【発明の詳細な説明】
ＨＩＶ−ＴＡＴの検出方法
本発明は、体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの検出方法及び本目的に使用されるキッ
トに関する。
ＡＩＤＳの場合、Ｔ細胞は、しばしばプログラムされた細胞死をこうむること
がよく知られている。該細胞死はＴ細胞アポトーシスとして述べられる。最近の
よってＴ細胞アポトーシスが増すという事実に言及している。
この知見は、現在、ＨＩＶ感染及びＡＩＤＳを、それぞれ、より良く理解すし
、新しい治療方法を考える可能性を提供する。しかしながら、本目的のために、
体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴを検出することができることが必要である。しかし、
これは、これまでは可能ではなかった。
したがって、本発明の目的は、体試料中にＨＩＶ−ＴＡＴを検出できる方法を
提供することにある。
本発明によって、これは下記工程を有する方法により達成される：
（ａ）体試料を採取し、該体試料をデターゼント（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｓ）及び高
濃度の塩と共にインキュベートする工程、
（ｂ）工程（ａ）由来の体試料をサイズ分画する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）由来の体試料を抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体と共にインキュベートす
る工程。
「体試料」という用語は、人間及び動物由来のいかなる種類でもよい体試料を
有する。特に、これらは、血液、痰、尿、大便、体液、胆汁、胃腸の分泌物、臓
器の吸引物又は斑（Ｏｒｇａｎｐｕｎｋｔａｔｅ）、生検試料及びリンパ液であ
る。
体試料を採取するために、慣用の方法を使うことができる。ついで、該体試料
を、慣用のデターゼント、例えば、ＮＰ−４０又はｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００と
共にインキュベートする。また複数のデターゼントを同時に又は連続的に使用す
ることが可能である。全体で１％のデターゼントを用いることが好ましい。さら
に、該体試料に高濃度の塩を添加する。それは慣用の塩、例えばＮａＣｌであっ
てもよい。また、複数の塩を同時に又は連続的に用いることが可能である。全体
で０．１〜１Ｍの塩を使用することが好ましい。ＨＩＶ−ＴＡＴを、デターゼン
ト及び高濃度の塩の使用によって、結合したタンパク質及び核酸から遊離する。
さらに、デターゼントによって、該体試料中でＨＩＶ粒子を不活性化する。
さらに、該体試料をサイズ分画に供する。本目的のために、慣用の方法、例え
ば、Ｆｉｌｔｒｏｎ社、ノースボロー（Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ）、マサチュ
ッツ州、Ｕ．Ｓ．Ａの遠心分離（分画）カラムによる分画を使用することが可能
である。５〜３０ｋＤの範囲以内で分画を行うことが好ましい。
また、該体試料を、抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体と共にインキュベートする。「ＨＩ
Ｖ−ＴＡＴ」という用語は、ＨＩＶ感染を引き起こす及び／又はＡＩＤＳを生じ
るウイルスから生じるいかなるＴＡＴ及びその断片をも有する。該用語は、合成
的に作成した、いかなるＴＡＴ及びその断片にも関する。該抗体はポリクローナ
ル又はモノクローナルであってよく、モノクローナル抗体が好ましい。さらに、
該抗体は、合成であってもよく、任意にＨＩＶ−ＴＡＴを認識するために必要で
ない部分を一部又は全部欠損してもよく、これらの部分をそれぞれ、さらに好ま
しい性質を有する抗体を提供する他の部分によって置き換えてもよい。また、多
様な抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体を同時に又は連続的に使用することが有利であろう。
特に、該１又は複数の抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体をインキュベートすることと並行し
て、該体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの定量的検出をしやすいように、一定のＴＡＴ
標品と共に前記インキュベートすることが好ましい。
１又は複数の抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体との該体試料のインキュベーション並びに
ＴＡＴ標品との後者のインキュベーションは、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ
、例えばサンドウィッチ若しくは競合ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法又は免疫沈降法等
の慣用の方法の一部となってもよい。本目的のために、該抗体はラベルしてもよ
く、もし適切ならば、又は該抗体に対するラベルされた抗体を組み合わせて用い
てもよい。
本発明による方法は、ＨＩＶ−ＴＡＴを体試料中で検出できるという点が特徴
である。該方法は、特異的に及び迅速に行うことができる。したがって、ＨＩＶ
感染を診断すること及び／又はＡＩＤＳ症状を追跡することのために完全に適す
る。また、後者は、特にＨＩＶ−ＴＡＴに対しておこなわれる治療方法の効果を
直接的に追跡する大きな利点を有する。
また、本発明によって、体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの検出のためのキットが提
供される。かかるキットは、好ましくは、下記を有する。
（ａ）デターゼント、
（ｂ）高濃度の塩の溶液、
（ｃ）サイズ分画カラム、
（ｄ）１又は複数の抗ＨＩＶ−ＴＡＴ抗体、
（ｅ）ＨＩＶ−ＴＡＴ標品、並びに
（ｆ）慣用の補助剤及び担体材料。
本発明による方法と関連して作られた前記説明は、ここで相応して考慮されな
ければならない。図面の簡単な説明
図はＨＩＶ−１感染した人間の体試料中のＨＩＶ−ＴＡＴの特異的検出を示す
。
本発明を以下の実施例により説明する。実施例：ＨＩＶ−１感染した人間の体試料中のＴＡＴの検出
３３人のＨＩＶ−１感染した人間から血清試料を採取した。２０人のＨＩＶの
人間由来の血清及びＨＩＶ−１感染したＨ９細胞の上清と共に、それらをＴＡＴ
の存在を試験した。さらに、一定の標品を得るために、対照血清に合成ＴＡＴを
添加した。
前記血清を１％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及び１ＭＮａＣｌと共に、それぞれ
インキュベートした。ついで、Ｆｉｌｔｒｏｎ社の遠心分離（分画）カラム、前
記参照、を用いて、該血清を５〜３０ｋＤの範囲のサイズ分画に供した。該血清
はドットブロット法にかけた。本目的のために、それらをニトロセルロース膜に
滴下することによりアプライし、熱によって固定した。タンパク質結合部位の残
りをブロックするために、該ニトロセルロース膜を、ＰＢＳ（０．０１％ Ｎ３
）に溶かした５％のミルク粉末と共に室温で２時間インキュベートした。該ニト
ロセルロース膜をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で室温で３０分間洗浄し
た。ついで、該ニトロセルロース膜を購入可能なＴＡＴ−特異的抗体と共に室温
で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回、
それぞれ、５分間洗浄した。該ニトロセルロース膜は、ＴＡＴ−特異的一次抗体
の定常領域に対する、ペルオキシダーゼ−結合二次抗体と共に、室温で２時間イ
ンキュベートした。その後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回、それ
ぞれ５分間洗浄した後、該ニトロセルロース膜を、抗ペルオキシダーゼ複合体と
共に室温で２時間インキュベートした。該ニトロセルロース膜を、ＰＢＳ／０．
０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で６回、それぞれ５分間洗浄した後、シグナルが比色反
応によって生成した（図を参照）。
本発明による方法によって、体試料中に特異的にＨＩＶ−ＴＡＴを検出できる
ことを示した。The present invention relates to a method for detecting HIV-TAT in a body sample and a kit used for the purpose. It is well known that in the case of AIDS, T cells often undergo programmed cell death. The cell death is described as T cell apoptosis. It mentions the fact that T cell apoptosis has recently increased. This finding now offers the potential to better understand HIV infection and AIDS, respectively, and to consider new treatments. However, for this purpose, it is necessary to be able to detect HIV-TAT in a body sample. However, this was not previously possible. Therefore, an object of the present invention is to provide a method capable of detecting HIV-TAT in a body sample. According to the present invention, this is achieved by a method comprising the steps of: (a) taking a body sample and incubating the body sample with Detergents and a high concentration of salt; (b) step (a) Size-fractionating the body sample from the source, and (c) incubating the body sample from step (b) with the anti-HIV-TAT antibody. The term "body sample" includes a body sample of any type from humans and animals. In particular, these are blood, sputum, urine, stool, bodily fluids, bile, gastrointestinal secretions, organ aspirates or plaques, biopsy samples and lymph. Conventional methods can be used to collect body samples. The body sample is then incubated with a conventional detasent such as NP-40 or triton X-100. It is also possible to use a plurality of detasants simultaneously or successively. It is preferred to use a total of 1% detasent. Further, a high concentration of salt is added to the body sample. It may be a conventional salt, for example NaCl. In addition, a plurality of salts can be used simultaneously or continuously. It is preferred to use a total of 0.1-1 M salt. HIV-TAT is released from bound proteins and nucleic acids by the use of detergent and high concentrations of salts. In addition, the detersant inactivates the HIV particles in the body sample. Further, the body sample is subjected to size fractionation. For this purpose, conventional methods are used, for example, Filtron, Northborough, Mass., U.S.A. S. It is possible to use the fractionation by centrifugation (fractionation) column of A. It is preferable to perform fractionation within the range of 5 to 30 kD. Also, the body sample is incubated with an anti-HIV-TAT antibody. The term "HIV-TAT" includes any TAT and fragments thereof resulting from a virus that causes HIV infection and / or causes AIDS. The term refers to any TAT and fragments thereof that have been made synthetically. The antibodies may be polyclonal or monoclonal, with monoclonal antibodies being preferred. Further, the antibody may be synthetic, or may have a portion or all of a portion that is not necessary for recognizing HIV-TAT, and each of these portions may be an antibody having more preferable properties. It may be replaced by other parts provided. It may also be advantageous to use various anti-HIV-TAT antibodies simultaneously or sequentially. In particular, in parallel with incubating the one or more anti-HIV-TAT antibodies, said incubating with a certain TAT standard may facilitate the quantitative detection of HIV-TAT in the body sample. preferable. Incubation of the body sample with one or more anti-HIV-TAT antibodies and the latter incubation with a TAT preparation can be performed by conventional methods such as Western blot, ELISA, for example, sandwich or competitive ELISA, immunofluorescence or immunoprecipitation. May be part of For this purpose, the antibodies may be labeled and, if appropriate, or in combination with labeled antibodies to the antibodies. The method according to the invention is characterized in that HIV-TAT can be detected in body samples. The method can be performed specifically and rapidly. Therefore, it is perfectly suitable for diagnosing HIV infection and / or tracking AIDS symptoms. The latter also has the great advantage of directly following the effects of the treatment methods, especially for HIV-TAT. The present invention also provides a kit for detecting HIV-TAT in a body sample. Such a kit preferably has: (B) high concentration salt solution, (c) size fractionation column, (d) one or more anti-HIV-TAT antibodies, (e) HIV-TAT preparation, and (f) conventional Adjuvants and carrier materials. The above description made in connection with the method according to the invention has to be considered here accordingly. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The figure shows the specific detection of HIV-TAT in HIV-1 infected human body samples. The invention is illustrated by the following example. Example: Detection of TAT in HIV-1 infected human body samples Serum samples were collected from 33 HIV-1 infected humans. Together with serum from 20 humans with HIV and the supernatant of HIV-1 infected H9 cells, they were tested for the presence of TAT. In addition, synthetic TAT was added to control serum to obtain a constant preparation. The sera were incubated with 1% triton X-100 and 1M NaCl, respectively. The serum was then subjected to size fractionation in the range of 5-30 kD using a Filtron centrifugation (fractionation) column, see above. The serum was subjected to a dot blot method. For this purpose, they were applied by dripping onto a nitrocellulose membrane and fixed by heat. The nitrocellulose membrane was incubated with 5% milk powder in PBS (0.01% N3) for 2 hours at room temperature to block the rest of the protein binding site. The nitrocellulose membrane was washed with PBS / 0.05% Tween 20 at room temperature for 30 minutes. The nitrocellulose membrane was then incubated with a commercially available TAT-specific antibody for 2 hours at room temperature and then washed 6 times with PBS / 0.05% Tween 20 for 5 minutes each. The nitrocellulose membrane was incubated for 2 hours at room temperature with a peroxidase-conjugated secondary antibody against the constant region of the TAT-specific primary antibody. After washing with PBS / 0.05% Tween 20 six times for 5 minutes each, the nitrocellulose membrane was incubated with the anti-peroxidase complex for 2 hours at room temperature. The nitrocellulose membrane was washed with PBS / 0. After washing six times with 05% Tween 20 for 5 minutes each, a signal was generated by a colorimetric reaction (see figure). It has been shown that the method according to the present invention can specifically detect HIV-TAT in a body sample.
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フロントページの続き
(72)発明者 ヴェステン−ドルプ，ミカエル
ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー
−69120 ラデンブルゲル シュトラーセ
55
(72)発明者 フランク，ライネル
ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー
−69120 ハンス−トーマ−シュトラーセ
76
(72)発明者 ベルント，クリスチーナ
ドイツ連邦共和国 ハイデルベルク デー
−69120 ベルクハイメル シュトラーセ
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Continuation of front page
(72) Inventor Westen-Dorp, Michael
Germany Heidelberg Day
−69120 Ladenburg Gel Strasse
55
(72) Inventor Frank, Reynell
Germany Heidelberg Day
−69120 Hans-Thomas-Strasse
76
(72) Inventor Bernd, Christina
Germany Heidelberg Day
−69120 Bergheimer Strasse
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