JPH11500918A

JPH11500918A - Methods for expressing modified recombinant proteins in bacterial systems

Info

Publication number: JPH11500918A
Application number: JP8526380A
Authority: JP
Inventors: マカージ，プレイデイツプ; サーマンド，エム・ジエニフアー; ハンソン，エル・ステイーク
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-02-27
Filing date: 1996-02-27
Publication date: 1999-01-26
Also published as: NZ304538A; CA2213857A1; WO1996027017A1; EP0812361A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、外因性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、そのタンパク質を修飾するための特異的酵素をコード化するヌクレオチド配列の両方をタンデムに含む単一ベクターを使用して、修飾組換えタンパク質を宿主細胞内で生産するための方法を提供する。更に、本発明は、特に、ヒトタンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、そのタンパク質のリン酸化のための特異的なヒトキナーゼをコード化するヌクレオチド配列をタンデムに含む単一ベクターを使用して、細菌系内で組換えリン酸化ヒトタンパク質を生産する方法を提供する。 (57) [Summary] The present invention provides for the use of a single vector comprising, in tandem, both a nucleotide sequence encoding an exogenous protein and a nucleotide sequence encoding a specific enzyme to modify the protein, to provide a modified recombinant protein. Methods for producing in a host cell are provided. In addition, the present invention specifically provides for the use of a single vector comprising, in tandem, a nucleotide sequence encoding a human protein and a nucleotide sequence encoding a specific human kinase for phosphorylation of the protein. A method for producing a recombinant phosphorylated human protein in a system is provided.

Description

【発明の詳細な説明】細菌系内で修飾組換えタンパク質を発現させるための方法技術分野本発明は、細菌系内で修飾組換えタンパク質を生産するための新規の方法に係わる。この方法は、外来性タンパク質と、そのタンパク質をインビボで修飾することが可能な酵素をコード化するヌクレオチド配列を有する単一ベクターを調製することと、宿主細胞中でこのベクターを発現させて修飾タンパク質を生産することを含む。本発明の１つの側面は、プロモーターと、その後に続くタンパク質コード化配列と、更にその後に続く酵素コード化配列とを含む、単一ベクターに係わる。発明の背景人乳が人間の乳幼児のための最良の栄養源であることが一般に認められている。人乳は、発達中の乳幼児にとって理想的な栄養物であるばかりでなく、様々な生物による感染から乳幼児を保護する免疫グロブリンと非免疫因子の両方も含む。更に、人乳は乳幼児によって容易に消化され、牛乳を主成分とする乳幼児用調合乳よりもアレルギー反応を引き起こす可能性が低い。人乳は、牛乳及び他の哺乳動物種の乳とは様々な点で異なっている。総タンパク質含量とタンパク質の種類は、人乳と牛乳との間で異なっている。４つの主要なウシカゼインが既に同定されている。牛乳は、２つのαカゼイン、βカゼイン、及び、κカゼインを含むが、人乳はβカゼインとκカゼインしか含まない。更に、人乳タンパク質のアミノ酸配列は、他の哺乳動物の乳タンパク質とは異なっている。人乳の有利な特性の幾つかを有し、且つ、乳幼児によるアレルギー反応と不完全消化のような、牛乳を主成分とする乳幼児用調合乳に関連した欠点を克服する乳幼児用調合乳を開発する努力がこれまで行われてきた。これを実現するための直感的に望ましい方法は、人乳タンパク質をその自然形態で含む既知の人乳構成要素の幾つかを調合乳に添加することである。ウシ及び他の哺乳動物の乳タンパク質のアミノ酸配列とは異なったアミノ酸配列を有するヒトカゼインは、その自然形態で乳幼児用調合乳に添加される場合に、調合乳の栄養的価値を増大させる働きをし且つ非人乳タンパク質の固有の欠点を低減させることが可能な、重要な物質である。乳幼児の成長と発達に求められるタンパク質の合成に必要なアミノ酸の供給源であることに加えて、人乳は、他の重要な生物学的機能を有するタンパク質（カゼインを含む）を含むことが知られている。 βカゼインは、乳腺内で合成される最も豊富な乳タンパク質の１つである。ゴルジ装置中での翻訳後修飾の後に、βカゼインが、ミセルと呼ばれる大きなカルシウム依存性凝集体として分泌される。βカゼインは単一の実体ではなく、泌乳刺激ホルモンに反応した乳分泌時に分泌されるリンタンパク質の混成グループである。ヒトβカゼインの一次構造は、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２５９：５１３２−５１３８，１９８４）によって決定された。この構造は、アミノ末端付近に位置する特定のセリル残基とトレオニル残基とにリン酸化部位を有するリン酸化タンパク質であることが明らかにされた。ヒトβカゼインとウシβカゼインの比較によって、４７％の同一性が確認された。ヒトβカゼインの配列は、Ｂｒｉｇｎｏｎ他（ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｉｅｓＬｅｔｔｅｒｓ１８８：４８−５４，１９８５）によって決定された。βカゼインはリン酸化され、一方、κカゼインはグルコシル化されている。人乳カゼインには幾つかの生物学的効果があり、こうした効果は、（１）カルシウム吸収の強化、（２）アンギオテンシンＩ変換酵素の阻害、（３）オピオイドアゴニズム、並びに、（４）免疫刺激及び免疫調節作用を含む。ヒトカゼインは、多量（＞８０％）のβ形と、より少ない量のκ形とから構成される（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他）。自然βカゼインは、２５ｋＤａタンパク質である。人乳中では、βカゼイン分子は、ポリペプチド鎖１つ当たり０個から５個までのリン酸基の範囲内で様々な度合いの翻訳後リン酸化を示す（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他，１９８４、及び、Ｈａｎｓｓｏｎ他，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ４：３７３−３８１，１９９３）。自然タンパク質のリン酸基は、アミノ末端付近のセリン残基とトレオニン残基とに結合している（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他，１９８４）。細菌細胞中の外来性遺伝子の発現は、組換え真核生物タンパク質を生産するための有効な方法を提供する。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌は、翻訳後修飾を行うために必要な内因性酵素を持たないので、多くの真核生物タンパク質に必要とされる翻訳後修飾を生じさせることが不可能である。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産される真核生物タンパク質には、真核細胞中で生じる可能性がある特定の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、又は、アミド化）が欠如している。適切なクローニング手法が開発される前は、化学試薬を使用して、キナーゼによる精製タンパク質のリン酸化がインビトロで行われた。このプロセスでは、タンパク質基質とキナーゼ酵素とを精製することが必要であり、これは、工業目的では非効率であり、費用有効性が低い。更に、工業化のためにプロセスの大規模化が求められる場合には、インビトロのプロセスは非効率的である。従って、タンパク質をインビボでリン酸化するために微生物を遺伝子操作するための方法を開発することが必要とされている。カナダ特許出願Ｎｏ．２，０８３，５２１（Ｐａｗｓｏｎ他）は、宿主細胞内でリン酸化外因性タンパク質を生産する方法を開示する。Ｐａｗｓｏｎ他の方法では、細菌細胞中に２つのベクターを導入することが必要である。一方のベクターは、タンパク質キナーゼの触媒ドメインによってリン酸化されることが可能な外因性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を有する。他方のベクターは、タンパク質キナーゼの触媒ドメインをコード化するヌクレオチド配列を有する。これらの両方のベクターをＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、外因性タンパク質をリン酸化するように、外因性タンパク質の生産とタンパク質キナーゼ触媒ドメインの生産とを誘導する。その後で、細菌細胞を溶解し、標準的な単離方法を使用して、外因性リン酸化タンパク質を単離する。カナダ特許出願Ｎｏ．２，０８３，５２１は、本発明の方法を示唆も開示もしていない。本発明は、基質とキナーゼ酵素の両方を発現させる単一のベクターを使用する。Ｐａｗｓｏｎ他の方法では、２つのベクターを使用することが必要である。本明細書で開示する発現系は、ホスホセリンに対する抗体によって判定されるような外因性タンパク質の特異的なリン酸化を生じさせ、一方、Ｐａｗｓｏｎ他の発現系は、宿主タンパク質と外因性タンパク質の両方の非特異的リン酸化を生じさせる。これは、工業的用途のための大規模化作業において宿主細菌の増殖に悪影響を与えるだろう。本発明は、Ｐａｗｓｏｎ他の方法とは違って、工業的生産に適したリン酸化組換えタンパク質の高レベルの生産を可能にする。Ｓｉｍｃｏｘ他，Ｓｒａｔｅｇｉｅｓｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ７（３）：６８−６９（１９９４）は、チロシンキナーゼプラスミドを含む２つのＥ．ｃｏｌｉ菌株を作成した。これらのＴＫ（チロシンキナーゼ）菌株を使用して、リン酸化標的ドメイン又はタンパク質をコード化する配列を含むプラスミドで形質転換することによって、リン酸化タンパク質を産生することが可能である。上記Ｅ．ｃｏｌｉ菌株は両方とも誘導性チロシンキナーゼ遺伝子を有する。一方の菌株であるＴＫＢ１を、Ｔ７プロモーターによってその発現が方向付けられる遺伝子を発現させるために使用することが可能である。Ｓｉｍｃｏｘ他によって開発された系は、２つの構築物、即ち、チロシンキナーゼを含むプラスミドと、リン酸化されるべきタンパク質又はドメインをコード化する遺伝子を含むプラスミドベクターとを必要とするという点で、本発明とは異なっている。ヒトβカゼインの構造と機能をより適切に理解するために、且つ、ヒトβカゼインの合成と分泌の調節に影響を与える因子の調査研究を可能にするために、このタンパク質をコード化するｃＤＮＡをクローニングして配列決定し（Ｌｏｅｎｎｅｒｄａｌ他，ＦｅｄｅｒａｔｉｏｎｏｆＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｉｅｓＬｅｔｔｅｒｓ２６９：１５３−１５６，１９９０）、人乳βカゼインをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとの中で生産した（Ｈａｎｓｓｏｎ他，１９９３）。Ｈａｎｓｓｏｎ他は、ｐＹＥＳ２．０ベクター（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、組換えヒトβカゼインが酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現させられることを実証した。生産レベルは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で得られる生産の約１０％であると推定された。しかし、タンパク質をリン酸化することが可能な内因性酵素を有する真核細胞であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得られた組換えβカゼインは、リン酸化されたが、自然状態ではタンパク質をリン酸化する能力を持たない原核細胞であるＥ．ｃｏｌｉによって生産されたタンパク質は、リン酸化されなかった。更に、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産され且つＥ．ｃｏｌｉから精製される組換えヒトカゼインキナーゼＩＩ（ｒｈＣＫＩＩ）がインビトロでタンパク質基質をリン酸化することが可能であることが明らかにされた（Ｓｈｉ他,ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ９１：２７６７−２７７１，１９９４）。本発明の１つの特定の実施様態では、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換して、リン酸化βカゼインを生産するために、単一の構築物内においてβカゼインコード化ヌクレオチド配列と共に組換えヒトカゼインキナーゼＩＩコード化ヌクレオチド配列を使用する。発明の要約本明細書では、外因性タンパク質とその外因性タンパク質を修飾することが可能な酵素の両方をコード化する単一ベクターを調製することを含む、宿主細胞中で修飾組換えタンパク質を生産するための方法を開示する。本発明のプロセスによって修飾されることが可能な外因性タンパク質の代表的な例は、非限定的に、ヒトカゼイン（βカゼインを含む）、細胞受容体タンパク質、脂肪アシル化タンパク質（パルミトイル化タンパク質を含む）、哺乳動物筋肉タンパク質、レトロウイルスのｇａｇポリタンパク質、及び、レトロウイルスｓｒｃキナーゼの標的となる哺乳動物タンパク質を含む。合成後に共有結合パルミチン酸基を獲得する貫膜糖タンパク質は、インスリン、β２−アドレナリン性受容体、及び、トランスフェリン受容体を含む。細胞表面受容体、チロシンキナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、その基質、ホスファターゼ、Ｇタンパク質、及び、Ｃａ²⁺として機能するタンパク質が、脂肪アシル化されることが知られている。宿主細胞内の特定の外因性タンパク質に官能基を転移させる能力を有する本発明で使用可能な代表的な酵素は、非限定的に、キナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ、又は、カゼインキナーゼ）、トランスフェラーゼ（例えば、哺乳動物及び酵母パルミトイルトランスフェラーゼ）、及び、レトロウイルスのｓｒｃ遺伝子によってコード化されるキナーゼを含む。本発明で使用可能なプロモーターの代表的な例は、誘導プロモーター（例えば、Ｔ７、πＰＬ、π Ｐ_R、及び、Ｔａｃ）、及び、構成的プロモーター（例えば、ｂｌａ及びｓｐａ）を含む。形質転換によって修飾タンパク質を発現させることが可能な宿主細胞の代表的な例は、非限定的に、細菌細胞であるＥ．ｃｏｌｉＫ−１２及びＥ．ｃｏｌｉＢ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、及び、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、並びに、酵母細胞又は哺乳動物細胞のような真核細胞を含む。外因性タンパク質は、それを生産する生物の外に起源を有するタンパク質である。この術語は、形質転換された宿主生物によって生産される組換えタンパク質を意味するものとして、ＤＮＡクローニング関連文献で使用されることもある。或いは、ＤＮＡクローニング方法を使用して生産する外因性タンパク質を、組換えタンパク質と呼ぶこともあり得る。これらの術語は、関連文献中で区別されずに使用されることが多く、従って、本明細書では同義の術語として使用する。しかし、本発明の開示内容に関する説明では、術語「組換え」を、形質転換生物によって生産されるタンパク質を表すものとして使用し、術語「外因性の」を、自然非組換えタンパク質、又は、そのタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を表す場合に使用する。本明細書で開示するのは、宿主細胞内で修飾組換えタンパク質を生産するための方法であり、この方法は、プロモーター配列と、外因性タンパク質配列と、その外因性タンパク質を修飾することが可能な酵素をコード化するヌクレオチド配列とを有する単一ベクターを調製する段階と、上記ベクターで上記宿主細胞を形質転換する段階と、生産される組換えタンパク質を生産される酵素が修飾するように上記宿主細胞内でベクターを発現させる段階と、生産された修飾組換えタンパク質を単離する段階とを含む。本発明の更に特定の実施様態では、宿主細胞内でリン酸化組換えタンパク質を生産するための方法を開示し、この方法は、プロモーター配列と、その後に続く、タンパク質キナーゼによってリン酸化されることが可能な外因性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、更にその後に続く、外因性タンパク質をリン酸化することが可能なタンパク質キナーゼをコード化するヌクレオチド配列とを有する単一ベクターを調製する段階と、上記宿主細胞を上記ベクターで形質転換する段階と、生産されるタンパク質キナーゼが、生産される組換えタンパク質をリン酸化するように、上記ベクターを上記宿主細胞内で発現させる段階と、リン酸化されたタンパク質を単離する段階とを含む。更に明確に述べれば、本発明は、細菌発現系内で修飾組換えヒトタンパク質を生産するための新規の方法を提供する。ヒトカゼインキナーゼのアルファ及びベータサブユニットをそれぞれ発現させる２つのヒトカゼインキナーゼコード化配列の組合せを使用した時に、Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換えリン酸化ヒトβカゼインのインビボ生産が得られた。ヒトカゼインキナーゼＩＩコード化配列を、βカゼインコード化配列とタンデムに配置し、その結果として、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産される組換えβカゼインの大部分が人乳の場合と同様にリン酸化された。更に、形質転換された宿主細胞内における組換えタンパク質のインビボの特異的なグリコシル化、アミド化もしくはアセチル化を生じさせるために、又は、形質転換宿主細胞内において適切な組換えタンパク質基質に脂肪酸を転移させるために、本発明の方法を使用することも可能である。本発明の特定の実施様態では、ヒトカゼインキナーゼＩＩ（ｈＣＫＩＩ βα ）をコード化するヌクレオチド配列が、細菌発現系内において、ヒトβカゼインコード化ヌクレオチド配列と共に単一の構築物内で同時発現させられ、組換えヒトβカゼインの適切なセリン残基及びトレオニン残基の効率的なインビボリン酸化を実現する。ｈＣＫＩＩ βαコード化ヌクレオチド配列とヒトβカゼインコード化ヌクレオチド配列とを単一の誘導発現ベクターを使用してＥ．ｃｏｌｉ中で同時発現させた実験によって、組換えｈＣＫＩＩ βαが組換えβカゼインをインビボでリン酸化する能力があることが実証された。これは予想外の非自明な結果であり、実験と創意とが求められた。初期の対照実験では否定的な結果が得られたように、本明細書で開示する発明の結果は非予測的であった。本明細書の方法は、有益なヒトタンパク質を栄養物製品と調剤製品とに添加することを可能にする有効で有益な結果を生じさせる。図面の簡単な説明図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ内での誘導細胞内発現のために作成した発現ベクターｐＳ６３７及びｐＲＪＢ−６の物理的地図を示す。１９１塩基対をｐＳ６３７から除去し、ＰＲＪＢ−６を生産した。図２は、発現ベクターｐＲＪＢ−６及びｐＲＪＢ−９の物理的地図を示し、どのようにｐＲＪＢ−６を切断し、ＣＫＩＩ βαにライゲーションさせ、ｐＲＪＢ−９を形成したかを説明する。図３は、発現ベクターｐＳ６３７及びｐＲＪＢ−７の物理的地図を示し、どのようにｐＳ６３７を切断し、ＣＫＩＩ βαにライゲーションさせ、ｐＲＪＢ− ７を形成したかを説明する。ｐＲＪＢ−７は、βカゼイン遺伝子とカゼインキナーゼ遺伝子の両方の前にＴ７プロモーターを有する。図４は、誘導発現を生じさせ且つＥ．ｃｏｌｉ内での細胞内局在性タンパク質の生産を仲介するために作成した、発現ベクターｐＳ７５０の物理的地図を示す。図５は、ベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩβαを使用してＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１菌株内で生産し、クーマシーブリリアントブルーで染色したＭｅｔ−βカゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌ではタンパク質合成がアミノ酸のメチオニンで開始するので、プラスミドｐＳ７５０の作成において、メチオニン（Ｍｅｔ）のコドンをβカゼインコード化配列の前に置いた。これは、ポリペプチド鎖の成長のための出発点をリボソームが認識することを可能にする。細胞内組換えβカゼインの生産は、生産されるべきタンパク質をコード化する配列の前にＭｅｔが挿入される場合にだけ可能である。レーン１：分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、前染色、相対分子量１０６、８０、４９．５、３２．５、２７．５、１８．５ｋＤａ）、レーン２：非リン酸化組換えβカゼイン、レーン３：５Ｐ−βカゼイン、レーン４：ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン５：ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン６：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン７：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン８：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン９：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン１０：５個の結合リン酸基を有する自然βカゼイン（５Ｐ−βカゼイン）。矢印はβカゼインのバンドを示す。図６は、ベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαを使用してＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１菌株内で生産し、ＥｔｈｙｌＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌで染色した、Ｍｅｔ−βカゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：５個の結合リン酸基を有する自然βカゼイン（５Ｐ−βカゼイン）、レーン２：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ− １１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン３：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン４：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩβα、レーン５：ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン６：ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩβα、レーン７：ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン８：５Ｐ−βカゼイン、レーン９：非リン酸化組換えβカゼイン、レーン１０：分子量マーカー（Ｂｉｏ −Ｒａｄ、前染色、相対分子量１０６、８０、４９．５、３２．５、２７．５、１８．５ｋＤａ）。矢印はリン酸化βカゼインのバンドを示し、このバンドはオリジナルの写真では緑色のバンドとして見える。図７は、ベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩを使用してＥ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内で生産し、ＥｔｈｙｌＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌで染色した、Ｍｅｔ−βカゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１：分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、前染色）、レーン２：非誘導ｐＳ７５０、レーン３：ＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン４：非誘導ｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩβα、レーン５：ＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン６：非誘導ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン７：ＩＰＴＧで誘導したｐＥＴ −１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン８：天然５Ｐ−βカゼイン、レーン９：組換えβカゼイン、レーン１０：分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、前染色、相対分子量１０６、８０、４９．５、３２．５、２７．５、１８．５ｋＤａ）。矢印はリン酸化βカゼインのバンドを示し、このバンドはオリジナルの写真では緑色のバンドとして見える。図８は、ヒトβカゼインに対する抗体を使用するウェスタンイムノブロット分析を示す。レーン１：分子量マーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、相対分子量４３．１、２９．２、１８．８、１６．５、６．４ｋＤａ）、レーン２：天然ヒト βカゼイン５０ｎｇ、レーン３：非誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−７）、レーン４：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−７）、レーン５：非誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ− １１ｄ−ＣＫＩＩ βα）、レーン６：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα）、レーン７：非誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン８：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）。図９は、ホスホセリンに対する抗体を使用するウェスタンイムノブロット分析を示す。レーン１：低分子量マーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、相対分子量４４、２８．７、１８．５、１４．７、５．８、２．９ｋＤａ）、レーン２：天然ヒトβカゼイン１μｇ、レーン３：天然ヒトβカゼイン２μ ｇ、レーン５：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα）、レーン６：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン７：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−７）、レーン８：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レーン１０：組換えヒトβカゼイン１μｇ、レーン１１：組換えヒトβカゼイン２μｇ。図１０は、ヒトβカゼインに対する抗体を使用するイムノブロット分析を示す。レーン１：分子量マーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、相対分子量４４、２８．９、１８．５、１４．７、５．８ｋＤａ）、レーン２：自然ヒトβカゼイン１ μｇ、レーン３：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン４：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レーン５：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα ）、レーン６：組換えヒトβカゼイン。図１１は、ホスホセリンに対する抗体を使用するイムノブロット分析を示す。レーン１：分子量マーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、相対分子量４４、２８．９、１８．５、１４．７、５．８、２．９ｋＤａ）、レーン２：自然ヒトβカゼイン１μｇ、レーン３：自然ヒトβカゼイン５００ｎｇ、レーン４：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン５：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レーン６：誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα）、レーン７：組換えヒトβカゼイン１μｇ、レーン８：組換えヒトβカゼイン５００ｎｇ。発明の詳細の説明上記のように、本発明は、宿主細胞内で修飾組換えタンパク質を生産するための方法に係わる。更に特定の実施様態では、本発明は、細菌細胞内でリン酸化ヒトタンパク質を生産するための方法に係わる。この方法は、タンパク質キナーゼによってリン酸化されることが可能な外因性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、適切なタンパク質キナーゼをコード化するヌクレオチド配列との両方を有する単一ベクターを調製する段階と、生産される組換えタンパク質を生産されるキナーゼがリン酸化するように、上記宿主細胞内で上記ベクターを発現させる段階と、リン酸化組換えタンパク質を単離する段階とを含む。本発明は、更に、リン酸化すべきタンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、上記キナーゼをコード化するヌクレオチド配列とを、プロモーターと共に単一構築物内にタンデムに置くことによって、高レベルの特異的なリン酸化が得られると同時に、抗生物質耐性遺伝子をマーカーとして使用する必要といった多重ベクターに関連した不利な特徴を取り除くことが可能になるという予想外の発見を提供する。単一構築物系の使用は、工業用に使用するために手順を大規模化することを容易にする。外因性タンパク質を発現させることが可能なあらゆる宿主細胞系で本発明の方法が有効であることが意図されている。適切な宿主細胞は、細菌のような原核生物の細胞と、酵母や哺乳動物のような真核生物の細胞とを含む。本発明の好ましい実施様態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。幾つかの異なった発現フォーマットのβカゼインコード化ヌクレオチド配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株内での組換えβカゼインの発現に関して評価した。単一構築物の中にヒトカゼインキナーゼＣＫＩＩ βαコード化配列と共にヒトβカゼインコード化配列を置いた場合に、組換えヒトβカゼインが効率的にリン酸化されたことを、一連の実験の後に確認した。１つのプラスミド内に両方の遺伝子をタンデムに置いた場合のリン酸化の効率は、２つのベクター内に別々にキナーゼコード化配列とβカゼインコード化配列とを置いた実験系のリン酸化効率に比較して、劣ってはいなかった。材料と方法実施例１から実施例５で説明する検査において次の材料と方法を使用した。更に別の材料及び／又は方法を、必要に応じて個々の実験に関して説明する。プラスミド図１に示すプラスミド構築物ｐＳ６３７は、１９位の追加のグルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基をコード化することを除いて、本明細書に引例として組み入れているＨａｎｓｓｏｎ他（１９９３）において作成され説明されているｐＳ２６と同一である。当初の発現ベクターｐＳ２６を修飾して、ヒト集団に見い出される最も多い変異型と同一である組換えβカゼインタンパク質を生産するｐＳ６３７を生じさせた。本明細書に引例として組み入れているカゼインキナーゼＩＩコード化ヌクレオチド配列（Ｓｈｉ他、１９９４）を同時発現させるために、２つのキナーゼサブユニットｂ及びａをコード化するＣＫＩＩ βαコード化ヌクレオチド配列をカセットとしてβカゼインコード化ヌクレオチド配列の下流に置くことによって作成物ｐＳ６３７を調製した。３シストロンタンデム発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ −ＣＫＩＩ βαは、Ｓｈｉ他（１９９４）によって産生されたＣＫＩＩ βα を含むプラスミドである。最初に、ｐＳ６３７を、βカゼインコード化配列の下流の２つの部位で切断し、再ライゲーションさせた。これらの２つの切断部位の間の１９１塩基を失った図１に示すプラスミドｐＲＪＢ−６を単離した。ｐＲＪＢ−６の中に挿入するためにキナーゼＣＫＩＩ βαを調製した。挿入後に得た作成物（図２に示す）をｐＲＪＢ−９と名付けた。ｐＲＪＢ−９は、リン酸化β カゼインの生産を仲介するように設計した単一構築物である。ｐＳ６３７を修飾し、プラスミドｐＳ７５０及びｐＲＪＢ−７を作成したが、これらのプラスミドについては下記で更に詳細に説明する。宿主細胞下記の本発明の特定の実施様態では、上記ベクターで形質転換した宿主生物はＥ．ｃｏｌｉだった。本発明の方法で使用可能な他の代表的な生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、及び、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種を含む。プロモーター下記の本発明の特定の実施様態では、Ｔ７プロモーターを使用した。本発明の方法で使用可能な他の代表的なプロモーターは、誘導プロモーターπＰ_L、πＰ_R 、及び、Ｔａｃと、構成的プロモーターｂｌａ及びｓｐａとを含む。細菌発現のためのプラスミドの作成：詳細な方法発現ベクターＳ６３７発現ベクターｐＳ６３７は、βカゼインコード化配列の１９位のグルタミン（Ｇｌｎ）アミノ酸残基をコード化するヌクレオチドトリプレットを含むので、Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９９３）で説明されているｐＳ２６と異なっている。このヌクレオチド配列を、ｐＳ２６配列よりも一般的にヒト集団中に見い出されるヒトｃＤＮＡ変異型から単離した。２つの合成オリゴヌクレオチドを、ボリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために合成した。この合成オリゴヌクレオチドは、細菌によって優先的に使用されるアミノ酸のための利便性が高い制限部位と取込みコドンとを与える。次の配列を有する２つのオリゴヌクレオチドを、ＳＹＭ４１７４（配列番号：１）とＳＹＭ４１７５（配列番号：２）と名付けた。Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９９２）で説明されている通りにＰＣＲ増幅を行い、増幅断片をＰｓｔＩとＡｖａＩＩとで消化し、８５ｂｐ断片を産生した。Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９９３）で説明されているプラスミドｐＳ２１を、ＥｃｏＲＶとＡｃｃＩとで消化し、３２８ｂｐ断片をゲル電気泳動で単離した。単離した断片を、電気溶出によってアガロースゲルから精製し、ＡｖａＩＩで消化した。これによって、１９７ｂｐＡｖａＩＩ／ＡｃｃＩ断片が得られ、この断片を精製した。８５ｂｐＰｓｔＩ／ＡｖａＩＩ消化ＰＣＲ増幅断片と１９７ｂｐＡｖａＩＩ／ＡｃｃＩ断片とを、Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９９３）で説明されているプラスミドであるＰｓｔＩ／ＡｃｃＩ消化ｐＳ２５の中にライゲーションさせた。その結果得たプラスミド作成物を配列決定し、ｐＳ６３６と名付けた。６４４ｂｐＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限断片をｐＳ６３６から単離し、Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９９３）で説明されているプラスミドであるＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ベクターｐＳ２６の中に導入した。その結果得た発現ベクターをｐＳ６３７と名付けた。発現ベクターｐＲＪＢ−９Ｓｈｉ他（１９９４）によって産生されたＣＫＩＩ βαコード化配列を含むｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαプラスミドを、組換えβカゼインとの同時発現のために調製した。最初に、βカゼインコード化配列から下流の２つのＥｃｏＲＩ部位を切断し、ｐＳ６３７を再ライゲーションさせることによって、１９１塩基対（ｂｐ）をｐＳ６３７から除去した。プラスミドｐＲＪＢ−６（図１）を単離し、このプラスミドは、上記２つの部位の間の１９１ｂｐを失っていたが、β カゼインコード化配列の３′末端から１３２ｂｐ離れた位置にある単一ＥｃｏＲｖ部位を保持していた。ＣＫＩＩ βαコード化配列を含むプラスミドｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαを、ＣｌａＩで切断し、その部位をクレノウ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）で補填し、平滑末端を生じさせた。補填したＣｌａＩ切断ＣＫＩＩコード化配列を、βカゼインコード化配列から下流に、ｐＲＪＢ−６の中に挿入し、その結果得た作成物をｐＲＪＢ−９と名付け、図２に示す。発現ベクターｐＲＪＢ−７ βカゼインコード化配列の直後にＣＫＩＩ βαコード化配列を置くことによって、組換えβカゼインとＣＫＩＩ βαキナーゼとの同時発現を生じさせるための作成物ｐＳ６３７を調製した。ＣＫＩＩ βαコード化配列を、ｐＳ６３７のＢａｍＨＩ部位の中にＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片として置き、ｐＲＪＢ−７と名付けた。この断片は、その当初のベクターｐＥＴ−ＩＩｄ−ＣＫＩＩ βα からのＴ７プロモーターを含んでいた。従って、図３に示すように、ｐＲＪＢ− ７は２つのＴ７プロモーターを含み、その一方はβカゼインコード化配列の前に位置し、他方はＣＫＩＩ βαコード化配列の前に位置する。発現ベクターｐＳ７５０アンピシリン耐性からカナマイシン耐性に選択マーカーを変化させるために、プラスミドｐＳ６３７をＰｖｕＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平滑末端を産生した。直線化ベクターを単離し、ＨｉｎｃＩＩカナマイシン耐性ｇｅｎｂｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）とライゲーションさせた。その結果得た発現ベクターをｐＳ７５０と名付けた（図４）。組換えヒトカゼインキナーゼＩＩのための発現ベクター発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα（Ｓｈｉ他，１９９４）は、ｔｈｅＨａｒｖａｒｄＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡのＣ．Ｗａｌｓｈ博士によって提供された。Ｓｔｕｄｉｅｒ他（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１８５：６０−８９，１９９０）によって説明されている通りに発現実験を行った。カルベニシリンに対する耐性を与える遺伝子を含むプラスミドであるｐＥＴ−１１ｄ −ＣＫＩＩ βαの場合には、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬを含むルリアブイヨン（ＬＢ培地）の中で細菌を増殖させ、カナマイシンに対する耐性を与える遺伝子を含むプラスミドであるベクターｐＳ７５０の場合にはカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むルリアブイヨンの中で細菌を増殖させた。クロラムフェニコールに対する耐性を与えるｐＬｙｓプラスミドを含む菌株を使用した時には、上記培地にクロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬを加えた。Ｔ７発現系の誘導のために、培養をＯＤ６００＝約０．５の密度に増殖させ、その後で、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．４ｍＭを加えた。誘導約９０分後に細胞を収集した。組換えβαカゼインの電気泳動と検出遠心分離によって細胞をペレット化し、培養１ｍＬからのペレットを、Ｔｒｉｓ、グリセロール、ＳＤＳ、ジチオトレオトール（ＤＴＴ）及びブロモフェノールブルーを含む試料緩衝液１００μＬ中に溶解した。Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５，１９７０）に記述されている通りにＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離させた。勾配ゲルを形成し、Ｐｒｏｔｅａｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）電気泳動装置内の不連続緩衝液系中で泳動させた。Ｌａｅｍｍｌｉの記述の通りにゲルを染色した。装置の製造者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の仕様書に従ってイムノブロットを行った。修飾タンパク質の単離のための手順当業者に公知の標準的な手順のいずれかによって修飾タンパク質を単離することが可能である。こうした標準的手順の代表的な例は次の通りである。標準的な物理的又は化学的手順によって細胞を収集し破裂させる。その後で細胞を緩衝液中に懸濁させ、均質化し、遠心し、上清液を取り除く。その結果得た不溶性ペレットを再懸濁させ、上清液を取り除く。洗浄した不溶性ペレットを得、５０ｍＭＴｒｉｓ及び６Ｍ尿素（ｐＨ８．２）中に懸濁させ、均質化する。βカゼイン上清液Ｉを取り除き、不溶性抽出物を得、この抽出物を、５０ｍＭＴｒｉｓ及び６Ｍ尿素（ｐＨ８．２）中に再懸濁させ、均質化する。βカゼイン上清液１１を取り除き、上清液Ｉと上清液ＩＩをプールする。残留する不溶性抽出物を除去する。プールした上清液を、５０ｍＭＴｒｉｓ及び（ｐＨ８．２）で１：１に希釈し、３Ｍ尿素で処理し、βカゼインを抽出する。５０ｍＭエタノールアミン及び１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ９．５）に対してβカゼイン尿素抽出物を透析し、遠心し、５０ｍＭエタノールアミン及び１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ９．５）中で５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈することによって、最終的なβカゼイン溶液を得る。ペレットを取り除く。実施例実施例１と実施例２に説明する実験は、βカゼインコード化ヌクレオチド配列とカゼインキナーゼコード化ヌクレオチド配列を別々に含む２つのベクターによって細菌を同時形質転換する場合に、組換えβカゼインの生産に悪影響が生じないことを示す。更に、これらの実施例は、組換えリン酸化βカゼインを細菌系内のこれら２つのベクターを使用して生産することが可能であることも実証する。実施例４は、プロモーターと、転写及びリン酸化されるべきタンパク質をコード化するヌクレオチド配列とキナーゼをコード化するヌクレオチド配列の両方とを含む単一構築物を細菌菌株の形質転換に使用した系を説明する。実施例４では、単一プラスミドを使用する組換えリン酸化βカゼインの生産を示した。ヒト自然βカゼインと同一である細胞外局在性組換えリン酸化βカゼインの発現のための単一構築物系を、実施例５で説明する。実施例１：Ｅ．ｃｏｌｉＢ内でのβαカゼインの生産：細胞内局在性組換えＭｅｔ− カゼインのリン酸化：ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株細菌発現系内でインビボで組換えβカゼインをリン酸化する組換えヒトＣＫＩＩ（ｒｈＣＫＩＩ）の能力を分析するために、２つの誘導発現ベクターを使用してＥ．ｃｏｌｉ内で実験を行った。発現ベクターｐＳ７５０を、単独で、又は、発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαと組み合わせて、Ｔ７宿主菌株であるＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、及び、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥの中に形質転換した。ＤＥ３は、ｌａｃＩリプレッサーと、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能なｌａｃＵＶ５プロモーターと、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコード化する遺伝子とを含むλファージから誘導されるＤＮＡ断片である。誘導物質の存在下で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産し、外因性遺伝子の転写を生じさせる。プラスミドｐＬｙｓＳはクロラムフェニコール耐性を与えるが、外因性タンパク質の増殖速度と生産に対してはほとんど影響しない。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのプラスミドの安定性を増大させ且つ凍結と解凍による細胞の分解を可能にするＴ７リゾチームを含む。図５に示す結果は、高レベルの組換えヒトＭｅｔ−βカゼインがＥ．ｃｏｌｉ内で生産されたことと、組換えヒトＣＫＩＩβαの同時生産によってはそのカゼインの生産量が影響されなかったことを示している。タンパク質の電気泳動分離とリン酸基染色との後では、ＣＫＩＩ βαが組換えヒトＭｅｔ−βカゼインをインビボでリン酸化したことが明らかである。これは図６に示され、２つのベクターを有する細菌系内でリン酸化βカゼインを生産することが可能であることを示している。実施例２：Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２内でのβカゼインの生産：細胞内局在性組換えＭｅｔ−βカゼインのリン酸化：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）菌株Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、及び、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを、組換えヒトＭｅｔ −βカゼインの生産のための宿主として評価し、ｐＳ７５０で形質転換した。ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳによって最も高効率の生産が得られた。ｐＳ７５０とｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαとを使用した同時発現実験は、組換えヒトＭｅｔ−βカゼイン生産の強力な誘導を示し、これは、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαの存在とは無関係だった。リン酸基染色（図７）によって、組換えヒトＣＫＩＩとのインビボ同時生産の場合にＭｅｔ−βカゼインの効率的なリン酸化が得られることが明らかになった。２プラスミド系は、宿主細胞内でのそのプラスミドの存在が発酵プロセス中に監視可能であるようにプラスミドの各々が抗生物質マーカーを含まなければならないので、本発明の単一プラスミド系よりも本質的に劣っている。これは、増殖培地中での２つの抗生物質の使用を必要とし、細菌増殖を妨げる。実施例３：Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２内でのヒトβカゼインの生産： βカゼインコード化配列とＣＫＩＩ βαコード化配列の両方を含む構築物ＲＪＢ−７： βカゼインコード化配列の前のＴ７プロモーター：ＣＫＩＩ βαコード化配列の前のＴ７プロモーターＴ７プロモーターがその前に位置するβカゼイン遺伝子と、Ｔ７プロモーターがその前に位置するＣＫＩＩ βα遺伝子とを含む作成物ｐＲＪＢ−７を、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの中に形質転換した。使用した形質転換手順と誘導手順は、実施例４で説明する通りのＮｏｖａｇｅｎｐＥＴｓｙｓｔｅｍｍａｎｕａｌの形質転換手順と誘導手順だった。ウェスタンブロット分析分離、転移、ブロッキング及び抗体の手順を、実施例４で説明する。図８は、４つの異なった作成物を含むＥ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞によるβカゼインの生産を比較するイムノブロットを示す。誘導細胞培地と非誘導培地の両方からのライゼートを分析する。細胞は、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα（ＣＫＩＩ βコード化配列とβカゼインコード化配列の両方を有するプラスミド）、ｐＲＪＢ−９（βカゼインコード化配列と、ＣＫＩＩ βαコード化配列と、βカゼインコード化配列だけの前のＴ７プロモーターとを有するハイブリッド作成物）、又は、ｐＲＪＢ−７（βカゼインコード化配列と、ＣＫＩＩ βαコード化配列と、βカゼインコード化配列及びＣＫＩＩ βαコード化配列の両方の前のＴ７プロモーターとを有するハイブリッド作成物）を含む。ｐＲＪＢ−７による細胞の形質転換は、細胞増殖の著しい減少となった。Ｅ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞は、１つのＴ７プロモーターだけしか含まない作成物であるｐＲＪＢ −９で形質転換した同一の菌株の倍加時間の約２倍の倍加時間を有した。図８に示すウェスタンブロットは、ｐＲＪＢ−９を含む細胞と比較した場合に、ｐＲＪＢ−７を含む誘導細胞による組換えβカゼインの生産が減少したことを明らかにしている。これは、レーン４（誘導ｐＲＪＢ−７）とレーン８（誘導ｐＲＪＢ− ９）との比較から明らかである。ｐＲＪＢ−７とｐＲＪＢ−９は両方ともｐＳ６３７から誘導されるが、ｐＲＪＢ−９だけがその親作成物と同等の量のβカゼインを生産した。ハイブリッド作成物内でＣＫＩＩ遺伝子の前に追加のＴ７プロモーターが存在することが、細胞増殖の減少と、従って組換えタンパク質生産の減少という結果をもたらした。図９は、ライゼートをリン酸化タンパク質を検出するためにホスホセリン抗体で展開したウェスタンブロット分析を示す。ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、ｐＲＪＢ−９（１つのＴ７プロモーターとを有するハイブリッド作成物）、ｐＲＪＢ−７（２つのＴ７プロモーターを有するハイブリッド作成物）、又は、ｐＳ６３７（βカゼインコード化配列を含むがＣＫＩＩ βαコード化配列は含まない）を含む誘導Ｅ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、リン酸化組換えβカゼインの生産に関して比較した。リン酸化βカゼインは、ｐＲＪＢ−９を含む細胞（レーン６）内でしか生産されなかった。ｐＲＪＢ−７を含む細胞のライゼートを含むレーン７では、リン酸化タンパク質は全く検出できなかった。２つのＴ７プロモーターを有する作成物においてリン酸化タンパク質を検出できなかったことは、適切に修飾した組換えタンパク質を微生物内で発現させるための本明細書で開示する単一作成物系を開発するために創意と実験の両方が必要だったことを示している。タンパク質コード化ヌクレオチド配列とキナーゼコード化ヌクレオチド配列とを含む単一作成物内で２つのＴ７プロモーターを使用した実験では否定的な結果を得たが、異なった実験条件下では、１つ以上のプロモーター配列の使用を排除すべきではない。２つの異なったプロモーターを使用することが好ましいと考えられる状況が、本発明の範囲内に含まれる。実施例４：Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２内でのヒトβカゼインの生産： βカゼインコード化配列とＣＫＩＩ βαコード化配列の両方を含む作成物ｐＲＪＢ−９本発明は、特異部位に対する官能基の転移のための情報と修飾されるべきタンパク質との両方を発現させるために、単一の作成物を使用する。本発明の特定の実施様態では、転移させられる官能基はリン酸基である。この転移を、インビボでヒトβカゼイン上の特異部位のリン酸化を仲介することが実証されているキナーゼによって生じさせる。本発明は、ヒトβカゼインをＥ．ｃｏｌｉによってインビボで特異的にリン酸化することが可能であるばかりでなく、βカゼインコード化配列の前に位置したプロモーターを有し且つ単一の作成物系の利点を有する単一作成物がこの機能を適切に仲介することも示す。Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内への形質転換 βカゼイン遺伝子とＣＫＩＩ βα遺伝子とを含む作成物ｐＲＪＢ−９を、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内へ形質転換した。使用した形質転換手順は、ＮｏｖａｇｅｎｐＥＴｓｙｓｔｅｍｍａｎｕａｌ（４ｔｈｅｄ，ＴＢＮｏ．５５，Ｊｕｎｅ，１９９４）の手順だった。発現の誘導プラスミドｐＲＪＢ−９（図２）、ｐＳ６３７（図１）、又は、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα（Ｓｈｉ他，１９９４）を含むＥ．ｃｏｌｉＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ宿主細胞を３０℃で増殖させ、ＯＤ６００＝０．５−０．６の密度にした。誘導物質ＩＰＴＧ１ｍＭを加える前と、加えてから６時間後に、培養試料を採取した。２つの１ｍＬアリコートをマイクロ遠心機内での遠心によってペレット化した。ゲル電気泳動のための試料ローディング緩衝液中に細胞を再懸濁させ、その後で、各々のアリコートから５００βＬの上清液を収集した。使用済みの溶媒培地をＭｉｃｒｏｃｏｎ１０ｓｐｉｎｆｉｌｔｅｒ（Ａｍｉｃｏｎ）で１０，０００ｘＧで３５分間濃縮した。１，０００ｘＧで３分間スピニングした後に保持物質を収集し、等量の倍濃度の試料緩衝液を加えた。ウェスタンブロット分析１０％−２０％勾配を使用してＳＤＳ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｐｒｅ−ｃａｓｔＧｅｌ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＳｙｓｔｅｍ）上で細胞ライゼートを分離し、セミドライブロッターでＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転移させた。Ｔｒａｎｓ−ＢｌｏｔＳＤＴｒａｎｓｆｅｒＣｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰＶＤＦｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、４５分間、定電流（０．８ｍＡ／ｃｍ２）でゲルをエレクトロブロッティングをした。転移緩衝液は、４８ｍＭＴｒｉｓ、３９ｍＭグリシン、１．３ｍＭＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、及び、２０％メタノールを含んだ。転移前に、フィルターを最初にメタノール中に浸し、その後で転移緩衝液中に浸した。ウェスタンブロット分析を行うために、上記メンブランを、ＴＢＳ（２５ｍＭＴｒｉｓ、０．１５４ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の３％ウシ血清アルブミン及び０．２％Ｔｗｅｅｎの中でブロッキングした。βカゼインに対する一次抗体と、二次抗体であるアルカリ性ホスファターゼヤギ抗ウサギ抗体とを、ブロッキング緩衝液中で１：８０００に希釈した。ホスホセリンを検出するために追加の抗体を使用した。ＴＢＳ中の２％増幅グレードブタ皮膚含有ゼラチン（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の中で２時間２５−２６℃でブロッキングと抗体反応を生じさせた。その後でブロットをＴＢＳで３０分間洗浄した。一次抗体であるマウスモノクローナル抗ホスホセリン（Ｓｉｇｍａ）を２％ゼラチンブロッカー中で１：２００又は１：１００に希釈し、２時間インキュベートした。ＴＢＳ中で５分間のブロット洗浄を２回行った。二次抗体であるヤギ抗マウスアルカリ性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を、上記ゼラチンブロッカー中で１：４，０００に希釈し、１時間インキュベートし、上記と同様にＴＢＳ中で洗浄した。ニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスファートを、発色のための基質として使用した。図１０は、異なった３つの作成物を含むＥ．ｃｏｌｉＫ−１２ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞によるβカゼインの生産を比較するイムノブロットを示す。細胞は、ｐＳ６３７（βカゼインコード化配列を有するプラスミド）、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα（ＣＫＩＩ βコード化配列とβカゼインコード化配列の両方を有するプラスミド）、又は、ｐＲＪＢ−９（βカゼインコード化配列とＣＫＩＩ βαコード化配列の両方を有するハイブリッド作成物）を含む。レーン３とレーン４の比較から、ｐＲＪＢ−９がそれから誘導され且つＣＫＩＩ βαコード化配列を含まないｐＳ６３７のβカゼイン生産量に等しい量の βカゼインを、ハイブリッド作成物ｐＲＪＢ−９が生産していることが明らかである。ｐＲＪＢ−９とｐＳ６３７の両方が、この宿主細胞中で４００ｍｇ／ｍＬから５００ｍｇ／ｍＬまでのβカゼインを生産した。この実験は、ＣＫＩＩ βαコード化配列とタンデムにβカゼインコード化配列を置くことがβカゼインの生産を大きく変化させないことを示している。図１１は、ライゼートをリン酸化タンパク質を検出するためにホスホセリン抗体で展開するウェスタンブロット分析を示す。図８のライゼートに加えて、増加量の自然ヒトβカゼインと非リン酸化組換えβカゼインを試験した。ＣＫＩＩ βαプラスミドからのライゼートを含むレーン６では、細菌タンパク質のリン酸化は検出されず、このことは、リン酸化が特異的であることを示している。βカゼインコード化配列とＣＫＩＩ βαコード化配列をタンデムに有するｐＲＪＢ −９を含むレーン４の細胞ライゼートは、上記抗体と交差反応する強いバンドを示す。レーン４のバンドは、レーン２及びレーン３に見られるような電気泳動分析による自然人乳βカゼインの分子量と同一の分子量を有する。レーン７及びレーン８の場合のように精製された組換え非リン酸化ヒトβカゼインに対する交差反応性、又は、レーン５の場合のようにｐＳ６３７によってインビボで発現された組換え非リン酸化ヒトβカゼインに対する交差反応性は存在しなかった。この実験は、単一作成物を使用する、細菌系内におけるＥ．ｃｏｌｉＫ−１２内でのインタクトな組換えヒトβカゼインの特異的で高レベルのリン酸化が得られることを実証する。実施例５：Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２内でのβカゼインの生産：細胞外局在性組換えβカゼインのリン酸化：Ｅ．ｃｏｌｉリーダー配列、プロモーター、カゼインコード化配列、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαを含む作成物この実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２を形質転換させ且つ細胞外局在性リン酸化βカゼインの生産を仲介するために使用する単一プラスミドの作成を開示する。細菌細胞の細胞周辺腔に対してリン酸化タンパク質を分泌するように設計した単一作成物を形成するために、βカゼインコード化配列を、タンパク質輸送を細胞周辺腔に方向付けるリーダー配列を含む発現ベクターの中に入れる。これらの手順で得られるクローンを標的ＤＮＡとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。ＭｉｄｌａｎｄＣｅｒｔｉｆｉｅｄＲｅａｇｅｎｔＣｏ．（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）で合成されたプライマーであるＲＯ−４：５′−ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＴ−３′（配列番号：３）、及び、ＲＯ−２９：５′−ＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＧＣＧＴＧＡＡＡＣ−３′（配列番号：４）をＰＣＲで使用することが可能である。ＲＯ−２９の下線付きの塩基は、タンパク質合成のための細菌の開始コドンであるメチオニンを除去するようにβカゼインコード化配列の末端にＭｌｕＩ部位を生じさせるための、単一塩基改変を含む。改変は、その結果得られるタンパク質がヒトβカゼインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するように行う。その後でＰＣＲ断片を精製する。非修飾の上記コード化配列の３′ 末端をＢａｍＨＩで切断する。５′平滑末端と３′ＢａｍＨＩ末端とを含むこの断片を、Ｔ７プロモーターを含むｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内にクローニングし、ＭｓｃＩとＢａｍＨＩとで平滑末端において切断する。ここで説明する作成物はＴ７プロモーターを含むが、他のプロモーター配列を使用することも可能である。ＣＫＩＩβαコード化配列を、ｐＲＪＢ− ９に関して上記で説明した通りに挿入する。実施例４で説明した手順に従って、発現を誘導し、ウェスタンブロット分析を行う。ホスホセリンに対する抗体と交差反応し且つ自然βカゼインと同様に泳動する、細菌細胞の細胞周辺腔から単離したタンパク質を同定するために、ウェスタンブロットを行う。この実験は、異種翻訳開始及びシグナル配列に融合した配列によってコード化される組換えヒトβカゼインのリン酸化を実証し、この配列の前にはプロモーター配列が位置し、リン酸化されるべき配列が、ＣＫＩＩ βαのようなキナーゼコード化配列を含むプラスミド内に置かれる。現在まで、細胞外局在性リン酸化タンパク質の生産は、１ベクター系又は２ベクター系のどちらの形でも開示されてはいない。生産されるリン酸化タンパク質が細胞外に局在することが細胞内に局在することよりも有利な点は、そのタンパク質の精製の容易さにある。細菌細胞の細胞周辺腔内に含まれる異物の量は、その細胞の内部に含まれる異物の量よりも少なく、従って、精製タンパク質の単離が容易に行える。これは、工業的生産において特に有利である。本発明は、微生物内でのリン酸化組換え哺乳動物タンパク質の生産を工業規模で行うことを可能にするだろう。本発明の方法を、非限定的に組換えヒトβカゼインを含む組換え外因性タンパク質を大量生産するために使用することが可能である。バイオリアクター内でのβカゼインのリン酸化は、自然ヒトβカゼインと同等の組換えβカゼインを発酵槽内で大規模に合成することを可能にする。これは、ヒトβカゼインをその自然リン酸化状態で含む乳幼児用調合乳の生産を容易化するだろう。本発明の方法を、リン酸化及び脱リン酸化によって調節され従って細胞代謝においてシグナルとして働く受容体を含む、細胞タンパク質のリン酸化のためにも使用することも可能である。本発明は、ペプチド受容体をリン酸化するためのコスト効率が高い方法を提供し、調剤薬剤の製造に有益だろう。組換えリン酸化ヒトβカゼインのような発酵タンパク質の工業生産のためは、単一プラスミド系が２プラスミド系よりも好ましい。増殖培地中の抗生物質によって与えられる選択プレッシャーなしに組換えタンパク質を大規模に生産することは、上記プラスミドを含む細胞が１つのプラスミドだけを含む又はプラスミドを全く含まない細胞を上回る選択上の利点を持たないばかりでなくそのプラスミドの存在による増殖速度の低下という悪影響も被るので、発酵プロセス中にプラスミド損失を生じさせる。しかし、発酵中に細菌内に２つのプラスミドを維持するのに必要な選択プレッシャーを得るために複数の抗生物質を使用することは、細菌の増殖を妨げ、所期の組換え産物の収量の低下を生じさせる場合が多い。従って、工業目的では、本明細書で開示する単一プラスミド系は、従来開示されている２プラスミド系よりも著しく有利である。本明細書に開示するように、自然ヒトβカゼインの特徴に類似した又はこの特徴と同一の特徴を有する組換えリン酸化ヒトβカゼインを生産するための新規の方法の発見は、乳幼児の発達のための重要な利点を有する人乳に乳幼児用調合乳をより一層近づけるために、乳幼児用調合乳にこのタンパク質を加えることを容易化する。更に、組換え修飾ヒトタンパク質を細菌系中で生産するための方法の開示は、他の食品製品及び調剤製品に対するこうしたヒトタンパク質の添加を容易化する。上記では、本発明の特定の好ましい実施様態を、添付の実施例と図面とを参照しながら説明したが、本発明はこれらの具体的な実施様態に限定されないということと、添付クレームで定義する通りの本発明の思想又は範囲から逸脱することなく当業者によって様々な変更と変形とが行われることが可能であるということが明らかだろう。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Methods for expressing modified recombinant proteins in bacterial systems Technical field The present invention relates to a novel method for producing modified recombinant proteins in bacterial systems. Wrong. This method modifies the foreign protein and the protein in vivo A single vector with a nucleotide sequence encoding a possible enzyme And expressing this vector in a host cell to produce the modified protein Including. One aspect of the invention relates to a promoter followed by a protein. Into a single vector containing the coding sequence followed by the enzyme coding sequence Get involved.Background of the Invention It is generally accepted that human milk is the best source of nutrition for human infants . Human milk is not only an ideal nutrient for developing infants, but also Includes both immunoglobulins and non-immune factors that protect infants from infection by organisms . In addition, human milk is easily digested by infants, and infant milk-based infant formulas It is less likely to cause an allergic reaction than milk. Human milk differs from milk and milk of other mammalian species in many ways. ing. Total protein content and protein types differ between human milk and milk I have. Four major bovine caseins have already been identified. Milk has two α-cases Human milk contains β-casein and κ-casein. Only include. In addition, the amino acid sequence of human milk protein is It is different from Parkin. It has some of the beneficial properties of human milk and allergic reactions and incompleteness by infants Overcoming shortcomings associated with milk-based infant formulas, such as whole digestion Efforts have been made to develop infant formula. To achieve this An intuitively desirable method is to use a known human milk composition that contains human milk protein in its natural form. The addition of some of the ingredients to the formula. Bovine and other mammalian milk tampers Human casein having an amino acid sequence different from that of protein Increases the nutritional value of formula when added to infant formula in natural form Important and capable of working and reducing the inherent disadvantages of non-human milk proteins Substance. Sources of amino acids required for the synthesis of proteins required for infant growth and development In addition to being human milk, other important raw materials It is known to include proteins having physical functions (including casein). Beta casein is one of the most abundant milk proteins synthesized in the mammary gland. Gol After post-translational modification in the device, β casein is transformed into a large calcium It is secreted as an um-dependent aggregate. Beta casein is not a single entity, A mixed group of phosphoproteins secreted during lactation in response to intense hormones. You. The primary structure of human β casein is described by Greenberg et al. (Journal o f Biological Chemistry 259: 5132-5138 , 1984). This structure is a specific structure located near the amino terminus. Phosphorylated protein with phosphorylation sites at the seryl and threonyl residues of It was revealed. By comparing human beta casein and bovine beta casein, A 47% identity was confirmed. The sequence of human β casein is described by Brignon et al. (F edition of European Biological Soc ieets Letters 188: 48-54, 1985) Was done. β casein is phosphorylated, while κ casein is glucosylated. You. Casein has several biological effects, and these effects are The fruit is (1) enhancement of calcium absorption, (2) inhibition of angiotensin I converting enzyme, (3) opioid agonism, and (4) Immunostimulation and immunomodulatory effects including. Human casein is composed of a large amount (> 80%) of β-form and a smaller amount of κ-form (Greenberg, et al.). Natural beta casein is a 25kDa protein is there. In human milk, 0 to 5 β-casein molecules per polypeptide chain Exhibit varying degrees of post-translational phosphorylation within the range of phosphate groups up to erg et al., 1984, and Hansson et al.,Protein Expresses session and Purification 4: 373-381, 1993 ). Phosphate groups of natural proteins are composed of serine and threonine residues near the amino terminus. (Greenberg, et al., 1984). Expression of exogenous genes in bacterial cells is important for producing recombinant eukaryotic proteins. Provide an effective method for But,E. FIG. coliBacteria such as post-translationally modified Endogenous needed to do Lack of enzymes produces post-translational modifications required by many eukaryotic proteins Is impossible. Therefore,E. FIG. coliEukaryotes produced within Proteins contain certain post-translational modifications that may occur in eukaryotic cells (eg, Lysosylation, phosphorylation, acetylation, or amidation). Prior to the development of appropriate cloning techniques, chemical reagents were used to bind kinases. The phosphorylation of the purified protein was performed in vitro. In this process, It is necessary to purify the protein substrate and the kinase enzyme, which is Is inefficient and cost-effective. In addition, large-scale processes for industrialization In vitro processes are inefficient when optimization is required. Therefore, Methods for genetically modifying microorganisms to phosphorylate proteins in vivo There is a need to develop. Canadian patent application no. 2,083,521 (Pawson et al.) Is in host cells Discloses a method for producing phosphorylated exogenous protein. Pawson and others Then, it is necessary to introduce two vectors into bacterial cells. One vector Can be phosphorylated by the catalytic domain of protein kinases. It has a nucleotide sequence encoding a possible exogenous protein. Other baek Is a nucleotide sequence that encodes the catalytic domain of a protein kinase. Have. Both of these vectors were used in E. coli. exogenous protein introduced into E. coli Exogenous protein production and protein kinase catalytic domain Inducing and producing. Then lyse the bacterial cells and use standard isolation methods. To isolate the exogenous phosphorylated protein. Canadian patent application no. 2,083,521 suggests or discloses the method of the present invention. Not. The present invention provides a single vector that expresses both the substrate and the kinase enzyme. use. The method of Pawson et al. Requires the use of two vectors. is there. The expression system disclosed herein is determined by antibodies to phosphoserine. Causes specific phosphorylation of the exogenous protein, whereas Pawso n Other expression systems involve non-specific phosphorylation of both host and exogenous proteins. Cause. This can increase host bacteria in large scale operations for industrial use. It will adversely affect reproduction. The present invention differs from Pawson et al. Of phosphorylated recombinant protein suitable for quantitative production Enables high level production. Simcox and others,Slategies in molecular biol ogy 7 (3): 68-69 (1994) discloses a tyrosine kinase plasmid. Including twoE. FIG. coliA strain was created. These TK (tyrosine kinase) bacteria Using a strain containing a sequence encoding a phosphorylation target domain or protein Transformation with a plasmid can produce phosphorylated proteins. It is possible. the aboveE. FIG. coliBoth strains have an inducible tyrosine kinase gene. Have. One of the strains, TKB1, is expressed by the T7 promoter. It can be used to express a targeted gene. Simco x et al. developed a system comprising two constructs, a tyrosine kinase-containing protein. Rasmids and genes encoding proteins or domains to be phosphorylated Is different from the present invention in that it requires a plasmid vector containing . To better understand the structure and function of human β casein, To enable the study of factors affecting the regulation of yne synthesis and secretion. Encodes a protein Cloned and sequenced (Loennerdal et al.,Fede ratio of European Biological Society is Letters 269: 153-156, 1990), human milk β casei. Escherichia coliWhenSaccharomycescere visiae (Hansson et al., 1993). Hansso n et al., pYES 2.0 vector (Invitrogen Corp., Sa n Diego, CA) using recombinant yeast β casein.. cere visiae Has been demonstrated to be expressed in The production level isE. FIG. coli It was estimated to be about 10% of the production obtained in. But the protein phosphate Eukaryotic cells with endogenous enzymes that can be convertedS. cerevisia e The recombinant β casein obtained from E. coli was phosphorylated, but naturally Prokaryotic cells without the ability to phosphorylateE. FIG. coliProduced by The protein was not phosphorylated. Furthermore,E. FIG. coliProduced within andE. FIG. coli Human casein kinase II (rhCKII) purified from Can phosphorylate protein substrates in vitro (Shi et al.,Proceeding of the N national Academy of Sciences, USA 91: 2 767-2771, 1994). In one particular embodiment of the invention,E. FIG. co li To produce phosphorylated β casein in a single construct Recombinant human casein kinase with β-casein-encoding nucleotide sequence The II encoding nucleotide sequence is used.Summary of the Invention In the present specification, it is possible to modify an exogenous protein and the exogenous protein. In a host cell, comprising preparing a single vector encoding both functional enzymes. Discloses a method for producing a modified recombinant protein. In the process of the present invention Representative examples of exogenous proteins that can thus be modified include, but are not limited to, Human casein (including beta casein), cell receptor protein, fatty acylated tan Protein (including palmitoylated protein), mammalian muscle protein, retro Viral gag polyprotein and retrovirussrcKinase targets And a mammalian protein. Acquires a covalent palmitate group after synthesis Transmembrane glycoproteins are insulin, β2-a Includes drenergic receptors and transferrin receptors. Cell surface receptors, Tyrosine kinase, serine / threonine kinase, its substrate, phosphatase, G protein and Ca²⁺Proteins that function as liposomes are fatty acylated It is known. Transfers functional groups to specific exogenous proteins in host cells Representative enzymes that can be used in the present invention that have the ability to control For example, tyrosine kinase or casein kinase), transferase (eg, For example, mammalian and yeast palmitoyltransferases) and retroviruses Luz'ssrcIncludes kinases encoded by genes. Can be used in the present invention Representative examples of such promoters include inducible promoters (eg, T7, πPL, π P_RAnd Tac) and constitutive promoters (eg,blaas well asspa )including. Host cells capable of expressing the modified protein by transformation Representative examples of, but are not limited to, bacterial cellsE. FIG. coli K-12 andE. FIG. coli B ,Bacillusseed,LactobacillusSpecies, andS treptococcus Species and eukaryotes such as yeast cells or mammalian cells Including cells. Exogenous proteins are proteins that originate outside the organism that produces them. You. The term refers to a recombinant protein produced by a transformed host organism. Is sometimes used in the literature related to DNA cloning. Alternatively, exogenous proteins produced using DNA cloning methods It may also be called a protein. These terms are not distinguished in the relevant literature And are therefore used interchangeably herein. I However, in describing the disclosure of the present invention, the term "recombination" is used to refer to a transformed organism. Therefore, the term "exogenous" is used to describe the protein produced Naturally, a non-recombinant protein or a nucleotide sequence encoding the protein Used to represent. Disclosed herein are methods for producing modified recombinant proteins in host cells. This method includes a promoter sequence, an exogenous protein sequence, Nucleotide sequence encoding an enzyme capable of modifying an exogenous protein Preparing a single vector having a sequence and forming the host cell with the vector. The transformation process and the enzymes produced to modify the recombinant protein produced. Vector in the host cell And isolating the modified recombinant protein produced. Book In a more particular embodiment of the invention, the production of a phosphorylated recombinant protein in a host cell A method comprising the steps of: a promoter sequence followed by a promoter sequence; Exogenous proteins that can be phosphorylated by protein kinases Phosphorylation of the exogenous protein followed by the nucleotide sequence to be converted Having a nucleotide sequence encoding a protein kinase capable of Preparing a single vector, and transforming the host cell with the vector. The steps and protein kinases produced Expressing the vector in the host cell such that it is oxidized; Isolating the isolated protein. More specifically, the present invention provides for the use of modified recombinant human proteins in bacterial expression systems. Provide a new way to produce. Alpha and beta human casein kinase Two human casein kinase-encoding sequences, each expressing a protein subunit When using column combinations,E. FIG. coliOf recombinant phosphorylated human β casein within In vivo production was obtained. Human casein kinase II The coding sequence is placed in tandem with the β casein coding sequence, resulting in ,E. FIG. coliMost of the recombinant β casein produced in Phosphorylated. In addition, recombinant proteins in transformed host cells Cause specific glycosylation, amidation or acetylation in vivo Fatty acids as appropriate recombinant protein substrates for or in transformed host cells. It is also possible to use the method of the invention to transfer In a particular embodiment of the invention, the human casein kinase II (hCKII βα ) Encodes a human β casein in a bacterial expression system. Co-expressed in a single construct with the encoding nucleotide sequence, the recombinant human Efficient in vivo phosphate of the appropriate serine and threonine residues of tobeta-casein Realization. hCKII βα encoding nucleotide sequence and human β casein Using a single inducible expression vectorE. FIG. coliDuring ~ The recombinant hCKII βα showed that recombinant β casein The ability to phosphorylate in vivo has been demonstrated. This is an unexpected non-trivial The result was that experimentation and creativity were required. initial As a negative result was obtained in the control experiment of the present invention, the result of the invention disclosed herein is Was unpredictable. The methods herein combine beneficial human proteins with nutritional products. It produces effective and beneficial results which allow it to be added to pharmaceutical products.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG.E. FIG. coliExpression vector p created for induced intracellular expression in E. coli Figure 5 shows a physical map of S637 and pRJB-6. 191 base pairs from pS637 Removed to produce PRJB-6. FIG. 2 shows a physical map of the expression vectors pRJB-6 and pRJB-9. PRJB-6 was cleaved as described above, and ligated to CKII βα. It will be described whether B-9 is formed. FIG. 3 shows a physical map of the expression vectors pS637 and pRJB-7, PS637, ligated to CKIIβα, pRJB- 7 is formed. pRJB-7 is composed of the β casein gene and caseinna. It has a T7 promoter in front of both of the protease genes. FIG. 4 gives rise to inducible expression andE. FIG. coliIn the cell within Expression vector pS750, created to mediate production of a localized protein 2 shows a physical map. FIG. 5 shows that using the vectors pS750 and pET-11d-CKIIβαE . coli Produced in BL21 strain and stained with Coomassie Brilliant Blue 2 shows SDS-PAGE of Met-β casein.E. FIG. coliAnd other bacteria Is the plasmid pS75, since protein synthesis starts with the amino acid methionine. 0, the methionine (Met) codon was replaced with the β casein coding sequence. I put it before. It is recognized by the ribosome as the starting point for polypeptide chain growth To be able to Production of intracellular recombinant β casein depends on the This is only possible if Met is inserted before the sequence coding for the protein. Les 1: molecular weight marker (Bio-Rad, pre-stained, relative molecular weight 106, 80) , 49.5, 32.5, 27.5, 18.5 kDa), lane 2: non-phosphorylated Recombinant β casein, lane 3: 5P-β casein, lane 4: BL21 (D PS750 induced with IPTG in E3), lane 5: in BL21 (DE3) IPTG-induced pS750 / pET-11d-CKII βα, lane 6 : BL21 (DE3) pS750 induced with IPTG in pLysS, lane 7: BL21 (DE3 ) PTG750 / pET-11d-CKII induced by IPTG in pLysS βα, lane 8: IPTG-induced p in BL21 (DE3) pLysE S750, lane 9: induced with IPTG in BL21 (DE3) pLysE cells PS750 / pET-11d-CKII βα, lane 10: 5 bonds Natural β casein having a phosphate group (5P-β casein). The arrow points to the casein β Command. FIG. 6 uses the vectors pS750 and pET-11d-CKIIβα. handE. FIG. coli Produced in BL21 strain, Ethyl Stains-All 2 shows SDS-PAGE of Met-β casein stained with. Lane 1: 5 pieces Natural casein (5P-β casein) with a linked phosphate group, lane 2: B PTG750 / pET- induced with IPTG in L21 (DE3) pLysE cells 11d-CKII βα, lane 3: IP in BL21 (DE3) pLysE TG-induced pS750, lane 4: in BL21 (DE3) pLysS IPTG-induced pS750 / pET-11d-CKIIβα, lane 5: IPT in BL21 (DE3) pLysS G induced pS750, lane 6: induced with IPTG in BL21 (DE3) PS750 / pET-11d-CKIIβα, lane 7: BL21 (DE PT750 induced with IPTG in 3), lane 8: 5P-β casein, lae 9: non-phosphorylated recombinant β casein, lane 10: molecular weight marker (Bio -Rad, prestain, relative molecular weight 106, 80, 49.5, 32.5, 27.5, 18.5 kDa). The arrow indicates the band of phosphorylated β casein, which is It appears as a green band in the original photo. FIG. 7 shows the results obtained using the vectors pS750 and pET-11d-CKII.E. FIG. coli Produced in HMS174 (DE3) pLysS, Ethyl Sta FIG. 2 shows SDS-PAGE of Met-β casein stained with ins-All. Les Lane 1: molecular weight marker (Bio-Rad, pre-stained), lane 2: uninduced p S750, lane 3: pTG induced with IPTG, lane 4: uninduced p S750 / pET-11d-CKIIβα, lane 5: IPTG-induced p S750 / pET-11d-CKII βα, lane 6: uninduced pET-11 d-CKII βα, lane 7: IPTG-induced pET -11d-CKII βα, lane 8: native 5P-β casein, lane 9: Recombinant β casein, lane 10: molecular weight marker (Bio-Rad, prestain, Relative molecular weight 106, 80, 49.5, 32.5, 27.5, 18.5 kDa). The arrow indicates the band of phosphorylated β casein, which is Appears as a green band. FIG. 8 shows Western immunoblot analysis using an antibody against human β casein. Shows the analysis. Lane 1: molecular weight marker (Gibco BRL, relative molecular weight 43) . 1, 29.2, 18.8, 16.5, 6.4 kDa), lane 2: natural human 50 ng β-casein, lane 3: uninduced HMS174 (DE3) pLysS ( pRJB-7), lane 4: Induced HMS174 (DE3) pLysS (pRJ B-7), Lane 5: uninduced HMS174 (DE3) pLysS (pET- 11d-CKII βα), lane 6: induced HMS174 (DE3) pLys S (pET-11d-CKII βα), lane 7: uninduced HMS174 (D E3) pLysS (pRJB-9), lane 8: induced HMS174 (DE3) pLysS (pRJB-9). FIG. 9 shows Western blots using antibodies to phosphoserine. 3 shows a munoblot analysis. Lane 1: low molecular weight marker (Gibco BRL) , Relative molecular weight 44, 28.7, 18.5, 14.7, 5.8, 2.9 kDa), Lane 2: 1 μg of natural human β casein, Lane 3: 2 μ of natural human β casein g, lane 5: induced HMS174 (DE3) pLysS (pET-11d-C KII βα), lane 6: induced HMS174 (DE3) pLysS (pRJ B-9), Lane 7: induced HMS174 (DE3) pLysS (pRJB-7 ), Lane 8: induced HMS174 (DE3) pLysS (pS637), lane 8 10: 1 μg of recombinant human β casein, lane 11: recombinant human β casein 2 μg. FIG. 10 shows an immunoblot analysis using an antibody against human β casein. . Lane 1: molecular weight marker (Gibco BRL, relative molecular weight 44, 28. 9, 18.5, 14.7, 5.8 kDa), lane 2: natural human β casein 1 μg, lane 3: induced HMS174 (DE3) pLysS (pRJB-9), Lane 4: induced HMS174 (DE3) pLysS (pS637), lane 5 : Induced HMS174 (DE3) pLysS (pET-11d-CKII βα ), Lane 6: Team Recombinant human beta casein. FIG. 11 shows an immunoblot analysis using an antibody against phosphoserine. Lane 1: molecular weight marker (Gibco BRL, relative molecular weight 44, 28.9) , 18.5, 14.7, 5.8, 2.9 kDa), lane 2: natural human β-case 1 μg in, lane 3: 500 ng of natural human β casein, lane 4: induced H MS 174 (DE3) pLysS (pRJB-9), lane 5: induced HMS1 74 (DE3) pLysS (pS637), lane 6: induced HMS174 (D E3) pLysS (pET-11d-CKIIβα), lane 7: recombinant human 1 μg of β-casein, lane 8: 500 ng of recombinant human β-casein.Detailed Description of the Invention As described above, the present invention is directed to producing modified recombinant proteins in host cells. Related to the method. In a more specific embodiment, the present invention provides a method for phosphorylation in bacterial cells. A method for producing a protein. This method uses protein kinase Encoding an exogenous protein that can be phosphorylated by Both the nucleotide sequence and the nucleotide sequence encoding the appropriate protein kinase To prepare a single vector with Stages and the kinases that produce the produced recombinant protein are phosphorylated Expressing the vector in the host cell, Isolating the substrate. The present invention further relates to proteins to be phosphorylated. Nucleotide sequence encoding the above kinase and nucleotide sequence encoding the above kinase By placing them in tandem with a promoter in a single construct. At the same time as specific phosphorylation of The disadvantages associated with multiplex vectors, such as the need to use Providing the unexpected discovery that it will work. Use of a single construct system is used for industrial To facilitate large-scale procedures. Express exogenous proteins It is intended that the method of the invention be effective in any possible host cell system. ing. Suitable host cells are prokaryotic cells, such as bacteria, and yeast and mammalian cells. Such as eukaryotic cells. In a preferred embodiment of the invention, the host cell isE. FIG. coliIt is. Some differences Β-casein-encoding nucleotide sequence in the resulting expression format,E. FIG. col i Evaluated for expression of recombinant β casein in the strain. Human in a single construct casein Placing the human β casein coding sequence together with the kinase CKII βα coding sequence Experiments showed that recombinant human β casein was efficiently phosphorylated. Confirmed after. Placing both genes in tandem in one plasmid The efficiency of phosphorylation was determined separately by the kinase coding sequence and β casei in the two vectors. Not inferior to the phosphorylation efficiency of the experimental system with the coding sequence Was.Materials and methods The following materials and methods were used in the inspections described in Examples 1-5. Change Other materials and / or methods are described for individual experiments as needed.Plasmid The plasmid construct pS637 shown in FIG. 1 contains an additional glutamine at position 19 (Gl n) incorporated herein by reference except that they encode amino acid residues PS26 created and described by Hansson et al. (1993) Is the same as The original expression vector pS26 was modified to be found in the human population PS63 producing a recombinant β casein protein identical to the most mutated variant Yielded 7. Casein kinase II-encoding nucleols, incorporated herein by reference. In order to co-express the pseudo sequence (Shi et al., 1994), two kinase sub- Encodes the CKII βα encoding nucleotide sequence encoding units b and a By placing them downstream of the β casein-encoding nucleotide sequence as a set. The product pS637 was prepared. 3-cistron tandem expression vector pET-11d -CKII βα is the CKII βα produced by Shi et al. (1994) It is a plasmid containing. First, pS637 is inserted under the β casein coding sequence. The stream was cut at two sites and religated. Of these two cleavage sites The plasmid pRJB-6 shown in FIG. 1 which lost 191 bases in between was isolated. pRJ Kinase CKII βα was prepared for insertion into B-6. Got after insertion The construct (shown in FIG. 2) was named pRJB-9. pRJB-9 is phosphorylated β A single construct designed to mediate casein production. Modifies pS637 Thus, plasmids pS750 and pRJB-7 were prepared. Will be described in more detail below.Host cells In certain embodiments of the invention described below, the host organism transformed with the vector isE. FIG. coli was. Other representative organisms that can be used in the methods of the present invention include:Baci lplus seed,LactobacillusSpecies, andStreptococcu s Including seeds.promoter In certain embodiments of the invention described below, the T7 promoter was used. Of the present invention Other representative promoters that can be used in the method include the inducible promoter πP_L, ΠP_R , And Tac, and the constitutive promoters bla and spa.Creating a plasmid for bacterial expression: a detailed method Expression vector S637 The expression vector pS637 contains glutamine (position 19) of the β casein coding sequence. Gln) contains a nucleotide triplet encoding an amino acid residue; It differs from pS26 described in Ansson et al. (1993). This nu The nucleotide sequence is a human sequence more commonly found in the human population than the pS26 sequence. Isolated from cDNA variants. Two synthetic oligonucleotides Otides were synthesized for volimerase chain reaction (PCR) amplification. This synthetic Ligonucleotides are a convenience for amino acids that are used preferentially by bacteria Gives high restriction sites and integration codons. Two oligonucleotides having the following sequences Leotide was converted to SYM4174 (SEQ ID NO: 1) and SYM4175 (SEQ ID NO: 2). ). Ausubel et al. (Ed.)Current Protocols in Mol ecological biology PCR amplification as described in (1992) And the amplified fragmentPstI andAvaDigested with II to produce an 85 bp fragment . Plasmid pS21 described in Hansson et al. (1993)Ec o RV andAccIAnd a 328 bp fragment was isolated by gel electrophoresis. Isolation The fragment was purified from an agarose gel by electroelution,AvaDigest with II Was. Thereby, 197 bpAvaII /AccI fragment is obtained, this fragment Was purified. 85bpPstI /AvaII digestion PCR amplification One piece and 197 bpAvaII /AccI fragment with Hansson et al. (1993) ) Is the plasmid described inPstI /AccLa in the digested pS25 Ignored. The resulting plasmid construct was sequenced and pS636 I named it. 644 bpNdeI andBamThe HI restriction fragment was digested from pS636 Isolated, a plasmid described by Hansson et al. (1993).Nde I /BamIt was introduced into the HI digestion vector pS26. The resulting expression vector -Was named pS637.Expression vector pRJB-9 Contains the CKII βα coding sequence produced by Shi et al. (1994) Co-expression of pET-11d-CKII βα plasmid with recombinant β casein Prepared for First, two downstream from the β casein coding sequenceEcoR By cutting the I site and religating pS637, the 191 salt The base pair (bp) was removed from pS637. Plasmid pRJB-6 (FIG. 1) Released, the plasmid had lost 191 bp between the two sites, A single fragment 132 bp away from the 3 'end of the casein coding sequenceEcoR v The site was retained. Plasmid pET-1 containing CKII βα coding sequence 1d-CKII βα,ClaI, and the site is digested with Klenow enzyme (Str atagene, CA) to generate blunt ends. CompensatedClaI cut A truncated CKII coding sequence was added downstream of the β casein coding sequence to pRJB-6. And the resulting construct was named pRJB-9 and is shown in FIG.Expression vector pRJB-7 Placing the CKII βα coding sequence immediately after the β casein coding sequence Thus, co-expression of recombinant β casein and CKII βα kinase was A construction pS637 was prepared. The CKII βα coding sequence was replaced with pS637 ofBamHIIn the partBglII/BamHIPlace as a fragment, pRJB-7 I named it. This fragment was constructed from its original vector pET-IId-CKII βα From the T7 promoter. Therefore, as shown in FIG. 3, pRJB- 7 contains two T7 promoters, one of which is preceded by the β casein coding sequence. And the other is located before the CKII βα coding sequence.Expression vector pS750 To change the selectable marker from ampicillin resistance to kanamycin resistance, Plasmid pS637PvuDigested with I and treated with T4 DNA polymerase Produced blunt ends. Isolating the linearized vector,HincII Kanamycin resistance Sex genblock (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and Ligation. The resulting expression vector was named pS750 (see FIG. 4).Expression vector for recombinant human casein kinase II The expression vector pET-11d-CKIIβα (Shi et al., 1994) he Harvard Medical School, Boston, MA C. Courtesy of Dr. Walsh. Studier et al. (Methods in Enzymology 185: 60-89, 1990). Cal PET-11d, a plasmid containing a gene conferring resistance to benicillin -In the case of CKII βα, luria buoy containing 50 μg / mL carbenicillin Bacteria are grown in Yong (LB medium) Vector pS750, which is a plasmid containing a gene conferring resistance to In this case, the bacteria are grown in luria broth containing 50 μg / mL kanamycin. Was. Strains containing the pLys plasmid conferring resistance to chloramphenicol When was used, 30 μg / mL of chloramphenicol was added to the above medium. For induction of the T7 expression system, the culture was grown to a density of OD600 = about 0.5 and Followed by 0.4 mM isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Was added. Cells were harvested about 90 minutes after induction.Electrophoresis and detection of recombinant βα casein Pellet cells by centrifugation and pellet from 1 mL of culture with Tri s, glycerol, SDS, dithiothreitol (DTT) and bromophenol Dissolved in 100 μL of sample buffer containing Leblue. Laemmli (Natu re 227: 680-685, 1970) as described in SDS-P. The proteins were separated by AGE. A gradient gel is formed and Protean ( Bio-Rad, Richmond, CA) in a discontinuous buffer system in an electrophoresis apparatus Electrophoresed. The gel was stained as described by Laemmli. Equipment manufacturer ( B Immunoblot was performed according to the specifications of (io-Rad).Procedure for isolation of modified proteins Isolation of the modified protein by any of the standard procedures known to those skilled in the art And it is possible. A representative example of such a standard procedure is as follows. Cells are collected and ruptured by standard physical or chemical procedures. Then fine The cells are suspended in a buffer, homogenized, centrifuged and the supernatant is removed. As a result Resuspend the insoluble pellet and remove the supernatant. Get washed insoluble pellets Suspended in 50 mM Tris and 6 M urea (pH 8.2) and homogenized . The β casein supernatant I was removed to obtain an insoluble extract. Resuspend in Tris and 6M urea (pH 8.2) and homogenize. β case The supernatant solution 11 is removed, and the supernatant solution I and the supernatant solution II are pooled. Residual insoluble The sexual extract is removed. The pooled supernatant was combined with 50 mM Tris and (pH 8. Dilute 1: 1 with 2), treat with 3M urea, and extract β casein. 50 mM Beta casei against ethanolamine and 100 mM NaCl (pH 9.5) The urea extract was dialyzed, centrifuged, 50 mM ethanolamine and 100 mM By diluting to a protein concentration of 5 mg / mL in NaCl (pH 9.5) Thus, a final β casein solution is obtained. Remove the pellet.Example The experiments described in Examples 1 and 2 demonstrate that the β casein-encoding nucleotide sequence And two vectors containing the casein kinase-encoding nucleotide sequences separately. Does not adversely affect recombinant β-casein production when co-transforming bacteria To indicate that Furthermore, these examples demonstrate that recombinant phosphorylated β-casein can be used in bacterial systems. It also demonstrates that it is possible to produce using these two vectors. Example 4 describes the coding of a promoter and the protein to be transcribed and phosphorylated. Both the nucleotide sequence that encodes and the nucleotide sequence that encodes the kinase Figure 2 illustrates a system in which a single construct containing was used to transform a bacterial strain. In Example 4, Demonstrated the production of recombinant phosphorylated β casein using a single plasmid. Human self For the expression of extracellularly localized recombinant phosphorylated β casein that is identical to β casein Is described in Example 5.Example 1 Production of βα casein in E. coli B: Intracellular localization Phosphorylation of Met- casein: BL21 (DE3) strain Recombinant human CKI phosphorylating recombinant casein in vivo in a bacterial expression system Two inducible expression vectors were used to analyze the ability of I (rhCKII). handE. FIG. coliThe experiment was performed within. Expression vector pS750 alone or In combination with the expression vector pET-11d-CKII βα, the T7 host strain Certain BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, and BL21 ( DE3) Transformed into pLysE. DE3 islacI repressor, Inducible by isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)lac UV5 promoter and gene encoding T7 RNA polymerase And a DNA fragment derived from λ phage. In the presence of an inducer, T 7 Produces RNA polymerase and causes transcription of exogenous genes. Plasmi PLysS confers chloramphenicol resistance but proliferates exogenous proteins Has little effect on speed and production. This plasmid isE. FIG. coliDuring ~ Increase the stability of the plasmid in Includes T7 lysozyme that allows for cell lysis by thawing. The results shown in FIG. 5 indicate that high levels of recombinant human Met-β caseinE. FIG. coli Depending on the co-production of recombinant human CKIIβα This indicates that the production of inn was not affected. Electrophoretic separation of proteins CKII βα recombines recombinant human Met-β casein after It is clear that it was phosphorylated in vivo. This is shown in FIG. That it is possible to produce phosphorylated β-casein in bacterial systems Is shown.Example 2: Production of β casein in E. coli K-12: an intracellular localization set Phosphorylation of recombinant Met-β casein: HMS174 (DE3) strain E. FIG. coli K-12 strains HMS174 (DE3), HMS174 (DE3) ) PLysS and HMS174 (DE3) pLysE were transformed with recombinant human Met. Evaluated as a host for the production of -β casein and transformed with pS750. H MS174 (DE3) pLysS gave the highest efficiency production. pS7 The co-expression experiment using pET-11d-CKIIβα with pET-11d-CKII βα Strong induction of Met-β casein production And was independent of the presence of pET-11d-CKII βα. Phosphate staining (FIG. 7) provides a means of co-production with recombinant human CKII in vivo. In this case, it was revealed that efficient phosphorylation of Met-β casein was obtained. The two-plasmid system monitors the presence of the plasmid in the host cell during the fermentation process. Each of the plasmids must contain an antibiotic marker to be visible Therefore, it is inherently inferior to the single plasmid system of the present invention. This is a growth medium It requires the use of two antibiotics in the ground and prevents bacterial growth.Example 3 Production of human β casein in E. coli K-12: β casei RJB-7 Construct Containing Both Encoding and CKII βα Encoding Sequences : T7 promoter in front of β casein coding sequence: CKII βα coding T7 promoter in front of an activating sequence A β casein gene preceded by a T7 promoter and a T7 promoter With the CKII βα gene preceded by a construct pRJB-7,E. FIG. coli Transformed into K-12 host HMS174 (DE3) pLysS . The transformation procedure and the induction procedure used were the same as described in Example 4. transformation and induction procedures for the vagen pET system manual Was.Western blot analysis The procedures for separation, transfer, blocking and antibody are described in Example 4. FIG. Includes 4 different artifactsE. FIG. coli HMS174 (DE3) pLysS Figure 3 shows an immunoblot comparing production of β casein by cells. Induced cell culture medium Lysate from both non-induction media is analyzed. Cells were pET-11d-CK II βα (having both CKII β coding sequence and β casein coding sequence Plasmid, pRJB-9 (β casein coding sequence and CKII βα Coding sequence and a T7 promoter in front of only the β casein coding sequence Hybrid construct) or pRJB-7 (β casein coding sequence plus CK II βα coding sequence, β casein coding sequence and CKII βα coding Hybrid constructs with a T7 promoter in front of both sequences. Transformation of cells with pRJB-7 resulted in a marked decrease in cell proliferation.E. FIG. c oli HMS174 (DE3) pLysS cells are one T7 promoter PRJB which is a creation that only contains It had about twice the doubling time of the same strain transformed with -9. In FIG. The Western blots shown show pRJB-9 when compared to cells containing pRJB-9. Revealing decreased production of recombinant β casein by induced cells containing B-7 doing. This is because lane 4 (induced pRJB-7) and lane 8 (induced pRJB- It is clear from the comparison with 9). pRJB-7 and pRJB-9 are both pS6 Derived from 37, only pRJB-9 has an equivalent amount of β casei as its parental product. Produced. Additional T7 promoter before the CKII gene in the hybrid construct The presence of a protein reduces the cell growth and thus the production of recombinant protein. The result was small. FIG. 9 shows a phosphoserine antibody for detecting a lysate-phosphorylated protein. 3 shows Western blot analysis developed in FIG. pET-11d-CKII βα, pRJB-9 (hybrid construct with one T7 promoter), pR JB-7 (hybrid construct with two T7 promoters) or pS 637 (including the β casein coding sequence but not the CKII βα coding sequence Induction includingE. FIG. coli HMS174 (DE3) pLysS cells were Oxidized recombinant β casei The production was compared. Phosphorylated β casein is expressed in cells containing pRJB-9 ( It was produced only in lane 6). Lysate of cells containing pRJB-7 In lane 7 including the sample, no phosphorylated protein was detected at all. Detection of phosphorylated proteins in constructs with two T7 promoters What did not work was that the appropriately modified recombinant protein could be expressed in microorganisms. Both creativity and experimentation are needed to develop a single-product system disclosed herein for It was shown that it was. Protein-encoding nucleotide sequence and kinase coding Using two T7 promoters in a single construct containing Experiments yielded negative results, but under different experimental conditions one or more promoters Should not be ruled out. Use two different promoters Situations where it is considered preferable are included within the scope of the present invention.Example 4: E. Production of human β casein in E. coli K-12: β casei PRJB-9, which contains both a CKII βα coding sequence and a CKII βα coding sequence The present invention provides information and repair for the transfer of a functional group to a specific site. Use a single construct to express both the protein to be decorated . In a particular embodiment of the invention, the functional group to be transferred is a phosphate group. this Metastasis mediates in vivo phosphorylation of specific sites on human β casein. Caused by proven kinases. The present invention provides human β caseinE. FIG. c oli Not only allows for specific phosphorylation in vivo , With a promoter located in front of the β casein coding sequence and a single construct We also show that a single construct with the benefits of the system mediates this function properly.E. FIG. E. coli K-12 HMS174 (DE3) Transformation into pLysS A construct pRJB-9 containing the β casein gene and the CKII βα geneE . coli Transformed into K-12 host HMS174 (DE3) pLysS . The transformation procedure used was the Novagen pET system manu al (4th ed, TB No. 55, June, 1994).Induction of expression Plasmids pRJB-9 (FIG. 2), pS637 (FIG. 1), and Contains pET-11d-CKII βα (Shi et al., 1994)E. FIG. col i HMS174 (DE3) pLysS host cells were grown at 30 ° C. and OD60 0 = 0.5-0.6 density. Before adding 1 mM of the inducer IPTG, Six hours after that, a culture sample was collected. Micro aliquot two 1mL aliquots Pelletized by centrifugation in a centrifuge. Sample loading for gel electrophoresis Cells were resuspended in the buffering buffer, after which 500 aL was removed from each aliquot. Of the supernatant was collected. Use the used solvent medium in Microcon 10 spin The mixture was concentrated at 10,000 × G for 35 minutes using a filter (Amicon). 1, Retained material was collected after spinning at 000 × G for 3 minutes, and an equal volume of double concentration sample Buffer was added.Western blot analysis SDS-Polyacrylamide p using a 10% -20% gradient re-cast Gel (Integrated Separations S cell lysate on a lysate) and Immob on a semi-dry blotter. Converted to ilon-P membrane (Millipore, Bedford, MA) Moved. Trans-Blot SD Transfer r Cell (Bio-Rad) using Immobilon PVDF constant current (0.8 mA / c) for 45 minutes on a filter (Millipore) The gel was electroblotted in m2). The transfer buffer was 48 mM T ris, 39 mM glycine, 1.3 mM SDS (sodium dodecyl sulfate) , And 20% methanol. Prior to transfer, filter first with methanol Immersion, followed by immersion in transfer buffer. For performing Western blot analysis First, the above-mentioned membrane was added to TBS (25 mM Tris, 0.154 M NaCl). In 3% bovine serum albumin and 0.2% Tween, pH 7.4). Locked. The primary antibody against β casein and the alkaline antibody Dilute 1:80 000 Sphatase goat anti-rabbit antibody in blocking buffer. I shouted. Additional antibodies were used to detect phosphoserine. 2% in TBS In amplification grade pig skin containing gelatin (US Biochemicals) For 2 hours at 25-26 ° C. to cause blocking and antibody reaction. Then block The plate was washed with TBS for 30 minutes. Mouse monoclonal anti-phospho as primary antibody Serine (Sigma) in a 2% gelatin blocker at 1: 200 Or diluted 1: 100 and incubated for 2 hours. 5 minutes in TBS Washing was performed twice. Goat anti-mouse alkaline phosphatase is a secondary antibody (Sigma) diluted 1: 4,000 in the above gelatin blocker, And washed in TBS as above. Nitro blue tetrazo Lithium and 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate are used for color development. Was used as a substrate. FIG. 10 includes three different artifactsE. FIG. coli K-12 HMS17 Immunoblot comparing β casein production by 4 (DE3) pLysS cells Is shown. The cells are pS637 (a plasmid having a β casein coding sequence), pET-11d-CKII βα (CKII β coding sequence and β caseinco Plasmid), or pRJB-9 (β casein encoding). Hybrid constructs having both the coding sequence and the CKII βα coding sequence). No. From a comparison of lanes 3 and 4, pRJB-9 was derived therefrom and CK II An amount equal to the amount of β-casein produced by pS637 without the βα coding sequence It is clear that β-casein is produced by the hybrid construct pRJB-9. is there. pRJB-9 and pS 637 both from 400 mg / mL to 500 mg / mL in this host cell. Produced casein. In this experiment, the CKII βα coding sequence and tandem A β-casein coding sequence in Escherichia coli does not significantly alter β-casein production It is shown that. FIG. 11 shows that the lysate was treated with a phosphoserine antibody to detect phosphorylated proteins. Figure 5 shows a Western blot analysis developed in the body. Increase in addition to the lysate in Figure 8 The amounts of native human beta casein and non-phosphorylated recombinant beta casein were tested. CKII In lane 6, containing the lysate from the βα plasmid, the bacterial protein phosphate No phosphorylation was detected, indicating that phosphorylation is specific. β PRJB having zein coding sequence and CKII βα coding sequence in tandem The cell lysate in lane 4 containing -9 shows a strong band cross-reacting with the above antibody. Show. The band in lane 4 is the electrophoretic fraction as seen in lanes 2 and 3. It has the same molecular weight as that of natural human milk β-casein by analysis. Lane 7 and Cross-linking to recombinant non-phosphorylated human β-casein purified as in Reactivity, or in vivo by pS637 as in lane 5 There was no cross-reactivity to the expressed recombinant non-phosphorylated human beta casein . This experiment was performed in a bacterial system using a single construct.E. FIG. coli K-1 2. Specific and high levels of phosphorylation of intact recombinant human β-casein within Demonstrate thatExample 5: Production of β-casein in E. coli K-12: Extracellular Localization Set Phosphorylation of recombinant β casein: coli leader sequence, promoter, mosquito Constructs comprising the zein coding sequence, pET-11d-CKII βα In this example,E. FIG. coli K-12 is transformed and extracellularly localized Discloses the construction of a single plasmid used to mediate the production of oxidized beta casein I do. Designed to secrete phosphorylated proteins into the periplasmic space of bacterial cells Β-casein coding sequence to form a single product Into an expression vector containing a leader sequence that directs the periplasmic space. this Using the clone obtained by these procedures as target DNA, polymerase chain reaction is performed. The reaction (PCR) is performed. Midland Certified Reagent Co. (Midland, TX) RO-4: 5'-TGT AAA ACG GCC ACT-3 '(sequence number No .: 3) and RO-29: 5'-GGG GAT CCG TAC Using GCG TGA AAC-3 '(SEQ ID NO: 4) in PCR Is possible. The underlined base of RO-29 is the bacterial base for protein synthesis. At the end of the β casein coding sequence to remove the initiation codon methionineMluI Includes single base modifications to create sites. The modification is Protein has the same amino acid sequence as human β casein Do so. Thereafter, the PCR fragment is purified. 3 'of the above unmodified coding sequence EndBamHIDisconnect with 5 'blunt end and 3'BamHIIncluding this end The fragment was cloned into pET-26b containing the T7 promoter (Novagen, Madis). on, WI)MscIWhenBamHIAnd at the blunt end Disconnect. The construct described here contains the T7 promoter, but other promoters It is also possible to use arrays. The CKIIβα coding sequence was converted to pRJB- Insert as described above for 9. According to the procedure described in Example 4, Expression is induced and Western blot analysis is performed. Cross reacts with antibodies to phosphoserine and migrates like native beta casein Western blot to identify proteins isolated from the periplasmic space of bacterial cells Perform a blot. This experiment was performed on sequences fused to the heterologous translation initiation and signal sequences. Thus, the phosphorylation of the encoded recombinant human β casein was demonstrated, Has a promoter sequence, and the sequence to be phosphorylated is CKII βα. Placed in a plasmid containing such a kinase coding sequence. To date, extracellular The production of localized phosphorylated proteins can be carried out in either a one-vector system or a two-vector system. It is not disclosed in any form. The fact that the phosphorylated protein produced is extracellularly localized An advantage over the above is the ease of purification of the protein. Cell circumference of bacterial cells The amount of foreign material contained in the luminal cavity is less than the amount of foreign material contained inside the cell. Therefore, isolation of the purified protein can be easily performed. This is in industrial production It is particularly advantageous. The present invention relates to the production of phosphorylated recombinant mammalian proteins in microorganisms on an industrial scale. Would be able to do with. The method of the present invention may be used without limitation to recombinant human β-case. Recombinant exogenous protein containing It can be used to mass produce proteins. Inside the bioreactor Β-casein phosphorylation in humans produces recombinant β-casein equivalent to natural human β-casein. It enables large-scale synthesis in fermenters. This converts human beta casein to It will facilitate the production of infant formulas that contain natural phosphorylation. The present invention The method is regulated by signal phosphorylation and dephosphorylation and thus Also used for phosphorylation of cellular proteins, including receptors that act as Is also possible. The present invention is cost-effective for phosphorylating peptide receptors. It would be useful for the manufacture of pharmaceutical preparations. For industrial production of fermented proteins such as recombinant phosphorylated human β casein, Single plasmid systems are preferred over two plasmid systems. Due to antibiotics in the growth medium Large-scale production of recombinant proteins without the selection pressure imposed by Means that the cells containing the above plasmid contain only one plasmid or the plasmid Not only has no selective advantage over cells containing no During the fermentation process, because the presence of Causes sumid loss. However, the two plasmids remain in the bacteria during fermentation. The use of multiple antibiotics to provide the necessary selection pressure to Often, they hinder bacterial growth and cause a reduction in the yield of the desired recombinant product. Obedience Thus, for industrial purposes, the single plasmid system disclosed herein has been previously disclosed. Significant advantages over some two-plasmid systems. As disclosed herein, characteristics similar or similar to those of natural human β casein are disclosed. A novel method for producing recombinant phosphorylated human beta casein with the same characteristics Finding a way to formulate infant formula into human milk has significant benefits for infant development It is advisable to add this protein to infant formula to bring Make it easier. Furthermore, methods for producing recombinant modified human proteins in bacterial systems are described. The disclosure allows for the addition of such human proteins to other food and pharmaceutical products. Make it easier. In the above, certain preferred embodiments of the present invention will be described with reference to the accompanying examples and drawings. However, the present invention is not limited to these specific embodiments. Departures from the spirit or scope of the invention as defined in the appended claims That various changes and modifications can be made by those skilled in the art. Will be obvious.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者ハンソン，エル・ステイークスウエーデン国、エス−907・38・ウーメオ、ビヨルクベーゲン・50──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI C12R 1:19) (C12P 21/00 C12R 1:07) (C12P 21/00 C12R 1: 225) (C12P 21/00 C12R 1 : 46) (72) Inventor Hanson, El Stake Sweden, S-907.38, Umeå, Bjorkwegen, 50

Claims

[Claims] 1. A method for producing a modified recombinant protein in a host cell, comprising: (a) a promoter sequence, a nucleotide sequence encoding an exogenous protein capable of post-translational modification, and modifying the exogenous protein. Preparing a single vector having a nucleotide sequence encoding an enzyme capable of: (b) transforming said host cell with said vector; (c) expressing said vector in said host cell Modifying the produced recombinant protein with the produced enzyme; and (d) isolating the modified recombinant protein. 2. A method for producing a phosphorylated recombinant protein in a host cell, comprising: (a) a promoter sequence followed by a nucleotide sequence encoding an exogenous protein capable of being phosphorylated by a protein kinase; Preparing a single vector having a nucleotide sequence encoding a protein kinase capable of phosphorylating the exogenous protein, followed by (b) transforming the host cell with the vector. (C) expressing the vector in the host cell, and phosphorylating the produced recombinant protein with the produced protein kinase; and (d) simply expressing the phosphorylated recombinant protein. The above method comprising the step of releasing. 3. 3. The method of claim 2, wherein said host cell is a prokaryotic cell. 4. The prokaryotic cells, Escherichia coli K-12, Esc herichia coli B, Bacillus species, Lactobacil lus species, and A method according to claim 3 selected from the group consisting of Stretococcus species. 5. The method according to claim 2, wherein the promoter sequence is an inducible promoter selected from the group consisting of T7, πPL, πPR, and Tac. 6. 3. The method of claim 2, wherein said promoter sequence is a constitutive promoter selected from the group consisting of bla and spa . 7. The method according to claim 1, wherein the enzyme is a protein kinase or palmitoyltransferase. 8. 3. The method of claim 2, wherein said protein kinase is selected from the group consisting of serine kinase, threonine kinase, and tyrosine kinase. 9. 3. The method according to claim 2, wherein said protein kinase is casein kinase. 10. The method according to claim 9, wherein the casein kinase is CKII βα. 11. 3. The method according to claim 2, wherein said recombinant protein is a mammalian protein. 12. 3. The method according to claim 2, wherein said recombinant protein is a human protein. 13. The method according to claim 12, wherein the human protein is β casein. 14． 14. The method according to claim 13, wherein the produced β casein is localized in a cell. 15. 14. The method according to claim 13, wherein the produced casein is extracellularly localized and confirmed in the periplasmic space of the host cell. 16. 3. The method of claim 2, wherein said vector is pRJB-9 as described in FIG. 17． 2. The human beta casein, a cell receptor protein, a fatty acylated protein, a mammalian muscle protein, a retroviral gag gene polypeptide, and a mammalian protein targeted by a retroviral src kinase. A protein produced by the method according to 1. 18. The protein produced by the method according to claim 2, wherein the protein is β casein. 19. A nutritional product comprising a modified protein produced as described in claim 1. 20. A preparation comprising a modified protein produced as described in claim 1.