JPH11506459A

JPH11506459A - コレラの処置

Info

Publication number: JPH11506459A
Application number: JP9500023A
Authority: JP
Inventors: ディー．ヒアーズ，ルイス; ディー．アームストロング，グレン
Original assignee: シンソーブバイオテック，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-04-18
Publication date: 1999-06-08
Also published as: EP0831915A1; WO1996039191A1; NZ305317A; US5661131A; AU5329496A; AU704203B2; CA2210291A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、V.colerae毒素および／または１つ以上の微生物V.coleraeの血清型に結合するオリゴサッカリド組成物を用いるコレラおよび関連する状態の処置に関する。より詳細には、本発明はV.colerae毒素および／または腸管からの微生物の中和および除去に関する。

Description

【発明の詳細な説明】コレラの処置発明の分野本発明はコレラの処置に関する。さらに詳細には、本発明はコレラ毒素の中和および除去に関する。本発明はまた、腸管からコレラの原因因子、Vibrio chole raeの結合および除去に関する。参考文献以下の参考文献は角括弧（[]）内の数字として本出願の関連の箇所で本出願中において引用される。上記の刊行物、特許、および特許出願の開示内容は、各々の個別の出版物、特許および特許出願内の言葉が特定して個別に本明細書中に含まれるのと同程度に、それらの全体が本明細書中で参考として援用される。発明の背景コレラは、世界中（主に開発途上国）で１年間に約３千万人の個体が感染する重篤な下痢疾患である。これは、微生物Vibro choleraeが混入した食物または飲み物を消費することにより起こる。この微生物は経口摂取されると腸管でコロニーを作る能力を有する。小腸において、V.choleraeは腸管粘膜に付着し、そして外毒素を放出する。最も重要なものはコレラ毒素(CT)であり、これは粘膜細胞に作用する[１〜４]。腸細胞でのCTの作用は、液体分泌および小腸内へ電解質の透過性の増大を誘導し、重篤な下痢および電解質不均衡を生じる。２つの他の毒素がまたV.coleraeにより産生される。これらは、細胞間の強固な結合を崩壊させる閉塞帯毒素(Zot)、および動物において下痢を引き起こすアクセサリーコレラエンテロトキシン(Ace)を含む。この疾患の全体的な病原におけるこれら２つの役割はまだ明らかではない。さらなる細胞障害性毒素が、V.coleraeの01 E1 Torおよび0139血清型により産生される。この毒素は、コレラの病原において役割をはたすようである溶血性および細胞障害活性を有する。死亡率はコレラに感染した乳児および小児において高い。コレラの処置の最近の方法は、体液の置換および電解質バランスの回復である。 V.coleraeのすべての株が疾患を引き起こす原因であるわけではない。疾患を引き起こす株は、クラシカルおよびE1 Tor 生物型を含む01血清型に属する。１つを除いて全ての他の血清型は、非毒性でありまたはわずかな下痢を引き起こし得ると考えられている。完全に発達したコレラを引き起こすことが示されている唯一のV.coleraeの非01株が２年前に同定された。これは0139血清型に属する。この血清型は、アジアにおけるコレラの近年の激増に対する原因因子として同定された。これは、V.coleraeの01血清型に関連する全ての毒性因子（CTを含む）を産生する。疾患を引き起こすことに対する最も重要な毒性因子は、V .coleraeが小腸内でコロニーを形成することを可能にする毒素同時調節繊毛(Tcp)である。宿主細胞レセプターが繊毛に対して同定されなければならないが、炭水化物が関与し得ることを示唆する間接的な証拠がある。この証拠は、Ｏ血液型を有する個体がコレラの重篤な症例に対して感受性がより高く、一方、AB血液型ポジティブを有する人々がこの疾患に対していくらか耐性である傾向を有するという知見に基づく。この知見に対する１つの可能性のある説明は、V.coleraeにおいて見出された繊毛が、小腸のコロニー形成のためにＯ血液型型オリゴサッカリド構造を用い得、従ってＯ血液型を有する個体に、疾患に対してより高い感受性を与えるということである。 CTは、この疾患の徴候に対して最も原因となる毒性因子である。CTは、宿主細胞内のサイクリックAMP(cAMP)レベルを上昇させる酵素活性を有する。cAMPレベルの上昇は、細胞内のイオン輸送系を変化させ、腸内の浸透圧バランスに影響し、下痢に導く。CTは宿主細胞レセプターに結合するために、ガングリオシドGM1( βGal(1-3)βGalNAc(1-4)[αNeuAc(2-3)]βGal(1-4)βGlc-セラミド)を利用する。コレラ毒素(CT)は、シアル酸のカルボキシル基が多くのC(1)アミドを形成するように改変されたガングリオシドGM1のいくつかの誘導体に結合することが示されている[5]。これらの化合物の構造は：βGal(1-3)βGalNAc(1-4)[αNeuAcR(2- 3)]βGal(1-4)βGlc-セラミドであり、ここでRはシアル酸のアミド、メチルアミド、エチルアミド、プロピルアミド、およびベンジルアミドからなる群より選択される。 CTに結合することが示されたGM1の他の誘導体は:βGal(1-3)βGalNH2(1-4)[α NeuAcR(2-3)]βGal(1-4)βGlc-セラミド；βGal(1-3)βGalNAc(1-4)[αNeuAcR(2 -3)]βGal(1-4)βGlc-セラミド（ここでRはシアル酸のメチルエステルである）；βGal(1-3)βGalNAc(1-4)[α(C7)NeuAc(2-3)]βGal(1-4)βGlc-セラミド；およびβGal(1-3)βGalNAc(1-4)[αNeuAcR(2-3)]βGal(1-4)βGlc-セラミド（ここでRはエタノールアミンアミドである）を含む[6]。 CTに結合することが示されている他のガングリオシドは:GM2(βGalNAc(1-4)[ αNeuAcR(2-3)]βGal(1-4)βGlc-セラミド)およびGD1b(βGal(1-3)βGalNAc(1-4 )[αNeuAc(2-3)αNeuAc(2-3)]βGal(1-4)βGlc-セラミドを含む[6,7]。さらに、高度に精製されたCT調製物は、リゾGM1ガングリオシドまたはガラクトースアフィニティーカラムを用いて得られている[8-10]。サンプル中のCTの存在の診断方法に関して、サンプル中のVibrio choleraeを検出するための１つの方法はサンプルを培養することである。この方法の不利な点としては、必要な時間の長さおよび非病原性の（すなわち非毒素産生）V.cole rae株による干渉が挙げられる。他の方法としては、特異的な抗血清またはモノクローナル抗体の使用が挙げられる。上記の観点から、コレラを処置する化合物が必要である。好ましい化合物は、経口のように非侵襲的に投与され、そして腸管から毒素および／または生物を特異的に除去する。発明の要旨本発明は、コレラ毒素により引き起こされるコレラおよび関連した症状を処置するための組成物および方法を提供する。本発明はまた、V.choleraeによる消化管のコロニー形成により引き起こされるコレラおよび関連した症状を処置するための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、被検体におけるコレラを処置するための方法を提供する。この方法は、非ペプチド性の適合性リンカーアームを通じて薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体（inert support）に共有結合されたオリゴサッカリド配列を含有する組成物の有効量をこのような処置を必要とする被検体に投与することを含む。ここで上記オリゴサッカリド配列はコレラ毒素に結合し、そして上記組成物は消化管から除去され得る。さらなる局面において、本発明は、コレラ毒素により発症されるコレラおよび関連する状態の処置に有用な薬学組成物を提供する。この組成物は、非ペプチド性の適合性リンカーアームを通じて薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体に共有結合されたオリゴサッカリド配列（ここでオリゴサッカリド配列はコレラ毒素に結合する）；および薬学的に受容可能なキャリアを含有する。ここで上記組成物は、消化管から除去され得る。なおさらなる局面において、本発明は、被検体におけるコレラを処置する方法を提供する。この方法は、非ペプチド性の適合性リンカーアームを通じて薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体に共有結合されたオリゴサッカリド配列を含有する組成物の有効量をこのような処置を必要とする被検体に投与することを含む。ここで上記オリゴサッカリド配列は、V.coleraeに結合し、そして上記組成物は、消化管から微生物が除去されるように微生物に結合し得る。なおさらなる局面において、本発明は、コレラおよび関連する状態の処置に有用な薬学組成物を提供する。この組成物は、非ペプチド性の適合性リンカーアームを通じて糖薬学的に受容可能な固体、不活性な支持体に共有結合されたオリゴサッカリド配列（ここで上記オリゴ配列は、V.choleraeに結合する）；および薬学的に受容可能なキャリアを含有する（ここで組成物は、消化管から微生物が除去されるように微生物に結合し得る）。なおさらなる局面において、本発明は、コレラ毒素および／またはV.cholerae 生物を、その毒素および生物を含有すると疑われるサンプルから結合および除去するための方法を提供する。この方法は、非ペプチド性の適合性リンカーアームを通じて固体の不活性な支持体に共有結合されたオリゴサッカリド配列と上記サンプルを接触させること（ここでオリゴサッカリド配列は、コレラ毒素および／またはV.colerae生物がその支持体に吸収される条件下で、そのコレラ毒素および／またはV.cholerae生物に結合する）；ならびにサンプルから吸収された毒素および／または生物を含有する支持体を分離することを含む。図面の簡単な説明図１は、種々のオリゴサッカリド配列を含有するSYNSORBのパネルを用いる、精製したコレラ毒素の細胞毒素の中和を示す。いくつかのSYNSORBがコレラ毒素活性を効果的に中和することを見出した。図２は、SYNSORB16、19、41、72、75、および88を用いたコレラ毒素活性の濃度依存的中和を示す。これらのSYNSORBの全ては、20mg/mlの濃度において約75％より多くのコレラ毒素活性を効果的に中和し得る。図３は、20mg/mlの濃度のSYNSORB16、41、72、75、および88を用いる、0139 V .coleraeにより産生されるコレラ毒素およびコレラ細胞毒素活性の中和を示す。いくつかのSYNSORBは両方の活性を中和することにおいて効果的であった。図４は、20mg/mlの濃度のSYNSORB16、41、72、75および88を用いる、01(E1 To r 生物型)V.coleraeにより産生されるコレラ毒素およびコレラ細胞毒素活性の中和を示す。いくつかのSYNSORBは両方の活性を中和することにおいて効果的であった。図５は、ウサギ腸ループのコレラ毒素媒介液体分泌を減少させることにおける SYNSORB16および75の有効性を示す。0.5g/kgの用量で用いたSYNSORB75は、精製コレラ毒素で処理されたウサギ腸ループの液体分泌を有意に減少させた。図６は、ウサギ腸ループのコレラ毒素媒介マンニトール透過性を減少させることにおけるSYNSORB16および75の有効性を示す。0.1g/kgの用量で用いたSYNSORB7 5および0.5g/kgの用量で用いたSYNSORB16は、精製コレラ毒素で処理されたウサギ腸ループの腸の透過性を有意に減少させた。図７は、01 V.colerae（クラシカル）に結合することにおけるSYNSORBの有効性を示す。この結果は、V.coleraeのクラシカル生物型がSYNSORB１、41、57、および90の表面に結合することを示す。図８は、01 V.colerae（E1 Tor）に結合することにおけるSYNSORBの有効性を示す。この結果は、V.coleraeのE1 Tor生物型がSYNSORB１、５、57、および72の表面に結合することを示す。図９は、0139 V.colerae（E1 Tor）に結合することにおけるSYNSORBの有効性を例証する。この結果は、V.coleraeの0139血清型がSYNSORB２、５、57、および 90に結合することを示す。発明の詳細な説明Ａ．定義本明細書中で用いられる以下の用語は以下の意味を有する：用語「コレラ」は、Vibriio choleraeにより引き起こされる、急性流行性感染疾患をいう。ここでVibrioによって腸管内に精巧に作られた可溶性毒素は、粘膜の透過性を変化させ、非常に水分が多い下痢、液体および電解質の極度の損失、ならびに脱水状態および循環虚脱を引き起こすが、腸の粘膜において大きな形態学的変化を引き起こさない。用語「生体適合性」は、ヒト組織または体液に関して化学的不活性をいう。生体適合性物質は非感作性である。用語「適合性リンカーアーム」は、オリゴサッカリド構造に生体適合性固体支持体から間隔をもたせるように働き、そして二官能性である成分をいう。ここで一方の官能基は支持体の相互的な（reciprocal）官能基に結合し得、そして他方の官能基はオリゴサッカリド構造の相互的な官能基に結合し得る。本発明において好ましい適合性リンカーアームは、非ペプチド性のスペーサーアームである。用語「固体支持体」は、オリゴサッカリド配列が適合性リンカーアームを介して結合し得る不活性な固体物質をいう。インビボで使用される場合、固体支持体は生体適合性である。用語「SYNSORB」は、Chromosorb P^TM（Manville Corp.，Denver，Colorado）[ 11]（誘導体化したシリカ粒子である）に共有結合した合成8-メトキシカルボニルオクチルオリゴサッカリド構造体をいう。用語「コレラ毒素」は、コレラおよび関連する状態を発症するV.choleraeの腸毒素をいう。この毒素はレクチン様活性を有する。この出願の目的のために、すべての糖は従来の３文字命名法を用いて言及される。他に記載しない限りすべての糖はＤ型であるとみなされるが、フコースは例外であり、Ｌ型である。さらに、すべての糖はピラノース型である。Ｂ．合成オリゴサッカリド構造合成のための化学的方法は、当該分野で公知の方法により達成され得る。これらの物質は、一般的には適切に保護された個々の単糖を用いて構築される。用いられる特定の方法は、一般的には合成されるべき各々の個別の構造について適応され至適化される。一般に、オリゴサッカリドグリコシドの全部または一部の化学合成は、まず還元糖または単糖のアノマー炭素原子におけるグリコシド結合の形成を含む。詳細には、適切に保護された形態の天然に存在するかまたは化学的に修飾されたサッカリド構造体（グリコシルドナー）が、ハロゲン化合物、トリクロロアセトイミデート、アセチル、チオグリコシドなどを含む脱離基を導入するように還元単位のアノマー中心で選択的に改変される。次いで、ドナーはアグリコンまたはグリコシド結合が確立されるべき位置に１つの遊離ヒドロキシル基を保有するアグリコンまたは適切な形態の炭水化物アクセプターと当該分野で周知の触媒条件下で反応させられる。種々のアグリコン成分が当該分野で公知であり、そして適切な配置で還元単位のアノマー中心に付着され得る。適合性ブロッキング基の適切な使用（炭化水素合成の分野で周知である）は、合成された構造の選択的な改変あるいはさらなる糖単位または糖ブロック（suga r block）のアクセプター構造へのさらなる付着を可能にする。グリコシド結合の形成後、サッカリドグリコシドは、さらなるサッカリド単位の結合を達成するために用いられるか、選択された位置で化学的に修飾されるか、または従来の脱保護後に酵素的な合成に使用され得る。一般に、天然に存在するかまたは化学的に修飾されたサッカリド単位のサッカリドグリコシドへの化学的な結合は、文献[12〜28]に詳細に十分に記載されている確立された化学を用いることにより達成される。本発明のオリゴサッカリド構造体が結合する固体支持体は、シートまたは粒子の形態であり得る。種々の生体適合性固体支持体物質が当業者に公知である。これらの例は、シリカ、多孔性ガラスのような合成ケイ酸塩、ケイ藻土のような生体ケイ酸塩、高陵石のようなケイ酸塩含有物質、ならびにポリスチレン、ポリエチレン、および多糖のような合成ポリマーである。無機物質からなる固体支持体が好ましい。好ましくは、インビボで使用するためには、固体支持体は約10から 500マイクロンの間の粒子サイズを有する。特に、100〜200マイクロンの粒子サイズが好ましい。オリゴサッカリド構造体は、固体支持体上に共有結合されるかまたは非共有的（受動的）に吸着される。共有結合は、支持体上の官能基とオリゴサッカリド構造体の適合性リンカーアームとの間の反応を介し得る。適合性リンカーアームを通じたオリゴサッカリド構造体の生体適合性固体支持体への付着が、固体支持体にも関わらず効果的に毒素を除去する産物を提供することが思いがけず見出された。間接的な結合に使用される結合成分は、好ましくは適切な長さ（少なくとも１つの炭素原子）の有機的な二官機能性であり、これは固体支持体の表面からオリゴサッカリド構造を引き離すように働く。本発明の組成物は好ましくは以下の式で表される： (オリゴサッカリド-Ｙ-Ｒ)_n-固体支持体ここでオリゴサッカリドは、少なくとも２つの糖単位のオリゴ糖基を表し、このオリゴ糖基はコレラ毒素および／またはV.choleraeに結合する。Ｙは酸素、イオウ、または窒素である。Ｒは少なくとも１炭素原子のアグリコン結合アームである。固体支持体は先に定義した通りである。そしてｎは１以上の整数である。好ましくはアグリコンは、１〜約10炭素原子である。約１〜10の糖単位を含有するオリゴサッカリド配列が使用され得る。約１〜３のサッカリド単位を有する配列が好ましい。好ましくは、ｎは、組成物が組成物１グラム当たり約0.25〜2.50μ molのオリゴサッカリドを含有するような整数である。多数のアグリコン結合アームが当該分野で公知である。例えば、p-ニトロフェニル基（すなわち、-OC₆H₄pNO₂）を含む結合アームが開示されている[29]。合成の間の適切な時期に、ニトロ基はアミノ基に還元される。このアミノ基はN-トリフルオロアセトアミドとして保護され得る。支持体への結合の前に、トリフルオロアセトアミド基が取り除かれ、それによりアミノ基がアンチマスキングされる。イオウを含有する結合アームが開示されている[37]。詳細には、この結合アームは2-ブロモエチル基に由来し、この2-ブロモエチル基は、チオヌクレオフィルを用いた置換反応において、-OCH₂CH₂SCH₂CO₂CH₃および-OCH₂CH₂SC₆H₄-pNH₂のような種々の末端官能基を保有する結合アームに至ることが示されている。これらの末端官能基は、固体支持体上の相補的な官能基への反応を可能し、それにより固体支持体への共有結合が形成される。このような反応は当該分野で周知である。 6-トリフルオロアセトアミド-ヘキシル結合アーム(-O-(CH₂)₆-NHCOCF₃)が開示されている[38]。ここでトリフルオロアセトアミド保護基は取り除かれ得、結合に用いられた１級アミノ基がアンチマスキングされる。公知の結合アームの他の例示としては、以下が挙げられる：7-メトキシカルボニル-3,6,ジオキサヘプチル結合アーム[32](-OCH₂-CH₂)₂OCH₂CO₂CH₃)；2-(4-メトキシカルボニルブタンカルボキサミド)エチル[33](-OCH₂CH₂NHC(O)(CH₂)₄CO₂C H₃)；アリル結合アーム[34](-OCH₂CH＝CH₂)、これは、適切なモノマーとのラジカル共重合により、コポリマーに至る；他のアリル結合アーム[35]が公知である (-O(CH₂CH₂O)₂CH₂CH＝CH₂)。さらに、アリル結合アームは2-アミノエタンチオール[36]の存在下で誘導体化されて、結合アーム-OCH₂CH₂CH₂SCH₂CH₂NH₂を提供し得る。他の適切な結合アームもまた開示されている[12〜14、16、17]。オリゴサッカリド基を固体支持体に共有結合的に付着させるのに用いられる特定の結合は重要ではない。好ましくは、アグリコン結合アームは疎水性基であり、もっとも好ましくは、アグリコン結合アームは-(CH₂)₈C(O)-、-(CH₂)₅OCH₂CH₂CH₂-、および-(CH₂)₈CH₂ O-からなる群から選択される疎水性基である。本発明者らは、生体適合性固体支持体（例えば、Chromosorb P^TM(SYNSORB)）に共有結合的に付着した合成オリゴサッカリド配列が、コレラ毒素および／またはV.choleraeに結合させるために使用され得ることを見出した。これらの組成物はコレラおよび関連する状態を処置するのに有用である。SYNSORBはこれらの組成物に特に有用である。なぜなら、これは非毒性であり、そして機械的および化学的析出に耐性であるからである。ラット（ヒト応答を予想し得ることから、前臨床研究に広く受容されているモデル）を用いた研究において、SYNSORBはラット胃腸管を影響を受けずに通過することが見出された。これらは、経口投与の後、完全にそして迅速に（72時間内に99%除去される）が除去されることが示されている。さらに、SYNSORB上の高密度のオリゴサッカリド成分は、コレラ毒素を結合させるのに特に有用である。なぜなら、この毒素は複数のオリゴサッカリド結合部分を保有すると考えられるからである[２]。SYNSORB上の高密度のオリゴサッカリドリガンドはまた、多数のV.choleraeの結合に有用である。非ペプチド性の結合アームが、本発明の適合性結合アームとしての使用のために好ましい。糖ペプチドの使用は所望されない。なぜなら、糖ペプチドは同じタンパク質に結合したいくつかの（しばしば異なる）オリゴサッカリドを含有するからである。糖ペプチドはまた、大量に得ることが困難であり、そして費用と時間のかかる精製を必要とする。同様に、BSAまたはHAS抱合体の使用は、例えば経口投与した場合に胃腸管における安定性に疑問があるので所望されない。コレラ毒素またはV.cholerae結合単位を含有するオリゴサッカリド基の、非ペプチドスペーサーアームを通じた不活性な固体支持体への共有結合的な付着は、コレラ毒素および／または生物の存在について分析すべきサンプルまたはコレラを患う患者の腸からの、コレラ毒素および/または微生物の効果的な結合および除去を可能にする。オリゴサッカリドがこの付着した適合性リンカーアーム（非誘導形態で）を用いて合成される場合、種々の固体支持体と結合し得る高度に純粋な組成物を達成し得る。Ｃ．薬学組成物本発明の方法は、１以上のオリゴサッカリド構造体を含有する薬学組成物を用いることにより達成される。このオリゴサッカリド構造体は固体支持体に付着した、コレラ毒素および/またはV.choleraeに結合する。経口投与（これが好ましい）に使用される場合、これらの組成物は種々の方法で製剤化され得る。液体形状または半固体形状が好ましい。水のような液体の薬学的に不活性なキャリアを含有する組成物が、経口投与のために考慮され得る。他の薬学的に適合性の液体または半固体も用いられ得る。このような液体および半固体の使用は、当業者に周知である。アップルソース、アイスクリームまたはプディングのような半固体食品と混合され得る組成物もまた好ましくあり得る。不快な味または後味を有さない処方物（例えば、SYNSORB）が好ましい。経鼻胃管もまた、組成物を胃に直接送達するために使用され得る。固体組成物も使用され得、そして薬学的に不活性なキャリアを含有する製剤中で必要に応じてそして簡便に使用され得る。薬学的に不活性なキャリアは、例えば、ラクトース、デンプン、デキストリンまたはマグネシウムステアレートなどの従来の固体キャリアを含み、これらは簡便に錠剤またはカプセルの形態で提供される。SYNSORB自体もまた、不活性な薬学的キャリアの添加なしに、特にカプセルの形態での使用のために使用され得る。用量は、罹患した患者の腸内に見出されるコレラ毒素および/またはV.cholera eの中和および除去を提供するために選択される。好ましい用量は約0.25〜1.25 μmolオリゴサッカリド/kg体重/日であり、より好ましくは約0.5〜1.0μmolオリゴサッカリド/kg体重/日である。SYNSORB組成物を使用するとき、これは約0.5〜 1.0g SYNSORB/kg体重/日を意味し、これは約20 mg/mlの腸内SYNSORB濃度を与える。投与は、１週間の期間または臨床的な症状が消失するまでの間１日に３〜４回であることが期待される。用量レベルおよび投与のスケジュールは、用いる特定のオリゴサッカリド構造体、被験体の年齢および症状などの因子に依存して変化し得る。コレラ毒素活性を完全に除去するための最適な時間は、１mlサンプル中に20mgの濃度のSYNSORBを用いて、37℃で約１時間であることが見出された。同様の条件が、腸からV.choleraeを効果的に結合および除去するために使用され得る。本発明のオリゴサッカリド含有組成物の７日間までの投与は、コレラおよび関連状態の処置において有用である。また、予防的投与は、V.choleraeによる腸のコロニー形成、および引き続く疾患の進行を妨げるために有用である。先に考察したように、経口投与が好ましいが、処方物は経直腸のような他の投与手段についても考慮され得る。これらの処方物の有用性は使用される特定の組成物および処置を受ける特定の被験体に依存し得る。これらの製剤は、油性、水性、または乳状であり得る液体キャリアを含有し得るか、あるいは投与の様式に適切な所定の溶媒を含有し得る。組成物は、単位用量形態、あるいは複数またはサブ単位用量で製剤化され得る。上記の期待される用量のために、経口投与される液体組成物は好ましくは約１ μmolオリゴサッカリド/mlを含有するべきである。Ｄ．方法論本発明者らは、コレラ毒素が、この毒素に結合する特定のオリゴサッカリド配列により中和され得ることを見出した。特に、固体支持体に非ペプチド性の適合性リンカーアームを介して共有結合的に付着されたこのようなオリゴサッカリドは、コレラ毒素を効果的に中和することが見出された。このような組成物の例は所定のSYNSORBであり、これはコレラ毒素活性に結合しそして中和する。本発明者らはまた、V.choleraeが、固体支持体に非ペプチド性の適合性リンカーアームを介して共有結合的に付着された所定のオリゴサッカリド配列に結合し得ることを見出した。このような組成物の例は特定のSYNSORBであり、これはV.c holeraeに結合し、それによって除去される前に生物が腸管内の宿主細胞レセプターに付着することを妨げる。本発明者らは、Chromosorb Pに8-メトキシカルボニルオクチル（MCO）スペーサーアームを介して付着したいくつかのオリゴサッカリド配列のコレラ毒素を中和し、そしてV.choleraeに結合する能力を試験した。試験した構造（SYNSORBとも呼ばれる）を表１に示す。図１〜４に示すように、試験したSYNSORBは、LT活性を少なくとも約50％中和する能力において多様である。図７〜９は、SYNSORB のV.choleraeに結合する能力を示す。本発明において有用な固体支持体に付着したオリゴサッカリド配列は、コレラ毒素を結合するオリゴサッカリド配列を含む。オリゴサッカリドのコレラ毒素に対する結合親和性は、例えば以下の実施例１に記載のような、簡単なインビトロ試験により容易に検出され得る。本発明の目的のためには、コレラ毒素に結合する固体支持体に付着したオリゴサッカリド配列は、実施例の項に示したアッセイを用いて、チャイニーズハムスター卵母(CHO)細胞アッセイにおける細胞毒性活性由来の終点力価を少なくとも50％減少させるオリゴサッカリド組成物を意味する。本発明において有用な固体支持体に付着した他のオリゴサッカリド配列は、いずれの付着したオリゴサッカリド配列をも含まないコントロールの支持体（例えば、Chromosorb P）よりも良好に（p≦0.05、WilcoxonまたはスチューデントのＴ検定のような適切な標準的な統計的方法を用いて）V.choleraeに結合し得るオリゴサッカリド配列である。オリゴサッカリドのV.choleraeに対する結合親和性は、以下の実施例６に概略されるように決定される。志賀様毒素（SLT）およびClostridium difficile 毒素Ａの、化学的に合成されるオリゴサッカリド配列への結合が研究されている[37〜41]。 SLTは、２つの部分（ＡサブユニットおよびＢオリゴマー）からなる毒素の群である。Ｂオリゴマーは、宿主細胞レセプターへの結合を可能にする毒素の結合部分である。SLT毒素は、αGal(1-4)βGal(1-4)決定因子を含有する糖脂質受容体に結合する。Ａサブユニットは、哺乳動物細胞内の28SリボソーマルRNAを脱プリン化する酵素活性（N-グリコシダーゼ）を有する。この酵素活性は、タンパク質合成を行うための毒素感染細胞の能力を破壊する。 SLTの作用部位は腎臓および腸管膜血管系に見出される内皮細胞であり、そしてSLTは腎不全および尿中ヘモグロビンを生じ得る損傷を引き起こし得る。SLTは溶血性尿毒症症候群における原因物質である。SLTはまた出血性大腸炎（血下痢）に一部関与し得る。 Clostridium difficile トキシンＡは、体液分泌、粘膜損傷、および腸炎も誘導するエンテロトキシンである。これは、ヒト好中球に対する化学的誘引物質として働く。トキシンＡは単一のタンパク質である。これは、活性化を引き起こし、そして単核細胞においてサイトカインの放出を生じる。これらの炎症の影響は、偽膜性大腸炎において見られるコロニー性炎症の誘導において重要な役割を担い得る。トキシンＡは、糖タンパク質レセプターへの結合するようであるが、その構造はまだ決定されていない。作用機構は、完全には理解されていないが、トキシンＡは、レセプター媒介形質捲く陥入を通じて細胞内に入り、そして細胞のアクチン細胞骨格に影響すると考えられている。トキシンＡレセプターは、グアニン調節タンパク質に結合すると考えらている。トキシンＡは、CDADおよびPMCの産生における最初の工程である。対照的に、コレラ毒素は、５つの同一のＢサブユニットおよび１つのＡサブユニットを有するAB₅６量体タンパク質である。Ｂ５量体は糖脂質レセプター(ガングリオシドGM1)を通して腸の細胞を認識し、そして結合する。次いでＡサブユニットは、酵素的に活性であり、細胞内部に輸送され、そこでサイクリックAMPレベルの上昇を引き起こし、コレラおよび関連する状態を特徴付ける液体の大規模な損失を導く。コレラ毒素のオリゴサッカリド結合特異性を規定する先の研究は、毒素結合のためのいくつかの構造的な必要物を同定した[1,5-10]。コレラ毒素結合のための主要な構造的な必要物は、βGal(1-3)βGalNAc(1-4)[αNeuAc(2-3)βGal[7]である。コレラ毒素はまたガラクトース親和性カラムに結合することが示されており、これは末端ガラクトース糖が毒素結合に重要であることを示す[8]。末端ガラクトース糖の重要性またガングリオシドGM2(βGalNAc(1-4)[αNeuac(2-3)βGal( 1-4)βGlc-セラミド)[6]へのコレラ毒素の減少した結合において確認されている。シアル酸はコレラ毒素結合において主要な役割を果たす[1,5]。アジアロGM1( βGal(1-3)βGalNAc(1-4)βGal(1-4)βGlc-セラミドを形成するためのGM1からのシアル酸の除去は、コレラ毒素結合を劇的に減少する[6]。毒素中和研究のために選択されるSYNSORBは、GM1オリゴサッカリド構造の選択されるセグメントを取り込む炭水化物を含む。結合研究のために選択される他の付加的なSYNSORBは、G M1ガングリオシド構造における選択された配列のアナログを表すオリゴサッカリド配列を含む。末端のβGal(1-3)βGal(1-4)βGal(1)成分を含むオリゴサッカリド構造はまた本発明において有用である。 SYNSORBに吸着するコレラ毒素の量を、いずれのSYNSORBも加えられていないコントロールと比較した残存する毒素活性のパーセントについて上清をアッセイすることにより決定した。結果を図１および図２に示す。SYNSORB16、19、41、72 、75、および88は、コレラ毒素活性を効果的に除去することが見出された。これらのSYNSORBのうち４つ(41、72、75および88)は、コレラ毒素に結合することが以前に示されていなかったオリゴサッカリド配列を含んでいた。従って、本発明者らは、コレラ毒素を中和する能力が不活性支持に付着したオリゴサッカリド配列に直接関連することを見出した。図１および図２における結果は、高親和性毒素結合に対するβGal(1-3)βGalNAc結合の重要性を示す。さらに、本発明者らは、βGal(1-3)βGalNAc(1-4)βGalおよびαNeuAc(2-3)βGalを有するオリゴサッカリド配列が高親和性毒素結合を示すことを見出した。さらに、βGal(1-3)βGal結合を有するオリゴサッカリド配列に結合するコレラ毒素を見出した。この構造は、GM1構造において見出されたβGal(1-3)βGalNAc配列のアナログを示す。図１および図２に示した結果は、残存する毒素活性のパーセントを示す。これらの結果は、SYNSORBを精製コレラ毒素に添加した場合、コントロールと比較した終点希釈における減少を示すチャイニーズハムスター卵母細胞(CHO)細胞を用いる組織培養アッセイにおいて得られた。適合性リンカーアームを通じて固体支持体に付着したいくつかの異なるオリゴサッカリド配列が、コレラ毒素活性を中和する能力を有することを見出した。これらの配列およびコレラ毒素を結合する別の配列は、コレラおよび関連する状態を処置するために使用され得る。コレラ毒素活性を完全に除去するための最適な時間は、１mlサンプル中に20mgのSYNSORB濃度を用いて、37℃で約１時間であることを見出した。SYNSORB１グラムは、約0.25〜1.0μmolのオリゴサッカリドを含有するので、１日に投与されるオリゴサッカリドの全量は、４リットルの腸容量を用いて7.5〜30μmolの範囲である。コレラを処置するための適合性リンカーアームを介して固体支持体に付着するオリゴサッカリド配列の有用性をまた、ウサギを用いるインビボ動物モデルにおけるコレラ毒素を中和するSYNSORB組成物の能力により実証した。図５および図６ならびに表３における結果は、SYNSORB75が連結されたウサギ腸ループにおけるコレラ毒素媒介体液分泌およびマンニトール透過性を効果的に減少し得ることを示す。さらに、ウサギモデルにおいて使用された状態が、ヒト腸において見出される実際の状態に最も近似する。コレラおよび関連する状態の処置は、適合性リンカーアーム（例えばSYNSOR B）を介して固体支持体に共有結合的に付着されたオリゴサッカリド配列を含有する組成物の経口投与により達成され得る。例えば、SYNSORBは、インタクトなラットの胃を通過することが見出された。次いで、それは腸管内でコレラ毒素と接触する。引き続くインタクトなSYNSORBおよびそれに結合したコレラ毒素の除去は、患者からのコレラ毒素の除去を生じる。腸内の表皮細胞へのV.coleraeの付着を担う主要な毒性因子は、毒素同時調節線毛である。付着プロセスに使用される宿主細胞レセプターは決定されていないが、付着は上皮細胞上で見出される血液型オリゴサッカリド配列によって媒介され得るということを示唆する間接的な証拠がある。細菌の付着研究に選択された SYNSORB（表１）は、Ａ，Ｂ、およびＯ血液型構造に関連する炭水化物を含む。選択されたさらなるSYNSORBは、コレラ毒素に結合することを示したオリゴサッカリド配列を含む。 SYNSORBの表面に結合するV.choleraeの量を、01(ClassicalおよびE1 Tor)または0139 V.cholerae（1×10⁵コロニー形成単位(CFU)/ml）の培養物と共にインキュベートしたSYNSORBの懸濁物をプレーティングすることにより決定した。コントロールのインキュベーションを、V.choleraeおよびいかなる付着オリゴサッカリド配列をも含有しないChromosorb Pを用いて行った。図７〜９の結果は、SYNS ORB１、２、５、57、72、および90がV.choleraeの１つ以上の血清型に結合することを示す。これらの６つのSYNSORBの全てが、V.choleraeに結合することが以前には示されていなかったオリゴサッカリド配列を含有する。これらの結果はまた、血液型とコレラに対する個体の感受性との間の関連性を示唆する疫学的証拠を確証する。従って、本発明者らは、V.choleraeに結合する能力が、不活性な支持体に付着したオリゴサッカリド配列に直接関係することを見出した。図７〜９の結果は、 αGalNAc(1-3)[αFuc(1-2)βGal（血液型Ａ）、αGal(1-3)[αFuc(1-2)βGal（血液型Ｂ）およびαFuc(1-2)βGal(1-4)βGlcNAc(H(O)血液型）のV.choleraeへの結合に対する重要性を示す。さらに本発明者らは、βGalNAc(1-4)βGalおよび βGal(1-3)βGal配列を有するオリゴサッカリドがまた、V.choleraeに効果的に結合し得ることを見出した。従って、βGal(1-4)βGal(2)を含有するオリゴサッカリド配列は、本発明の方法および組成物において有用である。コレラまたは関連する状態の処置は、適合性リンカーアーム（例えばSYNSORB ）を介して固体支持体に共有結合したオリゴサッカリド配列を含有する組成物の経口投与により達成され得る。例えば、SYNSORBは、インタクトなラットの胃を通過することが見出された。次いで、それは腸管内で生物V.cholerae接触する。引き続くインタクトなSYNSORBおよびそれに結合したV.choleraeの除去は、患者からのその個体の除去を生じる。本発明の別の局面は、生物学的サンプル中に存在する生理学的濃度のコレラ毒素またはV.choleraeの迅速で効果的な結合であり、これにより、これらのサンプル中のコレラ毒素および／または生物の存在および／または量のアッセイを可能にする。代表的には、生物学的サンプルは糞便サンプルである。サンプルは、標準的な抽出技術を用いて抽出および調製され得る。次いで、サンプルまたは抽出物を、サンプル中のいかなるコレラ毒素またはV.choleraeが吸収される条件下で、適合性リンカーアームを介して固体支持体に共有結合した毒素または個体結合オリゴサッカリド配列に接触させる。コレラ毒素またはV.choleraeは、任意の適切な検出系を用いてオリゴサッカリド含有支持体の表面上で直接測定され得る。例えば、放射性標識、ビオチン標識、または蛍光標識したコレラ毒素に対して特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体が支持体に結合したコレラ毒素の量を決定するために使用され得る。標準的な免疫アッセイ技術に類似した特異的結合複合体形成を検出するため広範な種々のプロトコルが当業者に周知である。 SYNSORBのパネル（表１）を、精製CTの活性を中和する能力についてスクリーニングした。図１の結果は、SYNSORB16、19、41、72、75、および88が、それぞれ80%、80%、80%、96%、96%、および80%(n=2)を除去したことを示す。より高度な親和性でCTに結合したSYNSORBは、末端ジサッカリド配列(βGal(1-3)βGalNAc )ならびにGM1構造体由来のシアル酸糖が毒素と炭水化物との間の相互作用において主要な役割をはたすことを示したＸ線構造解析から得られたデータと非常に良好に一致した[2]。図１の結果はまた、Chromosorb PがCTに結合しないようであることを示した。至適の結合条件を決定するために、種々の各SYNSORBの量を精製CTとともにインキュベートした。中和実験から得られた結果（図２）は、20mg/mmlの濃度での SYNSORBの使用がCT活性を中和することにおいて効果的であるはずであるということを示した。至適化された条件が、V.coleraeの01血清型由来のCT活性を吸収することにおいて効果的であるかどうかを決定するために、V.coleraeのクラシカルおよびE1 Tor生物型由来のV.colerae Crude培養上清をSYNSORB16、41、72、75、および88 とともにインキュベートした。01 V.coleraeのクラシカル生物型を用いた中和実験由来の結果は、CT活性が上記に列挙した各SYNSORBについてそれぞれ、94±3% 、90±0%、77±0%、97±0%および9±0%(n=4)に減少したことを示した。01 V.col eraeのE1 Tor生物型の２つの培養上清(NIH V86および95-0031)を用いると、SYNS ORB16、41、72、75および88は、それぞれ81±0%、75±0%、89±0%、81±0%および75±0%(n=2)ならびに50±0%、75±0%、88±0%、66±0%および94±0%(n=2)にCT 活性を減少させた。 Dr.W.Johnson,LCDC,Ottawaより入手した４つの0139 V.colerae臨床分離株を用いた予備的なCT中和実験は、V.coleraeのクラシカル01血清型で見出されない細胞毒性活性の存在を明らかにした。２つの組織培養アッセイがCT活性の検出において有用である。クラシカルCTアッセイは、チャイニーズハムスター卵母細胞(C HO)細胞を毒素を含有する溶液に曝露し、そして24時間後に細胞変性（細胞伸長）終点を決定することに関する。２つめは、CTに曝露した場合に大きな多形性の液胞を産生するHT29細胞に関する。0139臨床分離株由来の培養上清は、CHO細胞を迅速に死滅させる能力を有し（24時間未満に100％死滅）、そしてHT29細胞において液胞形成を誘導した（表２）。予備的な実験の結果は0139培養上清と精製 CTとの間のいくつかの差異を示す。この差異をさらに探査するために、抗CT抗血清を用いて中和実験を行った。精製CTおよび0139培養上清の希釈物を、CHOおよびHT29細胞に毒素を添加する前に、抗CT血清と組み合わせて30分間インキュベートした。毒素との24時間のインキュベーションの後、結果は、CHO細胞で観察された細胞毒性活性は、抗CT抗血清により中和されないことを示した。HT29細胞を用いる抗体中和実験は、抗血清が、液胞の形成を効果的に減少させることを示した。このことは培養上清中のCTの存在を示唆する精製CTを用いるコントロールアッセイは、CHOおよびHT29細胞の両方において良好な中和を示した。中和アッセイから得られたデータは、２つの毒素活性が0139株により産生されることを示唆する。活性の１つはCTであり、これはHT29細胞において液胞形成を引き起こす。第２の活性は、CHO細胞を死滅させるコレラ毒素(CC)である。0139 培養上清中のCCの存在を支持するさらなる証拠を、毒素含有溶液をCTの効果に対して耐性を示すVero細胞とともにインキュベートすることにより得た。0139培養上清をVero細胞とともにインキュベートすることにより、細胞の迅速な死滅が生じる。これはさらなる細胞毒性活性の存在を確証する。 V.coleraeのE1 Tor生物型は、0139血清型により産生されるCCに類似するさらなる細胞毒性／溶血性活性を有することが知られている。 SYNSORB16、41、72、75、および88での予備的な中和研究は、SYNSORBが培養上清由来のCCおよびCTに吸着する能力を有することを示した。CC中和の程度を、SY NSORBの細胞障害性終点と処理した培養上清とCHO細胞を用いる未処理コントロールサンプルで処理したものと比較することにより決定した。CT中和実験を、HT29 細胞を毒素レベルを評価するために用いることを除いて同様の方法で行った。図３の結果は、SYNSORB16、41、72、75、および88が、多くの場合CT活性を50%より多く中和する能力を有することを示した。結果はまた、0139血清型および01 E1 Tor生物型により産生された細胞傷害性活性が、宿主細胞と相互作用することについてCTにより用いられるオリゴサッカリドレセプターと同様のオリゴサッカリドレセプターを利用し得ることを示す。0139 V.colerae株由来のCT活性を中和するSYNSORBの能力は、01血清型で得られた結果と比較した場合幾分減少していた。種々のSYNSORBに対する減少した親和性は、２つのCT活性の間のわずかな差に起因し得る。Ｅ．実施例以下の方法は、以下の実施例における研究を行うために使用した。精製されたコレラ毒素はSigma Chemicalsより入手した。Vibrio cholerae 培養上清物の調製 V.colerae 01クラシカルならびにE1 Tor生物型をAKI培地（水１リットルあたり15g ペプトン(Difco)、５g NaCl、４g イーストエクストラクト(Difco)、重炭酸ナトリウムでpH７に合わせる）中で37℃で培養し、一方V.colerae 0139の臨床単離物をSyncase培地（水１リットル当たり20g カザミノ酸(Difco)、8.7g K₂POH₄ 、6g イーストエクストラクト(Difco)、25g NaCl)で増殖させた。V.coleraeの一晩培養物を、5000 x gで30分間遠心分離した。この上清を慎重に取り除き、毒素中和研究に利用した。組織培養細胞を用いたコレラ毒素活性のアッセイコレラ毒素の細胞毒性活性は、10％ウシ胎児血清を補充したHams F12培地中で、５％CO₂の雰囲気下で37℃にて維持されるチャイニーズハムスー卵母細胞(CHO) 細胞株の使用により測定し得る。試験されるCT試料をHams培地中で１：５に希釈し、0.22ミクロンシリンジフィルターを通して濾過滅菌した。試験される試料を培地中に５倍連続希釈し、そして各希釈物の100μLをCHO細胞のコンフルエントな単層のウェルに添加し、そして24時間37℃にて、５％CO₂内でインキュベートした。各試料を２回分析した。細胞変性効果を、毒素を含まないコントロールのウェルと比較することにより、24時間後に容易に可視化した。24時間後、細胞を 95％メタノールで固定し、Geimsa染色液で染色した。中和割合がSYNSORBを有する試料および有さない試料の終点希釈物と比較することにより決定されたことを除き、中和実験由来のCT含有試料を類似の方法で処理した。 CTの効果を測定するために使用した他の細胞株は、10％ウシ胎児血清を補充したDulbecco's Modified Eagles Medium(DMEM)を用いて17mM グルコースの存在下で増殖したヒト結腸腺癌HT 29細胞である。CT含有溶液を培地で３または５倍連続希釈し、HT 29細胞を含むウェルへ添加した。多形性空胞形成を、サンプルウェルと毒素を含まないコントロールとを比較することにより、24時間後に容易に可視化した。アフリカミドリザル(VERO)由来の腎臓細胞をコントロール細胞株として使用した。なぜなら、それはCTの効果に対して耐性であるからである。VERO細胞を、３％FBSを含有する最小必須培地(MEM)中で維持した。組織培養細胞を用いるコレラ毒素活性のアッセイコレラ毒素活性を、CHOまたはVero細胞のいずれかを用いて上述と同一の方法で測定した。以下の実施例は本発明を例示するために提供され、本発明の範囲を限定するように構築されることを決して意味しない。実施例１コレラ毒素活性を中和する能力に関するオリゴサッカリド含有固体支持体のスクリーニング精製CT2(１mlのPBS中２μg)を含有する溶液を、1.5 ml遠心管内の異なるオリゴサッカリド配列を含有する種々のSYNSORB（20.0〜22.5 mgの範囲の量）に添加し、そして室温で１時間、回転式ローテーター上でインキュベートした。インキュベート後、SYNSORBをチューブの底に沈め、そして上清を注意深く取り出した。上清の５倍連続希釈物を調製し、そして細胞変性終点を上述のように決定した。SYNSORB存在下における終点の減少の程度を、SYNSORBを添加していないコントロールと比較することにより決定した。用いたさらなるコントロールは、いずれの炭水化物リガンドも有しないChromosorbであった。結果は図１に示され、そしていくつかのオリゴサッカリド構造体が、コレラ毒素活性を効果的に中和することが見出されたことを示す。実施例２ SYNSORB16,19,41,72,75 および88を用いるコレラ毒素活性の濃度依存中和最大のコレラ毒素中和に必要とされるSYNSORB16、19、41、72、75、および88 の量を２μgのコレラ毒素(CT)を含有する精製コレラ毒素溶液１mlを、1.5ml遠心管内の予め重さを計った量の各SYNSORBに添加することにより決定した。SYNSO RB試料を10、20、および40mgの量を用いて試験した。試料を、１時間、37℃にて回転式ローテーター上でインキュベートした。コレラ毒素溶液のみを含有するコントロールサンプルまもた試験した。各サンプルにおける中和量を、SYNSORB含有サンプルおよび非含有由来のCHO細胞アッセイの終点力価を比較することにより決定した。図２に示す結果は、試験された各SYNSOEBの約20mgが、１mlのコレラ毒素溶液中の少なくとも75％のコレラ毒素を中和し得ることを示す。実施例３ V.colerae の0139および01(E1 Tor)生物型により産生されるコレラ毒素の特徴付け抗コレラ毒素中和アッセイ中和実験を、CHOまたはHT 29組織培養細胞で行った。V.colerae臨床分離株の培養上清の希釈物を調製し、そしてウサギ抗CT抗血清（各CT希釈物で100倍および1000倍に希釈した）とともに37℃で30分間インキュベートした。中和を、未処理サンプルの力価と抗血清で処置した上清の終点希釈力価とを比較することにより決定した。全ての実験を２回行った。表２の結果は、0139臨床分離株により産生される細胞障害性活性が、V.colera eの01 E1 Tor生物型により産生される細胞毒性活性と類似していたことを示す。図４の結果はまた、２つの毒性がV.coleraeのE1 Tor生物型中に存在することを示す。実施例４ V.cholerae の0139および01 E1 Tor 生物型由来のコレラ毒素およびコレラ細胞毒活性を中和するための能力に関するオリゴサッカリド含有固相のスクリーニング V.choleraeの0139および01 E1 Tor 生物型由来の粗培養上清を、1.5mlマイクロ遠心チューブ内の異なるオリゴサッカリド配列を含有する種々のSYNSORBs(20. 0〜22.5mgの範囲の量)に添加し、そして室温で１時間、回転ローテーター上でインキュベートした。インキュベーション後、SYNSORBをチューブの底に沈ませ、上清を注意深く取り出した。上清の３または５倍連続希釈物を調製し、そして細胞変性または細胞毒性終点を上述のように決定した。SYNSORB存在下における終点の減少の程度を、SYNSORBを添加していないコントロールと比較することにより決定した。利用されるさらなるコントロールは、いずれの炭水化物リガンドも有さないChromosorbであった。結果は図３および図４に示され、そして20mg/mlの濃度のSYNSORBsを用いるコレラ細胞毒およびコレラ毒素活性の中和を実証する。図３および図４の結果は、いくつかのオリゴサッカリド構造体が両方の毒素活性を効果的に中和することを見出されたことを示す。実施例５ウサギの小腸におけるコレラ毒素の効果を減少することにおけるSYNSORBの効力の決定体重約２kgの特定病原体非含有(SPF)雄New Zealandシロウサギを、回腸におけるCTの効果を減少するSYNSORBの潜在力を評価するために用いた。手術の前に、それぞれのウサギに適宜水は与えるが断食させる。次いで、ウサギを顔面マスク法によりIsofloraneを投与することによって麻酔した。無菌技術を用いて、腹部を胴の中間部に沿って切開し、そして４〜６つの10cm長の回腸セグメントを、ループを形成するように臍帯テープで連結した。各グループを５cmの腸セグメントに分離した。各ループに６mlの0.5%カルボキシメチルセルロース中の特定容量(0 .1g/kgまたは0.5g/kg)の1.5mlのSYNSORB16または75のいずれかの懸濁物を添加した。コントロール動物の各々の腸ループは、1.5mlの0.5%カルボキシメチルセルロースのみを受容した。腸ループへの生成CTの添加の前に、10μCiの³Hマンニトール(100μL)をシリンジで描くウサギの耳静脈に静脈内注射した。次いで、各腸ループに、100μLのCT 溶液(25μg)またはリン酸緩衝化生理食塩水のいずれかを、ツベルクリンシリンジで注射した。次いで、腸ループを腹部に再配置し、そして切開部を閉じた。各ウサギを光Isoflorane麻酔下に４時間維持し、実験の間水循環熱パッド上に各ウサギを配置することにより体温を37℃に維持した。インキュベーション期間の終了時に、次いでウサギをペントバルビタールの静脈内注射により屠殺した。回腸ループを取り除き、重量を計測しそしてその長さを測定した。ループ内容物を注意深く取り除き、そしてループの体積についてならびに各ループにおける³Hの両についてアッセイした。本発明者らの研究から得られた結果（図５および６、表３）は、SYNSORB 75がウサギの腸におけるCT活性を効果的に縮小することを示した。実施例６ SYNSORB およびVibrio choleraeを用いる結合実験結合実験を、0.5mlのPBS中の約10⁵CFUの01 V.cholerae(ClassicalおよびE1 To r 生物型)または0139 V.coleraeをSYNSORB１、２、５、57、72または90またはCh romosorb P(20mg)とともに室温で30分間インキュベートすることにより行った。非接着生物を除去するためにPBS(約20ml)でSYNSORBを十分に洗浄した後、SYNSOR Bを１mlの0.5％(w/v)カルボキシメチルセルロースに懸濁し、そして上清の２つの希釈物を栄養アガープレートに播種した。24時間後、このプレートを結合Vibr osの数を決定するために計数した。図７〜９における結果は、V.coleraeがSYNSORBの表面に効果的に結合し得ることを示す。この結果はまた、いくつかのオリゴサッカリド構造体がV.coleraeに対する結合部位として効果的に働くことが見出されたことを示す。SYNSORBへの生物結合とChromosorb P単独への生物結合との間に有意な差異が存在するので、 SYNSORBの結合はSYNSORB上で見出されるオリゴサッカリド配列に関する。図７〜９における結果は、少なくとも４つの定量の平均を表す。本発明の種々の実施態様を実行する上述の方法の改変は、本明細書に示す本発明の教示に従えば当業者に明らかである。上述の実施例は限定されず、単に本発明の例示である。本発明の範囲は、続く請求の範囲により規定される。すべてのオリゴサッカリドは、疎水性の８炭素スペーサーアームを通してChro mosorb Pに連結している。NeuAcはシアル酸の略語である。中和実験を、チャイニーズハムスター卵母細胞(CHO)またはヒト結腸腺ガン(HT 29)組織培養細胞で行った。臨床的に単離したV.colerae臨床分離株の培養上清の希釈物を調製し、そして抗-CTとともに37℃で30分間インキュベートした。中和を、抗血清で処理した上清の終点希釈力価と未処理サンプルを比較することにより決定した。全ての実験を２回行った。N.D.＝行わず。＊示したＰ値は、SYNSORB処置ウサギ回腸ループと未処置回腸ループとの間の、液体分泌、液体容積、またはマンニトール透過性のいずれかの程度における有意な差異を示す。Ｐ値は、SYSTATコンピュータソフトウェアのいてノンパラメトリックなWilcoxon試験を用いて決定した。＋Ｐ値は、SYSTATコンピュータソフトウェアにおいてStudents T試験を用いて決定した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アームストロング，グレンディー. カナダ国ティー６シー１ピー９アルバータ，エドモントン，91 アベニュー 7951

Claims

【特許請求の範囲】１．被検体においてコレラおよび関連する状態を処置する方法であって、該方法は、そのような処置を必要とする被検体に、非ペプチド性の適合性リンカーアームを介して薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体に共有結合的に付着したオリゴサッカリド配列を含有する組成物の有効量を投与する工程を包含し、ここで該サッカリド配列は１つ以上のV.choleraeに結合し、そしてここで該組成物は消化管から排除され得る、方法。２．前記オリゴサッカリド配列が１〜３のサッカリド単位を有する、請求項１に記載の方法。３．前記オリゴサッカリド配列が、表１に示されるオリゴサッカリド構造体番号１、２、３、７、10および11からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。４．非ペプチド性の適合性リンカーアームを介して薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体に共有結合的に付着した前記オリゴサッカリド配列が、表１に示されるSYNSORB番号１、２、５、57、72および90からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。５．前記リンカーアームが-(CH₂)₈C(O)-である、請求項１に記載の方法。６．コレラおよび関連する状態を処置するのに有用な薬学組成物であって、該組成物は： a) 非ペプチド性の適合性リンカーアームを介して薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体に共有結合的に付着したオリゴサッカリド配列であって、ここで該オリゴサッカリド配列は１つ以上のV.coleraeの血清型に結合する、オリゴサッカリド配列；および b)薬学的に受容可能なキャリアであって、ここで該組成物は消化管から排除され得る、キャリアを含有する、薬学組成物。７．前記オリゴサッカリド配列が１〜３のサッカリド単位を有する、請求項６に記載の組成物。８．前記オリゴサッカリド配列が、表１に示されるオリゴサッカリド構造番号１、２、３、７、10、および11からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。９．非ペプチド性の適合性リンカーアームを介して薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体に共有結合的に付着した前記オリゴサッカリド配列が、表１に示されるSYNSORB１、２、５、57、72および90からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。１０．組成物リンカーアームが-(CH₂)₈C(O)-である、請求項６に記載の方法。１１．微生物を含有すると推測されるサンプルからV.coleraeの１以上の血清型を結合および除去する方法であって、該方法は： a) 該サンプルと、非ペプチド性の適合性リンカーアームを介して薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体に共有結合的に付着したオリゴサッカリド配列とを接触させる工程であって、ここで該オリゴサッカリド配列は、該生物が該支持体に吸収される条件下で１つ以上のV.coleraeの血清型に結合する、工程；および b) 該サンプルから該吸収された生物を含有する該支持体を分離する工程を包含する、方法。１２．前記オリゴサッカリド配列が１〜３のサッカリド単位を有する、請求項１１に記載の組成物。１３．前記オリゴサッカリド配列が、表１のオリゴサッカリド構造体番号１、２、３、７、10、および11からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。１４．非ペプチド性の適合性リンカーアームを介して薬学的に受容可能な固体の不活性な支持体に共有結合的に付着した前記オリゴサッカリド配列が、表１のSY NSORB番号１、２、５、57、72および90からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。１５．前記リンカーアームが-(CH₂)₈C(O)-である、請求項１１に記載の方法。