JPH11507918A - Collagen peptide fraction and its use - Google Patents

Collagen peptide fraction and its use

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JPH11507918A
JPH11507918A JP9502592A JP50259296A JPH11507918A JP H11507918 A JPH11507918 A JP H11507918A JP 9502592 A JP9502592 A JP 9502592A JP 50259296 A JP50259296 A JP 50259296A JP H11507918 A JPH11507918 A JP H11507918A
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collagen
collagen peptide
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kda
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ストッカー・クルツ
ギャフニー・パトリック・ジェー
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ペンタファルム・アーゲー
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    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract

(57)【要約】 数種類のペプチド種から構成され、その７０％より大、特にはその８０％より大が、８−３０ ｋＤａの平均分子量を有し、ヒドロキシプロリン含量が、１５−１９％であり、プロリン含量が、１８−２２％であり及び、グリシン含量が、２７−３３％であり、１５０度Ｃまでの温度で安定であり、水中１０％濃度で２．０から３．０ cSt[mm2/秒]の粘度を示し、水中１％濃度で２８０nmでのＵＶ吸収が０．６から１．８であるコラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）、特に豚（ポルシン）コラーゲンは、凍結乾燥形態及び溶液中で蛋白及びポリペプチドに対して驚くべき安定化効果を有することを見い出した。ＣＰＦ−安定化蛋白及びポリペプチド薬剤は長期の注入（インフュージョン）、又は局所、経鼻又は経皮投与に使用できる。 (57) Abstract: Consisting of several peptide species, more than 70% of which, in particular, more than 80%, have an average molecular weight of 8-30 kDa and a hydroxyproline content of 15-19%. Yes, with a proline content of 18-22% and a glycine content of 27-33%, stable at temperatures up to 150 ° C. and 2.0-3.0 cSt at a 10% concentration in water. mm 2 / sec], and a collagen peptide fraction (CPF), especially a porcine (porsin) collagen, having a UV absorption at 280 nm of 0.6 to 1.8 at a concentration of 1% in water, in particular, lyophilized form and solution Have a surprising stabilizing effect on proteins and polypeptides. CPF-stabilized protein and polypeptide agents can be used for long term infusion, or for topical, nasal or transdermal administration.

Description

【発明の詳細な説明】コラーゲンペプチドフラクション及びその使用 本発明は、蛋白及びペプチド薬剤の液体型、それぞれ凍結乾燥（リオフィライズ ）された凍結乾燥蛋白及びペプチド及び局所、経鼻又は経皮投与される蛋白及び ペプチドを含むそれぞれ凍結乾燥（リオフィライズ）された凍結乾燥薬剤におけ る、長期間のインフュージョン（注入）の間に蛋白及びペプチド薬剤の安定化に 使用される、数個のペプチド種からなる新規コラーゲンペプチドフラクション（ ＣＰＦ）に関する。 自然環境下で生物学的に活性な蛋白は、生ポリマー、炭水化物、電解質のバラン スのとれた系内で安定化されている。治療及び他の用途の高精製蛋白の取扱及び 貯蔵の間の安定化維持には特別の手法が要求される。 ポリペプチド及び蛋白薬剤は、現在凍結乾燥（リオフィライゼイション）によっ て安定化され、投与の前に再構成しなければならない。一般的な凍結乾燥医薬の 製造には、バルク剤（例えば、アミノ酸、炭水化物又はポリアルコール類）、無 機及び有機バッファー物質、電解質及び静菌剤を含むことができる。凍結乾燥製 品の物質すべてはそれぞれが、互いに適合的でなければならず、そして全体の組 成物は、凍結乾燥状態下で、活性成分の安定化に最適の環境を与えるなければな らない。 凍結乾燥下で安定性を与える組成が、再構成後の溶液下の薬剤安定に とって必ずしも最適である必要はない。このことは、もしその製剤が再構成直後 に注入されるときは余り重要ではない。しかしながら、もし再構成された薬剤が 長期間継続的に注入されなければならないときには、これは重大な問題をもたら す可能性がある。このために、各薬剤の組成は、凍結乾燥下及び再構成後に最大 の安定性を保証する必要がある。 溶液中の蛋白及びポリペプチド薬剤の安定性の維持は、薬剤溶液の封入又はカプ セル化製剤を含む局所、経鼻又は経皮の薬剤搬送系における重要な問題であるか もしれない。 溶液中での蛋白活性の損失は、副最適ｐＨ及びイオン強度、自動触媒分解、熱、 酸素、表面変性、吸着剤表面、せん断力、高圧力、放射等によってもたらされる かもしれない。蛋白不活性化に関する論文：蛋白精製の案内、エム．ピー．ドイ チュエル (Ed)、Meth．in Enzymol.Vol.182, 83-89、アカデミック プレス:サ ンディエゴ、ニューヨーク、バークレイ(1990)、蛋白安定の維持を参照されたい 。 物理的作用による溶液中での蛋白及びポリペプチドの活性の損失は、不活性蛋白 の過剰添加によって最善に防止しうる。従って、ヒト血清アルブミン(HSA)、ボ ビン血清アルブミン(BSA)、及びオバルブミンは、蛋白安定剤としてしばしば使 用される。しかしながら、BSA及びオバルブミンは強力な抗原であり、従って、 注入薬剤の安定化には使用できない。ヒト血清アルブミンはヒトには抗原的でな いが、ビールス(HIV)ヘパチチス)及びミイコプラズマ汚染のリスクを負うことが できる。安定化剤としてのHSAの更なる不利益は、蛋白と作用して安定化する他 の生物学 的活性物質、例えば、プロテナーゼ又はプロテナーゼ阻害剤との汚染を生じるこ とを含む（M.C.E.Van Dam-Mieras，A.D.Muller，H.C.Hemker，血液凝固因子II,V ,VII,VIII,IX,X及びXI：クロッティングアッセイによる決定、酵素分析法、第３ 版、Vol.5，Enzymes 3，p.352-365，H.U.Bergmeyer(Ed)，Verlag Chemie: Weinh eim，Deerfield Beach,Basel（1984）及びD.B．Gubler，B.D．Wilson，C.J．Par ker，G.M.Rodgers, 内皮細胞蛋白Ｃ活性化の制御及びプロコアグラントアルブミ ンによるフィブリノリシスThromb．Res．70，459-469(1993)を参照されたい。HS Aは、局所投与に使用される場合にも同様に不利益である。 動物組織のバーチャリーな非抗原的主要構成成分であり、ペプシンによって溶解 後の、豚皮膚からのコラーゲンは、溶液中及び凍結乾燥下のトロンビンに対して 安定化効果を発揮することが発見された。しかしながら、溶解化コラーゲンは、 血小板凝集に対する活性化作用のために、注入投与では使用できない。溶解化コ ラーゲンの更なる不利益は、溶液中でのその高粘度及び不安定性である。４０度 Ｃを越える加熱はコラーゲンの変成及びその後の室温への冷却の際のゲル形成を もたらす。コラーゲンへのリン酸アニオンの添加は不溶解ゲルの形成をもたらす 。 しかしながら、低分子ペプチドへの部分酸加水分解を伴う、コラーゲンは、なお 蛋白安定化特性を示し、そして血小板の凝集をもたらさず、低粘度溶液を形成し 、リン酸塩を含む現在のバッファー物質と適合する。これをコラーゲンペプチド フラクション（ＣＰＦ）と名付けた。 又、物理化学的不活性化に高い感受性のある生物学的に活性な蛋白薬剤 （例えば、トロンビン、組織プラスミノーゲンアクティベーター、ウロキナーゼ 、アンチトロンビン及び他のプラズマ蛋白）は、ヒト血清アルブミンを含む溶液 中よりも、豚（ポルシン）皮膚コラーゲンからのＣＰＦ中でより安定であること も見出した。 最後に、ＣＰＦは、ミクロタイタープレート、ブロッティングメンブラン、フィ ルター、配管等の製造、分析、診断及び医学装置のガラス、合成又は天然高分子 の場に蛋白が吸着し又は共有結合することを飽和化したり阻害することができる ことを見出した。それゆえ、ＣＰＦ溶液による洗浄又はインキュベーション処理 は、酵素リンク化免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティング及び関連手法 のような免疫学的技術において、非特異的抗体又は抗原が結合するのを防止する のに使用できる。又、ＣＰＦとのインキュベーションはアフィニティークロマト グラフィーの活性サポートにおける過剰の活性基を飽和するのにも使用すること ができ、そして、フィルター材、ガラス又はプラスチック製品のＣＰＦによる洗 浄は、処理の間溶液からの蛋白の吸着を防止する。 従って、本発明のひとつの目的は、長期間のインフュージョンの間、蛋白及びペ プチド薬剤の安定化用に、コラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）を使用す ることである。 本発明のもうひとつの目的は、局所、経鼻又は経皮投与用の蛋白及びペプチド薬 剤の液体の安定化用に、コラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）を使用する ことである。 本発明のさらにもうひとつの目的は、局所、経鼻又は経皮投与用の蛋白及びペプ チド又は、蛋白及びペプチドを含む凍結乾燥薬剤の安定化用に、コラーゲンペプ チドフラクション（ＣＰＦ）を使用することである。 本発明のさらにもうひとつの目的は、酵素リンク化免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、イ ムノブロッティング又は関連手法のような免疫学的技術において、非特異的抗体 又は抗原が結合することを防止するのに、コラーゲンペプチドフラクション（Ｃ ＰＦ）を使用することである。 本発明のさらにもうひとつの目的は、アフィニティークロマトグラフィー用活性 化サポートにおける過剰の活性基を飽和するのに、コラーゲンペプチドフラクシ ョン（ＣＰＦ）を使用することである。 本発明のさらにもうひとつの目的は、フィルター材、ガラス又はプラスチック製 品を洗浄して処理する際に溶液からの蛋白吸着を防止するのに、コラーゲンペプ チドフラクション（ＣＰＦ）を使用することである。 本発明のコラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）を生産するのに好適なコラ ーゲンは、動物組織、好ましくは、豚皮膚（ピッグスキン）から得ることができ る。ペプシン溶解化Ｉ型コラーゲンは、従来方法、例えば、N D Light，1985．C ollagen in Skin:Preparation and Analysis，in: Methods in Skin Research（ D Skerrow and C J Skerow，Eds）J Wiley and Sons Ltd．p 559-585.によって 製造することができる。 Ｉ型コラーゲンの制御された加水分解は、水性コラーゲンサスペンジョ ンを低いｐＨで、特定の時間加熱することにより、達成することができる。本発 明のコラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）は、コラーゲンサスペンジョン をｐＨ ２．５−４．０で、３０−９０分間、１００−１５０度Ｃでオートクレ ーブ中で加熱することにより得ることができる。このパラメーター（ｐＨ）温度 、時間）は、広範囲に変えることができる。例えば、低いｐＨ及び高い温度は加 熱時間を低減する。 本発明のコラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）は、数種類のペプチド種か ら構成され、その７０％より大、特に８０％より大が、８−３０ ｋＤａ、特に 、８−２５ ｋＤａ、さらには、１０−２０ｋＤａ、最も特には２０ ｋＤａ（ ゲル浸透クロマトグラフィーによる）の分子量を有し、ヒドロキシプロリン含量 は、１５−１９％、プロリン含量は、１８−２２％及び、グリシン含量は、２７ −３３％（D.H.Spackman等，Anal．Chem．30，1190-1206，(1958)による。）で ある。６０度Ｃより大の加熱により水性溶液から沈殿する、血清及び卵アルブミ ンに反して、ＣＰＦは安定であり、１５０度Ｃまでの温度では沈殿せず、よって 、オートクレーブ内で加熱殺菌することができる。水中で１０％濃度のコラーゲ ンが粘調ペーストであるのに対して、及び室温で堅いゲルである１０％ゼラチン に対して、ＣＰＦは、１０％水性溶液で流動性があり、２．０から３．０ cSt[ mm2/秒]の粘度を示す。２８０nmでの強いUV吸収(A180%=6.2から7.5)を示すアル ブミンと異なり、ＣＰＦは、調製のモードによって、A280%値が０．６から１． ８（水中で１％、０．７％固体に相当）を示す。等量の１０％水性ＣＰＦ溶液と １０％トリクロロ酢酸の混合物は、蛋白沈殿を生じなかったが、同様の条件で、 アルブミン及びゼラチンは、強い沈殿を形成する。５％アンモ ニア溶液中のＣＰＦは、０．１ M、１mlの硝酸銀で、９５度Ｃに加熱後、褐色 化を示さないが、これに対して、同様条件下でゼラチンは、炭水化物の低下の故 に、暗褐色を示す。ゼラチンでは、グルコサミングリカン分解由来の炭水化物の 低下により、強力なオルシノール着色反応を生じるが、ＣＰＦは、ほとんど反応 を示さない。 実施例１ コラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）の調製 豚皮膚からのＩ型コラーゲンをライト(Light，前述文献を参照。)に従って、精 製した。新鮮な凍結した豚皮膚を破砕し、溶媒抽出で脱脂した。得た皮膚ファイ バーパルプをペプシンで処理してＩ型コラーゲンを溶解した。不溶性物質をろ過 で除去し、コラーゲンをpH ７．５でろ液から沈殿し、食塩水に溶解し、さらに 塩フラクショネーション及びイオン交換処理により精製した。沈殿したＩ型コラ ーゲンを水に懸濁し、ｐＨを塩酸で３．５に調整し、この酸性化した懸濁液をオ ートクレーブ中で６０分間、１４５度Ｃで加熱し、濃度を水で１０プラスマイナ ス１％固体にした。この溶液を無菌条件化、０．２ミクロン膜を通過させ、ml当 り１０エンドトキシン単位未満のエンドトキシン含量及び重金属含量が２０ ppm 未満の殺菌化１０％コラーゲンペプチド溶液を得た。分析ゲルクロマトグラフィ ーにより推定するとおり、得られたコラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ） の８０％より大の平均分子量は、１０−１５ kDaであった。 平均分子量 １０−１５ kDa 全窒素 １５−１９％ ポリペプチド含有量 ８０−１００％ ヒドロキシプロリン １５−１９％ プロリン １８−２２％ 実施例２ ヒトトロンビン(=TH、局所止血剤及び組織シーラントの成分として広範に使用さ れるプロコアグラント酵素)及び組織プラスミノーゲンアクチベーター（＝ＴＰ Ａ、さまざまな急性及び慢性血栓症の治療に使用される有名なトロンボリティッ ク剤）をHSA（０．５％溶液）及びコラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ、 ０．５％溶液）の存在下７日間、様々な温度（この種々の貯蔵温度は横座標=温 度ｔｅｍｐで示す）でインキュベートした。図１は、トロンビンの生物学的活性 は（残存活性比、=rarとして示す。）、ＨＦＡに比較して、ＣＰＦの存在下はっ きりと維持されることを示す。図２は、インフュージョンとしてとして治療で一 般的に使用されるＴＰＡの３７度Ｃでの活性の損失が、ＣＰＦとインキュベート したときの方が、ＨＳＡの場合よりもより少ない。 実施例３ 組織プラスミノーゲンアクチベーター（＝ＴＰＡ）、トロンビン（＝ＴＨ）及び アルカリホスホターゼ（＝ＡＰ、凍結乾燥による貯蔵の際の分解に高い感受性を 持つ酵素）をＣＰＦ及びＨＳＡの溶液で凍結乾燥し、種々の温度（＝温度temp） で１２週間貯蔵した（図３，４，５）。 凍結乾燥間の活性の損失ＣＰＦとＨＳＡとではおよそ同じであり、１２ 週間種々の温度で貯蔵した、ＣＰＦ溶液からの凍結された酵素のポテンシーは、 ＨＳＡ溶液からの凍結乾燥のそれと同じであった。極めて上昇した温度（例えば 、５６度Ｃ）でのみ、凍結乾燥されたＣＰＦ生成物は、凍結乾燥されたＨＳＡ生 成物に対して、ポテンシーの維持に有利さを示す（特に、図３及び図４）。 これらの５６度Ｃでの後者のデータは、凍結乾燥された生物学的活性の長期間の 貯蔵（１年未満）は、ＣＰＦフラクションの使用によって強化されるかもしれな いことを強く示唆する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Collagen Peptide Fraction and Use Thereof The present invention relates to liquid forms of protein and peptide drugs, lyophilized proteins and peptides, respectively lyophilized, and proteins administered topically, nasally or transdermally. Novel collagen peptide consisting of several peptide species used for stabilization of protein and peptide drugs during long-term infusion (infusion) in lyophilized lyophilized drugs each containing lipophiles and peptides Fraction (CPF). Proteins that are biologically active in the natural environment are stabilized in a balanced system of biopolymers, carbohydrates and electrolytes. Special techniques are required to maintain stability during handling and storage of highly purified proteins for therapeutic and other uses. Polypeptide and protein drugs are currently stabilized by lyophilization (lyophilization) and must be reconstituted prior to administration. Typical lyophilized pharmaceutical preparations can include bulking agents (eg, amino acids, carbohydrates or polyalcohols), inorganic and organic buffer substances, electrolytes and bacteriostats. All of the substances of the lyophilized product must be compatible with each other, and the entire composition must provide an optimal environment for stabilizing the active ingredient under lyophilized conditions. The composition that provides stability under lyophilization need not necessarily be optimal for drug stability in solution after reconstitution. This is less important if the formulation is injected immediately after reconstitution. However, if the reconstituted drug has to be infused continuously over a long period of time, this can cause serious problems. For this, the composition of each drug must guarantee maximum stability under lyophilization and after reconstitution. Maintaining the stability of protein and polypeptide drugs in solution may be an important problem in topical, nasal or transdermal drug delivery systems involving the encapsulation or encapsulation of drug solutions. Loss of protein activity in solution may be caused by suboptimal pH and ionic strength, autocatalytic degradation, heat, oxygen, surface denaturation, sorbent surfaces, shear forces, high pressure, radiation, and the like. Paper on Protein Inactivation: Guide to Protein Purification, M. P. Deutuel (Ed), Meth. See Enzymol. Vol. 182 , 83-89, Academic Press: San Diego, New York, Berkeley (1990), Maintaining Protein Stability. Loss of activity of proteins and polypeptides in solution by physical action can be best prevented by the excess addition of inert protein. Thus, human serum albumin (HSA), bobbin serum albumin (BSA), and ovalbumin are often used as protein stabilizers. However, BSA and ovalbumin are strong antigens and therefore cannot be used to stabilize infused drugs. Human serum albumin is not antigenic to humans, but can carry the risk of viral (HIV) hepatis) and mycoplasma contamination. Additional disadvantages of HSA as a stabilizing agent include causing contamination with other biologically active substances that act and stabilize proteins, such as proteinases or proteinase inhibitors (MCEVan Dam-Mieras, ADMuller, HCHemker, blood coagulation factors II, V, VII, VIII, IX, X and XI: Determination by clotting assay, Enzyme analysis, Third Edition, Vol. 5 , Enzymes 3, p. 352-365, HUBergmeyer ( Ed), Verlag Chemie: Weinheim, Deerfield Beach, Basel (1984) and DB.Gubler, BD.Wilson, CJ.Parker, GMRodgers, Regulation of endothelial cell protein C activation and fibrinolysis by procoagulant albumin Thromb. See Res., 70 , 459-469 (1993) HSA is similarly disadvantageous when used for topical administration, which is a virtual non-antigenic major component of animal tissue; Collagen from pig skin after dissolution by pepsin is in solution and It has been discovered that lyophilized thrombin exerts a stabilizing effect on thrombin, however, solubilized collagen cannot be used for infusion administration due to its activating effect on platelet aggregation. Benefits are its high viscosity and instability in solution.Heating above 40 ° C. leads to denaturation of the collagen and subsequent gel formation upon cooling to room temperature. However, with partial acid hydrolysis to small peptides, collagen still shows protein-stabilizing properties and does not result in platelet aggregation, forms a low viscosity solution, Compatible with current buffer materials, including salts, named collagen peptide fraction (CPF), and physicochemical inactivation Highly sensitive biologically active protein drugs (eg, thrombin, tissue plasminogen activator, urokinase, antithrombin, and other plasma proteins) are more likely to be present in pork (porcine) skin than in solutions containing human serum albumin. Finally, CPF was found to be more stable in CPF from collagen.Finally, CPF can be used for the manufacture of microtiter plates, blotting membranes, filters, tubing, etc., for analysis, diagnostics and medical devices. It has been found that the adsorption or covalent binding of proteins to the field can be saturated or inhibited. Therefore, washing or incubation with a CPF solution may prevent non-specific antibodies or antigens from binding in immunological techniques such as enzyme linked immunosorbent (ELISA), immunoblotting and related techniques. Can be used. Incubation with CPF can also be used to saturate excess active groups in the activity support of affinity chromatography, and washing of filter media, glass or plastic products with CPF will remove solution from the solution during processing. Prevent protein adsorption. Accordingly, one object of the present invention is to use collagen peptide fraction (CPF) for the stabilization of protein and peptide drugs during prolonged infusion. Another object of the present invention is to use collagen peptide fraction (CPF) for the stabilization of liquid protein and peptide drugs for topical, nasal or transdermal administration. Yet another object of the present invention is to use collagen peptide fractions (CPF) for stabilizing proteins and peptides for topical, nasal or transdermal administration or lyophilized drugs containing proteins and peptides. is there. Yet another object of the present invention is to provide a method for preventing the binding of non-specific antibodies or antigens in immunological techniques such as enzyme linked immunosorbent (ELISA), immunoblotting or related techniques. The use of peptide fractions (CPF). Yet another object of the present invention is to use a collagen peptide fraction (CPF) to saturate excess active groups in the activation support for affinity chromatography. Yet another object of the present invention is to use a collagen peptide fraction (CPF) to prevent protein adsorption from solution when washing and treating filter media, glass or plastic products. Collagen suitable for producing the collagen peptide fraction (CPF) of the present invention can be obtained from animal tissue, preferably pig skin. Pepsin-solubilized type I collagen is obtained by conventional methods, for example, ND Light, 1985. Collagen in Skin: Preparation and Analysis, in: Methods in Skin Research (D Skerrow and CJ Skerow, Eds) J Wiley and Sons Ltd. p 559-585. Controlled hydrolysis of type I collagen can be achieved by heating the aqueous collagen suspension at low pH for a specific period of time. The collagen peptide fraction (CPF) of the present invention can be obtained by heating a collagen suspension at pH 2.5-4.0 for 30-90 minutes at 100-150 ° C in an autoclave. This parameter (pH) temperature, time) can vary widely. For example, low pH and high temperature reduce heating time. The collagen peptide fraction (CPF) of the invention is composed of several peptide species, of which more than 70%, in particular more than 80%, have a concentration of 8-30 kDa, in particular 8-25 kDa, furthermore 10-20 kDa. Having a molecular weight of 20 kDa (by gel permeation chromatography), a hydroxyproline content of 15-19%, a proline content of 18-22% and a glycine content of 27-33% (DHSpackman et al. 30 , Anal. Chem. 30 , 1190-1206, (1958)). Contrary to serum and ovalbumin, which precipitate from aqueous solutions by heating above 60 ° C., CPF is stable and does not precipitate at temperatures up to 150 ° C. and thus can be pasteurized in an autoclave. . Whereas 10% collagen in water is a viscous paste and 10% gelatin, which is a hard gel at room temperature, CPF is flowable in a 10% aqueous solution and has a viscosity of 2.0 to 3%. It shows a viscosity of 0.0 cSt [mm 2 / sec]. Unlike albumin, which shows a strong UV absorption at 280 nm (A180% = 6.2 to 7.5), CPF has an A280% value of 0.6 to 1.0 depending on the mode of preparation. 8 (1% in water, corresponding to 0.7% solids). Mixtures of equal volumes of 10% aqueous CPF solution and 10% trichloroacetic acid did not result in protein precipitation, but under similar conditions, albumin and gelatin form strong precipitates. CPF in a 5% ammonia solution shows no browning after heating to 95 ° C. with 0.1 M, 1 ml of silver nitrate, whereas under similar conditions gelatin is reduced due to the reduction of carbohydrates. , Showing dark brown. In gelatin, the reduction of carbohydrates from glucosaming glycan degradation results in a strong orcinol coloring reaction, whereas CPF shows little response. Example 1 Preparation of Collagen Peptide Fraction (CPF) Type I collagen from pig skin was purified according to Light (Light, see the above-mentioned literature). Fresh frozen pig skin was crushed and defatted by solvent extraction. The obtained skin fiber pulp was treated with pepsin to dissolve type I collagen. Insoluble substances were removed by filtration, and collagen was precipitated from the filtrate at pH 7.5, dissolved in saline, and further purified by salt fractionation and ion exchange treatment. The precipitated type I collagen is suspended in water, the pH is adjusted to 3.5 with hydrochloric acid, the acidified suspension is heated in an autoclave for 60 minutes at 145 ° C. and the concentration is reduced to 10 ± 10% with water. 1% solids. The solution was sterile and passed through a 0.2 micron membrane to give a sterilized 10% collagen peptide solution with an endotoxin content of less than 10 endotoxin units per ml and a heavy metal content of less than 20 ppm. The average molecular weight of the obtained collagen peptide fraction (CPF) of greater than 80% was 10-15 kDa as estimated by analytical gel chromatography. Average molecular weight 10-15 kDa Total nitrogen 15-19% Polypeptide content 80-100% Hydroxyproline 15-19% Proline 18-22% Example 2 Human thrombin (= TH, extensively used as a component of local hemostats and tissue sealants) HSA (0.5% solution) and collagen, which are procoagulant enzymes used for steroids and tissue plasminogen activator (= TPA, a famous thrombotic agent used for the treatment of various acute and chronic thrombosis) Incubation was performed at various temperatures (the various storage temperatures are indicated by abscissa = temperature temp) for 7 days in the presence of the peptide fraction (CPF, 0.5% solution). FIG. 1 shows that the biological activity of thrombin (remaining activity ratio, shown as = rar) is clearly maintained in the presence of CPF compared to HFA. FIG. 2 shows that TPA, commonly used in therapy as an infusion, loses less activity at 37 ° C. when incubated with CPF than with HSA. Example 3 Tissue plasminogen activator (= TPA), thrombin (= TH) and alkaline phosphatase (= AP, an enzyme highly sensitive to degradation upon storage by lyophilization) in a solution of CPF and HSA It was dried and stored at various temperatures (= temperature temp) for 12 weeks (FIGS. 3, 4, 5). Loss of activity during lyophilization was approximately the same for CPF and HSA, and the potency of frozen enzyme from CPF solution stored at various temperatures for 12 weeks was similar to that of lyophilization from HSA solution. . Only at very elevated temperatures (eg, 56 ° C.) does the lyophilized CPF product show an advantage in maintaining potency over the lyophilized HSA product (in particular, FIGS. 3 and 4). ). These latter data at 56 ° C strongly suggest that long-term storage (less than one year) of lyophilized biological activity may be enhanced by the use of CPF fractions.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，Ｂ Ｇ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ， ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI G01N 33/531 G01N 33/531 B (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG) , AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, U A, UG, US, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．数種類のペプチド種から構成され、その７０％より大、特にはその８０％よ り大が、８−３０ ｋＤａ、特には、８−２５ ｋＤａ、さらには、１０−２０ ｋＤａ、最も特には２０ ｋＤａの平均分子量を有し、ヒドロキシプロリン含 量が、１５−１９％であり、プロリン含量が、１８−２２％であり及び、グリシ ン含量が、２７−３３％であり、１５０度Ｃまでの温度で安定であり、水中１０ ％濃度で２．０から３．０ cSt[mm2/秒]の粘度を示し、水中で１％濃度で２８ ０nmでのＵＶ吸収が０．６から１．８であるコラーゲンペプチドフラクション（ ＣＰＦ）。 ２．コラーゲンサスペンジョンをｐＨ ２．５−４．０で、３０−９０分間、１ ００−１５０度Ｃでオートクレーブ中で加熱することを特徴とする請求項１のコ ラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）の製造方法。 ３．ｐＨを塩酸で好ましくは３．５に調整し、このフラクションを好ましくはオ ートクレーブ中で、６０分間、１４５度Ｃで加熱することを特徴とする請求項２ の方法。 ４．出発物質として本質的にポルシンコラーゲンを用いる請求項２又は３の方法 。 ５．長期間の注入（インフュージョン）での蛋白及びペプチド薬剤の安 定化への、請求項１−４のいずれかひとつのコラーゲンペプチドフラクション（ ＣＰＦ）の使用。 ６．局所、経鼻及び経皮投与用の液体形態の蛋白及びペプチド薬剤の安定化への 、請求項１−４のいずれかひとつのコラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ） の使用。 ７．凍結乾燥蛋白及びペプチド、又は局所、経鼻及び経皮投与用の蛋白及びペプ チドを含む凍結乾燥薬剤の安定化への、請求項１−４のいずれかひとつのコラー ゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）の使用。 ８．酵素リンク化免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロッティング又は関連手法 のような免疫学的技術において、非特異的抗体又は抗原が結合することを防止す るための請求項１−４のいずれかひとつのコラーゲンペプチドフラクション（Ｃ ＰＦ）の使用。 ９．アフィニティークロマトグラフィー用活性化サポートにおける過剰の活性基 を飽和するための、請求項１−４のいずれかひとつのコラーゲンペプチドフラク ション（ＣＰＦ）の使用。 １０．処理の間、溶液から蛋白の吸着を防止するための、請求項１−４のいずれ かひとつのコラーゲンペプチドフラクション（ＣＰＦ）の使用。[Claims] 1. Consisting of several peptide species, more than 70% of which, in particular more than 80%, have 8-30 kDa, especially 8-25 kDa, even 10-20 kDa, most especially 20 kDa. It has an average molecular weight, a hydroxyproline content of 15-19%, a proline content of 18-22% and a glycine content of 27-33%, stable at temperatures up to 150 ° C. And a collagen peptide exhibiting a viscosity of 2.0 to 3.0 cSt [mm 2 / sec] at 10% concentration in water and a UV absorption of 0.6 to 1.8 at 280 nm at 1% concentration in water. Fraction (CPF). 2. The method for producing a collagen peptide fraction (CPF) according to claim 1, wherein the collagen suspension is heated in an autoclave at 100 to 150 ° C for 30 to 90 minutes at pH 2.5 to 4.0. 3. 3. The process according to claim 2, wherein the pH is adjusted to preferably 3.5 with hydrochloric acid and the fraction is heated at 145 DEG C. for 60 minutes, preferably in an autoclave. 4. 4. The method according to claim 2, wherein porsin collagen is used essentially as a starting material. 5. Use of a collagen peptide fraction (CPF) according to any one of claims 1 to 4 for the stabilization of protein and peptide drugs during prolonged infusion. 6. Use of the collagen peptide fraction (CPF) of any one of claims 1 to 4 for stabilizing protein and peptide drugs in liquid form for topical, nasal and transdermal administration. 7. Use of the collagen peptide fraction (CPF) according to any one of claims 1 to 4 for stabilizing lyophilized proteins and peptides or lyophilized drugs containing proteins and peptides for topical, nasal and transdermal administration. 8. A collagen peptide according to any one of claims 1 to 4 for preventing non-specific antibodies or antigens from binding in immunological techniques such as enzyme linked immunosorbent (ELISA), immunoblotting or related techniques. Use of fractions (CPF). 9. Use of a collagen peptide fraction (CPF) according to any one of claims 1 to 4 for saturating excess active groups in an activation support for affinity chromatography. 10. Use of a collagen peptide fraction (CPF) according to any one of claims 1 to 4 to prevent adsorption of proteins from solution during processing.
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