JPH11505113A - Animal gene therapy - Google Patents

Animal gene therapy

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JPH11505113A
JPH11505113A JP8533627A JP53362796A JPH11505113A JP H11505113 A JPH11505113 A JP H11505113A JP 8533627 A JP8533627 A JP 8533627A JP 53362796 A JP53362796 A JP 53362796A JP H11505113 A JPH11505113 A JP H11505113A
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ガニェ，マルク
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、乳腺炎等の感染性疾患を処置するための治療、特に遺伝子治療に用いるための、ＤＮＡ配列、発現カセット、およびＤＮＡ構築物に関する。また、該構築物を含む医薬および動物薬組成物、および該ＤＮＡで形質転換され宿主哺乳動物中に移植するのに適した細胞も含まれる。感染性疾患の遺伝子治療は、標的組織中でインサイチオでまたは全身的に実施することができる。   (57) [Summary] The present invention relates to therapies for treating infectious diseases such as mastitis, especially DNA sequences, expression cassettes and DNA constructs for use in gene therapy. Also included are pharmaceutical and veterinary compositions comprising the constructs, and cells transformed with the DNA and suitable for transplantation into a host mammal. Gene therapy for infectious diseases can be performed in situ or systemically in target tissues.

Description

【発明の詳細な説明】 動物遺伝子治療発明の背景 技術分野 本発明は乳腺炎のような感染疾患の処置のための治療、特に遺伝子治療に使用 するためのＤＮＡ配列、発現カセットおよびＤＮＡ構築物に関する。本構築物を 含む医薬および家畜治療薬組成物、およびＤＮＡで形質転換されておりかつ宿主 哺乳動物内への移植に適した細胞もまた含まれている。背景技術 最も高いレベルにおいて、トランスジェニック動物は動物における疾病に伝達 可能な耐性を与える主な方法である。マウスへの遺伝子導入が最初に成功してか らわずか数年後、養殖場動物で新しい技術が使用された。いくつかの遺伝子的処 理が家畜におけるトランスジェニック発生の応用の標的とされてきたが、これら の重要な面の一つは遺伝子導入法による動物の健康および疾病耐性の改良である 。分子生物学において最近開発された技術により達成される疾病耐性および処置 を導く一時的ならびに安定な遺伝的改良は疾病の問題を減少させることに非常に 寄与しうる。 動物の感染に対する耐性は種々のレベルで惹起される。構成性および食作用機 構（先天性免疫）は第一の防御線として働く。これらが有効でない場合には、感 染した生物体は特異的（後天的）免疫により応答することができる。従って、遺 伝子治療応用のための候補には、非特異的および特異的宿主防御機構を調節する ことが知られている全ての遺伝子、すなわち、サイトカイン、主要組織適合複合 体（ＭＨＣ）タンパク質、Ｔ−細胞レセプター（ＴＣＲ）および特異的疾病耐性 を与えるタンパク質が含まれる。病原体に対する増大した保護は、”細胞内免疫 化”、遺伝的免疫化、抗病原体薬としてのアンチセンス配列および疾病感受性遺 伝子の破壊のような他の方法によっても与えることができる。遺伝子調節免疫応答 サイトカインは細胞伝達の可溶性媒介物としてのその役割を通して免疫応答の 調和を保ち総合している。最初に白血球の生存力、増殖、分化および帰還を与え ることが同定されたが、それらはまた、機能の産生または互いを調節することも 観察された。加えて、サイトカインは白血球以外の細胞と相互作用しおよびそれ らの細胞からも産生され、免疫系と他の組織および器官の間の伝達手段を提供し ている。サイトカインとは、成長因子、インターロイキン、ケモカイン、コロニ ー刺激因子およびインターフェロンを含む、急速にその数が増加している調節ペ プチド因子を意味している。それらの機能はそれらの標的細胞上の細胞表面レセ プターへの結合により媒介される。サイトカインは感染性疾患および腫瘍発生の 間の病状の進展に直接的に寄与していることが示された。異なるサイトカインは 宿主防御機構に正および負の両方で影響することが報告されている。 インターフェロン（ＩＦＮ）はよく特徴付けられているサイトカインの群であ り、抗ウイルスおよび抗増殖活性を惹起するとともに細胞増殖、分化および免疫 応答を調節している。よく特徴付けられた抗ウイルス活性だけではなく、ＩＦＮ はマクロファージ活性化へ影響することにより非ウイルス病原体へ拮抗する手段 でもある。インターフェロンの抗ウイルスおよび殺菌作用およびその阻害活性機 構に含まれていることが知られているタンパク質は多数ある。ウイルス感染に対 し宿主感受性に正に影響するＩＦＮの能力はトランスジェニックマウスおよび細 胞株で試験された。ＩＦＮ−β遺伝子構築体を過剰発現しているトランスジェニ ック生物体は高められたウイルス耐性を示すことが明らかにされた。 ＩＦＮおよび種々の他のサイトカインにより活性化される信号伝達経路および 転写因子の理解における最近の進歩は、免疫応答の改良を目指す遺伝子導入処置 の新規治療法ならびに新規戦賂が開かれることを約束している；すなわち、それ 自体別個の”サイトカイン特異的”信号形成成分であるサイトカインをコードす る遺伝子の導入。インターフェロン調節因子（ＩＲＦ−１）導入遺伝子とも称さ れるインターフェロン刺激遺伝子因子（ＩＳＧＦ２）の構成的発現により、種々 のＩＦＮ誘導可能遺伝子のＩＦＮ非依存的活性化およびウイルス感染に対する高 められた耐性を生じることが報告されている。特異的疾患耐性遺伝子 局所遺伝子導入により動物にもたらすことができる他の改良は、特異的疾患耐 性である。よく研究されている特異的疾患耐性遺伝子はある種のマウス系統のＭ ｘｌ遺伝子産物である。マウスＭｘｌタンパク質は、ＩＦＮ処理脊椎動物細胞で 合成され、ＧＴＰａｓｅ活性を有するポリペプチドのファミリーに属している。 いくつかのＭｘタンパク質はある種の負鎖形成ＲＮＡウイルス（例えば、インフ ルエンザウイルス、ＶＳＶ、ラブドウイルスおよびトゴトウイルス）の増殖を阻 害することが示されている。種々の細胞株およびトランスジェニックマウスでの マウスＭｘｌタンパク質の合成は、インフルエンザＡウイルスに感受性であった 細胞および動物においてウイルス耐性を促進することが必要かつ十分であること を示した。この特異的疾患耐性遺伝子のクローニングおよび機能特性付けは、Ｍ ｘｌトランスジェニックブタがインフルエンザ感染に対して感受性の減少を示す であろうかどうかを研究するための遺伝子導入計画を可能にした。 マイコバクテリア、サルモネラおよびリューシュマニアのような抗原的に相関 していない微生物感染に対するある種の近交系マウス系統の天然の耐性は、各々Ｂｃｇ 、ＬｓｈまたはＩｔｙと称される染色体１上の優性遺伝子座により制御さ れている。遺伝子座は感染の非特異的マクロファージ依存期の間にこれらの感染 性病原体の増殖を制限する宿主の能力に影響する。ポジショナルクローニング法 によりＮｒａｍｐと称されるＢｃｇ遺伝子の候補が単離された。導入遺伝子発生 または遺伝子治療（インビボまたはエクスビボ）法によるサルモネラ感染の感受 性の減少は、動物、特に家禽生産に価値が高い。ニワトリ近交系においてサルモ ネラに対する耐性の大きな相違が観察されている。さらに、ヒトにおけるマイコ バクテリアおよび畜牛におけるブルセラによる感染に対する天然の耐性または感 受性は、近交系マウスで観察されたものと類似の遺伝子制御にあることが示され ており、Ｂｃｇにより支配されている。ブルセラ アボルタスによる畜牛の慢性 感染は仔牛胎児の自発的流産を引き起こし、酪農および肉牛産業の経済的安寧を 脅かしている。 ある種のレトロウイルスに対する遺伝的耐性が、いくつかの実験動物種におい て多形形質として観察されている。マウスにおいて同定された座の一つ、Ｆｖ− ４は、ｐｏｌ遺伝子の末端から完全ｅｎｖ遺伝子を通して伸びているマウス白血 病ウイルスの３’半分に似ている。ウイルス外皮タンパク質のみをコードしてい るＦｖ−４のトランスジェニックマウスにおける発現は、同種指向性レトロウイ ルス感染の耐性を与えた。Ｆｖ−４耐性の機構はウイルス干渉の現象、すなわち 、ウイルスレセプターに対する合成された外皮タンパク質と外因性ウイルスの競 合に関係していると考えられている。類似の機構が”細胞内免疫化”として知ら れている抗ウイルス戦略に使用されている。 共通の病原体に特異的な免疫グロブリンをコードしている導入遺伝子の発現は その病原体に対する免疫性を提供することができる。多くの研究で示されたよう に、モノクローナル抗体をコードしているクローン化遺伝子は、遺伝子操作した マウスにおいて大量に発現することができる。これらのマウスは、先立っての接 触または免疫化なしに特異的抗原に対する抗体を産生する。細胞内免疫化 ”細胞内免疫化”の概念は、野生型ウイルスの複製を強力に妨害できるウイル スタンパク質の異常形（優性で負の突然変異体）の宿主中での過剰発現を本質的 に含む。種々のウイルスに対して耐性が獲得される培養細胞での洗練された研究 には、標的細胞へのウイルス付着の防止、ウイルス−宿主転写複合体の形成の阻 害、優性で負のウイルストランス活性化体の発現または感染性ウイルス粒子の組 立の妨害などの方法が含まれる。 外因性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロウイルスはＭＭＴＶの長い末端反 復配列中にコードされているタンパク質と同一の自己−超抗原と称される座と遺 伝的に共分離されることが観察されている。この自己−超抗原を高レベルで発現 している遺伝子操作されたマウスは、感染の標的であるＴ細胞の特異的群の欠損 によりウイルス感染から保護されていることが示された。 ”細胞内免疫化”の定義は、特異的耐性遺伝子の発現、アンチセンスＲＮＡま たは他の抗ウイルス成分のような異なる関連物に記載されている抗ウイルス戦略 にも応用される。 最近、養殖場動物において実施された”細胞内免疫化”法が報告された。トラ ンスジェニックヒツジが創り出され、ビスナウイルス外皮（ｅｎｖ）遺伝子を発 現していることが示された。ビスナウイルスはヒツジに脳炎、肺炎および関節炎 を起こすヒツジレトロウイルスのサブファミリーに属している。ｅｎｖ糖タンパ ク質はこのウイルスの宿主細胞への結合に関与する。感染ヒツジにおけるビスナ ウイルス複製の標的細胞はマクロファージである。ビスナ感染細胞の細胞表面上 のｅｎｖタンパク質の発現はウイルスに対する免疫応答を誘導する。トランスジ ェニックヒツジにおいて、ｅｎｖ遺伝子に融合されたビスナＵ３エンハンサー領 域からなる遺伝子構築物の発現は明かに有害な影響は与えなかった。従って、遺 伝子操作されたヒツジ系統は、感染を防止するため、および／またはウイルス攻 撃後のその天然の宿主における疾患を調節するためのレトロウイルスｅｎｖ糖タ ンパク質の可能性の証拠を提供している。アンチセンスＲＮＡ 細胞または全生物体内のＲＮＡ機能を阻害するためのアンチセンスＲＮＡの使 用は有益な分子生物学的方法を提供してきた。アンチセンスＲＮＡは相補的配列 に高度に特異的な様式で結合し、それによりプロセシングおよび／または翻訳さ れるべき結合ＲＮＡの能力を阻害することにより機能する。アンチセンス配列は 微生物感染、癌、自己免疫疾患およびその他の機能不全の治療において、通常の 薬剤の魅力的な代替物と考えられている。アンチセンス構築物による遺伝子伝達 実験はマウスおよびウサギで実施されている。モロニーマウス白血病ウイルスの レトロウイルスパッケージング配列を標的とするアンチセンスＲＮＡを発現して いる遺伝子操作マウスは感染性ウイルスで攻撃させた後でも白血病を発症しない 。アデノウイルスｈ５ＲＮＡに相補的なアンチセンス構築物を発現しているトラ ンスジェニックウサギが産生された。これらのウサギからの初代の細胞は、対照 動物からの細胞よりアデノウイルス感染に対して９０−９８％より耐性であるこ とが観察された。 抗寄生虫発生剤としてのアンチセンスＲＮＡの使用が開発でき、ＲＮＡ−ＲＮ Ａハイブリッドを生じるだけでなく、標的ＲＮＡ鎖中のホスホジエステル結合を 触媒的に切断する。四つの構造的モチーフ（植物ＲＮＡ病原体で最初に同定され たハンマーヘッドおよびヘアピンモチーフ、ヒト肝炎デルタウイルスで見いださ れたデルタモチーフおよびあまりよく特徴付けられていないニュースポラからの モチーフ）がこれらの自己切断反応の中間体としてこれまで記載されている。こ のリボザイムファミリーのハンマーヘッドモチーフにアンチセンス配列を隣接さ せることにより、特定の標的ＲＮＡの切断が示された。リボザイムはそれ自身切 断反応の間に消費されないので、多数の基質分子が触媒的ＲＮＡにより処理でき る。レトロウイルスであるウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）は畜牛およびヒツジに おいてなかなか直らないリンパ球増加症およびＢリンパ球リンパ腫を起こす。Ｂ ＬＶの調節タンパク質に対するアンチセンス配列が隣接したハンマーヘッドリボ ザイムは、永続的に感染した細胞でのＢＬＶ発現を阻害することが示された。こ のことはＢＬＶ誘導疾患に抵抗性であろう局所化（インビボまたはエクスビボ） または一般化（トランスジェニック動物）遺伝子治療を生み出す可能性を示して いる。体細胞遺伝子導入法 養殖場動物への体細胞遺伝子導入はますます重要になるであろう。エクスビボ およびより最近ではインビボ遺伝子治療がいくつかのヒトにおける遺伝的疾患に 応用された。正常ではアデノシンデアミナーゼ、ＬＤＬレセプター、グルコセレ ブロシダーゼ、血液凝固因子VIII、フェニルアラニンヒドロキシダーゼ、ジスト ロフィンなどをコードしている不全遺伝子等の、１０以上のヒト遺伝子障害のた めに現在の治療法が開発されている。遺伝子治療法の有効性は、もはや証明され るべきものではない。 体細胞内への遺伝子導入の新規方法は非常に有効であることが約束されている 。これらには、遺伝子構築物送達のためのウイルスベクター、および組織または 血管内へのＤＮＡ粒子または溶液のマイクロボンバーディングまたは注入のよう な非ウイルス技術が含まれる。ほとんどの努力は第一にヒト疾患の治療の可能性 を目指すものではあるが、体細胞遺伝子導入のいくつかの応用は家畜用医薬とし て非常に価値がある。それは直接的”遺伝的免疫化”および免疫調節の別の方法 を可能にする。”遺伝的免疫化”（すなわち、免疫原をコードしているＤＮＡ構 築物の応用）には少なくとも二つの強力な使用法がある。一つは、タンパク質精 製の工程を除くことにより過程を単純化し、特定のタンパク質に対する抗体の産 生に必要とされる時間を短くする。中和または殺菌性抗体を直接的にコードして いる遺伝子の生物体内への導入もより迅速にできるであろう。第二は、適当な遺 伝子構築物によりコードされている外来アンチセンスを産生することによる感染 に 対する動物の遺伝的ワクチン化である。 体細胞遺伝子導入法は現在、標的とする微生物に致死的でありかつ絶対的に特 異性があり、動物に対してはいかなる親和性または影響も有しないタンパク質を 器官中または生物体中に放出することにより、感染性疾患の治療および防御の両 方で応用できる。 高度かつ特異的抗菌活性を有するそのようなタンパク質またはペプチドは二つ のファミリーに分けることができる。一つはバクテリオシンを含み、他方はラン チオニン（ランチバイオティクスとも称される）を含む。動物（特に養殖場動物 ）の治療へのバイオテクノロジーの応用は、重要な意味を有するであろう予防お よび制御の新しい道を開いている。バクテリオシンは酵素および別の殺菌性タン パク質から成る。それらは触媒として働き、単一の化学反応に非常に特異的であ る。バクテリオシンは細胞壁を溶解することにより標的生物体を急速に殺し、生 物体が細胞分裂する必要はない。それらは集団制御の手段として細菌により天然 に産生されている。これらのタンパク質は抗生物質よりも大きな分子であり、処 置した器官により長く存続することが期待される。よく知られたバクテリオシン の一つはリソスタフィンであり、それはスタフィロコッカス シムランス次亜種スタフィロリチカス により産生される。抗生物質と異なり、バクテリオシンの急 速な作用は標的および非標的生物体で耐性が誘導される可能性を減少させる。例 えば、これまでに実施された現在の研究では、乳腺炎処置に使用されたバクテリ オシンは他の生物体には無毒であることを示しているようである。 ランチバイオティクスはいくつかの病原性細菌に対して高い抗菌活性を有する ペプチド由来抗生物質である。ランチバイオティクスのリボソーム起源は、構造 遺伝子ｅｐｉＡ（エピデルミン、スタフィロコッカス エピデルミスにより産生 されるランチバイオティクスに対して）の単離により最初に示された。ランチバ イオティクス遺伝子の一般構造はこれまでに記述されたすべてのランチバイオテ ィクスで同一である。線状ランチバイオティクスの一次転写体はＮ−末端リーダ ー配列およびそれに続くＣ−末端プロペプチドからなるプレペプチドであり、そ れからランチバイオティクスが成熟し、−２位にプロリンを有する特徴的なタン パク質分解プロセシング部位が存在している。いくつかのラクトコッカス ラク チス 株により産生されるナイシンはランチオニン群の主要なものである。 他のバクテリオシンおよびランチオニンとしてはアンビシン、デフェンシン、 セクロピン、チオニン、メリチン、マガイニン、アタシン、ジフェテリン、サポ ニン、カクルチン、ゼノピン、サブチリン、エピデルミン、ｐｅｐ５、ラクチシ ン４８１、アンコベニン、デュラマイシン、ガリデルミン、シンナマイシン、ア ンドロピンおよびマストパランがある。 導入遺伝子、すなわち遺伝子治療応用に使用される遺伝的構築物により分泌で きる分子複合体の別の群は免疫付着因子である。抗体の治療能力は長い間認識さ れてきている。ヒト抗体は患者に対して最少の免疫原性であるべきである；すな わちそれらは慢性的または反復的使用に対して安全であるべきである。しかしな がら、いくつかの理由により有用なヒト抗体を発生させることは困難であろう： 実験目的でヒトを免疫化することは倫理上不可能であり、従って入手可能なヒト 抗体は不注意に基づく免疫化またはワクチン接種によるものに限定されている。 さらに、ヒト細胞株の不死化も技術的に困難である。多分最も手におえない技術 的問題は、多くの応用がヒト抗原に対する抗体を必要とすることである；所望の 特異性を有するヒト抗体。 これらの問題を回避するためにいくつかの可能性のある方法が存在する。一つ の方法はヒト抗体可変（Ｖ）領域内への結合の所望される特異性を操作すること である。このことはマウス抗体から、または選択を組み合わせたインビトロ組換 え（例えば、コンビナトリアルライブラリーおよびファージ表示技術）から相補 性決定領域を誘導することにより行うことができる。別の方法は、細胞表面レセ プターまたは細胞接着分子のようなヒトタンパク質から誘導される結合部位と抗 体定常ドメインを組み合わせることにより抗体様分子を創り出すことであり、し ばしばこの方法が有利である。そのような分子は免疫付着因子として知られてい る。 免疫付着因子は抗体の多くの所望の化学的および生物学的特性を有することが できる。Ｆｃレセプターに結合できる免疫付着因子の例では、抗体依存性細胞毒 性を媒介し、霊長類胎盤を通しての能動輸送を示している。免疫付着因子は適当 なヒンジおよびＦｃ配列に連結されたレセプター配列から構築されているので、 問題とする結合特異性は完全にヒト成分を用いて達成することができる。別の可 能性のある外来性配列は接合領域内に存在する。 よく研究された免疫付着因子の一つはＣＤ４−ＩｇＧであり、それはヒト臨床 試験において完全に非免疫原性であることが観察されている。臨床使用のための 第二の候補は腫瘍壊死因子レセプター免疫付着因子(ＴＨＦＲ−ＩｇＧ)である； 可溶性のレセプターそれ自身が体内で天然に観察され、および可能性のある治療 剤と考えられてきているので、この分子には特に興味が引かれる。可溶性レセプ ターは臨床的候補として有効であるが、ＩｇＧ融合形はより長い半減期および改 良された結合活性および親和性等の利点をさらに与える。ＩｇＧのＦｃ部と結合 されて免疫付着因子を形成しているいくつかのレセプターまたは免疫誘導剤が文 献に報告されている；Ｔ細胞レセプター、ＣＤ４、１−セレクチン、ＣＤ４４、 ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２２；ＴＮＦレセプター、ＮＰレセプター 、ＩｇＥレセプター、ＩＮＦ−γレセプター。これらの免疫付着因子は抗原認識 、ＨＩＶへの受容、リンパ球付着、ヒルロニダーゼレセプター、ＢおよびＴリン パ球の相互作用、炎症、敗血症性ショック、ホメオスタシスおよびアレルギーに 有用であるはずである。 動物において、分子生物学技術の出現は二つの特異的活性を有することができ る免疫付着因子を創り出すことを可能にする。例えば、黄色ブドウ球菌の汚染を 除去する目的においては、細菌表面上のタンパク質Ａに強い親和性を有するヒト ＩｇＧのＦｃ部分に結合された、リソスタフィンのような溶菌性酵素からなる免 疫付着因子を有することが可能である。一度Ｆｃが黄色ブドウ球菌上のタンパク 質Ａに結合されたら、溶菌性部分（リソスタフィン）が細菌を溶解することがで きる。 遺伝子治療処置は、トランスフェクトされる構築物に含まれる遺伝子が、イン ターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、ロイコトリエンおよびある種の 成長因子のような免疫調節剤をコードできるような様式で応用できる。先に説明 したように、免疫調節剤は動物をいくつかの微生物に対してより耐性にできる。発明の要約 本発明は動物の遺伝子治療に関する。動物の遺伝子治療とは、疾患の原因とな る感染性または潜在的感染性微生物に対して作用する治療的または予防的タンパ ク質またはアンチセンスＲＮＡまたはペプチドをコードしている遺伝子に連結さ れた誘導可能または構成的プロモーターを含むＤＮＡ構築物による方法を意味し ている。直接的または間接的に動物中の感染性微生物に対して治療的または予防 的効果を有するタンパク質またはアンチセンスＲＮＡまたはペプチドを発現する ための方法が開示されている。本発明は特定の組織または器官につなぎ留められ 、および動物に感染している微生物に作用することができる異種または同種タン パク質またはアンチセンスＲＮＡまたはペプチドの製造に有用である。本方法は 、遺伝的構築物を含む液体複合物を動物の決定された組織内に誘導することを含 む。必要に応じ、注入された遺伝子構築物は、動物の分泌細胞により取り込まれ る効率を改良するため、多陽イオン性化合物および／または脂質で処理すること ができる。 最も費用のかかる動物の感染性疾患は乳腺の感染により起こされる乳腺炎であ る。なかんずく、本発明は乳腺炎を処置する方法に関する。特に、本発明は乳を 分泌するまたは乳を分泌しない動物の両方の乳腺内へ注入後、治療的タンパク質 へ転写されるように設計されたＤＮＡ構築物の使用に関する。 ウシ、ヤギ、ヒツジおよびブタ乳腺炎は畜産において最も費用がかかる疾患の 一つとして残っている。乳腺炎は酪農産業への著しい経済的損失であり、約７０ から８０％が乳生産の減少を起こしうる。多くの感染作因が乳腺炎の原因として 示唆されてきており、これらはウシ、ヒツジ、ヤギおよびブタの特異的存在とし て別々に処理されている。 広く採用された搾乳後乳頭消毒法による乳腺炎制御の著しい進歩にも関わらず 、多くの牛群が引き続きこの疾患にかかっている。細菌および酵母により起こさ れる乳腺炎を治療するため、種々の異なる方法が記載および使用されてきた。こ れらの方法には、動物の感染作因に対する免疫応答を刺激するための感染作因の 全部または一部のタンパク質抽出物による感染動物の全身免疫化が含まれる。一 般的にこのようにして産生された抗体は膜タンパク質、結合タンパク質または微 生物により分泌される毒素に対して作用する。それ故、これらの抗体は抗接着性 、抗毒素、中和またはオプソニン様分子として作用する（Ｎｏｒｄｈａｕｇら、 １ ９９４，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７７：１２６７＆１２７６）。それにもか かわらず、血液−乳関門は授乳の間に乳腺分泌に到達する循環ＩｇＧ抗体の非常 にわずかな部分を防止できない。 白血球、特に多形核好中球およびマクロファージによる汚染作因の血管外遊出 および食菌作用を刺激するために別の方法が実施された。乳腺内注射により投与 された刺激分子は、サイトカイン、インターロイキン−１β、インターロイキン ２、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−αである。 感染性疾患を治療するために最も広く用いられている方法は抗生物質の投与で ある。しかしながら、この方法は動物に多くの副作用を与え、特に酪農動物の場 合、処置期間中は乳を廃棄しなければならない。都合の悪いことに、現在のすべ ての方法は持続が非常に短く、およびその結果として比較的有効ではない。例え ば、抗生物質処置後でも乳腺からグラム陽性菌は完全には除去されない。 これらの理由から、乳腺のような標的組織内への遺伝子組み込みを可能にし、 遺伝的治療により汚染微生物を除去する遺伝子治療法が望まれている。加えて、 乳腺炎の遺伝子治療は他の方法のすべての副作用を除き、また挿入された遺伝子 が有効量の治療タンパク質、ペプチドまたはＲＮＡアンチセンス生成物を永続的 に誘導的にまたは構成的に合成することを可能にする。従って、本発明は現在可 能なものよりはるかに特異的かつ効果的な感染疾患処置系を可能にする。 本発明のさらなる目的、特色および利点は、現在わかっている本発明の最良の 様式を例示している下記の好適な態様の詳細な説明を考慮することにより当業者 には明らかになるであろう。 本発明は、乳腺炎の予防または処置に有用であるタンパク質またはポリペプチ ド、および乳腺において該ヌクレオチド配列の発現を可能にする少なくとも一つ の調節的制御要素をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡを提供する 。 適した調節的制御要素には転写および翻訳調節配列が含まれる。転写および翻 訳調節配列は生成物の効率的な発現に必要なＤＮＡ配列である。一般に、そのよ うな調節要素は配列の発現を制御するために作動可能なように任意のヌクレオチ ド配列に連結させることができ、全体のユニットは”発現カセット”と称される 。ゆえに、本発明はさらに上記の組換えＤＮＡを含む発現カセットも提供する。 発現カセットは典型的には、コード化ヌクレオチド配列に加えてプロモーター 領域、翻訳開始部位および翻訳終止配列を含むであろう。 唯一のエンドヌクレアーゼ制限部位もまた発現カセットの末端に含まれていて もよく、本分野では既知のように、形質転換で使用するためにＤＮＡカセットを 創り出す時にカセットを容易に挿入または除去できるようにする。 特に、本発明は標的組織内への挿入後、感染性疾患の予防または処置に有用で あるタンパク質またはポリペプチドを発現するように設計されたＤＮＡ構築物を 提供する。コード化ヌクレオチド配列または遺伝子に結合されている誘導可能な または構成的プロモーターを含むＤＮＡ構築物が適しており、それにより動物の 疾患の原因となる感染性または潜在的感染性微生物に対して作用する治療的また は予防的タンパク質を発現する。 例えば、そのようなＤＮＡ構築物は乳分泌または非乳分泌両方の動物に乳腺炎 の予防または処置のために投与できる。故に、本発明はさらに、上記のＤＮＡ構 築物で乳腺組織を形質転換することを含む、乳腺炎の予防または処置法も提供す る。 本出願者は乳腺でのタンパク質の発現が長期間に渡って可能であることおよび 乳腺炎問題に対する遺伝子治療法が実施可能であることを発見した。治療タンパ ク質またはポリペプチドをコードしている遺伝子を乳腺組織内に組み込むことは 、例えば、遺伝的治療による感染性微生物の除去を可能にするであろう。加えて 、乳腺の遺伝子治療は他の方法のすべての副作用を除き、また、挿入遺伝子がそ の治療タンパク質生成物の有効量を永続的におよび誘導的に合成することを可能 にする。遺伝子治療法は現在利用可能なものよりもより特異的かつ有効な乳腺炎 処置系であろう。 乳腺組織の形質転換は一般的にＤＮＡが物理的に宿主の腺内に置かれることを 必要とする。現在の形質転換法は裸のＤＮＡを細胞内に導入するために種々の技 術を使用しており、乳腺を形質転換するのにこれらを使用することができる。例 えば、ＤＮＡは注射器の使用により直接的に腺内へ注入できる。もしくは、乳房 皮膚切開部を通して腺内へ小さなＤＮＡ付随粒子を噴射するために高速弾道学が 使用できる。 また、ＤＮＡを含む他の実体の挿入によりＤＮＡを乳腺内へ導入できる。これ らの実体には、ミニセル、細胞（例えば、線維芽細胞、脂肪細胞、上皮細胞、筋 上皮細胞、乳癌細胞、腎臓細胞）、リポソーム（例えば、天然または合成脂質ベ ヒクル、陽イオン性リポソーム）または他の融合可能な脂質表面体が含まれる。 これらの実体は上記のＤＮＡ構築物を用いて挿入に先だってインビトロで形質転 換される。 従って、本発明はまた、上記のＤＮＡ構築物を用いて形質転換されている細胞 も提供する。そのような細胞の例としてはＭａｃ−Ｔ細胞が含まれる。この型の 遺伝的に形質転換された細胞は、乳腺内に再移植して所望のタンパク質またはポ リペプチドを産生するのに適している。 さらに、本発明は上記のＤＮＡ構築物を取り込んだリポソームも提供する。 乳腺内への裸のまたは複合体を形成したＤＮＡ構築物の導入は、乳房の皮膚切 開部を通して、または乳頭管を通して直接的に注入することにより実施できる。 より適切には、ＤＮＡ構築物は適当な担体または希釈剤と組み合わせて医薬と してまたは家畜薬として受容可能な組成物の形で投与される。適した担体は、水 、塩緩衝化塩溶液またはその他の生理学的な溶液のような液体担体である。これ らの組成物はさらに本発明の別の態様を形成している。 生成されるタンパク質またはポリペプチドは乳腺炎の予防または処置に有効で なければならない。そのようなタンパク質またはポリペプチドには、酵素のよう な粘液溶解性タンパク質、抗生物質、抗体、サイトカイン、腫瘍壊死因子ならび に感染性または潜在的感性性作因への免疫応答を誘導できるタンパク質、および 多形核好中球またはマクロファージを活性化するタンパク質が含まれる。 好適な態様において、本発明は乳腺特異性プロモーターまたは任意の汎存性ま たは誘導可能非乳腺プロモーター制御下の、溶菌タンパク質または抗体をコード しているヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ配列を提供する。 本発明は家畜（ウシ、ヤギ、ヒツジおよびブタ）の処置に特に応用可能である が、より下等な哺乳動物またはより劣等な乳産生動物（ウサギ、ラクダおよびバ イソン）にも関係しうる。本発明はまた、特にほとんどのブドウ球菌を除去する ためにヒトにおいても使用できる。図の簡単な説明 図１は本発明に従ったＤＮＡ構築物の例を図示しており；および 図２は乳腺内に陽イオン性リポソーム−ＤＮＡ複合体を注射した後のヒツジ乳 中のヒト成長因子合成の速度を図示している。発明の詳細な説明 本発明の一つの好適な態様に従うと、感染性疾患の動物遺伝子治療は、分子を 生産するように設計されたＤＮＡ配列（器官または生物体内へ再連合されるであ ろう）で標的とする組織をトランスフェクトすることからなり、これにより感染 性または潜在的感染性微生物作因に対して動物が防御される。 本発明の別の態様に従うと、哺乳動物の乳腺炎遺伝子治療は、分子を生産する ように設計されたＤＮＡ配列（乳房内へ再連合されるであろう）で乳腺をトラン スフェクトすることからなり、これにより感染性または潜在的感染性微生物作因 に対して動物が防御される。 標的とされる組織はまた、遺伝子転写および翻訳調節配列のような他のＤＮＡ 配列でも形質転換できる。転写および翻訳調節配列とは遺伝子産物の効率よい発 現に必要とされるＤＮＡ配列である。一般に、そのような調節要素は配列の発現 を制御するために作動可能なように任意の遺伝子に連結させることができ、全体 のユニットは”発現カセット”と称される。発現カセットは典型的には、コード 化ヌクレオチド配列に加えてプロモーター領域、翻訳開始部位および翻訳終止配 列を含むであろう。唯一のエンドヌクレアーゼ制限部位が発現カセットの末端に 含まれていてもよく、ＤＮＡカセットを創り出す場合、カセットを容易に挿入ま たは除去できるようにする。 遺伝子の発現は第一にはその自身のプロモーターにより指示されるが、遺伝子 産物の効率的な発現には他のＤＮＡ調節要素が必要である。プロモーター配列要 素は、転写出発部位の通常２０から３０塩基対（ｂｐ）上流にあるＴＡＴＡボッ クス共通配列（ＴＡＴＡＡＴ）を含む。ほとんどの例でＴＡＴＡボックスが正確 な転写開始に必要である。慣例により、転写出発部位を＋１と呼ぶ。５’（上流 ）方向に伸びる配列にはマイナスの数字が与えられ、３’（下流）方向に伸びる 配列にはプラスの数字が与えられる。 プロモーターは構成的かまたは誘導的である。構成的プロモーターは細胞が生 存する間、一定の割合で遺伝子の転写を制御するが、一方、誘導可能なプロモー ターの活性は特異的誘導剤の存在（または不在）により決定されるように揺動す る。誘導可能なプロモーターの調節要素は通常ＴＡＴＡボックスより転写出発部 位のさらに上流に位置している。実験の目的に理想的には、誘導可能なプロモー ターは以下の性質の各々を有するべきである：誘導剤不在下での発現基礎レベル は無いかまたは低い、誘導剤存在下での発現が高レベル、および細胞の生理機能 を変化させない誘導スキーム。すべてのプロモーターの基礎転写活性は”エンハ ンサー”配列の存在により増加できる。その機構は明らかにされていないが、あ る種の明らかにされたエンハンサー調節配列はプロモーターの近くに存在する場 合、プロモーターの転写速度を増加させることが当業者には知られている。 構成的プロモーターは、乳腺の上皮細胞において天然に活性化させるように、 組織特異的様式でその連結された遺伝子の転写を活性化できる。例えば、強力な 構成的プロモーターとは、乳腺においてカゼイン、ラクトグロブリン、ラクトフ ェリン、ラクトアルブミン、リゾチーム、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）コード 遺伝子の発現を制御しているものである。好ましくは、プロモーターは家畜、ウ シ、ヤギ、ヒツジまたはブタ種起源である。もしくは、特異的乳腺プロモーター はより小さな動物、ウサギ、齧歯動物、ネコまたはイヌ起源でもよい。細胞質β −アクチンまたはユビキチン遺伝子の発現を調節している他の構成的プロモータ ーも使用できる。 サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）またはマウ ス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ、これはさらに誘導可能である）のようなウイルスま たはレトロウイルスプロモーターもまた使用できる。 誘導可能プロモーターには、誘導剤への暴露に応答して、与えられた遺伝子に より産生される遺伝子産物の量を増加できる任意のプロモーターが含まれる。誘 導可能プロモーターは当業者にはよく知られており、防御的または治療的分子の 遺伝子の発現を誘導するために使用できる種々のものが存在している。 二つの好適な誘導可能プロモーターは熱ショックプロモーター（ＨＳＴ）およ びグルココルチコイド系である。通常７０ｋＤａの熱ショックタンパク質をコー ドしている遺伝子が随伴しているプロモーターのような、熱ショックにより調節 されるプロモーターは、温度を上げると発現を数倍増加させることができる。熱 ショックプロモーターは防御的または治療的分子の遺伝子転写を制御するための 環境的誘導可能プロモーターとして使用しうる。グルココルチコイド系もまた防 御的または治療的分子遺伝子を含む遺伝子の発現の引き金としてよく機能する。 この系は、ステロイドホルモン存在下でホルモンと複合体を形成するグルココル チコイドレセプタータンパク質（ＧＰ）から成っている。この複合体は次にグル ココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）と名付けられた短いヌクレオチド配列（２６ ｂｐ）に結合し、この結合が連結された遺伝子の発現を活性化する。グルココル チコイド系は防御的および治療的分子の発現を誘導するための手段としてＤＮＡ 形質転換構築物中に含ませることができる。構築物が挿入されたら、体組織性ス テロイドホルモンまたはグルココルチコイドが構成的に産生されているＧＲタン パク質に会合してＧＲＥ要素へ結合され、防御的または治療的分子（例えば、抗 体または酵素）の遺伝子発現を刺激する。 おそらく標的組織は、挿入遺伝子（裸の、リポソーム、細胞に囲われたまたは 被覆固形粒子）がそのタンパク質産物を所望の効果を生み出すのに十分な量で産 生するのを許容するであろう。挿入された遺伝子の産物は、それが疾患の原因と なるまたは潜在的に原因となる感染性または潜在的感染性の微生物に対して発現 される器官または生物体を治療または防御しなければならない。 動物組織の形質転換はＤＮＡが物理的に宿主動物内に置かれていることを必要 とする。現在の形質転換法は細胞内へ裸のＤＮＡを導入するために種々の技術を 利用しており、それが標的組織の形質転換に使用できる。形質転換の一つの形態 において、ＤＮＡは注射器の使用により組織内へ直接的に注射される。もしくは 、皮膚切開部を通して組織内へ小さなＤＮＡ付随粒子を噴射するための高速弾道 学が使用できる。別の形態においては、ＤＮＡを含む他の実体の挿入によっても ＤＮＡを標的組織内へ導入できる。これらの実体にはミニセル、細胞（例えば、 線維芽細胞、脂肪細胞、Ｍａｃ−Ｔ細胞、筋上皮細胞、乳癌細胞、腎臓細胞、肝 臓細胞、肺細胞、リンパ球、白血球）、リポソーム（例えば、天然または合成脂 質運搬体、陽イオン性リポソーム）または他の融合可能な脂質表面体が含まれる 。 本発明は、感染性疾患の遺伝子治療のために使用される遺伝子から中和、溶菌 またはオプソニン様分子が合成される時に関する。好ましくは、乳腺炎の場合、 粘液溶解性タンパク質（例えば、バクテリオシンおよびランチオニン）をコード している遺伝子がグラム陽性細菌（ほとんどの場合球菌）を除去するために使用 できる。遺伝子産物は免疫調節剤として働き、免疫学的応答（例えば、多形核好 中球またはマクロファージの活性化）を誘導する。本産物はシトシンまたは他の 免疫調節剤でありうる。もしくは、本遺伝子は以下の治療的ポリペプチドのイン サイチオ合成にも使用できる： １．リソスタフィンおよびムコリシンのような酵素または粘液溶解性タンパク 質； ２．抗ヘモリシン、抗ロイコシジン、抗タンパク質Ａ、抗コラーゲン、抗フィ ブロネクチン結合タンパク質、抗ラミニン、抗α−毒素および抗β−毒素抗体の ような抗体；オプソニン様抗体および細胞融合ウイルスタンパク質に対する抗体 ； ３．サイトカイン、インターロイキン、ケモカイン、成長因子； ４．インターフェロン； ５．腫瘍壊死因子；および ６．免疫付着因子または免疫毒素。 抗生物質は非常に適しているわけではないが、誘導可能なプロモーターととも に使用できる。 乳腺炎の原因となることがあり、および遺伝子治療法で除去されうる微生物は 以下のものである： ウシにおいて： ストレプトコッカス アガラクチエ、Ｓｔｒ．ウベ、Ｓｔｒ．ズーエピ デミクス 、Ｓｔｒ．ディスガラクチエ、大便連鎖球菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球 菌、大腸菌、クレブシエラ亜種類、コルネバクテリウム ピオゲネス、ウシコル ネバクテリウム、マイコバクテリウム ツベルクローシス、マイコバクテリウム 亜種類、セレウス菌、動物パスツレラ症病原菌、緑膿菌、スフェロホルス ネク ロホルス 、霊菌、マイコプラズマ亜 種類、ノルカルジア亜種類、真菌トリコソポロン亜種類、酵母カンジダ亜種、ク リプトコッカス ネオホルマンス 、サッカロミセスおよびトルロプシス亜種類。 ヒツジにおいて： パスツレラ ヘモリチカ、黄色ブドウ球菌、アクチノバシラス リグニ エレシイ 、大腸菌、Ｓｔｒ．ウベリスおよびＳｔｒ．アガラクチエおよびＣｏｒ ．シュードツベルクローシス 。 ヤギにおいて： Ｓｔｒ．アガラクチエ、Ｓｔｒ．ディスガラクチエ、Ｓｔｒ．ピロゲネ ス および黄色ブドウ球菌。 ブタにおいて： アエロゲネス菌、大腸菌、クレブシエラ亜種類、シュードモナス アエ ルギノーサ 、コアギュラーゼ陽性スタフィロコッカス類、Ｓｔｒ．アガラクチエ 、Ｓｔｒ．ディスガラクチエ、およびＳｔｒ．ウベリス。 ウマにおいて： コルネバクテリウム シュードツベルクローシス、Ｓｔｒ．ズーエピデ ミクス およびＳｔｒ．エクイ。 遺伝子治療の方法により外来動物から除去できる他の微生物体および疾患は以 下のものを起こすものである： 霊長類において： ポリオ、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、ＤＰＴ、破傷風。 イヌにおいて： イヌジステンパー、イヌアデノウイルス、イヌパルボウイルス、イヌパ ラインフルエンザ、狂犬病、レプトスピラ バクテリン。 ネコにおいて： 汎白血球減少症、ネコ鼻気管炎、ネコカリチウイルス、狂水病。 偶蹄類において： ＢＶＤ、８−ウェイＣｌｏｓ．バクテリン、５−ウェイＬｅｐｔｏ．バ クテリン、パラインフルエンザ３、プリオン、スキャター。 遺伝子治療の応用により治療または防止しうる感染性疾患の例は以下のもので ある：貧血症、関節炎、鼻気管炎、気管支炎、延髄麻痺、嚢性疾患、肝炎、総排 出腔炎、鼻感冒、腸肝炎、造血組織壊死、黄痕、角結膜炎、喉頭気管炎、粘液腫 症、足皮膚炎、多発性関節炎、膿疱性亀頭包皮炎、外陰部膣炎、漿膜炎、副鼻腔 炎、口内炎、滑膜炎、髄膜炎および気管気管支炎。 本発明は感染性微生物原因疾患に治療的および予防的活性を有する遺伝子治療 法に関する。本発明は特に、本方法の使用を可能とするＤＮＡ配列、発現ベクタ ー、ＤＮＡ担体（リポソーム、固形粒子）および細胞に関する。 本発明は同等に、問題とする遺伝子によりインビトロで遺伝的に形質転換され 、疾患の原因または潜在的原因となる微生物に対する治療的または予防的タンパ ク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡを産生させるために元々の組織内へ再 移植された細胞（例えば、Ｍａｃ−Ｔ、肺、腎臓、筋肉細胞）にも関する。 本発明は特に家畜：ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌおよびトリ、に関 するが、ウサギ、ラクダおよびバイソンのようなより外来の動物にも関わること ができる。 本発明は、以下の実施例を参考にすることにより、より容易に理解されるであ ろうが、これらは本発明の範囲を制限するためではなく、本発明の例示のために 与えられる。実施例Ｉ ヒツジ乳腺におけるプラスミドＤＮＡの長期間持続および外来発現 導入遺伝子発現を乳腺に制限するためトランスジェニック動物において乳腺プ ロモーターが使用された。ただ一つの器官を標的として外来遺伝子を導入する遺 伝子治療技術もまた示されている。出生後遺伝子治療についてのほとんどの努力 は組織内への新規遺伝子情報に依存している：標的細胞が体から取り出され、新 規遺伝子情報を運ぶウイルスベクターを感染させ、次に体内へ再移植される。い くつかの応用に対しては、インビボでの組織内への遺伝子の直接導入（ウイルス ベクターを使用して、または使用しないで）が有用であろう。出生後動物へのイ ンビボ直接的遺伝子導入は、リポソームに包まれたＤＮＡ、ウイルス外皮レセプ タータンパク質を含むプロテオリポソームに捕捉されたＤＮＡ（Ｎｉｃｏｌａｕ ら、１９８３，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８０：１０６８）、リン酸カルシウム−共沈 ＤＮＡ（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙら、１９８６，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８３：９５５ １）、およびポリリシン−糖タンパク質担体複合体に結合されたＤＮＡ（Ｗｕお よびＷｕ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１）での処 方により達成されている。リン酸カルシウム−共沈物を形成させて、または形成 させずに、肝臓内へ直接注射した後のクローン化ウイルスＤＮＡ配列のインビボ 伝染性が記載されている(Ｓｅｅｇｅｒら、２９８４，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８１ ：５８４９)。陽イオン性脂質運搬体を使用して（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８９ ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８４：７４１３）、安定性を促進する要素を含むｍＲＮＡ 配列が組織培養細胞(Ｍａｌｏｎｅら、１９８９，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８６：６ ０７７)およびゼノパス ラエビス胚(Ｍａｌｏｎｅら、１９８９，Ｆｏｃｕｓ １１：６１)で効率よく翻訳できる。ここでは、陽イオン性リポソームと複合体 形成した純粋なＤＮＡをヒツジ乳腺に直接注射すると、腺内でレポーター遺伝子 が著しく発現されることが示される。プラスミド−リポソーム混合物の製造 プラスミドｐＣＲ３（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）が哺乳動物発現ベクターとして 使用された。ＰＣＲ増幅後、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ｃＤＮＡがｐＣＲ３内 に挿入された。プラスミド−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTM（ＢＲＬ）混合物は 使用説明書（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に記載されているように調製された。簡単に記 すと、５００μｌの無菌リン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）に５０μｇのｐＣＲ３− ｈＧＨを懸濁させ、前もって５００μｌのＰＢＳで希釈した１００μｌのＬｉｐ ｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTMと混合し、室温で１時間放置した。ヒツジ乳腺内へのプラスミド−リポソーム複合体の注入 環状ｐＣＲ３−ｈＧＨ プラスミド−ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥTM混合物を ガラス製注射器内に充填した。２０番ゲージを用い、滴下直後、ＤＮＡ−リポソ ーム複合体を乳房皮膚を通して乳腺細胞組織内へ直接注入した。二匹の雌ヒツジ の右側の乳房に１ｍｌが注射された。左乳腺の乳は、陰性対照として使用された 。ヒツジ乳の分析 ヒツジは１日１回、手で搾乳され、乳は分析するまで−８０℃で保存された。 ｈＧＨの量は、乳がアッセイの正確度に影響しないことが決定された後、免疫ア ッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｐ）により測定された。乳試料の一部(１００μｌ) が分析された。結果 乳腺内へのｐＣＲ３−ｈＧＨ注射により合成されたｈＧＨは、図２に示されて いるように、乳分泌期間を通して（約６０日間）すべて検出された。ヒツジ乳中 のｈＧＨの濃度は最初の５日間は比較的高かった。その時点では３００から４０ ０ｎｇ／ｍｌ（±４３ｎｇ／ｍｌ）であった。左側（対照）乳腺からの乳中のｈ ＧＨ濃度は、二匹のヒツジにおいて実験の各々の日について１０から１５ｎｇ／ ｍｌであった。各々のヒツジに対しては乳中のｈＧＨ濃度に重要な相違は観察さ れなかった。結論 これらの結果は、プラスミドＤＮＡからの発現はヒツジの乳腺において少なく とも６０日間は持続しうることを示している。ヒツジの搾乳期間を通して乳腺中 の外来遺伝子を安定に発現させるプラスミドＤＮＡの前例のない能力は、遺伝子 治療に対して重要な意味を有している。環状プラスミドＤＮＡの安定な発現は、 外来加速、またはウイルス形質導入によるものもまた安定に維持されるべきであ ることを示唆している。実施例II 乳腺内へのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子直接導入後のヤギ乳中のｈＧＨ分 泌 乳腺細胞組織内へ遺伝子を導入する代替経路は遺伝子治療技術を拡張するもの である。この研究では、二つのギボン類人猿白血病ウイルス（ＧａＬＶ）偽型レ トロウイルスベクターを用いて、インビトロおよびインビボでのヤギ哺乳器官分 泌上皮細胞内にレポーター遺伝子を導入した。細胞および組織培養 ウシ腎臓細胞株、ＭＤＢＫおよびウシ哺乳器官上皮細胞株、Ｍａｃ−Ｔ細胞が 使用された。使用されたレトロウイルスパッケージング細胞株（ψＣｒｅ、ＰＡ ３１７およびＰＧ１３／ＬＮｃ８）はＡＴＣＣから入手した。細胞はゲンタマイ シン（５４ｍｇ／ｍｌ）および１０％ウシ胎児血清を補給したダルベッコ改良イ ーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ2／９５％空気で維持された。産生細胞株の樹立 金ビーズ１ｍｇ当たり１μｇＤＮＡでのパーティクル衝撃によりＪＲ−ｇａｌ ｎｅｏ−（Ｗａｎｇら、１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５１：２６４２） を運ぶ構築物が同種指向性パッケージング細胞株ψＣｒｅ内へトランスフェクト された。衝撃２日後、これらの細胞から上清液を除いて遠心分離し、４μｇ／ｍ ｌのポリブレンを加えた後、レトロウイルス溶液を用いて両種指向性およびＧａ ＬＶ偽型両方のパッケージング細胞株を感染させた。レトロウイルスベクター、 ＭＦＧ−ｈＧＨを運ぶプラスミドはｐＳＶ２ｎｅｏと５０：１の比で、パーティ クル衝撃によりＰＡ３１７およびＰＧ１３／ＬＮ ｃ８内へ同時にトランスフェ クトされた。ｈＧＨ遺伝子を含むレトロウイルス産生パッケージング細胞は、Ｇ ４１８耐性（４００μｇ／ｍｌ）により選択された。ウイルス産生細胞 ヤギの乳腺内への注入のため、標的細胞株から最も高いレベルでｈＧＨが産生 されるＰＧ１３／ＬＮ ｃ８クローンが選択された。各々のクローンは２００１ ００ｍｍ−プレートで３回継代した。３日間にわたる細胞上清液を集め、濃縮し 、ゲンタマイシンを含むＤＭＥＭに再懸濁した。細胞分裂の誘導およびヤギ搾乳 ２匹の２才（ヤギ１および２）および２匹の１才（ヤギ３および４）の交尾し たことのない雌ザーレン交雑種ヤギが、乳発生および続いての乳分泌を誘導する ため１４日間にわたりｉ．ｍ．により外因性ステロイドで処理された。ヤギ乳腺内へのウイルス貯蔵液注入 濃縮ＰＧ１３／ＬＮ ｃ８ ＭＦＧ−ｈＧＨウイルス貯蔵液に８０μｇ／ｍｌ の濃度でポリブレンを加え、注射器に充填した。２２番ゲージスタブアダプター を用い、ヤギ１、２および４はホルモン投与計画の３、５、７、９、１１および １３日目に右哺乳器官にレトロウイルスが注入され、ヤギ３は３、５、７、９、 １０および１３日目に注入を受けた。各々の動物に対するウイルス量は異なって おり（８から２０ｍｌの範囲）、それは乳腺の全体容量により決定された。左乳 腺は動物内対照として働き、ゲンタマイシンを含むＤＭＥＭが注入された。注入 に使用されたウイルス貯蔵液は次にいくつかの細胞株でアッセイされた。ヤギ乳の分析 ヤギは午前中、手により毎日２回搾乳され、乳は分析まで−８０℃に保たれた 。ｈＧＨ量は乳がアッセイの正確度に影響しないことが決定された後、免疫アッ セイにより測定された。乳試料の一部（５μｌ）は２回蒸留水で１：１０に希釈 され、クーマシーブルーで染色する１４％ゲルのＳＤＳ／ＰＡＧＥによっても分 析された。乳試料のタンパク質濃度はＢＣＡ（Ｐｉｅｒｃｅら、１９７７，Ａｎ ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．，８１：４７８）を用いて決定された。結果 パッケージング細胞株のベクター産生 ＰＧ１３／ＬＮ ｃ８クローン６によりパッケージングされたレトロウイルス で感染させた２日後にＭａｃ−ＴおよびＭＤＢＫ細胞から除去された培地中のｈ ＧＨ濃度は各々１９２および３．８ｎｇ／ｍｌであった。感染２８日後、これら の細胞からのｈＧＨレベルは１１９．３および４．５ｎｇ／ｍｌであり、感染４ 週間後でもプロウイルスＬＴＲが依然として機能的であったことを示している。ヤギ乳腺内へのウイルス貯蔵液の注入 ヤギ１および２に１３日目に注入されたウイルス貯蔵液はｈＧＨを２２４μｇ ／ｍｌで含むことが観察され、ＰＧ１３／ＬＮ ｃ８パッケージング細胞もまた ｈＧＨを産生していることを示している。ヤギ乳の分析 最後のウイルス注入２４時間後、すなわちホルモン投与計画の１４日目に乳分 泌が始まった。乳は乳分泌の間を通して正常であるように見えた。各々の半分の 乳房から得られた乳量はヤギ１および２では搾乳の最初の日で約１５０ｍｌであ ったが、ヤギ３では１０ｍｌのみ、およびヤギ４は３５ｍｌであった。４匹すべ てのヤギについて、各々の乳腺により産生される乳量は日毎に増加した。ｈＧＨ レベルは免疫アッセイにより決定され、各々の動物で独特のｈＧＨ分泌パターン が得られた。ヤギ１においては、ｈＧＨ濃度は乳分泌の９日目まで定常的に下降 し、その時点でのレベルは３−５ｎｇ／ｍｌであり、他のヤギでは乳分泌の第１ 日目から２日目に測定されたｈＧＨが際だって減少し、約１０日目付近で動物の ｈＧＨ産生は２−３ｎｇ／ｍｌで安定化した。ヤギ１および２では乳分泌の１５ 日目で搾乳が中止された。ヤギ３の乳中のｈＧＨレベルは乳分泌の１から２日目 に劇的に下降し、８日目から９日目で増加して１６日目まで２３ｎｇ／ｍｌでと どまり、その時点から再び減少しはじめた。ヤギ４には最初の２日の下落後、残 りの１９日の乳分泌の終わりにプロスタグランジンＥ２が注入された。加えて、 ヤギ４は２８日後でもｈＧＨを５ｎｇ／ｍｌで分泌していた。左（対照）乳腺か らの乳中のｈＧＨ濃度は４匹のヤギにおいてすべての評価時で０．０から０．６ ｎｇ／ｍｌの範囲であった。これらの数字はアッセイの検出レベルであり、レト ロウイルスに暴露していない２匹の別の乳分泌ヤギで測定された数字と相関して いる。４匹の動物におけるｈＧＨの総生産は０．３から２μｇ／日の範囲であっ た。 もしｈＧＨ遺伝子が幹細胞集団内に安定に取り込まれていたとすれば、ヤギは 乳腺が退縮した後の第２乳分泌においてもｈＧＨを分泌するであろう。第２乳分 泌は２匹のヤギで誘導され、ヤギ１はｈＧＨを産生しなかったが、ヤギ２は５日 目に右（注入された）乳腺から検出可能な量のｈＧＨを分泌し始め、続いての１ ０日間のｈＧＨ濃度は０．４から２．３ｎｇ／ｍｌまで変化した。この乳分泌の 間、左対照乳腺からの乳は常に検出不可能なレベルのｈＧＨを有していた。 採取期間を通してヤギ乳試料のＳＤＳ／ＰＡＧＥは、レトロウイルス注入右乳 腺、対照左乳腺およびレトロウイルスに暴露されていないヤギのタンパク質プロ フィールに何の一貫した相違も示さなかった。ＢＣＡにより測定されたｈＧＨを 含む乳のタンパク質濃度は対照乳と統計的に異なってはおらず、哺乳器官分泌上 皮細胞によるｈＧＨ産生は正常の細胞タンパク質の仕組みには影響していないよ うである。処理乳腺中の乳のタンパク質は乳分泌の１日目には最大の濃度では分 泌されないことが指摘されている。結論 反すう動物乳腺内へ外来遺伝子を直接導入するために遺伝子治療技術および複 製欠陥レトロウイルスベクターを応用すると、乳中の医薬品の生産時間が数年か ら数週に劇的に短縮された。発現レベルは低いが、本方法はトランスジェニック 動物の生産または評価目的のための重要なタンパク質の低レベルでの生産のため の序幕として、異なる遺伝子構築物の評価における応用を見いだすかも知れない 。実施例III マウス乳腺の黄色ブドウ球菌感染に対するリソスタフィンの効果 リソスタフィンはスタフィロコッカス シムランスにより産生されるエンドペ プチダーゼである。それはスタフィロコッカス属の仲間のペプチドグリカンのペ ンタグリシン結合を加水分解し、したがって他の原核生物に対してはほとんど活 性を有さず、真核生物には全く活性がない。リソスタフィン遺伝子はクローン化 され、大腸菌およびバシラス種での発現が成功している（Ｈｅａｔｈら、１９８ ７，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４：１２９；Ｈ ｅｉｎｒｉｃｈら、１９８７,Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ ，２０９：５６３；Ｒｅｃｓｅｉら、１９８７，ＰＮＡＳ ＵＳ Ａ ，８４：１１２７）。種々の実験条件で黄色ブドウ球菌の溶菌を促進させるた めのリソスタフィンの使用はよく知られているが、他の宿主でのクローニングお よび発現の進歩は多量の酵素を比較的安価に製造する可能性を高める。このこと は乳分泌反すう動物の経済的に重要である疾患、スタフィロコッカス乳腺炎（Ｂ ｒａｍｌｅｙら、１９９０，Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，４９：１２０）を制御 する新しい方法におけるインビボでの使用を可能にするであろう。この実験は乳 分泌マウスにおける乳腺炎モデルの使用を示しており、およびインビボでの黄色 ブドウ球菌に対するリソスタフィンの強力な抗菌活性を明瞭に示している。 リソスタフィン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．）をスキムミルク（Ｏｘｏｉｄ）に 溶解して０．１から１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度を調製した。リソスタフィン を含まない対照液も含まれている。１ｍｌ容量の対照およびリソスタフィン希釈 液を黄色ブドウ球菌Ｍ６０の１０8コロニー形成単位（ｃｆｕ）に接種した。こ の株はαおよびβ毒素両方を産生し、ウシ乳腺炎の症例から単離された。ミルク 中２から３μｇ／ｍｌを超えるリソスタフィン濃度は生存可能な黄色ブドウ球菌 を２から３ｌｏｇ10減少させ、一方、ミルク中１０μｇ／ｍｌでは黄色ブドウ球 菌を対照の平均７．９５ｌｏｇ10／ｍｌから２．０ ｌｏｇ10／ｍｌに減少させ た。この結果、１０μｇのリソスタフィン用量がインビボ使用に選択された。Ｍ Ｆ１系統のマウスを麻酔し、腹部乳腺の上部対に接種した（Ｒ４およびＬ４と称 される）。８匹の乳分泌マウスに、Ｒ４およびＬ４の両方とも１０8ｃｆｕの黄 色ブドウ球菌の０．１ｍｌ塩溶液を接種した。続いて、１時間後にＲ４に１０μ ｇのリソスタフィンを含む０．１ｍｌ塩溶液を、Ｌ４に０．１ｍｌ塩溶液を注入 した。さらに３０分後、マウスを殺して乳腺を無菌的に除去し、０．１ｍｇ／ｍ ｌのトリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．）を含む塩溶液中でホモジナイズして 活性リソスタフィンを分解した。１０倍希釈液を７％ウシ血寒天（Ｏｘｏｉｄ Ｂｌｏｏｄ Ａｇａｒ Ｂａｓｅ ナンバー２）上に置き、３７℃で一夜インキ ュベートして生存数を決定した。２０匹のマウスを用いるさらなる実験において は、１０μｇのリソスタフィンを乳腺内に注入し、続いて直後または１時間後に １０3の黄色ブドウ球菌を注入することにより、リソスタフィンの予防的使用の 模擬実験を行った。対照乳腺にはリソスタフィンの代わりに塩溶液が注入された 。２４時間後、マウスを殺して解剖した。全体的な病理学的変化が注目され、生 存黄色ブドウ球菌数は上記のように決定された。結果 前もって黄色ブドウ球菌が接種されている乳腺への１０μｇリソスタフィンの 注入は対照と比較して３０分間で９９％以上細菌回収率を減少させた。この減少 は統計的に有意であった（ｔ＝２．５６；ｐ＜０．０２）。黄色ブドウ球菌接種 直前または１時間前に１０μｇのリソスタフィンが投与された場合、２４時間後 の回収率は、塩溶液処理対照の乳腺当たり約１０9個と比較して乳腺当たり平均 約１０2個の生存黄色ブドウ球菌であった。後者の場合、対照乳腺は、マウスに おける急性スタフィロコッカス乳腺炎に特徴的な重度の病理学的変化を示してい た。対照乳腺はより黒くて赤味をおびており、もろいテクスチャーおよびいくつ かの液化および溶血領域を有していた。組織学的切片は凝固性壊死領域を有する 重度の炎症、好中球およびマクロファージの浸潤を明らかにした。多数のスタフ ィロコッカスが認識された。対照的に、リソスタフィン処理乳腺は淡黄色で弾力 があるまま残っており、乳頭の基部周辺がわずかに赤くなっているだけであった 。組織学的検査は、細胞性浸潤がわずかであるかまたは存在せず、よく保存され かつ機能している胞状構造を示し、球菌がほとんどないことを示した。結論 これらの実験はインビボでのリソスタフィンの抗スタフィロコッカス活性を明 瞭に示している。治療的および予防的効力の両方が示された。リソスタフィン遺 伝子のクローニングにより、その競合的価格での治療的使用が容易に利用可能に なるであろうし、その比較的高い特異性は食品製造動物での使用を魅力的なもの にしている。さらに、トランスジェニック技術における進歩は反すう動物の乳腺 への導入遺伝子発現の方向付けを可能にする（Ｓｉｍｏｎｓら、１９８７，Ｎａ ｔｕｒｅ ，３２８：５３０）。一般に、これはヒト医薬での使用のための薬理学 的に活性な物質の製造に応用されてきた。しかしながら、乳分泌乳腺でのリソス タフィン遺伝子の取り込みおよび発現はスタフィロコッカス乳腺炎に対する動物 の耐性を増強しうる可能性がある。実施例IV 黄色ブドウ球菌哺乳器官内感染処置におけるリソスタフィンの効力 クローン化由来リソスタフィンの黄色ブドウ球菌哺乳器官内感染に対する殺菌 効果が評価された。感染４８時間後のモルモット乳腺からリソスタフィンにより 黄色ブドウ球菌（Ｎｅｗｂｏｕｌｄ３０５）が除去された；１２５μｇのリソス タフィンで１４／１６、２５μｇで５／８、５μｇで５／１０、１μｇで０／１ および０μｇで０／３。非処置モルモット中、攻撃後４８時間では黄色ブドウ球 菌で感染した乳腺が残っていたが、しかしながら、処置モルモットの３／２５の 対照乳腺では隣接した乳腺の処置に応答して菌が取り除かれていた。 モルモットの体細胞／ｍｌは、感染前乳腺の１０4個から黄色ブドウ球菌接種 後は３ｘ１０6個以上の細胞数に転じていた。リソスタフィンによる処置は処置 された乳腺中の好中球移動を１０8を超えるレベルまで起こし、隣接する非処置 乳腺での増加を伴うが、急激に処置前レベルまで下降した。対照乳腺での最も大 きな応答は１２５μｇを受けた動物で観察され、２／２５の対照乳腺で黄色ブド ウ球菌排除が起こった。 乳牛における哺乳器官内処置への白血球応答は上記のモルモットモデルと類似 している。処置後の搾乳時での黄色ブドウ球菌感染乳腺において、体細胞レベル は１０倍増加していた。続いての搾乳においては細胞レベルは処置前レベルに戻 っていたかまたはそれ以下であった。白血球単独の上昇では感染の除去を説明で きなかった。実施例Ｖ 乳腺炎治療薬としての組換え細菌性酵素リソスタフィンの使用 組換え粘液溶解性タンパク質、リソスタフィンが乳牛における黄色ブドウ球菌 乳腺炎に対する潜在的哺乳器官内治療薬として評価された。スタフィロコッカス シムランス の産物であるリソスタフィンは酵素的に黄色ブドウ球菌の細胞壁を分 解し、殺菌性である。 第１乳分泌にある３０頭のホルスタイン−フリーシアン乳牛を、黄色ブドウ球 菌（Ｎｅｗｂｏｕｌｄ３０５，ＡＴＣＣ２９７４０）ですべての乳房に感染させ た。感染が確立され、続いての処置前の３週間、体細胞数および黄色ブドウ球菌 コロニー形成単位がモニターされた。感染動物は、乳頭管を通して単一量の組換 えリソスタフィン（ｒＬＹＳ）（用量１から５００ｍｇ）を注入するか、または ３回の連続的ｐ．ｍ．搾乳後６０ｍｌの無菌リン酸緩衝液に溶解した１００ｍｇ のｒＬＹＳを注入した。最後の処置後、総計２８回の搾乳で黄色ブドウ球菌が乳 に残っていなければ動物は治癒したと考えられた。結果 免疫学的に活性なｒＬＹＳの速度論的分析は、最少殺菌濃度が３７℃で７２時 間まで乳中に維持されていたことを示した。対照的に、ペニシリンＧは同一のイ ンキュベーション時間ではその静菌活性の１０％未満しか保持していなかった。ウシ乳腺におけるｒＬＹＳの用量滴定および速度論 長期間治癒を引き出す至適有効用量を決定するため、０、１、１０、１００ま たは５００ｍｇ濃度のｒＬＹＳ単一量が投与される滴定が実施された。非処置乳 房および１ｍｇ処置はすべての乳房の黄色ブドウ球菌の除去に失敗した。１０、 １００および５００ｍｇ用量は少なくとも１回の搾乳に対し乳の黄色ブドウ球菌 を一時的に除去した。再発乳房において、黄色ブドウ球菌が除去されたままの乳 の時間の長さは投与した用量に大体比例していた。処置１４日後、二つの乳房が １００ｍｇ用量で、一つが５００ｍｇ用量で治癒された。ｒＬＹＳは最少殺菌濃 度（ＭＢＣ）を約２４時間維持し、実験的感染は２から４日のサイクルで行われ たので、３回の連続した搾乳にわたる、１００ｍｇのｒＬＹＳの多数回注入が、 最少有効濃度を３から５日維持し、治癒を引き出すためには最適であることが決 定された。結論 黄色ブドウ球菌はウシ乳腺炎の第一の病因的作因の一つであり、酪農産業の経 済的損失の主たる原因である。乳分泌乳牛のための効果的な乳腺炎治療は要求が 満たされない主なものとして残っている。現在の治療は中程度に有効であるだけ であり、乳廃棄および感染動物の選り抜きのために高価であるため、乾燥期間の みの処置が採用されたウシ群取扱実施の選択であった。慢性的かつ準臨床的であ る乳分泌動物の大多数の感染にどの方法も対処していない。黄色ブドウ球菌に対 して殺菌活性を有するｒＬＹＳのような組換えタンパク質は獣医師にとって非常 に有用な治療剤であろう。もしｒＬＹＳが抗生物質のように効果があれば、ｒＬ ＹＳの乳における天然のタンパク質分解および不活性化、ならびに消費者による 消化の間の不活性化は、乳中の残余に付随する心配を最小にする可能性がある。 インビボ用量滴定はｒＬＹＳの最少有効治療用量は１００ｍｇであることを示 唆した。しかしながら治療的には、１から３回の連続する搾乳に対して処置乳腺 の乳内の最少殺菌活性を維持するためにはｒＬＹＳの多数回の注入を行うことが 望ましいであろう。ｒＬＹＳのインビボ殺菌活性は、最後の哺乳器官内注入後、 最少限１回の搾乳に対して９５％の乳房から検出可能な黄色ブドウ球菌の乳を取 り除いたという事実により最も効果的に示された。実施例VI ヒツジ乳腺におけるジェット注射されたプラスミドＤＮＡの発現 ジェット注射に基づくＤＮＡ送達系がインビボにおける乳分泌乳腺を過渡的に トランスフェクトする手段としておよびＤＮＡワクチン接種のための技術として 評価された。モデル発現プラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子 １プロモーター／エンハンサー領域（ＣＭＶ）により推進されるヒト成長ホルモ ン（ｈＧＨ）を含む。ヒツジの乳分泌乳腺内へジェット注射された裸のプラスミ ドＤＮＡからの発現は、インビボトランスフェクションされて４８時間後に組織 が得られた場合、ノーザンブロット分析により検出するには十分である。結論と して、インビボで乳分泌哺乳器官組織を過渡的にトランスフェクトする能力は、 インビボ培養技術で遭遇する困難を回避し、哺乳器官調節要素を試験しかつトラ ンスジェニック動物バイオリアクターの製造のために設計された融合遺伝子構築 物を試験する方法を提供する。実施例VII リソスタフィンを発現している真核生物系における黄色ブドウ球菌の除去 リソスタフィン遺伝子をインビトロで維持された２９３細胞（ヒト胎児腎臓細 胞）内に導入した。組換えバクテリオシン（リソスタフィン）が培養培地に分泌 され、挑戦期間中混入した黄色ブドウ球菌を殺すことが観察された。 リソスタフィン遺伝子はスタフィロコッカス シムランス次亜種スタフィロリ チカス （ＮＲＲＬ Ｂ−２６２８）の抽出ＤＮＡからＰＣＲ増幅により得られ、 黄色ブドウ球菌株Ｎｅｗｂｏｕｌｄ（ＡＴＣＣ）がトランスフェクトされた真核 生物細胞での挑戦に使用された。スタフィロコッカス株は脳心臓滲出液（ＢＨＩ ）培地で増殖させた。リソスタフィン遺伝子の精製 スタフィロコッカス シムランス次亜種スタフィロリチカスを撹拌インキュベ ーター中、３７℃で一夜培養した。培地を遠心分離し、ペレットは５０ｍｇのリ ソスタフィン（Ｓｉｇｍａ）ｍｌ-1を含む５ｍｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ−５０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）に再懸濁し、懸濁液は３７℃で２時間インキュ ベートした。精製細菌ＤＮＡはＰＣＲ法により直接増幅してリソスタフィン遺伝 子を単離した。使用されたオリゴヌクレオチドプライマーの組は以下のものであ る：5'-TTAAGGTTGAAGAAAACAATT-3'（配列ＩＤ番号：１）および5'-GCGCTCACTTTA TAGTTCCCCAA-3'（配列ＩＤ番号：２）。増幅はＴｈｅｒｍａｌ ＤＮＡサイクラ ーおよび２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、６０℃でのアニーリング工程が３０秒、７２℃での伸長 が９０秒および９３℃での変性が１０秒の３０サイクルプログラムを使用して実 施された。ＰＣＲ生成物は完全リソスタフィン配列から構成されており、アミノ 末端プレーおよびプロー領域を有するコード遺伝子を含む。制限エンドヌクレア ーゼ分解、連結反応、フェノール−クロロホルム混合物での洗浄、エタノール沈 澱、形質転換および大腸菌株ＤＨ５ａでの構築物のクローニングを含むすべての 他の組換えＤＮＡ法は標準法により実施された。すべての酵素はＢｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍからのものであった。 リソスタフィンはヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子１プロモーター／エ ンハンサー領域（ＣＭＶ）およびヒトインターロイキン−２シグナルペプチドを 含む真核生物発現ベクターに連結された。細胞培養およびＤＮＡトランスフェクション サルウイルス４０の複製開始点−欠損突然変異体により形質転換されたヒト胎 児腎臓細胞である２９３細胞は、１０％（容量／容量）ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃ ｏ ＢＲＬ）およびグルタミン（１．４ｍＭ）を補給したダルベッコ改良イーグ ル培地（Ｓｉｇｍａ）で培養した。細胞は３０ｍｍウェル内へウェル当たり５０ ０，０００の細胞数で播種し、２ｍｌの培地中、３７℃で２４時間増殖（５％Ｃ Ｏ2を含む空気雰囲気中）させて、以下の修正を行ったカルシウム沈澱法により 細胞内へ５０％から６０％導入された。７．５μｇのＤＮＡを含む沈澱に２ｍｌ の培養培地を加えた。２４時間後、培地をウェル当たり２ｍｌの培地に置き換え 、トランスフェクション後２４時間毎に培地試料を採取して、ウェスタンブロッ ト分析およびＥＬＩＳＡによりリソスタフィンの産生を評価した。生物学的に活性なリソスタフィンのアッセイ トランスフェクトされた２９３細胞を含むウェルを１０2または１０3個の黄色 ブドウ球菌Ｎｅｗｂｏｕｌｄで感染させた。感染培地の１００μｌの試料はヒツ ジ血寒天上に広げた。３７℃で２４時間インキュベートした後、コロニー形成単 位（ＣＦＵ）数を評価して、細菌増殖に対する組換えリソスタフィンの阻害効果 を評価した。結果 トランスフェクトされた真核生物細胞による組換えリソスタフィンの産生 修飾されたリソスタフィン遺伝子が組織培養細胞内へトランスフェクトされ、 酵素の発現、プロセシングおよび感染細菌に対する活性が示された。培養培地を 分析すると、約２５ｋＤａのバンドが生成した；このバンドは成熟リソスタフィ ンの大きさに類似していた。同様の結果が、組換えリソスタフィンの発現が真核 生物細胞で実施された別の実験で観察された。ＥＬＩＳＡアッセイは組換えリソ スタフィンがクローンに依存して１００から２５０ｎｇ／ｍｌ／２４ｈの濃度で 産生されていることを明らかにした。哺乳動物細胞により分泌されたリソスタフィンの活性 トランスフェクトされた哺乳動物細胞により分泌された組換えリソスタフィン の活性は、培養培地中の感染性黄色ブドウ球菌の増殖を減少またはいくつかの複 製体では阻害する効率により観察された。非トランスフェクト細胞から採取した 培地試料はウェル中に存在する細菌の発育に対して阻害効果を示さなかった。寒 天プレートは一夜のインキュベーションで完全にコンフルエントになった。対照 的に、１０3個の初期量の細菌がトランスフェクトされた真核生物細胞の存在下 で培養された場合、ＣＦＵはプレート上でほとんど計数されなかった。１０3個 の細菌が使用された場合、１００未満のＣＦＵが我々のアッセイで観察されたが 、トランスフェクトされた細胞を含むウェルに１０2個の細菌が加えられた場合 のゲル上のＣＦＵの存在は観察していない。 本発明がその特定の実施態様に関連して説明されてきたが、さらなる修正が可 能であり、本出願は本発明の原理に一般に従った本発明の任意の変形、使用また は改作を包含することを意図しており、および本発明が関係する分野内の既知の または通例の実施に入るような、および本明細書で前に示した本質的特色へ応用 されるような、および付随する請求の範囲の範囲内に従うような本開示からのそ のような離脱を含むことが理解されるであろう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                               Animal gene therapyBackground of the Invention Technical field   The present invention finds use in therapy for the treatment of infectious diseases such as mastitis, especially gene therapy DNA cassettes, expression cassettes and DNA constructs. This construct Pharmaceutical and veterinary therapeutic composition comprising the same, and host transformed with DNA Cells suitable for implantation into a mammal are also included.Background art   At the highest level, transgenic animals transmit disease in animals It is the main way to give possible tolerance. First successful gene transfer into mice Just a few years later, new technology was used in farm animals. Some genetic processing Have been targeted for the application of transgenic development in livestock. Is an important aspect of improving animal health and disease resistance through gene transfer . Disease resistance and treatment achieved by recently developed techniques in molecular biology Temporary and stable genetic improvement leading to Can contribute.   Resistance to infection in animals is elicited at various levels. Composition and phagocytosis Structure (innate immunity) serves as the first line of defense. If these are not valid, The stained organism can respond by specific (acquired) immunity. Therefore, the remains Modulates nonspecific and specific host defense mechanisms for candidates for gene therapy applications All known genes, ie cytokines, major histocompatibility complex Body (MHC) protein, T-cell receptor (TCR) and specific disease resistance And proteins that provide Increased protection against pathogens is due to "intracellular immunity ”, Genetic immunization, antisense sequences as antipathogenic drugs and disease susceptibility It can also be provided by other means, such as disruption of the gene.Gene-regulated immune response   Cytokines regulate the immune response through their role as soluble mediators of cellular communication They are integrated in harmony. Gives leukocyte viability, proliferation, differentiation and return first But they can also regulate the production of functions or each other. Was observed. In addition, cytokines interact with cells other than leukocytes and They are also produced by these cells and provide a means of communication between the immune system and other tissues and organs. ing. Cytokines include growth factors, interleukins, chemokines, colonies Rapidly increasing numbers of regulatory markers, including stimulators and interferons Means peptide factor. Their functions depend on cell surface receptors on their target cells. It is mediated by binding to puter. Cytokines are responsible for infectious diseases and tumor development It was shown to directly contribute to the development of the disease condition during the period. Different cytokines It has been reported to positively and negatively affect host defense mechanisms.   Interferon (IFN) is a group of well-characterized cytokines Elicits antiviral and antiproliferative activities, as well as cell proliferation, differentiation and immunity Regulating response. IFN as well as well-characterized antiviral activity Is a means to antagonize non-viral pathogens by affecting macrophage activation But also. Antiviral and bactericidal action of interferon and its inhibitory activity mechanism There are many proteins known to be included in the composition. Against virus infection The ability of IFN to positively affect host susceptibility is Tested on spore strains. Transgenic overexpressing IFN-β gene construct It has been shown that the germ organisms exhibit increased viral resistance.   Signal transduction pathways activated by IFN and various other cytokines; Recent advances in understanding transcription factors include gene transfer treatments aimed at improving the immune response Promises to open new treatments and new war bribes; that is, Encodes a cytokine that is itself a distinct "cytokine-specific" signal-forming component Gene transfer. Also called interferon regulatory factor (IRF-1) transgene Constitutive expression of interferon-stimulated gene factor (ISGF2) IFN-inducible activation of IFN-inducible genes in It has been reported to result in increased resistance.Specific disease resistance gene   Other improvements that can be brought to animals by local gene transfer include specific disease resistance. Sex. A specific disease resistance gene that has been well studied is the M strain of certain mouse strains. xl gene product. Mouse Mxl protein is expressed in IFN-treated vertebrate cells. It belongs to a family of polypeptides that are synthesized and have GTPase activity. Some Mx proteins are found in certain negative-strand RNA viruses (eg, Inhibiting the growth of Ruenza virus, VSV, Rhabdovirus and Togoto virus) It has been shown to harm. In various cell lines and transgenic mice Mouse Mxl protein synthesis was sensitive to influenza A virus Necessary and sufficient to promote viral resistance in cells and animals showed that. The cloning and functional characterization of this specific disease resistance gene was xl transgenic pigs show reduced susceptibility to influenza infection Enabled a gene transfer program to study if   Mycobacteria,SalmonellaandLeusmaniaAntigenically correlated like The natural resistance of certain inbred mouse strains to uninfected microbial infections isBcg ,LshOrItyControlled by a dominant locus on chromosome 1, referred to as Have been. The locus controls these infections during the nonspecific macrophage-dependent phase of infection. Affects the host's ability to limit the growth of sexual pathogens. Positional cloning method ByNrampCalledBcgGene candidates were isolated. Transgene generation Or susceptibility to Salmonella infection by gene therapy (in vivo or ex vivo) Sex reductions are valuable for animal, especially poultry production. Salmo in chicken inbred lines Large differences in resistance to Nera have been observed. Furthermore, mycos in humans Natural resistance or susceptibility to infection by brucella in bacteria and cattle Fertility has been shown to be in gene regulation similar to that observed in inbred mice. AndBcgIs governed byBrucella  AboltusCattle chronic Infection causes spontaneous abortions of calf fetuses and increases the economic well-being of the dairy and beef industry. Threatening.   Genetic resistance to certain retroviruses has been found in some experimental animal species. Has been observed as a polymorphic trait. One of the loci identified in mice,Fv− 4 ispolComplete from the end of the geneenvMouse leukemia extending through genes Similar to the 3 'half of the disease virus. Encoding only the viral coat protein ToFv-4 expression in transgenic mice is Conferred resistance to Lus infection.FvThe mechanism of -4 resistance is a phenomenon of viral interference, , Competition between synthesized coat protein and exogenous virus for viral receptor It is believed to be involved in the case. Similar mechanism known as "intracellular immunization" Have been used in antiviral strategies.   Expression of a transgene encoding an immunoglobulin specific for a common pathogen It can provide immunity to the pathogen. As shown in many studies In addition, the cloned gene encoding the monoclonal antibody was genetically engineered. It can be expressed in large amounts in mice. These mice are Produce antibodies to specific antigens without touch or immunization.Intracellular immunization   The concept of "intracellular immunization" is a virus that can strongly interfere with wild-type virus replication. Essentially overexpresses an abnormal form of a protein (a dominant negative mutant) in the host Included. Sophisticated research on cultured cells that acquire resistance to various viruses Prevention of virus attachment to target cells and prevention of virus-host transcription complex formation Harm, expression of dominant negative viral transactivator or infectious virus particle set Includes methods such as standing obstruction.   The exogenous mouse mammary tumor virus (MMTV) provirus is a long terminal version of MMTV. Loci and residues referred to as self-superantigens identical to the protein encoded in the reverse sequence It has been observed that the gene is co-separated. High level expression of this self-superantigen Genetically engineered mice lack a specific population of T cells that are targets for infection Showed protection from viral infection.   "Intracellular immunization" is defined as expression of specific resistance genes, antisense RNA or Or antiviral strategies described in different associations like other antiviral components It is also applied to   Recently, an "intracellular immunization" method performed in farm animals was reported. Tiger A transgenic sheep was created and released the visnavirus coat (env) gene. Was shown to be present. Visnaviruses cause sheep encephalitis, pneumonia and arthritis Belongs to the subfamily of sheep retroviruses that cause env sugar tampa The protein is involved in binding the virus to host cells. Visna in infected sheep The target cells for virus replication are macrophages. On the cell surface of visna infected cells Expression of the env protein induces an immune response to the virus. Transge In the enzymatic sheep,envVisna U3 enhancer domain fused to gene Expression of the region-constituting gene construct had no apparent adverse effects. Therefore, the remains Genetically manipulated sheep strains can be used to prevent infection and / or Retroviral env glycoprotein for modulating disease in its natural host following a strike It provides evidence of possible protein.Antisense RNA   Use of antisense RNA to inhibit RNA function in cells or whole organisms Has provided a valuable molecular biological method. Antisense RNA is a complementary sequence Bind in a highly specific manner, thereby processing and / or translating It works by inhibiting the ability of the binding RNA to be performed. The antisense sequence In the treatment of microbial infections, cancer, autoimmune diseases and other dysfunctions, It is considered an attractive alternative to drugs. Gene transfer by antisense constructs Experiments have been performed on mice and rabbits. Moloney mouse leukemia virus Expression of antisense RNA targeting retroviral packaging sequence Genetically modified mice do not develop leukemia even after challenge with infectious virus . A tiger expressing an antisense construct complementary to adenovirus h5 RNA Transgenic rabbits were produced. Primary cells from these rabbits were 90-98% more resistant to adenovirus infection than cells from animals Was observed.   The use of antisense RNA as an antiparasitic agent can be developed and RNA-RN Not only give rise to A hybrids, but also reduce phosphodiester bonds in the target RNA strand. Catalytically cut. Four structural motifs (first identified in plant RNA pathogens) Hammerhead and hairpin motifs, found in human hepatitis delta virus Delta motif and poorly characterizedNews Polarfrom Motifs) have been described as intermediates in these self-cleaving reactions. This Antisense sequence adjacent to the hammerhead motif of the ribozyme family This showed cleavage of the specific target RNA. Ribozymes cut themselves Many substrate molecules can be treated with catalytic RNA because they are not consumed during the cleavage reaction. You. The retrovirus bovine leukemia virus (BLV) is transmitted to cattle and sheep. Cause persistent lymphocytosis and B-lymphocyte lymphoma. B Hammerhead ribonucleotide flanked by antisense sequences to regulatory proteins of LV Zyme has been shown to inhibit BLV expression in permanently infected cells. This Localization (in vivo or ex vivo) that may be resistant to BLV-induced disease Or show the potential to create a generalized (transgenic animal) gene therapy I have.Somatic cell gene transfer method   Somatic gene transfer into farm animals will become increasingly important. Ex vivo And more recently in vivo gene therapy has become a genetic disorder in some humans Applied. Normally, adenosine deaminase, LDL receptor, glucosel Brosidase, blood coagulation factor VIII, phenylalanine hydroxylase, dyst For more than 10 human genetic disorders, such as defective genes encoding Current treatments are being developed for this. The efficacy of gene therapy is no longer proven It should not be.   Novel method of gene transfer into somatic cells promises to be very effective . These include viral vectors for gene construct delivery, and tissue or Like microbombarding or injecting DNA particles or solutions into blood vessels Non-viral technology is included. Most efforts are primarily in the potential of treating human diseases However, some applications of somatic cell gene transfer are for veterinary medicine. And very valuable. It is direct "genetic immunization" and another method of immunomodulation Enable. "Genetic immunization" (ie, the DNA construct encoding the immunogen) There are at least two powerful uses for architectural applications. One is protein The elimination of the production step simplifies the process and allows the production of antibodies to specific proteins. Reduce the time needed for life. Encoding neutralizing or bactericidal antibodies directly The transfer of a given gene into an organism could be faster. The second is the proper remains Infection by producing a foreign antisense encoded by a gene construct To Genetic vaccination of animals.   Somatic gene transfer methods are currently lethal and absolutely Proteins that are of the opposite sex and do not have any affinity or effect on animals Release into organs or organisms can both treat and protect infectious diseases. Can be applied by   Two such proteins or peptides with high and specific antibacterial activity Can be divided into families. One contains bacteriocin and the other is run Contains thionine (also called lunch biotics). Animals, especially farm animals The application of biotechnology to the treatment of And open a new path of control. Bacteriocins are enzymes and other bactericidal tans. Consists of Parkin. They act as catalysts and are very specific to a single chemical reaction. You. Bacteriocin rapidly kills target organisms by lysing cell walls, The object does not need to divide. They are more natural by bacteria as a means of population control It is produced in. These proteins are larger molecules than antibiotics. It is expected to last longer for the organ placed. Well-known bacteriocin One is lysostaphin, which isStaphylococcus  SimransHypospeciesStaphyloliticus Produced by Unlike antibiotics, bacteriocins Fast action reduces the likelihood that resistance will be induced in target and non-target organisms. An example For example, current studies conducted to date indicate that the bacteria used to treat mastitis were Osin appears to be non-toxic to other organisms.   Lunch biotics have high antibacterial activity against some pathogenic bacteria It is a peptide-derived antibiotic. The ribosome origin of lunch biotics has a structure geneepiA (Epidermin,Staphylococcus  EpidelmisProduced by (Due to the launch biotics used). Lunchba The general structure of the iotics gene is the same for all previously described lunch biotechnologies. Are the same. Primary transcript of linear launch biotics is N-terminal leader -A pre-peptide consisting of a sequence followed by a C-terminal propeptide, Since then, the lunch biotics have matured and are characteristic tandems with proline at position -2. There is a proteolytic processing site. SeveralLactococcus  Easy Chiss Nisin produced by the strain is a major member of the lanthionine group.   Other bacteriocins and lanthionines include ambicine, defensin, Cecropin, thionine, melittin, magainin, atasin, dipheterin, sapo Nin, cacurtin, zenopin, subtilin, epidermin, pep5, lactis 481, anchobenin, duramycin, gallidermin, cinnamycin, There are nandropine and mast paran.   Secreted by the transgene, a genetic construct used in gene therapy applications Another group of molecular complexes that can be cut off are immunoadhesins. The therapeutic potential of antibodies has long been recognized Has been getting better. Human antibodies should be minimally immunogenic in patients; That is, they should be safe for chronic or repeated use. But However, it will be difficult to generate useful human antibodies for several reasons: It is ethically impossible to immunize humans for experimental purposes and therefore available humans Antibodies have been limited to inadvertent immunizations or vaccinations. Furthermore, immortalization of human cell lines is technically difficult. Probably the least accessible technology The problem is that many applications require antibodies to human antigens; Human antibodies with specificity.   There are several possible ways to avoid these problems. One Manipulates the desired specificity of binding into the human antibody variable (V) region. It is. This may be due to in vitro recombination from mouse antibodies or in combination with selection. (Eg, combinatorial libraries and phage display technology) It can be performed by inducing a sex determining region. Another method is cell surface Binding sites derived from human proteins such as butter or cell adhesion molecules Creating antibody-like molecules by combining body constant domains. This method is often advantageous. Such molecules are known as immunoadhesins You.   Immunoadhesins can have many of the desired chemical and biological properties of antibodies it can. Examples of immunoadhesins that can bind to Fc receptors include antibody-dependent cytotoxins It mediates sex and demonstrates active transport through the primate placenta. Immunoadhesin is appropriate Since it is constructed from a receptor sequence linked to a unique hinge and Fc sequence, The binding specificity in question can be achieved using fully human components. Another possible Potential foreign sequences are present in the junction region.   One well-studied immunoadhesin is CD4-IgG, which is It has been observed in tests to be completely non-immunogenic. For clinical use The second candidate is tumor necrosis factor receptor immunoadhesin (THFR-IgG); The soluble receptor itself is naturally found in the body, and potential treatment This molecule is of particular interest because it has been considered an agent. Soluble receptor Are effective as clinical candidates, but IgG fusions have longer half-lives and improved Further advantages such as better binding activity and affinity are provided. Binding to Fc part of IgG Some receptors or immunity-inducing agents that have been T cell receptor, CD4, 1-selectin, CD44, CD28, B7, CTLA-4, CD22; TNF receptor, NP receptor , IgE receptor, INF-γ receptor. These immunoadhesins recognize antigen , Receptor for HIV, lymphocyte adhesion, hiuronidase receptor, B and T phosphorus Papillary interactions, inflammation, septic shock, homeostasis and allergy Should be useful.   In animals, the advent of molecular biology techniques can have two specific activities To create immune adhesins. For example, Staphylococcus aureus contamination For the purpose of removal, humans with strong affinity for protein A on bacterial surfaces An immunoassay consisting of a lytic enzyme, such as lysostaphin, bound to the Fc portion of IgG. It is possible to have an epidote. Once Fc is a protein on Staphylococcus aureus Once bound to quality A, the lytic moiety (lysostaphin) can lyse the bacteria. Wear.   Gene therapy treatments involve the gene contained in the transfected construct Terleukins, chemokines, interferons, leukotrienes and certain It can be applied in such a way as to encode an immunomodulator such as a growth factor. Explained first As such, immunomodulators can make animals more resistant to some microorganisms.Summary of the Invention   The present invention relates to gene therapy for animals. Animal gene therapy is a disease-causing Therapeutic or prophylactic proteins acting against infectious or potentially infectious microorganisms Linked to the gene encoding the protein or antisense RNA or peptide. Means by a DNA construct containing an isolated inducible or constitutive promoter. ing. Therapeutic or prophylactic against infectious microorganisms in animals, directly or indirectly A protein or antisense RNA or peptide that has a potent effect A method is disclosed. The present invention is tethered to a particular tissue or organ. Xenogeneic or allogeneic tan that can act on microorganisms that are infecting animals Useful for the production of protein or antisense RNA or peptide. This method Involves inducing a liquid complex containing the genetic construct into the determined tissue of the animal. No. If necessary, the injected genetic construct is taken up by the animal's secretory cells. Treatment with polycationic compounds and / or lipids to improve efficiency Can be.   The most expensive animal infectious disease is mastitis caused by infection of the mammary gland. You. In particular, the invention relates to a method of treating mastitis. In particular, the present invention After injection into the mammary gland of both secreting and non-lactating animals, the therapeutic protein The use of DNA constructs designed to be transcribed into   Bovine, goat, sheep and porcine mastitis is one of the most costly diseases in animal husbandry. One remains. Mastitis is a significant economic loss to the dairy industry, with about 70 To 80% can result in reduced milk production. Many causes of infection as causes of mastitis These have been suggested as being specific for cattle, sheep, goats and pigs. Are treated separately.   Despite significant advances in mastitis control with widely adopted post-milking nipple disinfection methods Many herds continue to suffer from the disease. Caused by bacteria and yeast A variety of different methods have been described and used to treat mastitis. This These methods include the use of infection agents to stimulate the animal's immune response to the infection agent. Systemic immunization of infected animals with all or part of the protein extract is included. one In general, antibodies produced in this way are membrane proteins, binding proteins or microproteins. Acts on toxins secreted by organisms. Therefore, these antibodies are anti-adhesive Acts as an antitoxin, neutralizing or opsonin-like molecule (Nordhaug et al., 1 994J. Dairy Sci. , 77: 1267 & 1276). Or maybe Nevertheless, the blood-milk barrier is critical for circulating IgG antibodies to reach mammary secretions during lactation. Can not prevent a small part.   Extravasation of contaminants by leukocytes, especially polymorphonuclear neutrophils and macrophages And other methods have been implemented to stimulate phagocytosis. Administered by intramammary injection Stimulating molecules include cytokine, interleukin-1β, interleukin 2, interferon-γ, tumor necrosis factor-α.   The most widely used method of treating infectious diseases is with antibiotics is there. However, this method has many side effects on animals, especially in dairy animals. If so, the milk must be discarded during the procedure. Unfortunately, all of the current All methods have very short duration and are consequently relatively ineffective. example Thus, gram-positive bacteria are not completely eliminated from the mammary gland even after antibiotic treatment.   For these reasons, it allows for gene integration into target tissues such as the mammary gland, There is a need for a gene therapy method that removes contaminating microorganisms by genetic therapy. in addition, Mastitis gene therapy removes all side effects of other methods and also Provides effective amount of therapeutic protein, peptide or RNA antisense product permanently Inductively or constitutively. Therefore, the present invention is currently It allows for a much more specific and effective treatment system for infectious diseases than is possible.   Further objects, features and advantages of the present invention are Those skilled in the art will appreciate, in light of the following detailed description of the preferred embodiments which illustrate the mode. Will be clear to you.   The present invention relates to proteins or polypeptides useful for the prevention or treatment of mastitis. And at least one that allows expression of the nucleotide sequence in the mammary gland Recombinant DNA comprising a nucleotide sequence encoding a regulatory control element of .   Suitable regulatory control elements include transcriptional and translational regulatory sequences. Transcription and translation A regulatory sequence is a DNA sequence required for efficient expression of a product. In general, Such a regulatory element may be any nucleoside operable to control the expression of the sequence. And the entire unit is referred to as an "expression cassette" . Therefore, the present invention further provides an expression cassette comprising the above-mentioned recombinant DNA.   Expression cassettes typically contain a promoter in addition to the coding nucleotide sequence. Region, a translation start site and a translation termination sequence.   A unique endonuclease restriction site is also included at the end of the expression cassette. Alternatively, as is known in the art, the DNA cassette may be used for transformation. Enables easy insertion or removal of the cassette when creating.   In particular, the present invention is useful for preventing or treating infectious diseases after insertion into a target tissue. DNA constructs designed to express a protein or polypeptide provide. Inducible linked to a coding nucleotide sequence or gene Alternatively, a DNA construct containing a constitutive promoter is suitable, and Therapeutic or therapeutic action against infectious or potentially infectious microorganisms that cause disease Expresses a prophylactic protein.   For example, such DNA constructs can be used in both lactating or non-lactating animals in mastitis. For the prevention or treatment of Therefore, the present invention further provides the above-described DNA structure. Also provided is a method of preventing or treating mastitis, including transforming mammary tissue with a building. You.   Applicant has determined that expression of the protein in the mammary gland is possible over time and Gene therapy for mastitis problems has been found to be feasible. Therapeutic tampa Incorporating a gene encoding a protein or polypeptide into mammary tissue For example, it would allow the removal of infectious microorganisms by genetic therapy. in addition Gene therapy of the mammary gland eliminates all the side effects of other methods, and Permanent and inducible synthesis of effective amounts of therapeutic protein products To Gene therapy is more specific and effective mastitis than currently available Would be a treatment system.   Transformation of mammary tissue generally requires that the DNA be physically located in the host gland. I need. Current transformation methods use various techniques to introduce naked DNA into cells. Surgery and these can be used to transform the mammary gland. An example For example, DNA can be injected directly into the gland by use of a syringe. Or breast High-speed ballistics to eject small DNA-associated particles through the skin incision and into the gland Can be used.   DNA can also be introduced into the mammary gland by insertion of another entity containing DNA. this These entities include minicells, cells (eg, fibroblasts, adipocytes, epithelial cells, muscle cells). Epithelial cells, breast cancer cells, kidney cells), liposomes (eg, natural or synthetic lipid Vehicle, cationic liposomes) or other fusible lipid surface. These entities have been transformed in vitro prior to insertion with the DNA constructs described above. Is replaced.   Accordingly, the present invention also relates to a cell transformed with the above DNA construct. Also provide. Examples of such cells include Mac-T cells. Of this type Genetically transformed cells can be reimplanted into the mammary gland and Suitable for producing repeptides.   Furthermore, the present invention provides a liposome incorporating the above DNA construct.   The introduction of naked or complexed DNA constructs into the mammary gland is It can be performed by injection through the opening or directly through the papillary duct.   More suitably, the DNA construct is combined with the drug in combination with a suitable carrier or diluent. Or as a veterinary-acceptable composition. A suitable carrier is water , A liquid carrier such as a salt buffered salt solution or other physiological solution. this These compositions further form another aspect of the present invention.   The resulting protein or polypeptide is effective in preventing or treating mastitis There must be. Such proteins or polypeptides include enzymes, such as Mucolytic proteins, antibiotics, antibodies, cytokines, tumor necrosis factor and A protein capable of inducing an immune response to infectious or potentially susceptible agents in, and Includes proteins that activate polymorphonuclear neutrophils or macrophages.   In a preferred embodiment, the invention relates to a mammary gland-specific promoter or any ubiquitous promoter. Or a lytic protein or antibody under the control of an inducible non-mammary promoter A recombinant DNA sequence comprising the nucleotide sequence is provided.   The invention is particularly applicable to the treatment of domestic animals (cows, goats, sheep and pigs) Are lower mammals or lower milk producing animals (rabbits, camels and Ison). The present invention also specifically eliminates most staphylococci For use in humans.Brief description of figures   FIG. 1 illustrates an example of a DNA construct according to the present invention; and   FIG. 2 shows sheep milk after injection of cationic liposome-DNA complex into the mammary gland. 2 illustrates the rate of human growth factor synthesis during.Detailed description of the invention   According to one preferred embodiment of the present invention, animal gene therapy for infectious diseases comprises A DNA sequence designed to produce (which is reassociated into an organ or organism) Transfection of the target tissue with The animal is protected against sexual or potentially infectious microbial agents.   According to another aspect of the invention, mammalian mastitis gene therapy produces a molecule. The mammary gland with a DNA sequence designed to be reassociated into the breast Infection, thereby causing infectious or potentially infectious microbial agents The animal is protected against   The targeted tissue also contains other DNA, such as gene transcription and translation regulatory sequences. Sequences can also be transformed. Transcriptional and translational regulatory sequences are This is the actual required DNA sequence. Generally, such regulatory elements are sequence expression Can be operably linked to any gene to control Units are referred to as "expression cassettes". Expression cassettes are typically Promoter region, translation initiation site and translation termination sequence in addition to the optimized nucleotide sequence Will contain columns. Unique endonuclease restriction site at the end of the expression cassette When creating a DNA cassette, the cassette can be easily inserted. Or be removable.   Gene expression is primarily dictated by its own promoter, Other DNA regulatory elements are required for efficient expression of the product. Requires promoter sequence The TATA box is usually 20 to 30 base pairs (bp) upstream of the transcription start site. Contains a common consensus sequence (TATAAT). TATA box is accurate in most cases Is necessary for the initiation of transcription. By convention, the transcription start site is called +1. 5 '(upstream ) Direction is given a negative number and extends in the 3 '(downstream) direction. The array is given a positive number.   Promoters can be constitutive or inducible. A constitutive promoter is a living cell Control the transcription of genes at a constant rate during Activity is fluctuated as determined by the presence (or absence) of a specific inducer You. The regulatory element of the inducible promoter is usually the transcription start site from the TATA box. It is located further upstream of the rank. Ideally for an experimental purpose, an inducible promoter Should have each of the following properties: basal expression level in the absence of inducer No or low, high levels of expression in the presence of inducers, and cell physiology An induction scheme that does not change. The basic transcriptional activity of all promoters is The mechanism is not clear, but Certain enhancer regulatory sequences have been identified as being located near the promoter. In this case, it is known to those skilled in the art to increase the transcription rate of the promoter.   A constitutive promoter is naturally activated in mammary epithelial cells, The transcription of the linked gene can be activated in a tissue-specific manner. For example, powerful Constitutive promoters refer to casein, lactoglobulin, Erin, lactalbumin, lysozyme, whey acidic protein (WAP) code It controls gene expression. Preferably, the promoter is livestock, Originated from horse, goat, sheep or pig species. Or specific mammary gland promoter May be of smaller animal, rabbit, rodent, cat or dog origin. Cytoplasmic β -Other constitutive promoters regulating actin or ubiquitin gene expression -Can also be used.   Cytomegalovirus (CMV), simian virus 40 (SV40) or mouse Virus such as breast cancer virus (MMTV, which is more inducible) Alternatively, a retroviral promoter can also be used.   Inducible promoters contain a given gene in response to exposure to an inducing agent. Any promoter capable of increasing the amount of the gene product produced therefrom is included. Invitation Inducible promoters are well known to those of skill in the art, and include the use of protective or therapeutic molecules. There are a variety of things that can be used to induce gene expression.   Two suitable inducible promoters are the heat shock promoter (HST) and And glucocorticoids. Usually, a 70 kDa heat shock protein is Regulated by heat shock, such as a promoter associated with a gene Promoters can increase expression several fold with increasing temperature. heat Shock promoter is used to control gene transcription of protective or therapeutic molecules It can be used as an environmentally inducible promoter. Glucocorticoids also prevent It often functions as a trigger for the expression of genes, including therapeutic or therapeutic molecular genes. This system uses glucocord, which forms a complex with hormones in the presence of steroid hormones. Consists of the Ticoid receptor protein (GP). This complex is then A short nucleotide sequence (26) termed the cococorticoid response element (GRE) bp), which activates expression of the linked gene. Glucocor The ticoid system is used as a means to induce the expression of protective and therapeutic molecules. It can be included in the transformation construct. Once the construct has been inserted, GR tan in which steroid hormone or glucocorticoid is constitutively produced It associates with the protein and is bound to the GRE element, and is used to bind protective or therapeutic molecules (eg, Stimulates gene expression in the body or enzymes).   Perhaps the target tissue is the inserted gene (naked, liposome, cell-enclosed or Coated solid particles) produce the protein product in sufficient quantities to produce the desired effect. Will allow to live. The product of the inserted gene is Expressed against, or potentially causative, infectious or potentially infectious microorganisms The organ or organism to be treated must be treated or protected.   Transformation of animal tissues requires DNA to be physically located in the host animal And Current transformation methods employ various techniques to introduce naked DNA into cells. And can be used to transform target tissues. One form of transformation In, the DNA is injected directly into the tissue by use of a syringe. Or , Fast trajectory to eject small DNA-associated particles through tissue incision and into tissue Can be used. In another form, also by insertion of another entity, including DNA. DNA can be introduced into the target tissue. These entities include minicells, cells (eg, Fibroblasts, adipocytes, Mac-T cells, myoepithelial cells, breast cancer cells, kidney cells, liver Kidney cells, lung cells, lymphocytes, leukocytes), liposomes (eg, natural or synthetic fats) Transporters, cationic liposomes) or other fusible lipid surface .   The present invention relates to the neutralization and lysis of genes used for gene therapy of infectious diseases. Or when an opsonin-like molecule is synthesized. Preferably, in the case of mastitis, Encodes mucolytic proteins (eg, bacteriocin and lanthionine) Gene used to remove gram-positive bacteria (most often cocci) it can. The gene product acts as an immunomodulator and provides an immunological response (eg, Neutrophil or macrophage activation). The product is cytosine or other It can be an immunomodulator. Alternatively, the gene is an in the following therapeutic polypeptides: Can also be used for cythio synthesis:   1. Enzymes or mucolytic proteins such as lysostaphin and mucolycin quality;   2. Anti-hemolysin, anti-leucocidin, anti-protein A, anti-collagen, anti- Bronectin binding protein, anti-laminin, anti-α-toxin and anti-β-toxin antibody Such antibodies; opsonic-like antibodies and antibodies to cell fusion virus proteins ;   3. Cytokines, interleukins, chemokines, growth factors;   4. interferon;   5. Tumor necrosis factor; and   6. Immunoadhesin or immunotoxin.   Antibiotics are not very suitable, but with an inducible promoter Can be used for   Microorganisms that can cause mastitis and can be eliminated by gene therapy It is: In cattle:         Streptococcus agalactiae,Str. Ube,Str. Zooepi Demix ,Str. Disgaractie, Faecal streptococci, pneumococci, Staphylococcus aureus Bacteria, coliforms,KlebsierraSubtype,Cornebacterium pyogenes, Ushikor Nebacterium,Mycobacterium  Tuberculosis,Mycobacterium Subtypes, Bacillus cereus, pathogens of animal pasturella,Spherohors Nek Rohors , Germs,MycoplasmaSub type,NorcardiaSubtype, fungusTrichosopoloneSubtype, yeastCandidaSubspecies,K Liptococcus neoformans ,SaccharomycesandTruropsisSubtype. In sheep:         Pasteurella haemolytica,Staphylococcus aureus,Actinobacillus ligni Eleshii , E. coli,Str. UberisandStr. AgaractieandCor . Pseudotuberculosis . In goats:         Str. Agaractie,Str. Disgaractie,Str. Pyrogene S And Staphylococcus aureus. In pigs:         Aerogenes, E. coli,KlebsierraSubtype,Pseudomonas ae Luginosa , Coagulase positiveStaphylococcusKind,Str. Agaractie ,Str. Disgaractie,andStr. Uberis. In horses:         Cornebacterium pseudotuberculosis,Str. Zooepide Mix andStr. Equi.   Other microbes and diseases that can be removed from exotic animals by gene therapy methods include: What causes the following: In primates:         Polio, measles, mumps, rubella, DPT, tetanus. In dogs:         Canine distemper, canine adenovirus, canine parvovirus, canine La flu, rabies, leptospira bacterin. In cats:         Panleukopenia, feline rhinotracheitis, feline calicivirus, madness. In artiodactyl:         BVD, 8-way Clos. Bacterin, 5-way Lepto. Ba Cterin, parainfluenza 3, prions, scatter.   Examples of infectious diseases that can be treated or prevented by applying gene therapy are: Yes: anemia, arthritis, rhinotracheitis, bronchitis, medullary palsy, saccular disease, hepatitis, total elimination Cavitis, nasal cold, enterohepatitis, hematopoietic tissue necrosis, macules, keratoconjunctivitis, laryngotracheitis, myxoma Dermatitis, foot dermatitis, polyarthritis, pustular scleroderma, vulvar vaginitis, serositis, sinuses Inflammation, stomatitis, synovitis, meningitis and tracheobronchitis.   The present invention relates to gene therapy having therapeutic and prophylactic activity against infectious microbial diseases About the law. The invention is particularly directed to DNA sequences, expression vectors which enable the use of the method. , DNA carriers (liposomes, solid particles) and cells.   The present invention is equally applicable for genetically transforming in vitro a gene of interest. , Therapeutic or prophylactic tamper against microorganisms that cause or potentially cause disease Into the original tissue to produce protein, peptide or antisense RNA. It also relates to transplanted cells (eg, Mac-T, lung, kidney, muscle cells).   The invention is particularly applicable to livestock: cattle, goats, sheep, pigs, cats, dogs and birds. But also involves more exotic animals such as rabbits, camels and bison Can be.   The present invention will be more readily understood by reference to the following examples. However, these are not intended to limit the scope of the invention, but to illustrate the invention. Given.Example I Long-lasting and exogenous expression of plasmid DNA in sheep mammary gland   To limit transgene expression to the mammary gland, mammary gland Motor was used. Introduction of foreign genes targeting only one organ Gene therapy techniques have also been demonstrated. Most efforts on postnatal gene therapy Relies on new genetic information into tissues: target cells are removed from the body, It is infected with a viral vector that carries regulatory gene information and is then reimplanted into the body. I For some applications, direct transfer of genes into tissues in vivo (viral (With or without vectors) would be useful. Postnatal animals In vivo direct gene transfer can be achieved by liposome-encapsulated DNA, viral envelope receptors. DNA captured by a proteoliposome containing a protein (Nicolau) Et al., 1983,PNAS USA, 80: 1068), calcium phosphate-coprecipitation. DNA (Benvenisty et al., 1986,PNAS USA, 83: 955. 1) and DNA bound to the polylysine-glycoprotein carrier complex (Wu and And Wu, 1988,J. Biol. Chem. , 263: 14621) Has been achieved by Forming or forming calcium phosphate-coprecipitate In vivo of cloned viral DNA sequences after direct injection into the liver Infectivity has been described (Seeeger et al. 2984).PNAS USA, 81 : 5849). Using a cationic lipid carrier (Felgner et al., 1989) ,PNAS USA, 84: 7413), mRNA containing elements promoting stability. The sequence was used in tissue culture cells (Malone et al., 1989,PNAS USA, 86: 6 077) andXenopus LaevisEmbryos (Malone et al., 1989,Focus   11:61) can be translated efficiently. Here, the cationic liposome and the complex When the pure DNA formed is injected directly into the sheep mammary gland, the reporter gene Is remarkably expressed.Preparation of a plasmid-liposome mixture   Plasmid pCR3 (InVitrogen) is used as a mammalian expression vector Was used. After PCR amplification, human growth hormone (hGH) cDNA is contained in pCR3. Was inserted into. Plasmid-LipofectAMINETM(BRL) mixture Prepared as described in the instructions for use (GibcoBRL). Brief note Then, 50 μg of pCR3- was added to 500 μl of sterile phosphate buffered saline (PBS). hGH is suspended and 100 μl of Lip previously diluted with 500 μl of PBS effectAMINETMAnd left at room temperature for 1 hour.Injection of plasmid-liposome complex into sheep mammary gland   Circular pCR3-hGH plasmid-LipofectAMINETMThe mixture Filled in glass syringe. Using a No. 20 gauge, immediately after dropping, The complex was injected directly into the mammary gland tissue through the breast skin. Two ewe 1 ml was injected into the right udder. Left mammary gland milk was used as a negative control .Sheep milk analysis   The sheep were milked by hand once a day and the milk was stored at -80 ° C until analysis. The amount of hGH was determined by the immunoassay after milk was determined not to affect the accuracy of the assay. It was measured by Immunocorp. Part of milk sample (100μl) Was analyzed.result   HGH synthesized by pCR3-hGH injection into the mammary gland is shown in FIG. As shown, all were detected throughout the lactation period (about 60 days). Sheep milk HGH concentrations were relatively high for the first 5 days. At that time 300 to 40 0 ng / ml (± 43 ng / ml). H in milk from left (control) mammary gland The GH concentration was between 10 and 15 ng / day in two sheep for each day of the experiment. ml. Significant differences in hGH concentration in milk were observed for each sheep. Was not.Conclusion   These results indicate that expression from plasmid DNA is low in the sheep mammary gland. Both show that they can last for 60 days. In the mammary glands throughout the sheep milking period The unprecedented ability of plasmid DNA to stably express foreign genes in It has important implications for treatment. Stable expression of circular plasmid DNA Exogenous acceleration or viral transduction should also be kept stable. Suggests thatExample II HGH content in goat milk after direct introduction of the human growth hormone (hGH) gene into the mammary gland Secretion   Alternative pathways to introduce genes into mammary gland tissue extend gene therapy technology It is. In this study, two gibbon ape leukemia virus (GaLV) pseudotyped In Vitro and In Vivo Goat Mammalian Component Using Torovirus Vector The reporter gene was introduced into the epithelial cells.Cell and tissue culture   Bovine kidney cell line, MDBK and bovine mammalian epithelial cell line, Mac-T cells Was used. The retrovirus packaging cell line used (@Cre, PA 317 and PG13 / LNc8) were obtained from the ATCC. Cells are gentamic Dulbecco's modified serum supplemented with Syn (54 mg / ml) and 10% fetal bovine serum 37 ° C, 5% COTwo/ 95% air.Establishment of producer cell line   JR-gal by particle bombardment with 1 μg DNA per mg of gold beads neo- (Wang et al., 1991,Cancer Res. , 51: 2642). Construct is transfected into the allotropic packaging cell line @Cre Was done. Two days after the bombardment, the supernatant was removed from these cells and centrifuged. After adding 1 l of polybrene, the amphotropic and Ga Both LV pseudotyped packaging cell lines were infected. Retrovirus vector, Plasmid carrying MFG-hGH was a 50: 1 ratio with pSV2neo Simultaneous transfer into PA317 and PG13 / LN c8 by vehicle impact Was cut. Retrovirus-producing packaging cells containing the hGH gene 418 resistance (400 μg / ml).Virus-producing cells   Highest level of hGH produced from target cell line for injection into goat mammary gland PG13 / LN c8 clones were selected. Each clone was 2001 Passaged three times on a 00 mm-plate. The cell supernatant over 3 days was collected, concentrated and Gentamicin in DMEM.Induction of cell division and milking of goats   Mating two 2 year olds (goats 1 and 2) and 2 1 year olds (goats 3 and 4) Unexpected female Zaren hybrid goat induces lactation and subsequent lactation I. For 14 days m. Treated with exogenous steroids.Injection of virus stock into goat mammary gland   80 μg / ml in concentrated PG13 / LN c8 MFG-hGH virus stock Was added and filled into a syringe. 22 gauge stub adapter And goats 1, 2 and 4 were treated with hormones 3, 5, 7, 9, 11 and On day 13, a retrovirus was injected into the right mammal, and goats 3 were 3, 5, 7, 9, Injections were received on days 10 and 13. The amount of virus for each animal is different Cage (range 8 to 20 ml), which was determined by the total volume of the mammary gland. Left breast Glands served as intra-animal controls and were injected with DMEM containing gentamicin. Injection The virus stocks used for were then assayed on several cell lines.Goat milk analysis   Goats are milked by hand twice daily in the morning, and the milk is kept at -80 ° C until analysis . hGH levels were determined after the determination that milk did not affect the accuracy of the assay. Measured by Say. Part of milk sample (5 μl) diluted 1:10 with double distilled water And analyzed by SDS / PAGE on a 14% gel stained with Coomassie blue. Was analyzed. The protein concentration of the milk sample was determined by BCA (Pierce et al., 1977,An l. Biochem . , 81: 478).result Vector production of packaging cell lines   Retrovirus packaged by PG13 / LN c8 clone 6 H in medium removed from Mac-T and MDBK cells two days after infection with GH concentrations were 192 and 3.8 ng / ml, respectively. 28 days after infection, HGH levels from cells at 119.3 and 4.5 ng / ml were This shows that the proviral LTR was still functional after a week.Injection of virus stock into goat mammary gland   The virus stock injected into goats 1 and 2 on day 13 contained 224 μg hGH. / Ml of PG13 / LN c8 packaging cells This indicates that hGH is produced.Goat milk analysis   Twenty-four hours after the last virus injection, ie, on day 14 of the hormonal regimen, Lactation has begun. Milk appeared normal throughout lactation. Half of each The milk yield from the udder is approximately 150 ml for goats 1 and 2 on the first day of milking. However, only 10 ml for goat 3 and 35 ml for goat 4. All four For all goats, the amount of milk produced by each mammary gland increased daily. hGH Levels were determined by immunoassay and each animal had a unique hGH secretion pattern was gotten. In goat 1, hGH levels fall steadily until day 9 of lactation At that time, the level was 3-5 ng / ml, and in other goats, The hGH measured from day 2 to day 2 markedly decreased, and around hGH production stabilized at 2-3 ng / ml. In goats 1 and 2, lactation 15 Milking was stopped on the day. HGH levels in goat 3 milk from day 1 to day 2 of lactation Dramatic drop, increasing from day 8 to day 9 at 23 ng / ml until day 16 It stopped and began to decrease again from that point. Goat 4 left after falling for the first two days At the end of lactation on the 19th, prostaglandin E2 was injected. in addition, Goat 4 secreted hGH at 5 ng / ml even after 28 days. Left (control) mammary gland The hGH concentration in their milk was between 0.0 and 0.6 at all evaluations in 4 goats. ng / ml. These numbers are the detection levels of the assay and Correlated with numbers measured in two other lactating goats not exposed to the rovirus I have. Total hGH production in the four animals ranged from 0.3 to 2 μg / day. Was.   If the hGH gene was stably incorporated into the stem cell population, the goat would A second lactation after mammary gland regression will also secrete hGH. 2nd milk Lactation was induced in two goats, goat 1 did not produce hGH, but goat 2 The eye begins to secrete detectable amounts of hGH from the right (injected) mammary gland, followed by 1 The 0 day hGH concentration varied from 0.4 to 2.3 ng / ml. This lactating During this time, milk from the left control mammary gland always had undetectable levels of hGH.   SDS / PAGE of the goat milk samples throughout the collection period was performed using retrovirus injected right milk. Gland, control left mammary gland and goat protein pros not exposed to retrovirus There was no consistent difference in the feel. HGH measured by BCA The protein concentration of the milk containing is not statistically different from the control milk, HGH production by skin cells does not affect normal cellular protein mechanisms It is. Milk proteins in the treated mammary gland are not available at maximum concentration on day 1 of lactation. It is pointed out that it is not excreted.Conclusion   Gene therapy techniques and multiple techniques to introduce foreign genes directly into the ruminant mammary gland Applying a defective retroviral vector made in milk could take several years to produce pharmaceuticals in milk In a few weeks dramatically reduced. Low expression levels, but the method is transgenic For low-level production of important proteins for animal production or evaluation purposes May find applications in the evaluation of different genetic constructs .Example III Effect of lysostaphin on Staphylococcus aureus infection of mouse mammary gland   LysostaphinStaphylococcus SimransEndope produced by It is a peptidase. It is a member of the Staphylococcus genus peptidoglycan pe It hydrolyzes ntaglysin bonds and is therefore largely inactive against other prokaryotes. It is non-active and has no activity in eukaryotes. Lysostaphin gene cloned And have been successfully expressed in E. coli and Bacillus species (Heath et al., 198). 7,FEMS Microbiology Letters, 44: 129; H einrich et al., 1987,Molecular and General G enetics , 209: 563; Recsei et al., 1987,PNAS US A , 84: 1127). Promotes lysis of Staphylococcus aureus under various experimental conditions Although the use of lysostaphin is well known, cloning and Advances in expression and expression increase the likelihood of producing large quantities of enzymes relatively inexpensively. this thing Is an economically important disease in lactating ruminants, Staphylococcus mastitis (B Ramley et al., 1990,Res. Vet. Sci. , 49: 120) In vivo in a new way to do so. This experiment is milk 8 illustrates the use of a mastitis model in secretory mice, and in vivo yellow The strong antibacterial activity of lysostaphin against staphylococci is clearly shown.   Lysostaphin (Sigma Chem.) To skim milk (Oxoid) Upon dissolution, concentrations ranging from 0.1 to 100 μg / ml were prepared. Lysostaphin A control solution containing no is also included. 1 ml control and lysostaphin dilution The solution was transferred to Staphylococcus aureus M60 108Colony forming units (cfu) were inoculated. This Produced both α and β toxins and were isolated from cases of bovine mastitis. milk Lysostaphin concentrations above 2 to 3 μg / ml are viable Staphylococcus aureus 2 to 3 logTenReduced, while yellow spherules at 10 μg / ml in milk Bacteria average 7.95 log of controlTen/ Ml to 2.0 logTen/ Ml Was. As a result, a 10 μg lysostaphin dose was selected for in vivo use. M F1 strain mice were anesthetized and inoculated into the upper pair of abdominal mammary glands (designated R4 and L4). Is done). In 8 lactating mice, both R4 and L4 had 108cfu yellow A 0.1 ml salt solution of Staphylococcus aureus was inoculated. Then, after 1 hour, 10 μm was added to R4. 0.1 ml salt solution containing 0.1 g of lysostaphin and 0.1 ml salt solution into L4 did. After another 30 minutes, the mice were killed and the mammary glands were aseptically removed and 0.1 mg / m 1 in trypsin (Sigma Chem.) in a salt solution. Active lysostaphin was degraded. A 10-fold diluted solution was added to 7% bovine blood agar (Oxoid Blood Agar Base number 2) and incubate at 37 ° C overnight And the number of survivors was determined. In a further experiment using 20 mice Injected 10 μg of lysostaphin into the mammary gland followed immediately or 1 hour later 10ThreeInjection of staphylococcus aureus to prevent prophylactic use of lysostaphin A mock experiment was performed. Control mammary gland was injected with saline instead of lysostaphin . Twenty-four hours later, the mice were killed and dissected. Overall pathological changes are noted, Staphylococcus aureus counts were determined as described above.result   Delivery of 10 μg lysostaphin to mammary gland previously inoculated with Staphylococcus aureus Injection reduced bacterial recovery by more than 99% in 30 minutes compared to controls. This decrease Was statistically significant (t = 2.56; p <0.02). Staphylococcus aureus inoculation 24 hours if 10 μg lysostaphin was administered immediately before or 1 hour before Recovery was approximately 10 per mammary gland of the saline-treated control.9Average per mammary gland compared to individual About 10TwoViable Staphylococcus aureus. In the latter case, the control mammary gland Shows severe pathological changes characteristic of acute staphylococcal mastitis in Japan Was. The control mammary gland is darker and reddish, with fragile texture and some It had a liquefied and hemolyzed area. Histological sections have coagulable necrotic areas Severe inflammation, neutrophil and macrophage infiltration was revealed. Numerous staff Irococcus was recognized. In contrast, lysostaphin-treated mammary glands are pale yellow and elastic And only slightly reddened around the base of the nipple . Histological examination should be well preserved with little or no cellular infiltration It showed a functioning alveolar structure, indicating the absence of cocci.Conclusion   These experiments demonstrate the anti-staphylococcal activity of lysostaphin in vivo. It is clearly shown. Both therapeutic and prophylactic efficacy have been demonstrated. Lysostaphin remains Gene cloning makes its therapeutic use at competitive prices readily available And its relatively high specificity makes it attractive for use in food-producing animals I have to. In addition, advances in transgenic technology have led to the ruminant mammary gland (Simons et al., 1987, supra).Na cure 328: 530). Generally, this is the pharmacology for use in human medicine. It has been applied to the production of chemically active substances. However, lysos in lactating mammary glands Uptake and expression of the tuffin gene is an animal against Staphylococcus mastitis May be enhanced.Example IV Efficacy of lysostaphin in the treatment of intra-mammary infections of S. aureus   Bactericidal activity of cloning-derived lysostaphin against mammalian infections of S. aureus The effect was evaluated. Lysostaphin from guinea pig mammary gland 48 hours after infection Staphylococcus aureus (Newbound 305) was removed; 125 μg of lysos 14/16 for tuffin, 5/8 for 25 μg, 5/10 for 5 μg, 0/1 for 1 μg And 0/3 at 0 μg. Yellow globules 48 hours after challenge in untreated guinea pigs Bacterial infected mammary glands remained, however, of 3/25 of treated guinea pigs. In control mammary glands, bacteria were removed in response to treatment of adjacent mammary glands.   Guinea pig somatic cells / mlFourStaphylococcus aureus inoculation from individual The rest is 3x106It turned to more than the number of cells. Treatment with lysostaphin is treatment Neutrophil migration in the mammary gland8Up to a level above and adjacent untreated With an increase in the mammary gland, it dropped sharply to pre-treatment levels. Largest in control mammary gland Response was observed in animals receiving 125 μg, with yellow buds in 2/25 control mammary glands. Streptococcal exclusion occurred.   Leukocyte response to intramammalian treatment in dairy cows is similar to the guinea pig model described above doing. Somatic cell levels in Staphylococcus aureus-infected mammary glands during milking after treatment Had increased 10-fold. Subsequent milking returns cell levels to pre-treatment levels Or less. Elevation of leukocytes alone explains removal of infection I didn't come.Example V Use of the recombinant bacterial enzyme lysostaphin as a therapeutic agent for mastitis   Lysostaphin, a recombinant mucolytic protein, is a Staphylococcus aureus in dairy cows It was evaluated as a potential intramammary treatment for mastitis.Staphylococcus Simrans Lysostaphin, an enzyme product, enzymatically disrupts the cell wall of S. aureus Open and bactericidal.   30 Holstein-Friesian dairy cows in primary lactation Infect all breasts with fungus (Newbould 305, ATCC 29740) Was. Infection is established, followed by somatic cell counts and Staphylococcus aureus for 3 weeks prior to treatment Colony forming units were monitored. Infected animals are treated with a single dose of recombinant Inject lysostaphin (rLYS) (dose 1 to 500 mg) or Three consecutive p. m. 100 mg dissolved in 60 ml sterile phosphate buffer after milking RLYS was injected. After the last treatment, Staphylococcus aureus was milked in a total of 28 milkings. If not, the animal was considered cured.result   Kinetic analysis of immunologically active rLYS was performed at a minimum bactericidal concentration of 72 hours at 37 ° C. Showed that it had been maintained in the milk for a while. In contrast, penicillin G is the same The incubation time retained less than 10% of its bacteriostatic activity.Dose titration and kinetics of rLYS in bovine mammary gland   0, 1, 10, 100 or more to determine the optimal effective dose to elicit long-term healing A titration was performed in which a single dose of rLYS at a concentration of 500 mg was administered. Untreated milk Chamber and 1 mg treatments failed to remove all breast Staphylococcus aureus. 10, 100 and 500 mg doses for at least one milking Was temporarily removed. Milk with Staphylococcus aureus removed in recurrent breasts The length of time was approximately proportional to the dose administered. 14 days after the procedure, the two breasts At the 100 mg dose, one was cured at the 500 mg dose. rLYS is minimally sterilized Degree (MBC) is maintained for about 24 hours, and experimental infection is performed on a 2 to 4 day cycle. Thus, multiple injections of 100 mg rLYS over three consecutive milkings, Determined to be optimal for maintaining a minimum effective concentration of 3-5 days and eliciting healing Was decided.Conclusion   Staphylococcus aureus is one of the primary etiologic agents of bovine mastitis, It is the main cause of financial losses. Effective mastitis treatment for lactating dairy cows is demanding It remains as the main unfulfilled one. Current treatment is only moderately effective Because of the high cost of milk disposal and the selection of infected animals, Only treatment was the choice of herd handling practices adopted. Chronic and subclinical No method addresses the majority of infections in lactating animals. Against Staphylococcus aureus Recombinant proteins such as rLYS, which have bactericidal activity, are very Would be a useful therapeutic agent. If rLYS is as effective as an antibiotic, rLYS Natural proteolysis and inactivation of YS milk and by consumers Inactivation during digestion may minimize concerns associated with residues in milk.   In vivo dose titration shows that the minimum effective therapeutic dose of rLYS is 100 mg Incited. However, therapeutically, the treated mammary gland for one to three consecutive milkings Multiple injections of rLYS may be required to maintain minimal bactericidal activity in milk Would be desirable. The in vivo bactericidal activity of rLYS shows that after the last intramammary injection, For at least one milking, remove 95% of the breasts from detectable S. aureus milk Most effectively indicated by the fact thatExample VI Expression of jet-injected plasmid DNA in sheep mammary gland   Jet injection-based DNA delivery system transiently transduces lactating mammary glands in vivo As a means of transfection and as a technique for DNA vaccination Was evaluated. The model expression plasmid is a human cytomegalovirus immediate early gene Human growth hormone driven by one promoter / enhancer region (CMV) (HGH). Naked plasma injected into the sheep's lactating mammary gland Expression from DNA is performed 48 hours after in vivo transfection. Is sufficient for detection by Northern blot analysis. Conclusion and The ability to transiently transfect lactating mammalian tissue in vivo, Avoid the difficulties encountered with in vivo culture techniques, test mammalian regulatory elements and Fusion gene construction designed for the production of transgenic animal bioreactors A method for testing an object is provided.Example VII Elimination of Staphylococcus aureus in eukaryotic systems expressing lysostaphin   293 cells in which the lysostaphin gene was maintained in vitro (human fetal kidney cells) Vesicle). Recombinant bacteriocin (lysostaphin) secreted into culture medium And was observed to kill contaminating Staphylococcus aureus during the challenge period.   The lysostaphin geneStaphylococcus SimransHypospeciesStafilori Chicas (NRRL B-2628) obtained from the extracted DNA by PCR amplification, Eukaryotic transfected with Staphylococcus aureus strain Newboard (ATCC) Used for challenges in biological cells.StaphylococcusThe strain is brain heart exudate (BHI ) Propagated in medium.Purification of lysostaphin gene   Staphylococcus SimransHypospeciesStaphyloliticusStir incubes And incubated overnight at 37 ° C in a thermometer. The medium is centrifuged and the pellet is Sostafin (Sigma) ml-15 ml of 50 mM EDTA-50m containing M Tris-HCl (pH 7.8) and the suspension was incubated at 37 ° C for 2 hours. I was vate. Purified bacterial DNA is directly amplified by PCR and The offspring were isolated. The set of oligonucleotide primers used was: 5'-TTAAGGTTGAAGAAAACAATT-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-GCGCTCACTTTA TAGTTCCCCAA-3 ′ (SEQ ID NO: 2). Amplification is Thermal DNA Cycler And 2.5 units of Taq DNA polymerase (Perkin Elmer)   Cetus), annealing at 60 ° C. for 30 seconds, extension at 72 ° C. Was performed using a 30 cycle program with 90 seconds and 10 seconds denaturation at 93 ° C. It was given. The PCR product is composed of the complete lysostaphin sequence, Includes coding genes with terminal play and plow regions. Restriction endonucleus Digestion, ligation reaction, washing with phenol-chloroform mixture, ethanol precipitation All procedures including precipitation, transformation and cloning of the construct in E. coli strain DH5a Other recombinant DNA methods were performed according to standard methods. All enzymes are Boehrin ger Mannheim.   Lysostaphin is a human cytomegalovirus immediate early gene 1 promoter / Enhancer region (CMV) and human interleukin-2 signal peptide The eukaryotic expression vector was ligated.Cell culture and DNA transfection   Human embryos transformed with the replication origin-deficient mutant of simian virus 40 293 cells, which are fetal kidney cells, are 10% (vol / vol) fetal bovine serum (Gibc) o BRL) and glutamine (1.4 mM) supplemented with Dulbecco's Modified Eag The cells were cultured in a medium (Sigma). Cells are placed in 30 mm wells at 50 per well. The cells were seeded at a cell number of 0000 and grown in 2 ml of medium at 37 ° C. for 24 hours (5% C OTwoIn an air atmosphere containing) and the calcium precipitation method with the following modifications 50% to 60% was introduced into the cells. 2 ml to the precipitate containing 7.5 μg of DNA Of culture medium was added. After 24 hours, replace the medium with 2 ml medium per well Take medium samples every 24 hours after transfection and Lysostaphin production was assessed by immunoassay and ELISA.Assay for biologically active lysostaphin   10 wells containing transfected 293 cellsTwoOr 10ThreePieces of yellow Infected with staphylococcal Newboard. A 100 μl sample of infection medium was Spread on blood agar. After 24 hours of incubation at 37 ° C., Effect of Recombinant Lysostaphin on Bacterial Growth by Evaluating the Number of Positions (CFU) Was evaluated.result Production of recombinant lysostaphin by transfected eukaryotic cells   The modified lysostaphin gene is transfected into tissue culture cells, Enzyme expression, processing and activity against infected bacteria was demonstrated. Culture medium Analysis yielded a band of approximately 25 kDa; this band was mature lysostaphy. Was similar in size. Similar results indicate that recombinant lysostaphin expression is eukaryotic Observed in another experiment performed on biological cells. ELISA assay is for recombinant lyso Staffins at concentrations of 100 to 250 ng / ml / 24h depending on the clone It was revealed that it was produced.Activity of lysostaphin secreted by mammalian cells   Recombinant lysostaphin secreted by transfected mammalian cells Activity reduces the growth of infectious Staphylococcus aureus in the culture medium or reduces some In the preparation, it was observed due to the inhibitory efficiency. From non-transfected cells The media samples had no inhibitory effect on the growth of the bacteria present in the wells. Cold The top plate was completely confluent after overnight incubation. Contrast Typically 10ThreeIn the presence of eukaryotic cells transfected with an initial amount of bacteria CFU was hardly counted on the plate when cultured in. 10ThreeIndividual When less than 100 bacteria were used, less than 100 CFUs were observed in our assay. , 10 wells containing transfected cellsTwoWhen bacteria are added No presence of CFU on the gel was observed.   Although the present invention has been described with reference to specific embodiments thereof, further modifications are possible. This application is intended to cover any variations, uses, or adaptations of the invention that are generally in accordance with the principles of the invention. Is intended to cover adaptations and is well known in the art to which this invention pertains. Or as it goes into the customary practice and to the essential features set forth herein before From this disclosure as set forth and within the scope of the appended claims. It will be understood to include withdrawals such as

【手続補正書】 【提出日】１９９７年１１月１３日 【補正内容】 請求の範囲 １． 動物において感染性疾患を治療および／または予防する方法であって、 ａ） バクテリオシン、ランチオニン、ラクトフェリン、リゾチームからなる群 より選択される治療タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡをコードす るＤＮＡ配列に作動可能なように連結された、少なくとも５’発現制御ＤＮＡ配 列と分泌シグナル配列をコードする分泌ＤＮＡ配列とを含む組換えＤＮＡ発現系 を製造し、ここで前記発現制御ＤＮＡ配列および前記分泌ＤＮＡ配列は、治療上 有効量の前記タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡのＤＮＡ配列のイ ンビボ発現を指示することができ；そして ｂ） 前記治療タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡのインサイチオ 発現のために、工程ａのＤＮＡ発現系を動物の標的組織中に導入する； の各工程を含む方法。 ２． 前記ＤＮＡ発現系がトランスジェニック組換え動物細胞である、請求項１ 記載の方法。 ３． 前記細胞が、上皮乳腺細胞、血液細胞、リンパ球、白血球、Ｔ−リンパ球 、Ｂ−リンバ球、赤血球、筋肉細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、肺細胞、分泌細胞お よび非分泌細胞からなる群より選択される、請求項２記載の方法。 ４． 前記ＤＮＡ発現系が、脂質リポソーム、陽イオン性リポソームおよび陰イ オン性リポソームからなる群より選択される、請求項３記載の方法。 ５． 前記ベクターがウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、 請求項３記載の方法。 ６． 前記感染性疾患が、細菌、ウイルス、レトロウイルス、寄生虫、真菌、糸 状菌、酵母、プリオンまたはスクラピーにより引き起こされる、請求項１、２、 ３、４または５のいずれかに記載の方法。 ７． 前記バクテリオシンおよび／またはランチオニンが、アンビシン、デフェ ンシン、セクロピン、チオニン、メリチン、マガイニン、アタシン、ジフェテリ ン、サポニン、カクルチン、ゼノピン、サブチリン、エピデルミン、ｐｅｐ５、 ラクチシン４８１、アンコベニン、デュラマイシン、ガリデルミンまたはシンナ マイシンである、請求項６記載の方法。 ８． 前記治療タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡが、免疫グロブ リン、ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、胆汁酸塩刺激リパーゼまたは リボザイム、サイトカイン、ケモカイン、成長因子および免疫調節剤からなる群 より選択される、請求項６記載の方法。 ９． 前記動物細胞において機能的であり、前記治療タンパク質、ペプチドまた はアンチセンスＲＮＡをコードする組換えＤＮＡに作動可能なように連結されて いる３’発現制御ＤＮＡ配列と分泌ＤＮＡ配列とをさらに含む、細胞請求項２記 載の方法。 １０． 組換えタンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡを全身でまたは 標的組織において製造するための非ヒト遺伝的処置動物であって、該動物の標的 組織中に導入されたＤＮＡ発現系を含み、かつ、バクテリオシン、ランチオニン 、ラクトフェリン、リゾチームからなる群より選択される治療タンパク質、ペプ チドまたはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能なように連結 された、少なくとも５’発現制御ＤＮＡ配列と分泌シグナル配列をコードする分 泌ＤＮＡ配列とを含む動物。 １１． 前記発現制御ＤＮＡ配列が、構成性プロモーター、誘導性プロモーター 、サイトメガロウイルスプロモーターからなる群より選択される、請求項１０記 載の非ヒト遺伝的処置動物。 １２． 前記プロモーターが、ラクトフェリン、血清アルブミン、αＳ１−カゼ イン、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン 、乳清酸性タンパク質、β−ラクトグロブリン、サイトカイン、ケモカインまた は成長因子をコードするＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１１記載 の非ヒト遺伝的処置動物。 １３． 前記分泌シグナル配列が、ラクトフェリン、血清アルブミン、αＳ１− カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブ ミン、β−ラクトグロブリン、サイトカイン、ケモカインまたは成長因子をコー ドするＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１０記載の非ヒト遺伝的処 置動物。 １４． 発現制御および分泌シグナル配列が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ネコ 、イヌ、ウサギ、トリまたは魚に由来するものである、請求項１０記載の非ヒト 遺伝的処置動物。 １５． プロモーターが標的組織における発現について組織特異的である、請求 項１１記載の非ヒト遺伝的処置動物。[Procedure amendment] [Submission date] November 13, 1997 [Correction contents]                                 The scope of the claims 1. A method of treating and / or preventing an infectious disease in an animal, comprising: a) group consisting of bacteriocin, lanthionine, lactoferrin, lysozyme Encoding a more selected therapeutic protein, peptide or antisense RNA At least a 5 'expression control DNA sequence operably linked to a DNA sequence DNA expression system comprising a sequence and a secretory DNA sequence encoding a secretory signal sequence Wherein the expression control DNA sequence and the secretory DNA sequence are therapeutically An effective amount of the DNA sequence of the protein, peptide or antisense RNA. In vivo expression can be indicated; and b) In situ of said therapeutic protein, peptide or antisense RNA Introducing the DNA expression system of step a into a target tissue of an animal for expression; A method comprising the steps of: 2. 2. The DNA expression system is a transgenic recombinant animal cell. The described method. 3. Said cells are epithelial breast cells, blood cells, lymphocytes, leukocytes, T-lymphocytes , B-limba bulbs, erythrocytes, muscle cells, liver cells, kidney cells, lung cells, secretory cells and 3. The method of claim 2, wherein the method is selected from the group consisting of: and non-secreting cells. 4. The DNA expression system comprises a lipid liposome, a cationic liposome and a negative liposome. 4. The method of claim 3, wherein the method is selected from the group consisting of on-liposomes. 5. The vector is a viral vector or a retroviral vector, The method of claim 3. 6. The infectious disease is a bacterium, virus, retrovirus, parasite, fungus, or thread. 1, 2, or 3, which is caused by a fungus, yeast, prion or scrapie. The method according to any one of 3, 4, and 5. 7. The bacteriocin and / or lanthionine is ambicine, defferent Cincin, cecropin, thionine, melittin, magainin, atasin, dipheteri , Saponin, cacurtin, zenopin, subtilin, epidermin, pep5, Lacticin 481, anchovenin, duramycin, gallidermin or cinna 7. The method according to claim 6, which is mycin. 8. The therapeutic protein, peptide or antisense RNA is used as an immunoglobulin. Phosphorus, lactoglobulin, α-lactalbumin, bile salt-stimulated lipase or Group consisting of ribozymes, cytokines, chemokines, growth factors and immunomodulators 7. The method of claim 6, wherein the method is selected from: 9. Functional in the animal cell, wherein the therapeutic protein, peptide or Is operably linked to a recombinant DNA encoding an antisense RNA. 3. The cell of claim 2, further comprising a 3 'expression control DNA sequence and a secretory DNA sequence. The method described. 10. Recombinant protein, peptide or antisense RNA systemically or A non-human genetically treated animal for production in a target tissue, said target being an animal. Including a DNA expression system introduced into a tissue, and bacteriocin, lanthionine , A therapeutic protein selected from the group consisting of lactoferrin and lysozyme, pep Operably linked to a DNA sequence encoding a tide or antisense RNA At least the 5 'expression control DNA sequence and the secretory signal sequence An animal comprising a secretory DNA sequence. 11. The expression control DNA sequence is a constitutive promoter or an inducible promoter; 12. The method of claim 10, wherein the member is selected from the group consisting of: a cytomegalovirus promoter. Non-human genetically treated animal. 12. The promoter is lactoferrin, serum albumin, αS1-case In, αS2-casein, β-casein, κ-casein, α-lactalbumin , Whey acidic protein, β-lactoglobulin, cytokines, chemokines and 14. The method of claim 11, wherein said is selected from the group consisting of DNA sequences encoding growth factors. Non-human genetically treated animals. 13. The secretory signal sequence is lactoferrin, serum albumin, αS1- Casein, αS2-casein, β-casein, κ-casein, α-lactalbu Min, β-lactoglobulin, cytokines, chemokines or growth factors. 11. The non-human genetic treatment of claim 10, wherein the non-human genetic treatment is selected from the group consisting of: Animal. 14． Expression control and secretion signal sequences are human, bovine, goat, sheep, cat 11. The non-human of claim 10, which is derived from a dog, rabbit, bird or fish. Genetically treated animals. 15. Claims wherein the promoter is tissue-specific for expression in the target tissue Item 12. The non-human genetically treated animal according to Item 11.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI // C12N 5/10 C12N 5/00 B (C12N 5/10 C12R 1:91) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI , SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 動物において感染性疾患を治療および／または予防する方法であって、 ａ） 治療上有効量の治療タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡをコ ードするＤＮＡ配列のインビボ発現を指示しうるプロモーターに作動可能なよう に連結された前記タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡをコードする ＤＮＡ配列を少なくとも含む組換えＤＮＡ発現系を製造し；そして ｂ） 前記治療タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡの発現のために 、工程ａのＤＮＡ発現系を動物に導入する； の各工程を含む方法。 ２． 疾患の前記治療および／または予防がインサイチオで実施され、前記ＤＮ Ａ発現系が標的組織に導入される、請求項１記載の方法。 ３． 前記ＤＮＡ発現系がトランスジェニック組換え動物細胞である、請求項１ 記載の方法。 ４． 前記細胞が、上皮乳腺細胞、血液細胞、リンパ球、白血球、Ｔ−リンパ球 、Ｂ−リンパ球、赤血球、筋肉細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、肺細胞、分泌細胞お よび非分泌細胞からなる群より選択される、請求項３記載の方法。 ５． 前記ＤＮＡ発現系が、脂質リポソーム、陽イオン性リポソームおよび陰イ オン性リポソームからなる群より選択される、請求項３記載の方法。 ６ 前記ＤＮＡ配列および前記プロモーターが発現ベクター中に挿入される、請 求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の方法。 ７． 前記ベクターがウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、 請求項６記載の方法。 ８． 前記感染性疾患が、細菌、ウイルス、レトロウイルス、寄生虫、真菌、糸 状菌、酵母、プリオンまたはスクラピーにより引き起こされる、請求項１、２、 ３、４、５、６または７のいずれかに記載の方法。 ９． 前記治療タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡが、バクテリオ シン、ランチオニン、ラクトフェリン、リゾチームからなる群より選択される、 請求項８記載の方法。 １０． 前記バクテリオシンおよび／またはランチオニンが、アンビシン、デフ ェンシン、セクロピン、チオニン、メリチン、マガイニン、アタシン、ジフェテ リン、サポニン、カクルチン、ゼノピン、サブチリン、エピデルミン、ｐｅｐ５ 、ラクチシン４８１、アンコベニン、デュラマイシン、ガリデルミンまたはシン ナマイシンである、請求項９記載の方法。 １１． 前記治療タンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡが、免疫グロ ブリン、ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、胆汁酸塩刺激リパーゼまた はリボザイム、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、免疫調節剤および主要組 織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質からなる群より選択される、請求項８記載の 方法。 １２． 前記動物細胞において機能的であり、前記治療タンパク質、ペプチドま たはアンチセンスＲＮＡをコードする組換えＤＮＡに作動可能なように連結され ている、５’および３’発現制御ＤＮＡ配列および分泌ＤＮＡ配列をさらに含む 、細胞請求項３記載の方法。 １３． 組換えタンパク質、ペプチドまたはアンチセンスＲＮＡを全身でまたは 標的組織において生成するための非ヒトトランスジェニック動物であって、前記 動物の全身発現または標的組織細胞における発現のための、前記タンパク質、ペ プチドまたはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に作動可能なように連 結された、発現制御ＤＮＡ配列および分泌シグナル配列をコードする分泌ＤＮＡ 配列を少なくとも含む動物。 １４． 前記発現制御ＤＮＡ配列が、構成性プロモーター、誘導性プロモーター 、サイトメガロウイルスプロモーターからなる群より選択される、請求項１３記 載の非ヒトトランスジェニック動物。 １５． 前記プロモーターが、ラクトフェリン、血清アルブミン、αＳ１−カゼ イン、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン 、乳清酸性タンパク質、β−ラクトグロブリン、サイトカイン、ケモカインまた は成長因子をコードするＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１４記載 の非ヒトトランスジェニック動物。 １６． 前記分泌シグナル配列が、ラクトフェリン、血清アルブミン、αＳ１− カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、α−ラクトアルブ ミン、β−ラクトグロブリン、サイトカイン、ケモカインまたは成長因子をコー ドするＤＮＡ配列からなる群より選択される、請求項１３記載の非ヒトトランス ジェニック動物。 １７． 発現制御および分泌シグナル配列が、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ネコ 、イヌ、ウサギ、トリまたは魚に由来するものである、請求項１３記載の非ヒト トランスジェニック動物。 １８． プロモーターが標的組織における発現に組織特異的である、請求項１３ 記載の非ヒトトランスジェニック動物。[Claims] 1. A method of treating and / or preventing an infectious disease in an animal, comprising: a) A therapeutically effective amount of a therapeutic protein, peptide or antisense RNA Operable to a promoter capable of directing in vivo expression of a DNA sequence to be encoded Encodes the protein, peptide or antisense RNA linked to Producing a recombinant DNA expression system comprising at least a DNA sequence; and b) for expression of said therapeutic protein, peptide or antisense RNA Introducing the DNA expression system of step a into an animal; A method comprising the steps of: 2. Wherein said treating and / or preventing a disease is performed in situ and wherein said DN 2. The method of claim 1, wherein the A expression system is introduced into a target tissue. 3. 2. The DNA expression system is a transgenic recombinant animal cell. The described method. 4. Said cells are epithelial breast cells, blood cells, lymphocytes, leukocytes, T-lymphocytes , B-lymphocytes, erythrocytes, muscle cells, liver cells, kidney cells, lung cells, secretory cells and 4. The method of claim 3, wherein the method is selected from the group consisting of: and non-secreting cells. 5. The DNA expression system comprises a lipid liposome, a cationic liposome and a negative liposome. 4. The method of claim 3, wherein the method is selected from the group consisting of on-liposomes. 6. The DNA sequence and the promoter are inserted into an expression vector. A method according to any one of claims 1, 2, 3, 4 or 5. 7. The vector is a viral vector or a retroviral vector, The method of claim 6. 8. The infectious disease is a bacterium, virus, retrovirus, parasite, fungus, or thread. 1, 2, or 3, which is caused by a fungus, yeast, prion or scrapie. The method according to any one of 3, 4, 5, 6 or 7. 9. Wherein said therapeutic protein, peptide or antisense RNA is Selected from the group consisting of syn, lanthionine, lactoferrin, and lysozyme, The method of claim 8. 10. The bacteriocin and / or lanthionine is ambicine, differential Encin, cecropin, thionine, melittin, magainin, atasin, diphete Phosphorus, saponin, cacurtin, zenopin, subtilin, epidermin, pep5 , Lactisin 481, anchovenin, duramycin, gallidermin or syn 10. The method of claim 9, which is namycin. 11. The therapeutic protein, peptide or antisense RNA Brine, lactoglobulin, α-lactalbumin, bile salt-stimulated lipase or Are ribozymes, cytokines, chemokines, growth factors, immunomodulators and key groups 9. The method of claim 8, wherein the tissue compatible complex (MHC) protein is selected from the group consisting of proteins. Method. 12. Functional in the animal cell, wherein the therapeutic protein, peptide or Or operably linked to a recombinant DNA encoding an antisense RNA. Further comprising 5 'and 3' expression control DNA sequences and secretory DNA sequences 4. The method of claim 3, wherein the cells are cells. 13. Recombinant protein, peptide or antisense RNA systemically or A non-human transgenic animal for producing in a target tissue, wherein said animal is The protein, plasmid for systemic expression in animals or expression in target tissue cells. Operably linked to a DNA sequence encoding a peptide or antisense RNA. Ligated secretory DNA encoding expression control DNA sequence and secretory signal sequence An animal containing at least the sequence. 14． The expression control DNA sequence is a constitutive promoter or an inducible promoter; 14. The method according to claim 13, which is selected from the group consisting of: a cytomegalovirus promoter. Non-human transgenic animal mentioned. 15. The promoter is lactoferrin, serum albumin, αS1-case In, αS2-casein, β-casein, κ-casein, α-lactalbumin , Whey acidic protein, β-lactoglobulin, cytokines, chemokines and 15. The method according to claim 14, wherein is selected from the group consisting of DNA sequences encoding growth factors. Non-human transgenic animals. 16. The secretory signal sequence is lactoferrin, serum albumin, αS1- Casein, αS2-casein, β-casein, κ-casein, α-lactalbu Min, β-lactoglobulin, cytokines, chemokines or growth factors. The non-human trans according to claim 13, which is selected from the group consisting of a DNA sequence to be transfected. Genic animals. 17． Expression control and secretion signal sequences are human, bovine, goat, sheep, cat 14. The non-human of claim 13, which is derived from a dog, rabbit, bird or fish. Transgenic animals. 18. 14. The promoter is tissue-specific for expression in a target tissue. A non-human transgenic animal as described.
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