ましい。さらに、極めて好ましい態様において、第二の蛋白質は、蛋白質のリン酸化に影響する蛋白質、または前駆体蛋白質に影響するプロテアーゼであり、このリン酸化蛋白質またはプロテアーゼは、乳汁中に分泌されて、乳汁の組成を変化させる。本発明のこの局面の一定の好ましい態様において、第一の蛋白質は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII 因子、プロテインＳ、骨Gla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-PA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンである。一定の特に好ましい態様において、プロテアーゼは、対合塩基性アミノ酸切断酵素である。さらに好ましい態様において、第一のポリヌクレオチドは、プロテインＣをコードするものである。本発明のこの局面の特に好ましい態様において、プロテアーゼはPACE/フリン（furin）である。本発明の、その他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、この詳細な説明から、本発明の精神と範囲内でのさまざまな変更または改変が、当業者に対して明らかになるため、本発明の好ましい態様を述べてはいるが、詳細な説明、および特異的な実施例は、例示的なものにすぎないと理解されるべきである。図面の簡単な説明図１は、ヒト・プロテインＣ（「HPC」）で見られる翻訳後修飾を概略を示したもので、HPCは、まず、単鎖の461アミノ酸のポリペプチドとして肝細胞で合成され、合成後、18残基のシグナルペプチド（「SP」）が除去され、Ｎ-結合グリコシド（「CHO」）が、Asn⁹⁷、Asn²⁴⁸、Asn³¹³、およびAsn³²⁹に付加され、ビタミンＫ依存型ガンマ-カルボキシラーゼによって、アミノ末端近傍の９個のグルタミン酸にγ-カルボキシル基（「GLA」）が付加され、Ｎ-結合CHOが、ゴルジ体でさらにプロセシングを受け、β-ヒドロキシル基（「β-OH」）がAsp⁷¹に付加され、443残基のポリペプチドがプロテアーゼによって切断されて、24アミノ酸のペプチド前駆体（「PRO」）とジペプチドLys¹⁵⁶〜Arg¹⁵⁷（「KR」）を解離し、正しく修飾され、プロセシングされたHPCは、ジスルフィド結合によって連結された軽鎖（「LC:1-155」）と重鎖（「HC:158-420」）とを含む二本鎖蛋白質として、循環する血漿の中に分泌される。図２は、実施例の例示的なmWAP/HPCとmWAP/PACE構築物の概略を示したものである。エクソンが、黒く塗った四角で示されている。mWAPの非翻訳エクソン配列を四角で囲み、5'および3'近傍、ならびにイントロン配列は、直線で示されている。mWAPプロモーターとPACE cDNAの間の結合領域の配列は、GGTACCaCACCATGである。PACE cDNAとmWAP遺伝子との間の3'側結合領域は、TTTATCTGggGGATCCCという配列である。mWAPの配列を太字で、リンカー配列を小文字で、PACEの配列をイタリック体で示す。どちらの構築物も、同じ、-4098から+25までのmWAPの5'近傍配列をもっている。発明の詳細な説明本発明は、蛋白質の翻訳後修飾を変更し、それによりトランスジェニック非ヒト多細胞生物における物質生産を改良するために、クローニングされた遺伝子を発現させることに関する。一つの特定の局面において、驚くべきことに本発明により、非ヒト多細胞トランスジェニック生物の細胞の翻訳後修飾能力を、その生物に有害な効果をもたらすことなく改変できる。さらに、本発明は、翻訳後修飾を行なう酵素の発現を利用して、その生物の細胞における蛋白質の翻訳後修飾を改変するだけでなく、例えば、生物の細胞、組織、器官、および生理学的液体の組成と、その生物に由来する産物の組成を改変することができる。特定の局面において、本発明は、プロテアーゼの発現を利用して、乳汁の組成を改変し、それによって、乳漿、およびその他の乳汁組成物を改変できる。特に、これに関しては、本発明は、乳製品の組成および性質を改変するために用いることができる。したがって、本発明は、トランスジェニックバイオリアクターにおける物質の産生を促進するために利用できるだけでなく、その生物によって産生される産物で、牛乳、ならびにブタ、ヒツジ、およびヤギによって作られる乳製品などの有用性を向上させるためにも利用することができる。また、本発明は驚くべきことに、膜蛋白質を哺乳動物の上皮細胞に遺伝子導入して発現させることにより、乳汁中に分泌され、酵素活性があり、インサイチューで乳汁の組成物を改変することができると規定している。本発明の特定の態様において、PACE/フリン（furin）をコードするDNAを、乳漿の酸性蛋白質遺伝子のプロモーター（「WAP」）を用いて、トランスジェニック動物の乳腺の分泌細胞の中で発現させることができる。この細胞で発現された PACE/フリン（furin）は、乳汁の中に分泌されるが、これは、通常は、膜結合蛋白質である。さらに、分泌されたPACE/フリン（furin）は、明らかに、乳汁中の乳漿酸性蛋白質の量を減少させる。さらに、本発明は、細胞および乳汁の前記の改変が起きただけでなく適正な蛋白質分解によってプロセシングされたプロテインＣの量を乳汁中で上昇させているトランスジェニック動物の乳腺の分泌細胞における、PACE/フリン（furin）とヒト・プロテインＣとの同時発現を提供する。このように、本発明にしたがって、ヒト以外の多細胞生物の細胞中の蛋白質の翻訳後修飾を改変するために、その生物に遺伝子を導入する。好ましい態様において、この遺伝子は、生物の蛋白質、組織、または体液の組成を改変する蛋白質を発現させる。後者の場合、本発明の特に好ましい態様は、哺乳動物の乳腺の中で酵素を発現させ、乳汁の中に酵素を分泌させかつ乳汁の組成を改変する遺伝子を含む。別の好ましい態様において、２種の遺伝子を生物に導入する。第一の遺伝子は、翻訳後修飾を受ける第一の蛋白質をコードしている。第二の遺伝子は、第一の蛋白質の翻訳後修飾を行なう酵素をコードしている。この態様において、修飾酵素をコードする遺伝子の発現により、第一の遺伝子にコードされる第一の蛋白質の、生物体における成熟が改変される。本発明の別の好ましい態様において、トランスジェニック生物における物質の産生は、蛋白質を望ましい形状で産生することを制限する翻訳後修飾の緩慢な段階を同定して、次に、その段階が律速段階でなくなるよう、修飾を行なう物質を産生する、生物体中の細胞の能力を向上させることによって改善される。さらに産生を最適化するために、同じ処理を、産生が最適になるまで２回以上繰り返してもよい。さらに、別の好ましい態様において、翻訳後修飾は、生物体の特定の細胞または組織で改変される。また、この翻訳後修飾は、ホルモンなどの外部刺激または食物成分などの環境変化に応答して、細胞の中で誘導されて改変されてもよい。さらに、一定の好ましい態様において、改変された翻訳後修飾は、乳汁、尿、血液、または唾液などの体液の中に蛋白質を分泌する細胞の中での蛋白質の成熟に影響する。本発明に係る、翻訳後修飾、修飾のための蛋白質、方法、および生物が、以下の一般化された考察の中で例示されている。この考察は、本発明の範囲を例示するものと評価されるが、可能な態様のすべてを説明したものではなく、実際、すべてを説明することはできない。従って、考察は、説明的なものであって、制約的なものではない。例示的翻訳後修飾トランスジェニック生物における細胞の翻訳後修飾能力は、蛋白質を修飾する酵素をコードする導入遺伝子の発現によって改変することができる。多くの翻訳後修飾について説明され、特徴づけられてきた。これらは、「エフ・ウォルド（ F．Wold）、翻訳後の蛋白質修飾：考察と展望（ニューヨーク、アカデミック社、B.C.ジョンソン（B.C．Johnson）編、蛋白質の翻訳後の共有的修飾（1983）pp .1〜12」、「サイフター（Seifter）ら、蛋白質修飾および非蛋白質補助因子に関する解析（Meth．Enzymol．182:626〜646(1990)）」、「ラタン（Rattan）ら、蛋白質合成、翻訳後修飾、および加齢（Ann．N.Y．Acad．Sci．663: 48〜62(1 9 92)）」、「ハン（Han）ら、蛋白質の翻訳後の化学的修飾（Int．J．Biochem．2 4(1): 19〜28(1992)）」、「ハン（Han）ら、蛋白質の翻訳後の化学的修飾−III （Int．J．Biochem．25(7): 957〜970(1994)）」および「ハン（Han）ら、Int． J．Biochem．24(9): 1349〜1363(1994)）」などの多くの概説の主題となってきた。本発明は、原則として、あらゆる修飾を含む、さまざまな翻訳後修飾について実施することができる。これに関する、本発明における有用な翻訳後修飾には、本発明にしたがって改変しうる、蛋白質の既知の翻訳後修飾のいくつかの名前を挙げると、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的付加、ヘムの共有結合的付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的付加、脂質または脂質誘導体の共有結合的付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合的付加、クロスリンキング、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化（myristoylation）、酸化、蛋白質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（se lenoylation）、硫酸化、例えばアルギニル化などの、転移RNAが介在する蛋白質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化がある。トランスジェニック動物の細胞における、蛋白質のこのような翻訳後修飾の改変は、その蛋白質が発現されるはずの、選択されたトランスジェニック細胞または組織において、特異的な修飾の生成またはその効率に影響する蛋白質および酵素の活性を変更することによって行うことができる。直接に修飾を触媒する酵素、修飾の代謝および異化に関連する酵素、ならびに蛋白質の修飾に対する細胞の活性に影響する酵素を含む、多くの翻訳後修飾を触媒する酵素が同定され、精製され、特徴づけられている。このような酵素をコードする遺伝子は、クローニングすることができ、実際、クローニングされており、本明細書の別の箇所で説明されているように、トランスジェニック動物の細胞の中で発現させられている。次のリストは、本発明に従って用いることのできる酵素のいくつかを例示したものである。このような酵素をコードする、cDNAおよびゲノム由来のクローンの例も以下に列挙する。しかし、所与のいかなる蛋白質の修飾も、一般的に、細胞の中のさまざまな酵素の活性、ならびにその他の蛋白質および物質の結果として起こるものであると認識されるべきである。したがって、本発明によれば、トランスジェニック動物の細胞における蛋白質の修飾は、下記に例示されているような翻訳後修飾の直接の原因となる酵素の導入遺伝子の発現によるだけでなく、このような修飾酵素に間接的に影響するように作用する蛋白質の発現によって、細胞の中の別の発現蛋白質の翻訳後修飾が改変されることによっても影響されうる。アセチル化／脱アセチル化アセチル基の付加または除去による、細胞内での蛋白質の翻訳後修飾はしばしば、アセチルトランスフェラーゼおよびデアセチラーゼによって行われる。例えば、「SSAT」遺伝子にコードされるスペルミジン／スペルミンN1-アセチルトランスフェラーゼ、およびNAT1およびNAT2遺伝子にコードされるアリルアミンO-アセチルトランスフェラーゼなどがある。アシル化細胞における蛋白質の翻訳後のアシル化はしばしば、アシルエステラーゼによって行われるが、例えば、ラット・プロテオリピド蛋白質脂質アシルエステラーゼ、ラットミエリン結合非特異的エステラーゼ、クローニングされたpenDE遺伝子にコードされている、P．chrysogenumのアシルCoA:6-アミノパニシラン酸（6- aminopanicillanic acid）アシルトランスフェラーゼ、およびcDNAとしてクローニングされている、トウモロコシのG3Pアシルトランスフェラーゼなどがある。 ADPリボシル化翻訳後のADPリボシル化を行なうかまたは改変する酵素の実例として、PARP遺伝子にコードされる、モノ（ADPリボシル）トランスフェラーゼＡ、Ｃ、およびＤ、ポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ、二窒素還元酵素活性化グリコヒドロラーゼ、ARF2遺伝子にコードされるヒトADPリボシル化因子、ならびにコレラ毒素サブユニットＡ遺伝子にコードされるコレラ毒素サブユニットＡなどがある。アミド化細胞の中の蛋白質の翻訳後のアミド化に影響を与える酵素には、PAM遺伝子にコードされており、クローニングされているペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼがある。架橋細胞の中で翻訳後に蛋白質で起きる架橋反応に関係する酵素には、クロスリンキングパーオキシダーゼおよびとエクステンシンが含まれる。ジスルフィド結合形成ジスルフィド結合形成する酵素には、とりわけ、ジスルフィド酸化還元酵素またはイソメラーゼが含まれるが、例えば、cDNAとしてクローニングされているヒト蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ、これもcDNAとしてクローニングされているラット蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ、dipZ遺伝子にコードされている、大腸菌のPDI様蛋白質、これもクローニングされているA．castellaniiのPDI様蛋白質がある。細胞の中にある蛋白質におけるジスルフィド結合形成は、「バードウェル(Bar dwell)ら、Cell 74: 769〜771(1993)」などの、多くの概説の主題となってきた。ガンマ-カルボキシル化細胞内の蛋白質の翻訳後ガンマ-カルボキシル化を行なう酵素には、ビタミンＫ依存型カルボキシラーゼ、例えば、cDNAとしてクローニングされているヒトおよびウシのグルタミルカルボキシラーゼが含まれる。翻訳後ガンマ-カルボキシル化はまた、ビタミンＫエポキシダーゼ、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ、 NADH依存型およびジチオール依存型ビタミンＫレダクターゼなどのビタミンＫ合成酵素による影響を受ける。細胞内で蛋白質をガンマ-カルボキシル化することは、多くの研究の目的となっており、「フーリエ（Furie）ら、Blood 75(9)1753 〜1762(1990)」など、多数の概説の主題となってきた。グリコシル化細胞の中での蛋白質のグリコシル化に影響する多くの酵素には、例えば、ヒトのα-フコシルトランスフェラーゼの遺伝子などを含むいくつかのcDNAおよび遺伝子がクローニングされている、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコースアミニルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ、グルコシダーゼ、ならびにマンノシダーゼなどのグリコシルトランスフェラーゼが含まれる。細胞内の蛋白質の翻訳後のグリコシル化は、例えば、「ゴーシェ(Goochee)ら、B IO/Technology 9: 1348〜1354(1991)」を含む多くの概説の主題となっている。 GPIアンカー形成グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーを形成するのに関係する酵素には、既にクローニングされているGPIシンターゼクラスＡ、Ｆ、Ｈ cD NAにコードされている酵素などのGPIシンターゼが含まれる。ヒドロキシル化細胞の中での蛋白質の翻訳後のヒドロキシル化に影響する酵素には、cDNAとしてクローニングされている、ヒトの脳のトリプトファンヒドロキシラーゼ、これもcDNAとしてクローニングされている、ウサギの脳のトリプトファンヒドロキシラーゼ、cDNAとしてクローニングされている、ヒトのコレステロール 7アルファ -ヒドロキシラーゼ、その遺伝子が既にクローニングされているヒトのチロシンヒドロキシラーゼ、遺伝子が既にクローニングされているヒトのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、およびリシルヒドロキシラーゼなどを含むプロリル4-ヒドロキシラーゼが含まれる。ヨウ素化細胞の中の蛋白質のヨウ素化は、主としてチロシンで起こり、この翻訳後修飾に影響する酵素には、既にクローニングされた甲状腺パーオキシダーゼ（「TPO 」）遺伝子にコードされる甲状腺パーオキシダーゼが含まれる。脂質の修飾さまざまなリピド化、およびその他の脂質関連の修飾が、本発明にしたがって用いられ得る細胞の中の蛋白質において、翻訳後に起こる。これらの修飾のいくつかについては、本明細書の別の箇所で個別に考察されている。脂質修飾は、よく研究されており、「チョウら（Chow）、蛋白質に対する脂質修飾の構造と生物学的効果、Current OpinionCell Biol．4: 629〜63(1992)」などのさまざまな概説で説明されている。メチル化および脱メチル化蛋白質において通常観察されるメチル化には、例えば、P．aeruginosaの遺伝子pilDにコードされているN-メチルトランスフェラーゼを実例とする、カテコールO-メチルトランスフェラーゼなどの蛋白質メチルトランスフェラーゼによって行われる、カルボキシル基、Ｎ基、およびＯ基のメチル化が含まれる。メチル化もまた、詳細に研究されており、例えば、「クラーク（Clarke，S.）蛋白質のメチル化、Current Opinion Cell Biol．5: 977〜983(1993)」を含む、さまざまな概説の主題となってきた。特に、カルボキシル末端にあるシステイン残基のメチル化を概説したものが、「クラーク（Clarke，S.）、Ann．Rev．Biochem．61: 3 55〜386(1992)」によって提供されている。酸化細胞の中の蛋白質の翻訳後の酸化は、とりわけ、例えば、脂肪酸を酸化する脂質パーオキシダーゼによって影響を受ける。蛋白質分解細胞において、蛋白質の成熟を蛋白質分解作用によって行なうことが知られている多様なプロテアーゼの系列がある。特定の蛋白質分解プロセシングの段階はしばしば、細胞外への排出などの、膜を通過して細胞区分の外へ輸送することに関係する。さらに、蛋白質分解的な切断は、不活性な前駆体ポリペプチドとしてまず合成された蛋白質を活性化するのにしばしば必要とされる。このような酵素を利用することは、本発明において好ましい。特に好ましいのは、分泌または活性化のために切断を行なうプロテアーゼである。蛋白質分解的な翻訳後修飾に関係する酵素には、例示のために少数の例を挙げれば、トリプシン、キモトリプシン、大腸菌のシグナルペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＢなどのメタロ-カルボキシペプチダーゼ、DPP4遺伝子にコードされるヒトペプチジルアミノペプチダーゼIV、およびラットのミトコンドリアプロセシングペプチダーゼを含む、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、またはアスパラギン酸プロテアーゼなどのジペプチジルアミノペプチダーゼなどが含まれる。蛋白質分解によるプロセシングは、長年の、注意深い実験の対象となっており、広範に概説されている。蛋白質分解によるプロセシングが生理学的な過程に関連するために、特にこれに注目した概説の一つに、「ニューラス（Neurath，H. ）、蛋白質分解によるプロセシングと生理学的な調節、TIBS 14: 268〜271(1989 )」がある。リン酸化リン酸化は、細胞における蛋白質の活性の重要な局面であり、ホスホリラーゼと、cDNAとしてクローニングされているヒトTGF-6レセプターII型キナーゼ、これもcDNAとしてクローニングされているヒト蛋白質ホスファターゼ１（PP1）G- サブユニット、クローニングされたcDNAにコードされているシロイヌナズナ（A ．thaliana）のキナーゼ結合蛋白質ホスファターゼ（「KAPP」）、cobC遺伝子にコードされているネズミチフス菌（S．typhimurium）のホスファターゼを含む、プロテインキナーゼＡおよびＣなどのキナーゼとを含む多様な酵素によって行われる。プレニル化細胞内での蛋白質の翻訳後プレニル化は、とりわけ、cDNAとしてクローニングされているヒト・ヘムＡ：ファルネシルトランスフェラーゼ、これもcDNAとしてクローニングされているヒト・CAAXファルネシルトランスフェラーゼ、RAM1およびRAM2遺伝子にコードされている酵母のファルネシルトランスフェラーゼ、ispB 遺伝子にコードされている大腸菌のオクタプレニル二リン酸シンターゼ、これも cDNAとしてクローニングされているC．annumのゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼを実例とする、ファルネシルトランスフェラーゼとゲラニルゲラニルトランスフェラーゼを含むプレニルトランスフェラーゼによって行われる。蛋白質のプレニル化は、例えば、とりわけ「クラーク（Clarke，S.）、Ann．Rev．Biochem. 61: 355〜386(1992)」に概説されており、そこでは、カルボキシル末端のシステイン残基のイソプレニル化に焦点が当てられている。硫酸化細胞の蛋白質における翻訳後の硫酸化は、例えば、チロシルプロテインスルホトランスフェラーゼ（「TPST」）および硫酸スルホターゼを含み、実例としては、どちらもクローニングされているヒトの胎盤エストロケン・アリールスルホトランスフェラーゼおよびヒトの脳エストロゲン・アリールスルホトランスフェラーゼ、ならびに既にクローニングされている、ラットの肝臓アリールスルホトランスフェラーゼIVなどがある。蛋白質中のチロシンの翻訳後の硫酸化については、「ニールズ(Nierhs)ら、Chemico-Biological Interactions，93: 257〜271(19 94)」に概説されている。ユビキチン化ユビキチンの共有結合的付加によるイソペプチドの形成は、それらの多くがE2 sと呼ばれており、少なくとも10種の同定された酵母UBC遺伝子、およびシロイヌナズナの同定された20種以上のUBC遺伝子の例がある、ユビキチン結合イソペプチダーゼによって行われる。ユビキチン活性化酵素はまた、本発明の局面にしたがって、蛋白質の翻訳後のユビキチン化に影響を与えるために用いることができる。これらの型の酵素の中で、E1酵素が、イソペプチド結合が形成される前に、ユビキチンのα-カルボキシル基を活性化する。この型の酵素の実例は、E1をコードする酵母のUBA1遺伝子およびシロイヌナズナでE1をコードする遺伝子と同定された３種類の遺伝子の酵素である。また、これに関連して有用なのは、脱ユビキチン化酵素、およびユビキチン化に関係した基質認識因子である。ユビキチンの代謝と役割、およびユビキチン蛋白質の分解経路が、「ホッホストラッサー（ M．Hochstrasser）、Current Opinion in Cell Biology 4: 1024〜1031(1992)」で概説されている。前述した例示的な考察のいずれかに記載されているように、翻訳後修飾は通常、アミノ酸特異的である。したがって、本発明に従い、生物の細胞または組織の中でアミノ酸特異的な翻訳後修飾が行われる効率を操作することによって、トランスジェニック生物の細胞の中で、蛋白質における特異的なアミノ酸の翻訳後修飾を改変することができる。蛋白質の、既知のアミノ酸特異的な翻訳後修飾を示す、以下のリストは、本発明のこの局面を例示するものである。蛋白質の特異的なアミノ酸残基で１個以上の修飾を回避するかまたはそれらを生じさせるために、所定の蛋白質に点突然変異を導入するものと理解されるべきである。アミノ末端：ホルミル化、アセチル化、ピログルタミン酸の形成、N末端のアルギニル化、ミリストイル化（myristoylation）。アルギニン：N-メチル化、ADPリボシル化、リン酸化。アスパラギン：グリコシル化、β-ヒドロキシル化、脱アミド化、ADPリボシル化。アスパラギン酸：β-ヒドロキシル化、β-カルボキシル化、リン酸化、メチル化、ラセミ化（異性化）。カルボキシ末端：ホスファジルイノシトールの誘導化、グリシン-アミド化。システイン：シスチン形成、セレノシステイン形成、ヘム結合、ミリストイル化（myristoylation）、プレニル化、ADPリボシル化、ヘム付加、パルミトイル化（palmytoylation）、酸化。グルタミン酸：γ-カルボキシグルタミン酸形成、C-メチル化、ADPリボシル化。グルタミン：脱アミド化、クロスリンキング、ピログルタミン酸の形成。ヒスチジン：メチル化、ジフトアミド（diphthamide）形成、リン酸化、フラビン結合。リシン：N-アセチル化、N-メチル化、酸化、ヒドロキシル化、クロスリンキング、ビオチニル化、ユビキチン化、ヒプシン（hypusine）形成。メチオニン：セレノメチオニン形成。フェニルアラニン：ヒドロキシル化。プロリン：ヒドロキシル化、N末端メチル化。セリン：リン酸化、グリコシル化、アセチル化、ホスホパンテテイン付加。スレオニン：リン酸化、グリコシル化。チロシン：ヨウ素化、リン酸化、O-硫酸化、フラビン結合、ヌクレオチド結合。現在開示されている発明にしたがって、トランスジェニック動物の中で、前述の修飾のいずれをも改変することができる。前述の酵素およびこれらをコードする遺伝子を、本明細書において開示されている発明にしたがって、トランスジェニック生物の中で発現されている蛋白質の翻訳後修飾を改変するために用いることができる。トランスジェニック生物において、細胞の翻訳後修飾を改変することによって、より効果的に産生されるようになる蛋白質の例本発明は、トランスジェニック生物の細胞または組織で産生される、いかなる蛋白質に対しても、一般的に応用することができる。上述したように、本発明は、トランスジェニック生物の細胞で発現される蛋白質に自然に起きる翻訳後修飾の効率を改変するために用いることもできる。また、点突然変異または蛋白質のアミノ酸配列のより大幅な改変によって、蛋白質に導入された部位の翻訳後修飾を操作するために利用することもできる。これに関して、本発明の好ましい態様は、血清蛋白質の翻訳後修飾を行なう酵素、特に、止血、血液凝固、および血塊溶解に作用する血清因子に関する。これに関し、特に好ましいのは、ビタミンＫ依存型蛋白質である。本発明のこの局面にしたがって、特に関心の対象となる蛋白質には、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XIII因子、フィブリノーゲン、プロトロンビン、t-PAのようなプラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン、プロテインＳおよびプロテインＣ、骨のGla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、エリスロポエチン、免疫グロブリン、ならびにアルブミンがある。これに関して本発明に係るトランスジェニック生物におけるこれらの蛋白質の翻訳後修飾の特に好ましい改変には、蛋白質分解プロセシング、γ-カルボキシル化、β-ヒドロキシル化、硫酸化、およびグリコシル化を行なう酵素が含まれる。これに関して特に好ましいのは、蛋白質分解プロセシング、グリコシル化、硫酸化、およびγ-カルボキシル化を行なう酵素である。本発明のいくつかの局面において、蛋白質分解プロセシングが特に好ましい。これに関しては、PACEファミリーの酵素が好ましく、特に、PACE/フリン（fur in）が好ましい。PACE/フリン（furin）については、例えば、前掲の「ローブローク（Roebroek）（1986）」に説明されている。「ワイズ（Wise）ら、Proc．Na tl.Acad．Sci．U.S.A．87: 9378〜9382(1990)」、「ファン・ドバン（Van deVen ）ら、Mol．Biol．Rep．14: 265〜275(1990)」、「ブレシュナハン（Breshnahan ）ら、Ｊ．Cell Biol．111: 2851〜2859(1990)」、「ブレナン（Brennan）ら、J ．Biol．Chem．266: 21504〜21508(1991)」および「ミスミ（Misumi）ら、Bioch em．Biophys．Res．Comm．171: 3564〜3568(1990)」において説明されているように、PACE/フリン（furin）は、フォン・ヴィレント因子前駆体、神経発育因子前駆体、プロアルブミン、および補体蛋白質プロＣ３をプロセシングすることが明らかにされている。その上、PACE/フリン（furin）およびPACE4は、多くの細胞型での散在的な発現から分かるように、増殖因子、レセプター、ウイルスの糖蛋白質、および凝血因子を含む、その他のさまざまな蛋白質もプロセシングする可能性が高い。したがって、PACE/フリン（furin）は、トランスジェニック生物の細胞中で発現されると、これらの蛋白質のプロセシングおよび成熟を特に向上させうる。特に、P1およびP4のアルギニン残基が、PACEによるプロペプチドの効果的な切断にとって重要なアミノ酸であることが同定されている。例えば、「デライアン（Derian)ら、J．Biol．Chem．264: 6615〜6618(1989)」を参照のこと。これに関する特異的な発現構築に関する手引きは、「ウェズリー（Wasley）（ 1993）」などによって提供されているが、それらは、培養細胞で発現されるPAC 酵素をコードしている遺伝子について報告している。培養細胞で利用するための PACE発現構築物を作製するために用いられる、DNAおよびクローニング方法は、トランスジェニック生物における発現ベクターの作出に合わせて調整することができる。勿論、本明細書の別の箇所で説明されているように、生物の特定の細胞におけるPACE導入遺伝子の発現を目的として、プロモーター、およびその他の調節シグナルを用いることが望ましい。通常の組換え技術を用いた、導入遺伝子発現のための構築物の例示的な局面トランスジェニック生物を作出するためのDNAは、組換えDNAクローニングに関する従来の方法によって得ることができる。これに関して、適当なDNAを作製するための周知のDNA技術に関する一般的な考察は、「マニアティス（Maniatis）ら、分子クローニング、実験マニュアル（コールドスプリングハーバー研究所（ Cold Spring Harbor Laboratory）、1982」および「サムブルック（Sambrook）ら、実験マニュアル第二版、第１〜３巻（コールドスプリングハーバー研究所（ Cold Spring Harbor Laboratory）、1989」によって提供されている。全身または組織特異的に発現させるために、トランスジェニック生物に導入されているDN A構築物の実施例は、「動物の遺伝子工学、プーラー（A．Puhler）編、ニューヨーク、ワインハイム、VCH フェアラーク社」において提供されている。ある蛋白質をコードしているDNAは、後に非常に詳しく記述されるように、適正な読み枠に合わせて、適切な調節シグナルとともに融合し、さらに、例えば、バクテリアベクター中で増殖させるかまたはPCRによって増幅されうる遺伝子構築物を作出し、その後、従来の実施技術にしたがって、宿主生物の中に導入することができる。一般的には、生物体の中で、望ましい態様で発現するのに必要なシス作用シグナルを、遺伝子へ機能的に結合させる。これに関して、特に好ましいのは、特定の細胞の中での効果的な発現を提供する、プロモーターおよびその他のシス作用調節因子である。以下の考察では、プロモーターという用語は、広義に用いられており、厳密に技術的な意味では、プロモーターとは必ずしも見なされないエンハンサーなどのシス作用因子も包含される。本発明において有用なシス作用調節領域には、遺伝子の発現を調節するために用いられるプロモーターが含まれる。本発明において、特に有用なのは、所定の細胞型の中で特異的に活性を有する、これらのプロモーターである。これに関して、好ましいプロモーターは、物質を体液中に分泌する細胞に特異的な活性があるものである。この点に関して特に有用なのは、乳汁、尿、血液、および唾液の中に物質を分泌できる細胞である。したがって、特に、例えば、乳腺、尿路、肝臓、および唾液腺の細胞が特に有用である。本発明のいくつかの局面において、これに関して特に有用なプロモーターは、乳房組織で活性のあるものである。特に有用なのは、乳房組織に特異的な活性のあるプロモーターで、例えば、乳汁が合成される生理的な条件下で、他の組織におけるよりも、乳房で活性のあるプロモーターである。これに関して、最も好ましいのは、乳房組織において、特異的かつ効果的なプロモーターである。「効果的」とは、プロモーターが、乳房組織において強力なプロモーターであり、乳汁中に分泌するための蛋白質の大量合成を補助することを意味する。このようなプロモーターの中では、カゼイン、ラクトアルブミン、およびラクトグロブリンのプロモーターが好ましく、α-、β-、およびγ-カゼインプロモーター、ならびにα-ラクトアルブミン、およびβ-ラクトグロブリンのプロモーターがこれに含まれるが、これらに限定はされない。プロモーターの中で好ましいのは、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマに由来するプロモーターであり、特に、ラットのβ-カゼインプロモーター、ヒツジのβ-ラクトグロブリンプロモーター、ならびにラットおよびヤギのα-ラクトアルブミンプロモーターが好ましい。最も好ましいプロモーターは、乳漿酸性蛋白質（WAP）造伝子を調節するプロモーターであり、最も好ましいWAPプロモーターは、マウスのWAPプロモーターである。最も高度に好ましいプロモーターは、マウスの乳漿酸性蛋白質プロモーターの、4.2 kbのSau3A−Kpn1プロモーター断片である。トランスジェニック生物の乳汁中に蛋白質を高レベルで産生させるのに、この断片が非常に効果的であることが分かっている。上記で検討されたプロモーターのほかに、本発明において有用な転写を調節する配列には、とりわけ、エンハンサー（これは、プロモーターの一部とみなされることもある）、スプライスシグナル、転写終結シグナル、およびポリＡシグナルがある。特に有用な調節配列は、トランスジェニック動物において乳房細胞特異的な蛋白質発現効率を上昇させる。この点に関して、特に有用なのは、上記のα-、β-、およびγ-カゼイン遺伝子、ならびにα-ラクトアルブミンおよびβ-ラクトグロブリン遺伝子のように、乳房細胞の中で高レベルで発現する遺伝子の別の転写調節配列である。これに関し、調節配列の由来生物として好ましいのは、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマである。好ましい調節配列の実例は、それぞれ、ラットのβ-カゼイン遺伝子、ラットおよびヤギのα-ラクトアルブミン遺伝子、ならびにヒツジのβ-ラクトグロブリン遺伝子に連結した調節配列である。本発明において最も好ましい調節配列の中には、乳漿酸性蛋白質遺伝子に連結した調節配列のような、ホルモンに誘導される乳蛋白質で、妊娠中および授乳期間中にのみ発現される乳蛋白質をコードする調節配列がある。これに関連して、特に好ましいのは、マウスの乳漿酸性蛋白質遺伝子の調節配列である。上記で検討したシグナル配列のほかに、翻訳を調節する配列には、リボソーム結合部位、およびRNAの安定性を強化する配列がある。特に有用なのは、乳房細胞中で高レベルに発現する遺伝子の翻訳調節配列である。例えば、α-、β-、およびγ-カゼイン遺伝子、ならびにα-ラクトアルブミンおよびβ-ラクトグロブリン遺伝子の調節配列が好ましく、特に、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマに由来するものが好ましい。より一層、特に好ましいのは、ラットのβ-カゼイン遺伝子、およびヒツジの β-ラクトグロブリン遺伝子である。別の局面において、誘導できるプロモーターが好ましく、特に、食物成分のような、環境の変化によって誘導されるプロモーターが好ましい。これに関して顕著なものは、メタロチオネインのプロモーターで、食物中にある適当な金属性の誘導物質が取り込まれると、動物において誘導が起きるプロモーターである。メタロチオネインプロモーターは、オステオグリシン（osteoglycin）、エピセリン（epithelin）、およびウシのオンコスタチンＭを、トランスジェニック動物の中で発現させるために用いられており、例えば、「マリク（Malik）ら、Molec ．Cell Biol．15: 2349〜2358(1995)」において、組織特異的な発現もしくは誘導的な発現、またはその両方に用いることができるプロモーターに関する概説が提供される。また、乳腺刺激またはステロイドホルモンによって誘導できる乳汁遺伝子のプロモーターも好ましい。本発明において、組織特異的な発現もしくは誘導的な発現、またはその両方にとって有用な該プロモーターには、肝臓特異的な発現のためのアルブミンプロモーター、肝臓特異的な発現のためのα₁-抗トリプシンプロモーター、上皮細胞および基底細胞で発現させるためのケラチン14プロモーター、ニューロンで特に発現させるためのRIβプロモーター、膵臓のβ細胞で発現させるためのインシュリン-1プロモーター、胸腺細胞で発現させるためのLcKプロモーター、金属誘導性のメタロチオネインプロモーター、および乳腺で発現させるためのホルモン誘導性の乳蛋白質遺伝子プロモーターがある。ある蛋白質を高レベルで発現させるトランスジェニック生物における産生を促進する、さらに別の調節因子もあると考えられる。これらのシグナルのいくつかは、転写調節因子または細胞の外に輸送することに関係したシグナルであると考えられる。別のシグナルとしては、効果的な染色体への組み込み、または組み込まれたDNAの安定性に作用するものがあると考えられる。翻訳後修飾が改変されうる生物の例本発明を実施するのに適した非ヒト多細胞生物には、植物および動物が含まれる。物質を乳汁中に産出させるために、特に好ましいのは、ヒト以外の哺乳動物である。授乳する動物のすべて、すなわちすべての哺乳類が、本発明による使用に適している。好ましい哺乳動物には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、およびウマが含まれる。特に、家畜および研究用動物が好ましい。家畜の中でも、ウシ、ヤギ、ヒツジ、およびブタが好ましいが、ヒツジ、およびブタが特に好ましい。研究用動物では、前記されたもの、およびイヌ、ネコ、ハムスター、ウサギ、ラット、およびマウスである。これらの中では、ハムスター、ラット、およびマウスが特に好ましい。この点に関して、ラットおよびマウスが特に好ましい。トランスジェニック生物を作出するための一般的方法の例トランスジェニック生物を作出するための標準的な周知の技術を用いて、本発明にしたがって、生物の中に遺伝子を導入できる。これらの開発中の技術は、例えば、「マーフィー（Murphy）ら編、トランスジェニック技術（1993）、ニュージャージー、トトワ、ヒューマンプレス社」および「プーラー（A．Puhler）編、動物の遺伝子工学、ニューヨーク、ワインハイム、VCH フェアラーク社」など、多くの概説の主題となっている。例えば、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム媒介沈澱法、リポソーム融合法、レトロウイルス感染法、またはその他の方法によって、DNAを分化全能性幹細胞または多分化能性幹細胞の中に導入することができる。その後、異種性のDNAを含む細胞を細胞胚の中に導入して、その中でトランスジェニック生物を形成させることができる。好ましい方法では、レトロウイルスベクターを発生中の細胞または胚に感染させて、感染した胚からトランスジェニック動物を作出することができる。極めて好ましい方法においては、好ましくは単細胞期にある胚にDNAをマイクロインジェクションすると、胚は成長して、成熟したトランスジェニック動物になる。上述した技術を用いて、２種類以上の異なったDNAを多細胞生物のゲノムDNAに導入することによって、二重または多重トランスジェニック動物を作出することができる。DNAは、同じプロモーターかまたは別個のプロモーター、および他の発現調節シグナルを有しうる。第一および第二の蛋白質をコードするcDNAまたはゲノムDNAは、別々に構築されていても、単一の構築物になっていてもよい。さらに、多重トランスジェニック生物は、交配させることもできる。例えば、適当な周知の交配技術を用いて、２種の単一トランスジェニック生物を交配させて、両親の導入遺伝子を両方とも有する二重トランスジェニック子孫を作出することができる。また、連続交配を用いて、さらに別の遺伝子を導入することができる。本発明の実例である導入遺伝子を発現させるための、細胞、組織、器官、体液、およびその他の生理学的区分一般的に、生物のいかなる細胞または組織も、本発明にしたがって用いることができる。本発明のいくつかの局面においては、改変された翻訳後修飾を、特定の生理学的区分に隔離するような、あらゆるタイプの特異的な発現が好ましい。区分とは、改変を局所的にすることによって、全身への望ましくない影響を受ける可能性から生物体自体を守る、生物の生理学的および/または物理的に隔離された形状を意味する。この点に関して好ましいのは、物質を体液中に分泌する細胞および組織である。これに関して、蛋白質を血液、唾液、尿、および乳汁の中に分泌する細胞および組織が極めて好ましい。蛋白質を尿または乳汁の中に分泌する細胞および組織が非常に好ましい。これらの中でも、蛋白質を乳汁の中に分泌する乳房上皮細胞が特に好ましい。また、蛋白質を尿中に分泌される細胞も好ましい。本発明の産物の例本発明は、遺伝子導入した後生生物における蛋白質の成熟を促進するために用いることができると評価される。本発明を用いて、トランスジェニック生物の細胞における蛋白質の成熟を改変すれば、その生物の中の物質産生に影響を与えることができる。翻訳後修飾を改変することによって、物質の産生に直接影響を与えることができ、また、間接的に影響することもできる。例えば、後者の場合、本発明を用いて、細胞の代謝作用および異化作用の産物で、蛋白質性のものだけでなく、非蛋白質性の産物の産生に影響するよう、細胞の中の酵素活性を改変することができる。この点に関しては、例えば、本発明は、蛋白質の翻訳後のリン酸化を改変し、それによって、基質を産物に変換する活性を改変するのに役立つ。このように、本発明による翻訳後修飾の改変を用いて、トランスジェニック生物中の細胞が産生する何らかの物質の産生を改変することができる。より具体的には、本発明は、トランスジェニック生物における蛋白質の成熟を改変するために用いることができる。この点に関して、本発明は、例えば乳蛋白質の翻訳後修飾を改変するために用いることができる。本発明のこの局面の特定の実施例は、乳汁中のカゼインのリン酸化および蛋白質分解的プロセシングを、本発明の方法によって改変できることである。本発明のさらに別の局面において、このタイプの翻訳後修飾の改変を用いて、トランスジェニック生物の中で新しい産物を産出させることができると考えられる。例えば、本発明に係る方法によって、乳汁の品質を決定し、また、乳汁に由来する産物を産生するのに重要な役割を果たすことが知られているカゼインの翻訳後修飾を改変することができる。このように、前述した乳汁におけるカゼインのリン酸化および蛋白質分解的プロセシングの改変を用いて、新しい乳汁、乳蛋白質、および乳産物を提供するトランスジェニック哺乳動物を作出することができる。さらに、本発明は、翻訳後修飾を行なう酵素を産生し、乳汁および乳汁に由来する産物などの、該酵素を含む組成物を産生するために用いることができる。したがって、この点に関して、本発明は、一般的に新しい食料および食品を提供することに応用することができると考えられる。実例：トランスジェニックマウスの乳汁におけるHPCの、PACE/フリン（furin）によって促進される成熟ビタミンＫ依存型凝血蛋白質は、一般的に、前駆体として合成されてから、とりわけ、一連の蛋白質分解的切断を受けて、最終的に完全に成熟した蛋白質を産生する蛋白質の一つのクラスを表すものである。部分的には、プロテアーゼが前駆体型凝血蛋白質の成熟を担う。前駆体型凝血蛋白質の蛋白質分解的プロセシングは、本発明によって、物質産生を改良するために、トランスジェニック生物の中で改変することができる翻訳後修飾の一つのタイプである。本発明のこの局面の実例は、トランスジェニックマウスの乳汁において、成熟したHPCの産生を増加させるために、乳房上皮細胞の中でPACE/フリン（furin）を発現させることである。完全な翻訳後修飾およびプロセシングを受けた、ビタミンＫ依存型凝血蛋白質の効果的な導入遺伝子発現については、いくつかの有望な結果が得られているにも拘わらず、依然として一つの困難な問題が残っている。従来からある細胞系においてこれらの蛋白質のいくつかを発現させると、同じような傷害が観察される。例えば、HPCをトランスフェクションさせた培養細胞は、HPCの単鎖を完全にはプロセシングしない。実際、ヒトの肝臓細胞は、インビボで、単鎖を完全には二本鎖にプロセシングしない。観察者は、成熟した二本鎖型にプロセシングされた前駆体の量を、ヒトの肝臓においては85〜95％、肝臓由来のHepG2細胞においては50％、トランスフェクションされたハムスター新生児腎臓細胞においては30％、およびヒト腎臓293細胞では80％であると報告している。サティー（Suttie，J .W.，Thromb．Res．44: 129〜134(1986)）、およびヤンら（Yanら、Trends in B iochemical Sci．14: 264〜268(1989)）の報告によれば、チャイニーズハムスター卵巣細胞系（CHO）およびC127マウス線維芽細胞系は、この蛋白質を成熟型には全くプロセシングしなかったばかりか、プロペプチドを付加したままのrHPCを分泌しさえした。トランスジェニック動物の乳汁に分泌されたrHPCは、プロrHPCと単鎖rHPCとの混合物であることが報告された（Drohanら、Transgenic Res．3: 355〜364(1994 )，Valenderら、PNAS，U.S.A．89: 12003〜12007(1992)）。異なる細胞において、rHPCの蛋白質内部切断的な成熟の非効率性が変化するのは、細胞中でrHPCが産生されると、内因性のプロセシングプロテアーゼが定常状態になるためであろうと示唆されている。適切なプロテアーゼの発現によって、トランスジェニック生物の細胞における rHPCの蛋白質内部切断的なプロセシングは改良される。上述した蛋白質分解プロセシングを行なう酵素の中には、プロホルモンコンバターゼ（PC）と呼ばれるスブチリシン様セリンプロテアーゼまたは対合塩基性アミノ酸切断酵素（「PACE」）がある。これらの蛋白質は、本発明によるトランスジェニック生物中で発現し、蛋白質分解による凝血蛋白質前駆体型の成熟を促進することができる。乳腺におけるHPCのプロセシングを改良したトランスジェニックマウスを作出するための最初の段階として、HPCおよびPACE/フリン（furin）をコードする、クローニングされた遺伝子を、乳腺上皮細胞でHPCおよびPACE/フリン（furin）が発現されるように指図する発現調節の下に置いたDNAを構築した。この目的にとって好ましいプロモーターは、マウスの乳漿酸性蛋白質プロモーターの、4.2 kbのSau3A-Kpn1断片である。乳腺上皮細胞およびその他の細胞で同様の方式で、蛋白質を発現させるために、この他のプロモーターおよびプロモーター断片を用いてもよい。これに関する好ましい態様において、プロテインＣをコードするヒトのゲノム DNAを用いて、HPCを発現させることができる。最も好ましいヒトゲノムDNAには、プロテインＣの開始コドンから21塩基上流で始まり、プロテインＣ遺伝子の3' 末端のNheI部位で終わる、ヒト・プロテインＣ遺伝子の断片があり、これは、9. 4 kbの長さで、乳汁においてヒト・プロテインＣを高度に発現させる調節因子を含んでいる。これに関し、ここで説明した9.4 kbのヒト・プロテインＣの断片は、単に、極めて好ましいDNAの一つに過ぎないと理解されると考えられる。勿論、全く同じようにして、多くの他のDNAを用いることもできる。 PACE/フリン（furin）を発現させるために、作製され特徴付けが行われているさまざまなPACE/フリン（furin）DNAのいずれをも用いることができる。PACE/フリン（furin）をコードする、ここでの使用に適したDNAについては、例えば、ヴァンド・ヴェンら（van de Venら、Molecular Biology Reports 14: 265〜275(1 990)）、およびワスリーら（Wasleyら、J．Biol．Chem．268: 8458(1993)）によって説明されている。プロモーターを含むDNAを、プロテインＣをコードするDNAと、PACE/フリン（f urin）をコードするDNAとに連結させる。蛋白質の発現が、プロモーターからの転写によって調節されるように、DNAを配置する。連結した産物を適当なベクターの中に挿入して増殖させる。最後に、インジェクション用のDNAを精製して、トランスジェニックマウスを作出するために用いる。これらの処理に関係するすべての技術は、さらに詳しく上述されており、本明細書の別の箇所で引用された参照の中にもあるが、これらは、当業者によって周知であり、日常的に実施されている。インジェクションした胚から発生した子孫に導入遺伝子が存在しているか否かを、標準的な技術を用いて調べることができる。例えば、動物に導入遺伝子が入っていることは、尾の組織の小片から採取したゲノムDNAの中で、インジェクションしたPACE/フリン（furin）およびHPC DNAに特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）によって判定することができる。同様に、ウエスタンブロット、ELISA、前凝血因子活性測定法、およびHPCのトランスジェニック発現に含まれる文献で説明されている方法、とりわけ、本明細書の別の箇所で説明されているような標準的な技術を用いて、授乳中のマウスによるプロテインＣの発現を測定することができる。特に、乳汁中に含まれるプロテインＣは、活性に過度な影響を与えることなく、既知の方法によって精製することができる。この点に関して、適当な精製方法の一つは、イムノアフィニティー・クロマトグラフィーである。または例えば、ドロハンら（Drohan）（ガリンド(Galindo)ら編、オランダ、クルーワー・アカデミック社、生物処理工学の進展、501〜507貞(1994)）によって説明されている方法を用いたその他の従来の方法によって、発現されたプロテインＣを乳汁から分離することができる。本発明によって乳汁中に産生されたプロテインＣは、トランスジェニック哺乳動物から乳汁を採取したらできるだけ早く分離して、蛋白質の安定性に対する有害な効果を抑えることが好ましい。発現されたプロテインＣの蛋白質分解による成熟の程度は、全乳から乳漿を分離し、蛋白質をSDS/PAGEによりサイズによって分析し、この蛋白質をフィルター上にブロッティングし、乳汁中のrHPCを可視化するために、あらゆる形状のHPC を認識する抗体によってこのフィルターをプローブによる検索をして評価することができる。組換えプロHPC前駆体からプロHPCへの転換、プロHPCから成熟rHPCへの転換、および単鎖rHPCから二本鎖rHPCへの転換に対するPACE/フリン（furin）発現の効果を直接的に測定するために、遺伝子導入していないマウスからの乳汁中のrHPC 、HPCについて造伝子導入したマウス、ならびにHPCおよびPACE/フリン（furin）について遺伝子導入したマウスを、ブロットの中に並べて比較することができる。rHPCの形状を観察して、PACE/フリン（furin）によって媒介された切断が、天然のプロセシング部位に一致するか否かを判定するためにシークエンシングを行うことができる。天然のHPCを有するトランスジェニックマウスにおいて産生されるrHPCの正確さを評価するために、活性測定法を応用することもできる。上記のことは、後述する特異的な実施例において、より詳細に例示する。この例示は制限的なものではなく、同じ範例を用い、本発明にしたがって、あらゆる蛋白質の翻訳後プロセシングを改変することができる。このように、例えば、トランスジェニック動物の細胞中のrHPCを適切に切断できる別の酵素を、PACE/フリン（furin）と同じように用いることができ、また、トランスジェニック動物の中で別の蛋白質を発現させ、HPCの蛋白質分解的成熟を上述のように促進したのと同じ方法で、そのプロセシングを促進することができる。本発明は、以下の例証的な実施例を参照することによって、さらに説明される。トランスジェニック動物の器官の中の、複雑な異種性蛋白質のプロセシングが改良されることを示すものとして、正しくプロセシングされた二本鎖HPCの産生を上昇させ、マウスの乳汁およびマウスの乳漿の組成を改変するために、ヒトPA CE/フリン（furin）をコードするDNAを、トランスジェニック動物の乳腺細胞の中で発現させた。実施例１：WAP/HPCおよびWAP/PACE cDNAの構築、ならびにHPCおよびHPC/PACE二重トランスジェニックマウスの作製完全なHPC遺伝子と、（i）完全なPACEのcDNA、または（ii）酵素的に不活性な蛋白質（「PACEM」）をコードする変異PACEのcDNAを遺伝子導入したマウスを、標準的な方法を用いて、２種のcDNAを含む構築物をマウス胚に同時にインジェクションして作製した。図１に、ヒト・プロテインＣの翻訳後プロセシングが概略的に示されている。本実施例の例示的なDNA構築物が、図２に略図で示されている。乳腺でのPACEとPACEMの発現を目的として、cDNAをマウスWAPプロモーターの発現調節下に置いた。プロモーターは周知で、「ドロハン(Drohan)ら、Transgenic Res．3: 355〜364(1994)」、および「パレヤンダ(Paleyanda)ら、Transgenic Re s．3: 335〜343(1994)」において説明されているように、遺伝子導入した哺乳動物の乳汁の中で発現と分泌を行わせるために用いられた。イントロンのないWAP/PACE cDNAを用いて、PACEを少量発現させた。いくつかのグループが、イントロンのない導入遺伝子が、乳腺の中で低効率に発現されたことを記録した（ホワイトロー(Whitelaw)ら、Transgenic Res．1: 3〜13(1991) 、およびHennighausen，L.，Protein Expr．and Purif．1: 3〜8(1990)）。 WAP/HPC cDNA構築物は、4.1 kbのマウス乳漿酸性蛋白質（WAP）プロモーター（33）、および0.4 kbの3'側非翻訳配列を有する、9 kbのHPC遺伝子を含んでいた。このDNA構築物は、「ドロハン(Drohan)ら、Transgenic Res．3: 355〜364(1 994)」および「ホーガン(Hogan)ら、マウス胚の操作、コールドスプリングハーバー・プレス（1986）」で説明されているような（29）、周知の技術を用いて、容易に入手することができるDNAから構築した。 WAP/PACEおよびWAP/PACEMを作製するために、4.1 kbのSau3A-KpnI WAPプロモーター断片、および1.6 kbの3'側WAP非翻訳配列を含むBamHI-EcoRI断片を、PUC1 9の中にクローニングして、プラスミドpHL215を作製した。794コドンのヒトPACE をコードする配列と、74塩基の3'側非翻訳配列とを含む2.47 kbのEcoRI-SalI断片を、PACE cDNAクローンから切り出して（ワイズ(Wise)ら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA87: 9378〜9382(1990)）、マングビーン・ヌクレアーゼで処理した。次に、PACE、またはSer₂₆₁からAlaに変異したPACE（「PACEM」）断片を、Smal消化したpHL215プラスミドの中に挿入して、PACEまたはPACEM cDNAをWAPプロモーターの発現調節下に置き、それぞれ、プラスミドpHL252およびpHL255を作製した。インジェクションのためのWAP/PACEおよびWAP/PACEM DNAをNotl-HindIII消化によってプラスミドから切り出して、マイクロインジェクション用に精製した。 WAP/HPCおよびWAP/PACE断片を、分子比2:1、全濃度2 μg/mlで同時にインジェクションしてトランスジェニックマウスを作製した。PCRを用いて、インジェクションした胚から作出されたマウスから採取した尾のDNAの中で、導入遺伝子DNA を検出した。尾の試料から採取したDNAの中の、HPC、およびPACEに特異的なPCR 産物によって、トランスジェニックマウスを同定した。HPC遺伝子の5'末端の502 bpの領域、およびマウスWAP遺伝子の216 bpの領域を明らかにするプライマーを、WAP/HPC DNAに対するプローブとして用いた（ドロハン(Drohan)ら、Transgeni c Res．3: 355〜364(1994)）。PACE cDNAの5'末端の260bpの領域を明らかにするプライマーを、PACE DNAに対するプローブとして用いた（ワイズ(Wise)ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87: 9378〜9382(1990)）。 13匹のマウスをスクリーニングした中から、HPC、およびPACE導入遺伝子を両方とも有する４匹の創始者マウスを検出した。４匹のHPC/PACE創始者マウスはすべて、導入遺伝子を子孫に伝達した。オスのC1.2は、高頻度の導入遺伝子伝達を示し、モザイクのようだった。３匹のメス、C2.2、C4.1、およびC5.2は、低い伝達頻度を示し、モザイクのようだった。７匹のマウスをスクリーニングした中から、HPC、およびPACEM導入遺伝子を両方とも有する創始者マウス２匹と、PACE導入遺伝子のみを有する創始者マウス１匹を検出した。二重のトランスジェニック創始者マウスM2.3は、PACEM、およびHPC導入遺伝子を両方とも子孫に伝達した。後代への伝達を示した５匹の創始者マウスから系統を確立し、これらの系統から得たマウスをその後の実験に用いた。実施例２：ノザンブロッティングにようPACEおよびWAP発現の検出標準的な技術を用いて、F1またはF2世代のメスのトランスジェニックマウス、および対照用マウスの細胞から、全RNAを調製した。酸性グアニジウムチオシアネート・フェノール-クロロフォルム抽出を用いた１段階処理法（例えば、モレキュラーリサーチセンター社（Molecular Research Center，Inc）のRNAzolなどが市販されており、「チョムチェンスキー(Chomczynski)ら、Anal．Biochem．16 2: 156〜159(1987)」の中で説明されている）で、新鮮な組織、または凍結させた組織からRNAを単離した。RNAは、各試料について15μgの全RNAを用いてノザンブロットで解析した。各実験毎に、２匹以上の動物から採取したRNAを解析した。「チョムチェンスキー（Chomczynski，P.）Anal．Biochem．201: 134〜139(1992)」において説明されているように、RNA試料は、変性条件の下、ホルムアルデヒド- 1.2％アガロースゲル上で分離してから、ナイロンメンブレン（例えば、GENESCR EEN PLUS DuPont NEN（ジーンスクリーンプラス、デュポン NEN社）などのように購入可能）上に、2.5時間下方アルカリブロッティングを行なった。 HPC、PACE、および18S rRNAに特異的なプライマーによって、このメンブレンをスクリーニングした。HPCのHPC3'側領域からの0.5 kbのBamHI-NheI断片を、PA CEのmRNAのプローブとして用いた。pN29111（ATCC番号63178）の18SリボソームR NA（rRNA）遺伝子の0.75 kbのBamHI-SphI断片を、18S rRNAのプローブに用いた。本来のマウスPACE mRNAに対するプローブとして、完全長の2.5 kbのヒトPACE cDNA断片を用いた。プローブは、ランダムプライマーポリメリゼーション標識によって、³²Pで標識した。高速ハイブリダイゼーション用溶液（ストラタジーン社のQUIK-HYBなど）を用いて、68℃で0.5時間、フィルターをプレハイブリダイゼーションした。そして、0.5から1.0 ng/mlの変性プローブと、超音波破砕したサケ精子DNAを含むバッファー中で、68℃で２時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションした後、室温下、15分間、2×SSC、0.1％SDSの中で２回洗浄し、次に、60℃で、30分間、0.1×SSC、 0.1％SDSの中で１回洗浄してから、オートラジオグラフを作成した。３種のプライマーによる複製ブロットのノザンハイブリダイゼーションによって、HPC、およびPACE導入遺伝子が、HPC/PACEマウスの授乳中の乳腺で発現していることが明らかになった。 HPC mRNAの主要な分子種は、約1725〜1775塩基長（nt）であるが、それとは別に、約200塩基長短い、別の分子種もあった。短いmRNAは、別の3'側のポリA部位（29）によって産生されたものかもしれない。約2250、2400、および4800塩基長のHPC前駆体RNAも検出された。 PACE cDNAプローブによって、予想された大きさ、2700塩基長を有するヒトPAC E mRNAが検出された。オートラジオグラムに感光させる時間を延ばしても、マウス固有のPACEの転写産物は検出されなかった。しかし、厳密度を低くした条件下でハイブリダイゼーションを行なうと、導入造伝子のmRNAよりも、少なくとも一桁低いレベルで、固有の転写産物が検出された。後述の実施例３と表１において説明されているように、HPC特異的なポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAによって、創始者マウス、および後代のマウスの乳汁の中に分泌されるrHPCの量を測定した。実施例３：トランスジェニック動物の乳汁における、成熟rHPCの検出乳汁の回収を促進するために、0.3ml（0.6 IU）のオキシトシンを腹腔内に投与した。乳汁の試料は、授乳７日目から15日目の間に採集した。この乳汁は、50 mMのEDTAを含む２倍のリン酸緩衝食塩水pH 7.4で希釈し、４℃で15分間、15,00 0 rpmで２回遠心分離し、使用するときまで-80℃に保存した。EDTAは、カゼインのミセルを可溶化し、ミセルに結合したrHPCの回収をよくするために使用した。乳汁中のrHPCの濃度を、サンドイッチELISA（固相酵素免疫測定法）によって測定した。ヒツジの抗HPCポリクローナル抗体を固定した微量滴定用ウエルを用いて、希釈した乳汁試料中のrHPCを捕捉した（ドロハン(Drohan)ら、Transgenic Res．3: 355〜364(1994)）。ウサギの抗HPC抗体を用いて、固定した抗体に結合した捕捉rHPCを検出した。次に、ヤギの抗ウサギIgG抗体を結合したホースラディシュ・パーオキシダーゼ（HRP）を固定したウサギの抗HPC抗体に結合させた。熱量（比色）測定用基質3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）を用いた活性測定法によって、結合したパーオキシダーゼを検出した。650 nmの吸光度の10 分間の変化によって、基質利用性を測定した。精製した、血漿由来のHPCを対照用の乳汁で希釈したものを標準として用いた。これらの実験による結果が、以下の表１に示されている。創始者世代のHPC/PACEマウスの乳汁中で検出されたrHPCのレベルは、0.45〜1. 63 mg/mlの範囲にある、後代のマウスの乳汁中で検出されたレベルよりも有意に低かった。これは、創始者マウスのモザイク性を反映しているのかもしれない。 6.4系統からのHPCマウスの乳汁と、HPC/PACEマウスの中で、低量のrHPCを検出した。乳腺におけるrHPCとPACEの同時発現は、繰り返し授乳してもメスの健康に対して有害な影響を与えなかった。正常な非トランスジェニックマウスと同じように、HPC/PACE系統、C2.2、C5.2からのトランスジェニックマウスも、HPC/PACEMトランスジェニックマウスも、一腹で10〜15匹の仔ネズミを産むことができ、PACE は、本来の遺伝子よりも発現レベルが一桁高くても、子育ての能力には影響しないことを示している。HPC/PACEM系統、C1.2およびC4.1の動物は、健康状態は変化しないままであったが、２〜６匹の仔ネズミしか産まなかった。実施例４：遺伝子導入した乳汁中のHPCのウェスタンブロット解析から、PACE/フリン（furin）の同時発現によって成熟が促進することが示される乳蛋白質を、還元的な条件下、10％SDS-ポリアクリルアミドゲルで、予め着色してある分子量マーカーと並べて分離した。電気泳動の後、ゲルを銀染色するか、またはニトロセルロースメンブレン（アマーシャム社のHYBOND-ECLなど）に移しとった。このブロットを、連続的に、（i）重鎖の活性化ペプチド上のエピトープを認識する8861抗HPCモノクローナル抗体、またはヒツジの抗HPCポリクローナル抗体と反応させた後、（ii）HRPを結合した二次抗体と反応させた。HRP結合体を結合させて、フィルターを洗浄した後、増強した化学発光を用いて、結合HRPの活性を判定した。現像したウェスタンブロットのデンシトメータのスキャニングを用いて、蛋白質を定量した。この解析によって、HPCまたはHPC/PACEMトランスジェニックマウスの乳汁からのrHPCは、約40〜60％のrHPC単鎖型を含むことが示されたが、これは、ヒトの血漿中に存在する５〜15％よりも高かった。これとは極めて対照的に、PACEを発現するHPC/PACE二重トランスジェニックマウスの乳汁中の単鎖型の量は、平均して、５％よりも少なかったが、これは、異種性PACE遺伝子の導入遺伝子発現によって、前駆体から成熟二本鎖型への効果的な転換が起こっていることを示している。実施例５：トランスジェニックマウスの乳汁からのrHPCの精製およびアミノ酸解析から、PACE/フリン（furin）の同時発現によって正確な成熟が促進されることが示される C5.2系統の、何匹かのF2およびF3動物から集めた全乳1.5〜２mlを融解して、2 0 mlの50 mM Tris、0.15 M NaCl、2 mM EDTA、2 mM ベンズアミジン、pH 7.2で希釈して、30,000 gで、15分間、４℃で遠心分離した。遠心してできた水相を0. 45μmのメンブレン（例えば、ミリポア社のMILLEX-HA）に通して濾過した。濾過された液は、50mM Tris、0.15 M NaCl、2 mM EDTA、2 mM ベンズアミジン、pH 7 .2で平衡化したセファアロースCL-4B樹脂（ファルマシア社より）上に固定した8 861MAbを含む1.5 cm×2.7 cmのカラムに、直線的な流速2.7 cm/hrで流した。試料を流したカラムを、5 mMの酢酸アンモニウム、pH 5.0で洗浄してから、結合しているrHPCを、0.5 M酢酸アンモニウム、pH 3.0で溶出し、直ちに3 M Trisで中和してから-80℃で保存した。乳汁からのrHPCの回収率は、80％以上であった。既に説明したように、HPC/PA CEマウスの乳汁から精製したrHPCの電気泳動解析は、rHPCポリペプチドが、血漿由来のHPCよりも、僅かに速く移動することを明らかにした。この違いは、恐らく、グリコシル化の違いによるものであろう（ドロハン(Drohan)ら、Transgenic Res．3: 355〜364(1994)）。既述した精製処理によって、HPCマウスから得たrHPCから、単鎖のrHPCを除去したが、HPC/PACEマウスからのrHPCの中にある単鎖rHPCの量は、実質的に低かった（ドロハン(Drohan)ら、Transgenic Res．3: 355〜364(1994)）。さらに、この他のrHPC特異的な低分子量バンドは、非還元的SDS-PAGEにおいても、還元的SD S-PAGEにおいても観察されなかった。 HPC/PACEマウスの乳汁からのrHPCのアミノ酸配列の解析によって、下記の表２に示すように、HPCの１番目と158番目で始まる２つのアミノ末端配列があることが明らかになった。 Ala¹は、以前から、HPCプロペプチドの除去部位であることと同定されてきた（フォスター(Foster)ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82: 4673〜4677(1985) ）。As¹⁵⁸は、HPCチモーゲンが、成熟型の二本鎖HPCに転換する過程で起こる、内部Lys¹⁵⁶−Arg¹⁵⁷ジペプチドの切断部位である。これらの結果は、HPC/PACEマウスの乳腺細胞の適正な部位で、プロテインＣのプロペプチドと単鎖の両方のプロセシングが起こることを示している。これとは対照的に、HPCマウスにおいては、乳汁の中に分泌されるrHPCの20〜30％がプロペプチドを含んでいる（ドロハン(Drohan)ら、Transgenic Res．3: 355〜364(19 94)）。さらに、６、７、14、16、19、20、25、26、および29番目のGlu残基が十分に得られたことは、これらの発現レベルにおいては、グルタミン酸残基のγ-カルボキシル化が効果的には行われないことを間接的に示しており、これは初期の観察とも一致している（ドロハン(Drohan)ら、Transgenic Res．3: 355〜364(1994) ）。実施例６：PACE/フリン（furin）の発現は、トランスジェニック動物の乳汁の乳漿酸性蛋白質含量を減少させる対照用の非トランスジェニックマウス、HPCを遺伝子導入したマウス、HPCおよびPACEMを二重遺伝子導入したマウス、ならびにHPCおよびPACEを二重遺伝子導入したマウスから採取した乳蛋白質の中の、マウス乳漿酸性蛋白質（「WAP」）のウェスタンブロット解析によって、HPC/PACEの発現が、乳汁のWAP含量を減少させることが明らかになった。乳蛋白質を、本質的には上記と同様のウェスタンブロットにより解析した。簡単に説明すると、脱脂した乳蛋白質を14％SDS-PAGEゲル電気泳動により分離した。分離された蛋白質を、標準的なウェスタンブロッティング法によりフィルターに転写し、それから抗WAP抗体を用いてフィルター上のWAPを可視化した。非トランスジェニックマウス（すなわち正常マウス）、HPC/PACEトランスジェニックマウス、HPCトランスジェニックマウス、およびHPC/PACEMトランスジェニックマウスから得られた乳清蛋白質を並べて分析した。非トランスジェニックマウス、HP Cマウス、HPC/PACEマウスの乳汁中のWAP蛋白質量は、すべての場合においてほぼ同一であった。一方、HPC/PACEMトランスジェニックマウスのWAP蛋白質量は約40 〜60％減少した。実施例７：PACE/フリン（furin）はトランスジェニック動物の乳汁中に分泌される上記のようなウェスタンブロッティング法を用いて、トランスジェニックマウスの乳汁中にPACE/フリン（furin）が存在するか否かを解析した。対照マウスおよびトランスジェニックマウスの乳汁から得られた乳清蛋白質を8％SDSポリアクリルアミドゲルでのPAGEにより分離した。ゲルをフィルター上にブロットし、PA CE/フリン（furin）特異的抗体を用いてPACEを可視化した。全ての試料で出現した約50kDのバンドは、人工的な二次抗体の非特異的結合によるものであると考えられた。非トランスジェニック対照マウス、HPCトランスジェニックマウス、またはHPC/PACEトランスジェニックマウスの乳汁中には、furin特異的なバンドは観察されなかった。HPC/PACEMトランスジェニックマウスの乳蛋白質中には、約8 0kDaのPACE/furin特異的なバンドが検出された。実施例８：PACE/furinはトランスジェニックマウスの乳汁中において活性のあるプロテアーゼである対照トランスジェニック動物およびHPC/PACEトランスジェニック動物の乳汁中のPACE/furin活性を、以下のように一本鎖rHPCから二本鎖rHPCへの変換をモニターすることにより、決定した。マウスから得た全乳汁を37℃で0時間、1時間、および3時間インキュベートし、遠心分離により脱脂し、各試料由来の蛋白質を8〜16％ゲルでのSDS-PAGEにより分離した。さらに、HPC/PACEマウスの乳汁をHPCマウスの乳汁と1：10の比率で混合し、HPC/PACEマウスの乳汁中に分泌されたPACE/furinの活性を検出した。ゲルをフィルター上にブロッティングし、上記のように、HPC特異的抗体を用いたウェスタンブロッティング法により、HPCを可視化した。 HPC/PACEマウスの乳汁を含む試料に含まれていた一本鎖HPCは、他のマウスの乳汁よりも少なかった。前駆体の減少を、分泌されたPACE/furinの活性の指標とした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ペイルヤンダレッカケイ. アメリカ合衆国メリーランド州ガイサーズバーグキングジェイムズウェイ 17018 ＃203

Claims

【特許請求の範囲】１．第一の蛋白質をコードする第一のポリヌクレオチドおよび第二の蛋白質をコードする第二のポリヌクレオチドが発現可能に組み込まれている細胞を含有するトランスジェニック非ヒト多細胞生物であって、細胞内の該第二の蛋白質の発現が該第一の蛋白質の翻訳後修飾に影響を与えるものであることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト多細胞生物。２．植物であることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック生物。３．ポリヌクレオチドが生物の特定の細胞で発現することを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック生物。４．第一の蛋白質が生物の体液中に分泌されることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック生物。５．翻訳後修飾が第一の蛋白質の成熟にとって必要なものであることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック生物。６．第二の蛋白質が、アセチル化、ADPリボシル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的付加、ヘムの共有結合的付加、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的付加、脂質または脂質誘導体の共有結合的付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合的付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化（myristoylati on）、酸化、蛋白質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、アルギニル化のような転移RNAが介在する蛋白質へのアミノ酸付加、およびユビキチン化からなる群より選択される翻訳後修飾に影響を与えるものであることを特徴とする、請求項１記載のトランスジェニック生物。７．第一の蛋白質が生物の体液中に分泌されることを特徴とする、請求項３記載のトランスジェニック生物。８．体液が血液、乳汁、尿、および唾液からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項７記載のトランスジェニック生物。９．第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ該前駆体蛋白質が細胞内で該プロテアーゼによりプロセシングされるものであることを特徴とする、請求項７記載のトランスジェニック生物。１０．第一の蛋白質がビタミンＫ依存性蛋白質である、請求項７記載のトランスジェニック生物。１１．第一の蛋白質が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII因子、プロテインＳ、骨Gla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-PA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンであることを特徴とする、請求項７記載のトランスジェニック生物。１２．細胞が乳腺の分泌細胞であり、第一の蛋白質が生物の乳汁中に分泌されることを特徴とする、請求項８記載のトランスジェニック生物。１３．第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ該前駆体蛋白質が細胞内で該プロテアーゼによりプロセシングされるものであることを特徴とする、請求項１２記載のトランスジェニック生物。１４．第一の蛋白質が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII因子、プロテインＳ、骨Gla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-PA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンであることを特徴とする、請求項１３記載のトランスジェニック生物。１５．プロテアーゼが対合塩基性アミノ酸切断酵素であることを特徴とする、請求項１４記載のトランスジェニック生物。１６．第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードするものであることを特徴とする、請求項１５記載のトランスジェニック生物。１７．プロテアーゼがPACE/フリン（furin）であることを特徴とする、請求項１６記載のトランスジェニック生物。１８．蛋白質ガンマカルボキシル化に影響を与える第三の蛋白質をコードする第三のポリヌクレオチドをさらに含有する、請求項１３記載のトランスジェニック生物であって、第一の蛋白質がその成熟のためにガンマカルボキシル化を必要とし、第三の蛋白質が細胞内における第一の蛋白質のガンマカルボキシル化に影響を与えるものであることを特徴とする、トランスジェニック生物。１９．第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードするものであり、プロテアーゼがPACE/フリン（furin）であることを特徴とする、請求項１８記載のトランスジェニック生物。２０．第一の蛋白質をコードする第一のポリヌクレオチドおよび第二の蛋白質をコードする第二のポリヌクレオチドをトランスジェニック非ヒト多細胞生物に発現可能に組み込む段階、該第二の蛋白質が細胞内で該第一の蛋白質の翻訳後修飾に影響を与えるように、該生物の細胞内で第一の蛋白質および第二の蛋白質を発現させる段階、および、その後該生物から翻訳後修飾された第一の蛋白質を単離する段階を含むことを特徴とする、翻訳後修飾された蛋白質を作製する方法。２１．ポリヌクレオチドが生物内の特定の細胞において発現することを特徴とする、請求項２０記載の方法。２２．第一の蛋白質が生物の体液中に分泌されることを特徴とする、請求項２１記載の方法。２３．体液が血液、乳汁、尿、および唾液からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項２２記載の方法。２４．第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ該前駆体蛋白質が細胞内で該プロテアーゼによりプロセシングされるものであることを特徴とする、請求項２３記載の方法。２５．細胞が乳腺の分泌細胞であり、第一の蛋白質が生物の乳汁中に分泌されることを特徴とする、請求項２３記載の方法。２６．第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ該前駆体蛋白質が細胞内で該プロテアーゼによりプロセシングされるものであることを特徴とする、請求項２５記載の方法。２７．第一の蛋白質が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII因子、プロテインＳ、骨Gla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-pA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンであることを特徴とする、請求項２６記載の方法。２８．プロテアーゼが対合塩基性アミノ酸切断酵素であることを特徴とする、請求項２７記載の方法。２９．第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードするものであることを特徴とする、請求項２８記載の方法。３０．プロテアーゼがPACE/フリン（furin）であることを特徴とする、請求項２９記載の方法。３１．蛋白質のガンマカルボキシル化に影響を与える第三の蛋白質をコードする第三のポリヌクレオチドをさらに含有する、請求項２４記載の方法であって、第一の蛋白質がその成熟のためにガンマカルボキシル化を必要とし、第三の蛋白質が細胞内における第一の蛋白質のガンマカルボキシル化に影響を与えるものであることを特徴とする、方法。３２．第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードするものであり、プロテアーゼがPACE/フリン（furin）であることを特徴とする、請求項３１記載の方法。３３．生物の細胞内における第二の蛋白質の発現が第一の蛋白質の翻訳後修飾に影響を与えるように、第一の蛋白質をコードする第一のポリヌクレオチドおよび第二の蛋白質をコードする第二のポリヌクレオチドをトランスジェニック非ヒト多細胞生物に発現可能に組み込む段階、および、該生物から翻訳後修飾された蛋白質を単離する段階を含む方法により作製された翻訳後修飾された蛋白質。３４．ポリヌクレオチドが生物内の特定の細胞において発現することを特徴とする、請求項３３記載の翻訳後修飾された蛋白質。３５．第一の蛋白質が生物の体液中に分泌されることを特徴とする、請求項３４記載の翻訳後修飾された蛋白質。３６．体液が血液、乳汁、尿、および唾液からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項３５記載の翻訳後修飾された蛋白質。３７．第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ該前駆体蛋白質が細胞内で該プロテアーゼによりプロセシングされるものであることを特徴とする、請求項３５記載の翻訳後修飾された蛋白質。３８．細胞が乳腺の分泌細胞であり、第一の蛋白質が生物の乳汁中に分泌されることを特徴とする、請求項３６記載の翻訳後修飾された蛋白質。３９．第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ該前駆体蛋白質が細胞内で該プロテアーゼによりプロセシングされるものであることを特徴とする、請求項３８記載の翻訳後修飾された蛋白質。４０．第一の蛋白質が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII因子、プロテインＳ、骨Gla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-PA、エリスロポイエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンであることを特徴とする、請求項３９記載の翻訳後修飾された蛋白質。４１．プロテアーゼが対合塩基性アミノ酸切断酵素であることを特徴とする、請求項４０記載の翻訳後修飾された蛋白質。４２．第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードするものであることを特徴とする、請求項４１記載の翻訳後修飾された蛋白質。４３．プロテアーゼがPACE/フリン（furin）であることを特徴とする、請求項４２記載の翻訳後修飾された蛋白質。４４．蛋白質のガンマカルボキシル化に影響を与える第三の蛋白質をコードする第三のポリヌクレオチドをさらに含有する、請求項３９記載の翻訳後修飾された蛋白質であって、第一の蛋白質がその成熟のためにガンマカルボキシル化を必要とし、第三の蛋白質が細胞内における第一の蛋白質のガンマカルボキシル化に影響を与えるものであることを特徴とする、翻訳後修飾された蛋白質。４５．第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードするものであり、プロテアーゼがPACE/フリン（furin）であることを特徴とする、請求項４４記載の翻訳後修飾された蛋白質。４６．第一の蛋白質をコードする第一のポリヌクレオチドおよび第二の蛋白質をコードする第二のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とするトランスジェニック非ヒト多細胞生物の産物であって、該第二の蛋白質が、該生物の細胞内において該第一の蛋白質の翻訳後修飾に影響を与え、それにより該生物により産生される産物の天然の組成を変化させるものであることを特徴とする、産物。４７．ポリヌクレオチドが生物内の特定の細胞において発現することを特徴とする、請求項４６記載の産物。４８．第一の蛋白質、第二の蛋白質、または第一の蛋白質および第二の蛋白質が生物の体液中に分泌されることを特徴とする、請求項４７記載の産物。４９．体液が血液、乳汁、尿、および唾液からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項４８記載の産物。５０．乳汁であるかまたは乳汁に由来するものである、請求項４９記載の産物であって、細胞が乳腺の分泌細胞であり、第一の蛋白質、第二の蛋白質、または第一の蛋白質および第二の蛋白質両方が生物の乳汁中に分泌され乳汁を変化させるものであることを特徴とする、産物。５１．第一のポリヌクレオチドが前駆体蛋白質をコードし、第二のポリヌクレオチドがプロテアーゼをコードし、かつ該前駆体蛋白質が細胞内で該プロテアーゼによりプロセシングされるものであることを特徴とする、請求項５０記載の産物。５２．第二の蛋白質が蛋白質リン酸化に影響を与える蛋白質または前駆体蛋白質に影響を与えるプロテアーゼであり、該リン酸化蛋白質またはプロテアーゼが乳汁中に分泌され乳汁の組成を変化させるものであることを特徴とする、請求項５０記載の産物。５３．第一の蛋白質が、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、プロトロンビン、第X因子、プロテインＣ、第XIII因子、プロテインＳ、骨Gla蛋白質、基質Gla蛋白質、増殖停止特異的蛋白質６、抗トロンビンIII、t-pA、エリスロポエチン、フィブリノーゲン、免疫グロブリン、またはアルブミンであることを特徴とする、請求項４９記載の産物。５４．プロテアーゼが対合塩基性アミノ酸切断酵素であることを特徴とする、請求項５３記載の産物。５５．第一のポリヌクレオチドがプロテインＣをコードするものであることを特徴とする、請求項５４記載の産物。５６．プロテアーゼがPACE/フリン（furin）であることを特徴とする、請求項５５記載の産物。