JPH11509093A - Breast-specific genes and proteins - Google Patents

Breast-specific genes and proteins

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JPH11509093A
JPH11509093A JP9505093A JP50509397A JPH11509093A JP H11509093 A JPH11509093 A JP H11509093A JP 9505093 A JP9505093 A JP 9505093A JP 50509397 A JP50509397 A JP 50509397A JP H11509093 A JPH11509093 A JP H11509093A
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ジ，ホンジュン
エイ． ローゼン，クレイグ
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ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 ヒト乳房特異的遺伝子ポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするDNA(RNA)およびこのようなポリペプチドを組換え技術により産生するための手順を開示する。このようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドを乳ガンの診断マーカーとして、および乳ガンが転移しているかどうかを決定するための薬剤として利用するための方法もまた開示する。ガン細胞を標的化するために用いられ得、そして乳ガンワクチンの一部として使用され得る乳ガン特異的遺伝子ポリペプチドに特異的な抗体もまた開示する。ポリペプチドに対するアンタゴニストをスクリーニングするための方法およびその治療的使用もまた開示する。   (57) [Summary] Disclosed are human breast-specific gene polypeptides and DNA (RNA) encoding such polypeptides and procedures for producing such polypeptides by recombinant techniques. Also disclosed are methods for utilizing such polynucleotides or polypeptides as diagnostic markers for breast cancer and as agents for determining whether breast cancer has metastasized. Also disclosed are antibodies specific for breast cancer-specific gene polypeptides that can be used to target cancer cells and that can be used as part of a breast cancer vaccine. Also disclosed are methods for screening for antagonists to the polypeptide and their therapeutic uses.

Description

【発明の詳細な説明】 乳房特異的遺伝子およびタンパク質 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド にコードされるポリペプチド、および乳房の障害、特に乳ガンの存在および乳ガ ンの転移の検出のためのこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用 に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドの産生および機能の阻害に関 する。本発明の20個の乳房特異的遺伝子は、ときどき本明細書中以下で「BSG1」 、「BSG2」などといわれる。 乳腺は、容易に検出可能な種々の障害に供される。検出は、通常触診からなる 検査によって達成され得る。不運にも、定期的な自己検査はほとんどなされてお らず、そのため多くの乳房のしこりが偶発的な触診によってのみ発見される。疑 わしい嚢腫を微細ゲージ針で吸引することは、かなり一般的なもう１つの診断の 実施である。乳房の乳房撮影または乾式Ｘ線撮影（軟組織Ｘ線）は、なお別の診 断の実施である。病変領域または疑わしい領域の生検は、診断的試験の最高の方 法である。 乳腺に影響を及ぼす多くのタイプの腫瘍および嚢腫がある。線維腺腫は、最も 一般的な良性の乳房の腫瘍である。病理学の実体として、嚢胞の疾患および癌腫 それそれにつづき、３番目にランクされる。これらの腫瘍は、最も頻繁に若い人 々に見られ、通常容易に認識される。なぜなら、カプセル化されたことを感じる からである。良性の状態である線維性嚢胞の疾患は、最も一般的な女性の乳房の 疾患であり、約20％の閉経前の女性に起こる。乳房の脂肪腫もまた一般的であり 、そしてこれらはその性質が良性である。乳房の癌腫は、女性の間で最も一般的 な悪性の状態であり、女性に影響を及ぼす全ガンのうちで最も高い致死率を有す る。女性の一生のうちでいある時期に、アメリカ合衆国の15人の女性に１人が乳 房のガンを発生する。その報告された一年間の発生率は、1947年に人口の100,00 0人の女性あたり70人、1969年に白人について72.5人に、そして黒人について47. 8人から60.1人に上昇した。1930年から現在までの年間の死亡率は、かなり一 定なままであり、女性人口100,000あたり約23人である。乳ガンは、男性におい て希であるが、それが発生するときは、通常後期まで認識されず、従って治療の 結果は芳しくない。女性においては、乳房の癌腫は30歳前にはほとんど見られず 、その発生率は閉経後に急速に上昇する。この理由により、閉経後の乳房のしこ りは、そうでないと証明されるまでは、ガンと考慮されるべきである。 本発明の１つの局面によれば、本発明のヒト乳房特異的遺伝子から転写された RNAまたはこのようなRNAに対応するDNAに特異的にハイブリダイズするのに十分 な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。 本発明の別の局面によれば、宿主由来のサンプル中の本発明のヒト乳房特異的 遺伝子から転写されたRNA、またはこのようなRNAに対応するDNAの存在を検出す ることにより、乳ガンの形成および乳ガンの転移を診断するための方法および産 物が提供される。 本発明のなお別の局面によれば、宿主由来のサンプル中の本発明の乳房特異的 遺伝子に対応するポリペプチドの変化したレベルを検出し、それによりこのポリ ペプチドの上昇したレベルが乳ガンの診断を示すことにより、乳ガンの形成およ び乳ガンの転移を診断するための方法および産物が提供される。 本発明の別の局面によれば、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびにそれらの アンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用な それらのフラグメントを含むヒト乳房特異的ポリペプチドをコードする単離され たポリヌクレオチドが提供される。 本発明のなお別の局面によれば、配列表に記載のポリヌクレオチドを含むヒト 乳房特異的遺伝子が提供される。 本発明のさらなる局面によれば、ポリヌクレオチドにコードされる新規なポリ ペプチド、ならびに生物学的に活性で、かつ診断的または治療的に有用なそのフ ラグメント、アナログ、および誘導体が提供される 本発明のなおさらなる局面によれば、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え 原核生物宿主細胞および/または組換え真核生物宿主細胞を、前記タンパク質の 発現およびその後の前記タンパク質の回収を促進する条件下で、培養する工程を 包含する組換え技術によってこのようなポリペプチドを産生するための方法が提 供される。 本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに特異的な抗体 で、乳ガン細胞または乳ガン転移を検出するために使用され得る抗体が提供され る。 本発明の別の局面によれば、１つ以上の本発明のポリペプチドを乳ガンを処置 するために使用するための方法、およびこのポリペプチドをこのポリペプチドと 相互作用する化合物（例えば、本発明のポリペプチドを阻害または活性化する化 合物）をスクリーニングするために使用するための方法が提供される。 本発明のなお別の局面によれば、１つ以上の本発明のポリヌクレオチドおよび /またはポリペプチドの活性化を阻害し、治療的に、例えば乳ガンの処置におい て使用され得る化合物を検出するためのスクリーンが提供される。 本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチド、またはこのよ うなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、科学的研究、DNAの合成お よびDNAベクターの製造に関するインビトロの目的のために利用するための方法 が提供される。 本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであ るはずである。 以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包含 される本発明の範囲を限定することを意味しない。 図１は、本発明の乳房特異的遺伝子１の全長cDNA配列である。 図２は、本発明の部分cDNA配列、およびその対応する乳房特異的遺伝子２の推 定アミノ酸配列である。 図３は、本発明の部分cDNA配列および乳房特異的遺伝子３の推定アミノ酸配列 である。 図４は、本発明の部分cDNA配列およびその対応する乳房特異的遺伝子４の推定 アミノ酸配列である。 図５は、本発明の乳房特異的遺伝子５の部分cDNA配列である。 図６は、本発明の部分cDNA配列および乳房特異的遺伝子６の推定アミノ酸配列 である。 図７は、本発明の乳房特異的遺伝子７の部分cDNA配列である。 図８は、本発明の乳房特異的遺伝子８の部分cDNA配列である。 図９は、本発明の乳房特異的遺伝子９の部分cDNA配列である。 図１０は、本発明の乳房特異的遺伝子１０の部分cDNA配列である。 図１１は、本発明の乳房特異的遺伝子１１の部分cDNA配列である。 図１２は、本発明の乳房特異的遺伝子１２の部分cDNA配列である。 図１３は、本発明の乳房特異的遺伝子１３の部分cDNA配列である。 図１４は、本発明の乳房特異的遺伝子１４の部分cDNA配列である。 図１５は、本発明の乳房特異的遺伝子１５の部分cDNA配列である。 図１６は、本発明の乳房特異的遺伝子１６の部分cDNA配列である。 図１７は、本発明の乳房特異的遺伝子１７の部分cDNA配列である。 図１８は、本発明の乳房特異的遺伝子１８の部分cDNA配列である。 図１９は、本発明の乳房特異的遺伝子１９の部分cDNA配列である。 図２０は、本発明の乳房特異的遺伝子２０の部分cDNA配列である。 用語「乳房特異的遺伝子」は、このような遺伝子が主に乳房由来の組織で発現 され、そしてこのような遺伝子が乳房以外の組織由来の細胞において発現され得 ることを意味する。しかし、このような遺伝子の発現は乳房組織に由来しない組 織よりも乳房由来の組織において有意に高い。 本発明の１つの局面によれば、図１の推定アミノ酸配列（配列番号１）を有す る成熟ポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体をコ ードするポリヌクレオチドが提供される。 本発明のさらなる局面によれば、図２〜20（配列番号２〜20）のポリヌクレオ チドの１つならびにそのフラグメントに少なくとも90％同一の（好ましくは、少 なくとも95％同一、そして最も好ましくは少なくとも97％または100％同一の） ポリヌクレオチド含むコード部分を有するヒト遺伝子と同一の成熟ポリペプチド をコードするポリヌクレオチドが提供される。 本発明のなお別の局面によれば、そのコード部分がATCC受託番号第97175号（1 995年６月２日寄託）に含まれるポリヌクレオチドの１つと少なくとも90％同一 の（好ましくは、少なくとも95％同一、そして最も好ましくは少なくとも97％ま たは100％同一の）ポリヌクレオチドを含むヒト遺伝子と同一の成熟ポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチドが提供される。 本発明のなお別の局面によれば、そのコード部分が図１〜20（配列番号１〜20 ）のポリヌクレオチド配列の１つと少なくとも90％同一の（好ましくは、少なく とも95％同一の、そして最も好ましくは少なくとも97％または100％同一の）DNA 配列を含むヒト遺伝子のコード部分から転写されるmRNA（またはその対応するcD NA）にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブが提供される。 本発明はさらに、そのコード部分が図２〜20（配列番号２〜20）のポリヌクレ オチドの１つならびにこのようなポリペプチドのアナログ、誘導体、およびフラ グメントに少なくとも90％同一の（好ましくは、少なくとも95％同一、そしてよ り好ましくは少なくとも97％または100％同一の）DNA配列を含むヒト遺伝子のコ ード部分によってコードされる成熟ポリペプチドに関する。 本発明はまた、図１（配列番号１）の成熟ポリペプチド、ならびにこのような ポリペプチドのフラグメントアナログ、および誘導体の１つに関する。 本発明はさらに、そのコード部分がATCC受託番号第97175号（1995年６月２日 寄託）に包含されるポリヌクレオチドの１つと少なくとも90％同一の（好ましく は、少なくとも95％同一、そしてより好ましくは少なくとも97％または100％同 一の）DNAを含むヒト遺伝子によりコードされる同一の成熟ポリペプチドに関す る。 本発明の１つの局面によれば、図１（配列番号１）の推定アミノ酸配列を有す る成熟ポリペプチド、またはそのフラグメント、アナログ、または誘導体をコー ドする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。 本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAは、cDNA、ゲノ ムDNA、および合成DNAを含む）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖で あり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖 であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１〜20（配列番号 １〜20）または寄託したクローンのコード配列と同一であるDNAを含み得るか、 あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、そのコ ード配列が図１〜20（配列番号１〜20）のDNAまたは寄託したcDNAを含む遺伝子 のコード配列と同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る 。 本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る が、これらに限定されない：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプ チドのコード配列、およびリーダー配列または分泌配列あるいはプロタンパク質 配列のようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要 に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イントロンある いは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列）。 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ ドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列およ び/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。 本発明はさらに本発明の成熟ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および 誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリ ヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体 またはポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であり得る。 従って、本発明は、本明細書中上記のものと同じ成熟ポリペプチドをコードす るポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの変異体を含む。こ の変異体は、本発明のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコ ードする。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体、および 付加または挿入変異体を含む。 本発明のポリヌクレオチドは、そのコード配列が図１〜20（配列番号１〜20） に示すDNAを含むヒト遺伝子の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配 列または寄託されたクローン中のDNAのコード配列を有し得る。当該分野で公知 のように、対立遺伝子変異体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または 付加を有し得、コードされたポリペプチドの機能を実質的に変化させないポリヌ クレオチド配列の別の形態である。 本発明はまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、同一のリーディングフレー ムで宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド 配列（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として 機能するリーダー配列）に融合され得る、ポリヌクレオチドを含む。リーダー配 列を有するポリペプチドは、プレタンパク質であり、そしてポリペプチドの成熟 形態を形成するためにそのリーダー配列を宿主細胞により切断され得る。そのポ リヌクレオチドはまた、成熟タンパク質にさらなる5'アミノ酸残基が付いたもの であるプロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プ ロタンパク質であり、そしてそのタンパク質の不活性な形態である。一旦プロ配 列が切断されると、活性な成熟タンパク質が残る。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質、またはプロ配 列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方 を有するタンパク質をコードし得る。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする マーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列 は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供 する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。ある いは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用され る場合は、赤血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ赤血 球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Wilson，I.ら、Cell，37:767 (1984)）。 本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、およ びより好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記のポ リヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に 、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダ イズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジ ェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％、そし て好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味す る。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリ ダイズするポリヌクレオチドは、図１〜20（配列番号１〜20）のDNAまたは寄託 したcDNA（単数または複数）を含むコード配列によりコードされる本発明の成熟 ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを コードする。 あるいは、このポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダ イズし、本明細書中上記したように、それに対して同一性を有し、そして活性を 保持し得るかまたはし得ない、少なくとも10または20塩基、好ましくは少なくと も30塩基、そしてより好ましくは少なくとも50塩基を有し得る。例えばそのよう なポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのためのプローブとして（例えば、こ のポリヌクレオチドの回収のためのプローブ、または診断用プローブ）あるいは PCRプライマーとして用いられ得る。 従って、本発明は、図１〜20（配列番号１〜20）の１つのDNAを含むヒト遺伝 子によりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して 少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％の同一性、およびより好ましくは95 ％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびにそのフラグメント（このフラグ メントは、少なくとも30塩基および好ましくは少なくとも50塩基を有する）、な らびにこのようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。 部分配列は、メッセンジャーRNA分子に対する特異的なタグである。cDNAの形 態でのそのメッセンジャーRNAの完全配列は、部分配列をプローブとして用い、 全長転写物に対応するcDNAクローンを同定し、その後そのクローンの配列決定を することによって決定され得る。部分cDNAクローンはまた、ゲノムクローンまた は調節領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全遺伝 子を含むクローンを同定するためのプローブとして使用し得る。 図２〜20（配列番号２〜20）の部分配列は、それらが由来する対応する全長遺 伝子を同定するために使用し得る。部分配列は、ニックトッランスレーションさ れ得、または当業者に公知の標識法（Basic Methods in Molecular Biology，L. G．Davis，M.D．Dibner,およびJ.F．Battey編，Elsevier Press，NY，1986）を 用いてポリヌクレオチドキナーゼを用いて32Ｐで末端標識され得る。ヒト乳房組 織から調製されたラムダライブラリーは、目的の標識された配列で直接スクリー ニングされ得るか、または細菌のブレスティー(breasty)スクリーニングを容易 にするためにライブラリーはひとまとめにpBluescriptに変換され得る(Stratage ne Cloning Systems，La Jolla，CA92037)。pBluescriptに関しては、Sambrook ら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborator y Press(1989)，1.20頁を参照のこと。両方の方法が当該分野で周知である。簡 単に述べれば、pBluescriptにライブラリーを含む細菌のコロニーを有するフィ ルターまたはラムダプラークを含む細菌の芝生(lawn)は変性され、そしてDNAは フィルターに固定される。フィルターは、Davisら（前出）によって記載される ハイブリダイゼーション条件を用いて、標識されたプローブにハイブリダイズさ れる。ラムダまたはpBluescriptにクローニングされた部分配列は、正のコント ロールとしてバックグラウンド結合を評価するため、および正確なクローン同定 に必要なハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシーを調節するため に用い得る。得られたオートラジオグラムは、コロニーまたはプラークの複製プ レートと比較される；露出したスポットの各々は、陽性のブレスティーまたはプ ラークに対応する。コロニーまたはプラークは選択され、拡大され、そしてDNA は、さらなる分析および配列決定のためにコロニーから単離される。 陽性のcDNAクローンは分析されて、それらが含むさらなる配列の量を、部分配 列由来の一方のプライマーおよびベクター由来の他方のプライマーを用いたPCR を用いて決定する。元の部分配列よりも大きなベクター-挿入PCR産物を有するク ローンは制限消化およびDNA配列決定により分析され、それらがノーザンブロッ ト分析から決定されるmRNAのサイズと同じかまたは類似のサイズの挿入を含むか どうかが決定される。 一旦一つ以上の重複cDNAクローンが同定されると、クローンの完全配列が決定 され得る。好ましい方法は、エキソヌクレアーゼIII消化を用いることである(Mc Combie，W.R，Kirkness，E.，Fleming，J.T.，Kerlavage，A.R.，Iovannisci，D .M.，およびMartin-Gallardo，R.，Methods，3:33-40，1991)。一連の欠失クロ ーンが生成され、その各々が配列決定される。得られた重複配列は、高い縮重（ 各ヌクレオチド位置での通常３から５個の重複配列）を有する１つの連続配列に 構築され、その結果高度に正確な最終配列が得られる。 DNA配列（ならびにその対応するRNA配列）はまた、ATCC受託番号第97175号（1 995年６月２日寄託）に含まれ、そしてそれから単離可能な配列、およびその単 離されたDNA配列（および対応するRNA配列）のフラグメントまたは部分、ならび に同一のポリペプチドをコードするDNA(RNA)配列に同一のDNA配列であるかまた はそれを含む配列を含む。 本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続き上の微生物の寄託 の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当 業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第112条の下で 寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオ チドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、 本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのい かなる対立の場合にも管理している。寄託物を製造し、使用し、または販売する ためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾は本明細書によっ て与えられるわけではない。 本発明はさらに、少なくとも10塩基、好ましくは少なくとも20塩基を有し、そ して30以上の塩基を有し得るポリヌクレオチドであって、そのコード部分が本明 細書中上記のDNAを含むヒト遺伝子から転写されるRNA（およびこのようなRNAに 対応するDNA）にハイブリダイズし得、そして少なくともそれに70％の同一性を 有するポリヌクレオチドに関する。 従って、上記のようにハイブリダイズするポリヌクレオチド配列は、本明細書 中以下に記載されるように診断アッセイにおける使用のために、対応するヒト遺 伝子にハイブリダイズし、そしてその発現を検出するために用いられ得る。 本発明のなお別の局面によれば、宿主における乳ガンの微小転移を検出するた めの診断アッセイが提供される。出願人は本発明の推論(reasoning)をいかなる 特定の科学的理論に限定することを望まないが、乳房由来の細胞以外の宿主の細 胞中における本発明の乳房特異的遺伝子の活性な転写の存在が、乳ガン転移の指 標と考えられている。これは、本当である。なぜなら、乳房特異的遺伝子は身体 の全ての細胞において見出されるのに対し、それらのmRNA、cDNAへの転写および 発現産物は、非罹患個体においては主に乳房に限定されるからである。しかし、 乳ガンが存在すれば、乳ガン細胞は、ガンから他の細胞へ移動し、その結果、こ れらの他の細胞は、活発に乳房特異的遺伝子の転写および発現を、非罹患個体に おいて通常見出されるよりも高いレベルで行う(すなわち、転写は健康な個体の 非乳房組織において見出されるよりも高い)。乳房由来の細胞以外の細胞中での この増幅された転写または増幅されたタンパク質発現の検出が、乳ガンの転移の 指標である。 このような診断アッセイの１例において、乳房以外の組織由来のサンプル中の RNA配列は、プローブへのハイブリダイゼーションによって検出される。サンプ ルは、核酸または核酸の混合物を含み、少なくともそれらの１つは本発明のヒト 乳房特異的遺伝子またはそのフラグメントを含むと疑われ、それらは、このよう な組織中で転写されそして発現される。従って、例えば、特定のRNAの細胞中で の存在を決定するアッセイの形態において、初めにRNAがその細胞から単離され る。 サンプルは、乳房以外（血液、尿、唾液、組織生検材料、および剖検材料を含 むがこれらに限定されない）の組織由来の細胞から得られ得る。乳房以外由来の 細胞から得られたサンプル中の本発明のヒト乳房特異的遺伝子またはそのフラグ メントからmRNAへの増幅された転写を検出するためのこのような方法の使用は、 本明細書の教示から十分に当業者の範囲内にある。 mRNAの単離は、細胞を破壊し、そして分画遠心分離を行うことにより全細胞RN Aを単離することを含む。一旦全RNAが単離されると、mRNAは、当業者にポリ(Ａ) テール（実質的に全ての真核生物mRNA分子の3'末端で見出される）として公知の アデニンヌクレオチド残基を利用して単離される。デオキシチミジン[オリゴ(dT )]だけで構成されるオリゴヌクレオチドは、小さいカラムに詰められたセルロー スおよびオリゴ(dT)セルロースに結合される。全細胞RNAの調製物がこのような カラムを通過するとき、mRNA分子はポリ(Ａ)テールによりオリゴ(dT)に結合する が、残りのRNAは、カラムを流れ去る。次いで、結合したmRNAはカラムから溶出 され、そして回収される。 本発明の乳房特異的遺伝子から転写された単離されたmRNAを検出する一例とし て、本明細書中上記のように、回収されたmRNAを遺伝子特異的オリゴヌクレオチ ドプローブでスクリーニングすることを含む。 このようなプローブは好ましくは分析的に検出可能な試薬で標識され得るか、 または標識され、プローブの同定を容易にすることがまた理解される。有用な試 薬として、放射能、蛍光色素、または検出可能な生成物の形成を触媒し得る酵素 が含まれるが、これらに限定されない。 mRNA配列(cDNA)に相補的なポリヌクレオチドを検出する一例は、ポリメラーゼ 鎖反応(PCR)を逆転写酵素と共に利用する。PCRは、DNAストレッチまたはRNAスト レッチの特異的な増幅のための非常に強力な方法である(Saikiら、Nature，234: 163-166(1986))。この技術の１つの適用は、低コピー数で存在する核酸配列を、 検出可能なレベルまで成長させる核酸プローブ技術にある。この方法の多くの診 断的および科学的適用が、H.A．Erlich(編)によって、PCR Technology-Principl es and Applications for DNA Amplification，Stockton Press，USA，1989、お よびM.A．Inis(編)によって、PCR Protocols，Academic Press，San Diego，USA ，1990に記載されている。 RT-PCRは、PCRと逆転写酵素の組合せである。逆転写酵素は、cDNA分子を対応 するmRNA分子から産生する酵素である。これは重要である。なぜなら、PCRは、 核酸分子、特にDNAを増幅し、そしてこのDNAは、宿主由来のサンプルから単離さ れたmRNAから産生され得るからである。 RT-PCR診断アッセイの特定の例は、宿主の組織からサンプルを除去することを 含む。このようなサンプルは、乳房以外の組織、例えば、血液に由来する。従っ て、このような診断的アッセイの一例は、有核細胞の全血勾配単離、全RNA抽出 、全RNAのRT-PCR、およびPCR産物のアガロースゲル電気泳動を含む。PCR産物は 、本発明の一つ以上の乳房特異的遺伝子またはそのフラグメントから転写された RNAに相補的なcDNAを含む。より詳細には、血液サンプルが入手され、そしてそ の全血が、等容量のリン酸緩衝化生理食塩水と混合され、遠心分離され、そして リンパ球および顆粒球の層が注意深く吸引され、そしてリン酸緩衝化生理食塩水 中に再希釈され、そして再び遠心分離される。上清は捨てられ、そして有核細胞 を含むペレットが、製造者(Tel-Test Inc.，Friendswood，TX)によって記載され るようにRNazole Ｂ法を用いてRNA抽出に使用される。 本発明のDNA配列に高い特異性を有するオリゴヌクレオチドプライマーおよび プローブが、調製される。プローブは、少なくとも10塩基対長、好ましくは少な くとも30塩基対長、そして最も好ましくは少なくとも50塩基対長またはそれより 長い。逆転写酵素反応およびPCR増幅は、間断なしに連続的に行われる。Taqポリ メラーゼは、PCRの間使用され、そしてPCR産物は濃縮され、そして全サンプルが エチジウムブロマイドを含むTris-ホウ酸-EDTAアガロースゲルで流される。 本発明の別の局面によれば、乳房以外の組織由来の生物学的サンプル中での本 発明の乳房特異的ポリペプチドの変化したレベルを測定することにより、乳房の 障害、例えば、乳ガンを、診断する方法が提供される。本発明の乳房特異的ポリ ペプチドの上昇したレベルは、対応する乳房特異的遺伝子産物の活性な転写およ び発現を示す。宿主由来のサンプル中で乳房特異的遺伝子ポリペプチドのレベル を検出するために用いられるアッセイは、当業者に周知であり、そしてそれらは ラジオイムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、ELISA アッセイ、および「サンドイッチ」アッセイを含む。生物学的サンプルには、組 織抽出物、細胞サンプルまたは生物の体液が含まれ得るがこれらに限定されない 。しかし、本発明によれば、生物学的サンプルは特に、乳房の組織または細胞を 含まない。 ELISAアッセイ(Coliganら、Current Protocols in Immunology，1(2)，第６章 、1991)は、最初に本発明の乳房特異的ポリペプチドに特異的な抗体、好ましく はモノクローナル抗体を調製することを含む。さらに、レポーター抗体はモノク ローナル抗体に対して調製される。レポーター抗体には、放射能、蛍光、または 本実施例においては西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬が 付加される。サンプルは、宿主から除去され、そしてサンプル中のタンパク質に 結合する固体支持体（例えば、ポリスチレンディッシュ）上でインキュベートさ れる。次いで、このディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、BSAの ような非特異的タンパク質と共にインキュベートすることによって被覆される。 次いで、モノクローナル抗体は、ディッシュ中でインキュベートされ、その時間 の間モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに結合した乳房特異的ポリ ペプチドに結合する。全ての未結合のモノクローナル抗体は、緩衝液で洗浄除去 される。このとき、西洋ワサビペルオキシターゼに連結したレポーター抗体は、 ディッシュ中に置かれ、その結果、このレポーター抗体は、乳房特異的遺伝子ポ リペプチドに結合した任意のモノクローナル抗体へ結合する。次いで、未結合の レポーター抗体は、洗浄除去される。次いで、ペルオキシダーゼ基質が、ディッ シュに添加され、そして所定の時間内の発色量が、標準曲線に対して比較された 場合の患者のサンプルの所定の容量中に存在する乳房特異的ポリペプチドの測定 量である。 競合アッセイが、乳房特異的ポリペプチドに特異的な抗体が固体支持体に結合 している場合に使用され得る。次いで、乳房特異的ポリペプチドは標識され、そ して宿主由来の標識されたポリペプチドサンプルは固体支持体上を通され、そし て、例えば、液体シンチレーションクロマトグラフィーによって検出された標識 の量が、サンプル中の乳房特異的ポリペプチドの量に相関され得る。 「サンドイッチ」アッセイは、ELISAアッセイに類似する。「サンドイッチ」 アッセイにおいて、乳房特異的ポリペプチドは、固体支持体上を通され、そして 固体支持体に結合した抗体に結合する。次いで、二次抗体が、乳房特異的ポリペ プチドに結合する。次いで、標識されかつ二次抗体に特異的な三次抗体が、その 固体支持体を通され、そして二次抗体に結合し、次いでその量が定量化され得る 。 別の方法においては、標識された乳房特異的ポリペプチドに対する抗体が使用 される。１段階アッセイにおいては、標的分子は、存在すれば、固定化されそし て標識抗体と共にインキュベートされる。標識された抗体は、固定化された標的 分子に結合する。未結合の分子を除去するために洗浄した後、サンプルを標識の 存在についてアッセイする。２段階アッセイにおいては、固体化された標的分子 は、未標識の抗体と共にインキュベートされる。標識分子-標識抗体複合体は、 存在すれば、次いで未標識の抗体に特異的な標識された二次抗体に結合する。そ のサンプルを洗浄し、そして標識の存在についてアッセイする。 乳房特異的遺伝子タンパク質に特異的なこのような抗体、例えば、抗イディオ タイプの抗体は、上記のように標識され、そして乳ガン細胞に堅固に結合し、従 ってその存在を検出することによって、乳ガン細胞を検出するために使用され得 る。 これらの抗体はまた、例えば、乳ガン細胞に接触したときに、それらを破壊す るホーミング相互作用試薬の方法において、乳ガン細胞を標的化するために使用 し得る。これは事実である。なぜなら、この抗体は、主に乳ガンおいて発現され る乳ガン特異的遺伝子に特異的であり、そして相互作用試薬の抗体への結合が、 相互作用試薬の乳房への直接的な運搬を引き起こすためである。 このタイプの抗体はまた、例えば、乳房の走査を容易にするために抗体を標識 することによって、インビボ画像診断を行うために使用され得る。画像診断のた めの１つの方法は、画像診断されるべき任意の乳房のガン細胞を、検出可能なマ ーカーで標識された抗乳房特異的遺伝子タンパク質抗体と接触させることを含む 。この方法は、標識された抗体が乳房特異的遺伝子タンパク質に結合するような 条件下で行われる。特定の例において、抗体は乳房（例えば、乳ガン細胞）およ びフルオレセインとこのような接触のときに相互作用し、その結果画像診断およ び乳房の視感度が増幅され、乳房の疾患のまたは非疾患の状態の決定を可能にす る。 抗体を標識するのに使用されるマーカーの選択は、適用に依存して変化する。 しかし、マーカーの選択は、当業者にとって容易に決定可能である。これらの標 識された抗体は、免疫アッセイならびに組織学的な適用において、そのタンパク 質の存在を検出するために使用され得る。標識された抗体は、ポリクローナルま たはモノクローナルであり得る。 mRNA、cDNAまたは発現産物の変化したレベルの存在による、乳房以外の細胞中 での通常見出される転写よりも活性な乳房特異的遺伝子の転写の存在は、転移し た乳ガンの存在の重要な指標である。なぜなら、乳ガン細胞が乳房から一般の循 環中に移動しているからである。従って、この現象は重要な臨床的意味を有する 。なぜなら、局在した腫瘍の処置方法は、転移したものの処置とは対照的に、完 全に異なるからである。 開示される20個の乳房特異的遺伝子のうち、乳房特異的遺伝子１のみが全長遺 伝子である。乳房特異的遺伝子１は、ヒトアルツハイマー病アミロイド遺伝子に 79％同一であり、そして83％類似である。乳房特異的遺伝子２は、ヒトヒドロキ シインドール-o-メチルトランスフェラーゼ遺伝子に30％同一であり、そして48 ％類似である。乳房特異的遺伝子３は、ヒトO-6-メチルグアニン-DNAメチルトラ ンスフェラーゼ遺伝子に58％同一であり、そして62％類似である。乳房特異的遺 伝子４は、マウスp120遺伝子に34％同一であり、そして65％類似である。乳房特 異的遺伝子５は、ヒトp70リボソームS6キナーゼα-II遺伝子に78％同一であり、 そして89％類似である。乳房特異的遺伝子６は、ヒト転写因子NFATp遺伝子に7 7％同一、そして79％類似である。 前述のように、本発明の乳房特異的遺伝子は、乳ガン形成の診断、および乳ガ ン転移の診断における推定分子マーカーである。以下の表１に示すように、乳房 特異的遺伝子の存在が、正常乳房、乳ガン、胎児および他のガンライブラリーに おいて試験されたときに、本発明の乳房特異的遺伝子が、乳ガンライブラリーに おいて最も流行性であることが見出された。これは、本発明の遺伝子が、先に考 察したように、乳ガンを検出するために使用され得ることを示す。表はまた、既 知の遺伝子に対するBSG1からBSG6の相同性に基づいた推定の同定を示す。 上記のアッセイはまた、化学療法前に保存された骨髄が、乳ガン細胞の微小転 移によって汚染されているかどうかを試験するために用いられ得る。このアッセ イにおいて、骨髄由来の血液細胞が単離され、そして上記のように処置され、こ の方法は、保存された骨髄が、化学療法の後に未だ移植に適するかどうかを決定 することを可能にする。 本発明はさらに、成熟ポリペプチド（例えば、BSG1ポリペプチド）、ならびに そのようなポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体に関する。 用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、本発明の遺伝子 にコードされるポリペプチドをいう場合は、このようなポリペプチドと本質的に 同じ生物学的な機能または活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、ア ナログは、活性化成熟ポリペプチドを産生するためのプロタンパク質部分の切断 により活性化され得るプロタンパク質を含む。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または 合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 本発明の遺伝子によりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、ま たはアナログは、(i)その中の１以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的ア ミノ酸残基(好ましくは保存的アミノ酸残基)で置換され、そしてそのような置換 されるアミノ酸残基がこの遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であり得 るかあり得ないもの、または(ii)その中の１以上のアミノ酸残基が置換基を含む もの、または(iii)その中のポリペプチドがそのポリペプチドの半減期を増加さ せる化合物(例えば、ポリエチレングリコール)のような別の化合物に融合されて いるもの、または(iv)その中のさらなるアミノ酸がポリペプチド（例えば、リー ダー配列もしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に用いられる配列、 またはプロタンパク質配列であり得る）に融合されているものであり得る。その ようなフラグメント、誘導体、およびアナログは、本明細書中の教示から、当業 者の範囲内にあると考えられる。 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態 で提供され、そして好ましくは均一に精製される。 用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合 は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動 物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離され ていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離されて いる同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。このような ポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌ クレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、かつそのようなベク ターまたは組成物がその天然の環境の一部ではない点で、なお単離されている状 態であり得る。 本発明のポリペプチドは、図１（配列番号１）のポリペプチド（特に成熟ポリ ペプチド）ならびに少なくとも70％の類似性（好ましくは70％の同一性）を図１ （配列番号１）のポリペプチドに対して有し、そしてより好ましくは少なくとも 90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）を図８および図９（配 列番号８および９）のポリペプチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少 なくとも95％の類似性（なおより好ましくは95％の同一性）を図１（配列番号１ ）のポリペプチドに対して有するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なく とも30アミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むこのようなポ リペプチドの部分を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。 当業者に公知なように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペ プチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換を第２のポリペプチドの配 列と比較することにより決定される。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により対応 する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメン トは全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポ リヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを 合成するために使用され得る。 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプ チドの産生に関する。 宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまた は発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、ま たは形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば 、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主 細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、または乳房特 異的遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され 得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞 で以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するため に用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現す るための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクター は、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列（例えば、SV40の誘 導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド； プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA( 例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病)）を 含む。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意の ベクターも使用され得る。 適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配 列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数ま たは複数）に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内で あると考えられる。 発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの合成を指示する適切な発現制御配列（単 数または複数）（プロモーター）に作動可能に連結される。このようなプロモー ターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター 、E.coli lacまたはtrp、λファージPLプロモーター、および原核生物細胞また は真核生物細胞あるいはそれらのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知 られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソー ム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅 するための適切な配列を含有し得る。 さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のため の表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼま たはネオマイシン耐性、あるいは例えばE.coliにおけるテトラサイクリン耐性ま たはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。 本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列また は制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質 を発現させるために用いられ得る。 適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）； 昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9）；動物細胞（例えば 、CHO、COSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主 の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。 より詳細には、本発明はまた、先に広範に記載した１つ以上の配列を含む組換 え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたは ウイルスベクター）を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向また は逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさ らに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを含む）を 含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり 、そして市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE7 0、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK 、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、p KK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1 、pS G(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意のプ ラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能で ある限り、使用され得る。 プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子 から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびpCM7である。特に よく知られた細菌性プロモーターとして、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λPR、PL およびtrpが挙げられる。真核生物プロモーターとしては、CMV即時型、HSVチミ ジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマ ウスメタロチオネインIが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選 択は、十分に当業者のレベル内である。 さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。 宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細 胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例え ば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムト ランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエ レクトロポレーションにより実施され得る(Davis,L.，Dibner,M.，Battey,I.，B asic Methods in Molecular Biology,(1986))。 宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法で、組換え配列によりコードされる 遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド 合成機により合成的に産生され得る。 タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモ ーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物に由 来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。 原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクターおよ び発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 ２版，Cold Spring Harbor,N.Y.，(1989)（この開示は、本明細書中に参考とし て援用される）に記載されている。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ ーにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAの シス作動性エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモータ ーに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のbp100〜270の後期側 のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、 複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサ ーが挙げられる。 一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点お よび選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae のTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来 のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ解糖酵素（例えば 、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ、また は熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、 翻訳開始配列および翻訳終止配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、 異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化 された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る 。 細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み 枠で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパク質 をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つ 以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望される 場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のための 適切な原核生物宿主として、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimur ium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種 々の種が挙げられるが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。 代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、 周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含む市販 のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含み得る。この ような市販のベクターとしては、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals ，Uppsala，Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)が挙げられ る。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき 構造配列と組み合わされる。 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、 選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導） により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。 細胞は、代表的には遠心分離により回収され、物理的手段または化学的手段に より破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音 波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法によ り破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。 種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用い られ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載のサ ル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株 （例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物発 現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任 意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位お よびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５’フランキング非転 写配列をまた含む。SV40スプライス部位に由来するDNA配列、およびポリアデニ ル化部位は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために使用され得る。 乳房特異的遺伝子ポリペプチドは、以下を含む方法により組換え細胞培養物か ら回収され、そして精製され得る：硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰 イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラ フィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ ー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラ フィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refolding）工程が、成熟 タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマ トグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。 本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマー カー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列の一 例は、ベクター、好ましくはpQE-9ベクターによって供給され得るヘキサヒスチ ジンタグであり、これは細菌の宿主の場合、マーカーに融合したポリペプチドの 精製を提供し、または哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が用いられる場合に は、例えば、マーカー配列は赤血球凝集素(HA)タグであり得る。HAタグは、イン フルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する(Wilson，I.ら 、Cell，37:767(1984))。 本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物 であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の 細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生 され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチド は、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化されないかもしれない。本発 明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。 BSG1、および他の乳房特異的遺伝子、ならびにそのタンパク質産物は、乳ガン の早期検出のために利用され得る。なぜなら、これらは乳ガン状態において過剰 発現されるからである。 本発明の別の局面によれば、本発明の乳房特異的遺伝子または乳房特異的タン パク質の作用を阻害する治療薬をスクリーニングするために使用され得るアッセ イが提供される。本発明は、その生物学的作用を阻止するのに十分な親和性を有 して乳房特異的遺伝子タンパク質と複合体を形成する治療薬を選択する方法を開 示する。この方法には、タンパク質が支持体に固定化され、天然の基質および標 識された治療薬と同時または連続的な順序のいずれかで接触され、タンパク質の その基質への結合を阻止するのに十分な様式で治療有効的に天然の基質と競合す るかどうかを決定する競合アッセイを含む種々のアッセイが含まれる。 別の実施態様において、基質は支持体に固定化され、そして標識された乳房特 異的ポリペプチドおよび治療薬（または未標識のタンパク質および標識された治 療薬）の両方に接触され、そして基質に結合した乳房特異的ポリペプチドの量が 、治療薬が添加されていないアッセイに比較して減少しているかどうかが決定さ れる。乳房特異的ポリペプチドは、抗体で標識され得る。 潜在的な治療化合物には、上記のように抗体および抗イディオタイプ抗体が含 まれ、またはいくつかの場合にはポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドが 含まれる。 別の例は、アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンス構築物であり 、これは、転写を阻止するために乳房特異的ポリヌクレオチドに指向される。ア ンチセンス技術は、三重らせん形成もしくはアンチセンスDNAまたはRNAを介して 遺伝子発現を制御するために用いられ得、これらの方法の両方は、ポリヌクレオ チドがDNAまたはRNAに結合することに基づいている。例えば、本発明の成熟ポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分は、長さが約10〜40 塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNA オリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計 され（三重らせん−Leeら、Nucl．Acids Res.，6:3073(1979); Cooneyら、Scien ce，241:456(1988);およびDervanら、Science，251: 1360(1991)を参照のこと） 、それにより、転写および乳房特異的ポリヌクレオチドの産生を阻害する。アン チセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてm RNA分子の乳房特異的遺伝子ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセン ス−Okano、J．Neurochem.，56:560(1991)；遺伝子発現のアンチセンス阻害剤と してのオリゴデオキシヌクレオチド，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)）。上 記のオリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、それによって、アンチセン スRNAまたはDNAが、乳房特異的ポリペプチドの産生を阻害するためにインビボで 発現され得る。 別の例は、乳房特異的ポリペプチドに結合し、そしてその活性部位を占有し、 そうすることによって正常な生物学的活性が妨げられるように活性部位を基質へ 接近不可能にする小分子である。小分子の例としては、小ペプチドまたはペプチ ド様分子が挙げられるが、これらに限定されない。 これらの化合物は、乳ガンを処置するために使用し得る。なぜなら、これらは 、乳ガン細胞の生存に必要な天然の機能を阻害するのに十分な様式で乳房特異的 ポリペプチドの機能と相互作用するからである。これは事実である。なぜなら、 BSGおよびそれらのタンパク質産物は、おもに乳ガン組織で発現され、従って、 この状態の形成に決定的であると推定されからである。 化合物は、例えば、本明細書中以下で記載されるように、薬学的に受容可能な キャリアを有する組成物中で使用され得る。 本発明の化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。この ような組成物は、治療的有効量のポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャ リアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生 理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組 み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の様式に合わせ るべきである。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上 の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器（単数また は複数）に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制す る政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、ヒトへの 投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに 、薬学的組成物は、他の治療化合物と併用して用いられ得る。 薬学的組成物は、例えば、経口、局所、静脈内、腹膜腔内、筋肉内、皮下、鼻 腔内、肛門内または皮内経路による便利な様式で投与され得る。薬学的組成物は 、特定の症状の処置および／または予防に有効な量で投与される。一般に、薬学 的組成物は少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それ らは１日に約８mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、 １日に約10μg/kg体重から約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮さ れる。 乳房特異的遺伝子および化合物（これらはポリペプチドである）はまた、本発 明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。 これはしばしば「遺伝子治療」といわれる。 従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞 はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該 分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを 含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作 され得る。 同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分 野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発 明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するた めの産生細胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプ チドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペ プチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業 者には明らかである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウ イルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達 ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。 本明細書中上記のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイ ルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫 ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイ ルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、 骨髄増殖性肉腫ウイルス、および哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられるが、これら に限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクター は、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。 ベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモータ ーとしては、Millerら、Biotechniques、第７巻、第９号、980-990(1989)に記載 のレトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス(CM V)プロモーター、または他の任意のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモ ーター（ヒストン、pol III、およびβ-アクチンプロモーターを含むが、これら に限定されない））が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他の ウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナー ゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、 これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教 示から当業者に明らかである。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下 にある。使用され得る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモータ ー（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター （例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター）；RSウイルス(RSV)プロモ ーター；誘導性プロモーター（例えば、MMTプロモーター、メタロチオネインプ ロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロ モーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター （例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスLTR （本明細書先に記載の改変レトロウイルスLTRを含む）；βアクチンプロモータ ー；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されな い。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプ ロモーターであり得る。 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株に形質導入し、 産生細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージ ング細胞の例としては、Miller、Human Gene Therapy、第１巻、５-14頁(1990) （その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のPE501、PA317、ψ-2 、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E-86、GP+envAm12 、およびDAN細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該 分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質導入し得る。このよう な手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO4沈 澱が挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替として、レトロウイルス プラスミドベクターは、リポソームにカプセル化され得るか、または脂質に結合 され得、次いで宿主に投与され得る。 産生細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を含む 感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このようなレトロウイ ルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を 形質導入するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチ ドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核 生物細胞としては、胚芽幹細胞、胚芽肉腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線 維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げ られるが、これらに限定されない。 本発明はまた、本発明の乳房特異的遺伝子の診断薬としての使用に関する。例 えば、いくつかの疾患は、遺伝された欠損遺伝子が原因である。例えば、乳房特 異的遺伝子、CSG7およびCSG10は、正常細胞中の発現と比較して乳ガン細胞中で 減少した発現を有することが見出されている。さらに、残りの本発明の乳房特異 的遺伝子は、乳ガンにおいて過剰発現される。従って、これらの遺伝子における 変異は、乳房の障害（例えば、乳ガン）の検出を可能にする。DNAレベルでの本 発明の乳房特異的遺伝子における変異は、種々の技術によって検出され得る。診 断に用いられる核酸（ゲノムDNA、mRNAなど）は、血液、尿、唾液、組織生検、 および剖検材料のような、乳房以外の患者の細胞から得られ得る。ゲノムDNAは 、直接検出に用いられ得、またはPCR(Saikiら、Nature，324:163-166(1986))を 用いて分析前に酵素的に増幅され得る。RNAまたはcDNAはまた、同じ目的のため に用いられ得る。一例として、本発明の核酸に相補的であるPCRプライマーは、 本発明の乳房特異的ポリヌクレオチドにおける変異を同定および分析するために 用いられ得る。例えば、欠失および挿入は、増幅された産物の正常遺伝子型に比 較した場合のサイズの変化によって検出され得る。点変異は、増幅されたDNAを 放射能標識された乳房特異的RNAまたは放射能標識されたアンチセンスDNA配列に ハイブリダイズすることにより同定され得る PCR増幅後のDNAの特定のセグメントの変異をスクリーニングするための別の良 く確立された方法は、一本鎖立体配座多型性(SSCP)分析である。PCR産物は、32P -dCTPを組込むための10サイクルの再増幅によってSSCPのために調製され、200〜 300bpのフラグメントを生成するために適切な制限酵素で消化され、そして85℃ に５分間加熱することにより変性され、次いで氷に浸される。次いで、非変性ゲ ル（５％グリセロール、５％アクリルアミド）において電気泳動が行われる(Gla vac，D.およびDean，M.，Human Mutation，2:404-414(1993))。 参照の遺伝子と「変異体」の間の配列の相違は、直接的DNA配列決定法により 明らかにされ得る。さらに、クローン化DNAセグメントは、特定のDNAセグメント を検出するためのプローブとして用いられ得る。この方法の感受性は、PCRと組 み合わされたときに大きく増幅される。例えば、配列決定プライマーは、改変さ れたPCRによって生成された二本鎖PCR産物または一本鎖鋳型分子と共に使用され る。配列決定は、放射能標識されたヌクレオチドを用いる従来の手順により、ま たは蛍光タグを用いる自動配列決定手順により行われる。 DNA配列の差異に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲル におけるDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化の検出により達成され 得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって視覚化され 得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて区 別され得る。ここでゲル中の異なるDNAフラグメントの移動度は、それらの特異 的融解温度または部分的融解温度に従って異なる位置にゲル内で遅延される(例 えば、Myersら、Science，230:1242(1985)を参照のこと)。さらに、配列の変化 （特定の小さな欠失における）は、DNAの移動度のパターンにおける変化として 検出される。 特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNas e保護およびS1保護または化学的切断法（例えば、Cottonら、PNAS 、USA、85:439 7-4401(1985)））により明らかにされ得る。 従って、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学 的切断、直接的なDNA配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多 型(RFLP)）およびサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。 本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染 色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得 る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、染色 体位置の標識化に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標 識化試薬はほとんどない。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これら の配列と疾患に関連する遺伝子との相関付けにおける重要な第１工程である。 簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を 調製することにより染色体にマップされ得る。3'非翻訳領域のコンピューター解 析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセス を複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらの プライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニン グに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増 幅フラグメントを生じる。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当て るための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを本発明と共に 使用して、特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは類似の様式の大きな ゲノムクローンのプールを用いて、部分的局在性の決定(sublocalization)が達 成され得る。染色体にマップするために同様に使用され得る他のマッピングスト ラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した(flo w-sorted)染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブ ラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼー ション(FISH)は、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。こ の技術は、50または60塩基という短いcDNAを用いて使用され得る。この技術の総 説については、Vermaら，Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques， Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。 一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な 位置を遺伝子地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．M cKusick，Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Med ical Libraryからオンラインで入手可能である)において見出される。次いで、 同じ染色体領域にマップされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的 に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNA配列またはゲノム配列における差異 を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、 いずれの正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるよ うである。 物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、疾患 に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的 原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度、お よび20kbあたり１遺伝子と仮定する）。 このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナ ログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるため の免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、 またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、 およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産 物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメ ントの産生のために使用され得る。 本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポ リペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られ 得る。この動物は、好ましくは非ヒトである。次いで、このようにして得られた 抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドのフラグ メントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体 を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチド を発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。 モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体 を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle rおよびMilstein，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞 ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today 4: 72)、およびヒトモ ノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げら れる。 単鎖抗体を産生するために記載された技術(米国特許第4,946,778号)を、本発 明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る 。トランスジェニックマウスはまた、抗体を生成するために使用され得る。 抗体はまた、例えば、乳ガン細胞に接触したときにそれらを破壊するホーミン グ相互作用試薬の方法において、乳ガン細胞を標的化するために使用され得る。 これは事実である。なぜなら、抗体は、本発明の乳房特異的ポリペプチドに特異 的であるからである。相互作用試薬の抗体への結合は、相互作用試薬を乳房に直 接運ばせる。 このタイプの抗体はまた、例えば、骨盤領域および乳房の走査を容易にするた めに抗体を標識することによって、インビボ画像診断を行うために使用され得る 。 画像診断のための１つの方法は、画像診断されるべき乳房の任意のガン細胞と、 検出可能なマーカーで標識した抗乳房特異的タンパク質抗体を接触させる工程を 包含する。この方法は、標識された抗体が乳房特異的ポリペプチドに結合するよ うな条件下で行われる。特定の例において、抗体は、乳房（例えば、乳ガン細胞 ）と相互作用し、そして接触するときに蛍光を発し、その結果、乳房の画像診断 および視感度が増幅されて、乳房の疾患状態または非疾患状態の決定を可能にす る。 本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのよ うな実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部分または量 は、他に明記しない限り重量基準である。 以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／ま たは用語が記載される。 「プラスミド」は、先行する小文字のｐおよび／またはそれに続く大文字およ び／または数字を示すことにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、 市販されており、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従 って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと 等価のプラスミドが当該分野において公知であり、そして当業者には明らかであ る。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触 媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市 販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者 に公知のものが使用された。分析目的のためには、典型的には１μgのプラスミ ドまたはDNAフラグメントが、約２単位の酵素と共に約20μlの緩衝溶液中で使用 される。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のためには、 代表的には５〜50μgのDNAが、20〜250単位の酵素を用いてより大きな容量中で 消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者によ り特定される。37℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、 これは供給者の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミ ドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。 切断フラグメントのサイズ分離は、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Lab oratory Manual］Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の１％TAEアガ ロースゲルを使用して行われる。 「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相 補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成さ れ得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず、従ってキナ ーゼの存在下でATPと共にリン酸を添加しなければ、別のオリゴヌクレオチドと 連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメント に連結する。 「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形 成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供しなければ、連 結は公知の緩衝液および条件を使用して、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフ ラグメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成 され得る。 他に記載しない限り、Graham,F.およびVan der Eb，A.，Virology，52:456-45 7(1973)の方法に記載されるように、形質転換を実施した。 実施例１ 乳房特異的遺伝子の転写の測定 乳房特異的遺伝子RNAの活性な転写が存在するかしないかを評価するために、 約６mlの静脈血を、ヘパリン処理されたチューブを用いる標準的な静脈穿刺技術 を用いて得る。全血を等容量のリン酸緩衝化生理食塩水と混合し、次いでこれを 15-mlのポリスチレンチューブ中で８mlのFicoll(Pharmacia，Uppsala，Sweden) に上層する。この勾配を、５℃で1800×ｇで20分間遠心分離する。リンパ球およ び顆粒球の層（約５ml）を注意深く吸引し、そして50mlチューブ中で50mlまでリ ン酸緩衝化生理食塩水中で再希釈し、そして５℃で1800×ｇで20分間再び遠心分 離する。上清を捨て、そして有核細胞を含むペレットを、製造者により記載され るようにRNazole Ｂ法を用いるRNA抽出のために用いる(Tel-Test Inc.，Friends wood，TX)。 目的の遺伝子からのmRNAの量を測定するために、コード部分が図１〜20（配列 番号１〜20）のDNA配列を含むヒト遺伝子から転写されたmRNA配列の少なくとも 一部に同一性を有するようにプローブを設計する。このプローブを抽出されたRN Aと混合し、そしてこの混合されたDNAおよびRNAをエタノールで（-70℃で15分間 ）沈澱させる。このペレットをハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁し、そ して溶解する。この混合物を含むチューブを、DNAを変性させるために72℃の水 浴中で10〜15分間インキュベートする。このチューブを、所望のハイブリダイゼ ーション温度において迅速に水浴中に移す。ハイブリダイゼーション温度は、DN A中のＧ＋Ｃの含有量に依存する。ハイブリダイゼーションは、３時間行われる 。0.3mlのヌクレアーゼ-S1緩衝液を添加し、そして十分に混合する。50μlの4.0 Ｍ酢酸アンモニウムおよび0.1Ｍ EDTAを添加し反応を停止させる。この混合物を フェノール/クロロホルムで抽出し、そして20μgのキャリアtRNAを添加し、そし て等容量のイソプロパノールで沈澱させる。沈殿物を40μlのTE(pH 7.4)中に溶 解し、そしてアルカリアガロースゲルにかける。電気泳動後、RNAを微量配列決 定してヌクレオチド配列を確認する。(より詳細な概説については、Favaloro，J .ら、Mothods Enzymol.，65:718(1980)を参照のこと)。 ２つのオリゴヌクレオチドプライマーを上記の方法で単離した配列を増幅する ために使用する。5'プライマーは20ヌクレオチド長であり、そして3'プライマー は単離されたmRNAの3'末端に相補的な配列である。プライマーを、単離されたmR NAに従いカスタム設計する。逆転写反応およびPCR増幅を、Perkin Elmer 9600 P CRマシン(Emeryville，CA)において、間断なしに連続的に行う。20μlジエチル ピロカーボネート処理水中の400ngの全RNAを、65℃の水浴中に５分間置き、次い でPCR試薬の添加のすぐ前に迅速に氷上で冷却する。50-μlの全PCR容量は、2.5 単位Taqポリメラーゼ(Perkin-Elmer)、２単位のニワトリ骨髄芽球症ウイルス逆 転写酵素(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN); 200 μMの各dCTP，dATP， dGTPおよびdTTP(Perkin Elmer); 18 pMの各プライマー，10 mM Tris-HCl; 50 mM KCl;および2 mM MgCl2(Perkin Elmer)からなる。PCR条件は、以下の通りである ：サイクル１は42℃で15分間、次いで97℃で15秒間（１サイクル）；サイクル２ は95℃で１分間、60℃で１分間、そして72℃で30秒間（15サイクル）；サイク ル３は、95℃で１分間、60℃で１分間、そして72℃で１分間（10サイクル）；サ イクル４は、95℃で１分間、60℃で１分間、そして72℃で２分間（８サイクル） ；サイクル５は、72℃で15分間（１サイクル）；および最終サイクルは、サンプ ルが、マシンから取り出されるまで４℃で保持する。50-μlのPCR産物を、真空 遠心分離で10μlまで濃縮し、そして次にサンプルを、エチジウムブロマイドを 含む薄い1.2％ Tris-borate-EDTAアガロースゲルで流す。予想される大きさのバ ンドは、この遺伝子がアッセイされた組織中に存在することを示す。ペレット中 のRNAの量は、多数の方法で定量され得る。例えば、重量を量り得る。 PCR産物のヌクレオチド配列の確認を、微量配列決定によって行う。PCR産物を 、Qiagen PCR Product Purification Kit(Qiagen，Chatsworth，CA)を用いて、 製造者により記載されるように精製する。１μgのPCR産物を、Tag DyeDeoxy Ter minator Cycle 配列決定キットを用いて、Perkin-Elmer 9600 PCRマシンにおい て、Applied Biosystems(Foster，CA)により記載されるように、PCR配列決定に 供する。配列決定産物を、Centri-Sepカラム(Princeton Separations，Adelphia ，NJ)を用いて、この会社により記載されるように精製する。次いで、この産物 を、Macintosh IIciコンピューターの組み込まれたABIモデル373A DNA配列決定 システム（Applied Biosystems）を用いて分析する。 実施例２ BSG タンパク質の細菌発現および精製ならびにモノクローナル抗体調製のための 使用 本発明のポリペプチドをコードするDNA配列（本実施例においてはBSG1(ATCC受 託番号第97175号)）を、タンパク質の5'配列およびタンパク質に対するベクター 配列3'に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、最初に増幅を行 った。DNA配列に対応するさらなるヌクレオチドを、5'および3'配列それぞれに 付加する。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列5'GCCACCATGGATGTTTTCAAG3 '(配列番号21)を有し、そしてNcoI制限酵素部位、続いてプロセスされたタンパ ク質の最初のアミノ酸から開始する15ヌクレオチドのコード配列を含み得る。3' 配列5’GCGCAGATCTGTCTCCCCCACTCTGGGC 3'（配列番号22）は、BglII制限酵素部 位 に相補的な配列を含み、そしてまた続いてそのタンパク質をコードする18ヌクレ オチドの核酸配列を含む。制限酵素部位は、細菌発現ベクター、pQE-60（Qiagen ，Inc．Chatsworth，CA）の制限酵素部位に対応する。pQE-60は、抗生物質耐性 （Ampr）、細菌の複製起点（ori）、IPTG制御可能プロモーターオペレーター（P /O）、リボソーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部位をコードす る。次いで、pQE-60を、NcoIおよびBglIIで消化する。増殖配列をpQE-60に連結 し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列に関してインフレームに 挿入する。次いで、連結混合物を用いて、E ．coli株 M15/rep4(Qiagen)をSambro ok，J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)に記載の手順により形質転換する。M15/rep4は、プラスミドpREP 4の多数のコピーを含み、これは、lacIリプレッサーを発現し、そしてカナマイ シン耐性（Kanr）も付与する。形質転換体をLBプレート上で増殖するそれらの能 力により同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。 プラスミドDNAを単離し、そして制限酵素分析により確認する。 所望の構築物を含むクローンを、Amp（100μg/ml）とKan（25μg/ml）との両 方を補充したLB培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させる。O/N培養物を用 いて1:100〜1:250の比で大きな培養物に接種する。細胞を、600の光学密度（O.D .600）が0.4と0.6との間になるまで増殖させた。次いで、IPTG（「イソプロピル -B-D-チオガラクトピラノシド」）を加えて１mMの最終濃度にする。IPTGはlacI リプレッサーを不活性化することにより、遺伝子発現を増加させるためのp/Oの 解放を誘導する。細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離 により回収する。細胞ペレットをカオトロピック剤である６MグアニジンHClで可 溶化する。澄明後、可溶化されたタンパク質を、6-Hisタグを含むタンパク質に より堅く結合させる条件下でニッケルキレートカラムでのクロマトグラフィーに よりこの溶液から精製する（Hochuli，E.ら、J．Chromatography 411:177-184(1 984)）。BGS1タンパク質(>90％純粋)を、６MグアニジンHCl pH 5.0でカラムから 溶出し、そして再生の目的のために、３MグアニジンHCl、100mMリン酸ナトリウ ム、10mMグルタチオン（還元型）、および２mMグルタチオン（酸化型）に調整す る。この溶液中で12時間インキュベーションした後、タンパク質を10mMリン酸ナ トリウムに対して透析する。 このように精製されたタンパク質は、このようなタンパク質に特異的なモノク ローナル抗体を産生するために、エピトープとして用い得る。単離されたタンパ ク質のポリペプチドに対して産生されたモノクローナル抗体は、動物にそのポリ ペプチドを直接注射することによって、または動物にそのポリペプチドを投与す ることによって得られ得る。次いで、このように得られた抗体は、そのタンパク 質自身に結合する。次いで、このような抗体は、そのタンパク質をそのポリペプ チドを発現する組織から、例えばELISAアッセイを用いて、単離するために、用 いられ得る。 実施例３ 乳房組織からのcDNAライブラリーの調製 全細胞性RNAを、グアニジニウムフェノール法により、以前の記載(P．Chomczy nskiおよびN．Sacchi，Anal．Biochem.，162: 156-159(1987))に従い、RNAzol(C inna-Biotecx)を用いて、組織から調製する。RNAのさらなるエタノール沈澱を含 める。ポリＡ mRNAを、オリゴdT-コートしたラテックスビーズ(Qiagen)を用いて 、全RNAから単離する。充分な量の全RNAが入手可能なときは、ポリＡ選択を二度 行い、非ポリアデニレート化物質からのより良い分離を確実にする。 オリゴdTで選択されたmRNAを、GobblerおよびHoffman(Gobbler，U.およびB.J ．Hoffman，1983，Gene，25:263)の方法の改変によるcDNA合成のために用いる。 第一鎖合成を、Moloneyマウス肉腫ウイルス逆転写酵素（Stratagene）またはSup erscript II(Moloneyマウス逆転写酵素を含まないRNase H，Gibco-BRL)のいずれ かを用いて行う。第一鎖合成を、Xho I制限酵素部位を含むプライマー/リンカー を用いて開始する。合成に用いられたヌクレオチド混合物は、cDNA配列内での制 限酵素消化を阻止するために、メチル化されたdCTPを含む。第二鎖合成のために 、E.coliポリメラーゼKlenowフラグメントを用い、そして[32P]-dATPを、ヌクレ オチド取り込みのトレーサーとして取り込ませる。 第二鎖合成に続いて、cDNAを、T4 DNAポリメラーゼまたはKlenowフラグメント のいずれかを用いて、平滑末端化する。Eco RIアダプターをcDNAに添加し、そし てcDNAをXho Iで制限酵素消化する。cDNAを、Sephacryl S-500カラム(Pharmacia )でサイズ分画し、過剰のリンカーおよび約500塩基対未満のcDNAを除去する。 cDNAを、一方向的に、pBluescript IIファージミドまたはλUni-zap XR(Strat agene)のいずれかのEco RI-Xho I部位へクローン化する。pBluescript IIへクロ ーニングする場合は、プラスミドを、E.coli SUREコンピテント細胞(Stratagene )へエレクトロポレーションする。cDNAをUni-Zap XRへクローニングするときは 、Gigipack IIパッケージング抽出物（Stratagene）を用いてパッケージングす る。パッケージングファージを用いてSURE細胞を感染し、増幅する。cDNA挿入物 を含むpBluescriptファージミドを、λZapファージから、ヘルパーファージExAs sist(Stratagene)を用いて切除する。回収したファージミドを、SOLR E.coli細 胞(Stratagene)上に播種する。配列決定する鋳型の調製 配列決定のための鋳型DNAを、１）沸騰法、または２）PCR増幅により調製する 。 沸騰法は、HolmesおよびQuigley(Holmes，D.S.およびM．Quigley，1981，Anal .Biochem.，114:193)の方法の改変である。Bluescript II，または回収されたBl uescriptファージミドにクローニングされたcDNAのいずれか由来のコロニーを濃 縮細菌培地で一晩増殖させる。400μlの細胞を、遠心分離し、そしてリゾチーム (80μg/ml)およびRNase Ａ(4μg/ml)を含むSTET(0.1M NaCl，10mM TRIS pH8.0， 1.0mM EDTAおよび５％ Triton X-100)中に再懸濁する。細胞を40秒間沸騰させ、 そして10分間遠心分離する。上澄みを取り出し、そしてDNAをPEG/NaClで沈澱さ せ、そして70％エタノール（２×）で洗浄する。鋳型を約250ng/μlで水に再懸 濁する。 PCRによる鋳型の調製は、Rosenthalら(Rosenthalら、Nucleic Acids Res.，19 93，21:173-174)の方法の改変である。pBluescript IIまたは回収されたpBluesc riptファージミドにクローニングされたcDNAを含むコロニーを、アンピシリンを 含むLB中で、96ウエルの組織培養プレートにおいて、一晩培養する。２μlのこ の培養物を、トリシン緩衝液システム（PonceおよびMicol.，Nucleic Acids Res .，1992，20:1992）および200μM dNTPを用いて、PCR反応における鋳型として用 いる(Saiki，RK,ら、Science，239:487-493，1988;およびSaiki，RK,ら、Sci ence，230:1350-1354，1985)。鋳型の増幅に選択されたプライマーセットは、鋳 型の配列決定のために選択されたプライマーセットの外側にある。用いられたプ ライマーは、5'-ATGCTTCCGGCTCGTATG-3'（配列番号23）（これはpBluescript中 でのM13逆配列の5'である）、および5'-GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'（配列番号24） （これはpBluescript中でのM13順プライマーの3'である）である。M13順および 逆配列に隣接する配列に対応する任意のプライマーを用い得る。Perkin-Elmer 9 600サーモサイクラーを用いて、以下のサイクラー条件で、鋳型を増幅する：５ 分間94℃で（１サイクル）；（20秒間94℃で）；20秒間55℃で（１分72℃で）（ 30サイクル）；７分間72℃で（１サイクル）。増幅に続いて、PCR鋳型を、PEG/N aClを用いて沈澱させ、そして70％エタノールで３回洗浄する。鋳型を、水中に 再懸濁する。 実施例４ 乳房組織からの選択されたクローンの単離 ２つのアプローチを用いて、ヒト乳房組織から調製されたcDNAライブラリーか らの特定のクローンを単離する。 初めに、クローンを、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、直接ライブラリ ーをスクリーニングすることにより単離する。特定のクローンを単離するために 、30-40ヌクレオチドを有する特定のオリゴヌクレオチドを、Applied Biosystem s DNA合成機を用いて、本出願に記載の部分配列の１つに従い合成する。そのオ リゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32P- -ATPで標識し 、そして標準プロトコル（Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manu al，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring，NY，1982）に従い精製する。λc DNAライブラリーを1.5％寒天プレートに、密度20,000-50,000pfu/150 mmプレー トまで播種する。これらのプレートを、Nylon膜を用いて、標準的なファージス クリーニングプロトコル（Stratagene，1993）に従いスクリーニングする。詳細 には、変性しそして固定化したファージDNAを有するNylon膜を、６×SSC、20mM NaH2PO4、0.4％ SDS、変性させた500μg/mlの５×Denhardt、超音波処理された サケの精子DNA、および６×SSC、0.1％ SDS中でプレハイブリダイズする。１時 間のプレハ イブリダイゼーションの後、膜をハイブリダイゼーション緩衝液(６×SSC、20mM NaH2PO4、0.4％ SDS、500μg/mlの変性させ、超音波処理したサケ精子DNA)を用 い、１×106cpm/ml 32P-プローブで42℃で一晩ハイブリダイズする。膜を、45〜 50℃で、洗浄緩衝液（６×SSC、0.1％ SDS）で20〜30分間洗浄し、乾燥しそし てKodak Ｘ線フィルムに一晩曝露する。陽性のクローンを単離し、そして二次、 三次のスクリーニングで精製する。本出願に記載された部分配列に対する同一性 を検証するために、精製されたクローンの配列決定をする。 ヒト乳房組織から調製されたcDNAライブラリーをスクリーンする別のアプロー チは、全部分配列に対応するDNAプローブを調製することである。プローブを調 製するために、報告された部分配列の両末端由来の17〜20ヌクレオチドの２つの オリゴヌクレオチドプライマーを、合成しそして精製する。これらの２つのオリ ゴヌクレオチドを使用して、そのcDNAライブラリー鋳型を用いて、プローブを増 幅する。DNA鋳型を、cDNAライブラリーのファージ溶菌液から、標準ファージDNA 調製プロトコル（Maniatisら）に従い調製する。ポリメラーゼ連鎖反応を、0.5 μgの上記のcDNA鋳型を用いて、25μlの反応混合物中で行う。反応混合物は、1. 5〜5mM MgCl2、0.01％(w/v)ゼラチン、20μMの各dATP、dCTP、dGTP、dTTP、25pm olの各プライマー、および0.25 UnitのTaqポリメラーゼである。35サイクルのPC R(94℃で１分間の変性；55℃で１分間のアニーリング;72℃で１分間の伸長)を、 Perkin-Elmer Cetus自動化サーマルサイクラーを用いて行う。増幅された産物を 、アガロースゲル電気泳動で分析し、そして予測される分子量を有するDNAバン ドを切除し、そして精製する。PCR産物を、DNA産物をサブクローニングし、そし て配列決定することにより、プローブであることを確認する。プローブをMultip rime DNA Labelling System(Amersham)で、比活性＜１×109dmp/μgにおいて標 識する。このプローブを用いて、Stratageneのプロトコルに従い、λcDNAライブ ラリーをスクリーニングする。ハイブリダイゼーションを、５×TEN 920XTEN(0. 3Ｍ Tris-HCl pH 8.0、0.02Ｍ EDTAおよび３Ｍ NaCl)、５×Denhartdt's、0.5％ ピロリン酸ナトリウム、0.1％ SDS、0.2 mg/mlの熱変性サケ精子DNA、および１ ×106cpm/mlの[32P]-標識されたプローブを用いて、55℃において12時間行う。 フィルターを、0.5X TEN中で室温において20〜30分間、次いで55℃において15分 間 洗浄する。フィルターを乾燥し、そして-70℃においてKodak XAR-5フィルムを用 いてオートラジオグラフする。陽性のクローンを、第二および第三のスクリーニ ングにより精製する。単離されたクローンの配列を、DNA配列決定により確認す る。 本明細書中に記載の部分配列から、完全な配列を得るための一般的な手順は、 以下のように要約される； 手順１ 部分配列クローン（部分配列を得るために配列決定されたcDNAクローン）から の選択されたヒトDNAを、例えば、Eco-RIを用いるエンドヌクレアーゼ消化、ゲ ル電気泳動、および低融点アガロースゲルからの除去によるクローンの単離によ って、精製する。単離された挿入DNAを、例えば、32P標識によって、好ましくは ニックトランスレーションまたはランダムプライマー標識によって、放射能標識 する。標識された挿入物をプローブとして用い、λファージcDNAライブラリーま たはプラスミドcDNAライブラリーをスクリーニングする。プローブcDNAに関連す るクローンを含むコロニーを、公知の精製法によって、同定および精製する。新 しく精製されたクローンの末端をヌクレオチド配列決定し、全長配列を同定する 。次いで、全長クローンの完全な配列決定を、Exonuclease III消化またはプラ イマーウォーキングによって行う。部分配列が得られた寄託されたクローンの少 なくとも一部をプローブとして用い、種々の組織由来のmRNAのノーザンブロット を、必要に応じて行い、全長cDNAとされているものに対するmRNAの大きさを調べ 得る。 以下の手順２および３を、寄託されたクローン混合物から単離されたクローン が、全長配列を含まない場合に、全長遺伝子または遺伝子の全長コード部分を得 るために用い得る。ヒト乳房組織由来または寄託されたクローン混合物由来のラ イブラリーもまた、本発明の部分配列を用いて寄託された混合物以外の供給源か ら得られたクローンから全長配列を得るために適用可能である。 手順２ 全長遺伝子の回収のためのRACEプロトコル 部分cDNAクローンを、Frohman，M.A.、Dush，M.K.、およびMartin，G.R．(198 8)Proc．Nat'l．Acad．Sci．USA，85:8998-9002に記載されるcDNA末端の急速増 幅(RACE)手順を使用することにより、全長にし得る。5'または3'末端のいずれか を欠損するcDNAクローンは、翻訳開始または翻訳終止コドンのそれぞれに伸長す る、欠けている塩基対を含むように再構築し得る。ほとんどの場合、cDNAはその 翻訳の開始を欠損している。以下は、簡単に、この本来の5'RACE手順の改変を記 載する。ポリA+または全RNAを、Superscript II(Gibco/BRL)およびcDNA配列に特 異的なアンチセンスまたは相補的プライマーで逆転写する。プライマーを、Micr ocon Concentrator(Amicon)で反応物から除去する。次いで、第一鎖cDNAの末端 にdATPおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(Gibco/BRL)を付け る。こうして、PCR増幅に必要なアンカー配列を生成する。第二鎖を、PCR緩衝液 中のdA-テイル、Taq DNAポリメラーゼ(Perkin-Elmer Cetus)、３つの隣接した制 限酵素部位(XhoI、SalIおよびClaI)を5'末端に含むオリゴ-dTプライマー、およ びこれらの制限部位だけを含むプライマーから合成する。この二重鎖cDNAを、40 サイクルの間、同じプライマーならびに縮小された(nested)cDNA-特異的アンチ センスプライマーでPCR増幅する。PCR産物を、エチジウムブロマイド-アガロー スゲルでサイズ分離し、そして欠損タンパク質をコードするDNAの予測される大 きさのcDNA産物を含むゲルの領域を切除する。cDNAを、Magic PCR Prepキット(P romega)を用いてアガロースから精製し、XhoIまたはSalIを用いて制限酵素消化 し、そしてpBluescript SKII(Stratagene)のようなプラスミドに、ShoIおよびEc o RV部位で結合する。このDNAをバクテリアへ形質転換し、そしてプラスミドクロ ーンを、正しいタンパク質コード挿入物を同定するために配列決定する。正しい 5'末端を、この配列を推定的に同定されたホモログおよび部分cDNAクローンとの 重複と比較することにより、確認する。 いくつかの品質調節キットが市販されている。上記のものと類似の試薬および 方法が、Gibco/BRLからキット形態で供給されている。第二のキットは、Clontec hから入手可能であり、これは関連する技術、Dumasら（Dumas，J.B.，Edwards， M.，Delort，J.およびMallet，Jr.，1991，Nucleic Acids Res.，19:5227-5232 ）により開発されたSLIC(一本鎖cDNAへの一本鎖結合)の改変である。手順の主要 な相違は、逆転写の後にRNAがアルカリ加水分解されること、およびRNAリガー ゼが制限酵素部位を含むアンカープライマーを第一鎖cDNAに結合させるために用 いられることである。これは、越えて配列決定することが困難なポリTストレッ チを生じる、dA-テイリング反応の必要性を排除する。 5'cDNAをRNAから産生することの代わりとして、cDNAライブラリー二重鎖DNAを 用いることがある。非対称のPCR増幅アンチセンスcDNA鎖を、アンチセンスcDNA 特異的プライマーおよびプラスミドをつないだ(plasmid-anchored)プライマーで 合成する。これらのプライマーを除去し、そして対称PCR反応を、短縮したcDNA- 特異的アンチセンスプライマーおよびプラスミドをつないだプライマーで行う。 手順３ 全長遺伝子を得るために5'末端配列を産生するためのRNAリガーゼプロトコル 一旦目的の遺伝子が同定されると、いくつかの方法が、本来の寄託されたクロ ーンには存在し得ない遺伝子の、5'または3'部分の同定に利用可能である。これ らの方法には、5'および3'RACEに類似および同一の特定のプローブおよびプロト コルを用いたフィルタープロービング(filter probing)、クローン濃縮（enrich ment）が含まれるが、これらに限定されない。全長遺伝子はライブラリーに存在 し得、そしてプロービングによって同定し得る一方、5'末端を産生するための有 用な方法は、本来の部分配列からの現存の配列情報を、欠損する情報を産出する ために用いることである。5'RACEに同様な方法が、所望の全長遺伝子の欠損して いる5'末端を産生するために利用可能である。(この方法は、Fromont-Racineら により、Nucleic Acids Res.，21(7):1683-1684(1993)に公開された)。簡潔には 、特定のRNAオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子RNA転写物を含むと推定されるRN A、および連結したRNAオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーを含むプライマ ーセットの集団の5'末端に連結させる。目的の遺伝子の既知の配列(EST)に特異 的なプライマーを用いて、所望の全長遺伝子の5'部分をPCR増幅する。これは、 次いで配列決定され、そして全長遺伝子を産生するために用いられ得る。この方 法は、所望の供給源から単離された全RNAで始まり、ポリＡ RNAは用い得るが、 この手順には必要ではない。次いで、RNA調製物を、分解または損傷したRNAの5' リン酸基（これらは、後のRNAリガーゼ工程を妨害し得る）を排除する必要があ れば、ホスファターゼで処理し得る。次いで、ホスファターゼ（もし用いられた 場合）を、不活性化し、そしてメッセンジャーRNAの5'末端に存在するキャップ 構造を除去するために、RNAをタバコ酸性ピロホスファターゼで処理する。この 反応は、キャップが切断されたRNAの5'末端に5'リン酸基を残し、これは次いで 、T4 RNAリガーゼを用いて、RNAオリゴヌクレオチドへ結合する。次いで、この 改変されたRNA調製物を、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを用いる第一鎖cDNA 合成のための鋳型として用い得る。次いで、第一鎖合成反応物を、結合したRNA オリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列(EST )に特異的なプライマーを用いて、所望の5'末端のPCR増幅のための鋳型として用 い得る。次いで、得られる生成物の配列決定を行い、そして分析し、5'末端配列 が部分配列に属することを確認する。 実施例５ バキュロウイルス発現系を用いるBSG1のクローニングおよび発現 全長のBSG1タンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第97175号）を、こ の遺伝子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを 用いて増幅した： 5'プライマーは、配列5'-AAAGGATCCCCCGCCATCATGGATGTTTTCAAGAAG 3'（配列番 号25）を有し、そしてBamHI制限酵素部位（太字）と、それに続くBSG1遺伝子（ 翻訳の開始コドン「ATG」に下線を付する）の真核生物細胞における翻訳の開始 に効率的なシグナルに類似する８つのヌクレオチド（Kozak，M.，J．Mol．Biol. ，196:947-950(1987)）を含有する。 3'プライマーは、配列5’AAATCTAGACTAGTCTCCCCCACTCTG 3’（配列番号26）を 有し、そして制限エンドヌクレアーゼXbaIの切断部位およびこのBSG1遺伝子の3' 配列に相補的な21ヌクレオチドを含む。増幅した配列を、市販のキット（「Gene clean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルから単離 した。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIで消化 し、次いで再び１％アガロースゲルで精製した。このフラグメントを、F2と命名 する。 ベクターpA2（pVL941ベクターの改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系 を用いるBSG1タンパク質の発現のために用いる（総説については、Summers，M.D ．およびSmith，G.E．1987，A manual of methods for baculovirus vectors an d insect cell culture procedures，Texas Agricultural Experimental Statio n Bulletin No．1555を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa callif ornica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、それ に続く制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIの認識部位を含む。シミアンウ イルス（SV）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用い る。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβ-ガラクトシダー ゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、それに続くポリヘドリン遺伝子のポリ アデニル化シグナルと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェ クトした野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列に両 端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pA2の代わりに用い られ得る。例えば、pRG1、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である（Luckow，V.A. およびSummers，M.D.、Virology，170:31-39）。 プラスミドを制限酵素BamHIおよびXbaIで消化し、当該分野で公知の手順によ り仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、DNAを、市販のキ ット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロース ゲルから単離した。このベクターDNAをV2と呼ぶ。 フラグメントF2および脱リン酸化したプラスミドpA2を、T4 DNAリガーゼを用 いて連結した。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよ びXbaIを用いて、BSG1遺伝子を有するプラスミド（pBacBSG1）を含む細菌を同定 した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。 ５μgのプラスミドpBacBSG1を、リポフェクション法（Felgnerら Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化した バキュロウイルス（「BaculoGoldTM baculovirus DNA」，Pharmingen，San Dieg o，CA.）とともにコトランスフェクトした。 1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacBSG1を、50μl の無血清Grace培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイ ク ロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、10μlのリポフェクチ ンおよび90μlのGrace培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベ ートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清を含まないGrace 培地１mlを含有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CR L 1711）に滴下して加えた。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するため に、前後に振動させた。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートした。 ５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎 児血清を補充した１mlのGrace昆虫培地を添加した。プレートをインキュベータ ーに戻し、そして27℃で４日間培養を続けた。 ４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様 にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な 単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を 有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc.、Gaithersburgが配布する昆虫細胞培養およびバキュロ ウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。 連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加え、そして青く染色されたプラークを エッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天 を、200μlのGrace培地を含むエッペンドルフチューブ中で再懸濁した。寒天を 、短かい遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、 35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させるために用いた。４日後、これ らの培養ディッシュの上清を収集し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させた。細胞を、 感染多重度（MOI）２で、組換えバキュロウイルスV-BSG1で感染させた。６時間 後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（ Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42時間後、５μCiの35 Ｓ-メチオニンおよび５μCiの35Ｓシステイン（Amersham）を添加した。細胞を さらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により収集し、そして標 識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化した 。 実施例６ COS 細胞中での組換えBSG1の発現 プラスミド、BSG1 HAの発現を、ベクターpcDNAI/Amp（Invitrogen）から誘導 する。ベクターpcDNAI/Ampは以下を含有する：１）SV40複製起点、２）アンピシ リン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロ ン、およびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。前駆体全体およびその3 '末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベク ターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現は CMVプロモーター下に支配される。HAタグは、先に記載された（I．Wilson、H．N iman、R．Heighten、A Cherenson、M．Connolly、およびR．Lerner、1984，Cell 37，767(1984)）ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトー プに対応する。標的タンパク質へのHAタグの融合により、HAエピトープを認識す る抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。 プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する： BSG1をコードするDNA配列（ATCC受託番号第97175号）を、以下の２つのプライ マーを用いるPCRにより構築した：5'プライマー AAAGGATCCCCCGCCATCATGGATGTT TTCAAGAAG 3'（配列番号27）は、BamHI部位、それに続く開始コドンから始まるB SG1コード配列の18ヌクレオチドを含む；3'配列 AAATCTAGACTAAAGCGTAGTCTGGGAC GTCGTATGGGTACTCCTGGGGTCTCCCCCACTCTGGGC 3'（配列番号28）は、XbaI部位、翻 訳停止コドン、HAタグ、およびBamHIコード配列の最後の18ヌクレオチド（停止 コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、BamHI部位、 インフレームで融合したHAタグが続くBSG1コード配列、HAタグに隣接する翻訳終 結停止コドン、およびXbaI部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター （pcDNAI/Amp）を、BamHIおよびXbaI制限酵素を用いて消化し、そして連結した 。連結混合物を、E．coli SURE株（Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037より入手可能）に形質転換し、形質転 換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した 。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在を 制限酵素分析で調べた。組換えBSGタンパク質の発現のために、COS細胞をDEAE-D EX TRAN法（J．Sambrook、E．Fritsch、T．Maniatis、Molecular Cloning: A Labor atory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)）により発現ベクターで トランスフェクトした。BSG HAタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降 法により検出した（E．Harlow，D．Lane，Antibodies: A Laboratory Manual，C old Spring Harbor Laboratory Press，(1988)）。細胞を、トランスフェクショ ンの２日後、35S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そし て細胞を界面活性剤（RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ N P-40、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))で溶解した(Wilson，I.ら、同上 37:767(1 984))。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体を用 いて沈降させた。沈降したタンパク質を15％ SDS-PAGEゲルにおいて分析した。 本発明の多数の改変および変更が、上記の教示を参照して可能であり、従って 、添付する請求の範囲の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され得る 。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                     Breast-specific genes and proteins   The present invention relates to newly identified polynucleotides, such polynucleotides Polypeptides, and breast disorders, especially the presence of breast cancer and breast cancer Use of such polynucleotides and polypeptides for the detection of translocation of proteins About. The invention further relates to inhibiting the production and function of the polypeptide of the invention. I do. The 20 breast-specific genes of the present invention are sometimes referred to hereinafter as `` BSG1 '' , "BSG2" and so on.   The mammary gland is subject to various easily detectable disorders. Detection usually consists of palpation This can be achieved by inspection. Unfortunately, there is little regular self-examination Many lumpes in the breast are only found by accidental palpation. Doubt Aspiration of a dyscyst with a fine gauge needle is another fairly common diagnosis. It is an implementation. Mammography of the breast or dry radiography (soft tissue x-ray) is yet another examination It is the implementation of the interruption. Biopsy of diseased or suspicious areas is the best diagnostic test Is the law.   There are many types of tumors and cysts that affect the mammary gland. Fibroadenoma is the most It is a common benign breast tumor. Cystic disease and carcinoma as pathological entities After that, it is ranked third. These tumors are most often young Seen separately and usually easily recognized. Because I feel encapsulated Because. Fibrous cyst disease, a benign condition, is the most common type of breast disease in women. It is a disease that occurs in about 20% of premenopausal women. Lipomas of the breast are also common And these are benign in nature. Breast carcinoma is the most common among women Malignant condition with the highest mortality rate among all cancers affecting women You. At some point during the life of a woman, one in 15 women in the United States It develops tuft cancer. Its reported annual incidence was 100,00 of the population in 1947. 70 per 0 women, 72.5 for whites in 1969, and 47 for blacks. It rose from 8 to 60.1. The annual mortality rate from 1930 to the present It remains constant, about 23 per 100,000 female population. Breast cancer smells men Rare, but when it occurs, it is usually not recognized until late, and The result is not good. In women, breast carcinoma is rarely seen before age 30 , Its incidence increases rapidly after menopause. For this reason, postmenopausal breast Should be considered a cancer until proven otherwise.   According to one aspect of the present invention, transcribed from the human breast specific gene of the present invention Sufficient to specifically hybridize to RNA or DNA corresponding to such RNA A nucleic acid probe comprising a nucleic acid molecule of any length is provided.   According to another aspect of the present invention, the human breast specific of the present invention in a sample derived from a host Detect the presence of RNA transcribed from the gene or DNA corresponding to such RNA And a method for diagnosing breast cancer formation and metastasis of breast cancer. Things are provided.   According to yet another aspect of the present invention, the breast-specific of the present invention in a sample derived from a host. Detecting an altered level of the polypeptide corresponding to the gene, thereby Elevated levels of peptide are indicative of a breast cancer diagnosis, indicating that breast cancer formation and Methods and products are provided for diagnosing breast cancer metastasis.   According to another aspect of the present invention, mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA, and their Antisense analogs, and biologically active and useful for diagnosis or therapy An isolated human breast-specific polypeptide encoding fragments thereof Polynucleotides are provided.   According to yet another aspect of the present invention, a human comprising a polynucleotide set forth in the Sequence Listing A breast specific gene is provided.   According to a further aspect of the present invention, there is provided a novel polynucleotide encoded by a polynucleotide. Peptides and their biologically active and diagnostically or therapeutically useful Offers fragments, analogs, and derivatives   According to a still further aspect of the invention, a recombinant comprising a polynucleotide of the invention Prokaryotic host cells and / or recombinant eukaryotic host cells are Culturing under conditions that promote expression and subsequent recovery of the protein. Methods for producing such polypeptides by recombinant techniques, including, are provided. Provided.   According to a still further aspect of the invention, an antibody specific for such a polypeptide Provides antibodies that can be used to detect breast cancer cells or breast cancer metastases. You.   According to another aspect of the invention, one or more polypeptides of the invention treat breast cancer. And a polypeptide for use with the polypeptide. Interacting compounds (eg, compounds that inhibit or activate a polypeptide of the invention) ) Are provided for use in screening compounds.   According to yet another aspect of the invention, one or more polynucleotides of the invention and Inhibiting the activation of the polypeptide and / or therapeutically, e.g. in the treatment of breast cancer A screen is provided for detecting compounds that can be used.   According to a still further aspect of the invention, such a polypeptide, or such a polypeptide. Polynucleotides encoding such polypeptides can be used for scientific research, DNA synthesis and And methods for use for in vitro purposes for the production of DNA vectors Is provided.   These and other aspects of the invention will be apparent to those skilled in the art from the teachings herein. Should be.   The following drawings are illustrative of embodiments of the present invention and are encompassed by the claims. It is not meant to limit the scope of the invention.   FIG. 1 shows the full-length cDNA sequence of the breast-specific gene 1 of the present invention.   FIG. 2 shows the partial cDNA sequence of the present invention and its corresponding breast-specific gene 2. It is a constant amino acid sequence.   FIG. 3 shows the partial cDNA sequence of the present invention and the deduced amino acid sequence of breast-specific gene 3. It is.   FIG. 4 shows the deduced partial cDNA sequence of the present invention and its corresponding breast-specific gene 4. Amino acid sequence.   FIG. 5 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 5 of the present invention.   FIG. 6 shows the partial cDNA sequence of the present invention and the deduced amino acid sequence of breast-specific gene 6. It is.   FIG. 7 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 7 of the present invention.   FIG. 8 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 8 of the present invention.   FIG. 9 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 9 of the present invention.   FIG. 10 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 10 of the present invention.   FIG. 11 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 11 of the present invention.   FIG. 12 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 12 of the present invention.   FIG. 13 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 13 of the present invention.   FIG. 14 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 14 of the present invention.   FIG. 15 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 15 of the present invention.   FIG. 16 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 16 of the present invention.   FIG. 17 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 17 of the present invention.   FIG. 18 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 18 of the present invention.   FIG. 19 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 19 of the present invention.   FIG. 20 is a partial cDNA sequence of the breast-specific gene 20 of the present invention.   The term “breast-specific gene” means that such a gene is mainly expressed in breast-derived tissue And such genes can be expressed in cells from tissues other than the breast. Means that However, expression of such genes is not Significantly higher in breast-derived tissue than in tissue.   According to one aspect of the invention, it has the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Mature polypeptides and their fragments, analogs and derivatives A polynucleotide to be loaded is provided.   According to a further aspect of the invention, the polynucleotide of FIGS. 2-20 (SEQ ID NOs: 2-20) At least 90% identical (preferably less) to one of the At least 95% identical, and most preferably at least 97% or 100% identical) Mature polypeptide identical to human gene with coding portion including polynucleotide Are provided.   According to yet another aspect of the invention, the code portion is ATCC Accession No. 97175 (1 At least 90% identical to one of the polynucleotides contained on June 2, 995 (Preferably at least 95% identical, and most preferably at least 97% Or 100% identical) to the same mature polypeptide as the human gene containing the polynucleotide. Provided are polynucleotides that encode the codes.   According to yet another aspect of the present invention, the coding portion is shown in FIGS. ) Is at least 90% identical (preferably at least 90%) to one of the polynucleotide sequences DNA that are 95% identical, and most preferably at least 97% or 100% identical) MRNA transcribed from the coding portion of the human gene containing the sequence (or its corresponding cD Polynucleotide probes that hybridize to NA) are provided.   The present invention further relates to a polynucleotide wherein the coding portion is as shown in FIG. One of the otides and analogs, derivatives, and furans of such polypeptides At least 90% identical (preferably at least 95% identical and more More preferably, a human gene comprising at least 97% or 100% identical DNA sequence The mature polypeptide encoded by the nucleic acid moiety.   The present invention also provides the mature polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), as well as such The present invention relates to fragment analogs of polypeptides and to one of its derivatives.   The present invention further provides that the code portion is ATCC Accession No. 97175 (June 2, 1995). Deposit) at least 90% identical (preferably, Are at least 95% identical, and more preferably at least 97% or 100% identical The same mature polypeptide encoded by a human gene, including DNA You.   According to one aspect of the invention, it has the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). The mature polypeptide, or a fragment, analog, or derivative thereof. An isolated nucleic acid (polynucleotide) is provided.   The polynucleotide of the present invention may be in the form of RNA or DNA (this DNA may be cDNA, DNA, and synthetic DNA). DNA is double-stranded or single-stranded Possible and, if single-stranded, the coding strand or the non-coding (antisense) strand Can be The coding sequence encoding the mature polypeptide is shown in FIGS. 1-20) or the DNA which is identical to the coding sequence of the deposited clone, Alternatively, the coding sequence may be altered as a result of duplication or degeneracy of the genetic code. A gene containing the DNA of FIG. 1 to 20 (SEQ ID NO: 1 to 20) or the deposited cDNA Can be a different coding sequence encoding the same mature polypeptide as the coding sequence of .   Polynucleotides encoding the mature polypeptides of the invention may include: But not limited to: coding sequence for mature polypeptide only; mature polypeptide Coding sequence of the peptide and leader or secretory sequence or proprotein Additional coding sequence, such as a sequence; the coding sequence for the mature polypeptide (and Depending on the additional coding sequence) as well as non-coding sequences (eg introns Or the 5 'and / or 3' non-coding sequence of the coding sequence of the mature polypeptide).   Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" refers to a polypeptide. A polynucleotide containing only the coding sequence of the And / or polynucleotides containing non-coding sequences.   The invention further provides fragments, analogs, and The present invention relates to variants of the polynucleotides described herein which encode derivatives. Poly Nucleotide variants are naturally occurring allelic variants of the polynucleotide. Alternatively, it may be a non-naturally occurring variant of the polynucleotide.   Thus, the present invention encodes the same mature polypeptide as described herein above. As well as variants of such polynucleotides. This Variants encode fragments, derivatives or analogs of the polypeptides of the invention. To load. Such nucleotide variants include deletion variants, substitution variants, and Includes addition or insertion variants.   The polynucleotide of the present invention has a coding sequence shown in FIGS. 1 to 20 (SEQ ID NOS: 1 to 20). A coding sequence that is a naturally occurring allelic variant of a human gene containing the DNA set forth in Can have the coding sequence of the DNA in a row or deposited clone. Known in the art An allelic variant has one or more nucleotide substitutions, deletions, or A polynucleotide which may have an addition and which does not substantially alter the function of the encoded polypeptide. Another form of a nucleotide sequence.   The invention also provides that the coding sequence of the mature polypeptide is identical to the reading frame. Polynucleotide that assists expression and secretion of the polypeptide from the host cell in the cell Sequence (eg, as a secretory sequence to control the transport of the polypeptide from the cell) A functional leader sequence). Leader arrangement Polypeptides having a sequence are preproteins, and The leader sequence can be cleaved by the host cell to form morphology. That po Renucleotides are also mature proteins with additional 5 'amino acid residues. May be encoded. Mature proteins with prosequences And an inactive form of the protein. Once professional distribution When the row is cut, the active mature protein remains.   Thus, for example, a polynucleotide of the invention may be a mature protein, Protein with sequence, or both prosequence and presequence (leader sequence) Can be encoded.   The polynucleotide of the present invention also allows for purification of the polypeptide of the present invention. It may have the coding sequence fused in frame to the marker sequence. Marker sequence Provides for purification of the mature polypeptide fused to a marker in the case of a bacterial host The hexahistidine tag supplied by the pQE-9 vector. is there Alternatively, for example, a marker sequence is used in a mammalian host (eg, COS-7 cells). If so, it may be a hemagglutinin (HA) tag. HA tag for influenza red blood Corresponds to an epitope derived from the hemagglutinin protein (Wilson, I. et al., Cell, 37: 767 (1984)).   The invention further provides that at least 70%, preferably at least 90%, and And more preferably, if at least 95% identity is present, It relates to a polynucleotide that hybridizes to a polynucleotide. The invention is particularly Can be hybridized to the above-described polynucleotides under stringent conditions. The polynucleotide to be released. As used herein, the term "stringing "Hybrid conditions" means that hybridization is at least 95% between sequences and And preferably occurs only when at least 97% identity is present. You. In a preferred embodiment, the polynucleotides described herein above are hybridized. The soybean polynucleotide is the DNA of FIGS. 1 to 20 (SEQ ID NOS: 1 to 20) or the deposited Maturation of the invention encoded by a coding sequence comprising the isolated cDNA (s) A polypeptide that retains substantially the same biological function or activity as the polypeptide. Code.   Alternatively, the polynucleotide is hybridized to a polynucleotide of the invention. And has identity thereto, and has activity as described hereinabove. At least 10 or 20 bases, preferably at least 10 May also have 30 bases, and more preferably at least 50 bases. For example Polynucleotides can be used as probes for polynucleotides (eg, A probe for recovering a polynucleotide or a diagnostic probe) or It can be used as a PCR primer.   Accordingly, the present invention relates to a human gene comprising one of the DNAs of FIGS. For the polynucleotide encoding the mature polypeptide encoded by the offspring At least 70%, preferably at least 90% identity, and more preferably 95% % Identity, as well as fragments thereof (this flag Has at least 30 bases and preferably at least 50 bases). And polypeptides encoded by such polynucleotides.   A subsequence is a specific tag for a messenger RNA molecule. cDNA form The complete sequence of the messenger RNA in the form of Identify the cDNA clone corresponding to the full-length transcript and then sequence the clone. Can be determined. Partial cDNA clones can also be genomic clones or Is a complete gene, including regulatory and promoter regions, exons and introns It can be used as a probe to identify clones containing offspring.   The partial sequences in FIGS. 2-20 (SEQ ID NOs: 2-20) are the corresponding full length residues from which they are derived. Can be used to identify genes. The subsequence is nick-translated. Labeling methods known to those skilled in the art (Basic Methods in Molecular Biology, L. G. Davis, M.D. Dibner, and J.F. Battey ed., Elsevier Press, NY, 1986) Using polynucleotide kinase32It can be end-labeled with P. Human breast set Lambda libraries prepared from weaves are screened directly with the labeled sequence of interest. Can be screened or facilitate bacterial blasty screening Libraries can be batch-converted to pBluescript to ne Cloning Systems, La Jolla, CA92037). For pBluescript, see Sambrook Et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator See y Press (1989), page 1.20. Both methods are well known in the art. Simple Simply stated, a pBluescript containing a bacterial colony containing the library Bacterial lawns, including Luther or lambda plaque, are denatured and DNA is Fixed to the filter. The filter is described by Davis et al., Supra. Hybridization conditions are used to hybridize to the labeled probe. It is. The partial sequence cloned into lambda or pBluescript For assessing background binding as a roll and for accurate clone identification To control the hybridization and wash stringency required for Can be used. The resulting autoradiogram is used to replicate colonies or plaques. Rate is compared to each exposed spot; Respond to Lark. Colonies or plaques are selected, expanded, and DNA Is isolated from the colony for further analysis and sequencing.   Positive cDNA clones are analyzed to determine the amount of additional sequence they contain. PCR using one primer from the column and the other from the vector Is determined using Clone with vector-insert PCR product larger than the original partial sequence The loans are analyzed by restriction digestion and DNA sequencing, and they are Contains an insert of the same or similar size to the mRNA as determined from the Is determined.   Once one or more duplicate cDNA clones are identified, the complete sequence of the clone is determined Can be done. A preferred method is to use exonuclease III digestion (Mc Combie, W.R, Kirkness, E., Fleming, J.T., Kerlavage, A.R., Iovannisci, D .M., And Martin-Gallardo, R., Methods,Three: 33-40, 1991). A series of deletions Sequences are generated, each of which is sequenced. The resulting duplicated sequence has high degeneracy ( Into one contiguous sequence with (usually 3 to 5 overlapping sequences at each nucleotide position) Is constructed, resulting in a highly accurate final sequence.   The DNA sequence (as well as its corresponding RNA sequence) can also be found in ATCC Accession No. 97175 (1 Deposited on June 2, 995) and isolatable therefrom. Fragments or parts of the isolated DNA sequence (and the corresponding RNA sequence), and DNA sequence identical to the DNA (RNA) sequence encoding the same polypeptide Contains the sequence containing it.   Deposit (s) referred to herein are deposits of microorganisms for patent purposes Maintained under the Budapest Treaty on the International Recognition of These deposits are It is provided only as a convenience to the merchant, and under 35 U.S.C. 112 It does not acknowledge that a deposit is required. Polynucleotides in the deposit The sequence of the tide, as well as the amino acid sequence of the polypeptide encoded thereby, It is incorporated herein by reference, and includes any description of sequences herein. We manage in the event of such a conflict. Manufacture, use, or sell the deposit May require a license, and such a license is hereby granted. Is not given.   The invention further has at least 10 bases, preferably at least 20 bases, and Is a polynucleotide that can have 30 or more bases, RNA transcribed from human genes, including the DNA described above (and Corresponding DNA) and at least 70% identity to it A polynucleotide having the same.   Thus, a polynucleotide sequence that hybridizes as described above is a polynucleotide sequence described herein. The corresponding human remains for use in diagnostic assays as described below. It can hybridize to the gene and be used to detect its expression.   According to yet another aspect of the invention, a method for detecting breast cancer micrometastases in a host is provided. A diagnostic assay is provided. Applicant makes any reasoning for the present invention While not wishing to be limited to a particular scientific theory, the details of the host other than cells derived from the breast are The presence of active transcription of the breast-specific gene of the present invention in the vesicles is indicative of breast cancer metastasis. It is considered a mark. This is true. Because the breast-specific gene is the body Are found in all cells, whereas their transcription into mRNA, cDNA and This is because expression products are mainly restricted to the breast in unaffected individuals. But, If breast cancer is present, the breast cancer cells migrate from the cancer to other cells, and as a result, These other cells are actively transcribing and expressing breast-specific genes in unaffected individuals. (E.g., transcription occurs in healthy individuals). Higher than found in non-breast tissue). In cells other than breast-derived cells Detection of this amplified transcript or amplified protein expression is indicative of breast cancer metastasis. It is an indicator.   In one example of such a diagnostic assay, in a sample from tissue other than breast, The RNA sequence is detected by hybridization to the probe. Sump Comprises a nucleic acid or a mixture of nucleic acids, at least one of which is a human of the invention. Suspected to contain breast-specific genes or fragments thereof, Transcribed and expressed in various tissues. Thus, for example, in cells of a particular RNA In the form of an assay to determine the presence of RNA, RNA is first isolated from the cell. You.   Samples include non-breast (including blood, urine, saliva, tissue biopsy, and necropsy material). (But not limited to these). Other than breast Human breast-specific gene of the present invention or a flag thereof in a sample obtained from cells The use of such a method to detect amplified transcription from a It is well within the purview of those skilled in the art from the teachings herein.   Isolation of mRNA involves disrupting cells and performing differential centrifugation to remove whole cell RNs. Isolating A. Once the total RNA has been isolated, the mRNA is available to those skilled in the art as poly (A). Known as the tail (found at the 3 'end of virtually all eukaryotic mRNA molecules) It is isolated using adenine nucleotide residues. Deoxythymidine [oligo (dT )] Is an oligonucleotide consisting of cellulose packed in a small column. And oligo (dT) cellulose. Preparations of total cellular RNA As it passes through the column, the mRNA molecule binds to oligo (dT) via a poly (A) tail However, the remaining RNA flows off the column. The bound mRNA is then eluted from the column And recovered.   As an example for detecting an isolated mRNA transcribed from the breast-specific gene of the present invention As described hereinabove, the recovered mRNA is transformed into a gene-specific oligonucleotide. Screening with a probe.   Such a probe may preferably be labeled with an analytically detectable reagent, It is also understood that they are labeled or facilitate identification of the probe. Useful trial As a drug, an enzyme that can catalyze the formation of radioactivity, a fluorescent dye, or a detectable product But are not limited to these.   One example of detecting a polynucleotide complementary to an mRNA sequence (cDNA) is polymerase A chain reaction (PCR) is utilized with reverse transcriptase. PCR involves DNA stretch or RNA A very powerful method for the specific amplification of Letch (Saiki et al., Nature, 234: 163-166 (1986)). One application of this technology is to convert nucleic acid sequences present at low copy numbers into Nucleic acid probe technology to grow to detectable levels. Many examinations of this method Disruptive and scientific applications are described in H.A. Erlich (ed.), PCR Technology-Principl es and Applications for DNA Amplification, Stockton Press, USA, 1989, And M.A. PCR Protocols, Academic Press, San Diego, USA by Inis (eds.) , 1990.   RT-PCR is a combination of PCR and reverse transcriptase. Reverse transcriptase supports cDNA molecules It is an enzyme produced from an mRNA molecule. This is important. Because PCR is Amplifies nucleic acid molecules, especially DNA, and the DNA is isolated from a sample from the host. This is because it can be produced from the extracted mRNA.   A specific example of an RT-PCR diagnostic assay involves removing a sample from host tissue. Including. Such samples are derived from tissues other than the breast, such as blood. Follow Examples of such diagnostic assays include whole blood gradient isolation of nucleated cells and total RNA extraction. RT-PCR of total RNA, and agarose gel electrophoresis of PCR products. PCR products Transcribed from one or more breast-specific genes of the present invention or fragments thereof Includes cDNA complementary to RNA. More specifically, a blood sample is obtained and Of whole blood is mixed with an equal volume of phosphate buffered saline, centrifuged, and The layer of lymphocytes and granulocytes is carefully aspirated and phosphate buffered saline Rediluted and centrifuged again. The supernatant is discarded, and the nucleated cells Containing pellets were described by the manufacturer (Tel-Test Inc., Friendswood, TX). Used for RNA extraction using the RNazole B method.   Oligonucleotide primers having high specificity for the DNA sequences of the invention and A probe is prepared. The probe should be at least 10 base pairs long, preferably At least 30 base pairs long, and most preferably at least 50 base pairs long or more long. The reverse transcriptase reaction and PCR amplification are performed continuously without interruption. Taq poly Merase is used during PCR, and the PCR product is concentrated, and all samples are Run on a Tris-borate-EDTA agarose gel containing ethidium bromide.   According to another aspect of the present invention, a book in a biological sample from a tissue other than the breast. By measuring altered levels of a breast specific polypeptide of the invention, Methods are provided for diagnosing a disorder, for example, breast cancer. Breast-specific poly of the present invention Elevated levels of peptides are associated with active transcription and activation of the corresponding breast-specific gene product. And expression. Breast-specific gene polypeptide levels in host-derived samples Assays used to detect are well known to those of skill in the art, and they Radioimmunoassay, competitive binding assay, western blot analysis, ELISA Assays, and "sandwich" assays. Biological samples include pairs Can include, but is not limited to, a textile extract, a cell sample, or a biological fluid of an organism . However, according to the present invention, the biological sample may, in particular, comprise breast tissue or cells. Not included.   ELISA assays (Coligan et al.,Current Protocols in Immunology, 1 (2), Chapter 6 , 1991) is the first antibody specific to the breast-specific polypeptide of the present invention, preferably Comprises preparing a monoclonal antibody. In addition, reporter antibodies are Prepared against lonal antibody. Reporter antibodies include radioactivity, fluorescence, or In this example, a detectable reagent such as horseradish peroxidase enzyme is used. Will be added. The sample is removed from the host and the proteins in the sample Incubated on a solid support that binds (eg, a polystyrene dish). It is. Any free protein binding sites on this dish will then be Coated by incubating with such a non-specific protein. The monoclonal antibody is then incubated in the dish, During this time, the monoclonal antibody was Binds to peptides. All unbound monoclonal antibodies are washed away with buffer Is done. At this time, the reporter antibody linked to horseradish peroxidase Placed in the dish, so that this reporter antibody is Binds to any monoclonal antibody bound to the repeptide. Then, unbound The reporter antibody is washed away. The peroxidase substrate is then And the amount of color development within a given time was compared against a standard curve. Of breast-specific polypeptide present in a predetermined volume of a patient sample Quantity.   Competition assay binds antibodies specific for breast-specific polypeptides to solid support Can be used if you are. The breast-specific polypeptide is then labeled and The labeled polypeptide sample from the host is then passed over a solid support and For example, labels detected by liquid scintillation chromatography Can be correlated to the amount of breast-specific polypeptide in the sample.   "Sandwich" assays are similar to ELISA assays. "sandwich" In the assay, the breast-specific polypeptide is passed over a solid support, and Binds to the antibody bound to the solid support. The secondary antibody is then used to Binds to peptides. A tertiary antibody, labeled and specific for the secondary antibody, is then Passed through a solid support and binds to a secondary antibody, then the amount can be quantified .   In another method, antibodies to labeled breast-specific polypeptides are used. Is done. In one-step assays, the target molecule, if present, is immobilized and And incubated with the labeled antibody. The labeled antibody is used for immobilized target Binds to a molecule. After washing to remove unbound molecules, the sample is Assay for presence. In a two-step assay, the immobilized target molecule Is incubated with unlabeled antibody. The labeled molecule-labeled antibody complex is If present, then binds to a labeled secondary antibody specific for the unlabeled antibody. So Samples are washed and assayed for the presence of label.   Such antibodies specific for breast-specific gene proteins, e.g., anti-idio Types of antibodies are labeled as described above and bind tightly to breast cancer cells, Can be used to detect breast cancer cells by detecting their presence You.   These antibodies also destroy them, for example, when they come in contact with breast cancer cells. Homing interaction reagent method to target breast cancer cells I can do it. This is a fact. Because this antibody is mainly expressed in breast cancer Specific for a breast cancer-specific gene, and the binding of the interaction reagent to the antibody is This is to cause direct transport of the interaction reagent to the breast.   This type of antibody can also be used to label antibodies, for example, to facilitate breast scanning. Can be used to perform in vivo imaging. Diagnostic imaging One method is to detect cancer cells in any breast to be imaged by a Contacting with an anti-breast-specific gene protein antibody labeled with . This method is used to bind labeled antibodies to breast-specific gene proteins. It is performed under conditions. In certain instances, the antibodies are expressed in breast (eg, breast cancer cells) and And fluorescein during such contact, resulting in diagnostic imaging and The breast visibility is amplified, allowing the determination of diseased or non-disease status of the breast. You.   The choice of marker used to label the antibody will vary depending on the application. However, the choice of marker can be readily determined by one skilled in the art. These markers Recognized antibodies can be used in immunoassays and histological applications to Can be used to detect the presence of quality. Labeled antibodies can be polyclonal or Or monoclonal.   In non-breast cells due to the presence of altered levels of mRNA, cDNA or expression products The presence of a breast-specific gene transcript that is more active than is normally found in Is an important indicator of the presence of breast cancer. Because breast cancer cells are not This is because they are moving in the ring. Therefore, this phenomenon has important clinical implications . This is because the method of treating localized tumors, in contrast to treating metastases, is Because they are completely different.   Of the 20 breast-specific genes disclosed, only breast-specific gene 1 is full length It is a messenger. Breast-specific gene 1 is the human Alzheimer's disease amyloid gene 79% identical and 83% similar. Breast specific gene 2 is a human hydroxy 30% identical to the siindole-o-methyltransferase gene, and 48 % Are similar. Breast-specific gene 3 is human O-6-methylguanine-DNA methyl tra 58% identical and 62% similar to the transferase gene. Breast-specific remains Gene 4 is 34% identical and 65% similar to the mouse p120 gene. Breast The heterologous gene 5 is 78% identical to the human p70 ribosomal S6 kinase α-II gene, And 89% similar. Breast-specific gene 6 has 7 in the human transcription factor NFATp gene. 7% identical and 79% similar.   As described above, the breast-specific gene of the present invention is useful for diagnosing breast cancer formation and for breast cancer. It is a putative molecular marker in the diagnosis of metastasis. As shown in Table 1 below, Presence of specific genes in normal breast, breast cancer, fetus and other cancer libraries The breast-specific gene of the present invention has been added to the breast cancer library when tested in Was found to be the most epidemic. This is because the gene of the present invention was considered earlier. FIG. 7 shows that it can be used to detect breast cancer, as expected. The table also shows that Figure 4 shows putative identifications based on homology of BSG1 to BSG6 to known genes.   The above assay also demonstrates that bone marrow stored prior to chemotherapy can Can be used to test for contamination by transfer. This asse In b), bone marrow-derived blood cells are isolated and treated as described above. Method determines whether preserved bone marrow is still suitable for transplantation after chemotherapy To be able to   The invention further provides a mature polypeptide (eg, a BSG1 polypeptide), and Such polypeptide fragments, analogs, and derivatives.   The terms “fragment,” “derivative,” and “analog” refer to the genes of the present invention. When referring to a polypeptide encoded by, such a polypeptide is essentially Polypeptides that retain the same biological function or activity. Therefore, Nalog cleaves the proprotein portion to produce an activated mature polypeptide And proproteins that can be activated by   The polypeptide of the present invention may be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide, or It can be a synthetic polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.   Fragments, derivatives, or even polypeptides encoded by the genes of the invention. Or analogs (i) wherein one or more amino acid residues therein are conservative or non-conservative; Amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) and such substitutions Can be the amino acid residue encoded by this genetic code. Or (ii) one or more amino acid residues therein contain a substituent Or (iii) the polypeptide therein increases the half-life of the polypeptide. Fused to another compound, such as a compound (e.g., polyethylene glycol) Or (iv) further amino acids therein are polypeptides (eg, Sequence or secretory sequence, or a sequence used to purify the mature polypeptide, Or may be a proprotein sequence). That Such fragments, derivatives, and analogs are known in the art from the teachings herein. Is considered to be within the range of the person.   The polypeptides and polynucleotides of the present invention are preferably in isolated form And preferably purified to homogeneity.   The term "isolated" refers to a substance that is in its natural environment (e.g., when it occurs in nature). Means taken out of the natural environment). For example, living movement The naturally occurring polynucleotide or polypeptide present in the product is isolated But not separated from some or all of the coexisting materials in the natural system The same polynucleotide or polypeptide has been isolated. like this The polynucleotide may be part of a vector and / or such a polynucleotide Nucleotides or polypeptides can be part of the composition and such vectors State that the substance or composition is not part of its natural environment, State.   The polypeptide of the present invention comprises the polypeptide of FIG. Peptides) and at least 70% similarity (preferably 70% identity) in FIG. (SEQ ID NO: 1), and more preferably at least 90% similarity (more preferably, at least 90% identity) is shown in FIGS. Having the polypeptides of SEQ ID NOs: 8 and 9), and even more preferably At least 95% similarity (even more preferably 95% identity) is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). )) And generally also less than Such a port containing at least 30 amino acids and more preferably at least 50 amino acids. Include portions of such polypeptides that have portions of the polypeptide.   As is known to those skilled in the art, the "similarity" between two polypeptides is one polypeptide. The amino acid sequence of the peptide and its conservative amino acid substitutions can be Determined by comparing to a column.   Fragments or portions of the polypeptides of the present invention can be accommodated by peptide synthesis Can be used to produce a full-length polypeptide. Therefore, this fragment Can be used as an intermediate to produce a full-length polypeptide. The present invention A fragment or portion of a polynucleotide may comprise a full-length polynucleotide of the invention. Can be used to synthesize.   The present invention also provides a vector comprising the polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention. Cells genetically engineered with E. coli and polypep of the invention by recombinant technology It relates to the production of pide.   A host cell is a vector of the present invention (for example, a cloning vector or Can be genetically engineered (transduced or otherwise) using an expression vector. Or transformed or transfected). Vectors, for example , Plasmids, virus particles, phages and the like. Manipulated host Cells can activate the promoter, select for transformants, or Cultivated in a conventional nutrient medium suitably modified to amplify the foreign gene obtain. Culture conditions (eg, temperature, pH, etc.) may vary depending on the host cell selected for expression. Are the conditions used previously, and will be apparent to those skilled in the art.   The polynucleotide of the present invention is used for producing a polypeptide by recombinant technology. Can be used. Thus, for example, a polynucleotide expresses a polypeptide May be included in any one of a variety of expression vectors. Vector like this Are derived from chromosomal, non-chromosomal, and synthetic DNA sequences (eg, Conductor; bacterial plasmid; phage DNA; baculovirus; yeast plasmid; Vectors derived from combinations of plasmid and phage DNA, viral DNA ( For example, vaccinia, adenovirus, fowlpox virus, and pseudorabies)) Including. However, as long as it is replicable and viable in the host, any other Vectors can also be used.   The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various procedures. Generally, DNA distribution Rows are labeled with appropriate restriction endonuclease sites (single or multiple) by procedures known in the art. Or multiple). Such and other procedures are within the purview of those skilled in the art. It is believed that there is.   The DNA sequence in the expression vector may contain appropriate expression control sequences (simply directing mRNA synthesis). Operably linked to (several or multiple) (promoter). Such a promotion Representative examples of the promoter may include: LTR or SV40 promoter ,E.coli lacOrtrp, Λ phage PLPromoters, and prokaryotic cells or Regulates gene expression in eukaryotic cells or their viruses. Other promoters that are being used. The expression vector also provides a ribosomal It contains a system binding site and a transcription terminator. Vectors also amplify expression To contain the appropriate sequence.   Furthermore, the expression vector is preferably for selection of transformed host cells. Phenotypic characteristics (eg, for eukaryotic cell cultures, dihydrofolate reductase or Or neomycin resistance, or for exampleE.coliTetracycline resistance in Or one or more selectable marker genes that provide for ampicillin resistance.   A suitable DNA sequence as described herein above, as well as a suitable promoter sequence or The vector containing the control sequences is used to transform the Can be used to express   Representative examples of suitable hosts may include: bacterial cells (eg,E.coli ,Streptomyces,Salmonella typhimuriumA fungal cell (eg, yeast); Insect cells (eg,Drosophila  S2andSpodoptera Sf9); Animal cells (eg, CHO, COS or Bowes melanoma); adenovirus; plant cells and the like. Suitable host The selection of is considered to be within the purview of those skilled in the art from the teachings herein.   More particularly, the present invention also relates to a recombinant comprising one or more sequences as broadly described above. And constructs. The construct may be a vector (eg, a plasmid vector or Virus vector), in which the sequence of the present invention Are inserted in the opposite direction. In a preferred aspect of this embodiment, the construct is In addition, regulatory sequences (eg, including a promoter) operably linked to the sequence may be included. Including. Numerous suitable vectors and promoters are known to those of skill in the art. , And are commercially available. The following vectors are provided as examples. Bacterial: pQE7 0, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK , PBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, p KK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 , PS G (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). However, any other Rasmids or vectors must also be able to replicate and survive in the host. As long as it can be used.   The promoter region is CAT (chloramphenicol transferase) vector Using any vector that has a desired marker or other Can be selected from Two suitable vectors are PKK232-8 and pCM7. Especially Well-known bacterial promoters include lacI, lacZ, T3, T7, gpt, λPR, PL And trp. Eukaryotic promoters include CMV immediate, HSV Gin kinase, early and late SV40, LTRs from retrovirus, and Usmetallothionein I. Choosing the right vector and promoter The choice is well within the level of ordinary skill in the art.   In a further embodiment, the present invention relates to a host cell containing the above-described construct. Host cells can be higher eukaryotic cells (eg, mammalian cells) or lower eukaryotic cells. Or a host cell can be a prokaryotic cell (eg, a yeast cell). Bacterial cell). The introduction of the construct into the host Transfection, DEAE-dextran mediated transfection, or Lectroporation (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., B asic Methods in Molecular Biology, (1986)).   Encoded by a recombinant sequence in a conventional manner using the construct in a host cell Gene products can be produced. Alternatively, the polypeptide of the invention may be a conventional peptide It can be produced synthetically by a synthesizer.   The protein may be found in mammalian cells, yeast, bacteria, or other cells with the appropriate promoter. Can be expressed under the control of a protein. Cell-free translation systems also rely on the DNA constructs of the present invention. The resulting RNA can be used to produce such proteins. Suitable cloning vectors and vectors for use in prokaryotic and eukaryotic hosts And expression vectors are described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chapter 1. Second edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) (the disclosure of which is incorporated herein by reference). Which is incorporated by reference).   Transcription of a DNA encoding a polypeptide of the present invention by higher eukaryotes may be a vector It is increased by inserting an enhancer sequence into the gene. Enhancers are DNA Cis-acting element, usually about 10 to about 300 bp, And increase its transcription. As an example, the late side of bp 100-270 of the replication origin SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, Polyoma enhancer on the late side of the replication origin, and adenovirus enhancer -.   In general, recombinant expression vectors contain an origin of replication and a host for transformation of the host cell. And a selectable marker (eg,E.coliAmpicillin resistance gene andS.cerevisi ae TRP1 gene) and highly expressed genes that direct transcription of downstream structural sequences Including the promoter. Such promoters include, inter alia, glycolytic enzymes (eg, , 3-phosphoglycerate kinase (PGK)), α-factor, acid phosphatase, May be derived from an operon encoding a heat shock protein. The heterologous sequence is It is assembled in a suitable phase with the translation initiation and termination sequences. If necessary, Heterologous sequences may have desired characteristics, such as stabilization or simplification of the expressed recombinant product. Fusion protein containing an N-terminal identifying peptide that gives .   Expression vectors useful for bacterial use include functional promoters and operable readouts. In frame, the desired protein with the appropriate translation initiation and termination signals By inserting a structural DNA sequence that encodes One vector Ensure the maintenance of the phenotypic selectable marker, and the vector, and are as desired In some cases, it will contain an origin of replication to provide for amplification in the host. For transformation As a suitable prokaryotic host,E.coli,Bacillus subtilis,Salmonella typhimur ium And species within the genera Pseudomonas, Streptomyces, and Staphylococcus Although various species are listed, other species can also be used as selections.   As a representative, but non-limiting example, an expression vector useful for bacterial use is Commercially available containing the genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017) And a bacterial origin of replication. this Such commercially available vectors include, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals , Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). You. These pBR322 "backbone" portions are compatible with a suitable promoter and to be expressed. Combined with the structural sequence.   Following transformation of the appropriate host strain and propagation of the host strain to an appropriate cell density, The selected promoter is a suitable means (eg, temperature shift or chemical induction) And the cells are cultured for an additional period.   Cells are typically harvested by centrifugation and applied by physical or chemical means. More disrupted and the resulting crude extract is retained for further purification.   Microbial cells used in protein expression include freeze-thaw cycles, supersonic By any convenient method, including sonication, mechanical disruption, or use of cell lysing agents. Can be crushed. Such methods are well-known to those skilled in the art.   Various mammalian cell culture systems have also been used to express recombinant proteins. Can be Examples of mammalian expression systems include those described in Gluzman, Cell, 23: 175 (1981). COS-7 strain of kidney fibroblasts and other cell lines capable of expressing compatible vectors (Eg, C127, 3T3, CHO, HeLa, and BHK cell lines). From mammals The current vector contains an origin of replication, appropriate promoters and enhancers, and optional Necessary ribosome binding sites, polyadenylation sites, splice donor sites and And splice acceptor sites, transcription termination sequences, and 5 'flanking inversion Includes transcripts. DNA sequence derived from the SV40 splice site, and polyadenylation The cleavage site can be used to provide the necessary non-transcribed genetic elements.   Breast-specific gene polypeptide can be obtained from recombinant cell culture by methods including: Can be recovered and purified from: ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, Ion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography Fee, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography -, Hydroxylapatite chromatography, and lectin chromatography Fee. If necessary, the protein refolding step It can be used to complete protein placement. Finally, high-performance liquid chromatography Chromatography (HPLC) can be used for the final purification step.   The polynucleotide of the present invention is a marker capable of purifying the polypeptide of the present invention. It may have the coding sequence fused in frame to the Kerr sequence. One of the marker sequences An example is a hexahistidine that can be supplied by a vector, preferably a pQE-9 vector. Gin tag, which, in the case of a bacterial host, To provide purification or when a mammalian host (eg, COS-7 cells) is used For example, the marker sequence can be a hemagglutinin (HA) tag. HA tag Fluenza hemagglutinin protein-derived epitope (Wilson, I. et al. Cell, 37: 767 (1984)).   The polypeptides of the present invention may be natural purified products or products of chemical synthetic procedures. Or a prokaryotic or eukaryotic host (eg, in culture) Bacterial, yeast, higher plants, insects, and mammalian cells) Can be done. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptide of the invention May be glycosylated or may be non-glycosylated. Departure The light polypeptide may also include the first methionine amino acid residue.   BSG1, and other breast-specific genes, and their protein products, Can be used for early detection of Because these are excessive in breast cancer It is because it is expressed.   According to another aspect of the present invention, a breast-specific gene or a breast-specific Assays that can be used to screen for therapeutics that inhibit the action of protein A is provided. The present invention has sufficient affinity to block its biological effects. To select therapeutic agents that form complexes with breast-specific gene proteins Show. In this method, the protein is immobilized on a support and natural substrates and Contacted with a known therapeutic agent, either simultaneously or sequentially, Compete therapeutically with natural substrates in a manner sufficient to prevent binding to that substrate A variety of assays are included, including competition assays to determine whether   In another embodiment, the substrate is immobilized on a support and labeled breast features. Heterogeneous polypeptides and therapeutic agents (or unlabeled proteins and labeled therapeutics) The amount of breast-specific polypeptide that has been contacted by both To determine if the therapeutic agent is reduced compared to the assay without the additive. It is. Breast-specific polypeptides can be labeled with an antibody.   Potential therapeutic compounds include antibodies and anti-idiotype antibodies as described above. Rare, or in some cases, oligonucleotides that bind to the polypeptide included.   Another example is an antisense construct prepared using antisense technology. This is directed to breast specific polynucleotides to block transcription. A Antisense technology is based on triple helix formation or antisense DNA or RNA. Both of these methods can be used to control gene expression, It is based on the binding of tide to DNA or RNA. For example, the mature poly The 5 'coding portion of the polynucleotide sequence encoding the peptide can be from about 10 to 40 in length. Used to design base-paired antisense RNA oligonucleotides. DNA Oligonucleotides are designed to be complementary to regions of the gene involved in transcription (Triple helix-Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Scien ce, 241: 456 (1988); and Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)). , Thereby inhibiting transcription and production of breast-specific polynucleotides. Ann The antisense RNA oligonucleotide hybridizes to the mRNA in vivo and Block translation of RNA molecules into breast-specific gene polypeptides (antisense Su-Okano, J .; Neurochem., 56: 560 (1991); antisense inhibitors of gene expression Oligodeoxynucleotides, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Up The oligonucleotides described above can also be delivered to cells, thereby RNA or DNA in vivo to inhibit the production of breast-specific polypeptides Can be expressed.   Another example is binding to a breast-specific polypeptide and occupying its active site, In doing so, the active site is added to the substrate so that normal biological activity is prevented. Small molecules that make them inaccessible. Examples of small molecules include small peptides or peptides. But not limited to them.   These compounds can be used to treat breast cancer. Because these are Breast-specific in a manner sufficient to inhibit the natural functions required for breast cancer cell survival It interacts with the function of the polypeptide. This is a fact. Because BSG and their protein products are mainly expressed in breast cancer tissue, This is because it is presumed that the formation of this state is decisive.   The compound is pharmaceutically acceptable, for example, as described herein below. It can be used in a composition with a carrier.   The compounds of the present invention may be used in combination with a suitable pharmaceutical carrier. this Such compositions comprise a therapeutically effective amount of the polypeptide, and a pharmaceutically acceptable carrier. Including excipients or excipients. Such carriers include saline, buffered saline Saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and combinations thereof Combinations include, but are not limited to. The prescription is tailored to the mode of administration Should be.   The invention also relates to one or more components filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the invention. A pharmaceutical pack or kit comprising the container of Such containers (single or Controls the manufacture, use, or sale of drugs or biological products Product labeling in a format prescribed by government agencies, which may be Represents an institutional approval in manufacture, use, or sale for administration. further Pharmaceutical compositions can be used in combination with other therapeutic compounds.   Pharmaceutical compositions include, for example, oral, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, nasal It may be administered in a convenient manner by the intracavitary, intraanal or intradermal route. The pharmaceutical composition is Is administered in an amount effective to treat and / or prevent a particular condition. Generally, pharmacy Composition is administered in an amount of at least about 10 μg / kg body weight, and often Are administered in an amount not to exceed about 8 mg / kg body weight per day. Often the dosage is Approximately 10 μg / kg to 1 mg / kg body weight per day, taking into account the administration route, symptoms, etc. It is.   Breast-specific genes and compounds, which are polypeptides, are also As indicated, may be used by expression of such polypeptides in vivo. This is often referred to as "gene therapy".   Thus, for example, a cell from a patient can be a polynucleotide encoding a polypeptide. Can be engineered ex vivo with tide (DNA or RNA) and then engineered cells Is provided to the patient to be treated with this polypeptide. Such a method is Well known in the art. For example, a cell may contain RNA encoding the polypeptide of the invention. Operate by procedures known in the art by use of contained retroviral particles Can be done.   Similarly, cells can be used, for example, to express the polypeptide for in vivo expression of the polypeptide. It can be manipulated in vivo by known procedures in the field. As is known in the art, To produce retroviral particles containing RNA encoding the light polypeptide Producing cells for manipulating cells in vivo and for in vivo production of polypep It can be administered to a patient for expression of the tide. By such a method, the polypeptide of the present invention can be used. These and other methods for administering peptides are known in the art from the teachings of the present invention. It is clear to the person. For example, expression vehicles for manipulating cells are retro It can be other than ills (eg, adenovirus). This is a proper delivery After combining with a vehicle, it can be used to manipulate cells in vivo.   The retrovirus from which the retroviral plasmid vector described above can be derived Lus includes Moloney mouse leukemia virus, spleen necrosis virus, Rous sarcoma Virus-like retrovirus, Harvey sarcoma virus, chicken leukemia virus Rus, gibbon leukemia virus, human immunodeficiency virus, adenovirus, Myeloproliferative sarcoma virus, and mammalian tumor viruses, It is not limited to. In one embodiment, a retroviral plasmid vector Is derived from Moloney murine leukemia virus.   Vectors include one or more promoters. Suitable promoters that can be used -Miller et al.,Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989) Retroviral LTR; SV40 promoter; and human cytomegalovirus (CM V) promoter, or any other promoter (eg, a eukaryotic cell promoter) (Including the histone, pol III, and β-actin promoters, , But not limited thereto. Other that could be used Adenovirus promoter, thymidine kinase Zea (TK) promoter, and B19 parvovirus promoter, It is not limited to these. The selection of an appropriate promoter will depend on the teachings contained herein. It will be apparent to those skilled in the art from the illustration.   The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention may be under the control of a suitable promoter. It is in. Suitable promoters that can be used include adenovirus promoters -(Eg, adenovirus major late promoter); or heterologous promoter (Eg, cytomegalovirus (CMV) promoter); RS virus (RSV) promoter Inducible promoters (eg, MMT promoter, metallothionein promoter) Heat shock promoter; albumin promoter; ApoAI pro Motor; human globin promoter; viral thymidine kinase promoter (Eg, herpes simplex thymidine kinase promoter); retroviral LTR (Including the modified retroviral LTR described herein above); β-actin promoter And; the human growth hormone promoter, but not limited thereto. No. A promoter can also be a natural promoter that controls the gene encoding the polypeptide. Motor.   The retroviral plasmid vector transduces the packaging cell line, Used to form production cell lines. Packages that can be transfected Miller,Human Gene Therapy, Volume 1, 5-14 (1990) PE501, PA317, ψ-2 as described in (in their entirety herein incorporated by reference). , Ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ψCRE, ψCRIP, GP + E-86, GP + envAm12 , And DAN cell lines. The vector is The packaging cells can be transduced by any means known in the art. like this Techniques include electroporation, the use of liposomes, and CaPOFourSinking But not limited thereto. As an alternative, retrovirus Plasmid vectors can be encapsulated in liposomes or bound to lipids And can then be administered to a host.   The producer cell line contains the nucleic acid sequence (s) encoding the polypeptide. Produce infectious retroviral vector particles. Then, such a retro ui Lus vector particles can eukaryotic cells either in vitro or in vivo. It can be used to transduce. The transduced eukaryotic cell is a polypeptide Expresses the nucleic acid sequence (s) encoding the code. Eukaryotes that can be transduced The biological cells include embryonic stem cells, embryonic sarcoma cells, hematopoietic stem cells, hepatocytes, Include fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells, and bronchial epithelial cells But not limited to these.   The present invention also relates to the use of the breast-specific gene of the present invention as a diagnostic. An example For example, some diseases are due to inherited defective genes. For example, breast Heterologous genes, CSG7 and CSG10, are expressed in breast cancer cells as compared to expression in normal cells. It has been found to have reduced expression. In addition, the remaining breast-specific The target gene is overexpressed in breast cancer. Therefore, in these genes Mutations allow detection of breast disorders (eg, breast cancer). Books at the DNA level Mutations in the breast-specific genes of the invention can be detected by various techniques. Examination Nucleic acids (genomic DNA, mRNA, etc.) used for cutting are blood, urine, saliva, tissue biopsy, And from non-breast patient cells, such as autopsy material. Genomic DNA , Can be used for direct detection, or PCR (Saiki et al.,Nature, 324: 163-166 (1986)) And can be amplified enzymatically prior to analysis. RNA or cDNA can also be used for the same purpose Can be used. As an example, a PCR primer that is complementary to a nucleic acid of the invention is To identify and analyze mutations in breast specific polynucleotides of the invention Can be used. For example, deletions and insertions are relative to the normal genotype of the amplified product. It can be detected by a change in size when compared. Point mutations can result in amplified DNA Radiolabeled breast-specific RNA or radiolabeled antisense DNA sequence Can be identified by hybridizing   Another good way to screen for mutations in specific segments of DNA after PCR amplification A well-established method is single-stranded conformational polymorphism (SSCP) analysis. The PCR product32P Prepared for SSCP by 10 cycles of re-amplification to incorporate -dCTP, 200- Digested with the appropriate restriction enzymes to produce a 300 bp fragment, and For 5 minutes and then immersed in ice. Then, the non-denatured (5% glycerol, 5% acrylamide). vac, D. and Dean, M., Human Mutation, 2: 404-414 (1993)).   Sequence differences between the reference gene and the “variant” can be determined by direct DNA sequencing. Can be revealed. In addition, cloned DNA segments are Can be used as a probe to detect. The sensitivity of this method is paired with PCR. It is greatly amplified when combined. For example, the sequencing primer may be modified Used with double-stranded PCR products or single-stranded template molecules generated by PCR You. Sequencing may be accomplished by conventional procedures using radiolabeled nucleotides. Or by an automatic sequencing procedure using a fluorescent tag.   Genetic testing based on DNA sequence differences can be performed on gels with or without denaturing agents. Achieved by detecting changes in the electrophoretic mobility of DNA fragments in obtain. Small sequence deletions and insertions are visualized by high-resolution gel electrophoresis. obtain. DNA fragments of different sequences are separated on denaturing formamide gradient gels. Can be separated. Here the mobility of different DNA fragments in the gel depends on their specificity In the gel at different locations according to the local or partial melting temperature (e.g., For example, Myers et al.Science, 230: 1242 (1985)). In addition, sequence changes (In certain small deletions) as changes in the pattern of DNA mobility Is detected.   Sequence changes at specific positions may also be attributed to nuclease protection assays (eg, RNas e-protection and S1 protection or chemical cleavage methods (eg, Cotton et al.,PNAS , USA, 85: 439 7-4401 (1985))).   Therefore, detection of a specific DNA sequence can be detected by hybridization, RNase protection, Cleavage, direct DNA sequencing, or the use of restriction enzymes (e.g., (RFLP)) and Southern blotting.   The sequences of the present invention are also valuable for chromosome identification. This sequence is Specifically target a specific location on a chromosome and hybridize to that location You. In addition, there is now a need to identify specific sites on the chromosome. Currently dyed Chromosome markers based on actual sequence data (repetitive polymorphisms) that can be used to label body positions There are few intellectualizing reagents. The mapping of DNA to chromosome according to the present invention This is an important first step in correlating the sequence of the gene with a gene associated with a disease.   Briefly, the sequence consists of the PCR primers (preferably 15-25 bp) from the cDNA. It can be mapped to a chromosome by preparation. 3 'untranslated domain computer solution The analysis does not span more than one exon in the genomic DNA, thus the amplification process Used to quickly select primers that complicate the process. Then these Primers are used for PCR screening of somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Used for logging. Only hybrids containing the human gene corresponding to the primer increased Produces wide fragments.   PCR mapping of somatic cell hybrids assigns specific DNA to specific chromosomes A quick procedure for Use the same oligonucleotide primer with the present invention Use a panel of fragments from a particular chromosome or similar format in a large A pool of genomic clones is used to achieve sublocalization. Can be achieved. Other mapping lists that can also be used to map to chromosomes The strategy was in situ hybridization, labeled flow sorting (float w-sorted) Prescreening using chromosomes and live chromosome-specific cDNA Includes preselection by hybridization to build a rally.   Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosome spreads (FISH) can be used to provide a precise chromosomal location in one step. This The technique can be used with cDNAs as short as 50 or 60 bases. Total technology For the theory, see Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, See Pergamon Press, New York (1988).   Once a sequence has been mapped to a precise chromosomal location, the physical The location can be correlated with the genetic map data. Such data is described, for example, in M cKusick, Mendelian Inheritance in Man (Johns Hopkins University Welch Med (available online from the ical Library). Then The relationship between a disease and a gene that maps to the same chromosomal region is described by linkage analysis (physical analysis). (Simultaneous inheritance of genes adjacent to the gene).   Next, differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals Need to decide. The mutation is observed in some or all affected individuals, If not observed in any normal individual, this mutation is a causative agent of the disease. It is.   At the current resolution of physical and genetic mapping techniques, disease A cDNA correctly located in a chromosomal region associated with a potential of between 50 and 500 It may be one of the causative genes. (This is a 1 megabase mapping resolution, And one gene per 20 kb).   The polypeptide, a fragment or other derivative thereof, or an analog thereof. Logs, or cells that express them, produce antibodies against them Can be used as an immunogen. These antibodies are, for example, polyclonal antibodies, Or it may be a monoclonal antibody. The present invention also provides chimeric antibodies, single chain antibodies, And production of humanized antibodies and Fab fragments or Fab expression libraries Things. Various procedures known in the art can be used to construct such antibodies and fragments. Can be used for the production of   Antibodies raised against polypeptides corresponding to the sequences of the present invention may be used to Obtained by direct injection of the polypeptide or by administration of the polypeptide to the animal. obtain. The animal is preferably non-human. Then obtained in this way The antibody binds to the polypeptide itself. Thus, the polypeptide flag Antibodies that bind to the entire native polypeptide, even sequences that encode only Can be used to generate Such an antibody is then Can be used to isolate polypeptides from tissues that express.   Antibodies produced by continuous culture of cell lines for preparation of monoclonal antibodies Any technique that provides a can be used. Examples include hybridoma technology (Kohle r and Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), trioma technology, human B cells Hybridoma technology (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), and human EBV hybridoma technology for producing noclonal antibodies (Cole et al., 1985, Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). It is.   The technology described for producing single-chain antibodies (U.S. Pat. Can be adapted to generate single-chain antibodies to light immunogenic polypeptide products . Transgenic mice can also be used to generate antibodies.   Antibodies can also be used to destroy, for example, breast cancer cells when they come in contact with them. In the method of drug interaction reagents, it can be used to target breast cancer cells. This is a fact. Because the antibody is specific for the breast-specific polypeptide of the invention. Because it is a target. Binding of the interaction reagent to the antibody binds the interaction reagent directly to the breast. Let me carry you.   This type of antibody can also be used, for example, to facilitate pelvic area and breast scanning. Can be used to perform in vivo imaging by labeling the antibody for . One method for diagnostic imaging includes any cancer cells of the breast to be imaged, Contacting an anti-breast specific protein antibody labeled with a detectable marker Include. This method allows the labeled antibody to bind to the breast-specific polypeptide. It is performed under such conditions. In certain instances, the antibody is expressed in a breast (eg, a breast cancer cell). ) And fluoresces when in contact, resulting in breast imaging And the visibility is amplified to allow the determination of diseased or non-diseased breast conditions You.   The invention will be further described with reference to the following examples; It should be understood that the present invention is not limited to such an embodiment. All parts or quantity Are by weight unless otherwise specified.   To facilitate understanding of the following examples, certain methods and / or Or terms are described.   “Plasmids” are preceded by a lowercase p and / or a subsequent uppercase letter. And / or numbers. The starting plasmid herein is It is commercially available, publicly available without restriction, or according to published procedures. Can be constructed from available plasmids. In addition, the described plasmid Equivalent plasmids are known in the art and will be apparent to those skilled in the art. You.   `` Digestion '' of DNA involves touching it with a restriction enzyme that acts only at certain sequences in the DNA. It means to cut by a medium reaction. The various restriction enzymes used herein are commercially available. Are sold and their reaction conditions, cofactors, and other requirements are The known ones were used. For analytical purposes, typically 1 μg of plasmid Or DNA fragment is used in about 20 μl of buffer solution with about 2 units of enzyme Is done. For the purpose of isolating DNA fragments for plasmid construction, Typically, 5-50 μg of DNA is used in larger volumes with 20-250 units of enzyme. Digested. Appropriate buffers and substrate amounts for particular restriction enzymes can be determined by the manufacturer. Specified. An incubation time of about 1 hour at 37 ° C is usually used, This can vary according to the supplier's instructions. After digestion, the reaction is The desired fragment is isolated by direct electrophoresis on a gel.   Size separation of cleavage fragments is described in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Lab. oratory Manual] 1% TAE agar described in Cold Spring Laboratory Press, (1989) This is done using a loin gel.   "Oligonucleotide" refers to a single-stranded polydeoxynucleotide or two phases. Refers to any of the complementary polydeoxynucleotide chains, which are chemically synthesized Can be Such synthetic oligonucleotides do not have a 5 'phosphate and thus If you do not add phosphate with ATP in the presence of Do not connect. Synthetic oligonucleotides are non-dephosphorylated fragments Connect to   "Ligation" forms a phosphodiester bond between two double-stranded nucleic acid fragments. (Maniatis, T et al., Supra, p. 146). If not provided otherwise, Ligation is performed using known buffers and conditions, using approximately equimolar amounts of the DNA to be ligated. Achieved using 10 units of T4 DNA ligase (“ligase”) per 0.5 μg of fragment Can be done.   Unless otherwise stated, Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52: 456-45. 7 (1973). Transformation was performed as described in Method 7 (1973).                                 Example 1 Measuring transcription of breast-specific genes   To evaluate the presence or absence of active transcription of breast-specific gene RNA, Standard venous puncture technique using approximately 6 ml of venous blood in heparinized tubes Obtained using The whole blood is mixed with an equal volume of phosphate buffered saline, which is then 8 ml Ficoll (Pharmacia, Uppsala, Sweden) in a 15-ml polystyrene tube On top. The gradient is centrifuged at 1800 × g for 20 minutes at 5 ° C. Lymphocytes and Carefully aspirate the granulocyte layer (approximately 5 ml) and reconstitute in a 50 ml tube to Re-dilute in phosphate buffered saline and centrifuge again at 1800 × g for 20 minutes at 5 ° C. Let go. Discard the supernatant and pellet containing nucleated cells as described by the manufacturer. For RNA extraction using the RNazole B method (Tel-Test Inc., Friends wood, TX).   In order to measure the amount of mRNA from the gene of interest, the coding portion is shown in FIGS. No. 1 to 20) at least the mRNA sequence transcribed from the human gene including the DNA sequence Probes are designed to have partial identity. RN extracted from this probe A and mix the mixed DNA and RNA with ethanol (-70 ° C for 15 minutes ) Precipitate. The pellet is resuspended in hybridization buffer and And dissolve. Tube containing this mixture is placed in water at 72 ° C to denature DNA. Incubate in bath for 10-15 minutes. Transfer the tube to the desired hybrid Transfer into water bath quickly at solution temperature. Hybridization temperature is DN It depends on the content of G + C in A. Hybridization is performed for 3 hours . Add 0.3 ml nuclease-S1 buffer and mix well. 50 μl 4.0 The reaction is stopped by adding M ammonium acetate and 0.1 M EDTA. This mixture Extract with phenol / chloroform and add 20 μg of carrier tRNA and add With an equal volume of isopropanol. Dissolve the precipitate in 40 μl TE (pH 7.4) Dissolve and run on an alkaline agarose gel. After electrophoresis, trace RNA was sequenced And confirm the nucleotide sequence. (For a more detailed overview, see Favaloro, J. Et al., Mothods Enzymol., 65: 718 (1980)).   Amplifies a sequence isolated from two oligonucleotide primers by the above method Use to The 5 'primer is 20 nucleotides long and the 3' primer Is a sequence complementary to the 3 'end of the isolated mRNA. Primers were isolated from the isolated mR Custom design according to NA. Reverse transcription and PCR amplification were performed using the Perkin Elmer 9600 P Performed continuously without interruption in CR machines (Emeryville, CA). 20 μl diethyl Place 400 ng of total RNA in pyrocarbonate-treated water in a 65 ° C water bath for 5 minutes, then Cool on ice immediately before adding the PCR reagents. The total PCR volume of 50-μl is 2.5 Unit Taq polymerase (Perkin-Elmer), 2 units chicken myeloblastosis virus reverse Transcriptase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN); 200 μM of each dCTP, dATP, dGTP and dTTP (Perkin Elmer); 18 pM each primer, 10 mM Tris-HCl; 50 mM  KCl; and 2 mM MgClTwo(Perkin Elmer). The PCR conditions are as follows : Cycle 1 at 42 ° C. for 15 minutes, then at 97 ° C. for 15 seconds (1 cycle); Cycle 2 Cycle at 95 ° C for 1 minute, at 60 ° C for 1 minute, and at 72 ° C for 30 seconds (15 cycles); For 3 minutes at 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute (10 cycles); Cycle 4 at 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes (8 cycles) Cycle 5 for 15 minutes at 72 ° C. (one cycle); Hold at 4 ° C. until the bottle is removed from the machine. Vacuum 50-μl of PCR product Concentrate to 10 μl by centrifugation and then wash the sample with ethidium bromide. Run on a thin 1.2% Tris-borate-EDTA agarose gel containing Expected size Indicates that the gene is present in the assayed tissue. In pellet Can be quantified in a number of ways. For example, it may weigh.   Confirmation of the nucleotide sequence of the PCR product is performed by microsequencing. PCR products Using the Qiagen PCR Product Purification Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) Purify as described by the manufacturer. 1 μg of the PCR product was added to Tag DyeDeoxy Ter Use the minator Cycle sequencing kit on a Perkin-Elmer 9600 PCR machine. PCR sequencing as described by Applied Biosystems (Foster, CA). Offer. The sequencing product was applied to a Centri-Sep column (Princeton Separations, Adelphia , NJ) as described by this company. Then this product ABI model 373A DNA sequencing with Macintosh IIci computer Analyze using the system (Applied Biosystems).                                 Example 2 BSG For bacterial expression and purification of proteins and preparation of monoclonal antibodies use   The DNA sequence encoding the polypeptide of the present invention (in this example, BSG1 (ATCC Accession No. 97175)), the 5 'sequence of the protein and a vector for the protein. Amplification is first performed using PCR oligonucleotide primers corresponding to sequence 3 '. Was. Additional nucleotides corresponding to the DNA sequence were added to the 5 'and 3' sequences, respectively. Add. The 5 'oligonucleotide primer has the sequence 5' GCCACCATGGATGTTTTCAAG3 '(SEQ ID NO: 21) and have an NcoI restriction enzyme site, followed by the processed protein It may include a coding sequence of 15 nucleotides starting from the first amino acid of the protein. 3 ' The sequence 5′GCGCAGATCTGTCTCCCCCACTCTGGGC 3 ′ (SEQ ID NO: 22) is a BglII restriction enzyme Rank And a sequence that is complementary to Includes otide nucleic acid sequences. Restriction enzyme sites were determined using a bacterial expression vector, pQE-60 (Qiagen , Inc. Chatsworth, CA). pQE-60 is antibiotic resistant (Ampr), Bacterial origin of replication (ori), IPTG regulatable promoter operator (P / O), a ribosome binding site (RBS), a 6-His tag, and a restriction enzyme site You. Then, pQE-60 is digested with NcoI and BglII. Proliferation sequence linked to pQE-60 And in-frame with respect to the sequence encoding the histidine tag and RBS insert. Then, using the ligation mixture,E . coliStrain M15 / rep4 (Qiagen) ok, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory.  Transform by the procedure described in Press, (1989). M15 / rep4 is plasmid pREP 4 containing multiple copies, which express the lacI repressor and Thin resistance (Kanr) Is also given. Their ability to grow transformants on LB plates Identify by force and select ampicillin / kanamycin resistant colonies. Plasmid DNA is isolated and confirmed by restriction analysis.   Clones containing the desired construct were cloned into both Amp (100 μg / ml) and Kan (25 μg / ml). Grow overnight (O / N) in liquid culture in LB medium supplemented with either. Use O / N culture And inoculate a large culture at a ratio of 1: 100 to 1: 250. Cells are grown at an optical density of 600 (O.D. .600) Were grown to between 0.4 and 0.6. Then IPTG ("isopropyl -B-D-thiogalactopyranoside ") to a final concentration of 1 mM. IPTG is lacI P / O to increase gene expression by inactivating the repressor Induce release. The cells are grown for an additional 3-4 hours. The cells are then centrifuged To recover. Cell pellets can be treated with the chaotropic agent 6M guanidine HCl Solubilize. After clarification, the solubilized protein is converted to a protein containing a 6-His tag. For chromatography on nickel chelate columns under tighter binding conditions From this solution (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1 984)). BGS1 protein (> 90% pure) is loaded from the column with 6M guanidine HCl pH 5.0 For elution and for regeneration purposes, 3 M guanidine HCl, 100 mM sodium phosphate Adjust to 10 mM glutathione (reduced form) and 2 mM glutathione (oxidized form) You. After a 12 hour incubation in this solution, the protein was Dialyze against thorium.   Proteins purified in this way are specific for such proteins. It can be used as an epitope to produce nal antibodies. Isolated tampa Monoclonal antibodies raised against the polypeptide of the polypeptide Administering the polypeptide by direct injection of the peptide or to an animal Can be obtained by The antibody thus obtained is then used for its protein. Combine to the quality itself. Such antibodies then convert the protein to the polypeptide. For isolation from tissues expressing the tide, e.g., using an ELISA assay. You can be.                                 Example 3 Preparation of cDNA library from breast tissue   Total cellular RNA was prepared by the guanidinium phenol method as previously described (P. Chomczy). nski and N.M. Sacchi, Anal. Biochem.,162: 156-159 (1987)), RNAzol (C Inna-Biotecx) is used to prepare the tissue. Includes further ethanol precipitation of RNA Confuse. Poly A mRNA was synthesized using oligo dT-coated latex beads (Qiagen). , Isolated from total RNA. If a sufficient amount of total RNA is available, double-select polyA To ensure better separation from non-polyadenylated material.   Oligo dT-selected mRNA was analyzed by Gobbler and Hoffman (Gobbler, U. and B.J. . Hoffman, 1983, Gene,twenty five: 263) for cDNA synthesis by modification of the method. First-strand synthesis is performed using Moloney murine sarcoma virus reverse transcriptase (Stratagene) or Sup erscript II (RNase H without Moloney mouse reverse transcriptase, Gibco-BRL) Is performed using First-strand synthesis,Xho Primer / linker containing I restriction enzyme site Start with. The mixture of nucleotides used for synthesis is controlled within the cDNA sequence. Contains methylated dCTP to prevent restriction enzyme digestion. For second-strand synthesis Using the E. coli polymerase Klenow fragment, and [32P] -dATP, Incorporate as a tracer for incorporation of otide.   Following second strand synthesis, the cDNA is replaced with T4 DNA polymerase or Klenow fragment. Using either of the above, blunt-end.Eco Add RI adapter to cDNA and add CDNAXho Digest with I. Transfer the cDNA to a Sephacryl S-500 column (Pharmacia ) To remove excess linker and cDNA of less than about 500 base pairs.   cDNA was unidirectionally transformed with pBluescript II phagemid or λUni-zap XR (Strat agene)Eco RI-Xho Clone to I site. Black to pBluescript II The plasmid,E.coli SURE competent cells (Stratagene Electroporate to). When cloning cDNA into Uni-Zap XR , Packaging using Gigipack II packaging extract (Stratagene) You. SURE cells are infected and amplified with packaging phage. cDNA insert From the λZap phage to the helper phage ExAs Excision using sist (Stratagene). The recovered phagemids areE.coliFine Seeds on vesicles (Stratagene).Preparation of sequencing templates   Prepare template DNA for sequencing by 1) boiling or 2) PCR amplification .   The boiling method is described in Holmes and Quigley (Holmes, DS and M. Quigley, 1981, Anal. .Biochem.,114: 193). Bluescript II or recovered Bl Enrich for colonies from any of the cDNAs cloned into uescript phagemid Grow overnight in condensed bacterial medium. 400 μl of cells are centrifuged and lysozyme (80 μg / ml) and RNase A (4 μg / ml) in STET (0.1 M NaCl, 10 mM TRIS pH 8.0, Resuspend in 1.0 mM EDTA and 5% Triton X-100). Boil cells for 40 seconds, Then centrifuge for 10 minutes. Remove the supernatant and precipitate the DNA with PEG / NaCl And wash with 70% ethanol (2x). Resuspend the template in water at about 250ng / μl It becomes cloudy.   Preparation of templates by PCR is described in Rosenthal et al. (Rosenthal et al., Nucleic Acids Res., 19 93,twenty one: 173-174). pBluescript II or recovered pBluesc Colonies containing the cDNA cloned into the ript phagemid Grow overnight in 96-well tissue culture plates in LB containing. 2 μl saw From the Tricine buffer system (Ponce and Micol., Nucleic Acids Res. ., 1992,20: 1992) and 200 μM dNTPs as templates in PCR reactions (Saiki, RK, et al., Science,239: 487-493, 1988; and Saiki, RK, et al., Sci. ence,2301350-1354, 1985). The primer set selected for template amplification Outside of the primer set selected for sequencing of the type. Used The primer is 5'-ATGCTTCCGGCTCGTATG-3 '(SEQ ID NO: 23) (this is in pBluescript 5 'of the M13 reverse sequence at), and 5'-GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3' (SEQ ID NO: 24) (This is 3 'of the M13 forward primer in pBluescript). M13 order and Any primer corresponding to the sequence adjacent to the reverse sequence can be used. Perkin-Elmer 9 Amplify the template using a 600 thermocycler under the following cycler conditions: At 94 ° C for 1 minute (1 cycle); (at 94 ° C for 20 seconds); at 55 ° C for 20 seconds (at 72 ° C for 1 minute) ( 30 cycles); 7 minutes at 72 ° C (1 cycle). Following amplification, the PCR template was replaced with PEG / N Precipitate with aCl and wash three times with 70% ethanol. Mold in water Resuspend.                                 Example 4 Isolation of selected clones from breast tissue   A cDNA library prepared from human breast tissue using two approaches These specific clones are isolated.   First, clones are directly libraryd using oligonucleotide probes. Isolated by screening. To isolate a specific clone , A specific oligonucleotide having 30-40 nucleotides, Using a DNA synthesizer, synthesize according to one of the partial sequences described in this application. Oh Rigonucleotides using T4 polynucleotide kinase32Labeled with P- -ATP And standard protocols (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manu al, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY, 1982). λc DNA library on 1.5% agar plate, density 20,000-50,000pfu / 150mm And sow the seeds. These plates are plated using standard phage strains using Nylon membranes. Screen according to the cleaning protocol (Stratagene, 1993). Details The Nylon membrane with denatured and immobilized phage DNA was applied to 6 × SSC, 20 mM NaHTwoPOFour, 0.4% SDS, denatured 500 μg / ml 5 × Denhardt, sonicated Prehybridize in salmon sperm DNA and 6 × SSC, 0.1% SDS. 1 o'clock Preha After the hybridization, the membrane was washed with hybridization buffer (6 × SSC, 20 mM).  NaHTwoPOFour, 0.4% SDS, 500μg / ml denatured and sonicated salmon sperm DNA) No, 1 × 106cpm / ml32Hybridize overnight at 42 ° C with P-probe. Membrane, 45 ~ Wash at 50 ° C with wash buffer (6x SSC, 0.1% SDS) for 20-30 minutes, dry and wash To Kodak X-ray film overnight. Positive clones are isolated, and secondary, Purify by tertiary screening. Identity to the subsequence described in this application Purified clones are sequenced to verify   Another approach to screen cDNA libraries prepared from human breast tissue The first step is to prepare DNA probes corresponding to the entire partial sequence. Adjust the probe To produce two 17-20 nucleotides from both ends of the reported subsequence. Oligonucleotide primers are synthesized and purified. These two cages Using oligonucleotides to amplify the probe using the cDNA library template. Width. DNA template was prepared from phage lysate of cDNA library using standard phage DNA Prepare according to the preparation protocol (Maniatis et al.). Polymerase chain reaction to 0.5 Perform in 25 μl reaction mixture using μg of the above cDNA template. The reaction mixture is 1. 5-5mM MgClTwo, 0.01% (w / v) gelatin, 20 μM of each dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pm ol of each primer, and 0.25 Unit of Taq polymerase. 35 cycle PC R (denaturation at 94 ° C. for 1 minute; annealing at 55 ° C. for 1 minute; extension at 72 ° C. for 1 minute) Performed using a Perkin-Elmer Cetus automated thermal cycler. The amplified product Analyzed by agarose gel electrophoresis, and a DNA band with the expected molecular weight Excise and purify the drug. PCR products, DNA products are subcloned and Confirm the identity of the probe by sequencing. Multip probe Specific activity <1 × 10 with rime DNA Labeling System (Amersham)9dmp / μg Understand. Using this probe, according to the protocol of Stratagene, λ cDNA live Rally screening. Hybridization was performed using 5 × TEN 920XTEN (0. 3M Tris-HCl pH 8.0, 0.02M EDTA and 3M NaCl), 5x Denhartdt's, 0.5% Sodium pyrophosphate, 0.1% SDS, heat-denatured salmon sperm DNA at 0.2 mg / ml, and 1 × 106cpm / ml [32Performed at 55 ° C. for 12 hours using a P] -labeled probe. Filters are placed in 0.5X TEN at room temperature for 20-30 minutes, then at 55 ° C for 15 minutes while Wash. Dry the filter and use Kodak XAR-5 film at -70 ° C To autoradiograph. Positive clones are screened for second and third screens. And purify. Confirm the sequence of the isolated clone by DNA sequencing. You.   The general procedure for obtaining the complete sequence from the subsequences described herein is: Summarized as follows: Step 1   From partial sequence clones (cDNA clones sequenced to obtain partial sequences) The selected human DNA of, for example,EcoEndonuclease digestion using -RI Isolation of clones by electrophoresis and removal from low-melting agarose gels And purify. The isolated insert DNA is, for example,32By P-label, preferably Radiolabeled by nick translation or random primer labeling I do. Using the labeled insert as a probe, a λ phage cDNA library Or screen a plasmid cDNA library. Related to the probe cDNA Colonies containing the clones are identified and purified by known purification methods. new Nucleotide sequencing of ends of properly purified clones to identify full-length sequence . Complete sequencing of full-length clones is then performed by Exonuclease III digestion or Performed by immersion walking. A small number of the deposited clones from which the partial sequence was obtained Northern blot of mRNA from various tissues using at least a part as a probe As needed to determine the size of mRNA relative to what is considered full-length cDNA. obtain.   Procedures 2 and 3 below were performed using clones isolated from the deposited clone mixture. Does not contain the full-length sequence, the full-length gene or full-length coding Can be used to LA from human breast tissue or from the deposited clonal mixture Is the library also a source other than the mixture deposited using the subsequences of the invention? It is applicable to obtain a full-length sequence from the obtained clone. Step 2 RACE protocol for full-length gene recovery   Partial cDNA clones were obtained from Frohman, M.A., Dush, M.K., and Martin, G.R. (198 8) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA,85: Rapid increase of cDNA ends described in 8998-9002 By using the width (RACE) procedure, full length can be achieved. Either 5 'or 3' end CDNA clones deficient in the translation start or stop codon Reconstructed to include the missing base pair. In most cases, cDNA Missing start of translation. The following briefly describes a modification of this original 5'RACE procedure. Put on. Poly A + or total RNA is analyzed for Superscript II (Gibco / BRL) and cDNA sequences. Reverse transcribe with a different antisense or complementary primer. Primer, Micr Remove from reaction with ocon Concentrator (Amicon). Then, the end of the first strand cDNA With dATP and terminal deoxynucleotide transferase (Gibco / BRL) You. Thus, an anchor sequence required for PCR amplification is generated. Second strand, PCR buffer DA-tail, Taq DNA polymerase (Perkin-Elmer Cetus), three adjacent Restriction enzyme site (XhoI,SalI andClaAn oligo-dT primer containing (I) at the 5 ′ end, and And primers containing only these restriction sites. This double-stranded cDNA is During the cycle, the same primers as well as nested cDNA-specific anti- Perform PCR amplification with sense primers. Transfer the PCR product to ethidium bromide-agarose Size separation on a sgel and predict the expected size of DNA encoding the defective protein. The region of the gel containing the cDNA product is excised. Use the cDNA for the Magic PCR Prep Kit (P romega) using agarose,XhoI orSalRestriction enzyme digestion using I And into a plasmid such as pBluescript SKII (Stratagene)ShoI andEc o Binds at the RV site. This DNA is transformed into bacteria and the plasmid clone is The sequence is sequenced to identify the correct protein coding insert. correct The 5 'end is combined with homologs and partial cDNA clones that have putatively identified this sequence. Confirm by comparing with duplicates.   Several quality control kits are commercially available. Reagents similar to those above and The method is supplied in kit form from Gibco / BRL. The second kit is Clontec available from the relevant technology, Dumas et al. (Dumas, J.B., Edwards, M., Delort, J. and Mallet, Jr., 1991, Nucleic Acids Res.,19: 5227-5232 ) Is a modification of SLIC (single stranded binding to single stranded cDNA) developed by Main steps The major difference is that RNA is alkaline hydrolyzed after reverse transcription, and Is used to bind the anchor primer containing the restriction enzyme site to the first strand cDNA. That is to be. This is a poly-T stress that is difficult to sequence beyond. Eliminates the need for a dA-tailing reaction, which results in   As an alternative to producing 5 'cDNA from RNA, use cDNA library double-stranded DNA. May be used. Asymmetric PCR amplification of antisense cDNA strand Specific primers and plasmid-anchored primers Combine. These primers were removed and the symmetric PCR reaction was performed using a shortened cDNA- This is done with specific antisense primers and primers linked to a plasmid. Step 3 RNA ligase protocol for producing 5 'end sequences to obtain full length genes   Once the gene of interest has been identified, several methods are available for the original deposited clone. Can be used to identify the 5 'or 3' portions of genes that may not be present in the region. this These methods include specific probes and protocols similar and identical to 5 'and 3' RACE. Filter probing using a col, clone enrichment (enrich ment), but is not limited thereto. Full length gene is in library And can be identified by probing, while having the ability to produce a 5 'end. Method yields missing information from existing sequence information from the original subsequence It is used for. A similar method to 5'RACE is used to delete the desired full-length gene. Available to produce a 5 'end. (This method is based on Fromont-Racine et al. Nucleic Acids Res., 21 (7): 1683-1684 (1993)). Briefly A specific RNA oligonucleotide, an RN putatively containing a full-length gene RNA transcript A, and primers containing primers specific for the ligated RNA oligonucleotide Ligated to the 5 'end of the population. Specific to the known sequence (EST) of the gene of interest The PCR primer is used to amplify the 5 'portion of the desired full-length gene using a unique primer. this is, It can then be sequenced and used to produce the full length gene. This one The method begins with total RNA isolated from the desired source and poly A RNA may be used, This step is not required. The RNA preparation is then purified 5 ′ of the degraded or damaged RNA. Phosphate groups, which can interfere with subsequent RNA ligase steps, need to be eliminated. Can be treated with phosphatase. Then the phosphatase (if used ), Inactivate and cap present at the 5 'end of the messenger RNA The RNA is treated with tobacco acid pyrophosphatase to remove the structure. this The reaction leaves a 5 'phosphate group at the 5' end of the capped RNA, which in turn , Bind to the RNA oligonucleotide using T4 RNA ligase. Then this Modified RNA preparations, first-strand cDNA using gene-specific oligonucleotides Can be used as a template for synthesis. The first strand synthesis reaction is then combined with the bound RNA. Oligonucleotide-specific primers and the known sequence of the gene of interest (EST ) With primers specific to the desired 5 'end as a template for PCR amplification. Can be. The resulting product was then sequenced and analyzed to determine the 5 'terminal sequence. Make sure that belongs to the subsequence.                                 Example 5 Cloning and expression of BSG1 using baculovirus expression system   The DNA sequence encoding the full length BSG1 protein (ATCC Accession No. 97175) is PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' Amplified using:   The 5 'primer has the sequence 5'-AAAGGATCCCCCGCCATCATGGATGTTTTCAAGAAG 3 '(sequence number No. 25) and a BamHI restriction enzyme site (bold) followed by the BSG1 gene ( Translation initiation in eukaryotic cells (underlined translation initiation codon "ATG") 8 nucleotides (Kozak, M., J. Mol. Biol. , 196: 947-950 (1987)).   The 3 'primer is the sequence 5' AAATCTAGACTAGTCTCCCCCACTCTG 3 '(SEQ ID NO: 26) And the restriction endonuclease XbaI cleavage site and 3 ′ of this BSG1 gene Contains 21 nucleotides complementary to the sequence. The amplified sequence is transferred to a commercially available kit ("Gene clean "BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) from a 1% agarose gel. did. This fragment is then digested with the endonucleases BamHI and XbaI. And then again purified on a 1% agarose gel. Name this fragment F2 I do.   The vector pA2 (a modified version of the pVL941 vector, described below) was transformed into a baculovirus expression system. (For a review, see Summers, M.D.) . And Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors an d insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Statio n Bulletin No. 1555). This expression vector contains the Autographa callif ornica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) strong polyhedrin promoter, it Followed by recognition sites for the restriction endonucleases BamHI and XbaI. Simianu Use the polyadenylation site of ls (SV) 40 for efficient polyadenylation You. For easy selection of recombinant viruses, E. coli. β-galactosidase from E. coli The polyhedrin promoter followed by the polyhedrin gene Insert in the same direction as the adenylation signal. The polyhedrin sequence is The virus sequence for cell-mediated homologous recombination of the isolated wild-type viral DNA. Adjacent at the edge. Many other baculovirus vectors are used in place of pA2 Can be For example, pRG1, pAc373, pVL941, and pAcIM1 (Luckow, V.A. And Summers, M.D., Virology, 170: 31-39).   The plasmid is digested with the restriction enzymes BamHI and XbaI and digested with procedures known in the art. And dephosphorylated using calf intestinal phosphatase. The DNA is then transferred to a commercially available key. 1% agarose using a kit ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.) Isolated from gel. This vector DNA is called V2.   Fragment F2 and dephosphorylated plasmid pA2 were used with T4 DNA ligase. And connected. Then, E. E. coli HB101 cells and transform the enzymes BamHI and Of bacteria containing BSG1 gene-containing plasmid (pBacBSG1) using XbaI and XbaI did. The sequence of the cloned fragment was confirmed by DNA sequencing.   5 μg of the plasmid pBacBSG1 was ligated with the lipofection method (Felgner et al. Proc. Natl. . Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)). Baculovirus ("BaculoGoldTM baculovirus DNA ", Pharmingen, San Dieg o, CA.).   1 μg BaculoGoldTM50 μl of viral DNA and 5 μg of plasmid pBacBSG1 Containing serum-free Grace's medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) K Mixing in sterile wells of a rotiter plate. Then, 10 μl of Lipofecti And 90 μl of Grace's medium, mix and incubate at room temperature for 15 minutes. I did it. The transfection mixture was then combined with serum-free Grace Sf9 insect cells (ATCC CR) seeded in 35 mm tissue culture plates containing 1 ml of medium L 1711). Plate to mix the newly added solution Then, it was vibrated back and forth. The plate was then incubated at 27 ° C for 5 hours. After 5 hours, the transfection solution was removed from the plate and 10% calf 1 ml of Grace insect medium supplemented with baby serum was added. Plate incubator And the culture was continued at 27 ° C. for 4 days.   After 4 days, the supernatant was collected and as described by Summers and Smith (supra). A plaque assay was performed. As an alternative, the blue stained plaque "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) Agarose gel was used. (A detailed description of the "plaque assay" Insect cell culture and baculo distributed by Life Technologies Inc., Gaithersburg (It can also be found in the Virology User Guide (pages 9-10)).   Four days after serial dilution, virus was added to cells and blue stained plaques were removed. I picked it up with the tip of an Eppendorf pipette. Then, the agar containing the recombinant virus Was resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl Grace's medium. Agar , Removed by brief centrifugation, and the supernatant containing the recombinant baculovirus, It was used to infect Sf9 cells seeded on a 35 mm dish. Four days later, this The supernatant of these culture dishes was collected and then stored at 4 ° C.   Sf9 cells were grown in Grace medium supplemented with 10% heat inactivated FBS. Cells At a multiplicity of infection (MOI) of 2, the cells were infected with the recombinant baculovirus V-BSG1. 6 hours Afterwards, the medium was removed and SF900 II medium without methionine and cysteine ( Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 hours later, 5 μCi35 S-methionine and 5 μCi35S-cysteine (Amersham) was added. Cells Incubate for an additional 16 hours, after which cells are collected by centrifugation and Identified proteins were visualized by SDS-PAGE and autoradiography .                                 Example 6 COS Expression of recombinant BSG1 in cells   Induction of plasmid and BSG1 HA expression from vector pcDNAI / Amp (Invitrogen) I do. The vector pcDNAI / Amp contains the following: 1) SV40 origin of replication, 2) Ampici Phosphorus resistance gene, 3) E. coli origin of replication, 4) polylinker region, SV40 intro And a CMV promoter followed by a polyadenylation site. The whole precursor and part 3 'A DNA fragment encoding the HA tag fused in-frame to the end And cloned into the polylinker region of Therefore, recombinant protein expression is Controlled by the CMV promoter. The HA tag was described previously (I. Wilson, H.N. iman, R.A. Heighten, A Cherenson, M.S. Connolly, and R. Lerner, 1984, Cell  37,767 (1984)) epitome derived from influenza hemagglutinin protein Corresponding to the Recognition of HA epitope by fusion of HA tag to target protein This allows easy detection of recombinant proteins using different antibodies.   The plasmid construction strategy is described below:   The DNA sequence encoding BSG1 (ATCC Accession No. 97175) was Constructed by PCR using a primer: 5 'primer AAAGGATCCCCCGCCATCATGGATGTT TTCAAGAAG 3 ′ (SEQ ID NO: 27) is a BamHI site followed by a B starting from the start codon. Contains 18 nucleotides of SG1 coding sequence; 3 'sequence AAATCTAGACTAAAGCGTAGTCTGGGAC GTCGTATGGGTACTCCTGGGGTCTCCCCCACTCTGGGC 3 ′ (SEQ ID NO: 28) has an XbaI site, Translation stop codon, HA tag, and last 18 nucleotides of BamHI coding sequence (stop (Excluding codons). Therefore, the PCR product has a BamHI site, BSG1 coding sequence followed by HA tag fused in frame, translation termination adjacent to HA tag Includes a termination codon, and an XbaI site. PCR amplified DNA fragments and vectors (PcDNAI / Amp) was digested with BamHI and XbaI restriction enzymes and ligated . The ligation mixture is coli SURE strain (Stratagene Cloning Systems, 11099 North (Available from Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037). The replacement culture was plated on ampicillin medium plates and resistant colonies were selected. . Plasmid DNA is isolated from transformants and the presence of the correct fragment It was determined by restriction enzyme analysis. For expression of recombinant BSG protein, COS cells were transformed into DEAE-D EX TRAN method (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Labor atory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)) Transfected. Radiolabeling and immunoprecipitation of BSG HA protein expression (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, C old Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Transfect the cells Two days after35Labeled with S-cysteine for 8 hours. The culture medium is then recovered and Cells with detergent (RIPA buffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% N P-40, 0.5% DOC, 50 mM Tris (pH7.5)) (Wilson, I. et al., Supra, 37: 767 (1. 984)). Both the cell lysate and the culture medium use HA-specific monoclonal antibodies And settled. The precipitated proteins were analyzed on a 15% SDS-PAGE gel.   Many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings, Within the scope of the appended claims, the invention may be practiced other than as specifically described. .

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12N 5/10 C12N 5/00 A C12Q 1/68 A61K 37/02 ADU

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．単離されたポリヌクレオチドであって、以下： (a) 図１（配列番号１）に記載のポリヌクレオチドと同一のポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチド； (b) 図２〜20（配列番号２〜20）の１つに記載のDNAと少なくとも90％の同一 性を有するDNAを含むコード部分を有するヒト遺伝子と同一の成熟ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド； (c) (a)のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、そしてそのポリヌクレオチ ドと少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチド；および (d) 寄託されたクローンに含まれるDNAと少なくとも90％の同一性を有するDNA を含むコード部分を有するヒト遺伝子と同一の成熟ポリペプチドをコードするポ リヌクレオチド、 からなる群から選択されるメンバーを含む、単離されたポリヌクレオチド。 ２．前記ヒト遺伝子が前記寄託されたクローンに含まれるDNAを含む、請求項１ に記載のポリヌクレオチド。 ３．前記メンバーが図１（配列番号１）のポリヌクレオチドと同一のポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 ４．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 ５．請求項４に記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細 胞。 ６．請求項４に記載のベクターで細胞を遺伝子操作する工程を包含する、ポリペ プチドを発現し得る細胞を産生するための方法。 ７．請求項５に記載の宿主細胞から、前記ポリヌクレオチドによりコードされる ポリペプチドを発現する工程を包含する、ポリペプチドを産生するための方法。 ８．ポリペプチドであって、以下： (i) ヒト遺伝子によりコードされるポリペプチドであって、該ヒト遺伝子が、 そのDNAが図２〜20（配列番号２〜20）の１つのDNAに少なくとも90％の同一性を 有するコード部分を有する、ポリペプチド； (ii) 図１（配列番号１）に記載の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、 ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体；および (iii) そのコード領域が寄託されたクローンに含まれるDNAと少なくとも90％ の同一性を有するDNAを含む該ヒト遺伝子によりコードされるポリペプチド、な らびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体、 からなる群から選択されるメンバーを含むポリペプチド。 ９．前記ポリペプチドが図１（配列番号１）に記載の推定のアミノ酸配列を有す る、請求項８に記載のポリペプチド。 １０．請求項８に記載のポリペプチドに対する抗体。 １１．請求項８に記載のポリペプチドの活性化を阻害する化合物。 １２．治療有効量の請求項１１に記載の化合物を患者に投与する工程を包含する 、乳房特異的遺伝子タンパク質を阻害する必要性を有する患者を処置するための 方法。 １３．前記化合物がポリペプチドであり、そして治療有効量の該化合物が、患者 に該ポリペプチドをコードするDNAを提供し、そしてインビボで該ポリペプチド を発現することにより投与される、請求項１２に記載の方法。 １４．治療有効量の請求項８に記載のポリペプチドを患者に投与する工程を包含 する、乳房特異的遺伝子タンパク質を必要とする患者を処置するための方法。 １５．宿主における乳房の障害を診断するための方法であって、以下： 宿主の非乳房組織由来のサンプル中のヒト遺伝子の転写を測定する工程であっ て、該遺伝子が、図１〜20（配列番号１〜20）のDNAからなる群から選択されるD NAに少なくとも90％の同一性を有するDNAを含むコード部分を有し、それによっ て、該転写が宿主における乳房の障害を示す工程、 を包含する、方法。 １６．転写が前記ヒト遺伝子から転写されたRNAの変化したレベルの存在を検出 することによって測定される、請求項１５に記載の方法。 １７．転写が前記ヒト遺伝子から転写されたRNAに相補的なDNAの変化したレベル の存在を検出することによって測定される、請求項１５に記載の方法。 １８．転写が前記ヒト遺伝子の発現産物の変化したレベルの存在を検出すること によって測定される、請求項１５に記載の方法。 １９．宿主における乳房の障害を測定するための方法であって、以下： BSG抗原またはそのエピトープ部分に特異的な抗体を、宿主由来の液体サンプ ルに接触させる工程； 該サンプル中のBSG遺伝子産物の変化したレベルの存在を測定する工程、 を包含する、方法。 ２０．請求項８に記載のポリペプチドに対するアンタゴニストを同定する方法で あって、以下： 該ポリペプチドを天然の基質およびスクリーニングされるべき標識された化合 物に同時にまたは連続的な順のいずれかで接触させる工程；および 前記タンパク質のその基質への結合を阻害するのに十分な様式で、該治療薬が 該天然の基質と効果的に競合するかどうか測定する工程、 を包含する、方法。[Claims] 1. An isolated polynucleotide, comprising:   (a) The same polypeptide as the polynucleotide described in FIG. A polynucleotide to be loaded;   (b) at least 90% identical to the DNA described in one of FIGS. 2-20 (SEQ ID NOs: 2-20) Mature polypeptide identical to a human gene having a coding portion containing sexual DNA A polynucleotide encoding;   (c) hybridizes to the polynucleotide of (a), and A polynucleotide having at least 70% identity to the polynucleotide; and   (d) DNA having at least 90% identity to the DNA contained in the deposited clone Encoding a mature polypeptide identical to a human gene having a coding portion comprising Renucleotide, An isolated polynucleotide comprising a member selected from the group consisting of: 2. 2. The human gene comprises the DNA contained in the deposited clone. 3. The polynucleotide according to item 1. 3. A polypeptide whose member is the same as the polynucleotide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) The polynucleotide according to claim 1, which is a polynucleotide encoding a code. 4. A vector comprising the polynucleotide of claim 1. 5. A host cell transformed or transfected with the vector of claim 4. Vesicles. 6. A polypeptide comprising the step of genetically engineering a cell with the vector of claim 4. A method for producing a cell capable of expressing a peptide. 7. The host cell according to claim 5, which is encoded by the polynucleotide. A method for producing a polypeptide, comprising expressing the polypeptide. 8. A polypeptide, comprising:   (i) a polypeptide encoded by a human gene, wherein the human gene is: The DNA has at least 90% identity to one of the DNAs of FIGS. A polypeptide having a coding moiety having;   (ii) a polypeptide having the deduced amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), And fragments, analogs, and derivatives thereof; and   (iii) at least 90% of the DNA contained in the deposited clone whose coding region is A polypeptide encoded by the human gene, including DNA having the same identity as And fragments, analogs and derivatives of the polypeptide, A polypeptide comprising a member selected from the group consisting of: 9. The polypeptide has the deduced amino acid sequence set forth in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) The polypeptide of claim 8, wherein 10. An antibody against the polypeptide of claim 8. 11. A compound that inhibits activation of the polypeptide of claim 8. 12. Administering to the patient a therapeutically effective amount of the compound of claim 11. For treating patients having a need to inhibit breast specific gene protein Method. 13. The compound is a polypeptide and the compound is administered to a patient in a therapeutically effective amount. Providing DNA encoding said polypeptide in vivo and said polypeptide in vivo. 13. The method of claim 12, wherein the method is administered by expressing 14． Administering a therapeutically effective amount of the polypeptide of claim 8 to the patient. A method for treating a patient in need of a breast specific gene protein. 15. A method for diagnosing breast disorders in a host, comprising:   Measuring transcription of a human gene in a sample derived from a non-breast tissue of the host. The gene selected from the group consisting of the DNAs of FIGS. 1-20 (SEQ ID NOs: 1-20) Having a coding portion containing DNA having at least 90% identity to NA, thereby Wherein the transcription is indicative of breast damage in the host, A method comprising: 16. Transcription detects the presence of altered levels of RNA transcribed from the human gene 16. The method of claim 15, which is measured by: 17． Altered levels of DNA whose transcription is complementary to RNA transcribed from the human gene 16. The method of claim 15, wherein the method is measured by detecting the presence of 18. Transcription detecting the presence of altered levels of the expression product of said human gene 16. The method of claim 15, measured by: 19. A method for measuring breast damage in a host, comprising:   An antibody specific for the BSG antigen or its epitope portion is Contacting the   Measuring the presence of an altered level of a BSG gene product in the sample; A method comprising: 20. A method for identifying an antagonist to the polypeptide of claim 8. And the following:   The polypeptide may be a natural substrate and a labeled compound to be screened. Contacting the objects either simultaneously or in sequential order; and   The therapeutic agent is administered in a manner sufficient to inhibit the binding of the protein to its substrate. Measuring whether it effectively competes with the natural substrate, A method comprising:
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