EP0820595A1 - Process for detecting hiv-tat - Google Patents

Process for detecting hiv-tat

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EP0820595A1
EP0820595A1 EP96909957A EP96909957A EP0820595A1 EP 0820595 A1 EP0820595 A1 EP 0820595A1 EP 96909957 A EP96909957 A EP 96909957A EP 96909957 A EP96909957 A EP 96909957A EP 0820595 A1 EP0820595 A1 EP 0820595A1
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EP
European Patent Office
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tat
hiv
body sample
detergent
antibody
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96909957A
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Inventor
Peter Krammer
Michael Westendorp
Rainer Frank
Christina Berndt
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Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of HIV-TAT in a body sample and a kit that can be used therefor.
  • T cell apoptosis AIDS T cells often suffer programmed cell death. This cell death is called T cell apoptosis. Recent work by the applicant indicates that T cell apoptosis in AIDS is enhanced by an HIV protein called TAT.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a method with which HIV-TAT can be detected in a body sample.
  • body sample includes body samples of all types of humans and animals. In particular, these are blood, sputum, urine, stool, cerebrospinal fluid, bile, gastrointestinal secretions, organ punctures, biopsies and lymphatic fluid.
  • a body sample is then washed with a common detergent, e.g. NP-40 or Triton X-100, incubated.
  • a common detergent e.g. NP-40 or Triton X-100
  • Several detergents can also be used, simultaneously or in succession. It is beneficial to use a total of 1% detergent.
  • high salt is added to the body sample. This can be a common salt, e.g. NaCI, be.
  • salts can also be used, simultaneously or in succession. It is expedient to use a total of 0.1-1 M salt.
  • the body sample is then subjected to size fractionation.
  • Common methods e.g. Fractionation by centrifugation. Fractionation. Columns from Filtron, Northborough, MA, USA are used. It is favorable to carry out the fractionation in a range of 5-30 kD.
  • HIV-TAT includes any TAT and fragments thereof derived from viruses that can cause HIV infection and / or can cause AIDS.
  • the term also relates to any TAT and fragments thereof that have been synthesized.
  • the antibody can be polyclonal or monoclonal, a monoclonal antibody being preferred.
  • the antibody can be synthetic, parts or parts of it that are not necessary for the detection of HIV-TAT being missing in whole or in part or these parts being replaced by others which impart further favorable properties to the antibody. It can also be advantageous if different anti-HIV
  • TAT antibodies can be used simultaneously or sequentially. It is particularly expedient to incubate the anti-HIV-TAT antibody (s) in parallel with the above incubation with a defined TAT standard, whereby a quantitative detection of HIV-TAT in the body sample is facilitated.
  • Incubation of the body sample with the anti-HIV-TAT antibody (s) as well as incubation of the latter with a TAT standard can be part of a conventional method, such as a Western blot, an ELISA, e.g. Sandwich or competition ELISA, immunofluorescence or immunoprecipitation.
  • the antibody can, if it is appropriate, be labeled or can be used in combination with a labeled antibody directed against it.
  • the method according to the invention is characterized in that HIV-TAT can be detected in a body sample.
  • the process is specific and can be carried out quickly. It is therefore ideal for diagnosing HIV infection and / or for tracking AIDS.
  • the latter also has the great advantage of directly monitoring the effects of therapeutic measures, particularly against HIV-TAT.
  • a kit for the detection of HIV-TAT in a body sample is also provided.
  • a kit for the detection of HIV-TAT in a body sample advantageously includes the following:
  • the figure shows the specific detection of HIV-TAT in body samples from HIV-1 infected people.
  • the invention is illustrated by the following example.
  • Serum samples were taken from 33 people infected with HIV-1. These were tested for the presence of TAT together with sera from 20 HIV subjects and a supernatant from HIV-1 infected H9 cells. Further was
  • the above sera were each incubated with 1% Triton X-100 and 1 M NaCl.
  • the sera were then subjected to size fractionation in the range of 5-30 kD, using centrifugation (fractionation) columns from Filtron, cf. were used above.
  • the sera were subjected to a dot blot procedure. For this purpose, they were dripped onto a nitrocellulose membrane and fixed by heat. To block remaining protein binding sites, the nitrocellulose membrane was dissolved in 5% milk powder at room temperature for 2 hours in
  • Tween 20 washed before the signal was developed by a colorimetric reaction (see Fig.). It was found that HIV-TAT can be specifically detected in a body sample using the method according to the invention.

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Abstract

The invention relates to a process for detecting HIV-TAT in a body sample comprising the steps: (a) taking a body sample and incubating it with a detergent and a high salt, (b) size-fractionating the body sample from (a), and (c) incubation of the body sample from (b) with an anti-HIV-TAT antibody. The invention also relates to a kit suitable for implementing the process.

Description

Nachweisverfahren für HIV-TAT Detection procedure for HIV-TAT
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von HIV-TAT in einer Körperprobe und einen hierfür verwendbaren Kit.The present invention relates to a method for the detection of HIV-TAT in a body sample and a kit that can be used therefor.
Es ist bekannt, daß bei AIDS T-Zellen vielfach einen programmierten Zelltod erleiden. Dieser Zelltod wird mit T-Zell-Apoptöse bezeichnet. Jüngste Arbeiten des Anmelders weisen darauf hin, daß die T-Zell-Apoptose bei AIDS durch ein mit TAT bezeichnetes HIV-Protein verstärkt wird.It is known that AIDS T cells often suffer programmed cell death. This cell death is called T cell apoptosis. Recent work by the applicant indicates that T cell apoptosis in AIDS is enhanced by an HIV protein called TAT.
Diese Erkenntnis eröffnet nun die Möglichkeit, eine HIV-Infektion bzw. AIDS besser zu verstehen und neue Therapiemaßnahmen anzudenken. Hierfür ist es allerdings notwendig, HIV-TAT in einer Körperprobe nachweisen zu können. Dies ist jedoch bisher nicht möglich.This finding now opens up the possibility to better understand HIV infection or AIDS and to think about new therapeutic measures. For this, however, it is necessary to be able to detect HIV-TAT in a body sample. So far, however, this has not been possible.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem HIV-TAT in einer Körperprobe nachgewiesen werden kann.The present invention is therefore based on the object of providing a method with which HIV-TAT can be detected in a body sample.
Erfindungsgemäß wird dies mit einem Verfahren erreicht, das folgende Ver¬ fahrensschritte umfaßt:According to the invention, this is achieved with a method which comprises the following method steps:
(a) Entnahme einer Körperprobe und Inkubation dieser mit einem Deter¬ gens und hohem Salz,(a) taking a body sample and incubating it with a detergent and high salt,
(b) Größenfraktionierung der Körperprobe von (a), und(b) size fractionation of the body sample from (a), and
(c) Inkubation der Körperprobe von (b) mit einem Anti-HIV-TAT-Anti- körper. Der Ausdruck "Körperprobe" umfaßt Körperproben jeglicher Art von Mensch und Tier. Insbesondere sind dies Blut, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle, gastroin- testinale Sekrete, Organpunktate, Biopsien und Lymphflüssigkeit.(c) Incubating the body sample from (b) with an anti-HIV-TAT antibody. The term "body sample" includes body samples of all types of humans and animals. In particular, these are blood, sputum, urine, stool, cerebrospinal fluid, bile, gastrointestinal secretions, organ punctures, biopsies and lymphatic fluid.
Für die Entnahme einer Körperprobe können übliche Verfahren verwendet wer¬ den. Die Körperprobe wird dann mit einem üblichen Detergens, z.B. NP-40 oder Triton X-100, inkubiert. Auch können mehrere Detergentien, gleichzeitig oder nacheinander, verwendet werden. Günstig ist es, insgesamt 1 % Detergens einzusetzen. Desweiteren wird der Körperprobe hohes Salz zugegeben. Dies kann ein übliches Salz, z.B. NaCI, sein. Auch können mehrere Salze, gleichzeitig oder nacheinander, verwendet werden. Günstig ist es, insgesamt 0, 1 - 1 M Salz einzusetzen. Durch die Verwendung des Detergens und hohen Salzes wird HIV¬ TAT von assoziierten Proteinen und Nukleinsäuren befreit. Ferner werden durch das Detergens HlV-Virionen in der Körperprobe inaktiviert.Conventional methods can be used for taking a body sample. The body sample is then washed with a common detergent, e.g. NP-40 or Triton X-100, incubated. Several detergents can also be used, simultaneously or in succession. It is beneficial to use a total of 1% detergent. Furthermore, high salt is added to the body sample. This can be a common salt, e.g. NaCI, be. Several salts can also be used, simultaneously or in succession. It is expedient to use a total of 0.1-1 M salt. By using the detergent and high salt, HIV-TAT is freed from associated proteins and nucleic acids. The detergent also deactivates HIV virions in the body sample.
Im weiteren wird die Körperprobe einer Größenfraktionierung unterzogen. Hierfür können übliche Verfahren, z.B. Fraktionierung durch Zentrifugations-.Fraktionie- rungs.-Säulen der Firma Filtron, Northborough, MA, USA verwendet werden. Günstig ist es, die Fraktionierung in einem Bereich von 5-30 kD durchzuführen.The body sample is then subjected to size fractionation. Common methods, e.g. Fractionation by centrifugation. Fractionation. Columns from Filtron, Northborough, MA, USA are used. It is favorable to carry out the fractionation in a range of 5-30 kD.
Desweiteren wird die Körperprobe mit einem Anti-HIV-TAT-Antikörper inkubiert. Der Ausdruck "HIV-TAT" umfaßt jegliches TAT und Fragmente davon, die von Viren stammen, welche eine HIV-Infektion bedingen und/oder AIDS auslösen können. Auch betrifft der Ausdruck jegliches TAT und Fragmente davon, die synthetisch hergestellt worden sind. Der Antikörper kann polyklonal oder mono- klonal sein, wobei ein monoklonaler Antikörper bevorzugt ist. Ferner kann der Antikörper synthetisch sein, wobei ihm gegebenenfalls Teile, die für die Erken¬ nung von HIV-TAT nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind, die dem Antikörper weitere günstige Eigen- schaften verleihen. Vorteilhaft kann es ferner sein, wenn verschiedene Anti-HIV-Furthermore, the body sample is incubated with an anti-HIV-TAT antibody. The term "HIV-TAT" includes any TAT and fragments thereof derived from viruses that can cause HIV infection and / or can cause AIDS. The term also relates to any TAT and fragments thereof that have been synthesized. The antibody can be polyclonal or monoclonal, a monoclonal antibody being preferred. Furthermore, the antibody can be synthetic, parts or parts of it that are not necessary for the detection of HIV-TAT being missing in whole or in part or these parts being replaced by others which impart further favorable properties to the antibody. It can also be advantageous if different anti-HIV
TAT-Antikörper gleichzeitig oder nacheinander verwendet werden. Besonders günstig ist es, den oder die Anti-HIV-TAT-Antikörper parallel zu vorstehender Inkubation mit einem definierten TAT-Standard zu inkubieren, wodurch ein quantitativer Nachweis von HIV-TAT in der Körperprobe erleichtert wird.TAT antibodies can be used simultaneously or sequentially. It is particularly expedient to incubate the anti-HIV-TAT antibody (s) in parallel with the above incubation with a defined TAT standard, whereby a quantitative detection of HIV-TAT in the body sample is facilitated.
Die Inkubation der Körperprobe mit dem oder den Anti-HIV-TAT-Antikörpern wie auch die Inkubation letzterer mit einem TAT-Standard kann Bestandteil eines üblichen Verfahrens, wie eines Western Blot, eines ELISA, z.B. Sandwich- oder Kompetitions-ELISA, einer Immunfluoreszenz oder einer Immunpräzipitation, sein. Hierzu kann der Antikörper, wenn es angebracht ist, markiert sein oder in Kombination mit einem markierten gegen ihn gerichteten Antikörper eingesetzt werden.Incubation of the body sample with the anti-HIV-TAT antibody (s) as well as incubation of the latter with a TAT standard can be part of a conventional method, such as a Western blot, an ELISA, e.g. Sandwich or competition ELISA, immunofluorescence or immunoprecipitation. For this purpose, the antibody can, if it is appropriate, be labeled or can be used in combination with a labeled antibody directed against it.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß HIV-TAT in einer Körperprobe nachgewiesen werden kann. Das Verfahren ist spezifisch und schnell durchführbar. Es eignet sich daher bestens zur Diagnose einer HIV- Infektion und/oder zur Verfolgung einer AIDS-Erkrankung. Letzteres beinhaltet auch den großen Vorteil, die Wirkung von Therapiemaßnahmen, insbesondere gegen HIV-TAT, direkt zu verfolgen.The method according to the invention is characterized in that HIV-TAT can be detected in a body sample. The process is specific and can be carried out quickly. It is therefore ideal for diagnosing HIV infection and / or for tracking AIDS. The latter also has the great advantage of directly monitoring the effects of therapeutic measures, particularly against HIV-TAT.
Erfindungsgemäß wird auch ein Kit zum Nachweis von HIV-TAT in einer Körper¬ probe bereitgestellt. Günstigerweise umfaßt ein solcher Kit folgendes:According to the invention, a kit for the detection of HIV-TAT in a body sample is also provided. Such a kit advantageously includes the following:
(a) Detergens,(a) detergent,
(b) Lösung hohen Salzes,(b) high salt solution,
(c) Größenfraktionierungs-Säule,(c) size fractionation column,
(d) Anti-HIV-TAT-Antikörper, (e) HIV-TAT-Standard und(d) anti-HIV-TAT antibodies, (e) HIV-TAT standard and
(f) Trägermaterial sowie übliche Hilfsstoffe.(f) carrier material and customary auxiliaries.
Die vorstehenden Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren sind hier entsprechend zu berücksichtigen.The above statements regarding the method according to the invention are to be taken into account accordingly.
Kurze Beschreibung der Zeichnung:Brief description of the drawing:
Die Figur zeigt den spezifischen Nachweis von HIV-TAT in Körperproben von HIV-1 -infizierten Personen.The figure shows the specific detection of HIV-TAT in body samples from HIV-1 infected people.
Die Erfindung wird durch das nachfolgende Beispiel erläutert.The invention is illustrated by the following example.
Beispiel: Nachweis von TAT in Körperproben von HIV- 1 -infiziertenExample: Detection of TAT in body samples from people infected with HIV-1
Personenpeople
Von 33 HIV- 1 -infizierten Personen wurden Serumproben entnommen. Diese wurden zusammen mit Seren von 20 HIV Personen und einem Überstand von HIV- 1 -infizierten H9 Zellen auf das Vorliegen von TAT getestet. Ferner wurdeSerum samples were taken from 33 people infected with HIV-1. These were tested for the presence of TAT together with sera from 20 HIV subjects and a supernatant from HIV-1 infected H9 cells. Further was
> synthetisches TAT einem Kontrollserum zugegeben, wodurch ein definierter Standard erhalten wurde.> Synthetic TAT was added to a control serum, whereby a defined standard was obtained.
Vorstehende Seren wurden jeweils mit 1 % Triton X-100 und 1 M NaCI inku- biert. Danach wurden die Seren einer Größenfraktionierung im Bereich von 5-30 kD unterzogen, wobei Zentrifugations(Fraktionierungs)-Säulen der Firma Filtron, vgl. vorstehend, verwendet wurden. Die Seren wurden einem Dot Blot- Verfahren unterworfen. Hierzu wurden sie auf eine Nitrozellulosemembran aufgetropft und durch Hitze fixiert. Zur Blockierung restlicher Proteinbindungsstellen wurde die Nitrozellulosemembran 2 h bei Raumtemperatur mit 5 % Milchpulver, gelöst inThe above sera were each incubated with 1% Triton X-100 and 1 M NaCl. The sera were then subjected to size fractionation in the range of 5-30 kD, using centrifugation (fractionation) columns from Filtron, cf. were used above. The sera were subjected to a dot blot procedure. For this purpose, they were dripped onto a nitrocellulose membrane and fixed by heat. To block remaining protein binding sites, the nitrocellulose membrane was dissolved in 5% milk powder at room temperature for 2 hours in
PBS (0,01 % N3), inkubiert. Die Nitrozellulosemembran wurde mit PBS/0,05 % Tween 20 30 min bei Raumtemperatur gewaschen. Dann wurde sie 2 h mit einem käuflichen, TAT-spezifischen Antikörper bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie 6 x jeweils 5 min mit PBS/0,05 % Tween 20 gewaschen wurde. Die Nitrozellulosemembran wurde mit einem zweiten, Peroxidase-gekoppeltenPBS (0.01% N3), incubated. The nitrocellulose membrane was washed with PBS / 0.05% Tween 20 for 30 min at room temperature. Then it was incubated for 2 hours with a commercially available, TAT-specific antibody at room temperature before being washed 6 times with PBS / 0.05% Tween 20 for 5 minutes each. The nitrocellulose membrane was coupled with a second, peroxidase
Antikörper 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, der gegen die konstante Region des ersten, TAT-spezifischen Antikörpers gerichtet war. Danach wurde die Nitrozellulosemembran 6 x jeweils 5 min mit PBS/0,05 % Tween 20 gewaschen, bevor sie mit einem Anti-Peroxidase-Komplex 2 h bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Nitrozellulosemembran wurde 6 x jeweils 5 min mit PBS/0,05 %Antibody incubated for 2 h at room temperature, which was directed against the constant region of the first, TAT-specific antibody. The nitrocellulose membrane was then washed 6 × 5 min each with PBS / 0.05% Tween 20 before being incubated with an anti-peroxidase complex for 2 h at room temperature. The nitrocellulose membrane was 6 x 5 min each with PBS / 0.05%
Tween 20 gewaschen, bevor das Signal durch eine colorimetrische Reaktion entwickelt wurde (vgl. Fig.). Es zeigte sich, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren HIV-TAT in einer Körperprobe spezifisch nachgewiesen werden kann. Tween 20 washed before the signal was developed by a colorimetric reaction (see Fig.). It was found that HIV-TAT can be specifically detected in a body sample using the method according to the invention.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zum Nachweis von HIV-TAT in einer Körperprobe, umfassend die folgenden Verfahrensschritte:1. A method for the detection of HIV-TAT in a body sample, comprising the following method steps:
(a) Entnahme einer Körperprobe und Inkubation dieser mit einem Deter- gens und hohem Salz,(a) taking a body sample and incubating it with a detergent and high salt,
(b) Größenfraktionierung der Körperprobe von (a), und(b) size fractionation of the body sample from (a), and
(c) Inkubation der Körperprobe von (b) mit einem Anti-HIV-TAT-Anti¬ körper.(c) Incubation of the body sample from (b) with an anti-HIV-TAT antibody.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Körper¬ probe Blut, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle, gastrointestinales Sekret, Organpunktat, Biopsie und/oder Lymphflüssigkeit ist.2. The method according to claim 1, characterized in that the body sample is blood, sputum, urine, stool, cerebrospinal fluid, bile, gastrointestinal secretion, organ punctate, biopsy and / or lymph fluid.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt (a) 1 % Detergens und 0,1 bis 1 M Salz verwendet werden.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that 1% detergent and 0.1 to 1 M salt are used in process step (a).
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt (b) eine Größenfraktionierung von 5-30 kD erfolgt.4. The method according to any one of claims 1-3, characterized in that in step (b) there is a size fractionation of 5-30 kD.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren ferner den Verfahrensschritt (d) umfaßt, in dem der Anti- HIV-TAT-Antikörper von Verfahrensschritt (c) mit einem TAT-Standard inkubiert wird.Method according to one of claims 1-4, characterized in that the method further comprises step (d) in which the anti-HIV-TAT antibody from step (c) is incubated with a TAT standard.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt (c) und der Verfahrensschritt (d) Bestandteil eines Western Blot, eines ELISA, einer Immunfluoreszenz oder einer Immun- präzipitation sind. 7. Kit zum Nachweis von HIV-TAT in einer Körperprobe, umfassend:Method according to one of claims 1-5, characterized in that process step (c) and process step (d) are part of a Western blot, an ELISA, an immunofluorescence or an immunoprecipitation. 7. A kit for detecting HIV-TAT in a body sample, comprising:
(a) Detergens,(a) detergent,
(b) Lösung hohen Salzes,(b) high salt solution,
(c) Größenfraktionierungs-Säule,(c) size fractionation column,
(d) Anti-HIV-TAT-Antikörper,(d) anti-HIV-TAT antibodies,
(e) HIV-TAT-Standard, und(e) HIV-TAT standard, and
(f) Trägermaterial sowie übliche Hilfsstoffe. (f) carrier material and customary auxiliaries.
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