JPH11505713A - 細胞分化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、前駆体細胞の多分化能に関するものであり、一層特定的には予め選択された成熟した分化表現型をもたらすための予め選択された経路に沿って分化を選択的に促進するための方法および手段を提供して、この多分化能を利用することに関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞分化剤 本発明は、細胞の分化に影響する薬剤、この薬剤を含む方法およびこの薬剤を 含む製品に関するものである。 細胞分化は、細胞分化によって細胞が互いに異なるものとなるプロセスであり 、細胞が特化して特定の機能を果たすようになる。従って、例えば、網膜の細胞 が特化して光に反応し、その反応を脳に伝達するようになり、または、骨の細胞 が特化して、骨（骨芽細胞）または置換骨（軟骨芽細胞）または再吸収骨（破骨 細胞）のいずれかを生産できる。 この分化の経路の引き金を引く現象の性質と、各分化経路を規定するマーカー の性質とが最近研究されている。この分化プロセスにおける混乱は、明らかに、 成長中の胎児、若いヒトや動物、または実際にあらゆる成長中の有機体に対して 著しい結果をもたらすであろう。 生涯にわたって活発に代謝する組織に対しては、その分化プロセス中に混乱が 生ずると疾患をもたらし得る。例えば、骨は生涯にわたって活発に代謝し、この 代謝の際の欠陥は、骨粗髭症のような骨格障害をもたらし得ることが知られてい る。骨は骨芽細胞によって作られ、破骨細胞によって再吸収されるので、これら の二種類の細胞型の分化に対して興味が集まっており、なぜなら明らかに一方ま た他方の細胞型のいずれが優勢であるかが骨の代謝のバランスに影響を与え得る からである。しかし、細胞分化プロセスのマーカーはほとんどなく、従って現在 の知識は限られている。この事実にも係わらず、間葉幹細胞からの骨芽細胞の分 化が、初期の前駆体細胞の 多分化能が成熟の間に制限されたために、または間葉幹細胞の成長の初期に分化 経路または細胞系統に関与したことによって生ずることが提案されているが、し かしこのプロセスの知識は乏しい。 実際のところ、分化細胞に対して前駆体細胞が先行しており、前駆体細胞があ る段階で特定の分化プロセスに関与し始め、十分に分化した表現型をもたらすも のと考えられている。しかし、この説は多分化能の考え方を取り入れており、従 って、環境によっては、前駆体細胞が多数の異なる表現型を生産し得ると思われ る。不幸なことに、こうした環境の性質の大部分がはっきりしていない。 上記から理解できるように、分化プロセスの理解が進むと有利であり、分化の 際の混乱に伴う有害な結果に対して保護し、あるいは緩和するのを助けるであろ うし、このためには典型的には特定の分化経路が確実にとられるようにし、これ によって前記の経路からもたらされる産物の欠損に伴う疾患条件に対する保護と して働くようにする。 細胞の分化を調査するために、我々は不死化した細胞系を使用し、特に本出願 人の係属中の英国特許出願第９５２２５６２．９号に記載した、不死化したヒト 細胞系を使用した。これらの細胞系は、ヒト骨髄間質性細胞のようなヒト前駆体 細胞を、変調可能な腫瘍遺伝子でのレトロウイルス形質導入を採用して不死化さ せることで得られた。これは有利である。なぜなら不死化が一回の遺伝的な現象 によって引き起こされており、従ってその遺伝子型は、そして結果的にその細胞 系の表現型は、明確に規定されるからである。更に、この不死化している腫瘍遺 伝子産物の活性形の形質発現は調節可能である。従って、目的とする前駆体細胞 の大きな、均一な集団がいったん生産されると、その腫瘍遺伝子タンパク質は不 活性化され、細胞をその分化の最初期の状態に戻すことができる。我々は、これ ら の細胞を使用して、細胞の分化は可塑性を含んでおり、この可塑性において前駆 体細胞は多分化能を有しており、これによって相異なる多数の分化経路を辿って 分化し、採択した経路の性質に応じた相異なる細胞表現型をもたらし得ることを 示した。この多分化能は、前駆体細胞に対して作用す外部の薬剤によって調節さ れ、一層特定的には、我々は、前駆体細胞が血液、またはその抽出物、および／ または神経細胞の細胞外培地、またはその抽出物によって調節されることを発見 した。この発見は顕著な副産物をもたらすものである。なぜなら、前駆体細胞が 曝露される培地を制御することによって、成熟細胞の表現型の性質を制御できる ことを、明らかに示しているからである。 従って、我々は初めて前駆体細胞の多分化能を有利に利用し、特には、しかし 限定的ではなく、臨床的な病気の治療に利用することを提案する。 単に一例ではあるが、我々が観測したところでは、ヒト骨前駆体細胞系は、通 常の培養条件下では骨芽細胞表現型へと分化し、この条件にはデキサメタゾン／ （ＯＨ）₂ビタミンＤ₃投与への曝露が含まれ、しかし、血液や特定の血清、また はこれらの抽出物に曝露されたときには、これと同じヒト骨前駆体細胞系は、脂 肪細胞の表現型へと分化する。この観測結果は、すべての年齢の初期の骨粗髭症 および骨欠損症の患者では骨髄脂肪組織の容量が顕著に増大し、骨の容量が減少 するという事実と良く整合している。更に、動物研究からも良く知られているよ うに、骨固定化、無重力への曝露または卵巣摘除術による骨の損失の減少の後に 髄の脂質の容量の増大が生ずる。現在のところ、骨髄脂肪組織の容量と骨の容量 との間が逆になる関係を説明できるような細胞関係の機構は決定されていない。 このように我々が見いだしたところでは、骨粗髭症や骨髄脂肪組 織の容量の増大は、我々のヒト細胞系を使用して、血液、特定の血清やこれらの 抽出物の活性を阻害する薬剤を同定し、次いでこの薬剤をインビボで使用するこ とによって、治療できる。 これは、前駆体細胞の多分化能を利用して臨床的に効果のある治療法を提供し ようと考えた初めての例である。更に、前駆体細胞を選択的な分化経路に沿って 促進することによって、これらの前駆体細胞の多分化能を利用する薬剤を同定す るために、ヒト細胞系を使用することを目的として、ヒト細胞系を生産した初め ての例でもある。 他の実施例においては、我々が観測したところでは、ヒト神経細胞の前駆体細 胞系は、通常の培養条件下ではいずれかの神経細胞表現型に分化し、これらの条 件にはグリア細胞系に由来する神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）への曝露を含んでお り、しかし、血清やその抽出物に曝露されたときには、この同じヒト神経細胞の 前駆体細胞系が、星状膠細胞のようなグリア細胞に分化する。 これらの発見が示唆するところでは、血清やその抽出物の活性を阻害する薬剤 を同定するために我々のヒト細胞系を使用し、次いでこの薬剤をインビボで使用 することによって、神経細胞組織の欠損を特徴とする疾患を治療できる。 従って、本発明の目的は、前駆体細胞の分化を調節し、または制御し、または 予測する方法および手段を提供することである。 本発明は、その最も広い態様においては、前駆体細胞の多分化能を利用するこ とによって、成熟した表現型の性質を選択することを目的として、所定の経路に 沿って分化を選択的に促進することに関する。 従って、本発明の第一の態様に従って提供する、前駆体細胞の分化を少なくと も一種の表現型へと調節または制御するための方法は、 前記細胞を、血液、特に血清またはこれらの抽出物、および／または神経細胞の 細胞外培地またはその抽出物へと、分化を支持する培地下で曝露することによっ て、所定の成熟した表現型をもたらすように分化を選択的に促進することを含む 。 本発明の第二の態様に従って提供する、少なくとも一種の特定の表現型へと前 駆体細胞の分化を調節または制御する方法は、前記細胞を、血液、特に血清また はこれらの抽出物、および／または神経外の細胞外培地またはその抽出物の活性 を阻害する薬剤へと、分化を支持する培地下で曝露することを含む。 本発明の第一の態様においては、前記血液、特に血清またはこれらの抽出物、 および／または前記培地またはその抽出物を使用して、我々の命名によると、血 清指向性または神経細胞の細胞外培地指向性の分化をそれぞれ引き起こして、血 清または神経細胞の細胞外培地指向性の表現型をもたらす。 本発明の第二の態様においては、前記薬剤を使用し、我々が命名したところの 血清および／または神経細胞の細胞外培地指向性の分化を阻害し、別の表現型を もたらし、これは命名するならば血清または神経細胞の細胞外培地から独立した 表現型である。 本発明の第三の態様に従って提供する薬剤組成物は、選択的な前駆体細胞を少 なくとも一種の特定の表現型へと分化させるために、有効量の血液、特には血清 、またはその抽出物、および／または神経細胞の細胞外培地またはその抽出物を 含有する。 本発明の第四の態様に従って提供する薬剤組成物は、血液、特には血清、また はその抽出物、および／または神経細胞の細胞外培地またはその抽出物の活性を 阻害する有効量の薬剤を含有しており、これによって選択した前駆体細胞を血清 または神経細胞の細胞外培地から独立して分化させ、少なくとも一種の血清また は神経細胞の 細胞外培地から独立した表現型をもたらす。 本発明の第三の態様においては、前記組成物を骨前駆体細胞に関連して使用す ることによって、脂肪細胞の表現型をもたらすことができ；または神経前駆体細 胞に関連して使用することによって、グリア細胞の表現型をもたらすことができ 、こうして希突起膠グリア細胞の減少を特徴とする多発性硬化症のような疾患に 対して保護する。 本発明の第四の態様においては、前記薬剤組成物は、骨前駆体細胞に関連して 使用することによって、骨芽細胞の表現型をもたらすことができ、こうして骨粗 髭症、骨欠損症、変性性関節症、骨折、くる病および骨の生成の減少に伴う他の 骨の疾患に対する保護をもたらすことができ、更に肥満および脂肪組織の増大に 関連する他の疾患や（心臓）血管系の疾患に対する保護をもたらすことができ、 これによって血管系中の脂肪（細胞）の構成によって血流の変化をもたらすこと ができる。更に、分化の調節は、老人における筋肉の消耗に関連している。本発 明の第四の態様を、神経前駆体細胞に関連して使用する場合には、ニューロン細 胞の生産の向上をもたらすので、卒中損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病 、筋萎縮性側索硬化症、または運動ニューロン疾患またはハンチントン舞踏病の ような、ニューロン細胞の減少に関連する疾患に対する保護として採用できる。 本発明の第五の態様に従って提供する、骨粗髭症または肥満を予防し、緩和し 、あるいは取り除く方法は、治療すべき個体に対して薬剤組成物を投与すること からなり、薬剤組成物は、血液、特には血清および／または神経細胞の細胞外培 地を阻害する薬剤であって血清および／または神経細胞の細胞外培地指向性の分 化を阻害して骨に関連する表現型をもたらす薬剤を有効量含有する。 理想的には、前記表現型は骨芽細胞の表現型である。 本発明の好適な実施形態においては、前記薬剤組成物を治療すべき部位に投与 する。 本発明の第六の態様に従って提供する、治療すべき個体の脂肪組織の量を増大 または向上させる方法は、前記個体に対して薬剤組成物を投与することからなり 、この薬剤組成物は、脂肪細胞の前駆体細胞の血清および／または神経細胞の細 胞外培地指向性の分化を引き起こして血清指向性の脂肪表現型をもたらすための 、有効量の血清、またはその抽出物および／または神経細胞の細胞外培地または その抽出物を含有する。 本発明を神経の前駆体細胞の観点で使用すべき場合には、我々は、神経細胞の 細胞外培地が、分化を選択的に促進し、我々の命名によると神経細胞の細胞外培 地指向性の分化と神経細胞の細胞外培地表現型を生産することを見いだした。 本発明の第七の態様に従って提供する、神経細胞の減少に関連する疾患を予防 し、緩和し、または取り除くための方法は、治療すべき個体に対して薬剤組成物 を投与することからなり、この薬剤組成物は、血清指向性の分化および／または 神経細胞の細胞外培地指向性の分化を阻害することによって、神経細胞の前駆体 細胞が確実に血清および／または神経細胞の細胞外培地から独立した状態で分化 して神経細胞の表現型をもたらすようにする有効量の薬剤を含有する。 本発明の好適な実施形態においては、薬剤組成物は中枢神経系の組織を目的と する。 本発明のこの態様においては、薬剤組成物は、ニューロン細胞の生産の向上を もたらし、これによって卒中損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮 性側索硬化症、または運動ニューロン疾患 またはハンチントン舞踏病のような、神経細胞の減少に関連する疾患に対する保 護として採用できる。 本発明の第八の態様に従って、血清指向性の分化および／または神経細胞の細 胞外の培地指向性の分化を防止または阻害するのに有効な薬剤を同定する方法を 提供し、この方法は、前駆体細胞の集団を、有効量の （ａ）血液、特に血清、またはその抽出物、および／または有効量の神経細胞の 細胞外培地またはその抽出物；および／または （ｂ）試験剤 に対して、分化を支持する条件下で有効な長さの時間曝露し、次いでこの集団を 検査して、血清または神経細胞の細胞外培地指向性の分化が生じていたかどうか 、および／またはどの程度生じていたかを測定することを含む。 本発明の前記方法は、インビトロまたはインビボで実施できる。 本発明の好適な実施形態においては、前記細胞集団は細胞系であり、理想的に はヒト骨髄間質性細胞系またはヒト神経細胞系のようなヒト起源のものである。 明らかに、本発明のこの方法を使用して同定された薬剤は、血清および／また は神経細胞の細胞外培地指向性の分化を阻害するのに有効であり、これによって 骨前駆体細胞に関連して使用した場合には、骨芽細胞の表現型のような骨に関連 する表現型の生産をもたらし、神経細胞の前駆体細胞に関連して使用した場合に は、ニューロン細胞の生産をもたらす。 本発明の更に他の態様に従って、前記同定方法によって同定された薬剤を提供 する。 本発明の更に他の態様に従って、血清および／または神経細胞の細胞外培地指 向性の分化を促進するのに有効な薬剤を同定する方法 を提供し、この方法は、前駆体細胞の集団を、有効量の （ａ）血液、特に血清、またはその抽出物、および／または有効量の神経細胞の 細胞外培地またはその抽出物；および／または （ｂ）試験剤 を含有しており、分化を支持する条件下で有効な長さの時間曝露し、次いでこの 集団を検査して、血清または神経細胞の細胞外培地指向性の分化が生じているか どうかおよび／またはどの程度生じているかを測定することを含む。 本発明のこの方法はインビトロまたはインビボで実施できる。 本発明のこの態様においては、前記細胞集団は細胞系であり、理想的にはヒト 骨髄間質性細胞系またはヒト神経細胞系のようにヒト起源の細胞系である。 本発明の更に他の態様に従って、前記同定方法によって同定された薬剤を提供 する。 本発明のこの方法を採用して同定された薬剤は、骨前駆体細胞に関連して使用 した場合には、脂肪表現型への分化の促進をもたらし、神経前駆体細胞に関連し て使用された場合には、星状膠細胞の表現型を含むグリア細胞への分化の促進を もたらす。 本発明の他の態様に従って提供する、骨の生成を促進し、および少なくとも相 対的には脂肪の生成を減少させる方法は、脂肪表現型をもたらす骨前駆体細胞の 血清および／または神経細胞の細胞外培地指向性の分化を阻害するのに有効な薬 剤へと、骨前駆体細胞の集団を曝露することを含む。 本発明のこの態様の好適な実施形態においては、骨の組織と脂肪組織との間の 相対的バランスは、前記薬剤を除去することによって、および／または、脂肪組 織への指向性の分化を促進する、血清またはその抽出物、および／または神経細 胞の細胞外培地またはその抽 出物へと曝露することによって、逆転させることができる。 この方法は、インビトロまたはインビボのいずれかで実施できる。 本発明の更に他の態様において、ニューロン細胞組織の生成を促進し、および 少なくとも相対的にグリア細胞ないし一層特定的には星状膠細胞組織の量を減少 させるための方法を提供し、この方法は、血清および／または神経細胞の細胞外 培地指向性の分化を阻害するのに有効な薬剤へと神経前駆体細胞の集団を曝露す ることによって、前記集団を神経細胞表現型へと分化させることを含む。 本発明のこの態様の好適な実施形態では、ニューロン組織と星状膠細胞ないし 希突起膠細胞組織との間のバランスは、前記阻害剤を除去することによって、お よび／または、グリア細胞または一層特定的には星状膠細胞の表現型を生産する よに分化の指向性をもたらす、血清またはその抽出物、および／または神経細胞 の細胞外培地またはその抽出物へと、前記集団を曝露することによって、逆転さ せることができる。 この方法は、インビトロまたはインビボのいずれかで実施できる。 本明細書で参照する血液、特に血清、およびこれらの抽出物には、広範な範囲 の血清が参照され、例えば、限定されるものではないが、ヒト、ウサギ、ウシの 胎児、ウシの新生児、ウマの胎児、成長したウマ、ヒツジおよびロバの血清が参 照される。 更に、本明細書で参照する血液、特に血清およびその抽出物には、プロスタグ ランジンＪ２やその代謝産物のようなプロスタグランジンおよび特にプロスタグ ランジン代謝産物が参照され、および／またはレチノイル酸および／または種々 の栄養因子が参照され、例えばこれらに限定されるものではないが、毛様体神経 栄養因子ＣＮＴＦ、グリア細胞系に由来する神経栄養因子ＧＤＮＦ、繊維芽細胞 成長因子ＦＧＦおよびヒドロコルチゾンのような他の分子、および実 際に前述した薬剤の相似体および相同体が参照される。 本明細書で参照する神経細胞の細胞外培地またはその抽出物には、広範な培地 、例えば、これらに限定されるものではないが、ヒト、ウサギ、ウシの胎児、ウ シの新生児、ウマの胎児、成長したウマ、山羊およびロバが含まれる。 更に、本明細書で参照する神経細胞の細胞外培地およびその抽出物には、前記 培地中に見いだされる種々の因子が参照され、例えばこれらに限定ささるもので はないが、毛様体神経栄養因子ＣＮＴＦ、および／またはグリア細胞系に由来す る神経栄養因子ＧＤＮＧ、および／または脳に由来する神経栄養因子ＢＤＮＦ、 および／またはレチノイル酸、および／またはヒドロコルチゾンまたはデキサメ タゾンのようなステロイドホルモン、および実際に前述の薬剤の相似体および相 同体が参照される。 本明細書で参照する血清および／または神経細胞の細胞外培地を阻害するのに 有効な薬剤としては、ＣＮＴＦ、レチノイル酸、ＦＧＦおよびＰＧ_J2aの活性を 特異的に阻害する薬剤が参照される。 実際のところ、更なる実験において我々が見いだしたところでは、骨芽細胞／ 脂肪細胞の前駆体細胞に対して、血清指向性の作用を、炭による除去で取り除く ことができ、低分子量の成分が分化の指向性を担っていることを示唆している。 更に、我々は、この指向性の分化が、３０Ｋｄよりも大きい分子、更に特定的に は１００Ｋｄよりも大きい分子を除去することによって、阻害できることを示し た。これは、小分子量の分化剤が存在していて、より大きな担体タンパク質に対 して結合されていることを示唆しているようである。 こうして、本発明の他の態様に従って、血清指向性の分化に有効な抽出物を同 定するための方法を提供し、この方法は、血液、特に血清を分画し、次いで、分 化を支持する条件下で有効な長さの時間 にわたって前記血清の少なくとも一つの有効量のフラクションに対して、前駆体 細胞の集団を曝露し、次いでこの集団を検査して、血清指向性の分化が生じてい るかどうか、および／またはどの程度生じているかを測定する。 この方法はインビトロまたはインビボで実施できる。 本発明の他の態様は、前述の方法によって同定された抽出物に関する。 本発明の他の態様に従って、脂肪細胞の細胞外培地指向性の分化をもたらすの に有効な脂肪細胞の細胞外の抽出物を同定する方法を提供し、この方法は、前記 培地を分画し、次いで分化を支持する条件下で有効な長さの時間にわたって前記 培地の少なくとも一つの有効量のフラクションに対して、前駆体細胞の集団を曝 露し、この集団を検査して、神経細胞の細胞外培地指向性の分化が生じているか どうか、および／またはどの程度生じているかを測定する。 この方法はインビトロまたはインビボで実施できる。 本発明の他の態様は、前述の方法によって同定される抽出物に関する。 本発明の抽出物を同定するための上記の好適な方法のいずれにおいても、分画 を寸法に応じて実施でき、これによって相異なる分子量の血清成分を分離し、そ れぞれを上記の方法で試験できる。また、同定をイオン性分離によって、または 例えば限定はされないが、次の参考文献に記載されているような、実際のところ 本分野に習熟した者に知られているあらゆる方法によって達成できる。 １．ハイダー，ＢＣおよびバーロー，Ｄ「ポリペプチドおよびタンパク質薬剤− 生産、特徴および生成：Ｐolypeptide and Ｐrotein Ｄrugs-Ｐroduction,Ｃhar acterization and Ｆormation」1991年、エリス ハーウッド、ニューヨーク ２．フック，ＪＢおよびポステ，Ｇ「タンパク質設計および新しい治療法および ワクチンの進歩：Ｐrotein Ｄesign and the Ｄevelopment of Ｎew Ｔherapeut ices and Ｖaccines」1990、プレナム・プレス ニューヨーク ３．スミス，ＣＧ「新しい薬剤の発見と進歩の過程：Ｔhe Ｐrocess of Ｎew Ｄ rug Ｄiscovery and Ｄevelopment」1992年、ＣＲＣプレス ４．タイル，Ｐおよびラム，ＢＰ「標的治療システム：Ｔargeted Ｔherapeutic Ｓystems」1990年、マーセル．デッカー、ニューヨーク ５．ポルフレイマン，ＭＧ、マッカン，ＰＰ、ラベンバーグ，Ｗ，テンプル，Ｊ Ｇおよびスジョールヅマ，Ａ「薬剤設計用の標的としての酵素：Ｅnzymes as Ｔ argets for Ｄrug Ｄesign」1989年、アカデミックプレス、サンジエゴ ６．モトレン，ＧＭ「薬剤工業における臨床研究の方法：Ｔhe Ｃlinical Ｒese arch Ｐrocess in the Ｐharmaceutical Ｉndustry」1984年、マーセル・デッカ ー、ニューヨーク ７．スミシーズ，ＪＲおよびブラッドレー，ＲＪ「薬理学における受容体」1978 年、マーセル・デッカー、ニューヨーク ８．スミス,Ｒ.Ｂ.「医薬品の進歩：Ｔhe Ｄevelopment of a Ｍedicine」1985年 、ストックトン プレス 明らかに、いったん上記の型の指向性の分化のいずれかをもたらす薬剤が同定 されると、上記の技術を使用して、この作用を阻害する別の薬剤を同定でき、こ れによって指向性の分化をもたらすのに有効な薬剤に対する拮抗阻害剤を同定で きるであろう。 本明細書において参照する前駆体細胞としては、細胞の成熟した表現型まで成 長していない細胞を参照し、理想的には、成長のごく初期の段階にある細胞を参 照し、従って理想的には、分化プロセス が開始されておらず、このため組織特異的なマーカーが欠如しているか不足して いることを特徴とする細胞を参照する。 本明細書で参照する分化を支持する条件は、むろん、考慮すべき細胞集団の性 質に応じて変化するが、しかしどのような場合にも、これらの条件は本分野に習 熟した者には知られているであろう。従って、例えば、ヒト骨前駆体細胞の分化 を支持する条件には、デキサメタゾン／（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃への曝露が含まれ るであろう。 本明細書で参照する分化には分化転換が含まれており、ここで成熟した細胞型 が脱分化して、前駆体細胞型と考えられているものとなり、この後に更に分化の プロセスを経過して十分に成熟した細胞型を与える。または、分化転換は、前記 脱分化ステップなしに生じえる。 本発明の更に他の態様に従って、血清指向性の表現型をもたらす前駆体細胞の 集団における血清指向性の分化の存在、この分化への感受性またはこの分化へと 向かう素因を診断する方法を提供し、この方法は、試験すべき個体から血液、特 には血清の試験試料を得、分化を支持する条件下で前記試験試料へと前駆体細胞 を曝露し、次いで前記前駆体細胞の分化表現型の性質を観測することを含む。 本発明の更に他の態様に従って、血清指向性の表現型をもたらす前駆体細胞の 集団における血清指向性の分化の存在、この分化への感受性またはこの分化へと 向かう素因を診断する方法を提供し、この方法は、試験すべき個体から前駆体細 胞の試験試料を得、分化を支持する条件下で前記前駆体細胞を血液、特には血清 またはその抽出物へと曝露し、次いで前記前駆体細胞の分化した表現型の性質を 観測することを含む。 本発明の更に他の態様に従って提供する方法は、神経細胞の細胞外培地指向性 の表現型をもたらす前駆体細胞の集団における神経細 胞の細胞外培地指向性の分化の存在、この分化への感受性またはこの分化へと向 かう素因を診断するものであり、この方法は、試験すべき個体から神経細胞の細 胞外培地の試験試料を得、分化を支持する条件下で前記前駆体細胞を試験試料へ と曝露し、次いで前記前駆体細胞の分化した表現型の性質を観測することを含む 。 本発明の更に他の態様に従って提供する方法は、神経細胞の細胞外培地指向性 の表現型をもたらす前駆体細胞の集団における神経細胞の細胞外培地指向性の分 化の存在、この分化への感受性またはこの分化へと向かう素因を診断するもので あり、この方法は、試験すべき個体から前駆体細胞の試験試料を得、分化を支持 する条件下で前記前駆体細胞を神経細胞の細胞外培地またはその抽出物へと曝露 し、次いで前記前駆体細胞の分化した表現型の性質を観測することを含む。 前記血清または前記培地が前記試験試料である前記診断方法の好適例において は、前記前駆体細胞が、理想的には本明細書に記載したような、骨髄間質性細胞 またはヒト神経細胞系のような神経細胞系である。このように、上記の観測の方 法には、骨を生産する細胞またはニューロン細胞またはグリア細胞の数を測定す るためのアッセイが含まれる。 また、我々は本明細書において、幾分驚くべきことに、脂肪／骨原性前駆体胞 が、現在のところ成熟した脂肪細胞表現型、即ちペルオキソーム複製活性化受容 体γ（ＰＰＡＲγ）として知られている受容体に対するマーカーと考えられてい たものを、どのようにして形質発現するかを記載した。この驚くべき発見、およ びこの受容体のリガンドが脂肪／骨原性前駆体細胞の脂肪細胞表現型への分化を 引き起こすという事実から、我々は、この受容体とそれに関連するリガンドとが 、少なくともこれらの前駆体細胞の分化を調節および ／または制御する上で役割を果たしていると考える。従って、本明細書で血清お よび／または神経細胞の細胞外培地またはこれらの抽出物を参照するとき、この 受容体に結合するリガンドへの参照を含んでおり、本明細書で血清および／また は神経細胞の細胞外培地指向性の分化を阻害する薬剤を参照したとき、前記受容 体の機能に影響するこれらのリガンドおよび／または薬剤に対する拮抗阻害体へ の参照が含まれる。 本発明の実施形態をここで添付図面を参照して例示のみのために説明する。 図１ 不死化されたヒト骨髄間質性細胞クローン７中で形質発現したサルウイルス４ ０に由来する大きな腫瘍抗原の温度感受性形の蛍光免疫局在化 図２ ３つの異なる細胞密度の不死化されたヒト骨髄間質性細胞クローン７細胞の、 ４日間にわたる細胞成長曲線。細胞は、１ｃｍ²当たり２５００（開いた四角形 ）、５０００（開いたダイアモンド形）および１００００（開いた円）の密度で 平板培養され、許容温度（３３℃）で培養した。誤差棒は、各点ごとに４つの試 料の平均値からの標準偏差を示す。 図３ａ ７日間のデキサメタゾン（１０^-7Ｍ）での処置に応答した、不死化されたヒト 骨髄間質性細胞クローン７中の細胞性アルカリホスファターゼ活性。誤差棒は、 一点当たり６つの試料の平均値の標準偏差に関する。統計的分析を学生のｔ−試 験によって実施した。 図３ｂ 不死化されたヒト骨髄間質性細胞クローン７中における、４日間 のオステオカルシンタンパク質の形質発現。細胞を、１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃の濃 度範囲で、ビタミンＫの存在下に４日間処理した。次いで、この媒地を除去し、 ラジオイムノアッセイによってオステオカルシンを測定した。オステオカルシン の水準を、１００００個の細胞当たりナノグラムのオステオカルシンに標準化し た。結果を、１点ごとに４つの試料の平均値の平均＋／−標準偏差として表現す る。学生のｔ−試験を使用して統計的分析を行った。 図４ 図４は、不死化されたヒト骨髄間質性細胞クローン７中のｃＡＭＰの水準に対 する、２種類の拮抗阻害剤の作用を示している。細胞を、１ｍＭのＩＢＭＸで５ 分間予め処理し、次いで２０分間拮抗阻害剤で処理した。ｃＡＭＰの水準は、Ｅ ＬＩＳＡによって定量化し、各処理に対するｃＡＭＰの量を、対照例（ＩＢＭＸ のみ）と比較した。結果を、４つの試料の平均値の平均＋／−標準偏差として表 現する。この統計的分析を、学生のｔ−試験によって実施した。 図５ この図は、不死化されたヒト骨髄間質性細胞クローン７の無機化に対するデキ サメタゾン（１０_-７Ｍ）の作用を示す。細胞を、２８日間、１０％ウシ胎児の 血清を含有する培地中でβ−グリセロフォスフェートと共に、腫瘍遺伝子が許容 されない温度である３９℃ 色手順によって無機化することが示された。光学顕微鏡による分析で、培養物中 に幾らか結節が生成していることが示されているが、しかし無機化の証拠も至る ところに見られた。この無機堆積物は、明らかに細胞外の基質（マトリックス） へと局在化している。 図６ 不死化されたヒト骨髄間質性細胞クローン７に対する、正常なウ サギ血清の作用。細胞を、ウシ胎児の血清を含有する培地と、ウシ胎児の血清お よび正常ウサギ血清を含有する培地とのいずれかを使用して培養した。正常ウサ ギ血清が存在しない場合には、脂質は検出できなかった。しかし、ウサギ血清を 使用して培養すると、油−赤−Ｏ染色によって示されたように、脂質の含有量に 劇的な変化が引き起こされた。 図７ａおよび図７ｂ 不死化されたヒト骨髄間質性細胞の分化に対する、正常ウサギ血清（ＮＲＳ） の作用。図７ａが示すところでは、ＩαＩ型のコラーゲンの形質発現（レーン２ ）は、ＮＲＳ（１２３ｂｐのラダーマーカー、レーン１）によって１週間処理し た後には失われた（レーン３）。逆に、７日間ＮＲＳで処理すると（図７ｂ）、 脂質生成、リポタンパク質リパーゼ（レーン２）の初期マーカーの形質発現を引 き起こし、これはＮＲＳ（１２３ｂｐのラダーマーカー、レーン１）の不在下で は存在していない（レーン３）。 図８ 不死化されたヒト骨髄間質性細胞クローン７の脂質生成に対する種々の血清型 の作用を示す。 図９ 不死化されたヒト骨髄間質性細胞クローン７の脂質生成に対する、閉経前およ び後の血清の作用を示す。 図１０ ＬＯＰ−７細胞の分化に対する１５−デオキシＰＧＪ₂およびレチノイル酸の 作用を示す。 以下の材料および方法を本発明に関連して使用し、この応用に記載した。 ヒト骨系における分化経路の選択に影響する因子 材料 「コスター」組織培養プラスチックを使用して細胞を培養した（ハイ ワイコ ム、英国）。最小限の必須の培地−アルファ（α−ＭＥＭ）、「ダルベコ」の修 飾イーグルス培地（ＤＭＥＭ）、ＨＡＭのＦ１２、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、グ ミタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｇ４１８（ジェネチシン）、トリ ゾール剤およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを、ライフテクノロジーズ社（英国 、ペイズレー）から入手した。アスコルビン酸、ビタミンＫ、ＰＴＨフラグメン ト１−３４、ＰＧＥ₂、フォルスコリン(forskolin)、デキサメタゾン、ポリブレ ン、アルカリ フォスファターゼ、組織化学的検出キット、パラ−ニトロフェニ ル フォスフェート、パラ−ニトロフェニル 標準、油−赤 Ｏ、トリパン ブ ルー、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３−〔４，５−ジメチルチアゾール −２−イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、パー コルおよび抗マウスＩｇＣ ＦＩＴＣ接合抗体を、シグマ ケミカル社（英国、 ドーセット）から入手した。免疫マウスをライフ サイエンス インターナショ ナル（英国）社（バシングストーク、英国）から入手した。ＳＶ４０Ｔ抗原特異 性のモノクローナル抗体を、ケンブリッジ バイオサイエンス社（ケンブリッジ 、英国）から入手し、ヒトオステオカルシンＲＩＡキットを、ニコルス研究所（ カリフォルニア州、米国）から入手した。ｃＡＭＰアッセイキットをアメルシェ ル社（バッキンガムシャー、英国）から入手し、モロニー白血病ウイルス逆転写 酵素（Ｍ−ＭＬＶ ＲＴ）およびｄＮＴＰをプロメガ社（サザンプトン、英国） から入手した。インターロイキン１α、１β、３、４、６および８、ＣＭ−ＣＳ Ｆ およびＴＮＦα用のＰＣＲプライマーは、Ｗ．ウイシャート博士（スイス国、ベ イスル、サンドス ファルマ社）からの親切な贈り物であり、コラーゲン１型Ｐ ＣＲプライマーは、Ｋ．Ａ．ハーツ博士（英国、マックレスフィールド、ゼネカ ）からの親切な贈り物である。リポタンパク質リパーゼへのプライマーは、出版 されたデータ（ゴトダ等、１９８９年）から生成させた。ＳＶ４０巨大Ｔ抗原突 然変異体（ｔｓＡ５８）を含有する両性にパッケージされたレトロウイルス性ベ クターおよびネオマイシン耐性遺伝子は、Ｐ．Ｈ．ガリモア教授（英国、バーミ ンガム、癌研究所）からの親切な贈り物であった。 ヒト骨髄間質性細胞の分離および形質導入 新鮮なヒト肋骨を、骨の病歴がない、胸部の手術を受けた６８歳の女性の患者 から得た。この肋骨を、直ちに無菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、すべ ての付着した組織を掻き落とした。次いで、肋骨を割って２つのハーフを得、骨 髄空腔を露出させ、柱状骨をミンチにした。骨髄細胞を、このミンチされた柱状 骨から、１９ゲージの針を備えた１０ｍｌのシリンジを使用してα−ＭＥＭによ って洗浄した。培地で数回洗浄した後に、得られた細胞の懸濁液を汎用コンテナ へと移し、１０分間静置し、この時間後に表面に浮かんできた脂肪の堆積物を掻 き取った。この骨髄に由来する細胞を、遠心分離チューブに移し、１００ｘｇで ５分間回転させ、細胞をペレット化した。この培地と脂肪堆積物とを再び除去し 、細胞のペレットを５ｍｌの培地中で再懸濁させた。この再懸濁した細胞を、７ ０％のパーコル勾配上へと載せ、これを４６０ｇで１５分間回転させた。遠心分 離に続いて、低密度の骨芽細胞の前駆体細胞を含有する、この勾配容量の上部の ２５％を除去した（完了するまで；ヘイ ンズワース等、１９９２年）。この懸濁液に対して、等しい容量の新鮮な培地を 加え、懸濁液を１００ｘｇで１０分間遠心分離させた。こうして得られた細胞ペ レットを、新鮮な培地中で再懸濁させ、この細胞懸濁液を１９ゲージの針を数回 通過させることによって、単細胞溶液が得られた。生存中の細胞数を、１％（ｗ ／ｖ）のトリパンブルー染色を使用して計数した。 次いで、骨髄間質性細胞を１００ｘｇで５分間遠心分離し、この細胞のペレッ トを、ｔｓ−ＳＶ４０−Ｔプラス選択マーカーおよびポリブレンを８μｇ／ｍｌ の最終濃度で含有する両性のパッケージされたレトロウイルスシャトルベクター を含有する、適当な容量の培地中に再懸濁させた。この細胞および培地を２時間 培養し、この後に細胞懸濁液を再度遠心分離し、この細胞のペレットを、適当な 容量の通常の培地中に再懸濁させた。細胞を、Ｔ７５組織培養フラスコ中へと、 フラスコ一個当たり最終密度４×１０⁷個を播種した。このフラスコを３３℃で 培養し、細胞を３日で組織培養処理プラスチックへと付着させた。いったん細胞 の大部分がフラスコに付着すると、付着していない細胞を洗浄し、培地を、４０ ０μｇ／ｍｌの最終濃度のＧ４１８を含有する通常の培地によって入れ換えた。 ２週間後には、Ｇ４１８中の培養物にはジェネチシン耐性の細胞のみが生存し ており、それぞれ均質なＳＶ４０−Ｔ不死化細胞の分離されたコロニーがもたら された。これらの耐性のコロニーをそれぞれリングクローニングによって回収し 、細胞集団を組織培養フラスコ中で膨張させた。更に、９６のウエル平板中の各 コロニーに由来する単細胞を接種することによって、均質な細胞集団を得た。細 胞数を増加させた初期の段階の間は、コロニー調整された培地が、単細胞を支持 するために必要とされる。 細胞の培養 Ｇ４１８耐性の複製細胞クローンを選択し、１Ｘグルタミン、１Ｘ非必須アミ ノ酸、ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのＧ４１８および８ ％の熱不活性化ＦＣＳ（基礎培地）を含有するα−ＭＥＭ培地中で許容可能な温 度（３３℃）で膨張させた。細胞を１週間に２回規則的に通過させ、確実に細胞 が集密状態に達しないようにした。すべての実験を、他に断らない限りはこれと 同じ基礎培地中で実施した。 成長曲線の生成 細胞を、２４ウエルの組織培養平板中に２５００，５０００または１００００ 細胞／ｃｍ²で播種し、腫瘍遺伝子の許容可能な温度（３３℃）でインキュベー トした。１ｃｍ²当たりの細胞数を、集密状態に達するまで、血球計算板を使用 してトルイジンブルー排除によって示される生存細胞を計数することによって、 規則的な間隔で測定した。 免疫細胞化学 準集密状態の細胞をメタノールおよびアセトン（１：１の比率）によって−２ ０℃で２０分間固定した後に、巨大Ｔ−抗原用の免疫染色を実施した。ＳＶ４０ −Ｔに対する一次ＩｇＣマウスモノクローナル抗体を、ＰＢＳ中に１：２０の希 釈率で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。対照例の細胞をＰＢＳのみ の中でインキュベートした。細胞をＰＢＳによって２回洗浄し、二次抗体（ヤギ 抗マウスＩｇＣ ＦＩＴＣ接合）を、細胞に対してＰＢＳ中で１：２０の希釈率 で添加し、３７℃で更に６０分間インキュベートした。次いで、過剰の抗体をＰ ＢＳによって数回戦場して洗い流し、細胞を蛍光顕微鏡の前に免疫マウントに載 せた。 無機化された基質の染色 集密後の細胞の培地に、１０^-7Ｍのデキサメタゾンの存在下または不在下で、 ２８日間不許容温度（３９℃）で、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸および１０^-5 Ｍのβ−グリセロフォスフェートを補足した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１０ ％の緩衝ホルムアルデヒド塩中で１０分間室温で固定した。次いで、細胞をフォ ン・コッサ法（クック、１９７４年）を調整して染色した。簡潔に言うと細胞を 硝酸銀で処理し、紫外光に１時間曝露した。過剰の硝酸銀を蒸留水で洗い流し、 細胞を５％チオ硫酸ナトリウムで５分間室温で処理した。次いで、この細胞を蒸 留水で２回洗浄し、空気乾燥させた。 骨細胞タンパク質アッセイ 細胞を１ｃｍ²当たり１００００個の細胞密度で播種し、許容温度（３３℃） で集密状態に到達させ、この後デキサメタゾン、１，２５−（ＯＨ）₂Ｄ₃または ビヒクルで処理した。細胞を許容不能温度（３９℃）でインキュベートし、培地 を、適当な薬剤と共に３日ごとに補給した。この培地を除去し、オステオカルシ ンの測定に使用する前に−８０℃で貯蔵した。 オステオカルシンを、免疫放射測定アッセイキット（ニコルズ研究所）を使用 して測定し、これは生オステオカルシンとその巨大Ｎ−末端中間フラグメントと の双方を検出する。簡潔には、２０μｌの調整された培地または既知のオステオ カルシン標準を加えた培地を、¹²⁵Ｉ_-標識抗体と共にヒトオステオカルシンへと 混合し、非標識オステオカルシン抗体を被覆したプラスチックビーズを、オステ オカルシン分子上の他の部位に対して持ち出した。この混合物を３時間室温でイ ンキュベートし、この後ビーズを洗浄緩衝液（キット中に備えつけられている） で数回洗浄した。次いで、洗浄したビーズをガンマカウンター中に配置し、結合¹²⁵ Ｉを定量した。対照例 と処理試料とを、オステオカルシンの定量用の標準曲線と対比した。 アルカリ ホスファターゼを細胞層中で、ベッセー等（１９４６年）が最初に 記載した方法を調整して測定した。簡潔に言うと、細胞をＰＢＳ中で数回洗浄し 、氷冷した０．１％「トリトン−Ｘ１００」２００μｌ中へと細胞層を掻き取り 、この試料を温和な超音波処理に供することによって、細胞溶解液を調製した。 次いで、この試料の等分品を、予め温めた基質溶液（０．１Ｍのジエタノールア ミン、１ｍＭのＭｇＣｌ₂および２ｍＭのｐ−ＮＰＰ、ｐＨ１０．５）で１時間 インキュベートし、０．１ＭのＮａＯＨを添加して反応を停止させた。分光光度 計で４１０ｎＭで試料を定量し、最終的なｐ−ＮＰ濃度を既知のｐ−ＮＰ標準の 標準曲線を使用して評価した。 オステオカルシンおよびアルカリ ホスファターゼ測定の双方を、ブラッドフ ォード染色結合法（ブラッドフォード、１９７６年）に基づいてバイオ−ラドタ ンパク質アッセイによって得られた細胞層のタンパク質含有量を測定することに よって、単位タンパク質に対して標準化した。 パラチロイド ホルモンによるｃＡＭＰ合成の刺激 細胞を組織培養平板フラスコからトリプシン化によって除去し、ＩＢＭＸを１ ０^-4Ｍの濃度で含有する無血清培地中に、１ｍｌ当たり２．５×１０⁶個の細胞 密度で再懸濁した。次いで、２時間後、２００μｌのこの懸濁液をエッペンドル フチューブ中に等分し、ヒトＰＨＴ（１−３４）によって１０^-7および１０^-8Ｍ の用量で、またはＰＧＥ₂によって１０^-7または１０^-8Ｍの容量で、またはフォ ルスコリンによって１０^-5Ｍの容量で２０分間処理した。インキュベートに続い て、細胞を５分間沸騰させ、遠心分離し、２００ μ１の０．１％「トリトン Ｘ１００」中に再懸濁させた。次いで、試料を２回 冷凍／解凍し、超音波処理した。２０μｌの試料を、ｃＡＭＰについて、「アメ ルシャム」社から得た免疫測定キットを使用して測定した。 脂肪細胞様の表現型への分化の刺激 １０％のＦＣＳを含有する培地中に細胞を播種し、約６０％の集密率になるま で許容温度でインキュベートした。次いでこの培地を、１０％ウサギ血清を含有 する培地で置換し、この細胞を非許容温度（３９℃）で３日間培養した。培養に つづいて、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで１０％緩衝ホルムアルデヒド塩に よって固定した。細胞を染色し、クック（１９７４年）によって記載された油− 赤−Ｏ法を使用して脂質含有量を得た。 ＲＴ−ＰＣＲ 細胞を１ｃｍ²当たり１００００個の細胞数でフラスコ中に播種し、許容温度 で集密状態に達するまで培養した。培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、 これにトリゾール剤を添加し（１０ｃｍ²当たり１ｍｌ）、生産者が推奨してい るようにＲＮＡを抽出した。一本鎖ｃＤＮＡを５μｇのＲＮＡから０．２μｇの オリゴ（ｄＴ）プライマーによってｄＮＴＰ混合物（各０．５ｍＭ）の存在下に ＭＭＬＶ−ＲＴ（１００単位）によって２０μｌの最終容量で合成した。ＲＮＡ およびプライマーを７０℃で１０分間インキュベートし、次いで残りの成分を添 加する前に氷上で瞬間的に冷却し、この反応物を３７℃で１時間インキュベート した。次いで、試料を９５℃で５分間熱処理し、酵素を不活性化させた。ダキラ 等（１９９１年）が記載した「ホットスタート法」を採用して、ｄＮＴＰ混合物 （各 ０．２ｍＭ）、特異的プライマー（各０．５ｍＭ）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ （２．５単位）、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ および１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含有する１００μｌの反応物中でｃＤＮＡを増 殖させた。ＰＣＲ反応に使用したプライマーおよび増殖条件（３０サイクル）を 表１に列記する。 脂肪／骨原性前駆体の分化機構の解明 同定されたヒト脂肪／骨原性前駆体の一つの可能な分化機構を解明するために 、我々は脂肪細胞の形質発現を調節することが知られている因子を考察した。特 に、我々は、脂肪細胞マーカー−ペルオキソム増殖活性化受容体ガンマ、ＰＰＡ Ｒγの形質発現を研究した。 逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）を、我々のヒト脂肪／骨原性細胞 からのＲＮＡについて、ＰＰＡＲγに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライ マーを使用して実施した。驚くべきことに、この実験では、前駆体細胞によるＰ ＰＡＲγの形質発現が示された。現在までは、ＰＰＡＲγは、他の脂肪細胞特異 性の核受容体（ＣＥＢＰαのようなＣ／ＥＢＰ類）のように、分化した脂肪細胞 中でのみ形質発現するものと考えられてきた。 また、驚くべきことに、ＰＰＡＲγ、１５−デオキシ−デルタ １２，１４− プロスタグランジンＪ₂用の既知のリガンドによる細胞のインキュベートは、脂 肪／骨原性細胞の脂肪細胞表現型への分化を引き起こした（図１０を参照）。こ れが示すところでは、１５−デオキシ−デルタ １２，１４−プロスタグランジ ンＪ₂は、血液中に存在し、脂肪／骨原性前駆体の分化を調節できる特異的因子 である。 これは、著しく興味深いことである。なぜなら、ＰＰＡＲγおよびそのための リガンドが、骨を生成する細胞の生成の調節に関与で きること、あるいはその途中にあることを誰もこれまで示してこなかったからで ある。従って、デオキシ−デルタ １２，１４−プロスタグランジンＪ₂の脂肪 生成作用を拮抗阻害するために開発された薬剤は、例えば骨粗髭症に対する保護 をもたらし得る。興味深いことに、レチノイル酸は、これも血液中に存在してい るが、幾らかの脂肪生成能力を備えており（図１０を参照）、ＰＧＪ₂代謝産物 と相乗的に作用するように見える。従って、レチノイル酸の活性を阻害すること で、骨前駆体細胞の骨芽細胞の表現型への分化を促進できるはずである。 脂肪／骨原性前駆体の分化機構を解明するのに使用した上記の方法は、次の文 献のいずれかに直接または間接に記載されている。 （１）ヒュー・Ｅ等「脂肪生成転写因子ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰαによる筋 芽細胞の分化転換」「Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ」92巻、9856-9860頁、19 95年10月 （２）クリエウエル Ｓ．Ａ．等「プロスタグランジンＪ₂代謝産物は、ペルオ キソム増殖活性化受容体γに結合し、脂肪細胞の分化を促進する」「Ｃｅｌｌ」 第８３巻、８１３−８１９頁、１９９５年１２月１日 （３）フォーマン，Ｂ Ｍ等「１５−デオキシ−Δ １２，１４−プロスタグラ ンジンＪ₂は、脂肪細胞決定因子ＰＰＡＲγ用のリガンドである」「Ｃｅｌｌ」 ８３巻、８０３−８１２頁、１９９５年１２月１日 （４）グリーン等「ヒトＰＰＡＲγ ｃＤＮＡの分離：骨髄細胞における形質発 現および染色体マッピング」「Ｇene Ｅxpression」４巻、２８１−２９９頁、 １９９５年 ラット神経系中の分化経路の選択に影響する因子 方法および結果 １２−１３日のラット胎児縫合核からの神経細胞を、レトロウイルスにパッケ ージされた温度感受性の腫瘍遺伝子（ｔｓ）ＳＶ４０Ｔ（ストリンガー等、１９ ９４年）を形質導入することによって不死化させた。腫瘍遺伝子の許容温度で前 駆体単細胞に由来するクローンを分離および膨張させた後に、温度をその許容不 能な値に上昇させることによって、クローンを分化させた。この基礎的条件下で 、幾つかのクローンからの細胞が、神経繊維およびニューロン特異的なエノラー ゼ（ＮＳＥ）陽性を含む、同様のニューロン特性を示した。更に、セロトニン作 用性の表現型のマーカーが明らかになった。種々の血清（ヒト、ウサギ、ウシ胎 児、ウシの新生児、ウマの胎児、成体のウマ、ヤギおよびロバ）を含有させるこ とによって、この表現型の形質発現を防止する。この代わりに、この細胞は星状 膠細胞様の形態と、グリア繊維酸タンパク質（ＧＦＡＰ）の形質発現を示した。 温度を変化させてから後に遅れて血清を適用すると、十分な星状膠細胞の表現型 を成長させる細胞の能力が段階的に減少した。同様に、血清の適用を２日以上延 長した後に血清を除去すると、セロトニン作用性のニューロン表現型へと戻るの を許容ないし誘発できなくなった。 ウシ胎児血清を、「アミコン」限外濾過チューブを使用してフラクションにし た。ＭＷが３０Ｋを越える因子を含有するフラクションのみが、グリア表現型へ の変化を引き出す上で有効であった。マイクロモルの濃度のレチノイル酸（１０ ０％血清に見られる水準よりも数千倍高い）も、ＧＦＡＰの形質発現を生じさせ る。更に、温度変化のときにヒドロコルチゾンを添加すると、成長中の縫合細胞 の表現型に影響し、それをグリア細胞の経路へと促進する。 ラット脊髄バックグラウンド細胞（即ちニューロン細胞のない神 経細胞）をラット不死化縫合前駆体細胞クローンと共に許容不能温度で共培養し たときにも、不死化された細胞がもたらされ、基礎的条件に適合したニューロン 表現型からＧＦＡＰ陽性の、平坦な形態の典型的な星状膠細胞へとスイッチし； 基礎培地を使用し、血清を添加しなかった。ＧＤＮＦ（５ｎｇ／ｍｌ）はこの効 果を模擬しなかった。従って、いずれの経路が続くのかの選択を決定するのは、 少なくとも部分的には、神経細胞が成長してきた細胞外培地に由来する因子の存 在であり、また血清中に存在する因子である。これらの因子には、レチノイル酸 および血清中に見いだされる高分子量の物質が含まれる。 ラット胎児縫合の中の個々の細胞は、インビトロで少なくとも二種の異なる経 路で分化し得るものと結論される。続く経路の選択は、血清中に存在する因子に よって少なくとも部分的に決定されており、この一つはレチノイル酸であろう。 いずれの経路に沿った分化も、他のセロトニン作用性ニューロンまたは星状膠細 胞様の表現型を採用する細胞の能力が明らかに完全に喪失しない限りは、ますま す逆転させることが困難になる。 ヒト神経系における分化経路の選択に影響する因子 方法および結果 ８週間のヒト胎児の皮質から得た神経前駆体細胞を，上記したように不死化さ せ、単細胞からフラスコの水準まで膨張させた。フィブロネクチンで被覆した２ ４ウエルの平板上に細胞を平板培養し、細胞が約７０％の集密状態に達するまで ３３℃で３−４日間保持した。薬剤を、３９℃に温度を上昇させる前に、あるい は温度変化のときに添加し、更に７−１０日間後に、培養物を固定し、免疫染色 した。特異性の因子と薬剤とが、得られた皮質細胞系の表現型に対 して顕著な作用を示す。１つの例として、（ＨＣｏｒｔ５ｂ膨張）グリア細胞系 に由来する神経栄養因子（ＧＤＮＦ）によって、幾つかの細胞が、ニューロン特 異性のエノラーゼ免疫反応性および明相形態のようなニューロンの特徴を示す。 同様の培養条件の下で、この代わりに毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の存在下 では、ＧＦＡＰ染色は、幾らか平坦な、暗相の星状膠様細胞中で明らかになった 。これらの二種類の因子のいずれも存在しない場合には、いずれのニューロン表 現型のグリアの特徴も示されていなかった。他の皮質細胞系（ＨＣｏｒｔ３ｂ膨 張）においては、弱いＧＦＡＰ免疫染色が、基礎インキュベーション条件下で幾 つかの細胞中に存在していたが、しかしこの貯蔵溶液から繊維芽成長因子（ＦＧ Ｆ）を除去し、デキサメタゾンを添加すると、細胞の大部分がニューロン様の形 態を示し、強いＮＳＥ様の免疫反応性を示した。ＦＧＦは、このデキサメタゾン の作用を防止する。 要約すると、栄養因子として知られる幾つかの血清中の未知の因子、および幾 つかの小分子が、ヒトおよびラットの神経前駆体の全体のニューロン対星状膠細 胞の表現型を選択する能力を持つことを明確にした。 結果 我々の実験が示すところでは、一次ヒト骨髄間質性細胞を（ｔｓ）−ＳＶ４０ −Ｔ（Ａ５８）腫瘍遺伝子を有するベクターによってＭＬＶ由来のＬＴＲおよび ｎｅｏｒの制御下にレトロウイルス形質導入すると、異なる源に由来する一連の 骨細胞集団にジェネチシン耐性が付与される。 免疫細胞化学は、不死化したクローン（図１）内のすべての細胞中でＳＶ４０ の巨大Ｔ−抗原の形質発現を示し、予期したようにタ ンパク質は細胞核に局在化されていた。一次抗体によって処理されていない対照 例の細胞については、染色は見られなかった。更に、ポリアクリルアミドゲル電 気泳動法およびウエスタンブロッティング法によって、これらの細胞中のＴ−抗 原を同定し、ブロッティングに先立って抗原の沈殿および選択を行う必要がなく 、約９６Ｋｄ（データは示していない）の全長Ｔ−抗原に対する予期されたＭｒ を得た。 種々の細胞密度では３つともすべて許容温度（３３℃）で細胞数の定常的な増 加を示し、１ｃｍ²当たり１００００個の細胞密度で平板培養した細胞について は、最も大きな成長速度が観測された。このグラフ（図２）から、１ｃｍ²当た り３００００個の細胞を越えたところで、集密状態に達し、この後は細胞の成長 速度が減少することが明らかであるが、細胞死の速度が増大する可能性は排除で きない。約２倍に増加する時間は、細胞密度が増大するのにつれて減少し、高密 度の場合の約３６時間から最も低い細胞密度では４５時間になる。許容不能温度 （３９℃）では、通常の培地の存在下では細胞は増殖するようには見えなかった （データは示していない）。 もとのクローンからの細胞試料は２１回を越える移送（約８４回の集団の倍増 ）を受けた。クローン７からの試料においては、細胞が増殖して、２１回移送を 受けた（約８４回の集団の倍増であり、これは全体として約１０²⁴倍の潜在的な 細胞がある）。 不死化したクローンをアルカリ ホスファターゼ活性（図３ａ）およびオステ オカルシンタンパク質の形質発現（図３ｂ）の双方について試験することによっ て、これらの細胞が、骨芽細胞の表現型の特徴であるこれらの二種のタンパク質 を構成的にまたは誘起的に形質発現しているかどうかを測定した。 許容温度では、アルカリ ホスファターゼの形質発現が観測され、 その活性は、１０^-7Ｍの用量のデキサメタゾンによる処理によって増大させるこ とができた。このデキサメタゾンによる活性の増大は、活性の腫瘍遺伝子産物が 存在すると顕著に阻害され、許容温度での活性は０．８４８＋／−０．２１ μ Ｍｏｌｅｓ ｐ−ＮＰ／ｍｇタンパク質／時間であり、許容不能温度での活性は ７．４４１＋／−１．９７ μＭｏｌｅｓ ｐ−ＮＰ／ｍｇタンパク質／時間で ある。集密状態に達した細胞を許容不能温度にスイッチし、通常の培地中で７日 間培養すると、アルカリ ホスファターゼの活性の増大が観測され、許容温度で の活性は０．２３６＋／−０．０９ μＭｏｌｅｓ ｐ−ＮＰ／ｍｇタンパク質 ／時間であり、許容不能温度での活性は０．９８５＋／−０．１８ μＭｏｌｅ ｓ ｐ−ＮＰ／ｍｇタンパク質／時間である。許容温度と許容不能温度との双方 において、デキサメタゾン処理はアルカリ ホスファターゼ活性の顕著な増大と 関連している（３３℃でｐ＜０．０５、３９℃でｐ＜０．０１）。しかし、我々 の他の骨髄間質性に由来する不死化したクローンの幾つかにおいては、検出可能 な水準のアルカリ ホスファターゼ活性は、デキサメタゾンまたは１，２５（Ｏ Ｈ）₂ビタミンＤ₃によって刺激する前には観測されなかった。 オステオカルシンの合成は、基礎培地を用いて培養した細胞において最大３週 間にわたって検出されなかったが、しかし１，２５（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃をこの 培地にビタミンＫと共に添加すると、オステオカルシンが培養の第２週目に検出 された。１，２５４（ＯＨ）₂ビタミンＤ₃に対するオステオカルシンの応答は用 量に依存しており、最も低い用量である１０^-11Ｍでは１０⁴個の細胞当たり０． ４１＋／−０．１７ｎｇのオステオカルシンの生産を刺激し、最も多い用量の１ ０^-7では１０⁴個の細胞当たり６．３７＋／−０．５５ｎｇのオステオカルシン をもたらした。予期したように、デキサ メタゾンへの曝露は、測定可能な量のオステオカルシンの合成をもたらさなかっ た。 フォースコリン、ＰＧＥ₂およびＰＴＨ（１−３４）に対するｃＡＭＰの反応 を研究し、これらの既知の骨拮抗阻害剤がｃＡＭＰの水準に上昇を引き起こすか どうかを調査した。３種類のすべての拮抗阻害剤がｃＡＭＰの水準に刺激作用を 有していたことは明らかである（図４）。予期されたように、最良の反応は、１ ０^-5Ｍの用量のフォースコリンについて観測され、これは２倍以上の水準まで増 大した。ＰＴＨと−ＰＧＥ₂の双方は、用量に依存してｃＡＭＰに増大をもたら し、１０^-9ＭのＰＧＥ₂は、ｃＡＭＰに３８．７＋／−８．４％の増大をもたら し、これと比較して１０^-8ＭのＰＧＥ₂は７９＋／−４．２％の増大をもたらし 、１０^-9Ｍの１−３４ＰＴＨは、ｃＡＭＰに５０＋／−１１．６％の増大をもた らし、１０^-8Ｍでは５８＋／−１１．０２％の増大をもたらした。 β−グリセロフォスフェートの存在下に、１０^-7Ｍのデキサメタゾンの存在ま たは不在下に２８日間培養した後に、クローン７細胞を、フォン・コッサ法を使 用して染色し、細胞外の基質の無機化を示した。処理された細胞と非処理の細胞 との双方が、その細胞外の基質の無機化を示したが、デキサメタゾンで処理した 細胞においては一層多量の無機化が見られた（図５ａ）。また、これらの培養物 においては幾らかの結節生成が見られたが、しかし無機化も結節していない領域 内で生じていることは明らかである。光学顕微鏡による分析によって、細胞外の 基質中に堆積している無機質の存在が明らかに示された（図５ｂ）。 ３日間１０％正常ウサギ血清の存在中で培養したクローン７細胞は、油−赤− Ｏ染色によって示されたように、細胞の脂質含有量に劇的な変化を示した。処理 されていない細胞は、検出可能な脂質含 有量を示さなかった。しかし、ウサギ血清によって処理した場合には、陽性の染 色を示す細胞の割合は１００％に上昇した（図６ａ、ｂ）。対照的に、ヒト成人 の柱状骨チップに由来するｔｓ−ＳＶ４０−Ｔ不死化骨芽細胞様の細胞は、脂肪 細胞の経路を辿る分化を引き起こすことはできなかった（データは示していない ）。 不死化した間質性細胞を正常ウサギ血清で一週間の間３９℃で処理しても、脂 肪細胞の系統の初期マーカーである、リポタンパク質リパーゼの形質発現を引き 起こした（図７ａ）。更に、骨芽細胞系のマーカーであるＩ型コラーゲンの形質 発現は、１０％の正常ウサギ血清で７日間インキュベートした後には失われた（ 図７ｂ）。 骨粗髭症は、骨髄脂肪組織の増大と骨の容量の減少とを特徴とするが、骨粗髭 症が閉経後の女性に生ずる傾向があり、また我々の結果が示唆するところでは、 血清やその抽出物が脂肪生成への切り換えをもたらすということを考え、我々は 、脂肪細胞をもたらす分化を促進する薬剤を含有することが判明したウサギ血清 に対して、このような薬剤を比較的に少量かまたはまったく含有していないもの と推論している閉経前のヒト女性の血清に対して、およびこのような薬剤を含有 しているものと推論している閉経後のヒト女性の血清に対して、我々のクローン ７の不死化ヒト骨髄間質性細胞を曝露した。これらの結果を図８および図９に示 す。 図８において理解できるように、予期されたように、我々のヒト細胞系をウサ ギ血清に対して曝露すると、約９０％の脂肪細胞の生産が生じた。対照的に、こ れと同じ細胞系を閉経前のヒト女性の血清に対して曝露すると、僅かに約１０％ の脂肪細胞の生産がもたらされ、脂肪細胞への切り換え作用を持つ薬剤が、活性 が乏しいか、少量しか存在していないか、あるいはまったく存在していないこと を示唆している。これと同じ細胞系を閉経後のヒト女性の血清へと 曝露すると、約４０％の脂肪細胞の生産がもたらされ、血清による脂肪細胞の表 現型への分化の促進が起こり、従って脂肪細胞への切り換え作用を持つ薬剤が、 この血清中で一層活性であるかまたは一層多量に存在していることを示唆してい る。 図９を参照すると理解されるように、閉経前の女性の集団からの血清と、閉経 後の女性の集団からの血清とを使用して、これと実質的に同じ実験を繰り返した ところ、同じ結果が得られた。 図１０を参照すると理解できるように、脂肪／骨原性前駆体は、ペルオキソム 増殖活性化受容体γ ＰＰＡＲγを含む経路を辿って分化する。分化に際しての この受容体の役割は、従来はこの受容体が、分化の終わった、つまり成熟した表 現型のマーカーであると考えられてきたことを考慮すると、驚くべきものである 。このように、我々のデータが示唆するところでは、ＰＰＡＲγを活性化／不活 性化する薬剤は、これらの前駆体細胞の分化に際して役割を担うであろう。 このデータが示唆するところでは、血清中に分化を促進する作用を持つ薬剤が あり、ヒト骨髄間質性細胞を前記の薬剤に曝露すると、脂肪細胞の表現型が優先 する。 我々の結果が明らかに示すところでは、調節可能な形態のＳＶ−４０−Ｔを形 質発現するベクターによってレトロウイルスの形質導入を受けたヒトまたは動物 の細胞系を使用して、腫瘍遺伝子の許容温度で、前駆体細胞の均質な集団へと複 製できる前駆体細胞を提供することができた。次いで、これらの細胞を使用して 分化を研究した。これらの細胞を使用して、前駆体細胞が多分化能であり得、従 ってこれらがとる分化プロセスの性質によっては、前駆体細胞が一種以上の表現 型へと分化しえることを示すことができた。従って、例えば、我々が示したとこ ろでは、骨前駆体細胞は、分化して骨細 胞または脂肪細胞のいずれかを生産するようにすることができ、神経前駆体細胞 は、分化してニューロン細胞または星状膠細胞のいずれかを生産するようにでき る。我々の結果が示唆するところでは、続く経路の選択は、少なくとも、血清中 および／または神経細胞の細胞外培地中に存在する可溶性の因子によって決定さ れる。我々は、低分子量の可溶性の因子が関与しているものと考えており、更に これらの低分子量の可溶性の因子は、高分子量の担体タンパク質によって支持さ れているらしいと考える。また、我々が示したところでは、別の経路に沿った分 化は、逆転させることが困難であり、なぜならこれが関与している経路以外の経 路に適合する能力が明らかに完全に喪失するまで、この分化プロセスが進行する からである。我々の発見と、従って本出願に記載した本発明とが、多大な技術的 な重要性を有しているのは、前駆体細胞が一種以上の経路に沿って成長しえるこ とを明らかにしたこと；この成長がどのように促進されているかを明らかにした こと；およびこの成長をどのようにして調節できるかを明らかにしたことにある 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９６０６３７３．０ (32)優先日 1996年３月26日 (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも多分化能を持つヒト前駆体細胞の特定の成熟した表現型への分化 を調節または制御する方法であって、前記細胞を血液、特に血清、またはその抽 出物および／または神経細胞の細胞外培地またはその抽出物に対して、分化を支 持する条件下に曝露することによって、予め選択された成熟表現型をもたらすよ うな分化を選択的に促進する方法。 ２．前記前駆体細胞を、前記の代わりにまたは前記に加えて、前記血清または前 記培地の活性を阻害する薬剤に対して曝露することを特徴とする、請求項１記載 の方法。 ３．薬剤組成物であって、予め選択された成熟表現型をもたらすように少なくと も多分化能を持つヒト前駆体細胞の分化を促進するために、有効量の血液、特に 血清、またはその抽出物および／または神経細胞の細胞外培地またはその抽出物 を含有する薬剤組成物。 ４．薬剤組成物であって、血液、特に血清、またはその抽出物および／または神 経細胞の細胞外培地またはその抽出物の活性を阻害する有効量の薬剤を含有する ことによって、選択された少なくとも多分化能を持つヒト前駆体細胞の血清また は神経細胞の細胞外培地から独立した分化をもたらし、予め選択された血清また は神経細胞の細胞外培地から独立した成熟表現型をもたらす、薬剤組成物。 ５．血清指向性の分化および／または神経細胞の細胞外の培地指向性の分化を防 止または阻害するのに有効な薬剤を同定する方法であ って： 少なくとも多分化能を持つヒト前駆体細胞の集団を、有効量の （ａ）血液、特に血清、またはその抽出物、および／または有効量の神経細胞の 細胞外培地またはその抽出物；および／または （ｂ）試験剤 に対して、成熟した表現型への分化を支持する条件下で有効な長さの時間曝露し 、この集団を検査して、成熟した表現型への血清または神経細胞の細胞外培地指 向性の分化が生じていたかどうか、および／またはどの程度生じていたかを測定 することを含む方法。 ６．前記集団が細胞系である、請求項５記載の方法。 ７．前記細胞系がヒト骨髄間質性細胞系である、請求項５または６記載の方法。 ８．前記細胞系がヒト神経細胞系である、請求項５または６記載の方法。 ９．血清指向性の分化および／または神経細胞の細胞外の培地指向性の分化を促 進するのに有効な薬剤を同定する方法であって： 少なくとも多分化能を持つヒト前駆体細胞の集団を、有効量の （ａ）血液、特に血清、またはその抽出物、および／または有効量の神経細胞の 細胞外培地またはその抽出物；および／または （ｂ）試験剤 に対して、成熟した表現型への分化を支持する条件下で有効な長さの時間曝露し 、次いでこの集団を検査して、成熟した表現型への血清または神経細胞の細胞外 培地指向性の分化が生じていたかどうか、 および／またはどの程度生じていたかを測定することを含む方法。 １０．請求項５または９記載の方法によって同定された薬剤。 １１．血清指向性の分化をもたらすのに有効な血液、特に血清抽出物を同定する 方法であって、前記血液および特に血清を等分し、次いで少なくとも多分化能を 持つヒト前駆体細胞集団を前記血清の少なくとも一種の有効量のフラクションに 対して、予め選択された成熟表現型への分化を支持する条件下で有効な長さの時 間の間曝露し、この集団を検査して、成熟した表現型への血清指向性の分化が生 じていたかどうか、および／またはどの程度生じていたかを測定することを含む 方法。 １２．神経細胞の細胞外培地指向性の分化をもたらすのに有効な神経細胞の細胞 外培地抽出物を同定する方法であって、前記培地を等分し、少なくとも多分化能 を持つヒト前駆体細胞集団を前記培地の少なくとも一種の有効量のフラクション に対して、予め選択された成熟表現型への分化を支持する条件下で有効な長さの 時間の間曝露し、この集団を検査して、成熟した表現型への神経細胞の細胞外培 地指向性の分化が生じていたかどうか、および／またはどの程度生じていたかを 測定することを含む方法。 １３．請求項１１または１２記載の方法によって同定された抽出物。 １４．血清指向性の予め選択された成熟表現型をもたらす少なくとも多分化能を 持つヒト前駆体細胞集団の血清指向性の分化の存在、この分化への感受性または この分化へと向かう素因を診断する方法 であって、試験すべき個体から血液、特には血清またはその抽出物の試験試料を 得、予め選択された成熟表現型への分化を支持する条件下で前記試験試料へと少 なくとも多分化能を持つヒト前駆体細胞を曝露し、次いで前記前駆体細胞の分化 表現型の性質を観測することを含む方法。 １５．血清指向性の予め選択された成熟表現型をもたらす少なくとも多分化能を 持つヒト前駆体細胞集団の血清指向性の分化の存在、この分化への感受性または この分化へと向かう素因を診断する方法であって、試験すべき個体から少なくと も多分化能を持つヒト前駆体細胞の試験試料を得、予め選択された成熟表現型へ の分化を支持する条件下で前記前駆体細胞を血液、特に血清、またはその抽出物 へと曝露し、次いで前記前駆体細胞の分化表現型の性質を観測することを含む方 法。 １６．神経細胞の細胞外培地指向性の予め選択された成熟表現型をもたらす少な くとも多分化能を持つヒト前駆体細胞集団の神経細胞の細胞外培地指向性の分化 の存在、この分化への感受性またはこの分化へと向かう素因を診断する方法であ って、試験すべき個体から神経細胞の細胞外培地またはその抽出物の試験試料を 得、予め選択された成熟表現型への分化を支持する条件下で少なくとも多分化能 を持つヒト前駆体細胞を前記試験試料へと曝露し、次いで前記前駆体細胞の分化 表現型の性質を観測することを含む方法。 １７．神経細胞の細胞外培地指向性の予め選択された成熟表現型をもたらす少な くとも多分化能を持つヒト前駆体細胞集団の神経細胞の細胞外培地指向性の分化 の存在、この分化への感受性またはこの 分化へと向かう素因を診断する方法であって、試験すべき個体から少なくとも多 分化能を持つヒト前駆体細胞の試験試料を得、予め選択された成熟表現型への分 化を支持する条件下で前記前駆体細胞を神経細胞の細胞外培地またはその抽出物 へと曝露し、次いで前記前駆体細胞の分化表現型の性質を観測することを含む方 法。 １８．血清指向性の予め選択された成熟表現型をもたらす少なくとも多分化能を 持つヒト前駆体細胞集団の血清指向性の分化の存在、この分化への感受性または この分化へと向かう素因を診断する方法であって、試験すべき個体から血液、特 に血清、またはその抽出物の試験試料を得、予め選択された薬剤を同定するため に前記試験試料をアッセイすることを含む方法。 １９．前記薬剤が、プロスタグランジンＪ２やその代謝産物のようなプロスタグ ランジン、特にプロスタグランジン代謝産物、レチノイル酸、毛様体神経栄養因 子ＣＮＴＦ、グリア細胞系に由来する神経栄養因子ＧＤＮＦ、繊維芽細胞成長因 子ＦＧＦ、ヒドロコルチゾンのような栄養因子、および／または前述した物質の 相似体または相同体のうちのいずれか一種以上を含有する、請求項１８記載の方 法。 ２０．神経細胞の細胞外培地指向性の予め選択された成熟表現型をもたらす少な くとも多分化能を持つヒト前駆体細胞集団の神経細胞の細胞外培地指向性の分化 の存在、この分化への感受性またはこの分化へと向かう素因を診断する方法であ って、試験すべき個体から神経細胞の細胞外培地，またはその抽出物の試験試料 を得、予め選択された薬剤を同定するために前記試験試料をアッセイすることを 含む方法。 ２１．前記薬剤が、毛様体神経栄養因子ＣＮＴＦ、グリア細胞系に由来する神経 栄養因子ＧＤＮＦ、脳に由来する神経栄養因子ＢＤＮＦ、レチノイル酸、ヒドロ コルチゾン、および／または前述の物質の相似体または相同体のうちのいずれか 一種以上を含有する、請求項２０記載の方法。