JPH11504348A

JPH11504348A - Ｇｍ２の合成方法

Info

Publication number: JPH11504348A
Application number: JP9529398A
Authority: JP
Inventors: シュミット，リヒャルト; カストロ，パロミノ，ユリオ，ツェー; ドール，アンドレアス; リッター，ゲルト; オールド，ロイド，ジェイ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1997-02-05
Publication date: 1999-04-20
Anticipated expiration: 2017-02-05
Also published as: AU712149B2; DE69723926T2; EP0821691A4; US5756695A; WO1997030061A1; JP2001316397A; DE69723926D1; AU1858697A; ATE246697T1; EP0821691A1; EP0821691B1; JP3220704B2; CA2217708A1

Abstract

(57)【要約】ガングリオシドＧＭ２の合成方法が開示される。この方法は、触媒の存在下でトリサッカリド化合物とグリコシル供与体化合物を反応させる工程を含む。

Description

【発明の詳細な説明】ＧＭ２の合成方法発明の分野本発明は、合成ＧＭ２の製造方法に関する。本発明の方法によって製造される合成ＧＭ２は、９５％以上の純度を有し、牛脳由来のＧＭ２と同一の、抗−ＧＭ２抗体との免疫反応性を有する。発明の背景ガングリオシドは、糖脂質の１つのクラスの分子である。種々のガングリオシドが、メラノーマや他の神経外胚葉起源の腫瘍を含む様々な形質転換細胞の、顕著な細胞表面構成物質として同定されてきた。ここにその両方を参考文献として引用する、リッター(Ritter)およびリヴィングストン(Livingston)他，Sem.Canc .Biol.，2:401-409(1991)及び、エットゲン（Oettgen），VCH Verlags Gesellsh aft(Weinheim Germany 1989)、等を参照のこと。ガングリオシドは、シアル酸残基によるグリコシル化の程度によってモノ−、ジ−、トリ又はポリシアロガングリオシドとして知られている。“ＧＭ１”、“ ＧＤ３”、“ＧＴ１”、等を含むこれらの分子を識別するために用いられる略記において、“Ｇ”はガングリオシドであることを表し、“Ｍ”、“Ｄ”又は“Ｔ ”等はシアル酸残基の数を表し、そして数字又は数字＋文字（例えば、“ＧＴ１ａ”）は、その分子にみられる結合パターンを表す。レーニガー（Lehninger），Biochemistry,pg.294-296(Worth Publishers，1981); Wiegandt，Glycolipids : New Comprehensive Biochemistry(ノイベルガー（Neuberger）他，ed.，Elsev ier，1985)，pp.199-260.を参照のこと。モノシアロガングリオシドＧＭ２は下記の構造を有する。ガングリオシドは、メラノーマ等の形質転換細胞における有力な細胞表面マーカーである。このことによってガングリオシドは、ガン研究にとって魅力のあるターゲットとなってきた。ここに参考文献として引用する、リヴィングストン(L ivingston)他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84:2911-2915(1987)には、ワクチンを基礎とする試験の結果を開示している。そこにおいて、メラノーマをわずらう患者がワクチンとして、高レベルのＧＭ２を発現する細胞そのもの、純粋なＧＭ２、又は、純粋なＧＭ２にバクテリア・アジュバントを加えたもののいずれかを投与されている。ここにその両方が参考文献として引用され、ＧＭ２のワクチンとしての使用について開示している、リヴィングストン（Livingston）他，J. Clin.Oncol.，12(5): 1036-1044(1994)、及びアイリー（Irie）他,米国特許第４，５５７，９３１号も注目される。ガングリオシドの免疫学に特有の難問も存在するが、ここでそれについて簡単にふれておく。まず第１に、これらの分子は形質転換細胞において、優勢である一方で、神経細胞のようないくらかの正常細胞においても普通に存在する。患者にガングリオシドを投与する際、その結果としておこる抗体応答が正常細胞に損傷を与えるであろうというリスクが存在する。事実、ギャン−バレー症候群のような、ある種の自己免疫疾患は、ＧＭ１又はＧＱ１ｂと反応する自己免疫抗体によって特徴づけられる。例えば、ユウキ（Yuki）他，J.Exp.Med.，178: 11771-1775(1993); アスピナル（Aspinall）他，Infect & Immun.，6295):22122-2125(1994)を参照のこと。他にもう１つ実際的な問題がある。というのは、免疫処置プロトコールに十分な量の、高純度のガングリオシドを確保するのは非常に困難であるということである。実際的に利用できる合成方法は現在のところ存在しない。結果として、ガングリオシドは、ウシの脳組織などの、組織からの精製によって確保されている。しかし、最適条件化においてでさえ、純粋なガングリオシドの収率は、特にＧＭ２については、ほとんどないくらいに小さい。さらに哺乳類の組織からの精製には、ウイルス、プリオン粒子、等のようなコンタミナントの伝染というリスクがともなう。従って、ガングリオシド特異的抗体を確保する、既存のものに代わる方法が強く望まれる。ガングリオシドは重要であるので、純粋なガングリオシドを高い収率で合成する方法を開発することが望まれる。本出願の発明者らは高い収率で純粋なＧＭ２を合成する新規な方法を開発した。合成ＧＭ２を作り出す他の方法はハセガワ（Ha segawa）他，J．Carbohydrate Chemistry，11(6):699-714(1992)及びスギモト（ Sugimoto）他，Carbohydrate Research，156:c1-c5(1986)に開示されている。ここに開示する方法は、これらの参考文献によって示唆されておらず、ここに開示する本発明は当該技術を発展させるものである。発明の概要本発明は、ＧＭ２の合成方法に関する。第１の方法では、トリサッカリド化合物IIIａ又はIIIｂとグリコシル供与体化合物IVが触媒の存在化でグリコシル化され、テトラサッカリド化合物Ｖａ又はＶｂが得られる。化合物Ｖａ又はＶｂからＮ−トリクロロエチオキシカルボニル基が除去され、アセトアミド基が遊離状態となり、アセトアミド誘導体化合物VIａ又はVIｂが得られる。化合物VIａ又はVI ｂは脱ベンジル化及びＯ−アセチル化され、化合物VIIａ又はVIIｂが得られ、これがその後ＧＭ２に変換される。第２の方法では、トリサッカリド化合物IIIａ又はIIIｂとグリコシル供与体化合物VIIIが触媒の存在化でグリコシル化され、化合物IXａ又はIXｂが得られる。化合物IXａ又はIXｂは、アセトアミド誘導体化合物VIａ又はVIｂに変換される。化合物VIａ又はVIｂは脱ベンジル化及びＯ−アセチル化され、化合物VIIａ又はV IIｂが得られ、これがその後ＧＭ２に変換される。第３の方法では、トリサッカリド化合物IIIａ又はIIIｂとグリコシル供与体化合物Ｘが触媒の存在化でグリコシル化され、そのグリコシル化生成物が引き続き（ｉｎｓｉｔｕ）、無水酢酸中で亜鉛で処理されると化合物VIａ又はVIｂが得られる。化合物VIａ又はVIｂは脱ベンジル化及びＯ−アセチル化され、化合物VI Iａ又はVIIｂが得られ、これがその後ＧＭ２に変換される。図面の簡単な説明前記の簡単な説明、及び、本発明のさらなる目的と特徴が、後述の、本発明の、例示的ではあるが、好適な実施例の詳細な説明を添付の図面と結び付けて参照することによって、より完全に理解されるであろう。添付の図面において、図１は、図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃからなり、本発明によるＧＭ２の製造に使用される方法と化合物の概略図を表している。図２は、シアル酸含有化合物をレゾルシノールで染色した本発明の合成ＧＭ２の薄膜クロマトグラフィーを表している。図３は、脂質含有化合物を気体ヨウ素で染色した本発明の合成ＧＭ２の薄膜クロマトグラフィーを表している。図４は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）による、本発明の合成ＧＭ２及びウシ脳由来ＧＭ２と、ｍＡｂ１０．１１との免疫反応性を表している。図５は、固相酵素免疫検定法による、本発明の合成ＧＭ２及びウシ脳由来ＧＭ２と、ｍＡｂ４５．１１４との免疫反応性を表している。図６は、本発明の合成ＧＭ２及びウシ脳由来ＧＭ２と、ウシ脳由来ＧＭ２をワクチン接種されたメラノーマ患者から得られた血清との免疫反応性を表している。そして、図７は、免疫薄膜クロマトグラフィーによる、本発明の合成ＧＭ２及びウシ脳由来ＧＭ２と、ｍＡｂ１０．１１との免疫反応性を表している。発明の詳細な説明本発明は、ＧＭ２の合成方法に関する。第１の方法では、GM３関連トリサッカリド（図１Ａの化合物IIIａ及びIIIｂ、ここで好適実施例においてＲ＝ベンジル又はＲ＝ピバロイルである）が得られる。これらの化合物は公知のシアリル供与体（化合物Ｉ（図１Ａ）、ここでＲは好ましくはエチルである）と、公知のグリコシル受容体（図１Ａの化合物II、ここでＲは好ましくはベンジル又はピバロイルである）を用いて得られる。（ここに参考文献として引用する、ティ・ジェイ・マーティン(T.J.Martin)他，GlycoconjugateJ.，Vol.10，p.16-28(1993)、及びムラセ(Murase)他，Carbohydr．Res.，Vol.184，pp.C1-C4(1984)を参照のこと。）ここで、触媒として、トリフルオロメタンスルホン酸スズ（II）、トリフルオロメタンスルホン酸イッテルビウム（III）、トリフルオロメタンスルホン酸銅（II）、トリフルオロメタンスルホン酸銀（Ｉ）、及び関連金属のトリフルオロメタンスルホン酸塩が用いられる。これらの触媒は、一般に用いられていた触媒であるトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ティ・ジェイ・マーティン(T.J.Martin)他，前出）よりも優れている。従って、所望の化合物IIIのα−生成物がより高い収率で得られる。エチル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−（Ｎ−トリクロロエチオキシカルボニル）−アセトアミド−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物IV、図１Ａ）と、化合物IIIとを、プロモーターシステムとしてＮ −ヨードスクシンイミド（ＮＩＳ）及びトリフルオロメタンスルホン酸の存在下で直接反応させると、ベンジルＯ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−（Ｎ−トリクロロエトキシカルボニル）アセトアミド−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−｛[メチル（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）オネート]−（２−３）｝−２，６−ジ−Ｏ− ベンジル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−２，３，６−トリ−Ｏ −ベンジル−ａ／ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（化合物Ｖａ、図１Ａ）又は、ベンジルＯ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−（Ｎ−トリクロロエトキシカルボニル）アセトアミド−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１ −４）−｛[メチル（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）オネート]−（２−３）｝−２，６−ジ−Ｏ−ベンジル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−ピバロイル −ａ／ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（化合物Ｖｂ、図１Ａ）がそれぞれ得られる。化合物Ｖａ又はＶｂは、次に、酢酸中の亜鉛に促進されて、Ｎ−トリクロロエチオキシカルボニル基が除去され、アセトアミド基が遊離状態となり、ベンジルＯ −（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−ｂ− Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−｛[メチル（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α− Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）オネーテル]−（２−３）｝−（２，６ −ジ−Ｏ−ベンジル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）− （１−４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α／ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（化合物VIａ、図１Ａ）又は、ベンジルＯ−（２−アセトアミド−３，４，６− トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−｛[メチル（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル− ３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）オネーテル]−（２−３）｝−（２，６−ジ−Ｏ−ベンジル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−ピバロイル− α／ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（化合物VIｂ、図１Ａ）がそれぞれもたらされる。次に、Ｏ−ベンジル基の除去とそれに続く、標準条件下でのピリジン中の無水酢酸での処理により、合成生成物VIIａ及びVIIｂ（図１Ａ）が生成し、それらは次に、公知の方法を用いてＧＭ２へと変換される。（ここに参考文献として引用する、アール・アール・シュミット（R.R.Schmidt）他，Angew．Chem Int．Ed． Engl.，Vol.25，p.725-726(1986)及びLiebigs Ann．Chem．p.449-464(1994)を参照のこと。）IIIａ及びIIIｂと、グリコシル供与体として、より反応性の高いＮ −アシル基を有する公知のメチル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−（Ｎ− アセチル）アセトアミド−２−デオキシ−１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ジェイ・シー・カストローパロミノ（J.C.Castro-Palomino）他，Tetrahedr on Lett．Vol.36，p.6871-6874(1995)を参照のこと）とを反応させると、主にＮ／Ｏ−アセチル基転移がおこり、従って化合物Ｖａ及びＶｂの高い生成収率を得ることが妨げられた。それゆえ、化合物IVａ及びIVｂそして選択的に除去可能なＮ−カルボニル基（例えば、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル等）を有する構造的関連のある化合物が、ガラクトース残基の、この妨害された位置にある４−ヒドロキシ基において、高いグリコシド収率を得るための理想的なグリコシル供与体である。それに加えて、これらのグリコシル供与体は所望のＮ−アセチルガラクトサミン残基において、遊離のアミノ基をもつ仲介物を生成させずに、２−アセトアミド基を、直接遊離状態とするのに好適である。ＧＭ２合成の第２の方法は、化合物IIIから化合物VIへの変換を必要とする。この方法は、グリコシル供与体として、Ｏ−（３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル −２−デオキシ−２−トリクロロアセトアミド−α−ガラクトピラノシル）トリクロロアセトイミデート（化合物VIII、図１Ｂ）とともに、例えば、グリコシル受容体として、ガラクトース残基の反応性の低い４−ヒドロキシ基を有する、IIIａ又はI IIｂを使用することからなる。従って、ベンジルＯ−（３，４，６−トリ−Ｏ− アセチル−２−デオキシ−２−トリクロロアセトアミド−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−｛[メチル（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２ −ノヌロピラノシル）オネート]−（２−３）｝−（２，６−ジ−Ｏ−ベンジル −ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α，ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（化合物IXａ、図１Ｂ）又は、ベンジルＯ− （３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−トリクロロアセトアミド−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−｛[メチル（５−アセトアミド−４，７，８，９−テトラ−Ｏ−アセチル−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）オネート]−（２−３）｝−（２，６−ジ−Ｏ−ベンジル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１−４）−３，６−ジ−Ｏ−ベンジル−２−Ｏ−ピバロイル−α，ｂ−Ｄ−グルコピラノシド（化合物IXｂ、図１Ｂ）が、それぞれ、よい収率で得られる。例えば、水素化トリブチルスズを用いた、トリクロロアセトアミド基における塩素原子の還元的除去により、直接、所望のアセトアミド誘導体VIａ及びVIｂが得られる。従って、グリコシル化工程の後、直接Ｎ−アセチル基に変換されることが可能な、ガラクトサミン残基のアミノ基におけるいかなる強力な電子吸引基も目的にかなうということが示される。このことは、電子吸引性のＮ−トリクロロエトキシカルボニル基が、グリコシル化反応を助けるために用いられ、その後、引き続き（in situ ）無水酢酸中の亜鉛の存在下でＮ−アセチル基に置換されるという、第３の方法においても示される。本発明において、Ｎｅｕ５Ａｃ残基の、ラクトース残基への結合のために、新規な触媒が用いられ、その結果、α（２−３）−結合ＧＭ３タイプの中間体が提供される。ＧＭ２−テトラサッカリドを得るためにＧａｌＮＡｃ残基がＧａｌ残基の低反応性４−ＯＨ基に結合される。遊離のアミノ基への脱保護工程において（例えばアジド又はフタルイミド基）、鉛を用いる方法では、保護基の除去における困難な問題のために収率が低くなる、及び／又は、副反応（Ｎｅｕ５Ａｃ残基のエステル基とのラクタム形成）がおこるという結果におちいることがよくある。ここに開示する発明は、ＧａｌＮＡｃ残基の２−アセトアミド基における容易に除去可能な補助基、又は、ＧａｌＮＡｃ残基の２−アセトアミド基の替わりとなる基を用意する方法を提供する。従って、２−アセトアミド基を直接遊離状態にすることに関する、グリコシル供与体の特性の必要とされていた改良が達成され、遊離のアミンと、それに続くそのアミンのＮ−アセチル化という手段にたよらなくてもよくなった。例１ここでＧＭ２と呼称する、II³ＮｅｕＡｃＧｇＯｓｅ₃Ｃｅｒを調製するため、化合物Ｉ（Ｒ＝エチル）及び化合物IIａ、ｂをティ・ジェイ・マーティン(T.J.M artin)他，Glycoconjugate J．1993，前出の記載に従って、調製した。化合物II Iａ及びｂを得るために、非含水（ｄｒｙ）アセトニトリル（５ｍＬ）中の供与体Ｉ（１ｍｍｏｌ）及び受容体II（１．５ｍｍｏｌ）の溶液を−４０℃まで冷却した。。窒素雰囲気化で触媒(０．１５ｍｍｏｌ)(トリフルオロメタンスルホン酸スズ(II))を添加した。１時間後、溶液をトリエチルアミンで中和し、真空中で蒸発させた。残留物を、溶離剤として、トルエン−アセトン（３：１）を用いたシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製したところ、化合物IIIが６５％の収率で得られた。ＮＭＲデータについては、ティ・ジェイ・マーティン（T.J.Martin）他，Glycoconjugate J．1993，前出を参照のこと。化合物IVに関して、Ｙは容易に除去可能な、いずれのオキシカルボニル、チオカルボニル又はアミノカルボニル誘導体であってもよく、これらに限定されるものではないが、２，２，２−トリブロモエトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、４−ニトロフェニルエトキシカルボニル、又はトリクロロメチルチオカルボニルを含む。グリコシル供与体化合物IV（Ｒ＝メチル、Ｙ＝トリクロロエトキシカルボニル）は以下の手順によって得られた。１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アミノ−２−デオキシ−ｂ−Ｄ− ガラクトピラノースを、アール・バーグマン（R.Bergmann）他，Chem.Ber.Vol.6 4，p977-979(1991)の記載にしたがって、調製した。この結晶アミン（３．２ｇ、９．２１ｍｍｏｌ）を０℃で無水ＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍＬ）中に溶解させ、そしてＨｕｅｎｉｇ塩基（Ｈｕｅｎｉｇ‘ｓｂａｓｅ）（１．７ｍＬ、１８．８ｍｍｏｌ）と、トリクロロエトキシカルボニルクロリド（１．５ｍＬ、１１．０５ｍｍｏｌ）を連続的に添加した。この混合物を３０分間攪拌し、次にＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍＬ）で希釈し、水、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液、そして水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、そして濃縮した。残留物を２：１のヘキサン：酢酸エチルを用いてシリカゲルのカラムから溶出させ、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２ −トリクロロエトキシカルボニルアミノ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（４．９ｇ、９７％）を得た。エム・シュルツ(M.Shultz)他，Tetrahedron Asymmetry Vo l.4，1205-1250(1993)による方法にしたがって、この化合物にエチルチオ基を導入し、エチル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１−チオ−２− トリクロロエチオキシカルボニルアミノ−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシドを得た。これを化合物IVへと変換するために、以下の手順を適用した。エチル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１−チオ−２−トリクロロエトキシカルボニルアミノ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（１．７４ｇ、３．３１ｍｍｏｌ）、ＡＣ₂Ｏ（０．７８ｍＬ、８．２８ｍｍｏｌ）、Ｈｕｅｎｉｇ塩基（０．５６ｍＬ、３．３１ｍｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．４ｇ、３．３１ｍｍｏｌ）からなる混合物を室温で２日間攪拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物をトルエン／酢酸エチル（６：１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、化合物IV（１．７０ｇ、３．００ｍｍｏｌ、９１％）を生成させた。−［ａ］²² _D−５１．２（ｃ＝１、ＣＨＣＬ₃）；Ｒｆ０．４２（トルエン／酢酸エチル、４：１）であった。テトラサッカリド化合物Ｖａ及びｂを得るためのIIIとIVとのグリコシル化のため、以下の一般的な手順が適用された。化合物III（０．３４ｍｍｏｌ）と化合物IV（４０１ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解させた。Ｎ−ヨードスクシンイミド（１６８ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）とトリフルオロメタンスルホン酸（．６７μＬ、０．０７５ｍｍｏｌ）を連続的に添加し、この混合物を、ＴＬＣ（トルエン／アセトン、３：１）が完全に反応したことを示すまで、３０分間攪拌した。この混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液、１ＭＮａ₂Ｓ₂Ｏ₃溶液及び水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(トルエン／アセトン、３：１)で精製し、化合物Ｖ（６１％）を得た。アセトアミド誘導体化合物VIａ及びｂへの直接変換を行うため、以下の手順が適用された。酢酸（１０ｍＬ）中のテトラサッカリド化合物Ｖ（０．１８ｍｍｏｌ）の溶液を、新たに活性化させた亜鉛粉１５０ｍｇとともに４時間激しく攪拌した。懸濁液をセライトでろ過し、真空中で蒸発させた。残留物をトルエン／アセトン、３：１を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物VI（９０％）を得た。これらの化合物の構造は明らかに指定できる。化合物VIａは、異なる経路によって得られた物質（エム・スギモタ（M.Sugimota）他，Carbohydr.Res．Vol.p.5 6，C1-C5(1986)を参照のこと。）と一致する物理的データを示す。化合物VIｂの構造は下記の¹ＨＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣＬ₃）の結果から分かる。 δ＝１．７３−２．１９（９ｘｓ，２７Ｈ，９ｘＣＨ₃），１．１８（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ），２．１１（ｄｄ，１Ｈ，３Ｃ_a−Ｈ），２．２２（ｄｄ，１Ｈ，３Ｃ_e−Ｈ），３．１５（ｍ，１Ｈ，６ａ−Ｈ），３．２９（ｍ，１Ｈ，６ａ− Ｈ），３．３９−３．４７（ｍ，３Ｈ，５Ａ−Ｈ＋２ｂ−Ｈ＋６ｂ−Ｈ），３．６６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_2,3＝Ｊ_3,4＝１０Ｈｚ，３ａ−Ｈ），３．７２（ｍ，２Ｈ，６ｂ−Ｈ＋４ｂ−Ｈ），３．７９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_2,3＝９．８Ｈｚ，Ｊ_3,4＝１．４Ｈｚ，３ｂ−Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃），３．９０−４．７０（ｍ，１４Ｈ，５ｘＣＨ₂Ｂｎ＋２ｘ６ｄ−Ｈ＋２ｘ９ｃ−Ｈ），４．０２（ｄｄ，１Ｈ，５ｃ−Ｈ），４．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ_1,2＝９．８Ｈｚ，１ｂ−Ｈ），４．４７（ｄ，１Ｈ，Ｊ_1,2＝１０Ｈｚ，１ａ−Ｈ），４．５０（ｄｄ，１Ｈ，２ｄ−Ｈ），４．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ_1,2＝９．３Ｈｚ，１ｄ−Ｈ），５．０８（ｄｄ，Ｊ_1,2＝Ｊ_2,3＝１０Ｈｚ，１Ｈ，２ａ−Ｈ），５．１３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_2,3＝９．３Ｈｚ，Ｊ_3,4＝１．８Ｈｚ，３ｄ−Ｈ），５．４０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_3,4＝１．８Ｈｚ，Ｊ_4,5＝０．８Ｈｚ，４ｄ−Ｈ），５．１５−５．３２（ｍ，２Ｈ，７ｃ−Ｈ＋８ｃ−Ｈ）。化合物VIIａ及びｂを生成するための化合物VIａ及びｂの脱ベンジル化とそれに続くＯ−アセチル化は標準的手順を用いて行った。ＭｅＯＨ−ＣＨ₃ＣＯＯＨ（８ｍＬ、５：１）中の化合物VIａ（８５ｍｇ、５１μｍｏｌ）と１０％Ｐｄ−Ｃ（１５ｍｇ）からなる混合物をＨ₂下、室温で２時間撹拌した。ろ過した後、この溶液を濃縮した。精製はせずに、この残留物と、無水酢酸（１ｍＬ）と、ピリジン（１ｍＬ）と、４−ジメチルアミノピリジン（１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）からなる混合物を室温で一晩攪拌した後、濃縮した。残留物を、５：１トルエン −アセトンを用いて、シリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、化合物VIIａ（６６ｍｇ、９４％）を得た。−［ａ］_D＋１．６°（ｃ＝１、ＣＨＣｌ₃）；Ｒｆ０．３２、９５：５、ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨであった。化合物VIIａは、異なる経路によって、得られた物質と同一であった。次に化合物VIIは、当業者にとって周知の標準的技術（例えば、ここに参考文献として引用する、シュミット(Schmi dt)他，Agnew．Chem．Int．Ed．Engl.，Vol.25，pp.725-726(1986)及びLiebigs Ann．Chem.，pp.449-464(1994)を参照のこと）を用いて、ＧＭ２へと変換することができる。例２化合物VIの第２の合成方法を提供する。この方法ではグリコシル供与体化合物 VIIIの準備が必要となる。これはガラクトサミンから始まる以下の手順を経てなされた。水（４６ｍＬ）中のＤ−ガラクトサミンヒドロクロリド（５ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ₃（５．８４ｇ、６９ｍｍｏｌ）の溶液を激しく攪拌し、この溶液にトリクロロアセチルクロリド（３．８８ｍＬ、３４．８ｍｍｏｌ）を室温で３０分間以内で滴下した。この混合物を１時間攪拌し、１ＭＨＣｌで中和し、濃縮し、真空中で乾燥させた。残留物をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）とともに０℃で３時間攪拌した。塩をろ過して除き、ろ液を濃縮し、Ｎ−トリクロロアセチル−Ｄ−ガラクトサミンとＤ−ガラクトサミンの混合物を得た。（定量的収率：quantitive yield）；Ｒｆ０．２０（トルエン／アセトン、４：６）であった。無水酢酸（２５ｍＬ）とピリジン（１ｍＬ）中のこの粗生成物（１０ｇ）の溶液を、室温で３時間攪拌し、その後濃縮した。残留物を７：１トルエン−アセトンを用いたシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、１，３，４，６−テトラ− Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−トリクロロアセトアミド−α，ｂ−Ｄ−ガラクトピラノースを白色固体（１．８５ｇ、３０％）として得た。ｂ−アイソマー：［ａ］_D ＋３．９°（ｃ＝１、ＣＨＣｌ₃）；Ｒｆ０．８５、９５：５ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ中であった。以下の手順では、この物質がより高収率で得られた。ＣＨ₂Ｃｌ₂中の１、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−アミノ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノース（１５０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）と４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏl）の溶液を０℃まで冷却した。トリクロロアセチルクロリド（５３μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）と、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（８３μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で３時間攪拌し、その後濃縮した。残留物を７：１トルエン／アセトンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、１７０ｍｇ、８０％の生成物を得た。ｂ−アイソマーの¹ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）データを以下に示す。２．１６，２．１０，２．０３，１．９７（４ｓ，１２Ｈ，４Ａｃ），４．０４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_5,6＝３．５Ｈｚ，５−Ｈ），４．１３（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ_6a, _6b ＝１１．２Ｈｚ，６Ａ−Ｈ，６Ｂ−Ｈ），４．４２（ｄｄｄ，１Ｈ，２−Ｈ），５．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_2,3＝１１．２Ｈｚ，Ｊ_3,4＝１．３Ｈｚ，３−Ｈ），５．３７（ｄ，１Ｈ，Ｊ_4,5＝２．９Ｈｚ，４−Ｈ），５．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ_1,2＝８．８Ｈｚ，１−Ｈｂ），７．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，ＮＨ）。化合物VIIIへの変換は以下の様に行われた。ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の１、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−トリクロロアセトアミド− ａ，ｂ−Ｄ−ガラクトピラノース（１．７３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）とヒドラジンアセテート（３５５ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）からなる溶液を０℃で２時間撹拌し、その後ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＣｌ水溶液と水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させ、そして濃縮した。ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍＬ）中の、この残留物と、トリクロロアセトニトリル（３．３５ｍＬ、３３．４ｍｍｏｌ）と、ＤＢＵ（０．１ｍＬ、０．７ｍｍｏｌ）の混合物を室温で、３０分間攪拌し、その後濃縮した。残留物を０．１％のトリエチルアミンを含有する２：１ペトローレウムエーテル／酢酸エチルを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、化合物VIII（１．０４ｇ、５０％）を得た。［ａ］_D＋６３°（ｃ＝１、ＣＨＣｌ₃）；Ｒｆ０．６２、２：１ペトローレウムエーテル／酢酸エチル＋０．１％ＮＥｔ₃中であった。 ¹ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）データを以下に示す。２．１９，２．０２，２．０１（３ｓ，９Ｈ，３Ａｃ），４．０６（ｄｄ，１Ｈ，６Ｂ−Ｈ），４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_6a,6b＝１１．３Ｈｚ，６Ａ−Ｈ），４．３５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_5,6＝６．９Ｈｚ，５−Ｈ），４．７０（ｄｄｄ，１Ｈ，２−Ｈ），５．３９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_2,3＝１１．３Ｈｚ，Ｊ_3,4＝３．１Ｈｚ，３−Ｈ），５．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_4,5＜１Ｈｚ，４−Ｈ），６．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ_1,2＝３．６Ｈｚ，１−Ｈａ），６．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ_9.1Ｈｚ，ＮＨ），８．８１（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＮＨ）。化合物VIIIはトリクロロアセチル基を含有しているが、これはこれらに限定されるものではないが、トリブロモアセチル又はトリフルオロアセチル基を含む、いずれの構造的に関連した電子吸引基によっても置換することができる。化合物IXを得るための、グリコシル供与体化合物VIIIと受容体化合物IIIａ又はｂとの反応は、例１において化合物IIIａについて記載したように行った。ＣＨ₂Ｃｌ₂（８ｍＬ）中の、化合物VIII（２００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）と、化合物IIIａ（２２８、０．１７ｍｍｏｌ）と４Å分子ふるい（４Åmolecular sie ves）の混合物を、アルゴン（Ａｒ）下、室温で１時間攪拌し、その後０℃まで冷却した。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１５μＬ、８４ μｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２時間攪拌した。トリエチルアミン（０．１ｍＬ）を添加し、混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、ろ過し、そして濃縮した。残留物を７：１トルエン／アセトンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、化合物IXａ（２２２ｍｇ、７４％）を得た。［ａ］_D＋３°（ｃ＝０．３３、ＣＨＣｌ₃）；Ｒｆ０．２７、トルエン／アセトン４：１、であった。周知の化合物VIａへの変換は以下の様に行った。ベンゼン（８ｍＬ）中の化合物IXａ（１３０ｍｇ、７３μｍｏｌ）と、トリブチルスタンナン（０．２９ｍＬ、１．０９ｍｍｏｌ）と、アゾイソブチロニトリル（３ｍｇ）からなる溶液をアルゴン（Ａｒ）下で１時間攪拌し、その後、還流しながら２時間加熱し、冷却し、そして濃縮した。残留物を７：１トルエン／アセトンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、化合物VIａ（１００ｍｇ、８１％）を得た。これは、前述の物質と同一であった。［ａ］_D−６．８°（ｃ＝１、ＣＨＣｌ）、Ｒｆ０．４８、９５：５ＣＨＣｌ₃−ＭｅＯＨであった。化合物VIａ又はVIｂは次に化合物VIIａ又はVIIｂを生成させるために用いられ、そして化合物VIIａ又はVIIｂは当業者に周知の標準的技術を用いてＧＭ２へと変換される。例３化合物VIの第３の合成方法を提供する。この方法では、グリコシル供与体Ｘ（図１Ｃ）の調製が必要となる。これは以下の手順で行われた。１、３、４、６− テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−トリクロロエトキシカルボニルアミノ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（例１を参照のこと）（３ｇ、５．７３ｍｍｏｌ）とヒドラジンアセテート（０．６ｇ、６．３１ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２０分間攪拌し、その後ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、水、飽和ＮａＨＣＯ₃ 水溶液、及び水で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、そして濃縮した。ＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍＬ）中の、残留物と、トリクロロアセトニトリル（４ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）と、ＤＢＵ（０．１５ｍＬ、１ｍｍｏｌ）の混合物を室温で４５分間攪拌した後、濃縮した。残留物を、０．１％のＥｔ₃Ｎを含有する３：１ヘキサン −ＥｔＯＡｃを用いたシリカゲル（８０ｇ）のカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物Ｘ（３．０５ｇ、９３．１％）を得た。［ａ］_D＋６４（ｃ＝１、ＣＨＣｌ₃）であった。 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）データを以下に示す。６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ_1,2＝３．８Ｈｚ，Ｈ−１），８．８１（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＮＨ），５．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_3,4,＝Ｊ_4,5,１．１Ｈｚ，Ｈ−４），５．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ＮＨ），５．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ_2,3＝１０Ｈｚ，Ｊ_3,4＝１．１Ｈｚ，Ｈ−３），４．７２（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ_2-ＣＣｌ₃）、４．５３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−６‘），４．３８（ｍ，１Ｈ，Ｈ−６），４．００−４．２５（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２＋Ｈ−５），２．００−２．１３（３ｘｓ，９Ｈ，３ｘＣＨ₃−Ｃ）。化合物Ｘは２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基を含有しているが、これはこれらに限定されるものではないが、２，２，２−トリブロモエトキシカルボニル、２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル、又は４−ニトロフェニルエトキシカルボニルを含む、いずれの構造的に関連した電子吸引基によっても置換することができる。無水のジクロロメタン（５ｍＬ）中の、イミデートＸ（１２０ｍｇ，０．１９２ｍｍｏｌ）と、受容体IIIｂ（１５０ｍｇ，０．１２８ｍｍｏｌ）と活性化した４Å分子ふるい（２００ｍｇ）からなる混合物を乾燥アルゴン（Ａｒ）下、室温で１時間攪拌した。トリメチルシリルトリフレート（０．３５μＬ、０．０１９２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を４時間攪拌した。Ｅｔ₃Ｎ（０．１ｍＬ）を添加し、この混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（２５ｍＬ）で希釈し、ろ過し、そして濃縮した。残留物をＡｃ₂Ｏ：ＡｃＯＨ（５：１、６ｍＬ）の混合物中に溶解させ、亜鉛粉（２００ｍｇ）を添加した。この混合物を室温で１６時間撹拌した後、ろ過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィーにかけたところ、VI ｂ（１５２．７ｍｇ、７８％）が得られた。化合物VIｂは、前述したように、ＧＭ２を生成させるのに使用できる。例４例１に記載した手順によって得られた合成ＧＭ２の純度を分析した。ＧＭ２を当業者に周知の技術を用いて、薄層クロマトグラフィーにかけた。ＧＭ２を図面の簡単な説明に示されているように、レゾルシノール／ＨＣｌ及び気体ヨウ素を用いて可視化した。合成ＧＭ２は１本のメジャーバンドを含み、これはレゾルシノール及びオルシノールに陽性であった。合成ＧＭ２は、ウシ脳由来ＧＭ２と同様に移動した。それに加えて５及び１０μｇの合成ＧＭ２を含むレーンにおいて、３本のメジャーバンドが、オルシノール及びレゾルシノールによる染色後に検出できた。メインのＧＭ２バンドと比べて、１本のバンドはわずかにはやく移動し、２本のバンドはわずかに遅く移動した。（図２参照のこと）これらのバンドは、薄層クロマトグラフィー分離前に行った合成ＧＭ２のおだやかな塩基処理の後にも検出できた。塩基処理は、ＭｅＯＨ中の０．０５ＭＮａＯＨによる、５０℃、１時間の処理からなる。これに加えて、気体ヨウ素による染色後は、メインのＧＭ２バンドのみが検出できた。（図３を参照のこと）例１に記載の方法によって合成されたＧＭ２の純度は、薄層クロマトグラフィーによって判断されるように９５％以上であることがわかった。純度の判定に関して、記載したプロセスにおける最終生成物の純度は、出発原料の純度に依存する。ここに記載したデータにおいて、もし、例えば９９％のより高い純度の脂肪酸のような、高純度の実質的な出発原料が入手可能であれば、９５％という値は、おそらく９９％まで改善されるであろう。また、“ＧＭ２”という用語は実際は１つのバックボーン（backbone）構造を指すものであるが、記載されたグリコシド鎖は一定である一方で、この分子の脂肪酸組成において自然の変異性があるため、いくらかの変異性が可能である。従って、ＧＭ２を複数形（“ＧＭ２ｓ”）で呼称するか、又は、“すべてのメンバーがＧＭ２バックボーン構造を有する分子のファミリー”と呼称するのがよりふさわしい。例５例１に記載の方法によって合成したＧＭ２の抗原性をウシ脳由来ＧＭ２の抗原性と比較した。これを行うために、合成ＧＭ２を、様々なＧＭ２抗血清との反応性を調べるため、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によってテストした。固相酵素免疫検定法を行うために、抗体のタイター測定（titration）とＧＭ２抗原（合成のものとウシ脳由来のものの両方）のタイター測定を行った。合成ＧＭ２は、３種の異なるＧＭ２反応性抗血清によって認識された。これらの抗血清は、マウスモノクローナル抗体１０．１１（図４）、ヒトモノクローナル抗体４５．１１４（図５）、及び、ウシ脳由来ＧＭ２を含むワクチンによって免疫化されたメラノーマ患者由来の血清（図６）を含んでいた。下記の表１は、合成ＧＭ２とウシ脳由来ＧＭ２は、固相酵素免疫検定法によって、同一の抗体によって認識されたことを示している。具体的には、合成ＧＭ２とウシ脳由来ＧＭ２の両方が、モノクローナル抗体１０．１１、モノクローナル抗体４５．１１４、及びウシ脳由来ＧＭ２を含むワクチンによって免疫化された患者の血清によって認識された。合成ＧＭ２とウシ脳由来ＧＭ２のどちらも、モノクローナル抗体Ｒ２４（これは抗−ＧＤ３モノクローナル抗体である）又は糖脂質認識抗体の１つであるＦ３１によっては、認識されなかった。同様に、合成ＧＭ２もウシ脳由来ＧＭ２も、ウシ脳由来ＧＭ２を含むワクチンによって予め免疫化されていない患者由来の血清によっては認識されなかった。例６当業者にとって周知の免疫薄層クロマトグラフィー技術を使用して、合成ＧＭ２の抗原性をウシ脳由来ＧＭ２の抗原性と比較した。このクロマトグラフィーにおいてモノクローナル抗体１０．１１（図７）を使用した。合成ＧＭ２調製物において、１本のメインバンドと２本のマイナーバンドがモノクローナル抗体１０．１１と免疫反応性を示した。メインバンドは、ウシ脳由来ＧＭ２と同じ様に移動したが、２本のマイナーバンドの両方は、メインＧＭ２バンドよりもわずかに速く移動した（図７を参照のこと）。抗ＧＭ２モノクローナル抗体と免疫反応性を示した２本のマイナーバンドは、おそらく全てＧＭ２種であり、ｃ１８：０及びｄ１８：１を含むメジャーバンドと、セラミドの組成が異なるものであると考えられる。モノクローナル抗体１０．１１によって特異的に染色される、メインＧＭ２バンドより遅く移動するバンドは見られなかった。例７抗−ＧＭ２抗体の産生を誘発するために、例１に記載した方法によって得た合成ＧＭ２又はウシ脳由来ＧＭ２のいずれかによってウサギを免疫化した。ウサギを３週間隔で４回免疫化した。最初の２回の免疫処置では２００μｇのＧＭ２を、後の注射では１００μｇのＧＭ２を用いた。フロイントアジュバンドを利用した。３ヶ月後、３週間隔でさらに２回の免疫処置を行った。免疫化した動物からの血清を免疫反応性についてテストした。合成ＧＭ２で免疫化したウサギ及びウシ脳由来ＧＭ２で免疫化したウサギの血清は両者ともにＩｇＭ及びＩｇＧ抗−ＧＭ２抗体のタイターは低いということが判った。両血清とも、同じく低レベルの免疫原性を示した。これは合成ＧＭ２とウシ脳由来ＧＭ２は、免疫システムによって区別されないことを示す。本発明は、特定の実施例に関して記載しているが、これらの実施例は本発明の様々な側面を単に例示するものであるということが理解されるべきである。従って、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、例示的な実施例において、様々な改良を行うことが可能であり、他の改変を開発することが可能であることが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カストロ，パロミノ，ユリオ，ツェードイツ連邦共和国デー−78464 コンスタンツウニヴェルジテーツシュトラーセ 10 エム725 (72)発明者ドール，アンドレアスドイツ連邦共和国デー−78464 コンスタンツウニヴェルジテーツシュトラーセ 10 エム725 (72)発明者リッター，ゲルトアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345 (72)発明者オールド，ロイド，ジェイアメリカ合衆国ニューヨーク 10105 ニューヨークアベニュー・オブ・ジ・アメリカズ 1345

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）トリサッカリド化合物IIIａ又はIIIｂを得る工程と、（ｂ）グリコシル供与体化合物IVを得る工程と、（ｃ）トリサッカリド化合物IIIと化合物IVを触媒の存在化でグリコシル化してテトラサッカリド化合物Ｖａ又はＶｂを得る工程と、（ｄ）前記化合物Ｖａ又はＶｂのＮ−トリクロロエトキシカルボニル基を除去し、アセトアミド基を遊離状態にすることにより、アセトアミノ誘導体化合物VI ａ又はVIｂを得る工程と、（ｅ）化合物VIａ又はVIｂからＯ−ベンジル基を除去し、脱ベンジル化された化合物を得て、この脱ベンジル化された化合物をＯ−アセチル化することにより、化合物VIIａ又はVIIｂを得る工程と、（ｆ）化合物VIIａ又はVIIｂをＧＭ２に変換する工程、とからなるＧＭ２の合成方法。２．触媒を利用して、グリコシル受容体IIａ又はグリコシル受容体IIｂとシアリル供与体Ｉとをグリコシル化することによって、前記トリサッカリド化合物II Iａ又はIIIｂを得る、請求項１の方法。３．前記触媒がトリフルオロメタンスルホン酸塩である請求項２の方法。４．前記触媒が、トリフルオロメタンスルホン酸スズ（II）、トリフルオロメタンスルホン酸イッテルビウム（III）、トリフルオロメタンスルホン酸銅（II ）、トリフルオロメタンスルホン酸銀（Ｉ）及び、他の金属のトリフルオロメタンスルホン酸塩からなるグループから選択される、請求項１の方法。５．グリコシル供与体化合物IVにおけるＹが、オキシカルボニル誘導体、チオカルボニル誘導体、及びアミノカルボニル誘導体からなるグループから選択される、請求項１の方法。６．グリコシル供与体化合物IVにおけるＹが、２，２，２−トリブロモエトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、４−ニトロフェニルエトキシカルボニル、及びトリクロロメチルチオカルボニルからなるグループから選択される、請求項５の方法。７．（ａ）トリサッカリド化合物IIIａ又はIIIｂを得る工程と、（ｂ）グリコシル供与体化合物Ｘを得る工程と、（ｃ）トリサッカリド化合物IIIａ又はIIIｂとグリコシル供与体Ｘを触媒の存在化でグリコシル化し、引き続き（ｉｎｓｉｔｕ）Ｎ−トリクロロエトキシカルボニル基をアセチル基によって置換した後、化合物VIａ又はVIｂをそれぞれ得る工程と、（ｄ）化合物VIａ又はVIｂからＯ−ベンジル基を除去し、脱ベンジル化された化合物を得て、この脱ベンジル化された化合物をＯ−アセチル化することにより、化合物VIIａ又はVIIｂを得る工程と、（ｅ）化合物VIIａ又はVIIｂをＧＭ２に変換する工程、とからなるＧＭ２の合成方法。８．グリコシル供与体化合物Ｘの２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基が、２，２，２−トリブロモエトキシカルボニル、２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル、４−ニトロフェニルエトキシカルボニル、及びその他の構造的に関連する電子吸引基からなるグループから選択される基と置換される、請求項７の方法。９．（ａ）トリサッカリド化合物IIIａ又はIIIｂを得る工程と、（ｂ）グリコシル供与体化合物VIIIを得る工程と、（ｃ）トリサッカリド化合物IIIａ又はIIIｂとグリコシル供与体化合物VIIIを触媒の存在化でグリコシル化し、化合物IXａ又はIXｂを得る工程と、（ｄ）化合物IXａ又はIXｂをアセトアミノ誘導体化合物VIａ又はVIｂに転化させる工程と、（ｅ）化合物VIａ又はVIｂからＯ−ベンジル基を除去し、脱ベンジル化された化合物を得て、この脱ベンジル化された化合物をＯ−アセチル化することにより、化合物VIIａ又はVIIｂを得る工程と、（ｆ）化合物VIIａ又はVIIｂをＧＭ２に変換する工程、とからなるＧＭ２の合成方法。１０．触媒を利用して、シアリル供与体Ｉとグリコシル受容体IIａ又はグリコシル受容体IIｂとをグリコシル化することによって、前記トリサッカリド化合物II Iａ又はIIIｂを得る、請求項９の方法。１１．前記触媒がトリフルオロメタンスルホン酸塩である請求項１０の方法。１２．グリコシル供与体化合物VIIIのトリクロロアセチル基が、トリブロモアセチル、トリフルオロアセチル、及びその他の構造的に関連する電子吸引基からなるグループから選択される基と置換される、請求項９の方法。１３．前記触媒が、トリフルオロメタンスルホン酸スズ（II）、トリフルオロメタンスルホン酸イッテルビウム（III）、トリフルオロメタンスルホン酸銅（II ）、トリフルオロメタンスルホン酸銀（Ｉ）及び、他の金属のトリフルオロメタンスルホン酸塩からなるグループから選択される、請求項９の方法。