JPH11507645A - Ｎｆ−ｋｂ転写因子の調節方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＮＦ−ｋＢ転写因子の調節方法であって、式： Ｒ₂はピロリジン、ヘキサメチレンイミノおよびピペリジノからなる群から選ばれる］で示される化合物またはその医薬的に許容される塩または溶媒和物の有効量を、該調節を必要とするヒトに投与することを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＦ−ＫＢ転写因子の調節方法 発明の背景 すべての生物学的過程の調節は、ＤＮＡ調節エレメントと相互作用し、互いに 相互作用する種々の正および負の作用をする因子間のバランスによってなされる 。これらタンパク質因子は、タンパク質発現の調節に重要な役割を演じ、このよ うに、正常および病的過程の両方に重要である。これらのタンパク質因子とそれ らがどのように遺伝子発現を調節するかを理解することが、病気の始まりと進行 を調節する物質を開発するための戦略の鍵となる。 多くのこれらの重要なトランス作用調節タンパク質が文献に記載され、病的過 程に役割を演じることが証明されてきた。そのような因子の１つに、真核性転写 因子のＲｅｌファミリーのメンバーであるＮＦ−ｋＢがある。Ｒｅｌファミリー のタンパク質は様々な細胞反応を調節する。例えば、それらタンパク質は、遺伝 子発現のシグナル反応性誘導、宿主防御反応および成長反応の鍵となる調節分子 である。ＮＦ−ｋＢおよびＲｅｌファミリーの他のメンバーの結合を特異的に調 節する能力は、敗血症性ショック、移植対宿主反応、急性炎症性異常、全身性炎 症反応、急性期反応、脈管性凝固、虚血性再還流傷害、アテローム性動脈硬化症 、ＨＩＶ感染および癌に及ぶ種々の異常の治療に有用であろう。 別の重要な転写因子に、ＮＦ−１ファミリーの転写制御因子のメンバーである ＢＥＦ−１がある。ＢＥＦ−１は最初、ヒトＢＫウイルスのエンハンサー内の転 写リプレッサーとして確認された。この遍在する転写因子の結合部位は多くのヒ ト遺伝子の調節領域内に存在している。例えば、ＢＥＦ−１は、脂質輸送および 再分布（逆コレステロール輸送）において機能する血漿リポタンパク質の主要成 分であるヒトアポリポタンパク質の発現を調節することが示されている。Ａｐｏ Ｅはおそらく、アテローム性動脈硬化症の発生および／または進行の阻害にも重 要な役割を演じている。ＢＥＦ−１のレベルと結合活性は、ウイルス性腫瘍遺伝 子Ｅｌａ、サイトカイン、およびチロシンリン酸化を介した効果によって証明さ れている通り、いずれも細胞内シグナリングを介して調節されることが示されて いる。 本発明者らは、ＢＥＦ−１結合部位がＮＦ−ｋＢ結合部位（例えば、血管付着 分子−１：ＶＣＡＭ-１）とオーバーラップし得ることをみいだした。逆に、ａ ｐｏＥプロモーター中のようなＢＥＦ−１結合部位はＲｅｌタンパク質と結合す ることができる。このように、ＢＥＦ−１およびＮＦ−ｋＢはいずれも同じ部位 に結合するために競合するかもしれない。さらに、ＢＥＦ−１活性のレベルを調 節する化合物は、ＢＥＦ−１によって調節される遺伝子みならず、ＮＦ−ｋＢに よって調節される遺伝子の調節にも有効かも知れない。 発明の要約 本発明は、ＮＦ−ｋＢ転写因子の調節方法であって、式Ｉ： Ｒ²はピロリジノ、ヘキサメチレンイミノおよびピペリジノからなる群から選ば れる］ で示される化合物またはその医薬的に許容される塩または溶媒和物の有効量を、 該調節を必要とするヒトに投与することを含む方法を提供する。 発明の詳細な説明 本発明は、式Ｉの化合物である２−フェニル−３−アロイルベンゾチオフェン （ベンゾチオフェン）の選ばれた群が、ＮＦ−ｋＢ転写因子の調節に有用である ことの発見に関する。 本発明が提供する使用方法は、式Ｉの化合物またはその医薬的に許容される塩 または溶媒和物の用量をそれを必要とするヒトに投与することにより実施され、 ＮＦ−ｋＢ転写因子を調節するのに有効である。このように、本発明の方法には 、適切な医療的な治療的および／または予防的投与の両方が含まれる。 Ｒ¹およびＲ³が水素であり、Ｒ²が１−ピペリジニルである式Ｉの化合物の塩 酸塩である本発明の化合物、ラロキシフェンは、核制御分子である。ラロキシフ ェンはエストロゲンレセプターと結合することが知られており、当初、子宮組織 およびエストロゲン依存性乳癌を活性化するエストロゲンの能力をブロックする 抗エストロゲンの機能と薬理作用を有する分子であると考えられた。特に、ラロ キシフェンはある細胞のエストロゲンの作用をブロックするが、他の種類の細胞 では、ラロキシフェンはエストロゲンが活性化するのと同じ遺伝子を活性化し、 同じ薬理作用（例えば、骨粗鬆症、高脂血症）を示す。そのため、ラロキシフェ ンは、アゴニスト−アンタゴニスト特性がひとつになった抗エストロゲンとして 言及されてきた。ラロキシフェンが示す、エストロゲンと異なる独特なプロフィ ールは、今ではエストロゲン−エストロゲンレセプターコンプレックスによる遺 伝子の活性化および／または抑制とは全く違ったものとしてラロキシフェン−エ ストロゲンレセプターコンプレックスによる種々の遺伝子の機能の独特な活性化 および／または抑制によると考えられている。したがって、ラロキシフェンとエ ストロゲンは同じレセプターを利用し、競合するが、この２つの遺伝子制御の薬 理学的結果は容易に予測されるものではなく、互いに独特である。 一般的に、本化合物は通常の賦形剤、希釈剤または担体を用いて製剤化され、 圧縮して錠剤にするか、または経口投与に好都合なエリキシル剤または溶液剤と して製剤化されるか、または筋肉内または静脈内経路で投与される。本化合物は 経皮的に投与することができ、持続放出投与剤形などとして製剤化することがで きよう。 本発明の方法に用いる化合物は、米国特許第4133814号、第4418068号、第4380 635号（これらの内容は本明細書の一部を構成する）に詳述されているような確 立された方法に従って製造することができる。一般的に、この工程は、６−ヒド ロキシル基および２−（４−ヒドロキシフェニル）基を有するベンゾ［ｂ］チオ フェンを用いて出発する。出発化合物は、保護され、アシル化され、次いで脱保 護されて式Ｉの化合物が形成される。そのような化合物の製造例は上記米国特許 に記載されている。所望により置換されたフェニルには、フェニル、およびＣ₁ −Ｃ₆アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、クロロ、フルオロ またはトリ(クロロまたはフルオロ)メチルで１または２度置換されたフェニルが 含まれる。 本発明の方法に用いる化合物は、種々の有機および無機酸並びに塩基と共に医 薬的に許容される酸および塩基付加塩を形成し、それには薬化学に頻繁に使用さ れる医薬的に許容される塩が含まれる。そのような塩も本発明の一部である。こ のような塩の形成に使用される典型的な無機酸には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化 水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、次リン酸などが含まれる。脂肪族モノおよびジカ ルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸及びヒドロキシアル カン二酸、芳香族の酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの有機酸から誘導さ れる塩も使用できる。従って、そのような医薬的に許容される塩には酢酸塩、フ ェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香 酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキ シ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ−アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン−２ −安息香酸塩、臭化物、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、 ブチン−１，４−二酸塩、ヘキシン−１，４−二酸塩、カプリン酸塩、カプリル 酸塩、塩化物、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩 、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマ レ イン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシレート、ニコチン酸塩、イソニコチ ン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、テレフタル酸塩、リン酸塩、リン酸 −水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピオレート、プ ロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、セバケート、コハク酸 塩、スベレート、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、スル ホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸塩、クロロベ ンゼンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩 、メタンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スル ホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酒石酸塩などが 含まれる。好ましい塩は塩酸塩である。 医薬的に許容される酸付加塩は、典型的には式Ｉの化合物を等モルまたは過剰 量の酸と反応させることによって形成する。反応体は一般に、ジエチルエーテル またはベンゼンなどの相互溶媒中で混合する。塩は普通、約１時間から１０日以 内に溶液から沈殿し、濾過によって分離するかまたは慣用の方法によって溶媒を 除去し得る。 塩製剤用に通常用いられる塩基には、水酸化アンモニウム、アルカリおよびア ルカリ土類金属水酸化物、カーボネート、および脂肪族および第１級、第２級、 および第３級アミン、脂肪族ジアミンが含まれる。付加塩の製造に特に有用な塩 基には、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、メチルアミン、ジエチルアミン、 エチレンジアミンおよびシクロヘキシルアミンが含まれる。 一般に、医薬的に許容される塩は、それが誘導される化合物に比べて溶解特性 が増大しており、したがって液剤やエマルジョン剤としてより製剤にしやすいこ とが多い。 医薬製剤は当技術分野において知られている手法によって製造することができ る。例えば、本化合物は、一般的な賦形剤、希釈剤、または担体と共に製剤化す ることができ、錠剤、カプセル剤および粉末剤などに形成することができる。こ のような製剤に適当な賦形剤、希釈剤、及び担体の例には次のものが含まれる： デンプン、糖類、マンニトール及びケイ酸誘導体などの充填剤及び展開剤、カル ボキシメチルセルロース及び他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、 及びポリビニルピロリドンなどの結合剤、グリセリンなどの湿潤剤、炭酸カルシ ウム及び重炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、パラフィンなどの溶出遅延剤、第四級 アンモニウム化合物などの吸収促進剤、セチルアルコール、グリセリンモノステ アレートなどの界面活性剤、カオリン及びベントナイトなどの吸着担体、タルク 、ステアリン酸カルシウム及びステアリン酸マグネシウム、及び固体のポリエチ レングリコールなどの滑沢剤。 本化合物は、経口投与に好都合なエリキシル剤や溶液剤、または非経口投与（ 例えば、筋肉内、皮下、または静脈内経路による）に適した溶液剤として製剤化 することもできる。さらに本化合物は、持続放出投与剤形などの製剤によく適合 する。該製剤は、唯一または好ましくは腸管の特定部分において、できるだけ一 定期間活性成分を放出するように構成することもできる。コーティング、外被、 および保護マトリックスは、例えばポリマー物質またはワックスから製造するこ とができよう。 ＮＦ−ｋＢ転写因子の調節、または本明細書に開示したあらゆる他の使用に必 要な、本発明に従った式Ｉの化合物の特定の用量は、異常の重症度、投与経路、 および関連因子に依存し、担当医師によって決定されるであろう。一般的に、許 容される有効１日用量は、約０．１〜約１０００mg／日、より典型的には約５０ 〜約２００ｍｇ／日であろう。そのような用量は、ＮＦ−ｋＢ転写因子を有効に 調節する必要性や本明細書に開示した他のあらゆる使用に応じて、それを必要と する対象に対し１日に１〜約３回、またはそれより頻繁に投与されるであろう。 ピペリジノ環のような塩基性基を有する医薬製剤を投与するのが通例である通 り、式Ｉの化合物を酸付加塩の形で投与するのが通常好ましい。そのような化合 物を経口経路によって投与することも好都合である。そのような目的に、以下の 経口投与剤形が利用できる。 製剤例 以下の製剤例において、「活性成分」は式Ｉの化合物を意味する。製剤例１ ：ゼラチンカプセル 硬ゼラチンカプセルは以下のものを用いて製造される。 成 分 量（ｍg/カプセル） 活性成分 ０．１−１０００ デンプン、ＮＦ ０−６５０ デンプン流動性粉末 ０−６５０ シリコーン液３５０センチストーク ０− １５ 成分を混合し、Ｎo.４５メッシュＵ.Ｓ.シーブに通し、硬ゼラチンカプセルに充 填する。 製造されたラロキシフェンの特定のカプセル製剤の例には以下に示すものが含 まれる。製剤例２ ：ラロキシフェンカプセル 成 分 量（ｍg/カプセル） ラロキシフェン １ デンプン、ＮＦ １１２ デンプン流動性粉末 ２２５．３ シリコーン液３５０センチストーク １．７ 製剤例３ ：ラロキシフェンカプセル 成 分 量（ｍg/カプセル） ラロキシフェン ５ デンプン、ＮＦ １０８ デンプン流動性粉末 ２２５．３ シリコーン液３５０センチストーク １．７ 製剤例４ ：ラロキシフェンカプセル 成 分 量（ｍg/カプセル） ラロキシフェン １０ デンプン、ＮＦ １０３ デンプン流動性粉末 ２２５．３ シリコーン液３５０センチストーク １．７ 製剤例５ ：ラロキシフェンカプセル 成 分 量（ｍg/カプセル） ラロキシフェン ５０ デンプン、ＮＦ １５０ デンプン流動性粉末 ３９７ シリコーン液３５０センチストーク ３．０ 上記の特定の製剤は、与えられる妥当な変化に応じて変化させることができよ う。 錠剤は以下の成分を用いて製造される。製剤例６ ：錠剤 成 分 量（ｍg/錠） 活性成分 ０．１−１０００ セルロース、微晶質 ０−６５０ 二酸化ケイ素、発煙 ０−６５０ ステアリン酸 ０− １５ 化合物を混合し、圧縮して錠剤を形成する。 あるいはまた、活性成分０．１−１０００ｍｇを含む錠剤を以下のごとく製造 する。製剤例７ ：錠剤 成 分 量（ｍg/錠） 活性成分 ０．１−１０００ デンプン ４５ セルロース、微晶質 ３５ ポリビニルピロリドン ４ （１０％水溶液として） ナトリウムカルボキシメチルセルロース ４．５ ステアリン酸マグネシウム ０．５ タルク １ 活性成分、デンプンおよびセルロースをＮo.４５メッシュＵ.Ｓ.シーブに通し 、完全に混合する。ポリビニルピロリドンの溶液を得られる粉末と混合し、次い で、これをＮｏ．１４メッシュＵ．Ｓ．シーブに通す。そのようにして得られた 顆粒を５０〜６０℃で乾燥し、Ｎｏ．１８メッシュＵ．Ｓ．シーブに通す。次に 、あらかじめＮｏ．６０メッシュＵ．Ｓ．シーブに通したナトリウムカルボキシ メチルデンプン、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクを顆粒に加え、混合し た後、打錠器で圧縮して錠剤を得る。 用量５mLあたり活性成分０．１−１０００ｍｇを含む懸濁剤を以下のごとく製 造する。製剤例８ ：懸濁剤 成 分 量（ｍg/５ｍＬ） 活性成分 ０．１−１０００ｍｇ ナトリウムカルボキシメチルセルロース ５０ｍｇ シロップ １．２５ｍｇ 安息香酸溶液 ０．１０ｍＬ 香味料 適量 着色料 適量 精製水 終量５ｍＬ 活性成分をＮｏ．４５メッシュＵ．Ｓ．シーブに通し、ナトリウムカルボキシメ チルセルロースおよびシロップと混合し、滑らかなペーストとする。安息香酸溶 液、香味料および着色料を、撹拌しながら、水で希釈し、加える。次に、十分な 水を加えて所要量とする。細胞の化合物Ａ*による処理 ヒトＨｅｐＧ２細胞を、１０ｎＭセレン、５０ｕＭ２アミノエタノール、２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび５０ｕｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび２．５％ウシ胎児 血清を添加した、ダルベッコ改良イーグル培地とハム栄養混合液Ｆ１２の３：１ ｖ／ｖ混合物中で培養した。細胞がコンフルエントに達してから、単層培養をＨ ＢＳＳで１度すすぎ、１０ｎＭ化合物Ａを添加するかまたは添加していない、Ｆ ＢＳ不含、１００ｕｇ／ｍＬ無脂肪酸ＢＳＡ、０．８ｕｇ／ｍＬオレイン酸含有 、上記培地で培養した。２４時間インキュベーション後、細胞を処理して核抽出 物とし、核因子アッセイを、下記およびReifel-Millerら(Reifel-Miller，A.E. ，Berg,D.T.およびGrinnell，B.G.(1991)The Journal of Biological Chemistry 266，13873-13882)に記載のごとく実施した。ゲル移動度遅延アッセイによる核因子結合 −核抽出物を、Dignam，J.D.，Lebovits，R．M.およびRoeder，R．G．(1983)Nuc leic Acids Res．11，1475-1489に記載のごとく製造した。ゲル移動度遅延アッ セイのためのＮＦ−ｋＢの核因子結合部位は、VCAM-1由来の5'-CCTTGAAGGGATTTC CCTCCGCCT-3であり、ＢＥＦ−１の核因子結合部位はプロトタイプ配列5'-AGTGCA TGACTGGGCAGCCAGCCAGTGGCAG-3'であった。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ(Bethe sda Research Laboratories，Inc.)と（ｇ−³²ｐ）ＡＴＰ(Du Pont-New Wngland Nuclear)を用いてオリゴヌクレオチドの５’末端を標識した。ＢＥＦ−１また は精製ヒトＮＦ−ｋＢタンパク質（ｐ４９およびｐ５０）を含む核抽出物をプロ ーブ０．２−０．３ｐｍｏｌ（約１００００ｃｐｍ）を用いて２５℃で３０分イ ンキュベートした。反応混合物10-uLには、ポリ(dI-dC)-ポリ(dI-dC)(Pharmacia )、１５％グリセロール、２０ｍＭ HEPES(pH7.9)、１００ｍＭ ＫＣｌ、５mM Ｍ ｇＣｌ₂、0.2ｍＭ ＥＤＴＡおよび0.5mMジチオスレイトールも含まれた。３０分 インキュベーション後、Fried，M.およびCrothers，D．M.(1981)Nucleic Acids Res．9,6505-6525の記載に従って、試料を４％低イオン強度ポリアクリルアミド ゲル電気泳動にかけた。ゲルを乾燥した後、特異的タンパク質−ＤＮＡコンプレ ックスをオートラジオグラフィにより可視化し、Betascope 603 Blot Analyzer またはホスホイメージャー(Molecular Dynamics)を用いて定量した。Betascope 603 Blot Analyzerを用いた定量結果を、タンパク質１ｕｇあたりの標識結合プ ローブ量／遊離プローブ量で表す。ホスホイメージャーによるデータはＴＰ標識 ゲルソフトウエア（Ver 1.5，Signal Analytics Corp.）を用いて分析し、ピク セル（画素）強度単位（ＰＵ）で表す。結果 転写因子結合アッセイを用い、細胞抽出物中に存在するＢＥＦ−１のＶＣＡＭ ＮＦ−ｋＢ結合部位に対する結合能、および逆に精製ＮＦ−ｋＢ ｐ４９および ｐ５０のＢＥＦ−１結合部位に対する結合能について評価した。２濃度のＢＥＦ −１を含む核抽出物を用いて表１に示すように、VCAM-1 NF-kB結合部位に対する ＢＲＦ−１の濃度依存性結合が得られた。表２に示すように、精製ＮＦ−ｋＢタ ンパク質(ｐ５０およびｐ４９：Promega)は、濃度依存性にプロトタイプＢＥＦ −１結合部位と結合した。予期したように、これら２つのＮＦ−ｋＢタンパク質 もVCAM NF-kB結合部位と結合した。 細胞内ＢＥＦ−１レベルに対する化合物Ａの影響を、化合物Ａ処理および無処 理ヒトＨｅｐＧ２細胞から製造した核抽出物中のＢＥＦ−１結合活性を測定する ことにより検討した。表３に示すように、４つの別個の試験において、１０ｎＭ 化合物Ａで細胞を処理することによりＢＥＦ−１レベルは１９３〜２９３％（平 均２５３±４２）増加した。このように、化合物Ａは細胞内レプレッサーＢＥＦ −１レベルを増加させ、ＢＥＦ−１によって調節される遺伝子の活性を調節する ことができる。さらに、ＮＦ−ｋＢ結合部位と相互作用するＢＥＦ−１の能力は 、化合物Ａが重要な細胞調節分子ＮＦ−ｋＢの作用をブロックするのに有効であ ることを示唆する。 ＊ 化合物Ａは、Ｒ₁とＲ₃がヒドロキシであり、Ｒ₂がピロリジノである式Ｉの化 合物である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ， ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，Ｔ Ｄ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ )，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 グリネル，ブライアン・ダブリュー アメリカ合衆国46220インディアナ州 イ ンディアナポリス、イースト・セブンティ ファースト・ストリート3625番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＮＦ−ｋＢ転写因子の調節方法であって、式： Ｒ²はピロリジン、ヘキサメチレンイミノおよびピペリジノからなる群から選ば れる］ で示される化合物またはその医薬的に許容される塩または溶媒和物の有効量を、 該調節を必要とするヒトに投与することを含む方法。 ２．該化合物がその塩酸塩である請求項１に記載の方法。 ３．該化合物が、 またはその塩酸塩である請求項１に記載の方法。