JPH11504715A

JPH11504715A - 悪性腫瘍に対する薬の治療応答を予測するための方法及びキット

Info

Publication number: JPH11504715A
Application number: JP8533784A
Authority: JP
Inventors: ホーカンソン，レイフ; ホーカンソン，アンニカ; グスタフソン，ベルティル
Original assignee: ランドスティンゲットイーオステルギョトランド
Priority date: 1995-05-12
Filing date: 1996-05-10
Publication date: 1999-04-27
Also published as: US6114128A; ES2151665T3; DE69610496T2; ATE196688T1; PT824696E; GR3034891T3; EP0824696B1; DE69610496D1; WO1996035949A1; EP0824696A1; DK0824696T3; CA2215627A1; SE9501782D0

Abstract

(57)【要約】本発明は患者からの腫瘍の細い注射針吸引物の標本を用いて、ヒト患者の悪性腫瘍に対する薬の治療応答を予測する方法に関する。前記方法は前記標本中の１つの類の細胞に属する細胞の数を、前記標本中の他の細胞に関して同定及び評価し、前記評価と、前記細胞の数とヒト患者における前記腫瘍を指向する前記薬の治療応答のパラメーターの間の相関性を立証する過去に作成された分析とを比較し、比較の結果がヒト患者の前記薬の治療応答を表示している段階を含む。診断キットは、腫瘍の標本を単独の細胞懸濁液にさせる酵素の混合物、前記単独の細胞懸濁液中の腫瘍上の腫瘍と関連する抗原を指向するモノクローナル抗体の混合物であって、前記抗体は第１の標識を有する混合物、及びリンパ球上の２つの特異的抗原を指向する２つの型のモノクローナル抗体の第２の混合物であって、前記抗体はそれぞれ第２及び第３の標識を有する混合物を含む。

Description

【発明の詳細な説明】悪性腫瘍に対する薬の治療応答を予測するための方法及びキット本発明は一般的には薬の治療応答を予測する方法に関する。より詳しくは、本発明はヒト患者の悪性腫瘍を指向する薬の治療応答を予測する方法及び日常的に適用される前記方法を可能にするための診断キットに関する。悪性腫瘍の免疫系による抑制におけるリンパ球の重要性並びに腫瘍においてこれらの細胞の存在が必要なことは数10年も公知であった。しかしながら、だれも細い注射針の吸引物を用いて、腫瘍におけるリンパ球の存在を免疫療法及び上首尾の結果を伴った病気を治療する効果と関連して研究したことがなかった。悪性腫瘍に対して特異的な薬を用いる患者の治療の結果はしばしば予測不能である。患者の約15〜20％のみが各タイプの治療薬に応答する。薬を受け入れる患者は、しばしば用いられた薬から逆の反応が得られるので、不必要な苦痛を受ける。たいていは、薬の効果は３〜６ケ月の治療の後でないと分からない。悪性腫瘍の治療用の薬はしばしば高価であって、もしも用いられた薬が効果的でないなら、相当なコストの削減が得られるだろう。したがって、治療の開始前に応答する高い確率を有する患者を同定できるなら、非常に重要であろう。たとえば、インターフェロン−アルファ(IFN−α)は悪性腫瘍に対して文書で証明された活性を有する。週３回の 500〜 100万単位の IFN−αは、合理的な副作用という代償を払って最適投与範囲であるようだ(Legha他)。治療効能は種々の研究で異なり(Creagan他、Gundersen，Legha他)、 IFN-αのみに対する総体的な応答速度（CR＋PR）は約20％だけである(Creagan他、 Legha他)。したがって、もしもこの治療に応答する高い確率を有する患者を予測試験を用いて同定できるなら相当な改良となるであろう。抗増殖活性を持つことは別にして（Balkwill他、 Rivie re他）、 IFN−αの抗腫瘍効果は、腫瘍細胞の活性調節、たとえば、２，５−Ａシンセターゼの誘発または細胞表面タンパク質、MHＩ及び腫瘍の免疫学的調節に重要である腫瘍関連抗原の増加した発現によることがある。さらに、 IFN−αはいくつかの免疫機能を調節する(12 Friedman)。これらの IFN−αの活性の内、抗腫瘍活性について何が最も重要なものであるのか、またはそれらすべてが貢献するのかを示す確固たるデータはまだない。 IFN−αは、免疫系の種々の細胞の活性、たとえば、マクロファージ、NK−細胞、細胞毒性Ｔ−細胞及びＢ−細胞機能を調節するので（Friedman他）、治療効果は IFN−α療法を開始した時の患者の免疫状態に依存するのかもしれない。悪性黒色腫に対する免疫反応性は自発的退縮(Mc Govern他、 Sondergaard他、 Ronan他、Kang他)、黒色腫に関連する抗体に対する予後の重要な抗体及び特異的細胞毒性リンパ球の発生(Abershold他)として証明された。しかしながら、原発性悪性腫瘍におけるリンパ球の浸潤の予後の重要性に関して矛盾する結果が報告された。いくつかの研究は原発性病害にリンパ球の顕著な浸潤があった場合に、有意により良い予後を見出したが（Hansen他、Larsen他）、他の者はそのような相関性を見出さなかった(Balch他)。３つの研究も腫瘍の厚みとリンパ球の浸潤に関連を見出した(Balch他、Hansen他、Larsen他)。この矛盾をさらに Mc Gov ern他が研究し、端でのリンパ球浸潤に対して、黒色腫の基部でのリンパ球浸潤は予後の有意性となることを見い出した。これらの著者は腫瘍基部でのリンパ球浸潤は、腫瘍の厚みが増加するにつれ減少したことも見出した。したがって、悪性腫瘍を治療する合理的な方法は、この型の悪性腫瘍に対する免疫反応性に基づいて、免疫活性を調節する物質、たとえば、インターフェロン及びインターロイキン−２による抗腫瘍免疫反応性を増強することであろう。本発明の目的は、ヒト患者における悪性腫瘍に対する薬の治療応答を、前記患者からの前記細い注射針の吸引物の標本を用いて予測する方法を生成することである。したがって、本発明による方法はリンパ球の蓄積物の腫瘍における直接的診断に基づく。この目的を達成するために、本発明の方法は請求項１の特徴とする要件を与えられた。薬の治療応答を予測する方法は、局部的並びに全身の転移形成を有する患者に関する。本発明による方法により、免疫療法を予測し、監視することも可能である。材料及び方法患者のデータこの報告は転移した悪性黒色腫の患者41人、男性23人及び女性18人を包含する。中間の年令は60才（33〜77才の範囲）で、カルノフスキー実績状況は70以上であった。すべての患者は組織学的に悪性腫瘍であることが立証され、治療の開始前に細胞学的に再発が立証されていた。20人の患者には局部的な転移があり（20 人はリンパ節転移）、それらは一般に IFN−α治療の１〜３週間後に切除され、 21人の患者は次の転移部位を有する全身的な病気であった。すなわち、皮膚２人、皮下５人、リンパ節16人、肺７人、骨３人及び内臓（肝臓の転移９人、卵巣の転移１人、外陰部の転移１人、副腎腺の転移１人及び脾臓の転移３人）16人であった。転移の部位の数は、７患者が１、５患者が２、４患者が３、１患者が４人で、４患者が５以上であった。どの患者も原発性の病害または転移の切除以外は過去に治療を受けていなかった。脳の転移の症状をもつ患者はこの研究に包含させなかった。患者の評価治療前調査はECG(心電図)、腹部CT／US（コンピューター化トモグラフィ／超音波）、胸部Ｘ線、クレアチニンの測定のための骨のシンチグラフィー及び血液標本、ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼ、アルカリ性−アミノトランスフェラーゼ、乳酸−デヒドロゲナーゼ、アルファアミラーゼ、ヘモグロビン、白血球及び血小板を包含した。治療スケジュール 12人の患者（４人は局部的な病気及び８人は全身的な転移）を包含する試験的な研究では、 IFN−αを 10⁶IUの用量で週に３日皮下に与えた。この試験的な研究では、 IFN−αの治療効率を増強する試みにおいて、 IFN−αに加えて、シクロホスファミド及びインドメタシンを与えることを決定した。患者を３週間毎に静脈ボーラス注射で投与された 300mg／ｍ²の用量のシクロホスファミドで治療し、これらの患者の内６人は毎日３回、50mgのインドメタシンでも治療し、この６人の内１人にはさらに毎日２回 400mgのシメチジンを与えた。腫瘍応答を局部的な切除可能な病気の患者では１〜３週間後に、及び離れた転移の患者では、１サイクルが３週間である、１〜３治療サイクル後に評価した。試験研究に、29人の患者（16人は局部的な切除可能な病気で13人は全身の病気）を包含する確認研究が続き、患者は IFN−αのみを皮下で10miljIUの投与量で週に３回、 IFN−α治療の結果のためにリンパ球に浸潤するCD4+腫瘍の予測値を示すために治療を受けた。局部的な切除可能な病気の患者では、外科手術の前の１〜３週間の間治療を受け、離れた転移を有する群では３週間の治療後、治療の無い１週間が続いた。確認研究では、どちらの群にも他の治療を加えなかった。局部的な切除可能な転移の患者では第１サイクル後に、離れた転移を有する患者では１〜３治療サイクル後に腫瘍応答を評価した。応答速度または炎症性細胞に浸潤する腫瘍の組織病理学的退縮に関して２つの研究の間に差が見出されなかったのでそれらの結果を最終分析のために加えた。モノクローナル抗体 CD ４（Leu-3a，Becton-Dickinson）：抗体はヘルパーＴサブセット上で、単球上に低密度で、単球及びマクロファージの細胞質中に存在する。 CD ８（Leu-2a，Becton-Dickinson）：抗体は細胞毒性／サプレッサーリンパ球上に存在する。抗体はいくつかのLeu-11+(CD16)細胞毒性NK細胞上、Leu-7+(HNK- 1)細胞（細胞毒性及びNK活性を有していない）の小集団上に、いくつかのLeu-8+ 細胞（Ｂ−細胞機能の抑制に関係する）上に、そしてサプレッサー機能と関連するLeu-15+(CD11b)細胞上にも発現される。 CD11c(M5，Becton-Dickinson)：抗体は単球上に、顆粒球上に低密度で、そして、末梢血液中で大きな顆粒状リンパ球として存在する。それは、正常なリンパ組織中のマクロファージ上に、肝臓中のクッパー細胞上に、そして肺組織中の肺胞マクロファージにも発現される。転移の細い注射針吸引通常 0.1mmの皮下注射針を用いて各腫瘍から７〜10吸引を行った。吸引物をガラススライド上になすりつけ、空気中で乾燥させた。次いで少なくとも２枚のなすりつけ標本をメイ−グルネバルド−ギームサ（May-Grunewald-Giemsa）法にしたがって慣用の細胞形態学のために染色した。腫瘍細胞中に明らかなメラニン顔料のない場合には、黒色腫の診断はビメンチン及びタンパク質 S-100についての免疫染色で確認した。退化または壊死の形態学的徴候を記録した。細い注射針吸引物の免疫学的染色スライドを空気乾燥させ、次にアセトン中で５分間固定した。乾燥後、スライドをリン酸緩衝化塩類液(PBS)、pH 7.6中で洗浄し、CD４，CD８及びCD11c(上記参照)に対するモノクローナル抗体を30分間インキュベートした。マウスのIgG（ sigma、ストックホルム，スウェーデン）を負の対照として用いた。 PBSで洗浄後、切片をウサギ抗−マウス免疫グロブリン(Dakopatts Z 259)とインキュベートし、30分間インキュベートし、 TBSで洗浄し、 PAPマウスモノクローナル抗体 (Dakopatts，P850)と30分間インキュベートした。 TBSで洗浄後、スライドを３％のH₂O₂中でジアミノベンジリデン(DAB)(Sigma、ストックホルム，スウェーデン)を用いて６分間処理し、洗浄した。スライドをマイヤーヘマトキシリン中で15分間向流染色し、洗浄にグリセルゲル（Glycergel，Dakopatts、スウェーデン）上に載せた。すべてのインキュベートは湿った室の中で行った。腫瘍生検の調製物及び組織切片の免疫学的染色切除可能な腫瘍からの生検を直ちに素早く冷凍し、さらに加工するまで−70℃ で貯蔵した。厚さ６〜７μｍの冷凍した組織切片をアセトン中で10分間固定し、次いで空気乾燥した。それらをトリス緩衝化塩類液(TBS)、pH 7.6中で５分間洗浄し、一次抗体CD４，CD８及びCD11c(上記参照）と30分間インキュベートし、次いで TBS中で５分間洗浄した。マウスのIgG（sigma、ストックホルム，スウェーデン）を負の対照として用いた。次に切片をウサギ抗−マウス免疫グロブリン（Dakopatts，Z 259）と30分間インキュベートし、 TBS中で洗浄し、 APAAPマウスモノクローナル抗体(Dakopatts D 651)と30分間インキュベートした。 TBS中で洗浄及びアルカリ性ホスファターゼ基質(Naphtol AS-MXリン酸塩) ２mg(Sigma N4875)、ジメチルホルムアミド 0.2ml、 0.1Ｍトリス緩衝液pH8.2 9.8ml、１Ｍレバミソール50μｌ（Sigma L 9756）及びファスト−レッドTR塩10m g（Sigma F 1500）と20分間インキュベート後、切片を再度 TBS中で洗浄した。次いでそれらをマイヤーヘマトキシリン中で15分間向流染色し、グリセルゲル (Dakopatts、スウェーデン)中に載せた。すべてのインキュベートを湿った室で行なった。単核細胞の評価浸潤する炎症性細胞のたびたびの異種性分布のため、顕微鏡視域当りの細胞を数えることを行なわなかった。代りにこれらの細胞の各サブセットの総発生を腫瘍細胞の数に関連して、−（不在）、＋（まばら、少数）、++（中位）、+++（高い）として、２人の調査者により独立に評価した。リンパ球として評価したCD 4+細胞は小さい核及び別個の細胞膜をもったまばらな細胞質を有していた。これに対し、CD4+マクロファージは大きな核及び豊富な一般にかすかに着色している細胞質を見せた。腫瘍退縮の基準他の研究の原発性黒色腫の退縮の記載に基づいて(Mc Govern他、Kang他、 Son dergaard他、 Ronan他)、次の腫瘍退縮の基準をこの研究で用いた。すなわち、１．腫瘍細胞の低及び可変密度、特に同じ腫瘍結節内の密度の変異、２．間質組織で取り囲まれた残存腫瘍細胞の巣を有する腫瘍の構造の無秩序である。退縮域の発生は、退縮の徴候無しから、ほんの少数の残存腫瘍細胞を有するほとんど完全な腫瘍の破壊まで変化する。切除した転移を有する患者のこの研究で用いられた腫瘍の退縮変化の発生は25 ％より少（わずかな退縮）、25〜75％及び75％より大（著るしい退縮）であると評価された。統計学的方法腫瘍応答を有する患者と進行性の病気の患者の炎症性細胞の分布の差をカイ二乗検定法を用いて分析した。例１治療効能２つの患者の群、すなわち、切除可能な局部的転移の患者と全身の転移の患者を研究した。後者の群では IFN−α治療の効果を腫瘍の大きさの減少として測定した。この研究の主な目的は IFN−αの抗腫瘍効果についての腫瘍浸潤炎症性細胞の重要性を分析することであったので、混合応答を有する患者における有意な腫瘍退縮（25％より大）及び部分的寛解の基準を満たさない退縮を記録し、次の分析に用いた。21人の患者の内全身性転移の患者11人は腫瘍の大きさが減少した。１人は完全な寛解で、４人は部分的寛解、３人は25〜50％の間の測定し得る腫瘍の減少、３人は混合した応答、10人は進行性の病気であった。局部的な切除可能な転移の患者は、外科手術を遅らせないという重要性のため、１〜３週間のみ IFN−αで治療した。もちろん、これは腫瘍の大きさのみの測定に基づく治療効能の適切な決定を可能にするには時間が短かすぎる。したがって、この群の治療効果の決定は腫瘍生検の組織病理学的試験における腫瘍退縮の発生に基づいた。進行中の退縮の転移は一般的にCD4+及びCD8+リンパ球並びにCD 11c+マクロファージにより広がる。悪性黒色腫の自発的退縮の徴候のための組織病理学的基準は原発性腫瘍に記載されてきた。このような基準（上記）に基づき、局部的転移の９人の患者は切除された転移の著るしい組織病理学的退縮を有し、11人の患者はほんのわずかの退縮性変化を有した。腫瘍退縮（大きさの減少または組織病理学的退縮性変化の発生として決定した）に関して、試験的研究と確認研究の間に差が見出されなかったので、これらの研究の患者を下記の分析においていっしょにした。 IFN−αで１週間治療した数人（５人）の患者で得られた結果は、２〜３週間の治療後の結果と異ならないようであった。したがって、すべての患者を次の分析でいっしょにした。腫瘍浸潤単核細胞(MNC)のサブセット細い注射針吸引物をリンパ節、皮下及び肝臓転移から得た。これらの吸引物における腫瘍浸潤単核細胞の発生を IFN−α治療の開始前に研究した。異なった転移からの吸引物中の種々のサブセットの単核細胞の数及び分布は相当な個体変化を示した（表１）。治療前には、局部的転移の20人の患者の内10人からの転移において、高い数の CD4+細胞が見出された。高い数のCD4+細胞を有するすべての患者において、これらの細胞の50％よりも多くが、リンパ球の形態学的な特徴を示した。これに対して、これらの細胞の低い数の腫瘍では、６人の患者の内２人でCD4+マクロファージがCD4+リンパ球より富んでいた。中位の数のCD4+細胞を有する患者では、４人の患者の内２人はマクロファージがリンパ球よりも富んでいた。全身的な転移の患者では、高い数のCD4+細胞が治療前の21人の患者の内４人に見出され、その結果は局部的な病気の患者で見い出された頻度とは有意に異なっている（Ｐ＜0.05）。これらの患者のすべてで、CD4+細胞の50％より多くがリンパ球の形態学的特徴を示した。低い数のCD4+細胞を有する患者からの吸引物では、10人の患者の内１人においてマクロファージがリンパ球よりも富んでいた。中位の数のCD4+細胞を有する患者では、７人の患者の内１人がマクロファージがリンパ球よりも富んでいることが分かった。局部的な病気の患者では、19人の患者の内７人においてCD4+細胞がCD8+細胞に対して多かった。10人の患者ではいずれのサブセットも優勢ではなく、２人においてはCD8+細胞がCD4+細胞に対して多かった。治療前の局部的な病気の19人の患者の内４人に高い数のCD11c+マクロファージが見出された。全身的な病気の群では、20の腫瘍の内５に高い数が見出された。 IFN−α治療後の細い注射針吸引物及び生検における炎症性細胞の発生を20人の患者で比較した。たとえ IFN−αがこれらの細胞の補充に影響を及ぼしたとしても、一般に非常に良い相関性があった。吸引物に比較して組織切片における低い数のCD4+細胞が20人の患者の内３人にのみ見出された。これらの３人の患者の内１人は応答者であった。すべての生検は変化量の正常なリンパ節の残余を含有していた。これはこの矛盾を説明するかもしれない。代りに IFN−α治療の間に下方調節が起こったのかもしれない。２人の生検は吸引物に比較してCD4+細胞の増加を示し、それらの内の１人は応答者であった。リンパ節の転移の大きさは残存する正常なリンパ節の存在に関して、いくらかの参考になるようである。正常なリンパ節の残余は、直径20mmより小さい13のリンパ節転移の内７に見出され、これに対してより大きな大きさのリンパ節転移では７の内たったの２に見出された。 IFN −α治療への応答に対する相関性 IFN−αの治療効果に関連する炎症性細胞の発生は全身性の転移の患者については表２に、局部的な切除可能な転移については表３に示す。明らかに、これらの両方の患者の群で抗腫瘍効果とCD4+リンパ球の存在の間に非常に良い相関性がある。離れた転移を有する応答する患者からの吸引物中のこれらの細胞の発生は進行性の腫瘍の患者からのものと有意に異なる(Ｐ＝0.007)。同様な差が転移においてほんの少しの退縮性変化または退縮性変化のない患者に比較して、局部的転移の患者、 IFN−α治療後著るしい組織病理学的退縮性変化を示す転移においてより多いCD4+リンパ球を有する患者についても見出される(Ｐ＝0.077)。驚くべきことに、CD8+またはCD11c+細胞の発生と IFN−α治療への応答には、局部的な病気においても全身性の病気においても相関性はなかった。本発明によると特異的な類の細胞の発生と腫瘍に対する薬への治療応答との間に良好な相関性が得られた。示された例においてはこの相関性はヘルパーＴサブセットと IFN−αの治療の恩恵とに相関性が得られた。局部的な病気の患者では細い注射針吸引物中の高い数のこれらの細胞を有する10人の患者の内７人は著るしい組織病理学的腫瘍退縮を達成した。これに対して低い数のこのサブセットの細胞を有する患者では６人の患者の内５人がその腫瘍のわずかな退縮のみを達成した。離れた転移を有する群では、腫瘍における中位または高い浸潤のこのサブセットの細胞を有する11人の患者の内10人は腫瘍退縮を達成した。これに対して、これらの細胞の低浸潤を有する患者の10人の内９人は進行性の病気であった。これらの結果に基づくと、 IFN−αによる治療を成功させるにはこの治療の開始前に、腫瘍に浸潤するこのサブセットの細胞が必要であるようである。したがって、これらの細胞の浸潤の程度がこの療法に適切な患者を選択するための有用な予測試験であるようである。患者からの腫瘍の細い注射針吸引物を用いる診断技術を簡単にそして容易にするために診断キットの使用を応用する。このようなキットの例を下記に示す。コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ及び DNAアーゼの酵素混合物中に吸引物を懸濁させることにより細い注射針吸引物の単独の細胞懸濁液を調製する。腫瘍細胞上の抗原に関連する腫瘍を指向する１つの型の蛍光色素（型Ａ）で標識されたモノクローナル抗体の混合物をこのようにして得られた細胞懸濁液に加える。次に、リンパ球上のCD３（Ｔ−リンパ球マーカー）及びCD４抗原を指向するモノクローナル抗体、すなわち、型Ｂの蛍光色素で標識された抗− CD４抗体及び型Ｃの蛍光色素で標識された抗−CD４抗体、の混合物を加える。このような二重染色はCD4+リンパ球を同定し、CD4+単球／マクロファージを算えることを回避するために用いられる。次に腫瘍及び二重染色リンパ球の数をフローサイトメトリーによって測定する。本発明により高比率のCD4+リンパ球／腫瘍細胞は免疫療法の応答者を同定する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年４月３０日【補正内容】請求の範囲１．ヒト患者からの悪性腫瘍の細い注射針吸引物の標本を用いて、前記患者の前記腫瘍に対する薬の免疫療法における治療応答を予測する方法であって、前記方法は、前記標本中の１つの類の細胞に属する細胞の数を、前記標本中の他の細胞に関して同定及び評価し、前記細胞の数とヒト患者における前記腫瘍を指向する前記薬の治療応答のパラメーターの間の相関性を立証する段階を含み、前記相関性の結果が前記ヒト患者における前記薬の治療応答を表示していることを特徴とする前記方法。２．前記薬が免疫活性調節剤であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記類の細胞が腫瘍浸潤単核細胞のサブセットであることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．前記サブセットの腫瘍浸潤単核細胞がヘルパーＴサブセットであることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記腫瘍が転移悪性黒色腫で前記薬がインターフェロン−アルファであることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．前記細胞を免疫学的染色により同定及び評価することを特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記免疫学的染色をモノクローナル抗体を用いて行うことを特徴とする請求項６に記載の方法。８．ヒト患者における悪性腫瘍を指向する薬の治療応答を予測する時に免疫療法への応答者を同定するのに有用な診断キットであって、前記キットは、前記患者からの前記腫瘍の細い注射針吸引物の標本を単独の細胞懸濁液にさせる酵素の混合物、前記単独の細胞の懸濁液中の腫瘍細胞上の腫瘍会合抗原に指向するモノクローナル抗体の第１混合物であって、前記抗体は第１の標識を有するものである前記混合物及び、リンパ球上の２つの特異的抗原に指向する２つの型のモノクローナル抗体の第２の混合物であって、前記２つの型の抗体はそれぞれ、第２及び第３の標識を有するものである前記混合物を含み、腫瘍細胞の数及び二重染色されたリンパ球は血液勘定による測定のために調製されたものであることを特徴とする前記キット。９．前記酵素の混合物はコラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ及び DNAアーゼを含むことを特徴とする請求項８に記載の診断キット。 10．前記２つのリンパ球上の特異的抗原がCD３及びCD４抗原であることを特徴とする請求項８に記載の診断キット。 11．前記第１の標識が型Ａの蛍光色素で、第２標識及び第３標識がそれぞれ型Ｂ及びＣの蛍光色素であることを特徴とする請求項８に記載の診断キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ホーカンソン，アンニカスウェーデン国，エス−590 50 ビキングスタッド，ビキングスタッドプレーストゴート (72)発明者グスタフソン，ベルティルスウェーデン国，エス−582 53 リンコーピング，リンデンガタン 27

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト患者からの悪性腫瘍の細い注射針吸引物の標本を用いて、前記患者の前記腫瘍に対する薬の治療応答を予測する方法であって、前記方法は、前記標本中の１つの類の細胞に属する細胞の数を、前記標本中の他の細胞に関して同定及び評価し、前記評価と、前記細胞の数とヒト患者における前記腫瘍を指向する前記薬の治療応答のパラメーターの間の相関性を立証する過去に作成された分析とを比較する段階を含み、前記比較の結果が前記ヒト患者の前記薬の治療応答を表示していることを特徴とする前記方法。２．前記薬が免疫活性調節剤であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記類の細胞が腫瘍浸潤単核細胞のサブセットであることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．前記サブセットの腫瘍浸潤単核細胞がヘルパーＴサブセットであることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．前記腫瘍が転移悪性黒色腫で前記薬がインターフェロン−アルファであることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．前記細胞を免疫学的染色により同定及び評価することを特徴とする請求項１に記載の方法。７．前記免疫学的染色をモノクローナル抗体を用いて行うことを特徴とする請求項６に記載の方法。８．ヒト患者における悪性腫瘍を指向する薬の治療応答を予測する時に免疫療法への応答者を同定するのに有用な診断キットであって、前記キットは、前記患者からの前記腫瘍の細い注射針吸引物の標本を単独の細胞懸濁液にさせる酵素の混合物、前記単独の細胞の懸濁液中の腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原に指向するモノクローナル抗体の第１混合物であって、前記抗体は第１の標識を有するものである前記混合物及び、リンパ球上の２つの特異的抗原に指向する２つの型のモノクローナル抗体の第２の混合物であって、前記２つの型の抗体はそれぞれ、第２及び第３の標識を有するものである前記混合物を含み、腫瘍細胞の数及び二重染色されたリンパ球は血液勘定による測定のために調製されたものであることを特徴とする前記キット。９．前記酵素の混合物はコラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ及び DNAアーゼを含むことを特徴とする請求項８に記載の診断キット。 10．前記２つのリンパ球上の特異的抗原がCD３及びCD４抗原であることを特徴とする請求項８に記載の診断キット。 11．前記第１の標識が型Ａの蛍光色素で、第２標識及び第３標識がそれぞれ型Ｂ及びＣの蛍光色素であることを特徴とする請求項８に記載の診断キット。