JPH11500902A

JPH11500902A - 植物細胞内ミリスチン酸エステルの産生

Info

Publication number: JPH11500902A
Application number: JP8523784A
Authority: JP
Inventors: デヘシュ，カタヨーン; アロイスボールカー，トニ; ホーキンス，デボラー
Original assignee: カルジーン，インコーポレイティド
Priority date: 1995-02-02
Filing date: 1996-02-01
Publication date: 1999-01-26
Also published as: CA2212003A1; WO1996023892A2; WO1996023892A3; US5850022A; EP0807182A2

Abstract

(57)【要約】本発明によると、植物種子油中にＣ14脂肪酸を産生する方法が提供される。第１の態様では、本発明はクフェア・パルストリス、クスノキまたはニクズク由来であって特定のＣ14を好むアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ配列に関し、Ｃ14脂肪酸を産生するために宿主細胞内で上記チオエステラーゼを発現するためのＤＮＡ構築物に関する。本発明の他の態様は、植物細胞内にＣ14脂肪酸を産生するために他の植物の中鎖チオエステラーゼ、あるいは非植物由来の中鎖チオエステラーゼを使用する方法に関する。この点に関しては、クフェア・パルストリス、ニクズクおよびクスノキの中鎖アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼからの発現の結果、植物細胞内におけるＣ14脂肪酸の産生がもたらされる。

Description

【発明の詳細な説明】植物細胞内ミリスチン酸エステルの産生本出願は1995年２月２日に提出したUSSN08/383,756の一部継続出願である。技術分野本発明は核酸配列および構築物と、それに関連する方法に関する。緒言背景いくつかの科に属する植物は、分化した貯蔵組織内部に主に中鎖（Ｃ８〜Ｃ14 ）の大量のトリグリセリドを合成し、その何種類かは収穫され、植物油を含む重要な食用・工業用中鎖脂肪酸の生産に用いられている(F.D. Gunstone，「The Li pid Handbook」 Chapman & Hall，New York，(1986)pp．55-112)。ラウリン油（Ｃ12:0脂肪酸アシル基を含むもの）とその誘導体は広く使用され、特に石鹸、洗剤、パーソナル・ケア産業において著しい。石鹸、洗剤、パーソナル・ケア製品の差別化においては、過去数年間にわたりマイルドさがますます重要となってきた。なかでも、マイルドさが改善された条件に適合した性能の開発はきわだっている。ミリスチン酸エステル（Ｃ14:0）を主成分とする界面活性剤によると、洗浄とマイルドさの組合せは優れたものとなる。しかし、この界面活性剤は機能上優れているにも関わらず、ミリスチン酸エステルの供給に限りがあることがその界面活性剤の活発な使用の妨げとなってきた。ミリスチン酸エステルはラウリン油分画の副産物として比較的少量だけが利用できる。ココナツ油にはＣ12:0およそ48％とＣ14:0およそ17％が含まれ、パームナッツ油にはＣ12:0およそ51％とＣ14:0およそ18％が含まれる。しかし、市販の「ラウリン脂肪酸／メチルエステル」製品には主成分のラウリン酸エステルの他にかなりの量のミリスチン酸エステルが含まれるため、これらの油に存在するＣ14:0のうち、精製C14:0（ミリスチン酸エステル）として利用できるのはほんの一部分だけである。現在パーソナル・ケア産業ではミリスチン酸エステルを主成分とする誘導体はその生産に伴う高コストのために限られた用途でしか使用されていない。文献 Pollardら（「Arch．of Biochem．and Biophys.」（1991）284:1-7）は、カリフォルニア・ゲッケイジュ、別名ウンベルラリア・カリフォルニカ（Umbellular ia californica）の油料種子の成長中に中鎖アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ活性を確認した。その後、このカリフォルニア・ゲッケイジュのチオエステラーゼはDaviesらによって精製され（Arch．Biochem．Biophys．（1991）290:37-45）、それによって対応ｃＤＮＡがクローン化され、植物のトリグリセリド組成の変更に使用された(WO 91/16421およびWO 92/20236)。クフェア・ホオケリアーナ(Cuphea hookeriana)とニレから得られたＣ８およびＣ10の基質に活性を示した中鎖チオエステラーゼは WO 94/10228に記載されている。また、クラスＩＩ型チオエステラーゼ遺伝子の発現による形質転換植物中でのＣ16脂肪酸の産生は WO 95/13390に記載されている。図面の説明第１図。クフェア・パルストリス（Cuphea palustris）のＣ14:0‐ ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡクローンＭＣＴ３４（ＣｐＦａｔＢ２）の核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列を示す。第２図。Ｃ14:0‐ＡＣＰに対する優先活性を有するニクズク〔ミリスチカ・フラグランス（Myristica fragrans）〕種子クラスＩＩ型チオエステラーゼ、ＭＹＲＦ‐１（ＭｆＦａｔＢ２）の核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列を示す。第３図。Ｃ14:0‐ＡＣＰに対する優先活性を有するニクズク（ミリスチカ・フラグランス）種子クラスＩＩ型チオエステラーゼ、ＭＹＲＦ‐２（ＭｆＦａｔＢ１）の核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列を示す。第４図。クスノキのクラスＩＩアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼの完全なタンパク質部分をコードする領域を含むＰＣＲ断片の核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列を示す。第５図。ニレのアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ部分ｃＤＮＡクローンの核酸配列および翻訳されたアミノ酸配列を示す。第６図。クフェア・ホオケリアーナのＣＵＰＨ‐４チオエステラーゼｃＤＮＡクローン、ＣＭＴ１３の核酸配列を示す。第７図。オレオシン(oleosin)発現カセットの核酸配列を示す。第８図。ニクズク種子ＦａｔＢチオエステラーゼを発現するアブラナ属植物3854 -3および 3854-11の個々の種子から得たモル％脂肪酸組成データを示す。第９図。クスノキのＦａｔＢチオエステラーゼを発現するアブラナ属植物5233-5 （第９Ａ図）および5233-6（第９Ｂ図）の個々の種子から得たモル％脂肪酸組成データを示す。第１０図。クフェア・パルストリスのＦａｔＢチオエステラーゼを発現するアブラナ属植物 3863-10、3863-7、3863-4、3863-8、3863-2および3863-5の個々の種子から得たモル％脂肪酸組成データを示す。第１１図。クフェア・パルストリス、クスノキおよびニクズクの種子Ｃ14チオエステラーゼで形質転換したブラシカ・ナプス（B．napus）植物種子のＣ16およびＣ14脂肪酸組成のグラフを示す。第１２図。オレオシン／クフェア・パルストリスＣ14チオエステラーゼ（pCGN38 64）構築物およびオレオシン／ニクズク種子Ｃ14チオエステラーゼ（pCGN3857）構築物で形質転換したブラシカ・ナプス植物のプールされた種子から得たモル％脂肪酸組成データを示す。発明の概要本発明によると、Ｃ14:0‐ＡＣＰ基質に作用してＣ14:0（ミリスチン酸エステル）を生成する能力を有し、アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼをコードする植物遺伝子が提供される。使用する特定のチオエステラーゼに応じて、ミリスチン酸エステルの産生に伴うＣ16（パルミチン酸エステル）やＣ18（ステアリン酸エステル）などのその他の飽和脂肪酸の産生率が高くなる。本発明には植物由来の生理活性チオエステラーゼをコードする配列並びにプローブ、形質転換用のベクター、あるいはクローニング中間生成物をコードする配列が含まれる。生物活性配列は、種々の構築物中に見られる転写調節領域に関するセンス配向に優先的に見られる。本発明はゲノム配列またはｃＤＮＡ配列の全部もしくは一部と、それによってコードされる、前駆物質または成熟植物タンパク質を含むチオエステラーゼタンパク質に関する。Ｃ14:0‐ＡＣＰ基質の加水分解能を有し、チオエステラーゼをコードする種々の植物遺伝子が本明細書中で例示され、例えばクフェア種、ニクズク、クスノキから得られる。また、例示される植物チオエステラーゼ配列はその他の関連植物チオエステラーゼ遺伝子を得るためにも使用できる。特に興味深いのは、開示したタンパク質配列の転写あるいは転写および翻訳（発現）が可能な組換えＤＮＡ構築物である。特に、植物宿主細胞中で転写あるいは転写および翻訳（発現）を行う能力がある構築物が好ましい。このような構築物には、植物種子組織中で優先的に発現される遺伝子から得られる転写開始領域を含む種々の調節領域が含まれる。第二の態様では、本発明は宿主細胞、特に植物宿主細胞中のこのような構築物の存在に関し、宿主細胞またはその後代の内部で構築物を発現させることを通して、その細胞内にＣ14アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質を産生させる方法に関する。関連する態様では、本発明はＣ14アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する発現部位を内部に有する形質転換宿主細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は細胞、特に植物細胞内部で産生される脂肪酸の比を変更するためにＣ14:0アシル‐ＡＣＰ基質の加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を使用する方法に関する。このような脂肪酸組成比が変更された植物細胞も本明細書中で企図される。特に興味深いのは、脂肪種子植物中の貯蔵トリグリセリドの脂肪酸組成のＣ14 :0脂肪酸アシル基比を増大させる変更であり、ある場合は炭素数が16や18のその他の飽和脂肪酸アシル基を増大させる変更である。このように、新しい脂肪酸アシル組成を有する油変更種子が作成される。このような新規の種子と油も本発明によって企図される。発明の詳細な説明本発明で使用されるＣ14アシル‐ＡＣＰ基質加水分解能を有する植物タンパク質には、植物酵素反応条件下でＣ14:0‐ＡＣＰ基質から遊離脂肪酸を産生する触媒能力を表すアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質のあらゆる配列が含まれる。「酵素反応条件」とは、酵素が作用できる環境（すなわち温度、ｐＨ、阻害物質がないことなどの因子）で必要ないかなる条件も利用できることである。Ｃ14加水分解活性を有するこのようなタンパク質は種々の植物材料から得られ、またパルミチン酸エステル（16:0）や、場合によってはステアリン酸エステル（18:0）などの飽和脂肪酸を含む様々な鎖長の脂肪酸アシル‐ＡＣＰの加水分解活性をも表す。本適用で特に興味深いのは、中鎖または長鎖アシル‐ＡＣＰ基質を含む他のアシル‐ＡＣＰと比較して主にＣ14:0‐ＡＣＰ基質の加水分解活性を有する植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼである。この点では、クフェア・パルストリスから得られる配列をコードするチオエステラーゼが本発明では特に興味深い。また、Ｃ14:0‐ＡＣＰ活性を有するその他の植物チオエステラーゼも、他の中鎖アシル‐ＡＣＰ基質、すなわち炭素鎖長Ｃ８、Ｃ10、Ｃ12を有するものと比較してＣ 14:0‐ＡＣＰ基質に対して優先的に加水分解活性を表す限り興味深い。従って、より長鎖の基質と他の中鎖の基質に対していくらか活性を有するとともにＣ14:0 ‐ＡＣＰ基質に対して実質的な活性を有するニクズクおよびクスノキ由来のアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼも本発明によって企図される。従って、Ｃ14産生に有用な植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼも、Ｃ16やＣ18の炭素鎖長を有するものなど、より長鎖のアシル‐ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を表すことが分かる。本明細書に例示した植物ＣI4:0‐ＡＣＰチオエステラーゼ配列に加えて、その他の植物種由来のアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼも本発明の関心の対象である。植物Ｃ14:0‐ＡＣＰに対して活性を有するチオエステラーゼをコードする遺伝子を分離するための標的植物種には、ミリスチカセアエ(Myristicaceae)、シマルバセアエ（Simarubaceae）、ボチシアセアエ（Vochy siaceae）、サルバドラセアエ(Salvadoraceae)など、かなりの濃度のＣ14脂肪酸を蓄積することが報告されているもの、およびエリスマ（Erisma）、ピクラムニア(Picramnia)、ビロラ（Virola）の降雨林種が含まれる。14:0‐ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を分離するため、本明細書に提供されるＣ14:0‐ＡＣＰチオエステラーゼ配列、あるいは既に記載された他の植物中鎖アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ配列から核酸プローブを調製する。中鎖植物チオエステラーゼを含む植物チオエステラーゼはWO 91/16421(PCT/US 91/02960)、WO 92/20236 (PCT/US92/04332)、WO 94/10288(PCT/US93/10814)およびWO 95/13390(PCT/US94/13131)に記載され、その開示全体を参照により本明細書に組み込む。幾つかの植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼをコードする配列と翻訳されたアミノ酸配列の分析から「クラスＩ」または「ＦａｔＡ」（fatty acyl transferase type Aの略）および「クラスＩＩ」（または「ＦａｔＢ」）と呼ばれる植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼの進化クラスが二つ存在することが示された。これらのクラスは単にチオエステラーゼをコードする配列が得られた種々の植物の系統発生的関係を反映したものではない。例えば、クフェア・ホオケリアーナＦａｔＡクローン(WO 94/10288、第１０図のクローンＣＬＴ７) はベニバナＦａｔＡクローン(WO 92/20236、第４図に提供される配列)と密接な関係がある。対照的に、クフェア・ホオケリアーナＦａｔＢクローン(WO 94/102 88、第６図のＣＵＰＨ‐１クローン)はクフェア・ホオケリアーナＦａｔＡクローンおよびベニバナＦａｔＡクローンから進化関係が等しく離れている。クラスＩチオエステラーゼは、マンゴー（第１図）、ベニバナ、ブラシカ・カンペストリス(Brassica campestris)およびクフェア・ホオケリアーナにあることが知られ、その配列は1992年７月21日出願、現在審査中のUSSN07/949,102と、 WO 92/20236および WO 94/10288の中に提供されている。現在まで記載された植物クラスＩ型チオエステラーゼは、より長鎖のアシル‐ＡＣＰ基質、特に18:1‐ ＡＣＰに対して優先的な活性を有する。クラスＩＩチオエステラーゼは、例えばカリフォルニア・ゲッケイジュ、ニレ、クフェア・ホオケリアーナ、アラビドプシス・サリアーナ（Arabidopsis thaliana）およびクスノキに発見されている。本明細書に記載した植物Ｃ14:0アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼもクラスＩＩ型である。現在までに記載された中鎖を好むすべてのアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼは、Ｃ14:0 に対して活性を有するものも含めてクラスＩＩ型である。従って、Ｃ14:0基質に対して活性を有するその他の植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼは中鎖アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼとの配列相同性を通して確認できる。例えば、本明細書に例示したクフェア・パルストリスＣ14アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼは、中鎖を好むアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼの配列をコードする遺伝子ライブラリーのスクリーニングによってクフェア・パルストリスから得られた。クフェア・パルストリスの遺伝子配列がＣ８、Ｃ10、Ｃ16脂肪酸に対し優先的な活性を有するチオエステラーゼをコードしているのにも関わらず、種々のクフェア種でチオエステラーゼ遺伝子中の配列相同性がかなりあることから、検出できる程度にクフェア・パルストリスＣ14クローンのクフェア・ホオケリアーナ遺伝子プローブへのハイブリダイゼーションを行うことが可能であった。クフェア種以外の植物由来のＣ14チオエステラーゼのハイブリダイゼーションを行うためには、厳密性が低い条件下の直接ハイブリダイゼーション技術も成功する可能性がある。例えば、本明細書に記載したニクズクＣ14:0‐ＡＣＰチオエステラーゼ・クローンは、カリフォルニア・ゲッケイジュＣ12:0‐ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子フラグメントをプローブに使用した低厳密性ハイブリダイゼーション・スクリーニングによって得られた。従って、その他の植物種由来の中鎖アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をＣ14アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の確認に使用できる。加えて、種々の植物中鎖チオエステラーゼアミノ酸配列中に高度保存領域が確認されている。このような領域は、特にＣ14:0‐ＡＣＰに対して優先的な活性を有するものを含むその他の中鎖チオエステラーゼ遺伝子の確認、例えばＰＣＲ増幅技術による確認に使用される。上記のように、その内部にＣ14:0脂肪酸がかなり存在する植物は、天然のＣ14 :0植物チオエステラーゼを得るには好ましい候補である。しかしながら、Ｃ14:0 脂肪酸がそれほど存在しないその他の植物材料をその他の酵素材料としてスクリーニングにかけることができることも認めるべきである。例えば、本明細書で論じたように、クスノキの種子油の組成の分析によるとＣ12:0肪酸基はかなりの濃度であるがＣ14脂肪酸基は低濃度しかないことが示されたのにも関わらず、クスノキアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子がＣ14:0‐ＡＣＰ基質に対する優先的な加水分解活性を有し、Ｃ12:0‐ＡＣＰ基質に対しては少ししか活性がないことが分かった。従って、大腸菌中の中鎖アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼの発現は、形質転換植物中でＣ14:0脂肪酸を産生するのに使用できるアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼの確認に使用できる。候補の植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子のノーザン分析もＣ14:0脂肪酸に対して活性を有するものの確認に有用であろう。クフェア・ホオケリアーナでは、種々の植物組織中に低濃度で発現するクローン、ＣＵＰＨ ‐１が主に16:0アシル‐ＡＣＰ基質に対して活性を有することが立証されている。しかし、同類のクフェア・ホオケリアーナのチオエステラーゼのクローン、ＣＵＰＨ‐２は高濃度で発現し種子に特異的であることが立証された。このＣＵＰＨ‐２は主に中鎖アシル‐ＡＣＰ基質、すなわちＣ８とＣ10に対して加水分解活性を有することが分かった。同様に、クフェア・ホオケリアーナＣＵＰＨ‐４も種子特異的に高濃度で発現し、本明細書中の実施例でさらに立証するが、形質転換した宿主細胞の中でＣ14脂肪酸の産生を増やすのに使用できる。抗体調製物、核酸プローブ（ＤＮＡとＲＮＡ）等は種々の植物材料から「相同」あるいは「同類」のチオエステラーゼをスクリーニングして取り出すのに調製・使用できることに当業者なら容易に気づくであろう。免疫スクリーニング法には、モノクローナルにせよポリクローナルにせよ、抗体調製物が使用される。その抗体を検出するため、放射能、もしくは市販の様々な第二抗体／酵素共役系のうち任意の一つを用いて標識する。利用できる抗体検出系のいくつかの例はOber filder（「Focus」(1989)、ＢＲＬライフテクノロジーズ社、11:1-5）によって記載されている。核酸スクリーニング法としては、関心のある候補の植物源から調製されたゲノム・ライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを植物チオエステラーゼから得た保存配列をプローブとして調べ、相同的に同類の配列を確認する。相同配列は、配列情報、核酸またはアミノ酸、を比較して、あるいは既知のチオエステラーゼと候補の材料との間のハイブリダイゼーション反応を通して決定される配列の同一性があるときに見出される。アミノ酸配列の相同性を決定するにはＧｌｕ／Ａｓｐ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ｇｌｎ／Ａｓｎなどの保存変化も考慮される。２個の完全な成熟タンパク質の間で少なくとも25％の配列が同一であれば、アミノ酸配列は相同と考えられる。（一般に Doolittle，R.F.、「ＵＲＦＳ and ＯＲＦＳ」（University Science Books ，CA，1986）参照。）通常、長い核酸配列は、存在する可能性があるがなお同類と考えられる欠失をすべて除き、標的配列と所与の関心のある植物チオエステラーゼとの間に少なくとも50〜60％の配列相同性を示し、より好ましくは最低約70％の配列同一性を示す。大きいｃＤＮＡフラグメントなど、比較的長い核酸フラグメント(>100 bp) をプローブとして使用した場合、標的試料からシグナルを20〜50％の偏差で得る、すなわち相同配列を得るためには、厳密性を低くして（例えばプローブの融点から40〜50℃低い温度で）スクリーニングする。(Beltzら、「Methods in Enzym ology(酵素学の方法)」（1983）100:266-285参照。）比較的短いプローブもチオエステラーゼ遺伝子分離技術に有用であり、特に複製連鎖反応（ＰＣＲ）で適用される。以下の実施例でさらに詳細に説明するが、植物中鎖アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ・タンパク質配列中に高度に保存される配列に対するプライマーを用いたＰＣＲによって中鎖チオエステラーゼ遺伝子フラグメントを得ることができる。当業者に周知の方法を用いて、Ｃ14:0‐ＡＣＰ基質の加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を構築物中に挿入し、次いでこの構築物を形質転換植物を作成するための植物細胞を含む、酵素を発現させるために選択した宿主細胞の内部に導入することができる。従って、宿主細胞の可能性のある細胞には原核細胞と真核細胞の両者が含まれる。宿主細胞は、使用目的によって単細胞か多細胞分化型か未分化型の生物体とする。本発明の細胞は、その中に存在する野生型細胞には異質のＣ14:0アシル‐ＡＣＰ基質の加水分解活性のあるタンパク質を有すること、例えばその中に植物チオエステラーゼをコードする組換え核酸構築物を有することなどによって見分けられる。また、宿主細胞により、ウイルス、プラスミドまたは染色体の遺伝子等由来の領域を含む調節領域は異なる。原核微生物または真核微生物、特に単細胞宿主内での発現に対して、多種多様な構成プロモーターまたは調節可能プロモーターが使用できる。記載された転写開始領域のなかには、β‐ガラクトシダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファンＥ等の遺伝子を含む、大腸菌、枯草菌、サッカロミセス・セルビシエなどの細菌と酵母の宿主由来の領域がある。植物宿主細胞中での発現が望まれる場合、構築物にはたいていは植物中で機能する調節領域（プロモーターおよび集結領域）が含まれる。Ｃ14:0‐ＡＣＰ基質の加水分解活性を有するタンパク質をコードするオープンリーディングフレームをその５’末端で植物チオエステラーゼ構造遺伝子の５’上流に天然に見られる野生型配列などの転写開始調節領域と接合させる。植物に使用されるその他の非常に多くの転写開始領域が利用でき、多種多様の構造性の、あるいは調節可能な、例えば誘発可能な構造遺伝子機能の転写に対応する。植物に使用される転写開始領域のなかには、CaMV35S、ノパリン、マンノパイン・シンターゼなどの構造遺伝子やナピン、ＡＣＰプロモーター等を伴った領域がある。このような構造遺伝子に対応する転写／翻訳開始領域は、それぞれの開始コドンの５’すぐ上流に見られる。関心のある植物宿主本来のプロモーターや修飾したプロモーター、すなわち関心のある植物チオエステラーゼをコードする配列を含み、一つの遺伝子材料由来の転写開始領域と異なった遺伝子材料由来の転写開始領域を有するプロモーターや、二重35S CaMVプロモーターなど、特定のプロモーターを望む場合、標準の技術を使用して配列を接合する。植物体内でＣ 14:0‐ＡＣＰチオエステラーゼの発現を望むほとんどの適用で種子特異的なプロモーターの使用が好ましい。ある適用には、Ｃ14:0‐ＡＣＰチオエステラーゼの発現とともに他のタンパク質の発現が望まれる。例えば、以下の実施例でさらに詳細に説明するが、Ｃ14:0 ‐ＡＣＰチオエステラーゼが発現すると40モル％に達するＣ14濃度が得られ、トリグリセリドのｓｎ‐１、２、３部位の分析によってＣ14のｓｎ‐２への取込が限られていることが示される。中鎖を好むリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（ＬＰＡＡＴ）がＣ14:0‐ＡＣＰチオエステラーゼと共に発現するとＣ14のｓｎ‐２への取込が増大する。植物中鎖を好むＬＰＡＡＴは国際特許出願第PCT/95/03997号（第WO 95/27791号公報）に記載され、その開示全体を本明細書に組み込む。本発明のタンパク質の発現が植物細胞内で望まれる場合、関心のある種々の植物には菜種〔低リノール酸系統と高エルカ酸変種を含むカノーラ（Canola）変種〕、ヒマワリ、ベニバナ、ワタ、クフェア、ダイズ、ラッカセイ、ココヤシおよびアブラヤシ、トウモロコシが含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞に組換え構築物を導入する方法によっては、その他のＤＮＡ配列が必要となる可能性がある。本発明が双子葉植物種にも単子葉植物種にも同様に適用でき、新規の、あるいは改良された形質転換・調節技術に容易に適用できることが重要である。少なくともこの転写方法は本発明にとって決定的ではなく、現在、植物形質転換の種々の方法が利用できる。もっと新しい方法が作物に利用できれば、それを直接本明細書の下記で適用できる。例えばアグロバクテリウム属感染に対して天然に感受性がある多くの植物種は、アグロバクテリウム属を媒体とする転写の三分節系ベクター法またはバイナリーベクター法を介して形質転換できる。加えてマイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子ボンバード、エレクトロポレーションの諸技術が開発され、それによって種々の単子葉、双子葉植物種の形質転換が可能となっている。本発明の形質転換宿主細胞内部で産生されるＣ14脂肪酸は、種々の工業的応用において有用であり、例えば洗剤工業で格別の用途を見い出すであろう。様々な量のＣ14およびＣ16脂肪酸を主にｓｎ‐１およびｓｎ‐３位に含む油はショートニングなどの食品用途に使用される。以下の例は限定的なものではなく、例示的なものとして提供する。例例１．アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ配列Ａ．クフェア・ホオケリアーナ WO 92/20236 に記載の植物チオエステラーゼ保存領域由来のペプチド・フラグメントから設計された縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによってクフェア・チオエステラーゼのペプチド領域に対応するＤＮＡ配列が得られる。正プライマーであるＴＥＣＵ９は、カリフォルニア・ゲッケイジュおよびクスノキのチオエステラーゼ・タンパク質のアミノ酸 176〜181 に対する可能なすべてのコード配列に対応するヌクレオチドを17個含む。逆プライマーであるＴＥＣＵ３Ａは、カリフォルニア・ゲッケイジュおよびクスノキのチオエステラーゼ・タンパク質のアミノ酸 283〜288 に対する可能なすべてのコード配列に対応するヌクレオチドを18個含む。加えて、正プライマーと逆プライマーはそれぞれＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩ制限部位を５’ 末端に含み、逆プライマーはイノシン・ヌクレオチドを３’末端に含む。ベニバナ、カリフォルニア・ゲッケイジュ、クスノキの配列は正プライマー領域内の２ヶ所のアミノ酸部位と、逆プライマー領域内の１個のアミノ酸残基に分かれている。オリゴヌクレオチドの縮重はベニバナ、カリフォルニア・ゲッケイジュ、クスノキの配列をコードできるほどである。テンプレートとして逆転写クフェア・ホオケリアーナＲＮＡを、またオリゴヌクレオチド・プライマー各１μＭを用いてポリメラーゼ連鎖反応試料(100μｌ) を調製する。アガロース・ゲル電気泳動法によってＰＣＲ反応生成物を分析し、チオエステラーゼ・ペプチド配列から予測したサイズの、およそ 300bpのＤＮＡフラグメントが観察される。Ｃ９３Ａ（クフェア）と呼ばれるこのＤＮＡフラグメントを単離し、ＰＣＲ挿入ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限消化部位を用いて慣用のプラスミド・ベクター中にクローン化する。代表的なクローンのＤＮＡ配列が得られる。これらの配列を分析すると、別の最低２個の相同クフェア・ホオケリアーナｃＤＮＡが増幅されたことが示される。ｃＤＮＡライブラリー構築のためのクフェアＲＮＡ全体がWebbとKnapp(「Plan t Mol．Biol．Reporter」(1990))のＤＮＡ単離法を変更することによって成長中のクフェア・ホオケリアーナ胚から単離できる。緩衝液には以下のものが含まれる。ＲＥＣ：50mMトリス塩酸 pH9、0.7M ＮａＣｌ、10mM ＥＤＴＡ pH8、0.5％ＣＴＡＢ。ＲＥＣ+ ：使用直前にＢ‐メルカプトエタノールを加えて１％とする。ＲＥＣＰ：50mMトリス塩酸 pH9、10mMＥＤＴＡ pH8、0.5％ＣＴＡＢ。ＲＥＣＰ+ ：使用直前にＢ‐メルカプトエタノールを加えて１％とする。組織１gを抽出するため、液体窒素中で破砕した組織にＲＥＣ+ 10mLとＰＶＰＰ 0.5gを加えてホモジナイズする。ホモジナイズした材料を 1200rpmで10分間遠心分離する。上清をミラクロス(miracloth)を通して冷クロロホルム 3mLに注ぎ入れ、再びホモジナイズする。12,000RPMで10分間遠心分離後、上相を取り、その体積を量る。等量のＲＥＣＰ+ を加え、混合物を室温で20分間静置する。この材料を 10,000rpmで20分間２回遠心分離し、各回転後に上清を捨てる。ペレットを 1M ＮａＣｌ（ＤＥＰＣ）0.4mLに溶解し、等量のフェノール／クロロホルムで抽出する。エタノール沈殿後、ペレットをＤＥＰＣ水 1mLに溶解する。Mani atisら（「Molecular Cloning:実験室マニュアル」（1982）ニューヨーク、Cold Spring Harbor社）により、この総ＲＮＡからポリ（Ａ）ＲＮＡを単離できる。市販のプラスミドまたはファージ・ベクター中にｃＤＮＡライブラリーを構築できる。上記のようにＰＣＲによって得られたチオエステラーゼをコードするフラグメントを標識し、クフェアｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてチオエステラーゼｃＤＮＡを単離するのに使用する。クフェアｃＤＮＡクローンＴＡＡ３４２の予備ＤＮＡ配列を第Ｘ図に示す。推定された成熟Ｎ末端（カリフォルニア・ゲッケイジュのチオエステラーゼとの相同性に基づいて）から翻訳されたクフェア・クローンのアミノ酸配列が示されている。この配列は予備的であり、単一のオープンリーディングフレームをクローンの５’領域に現さない。成熟タンパク質の配列を表すと思われるオープンリーディングフレームは対応するＤＮＡ配列の下に示される。カリフォルニア・ゲッケイジュのチオエステラーゼタンパク質に対する相同性に基づいてＮ末端アミノ酸を選択した。Ｕｎｉ‐ＺＡＰ（ストラタジーン社）ファージ・ライブラリー・クローニング・システムを用いて調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、他のクフェア・ホオケリアーナｃＤＮＡが得られた。このライブラリーを放射標識ＴＡＡ３４２ＤＮＡを用いてスクリーニングした。このライブラリーについて30％ホルミアミドを用いて42℃でハイブリダイゼーションを行い、低厳密性（室温で１×ＳＳＣ、0.1 ％ＳＤＳ使用）で洗浄を行った。非常に多数のチオエステラーゼ・クローンを同定し、ＤＮＡ配列を決定した。３クラスのクフェアｃＤＮＡクローン３を同定した。上で論じた元のＴＡＡ３４２クローンは、その他の植物中鎖を好むアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼと相同の広範な領域を有するＣＵＰＨ‐１型クローンの代表である。ＣＵＰＨ‐１型クローンであるＣＭＴ９の核酸配列は WO 94/10288の第６図に示されている。成熟タンパク質はアミノ酸位置88のロイシンまたはその近傍、あるいはアミノ酸位置 112のロイシンで開始すると思われる。種々のクフェア・ホオケリアーナから単離したＲＮＡのノーザン分析によると、ＣＵＰＨ‐１遺伝子は調べたクフェア・ホオケリアーナ植物組織のすべてにおいて低濃度で発現することが示される。クフェア・チオエステラーゼｃＤＮＡの二番目のクラスはＣＵＰＨ‐２と同定される。これらのｃＤＮＡは他の植物中鎖アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼとも広範な相同性を示す。代表的なクローンであるＣＭＴ７の大腸菌中での発現から、ＣＵＰＨ‐２クローンがＣ８およびＣ10アシル‐ＡＣＰ基質に対して優先的な活性を有する中鎖を好むアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ・タンパク質をコードすることが立証された。ＣＭＴ７のＤＮＡ配列と翻訳されたアミノ酸配列は WO 94/10288の第７図に示されている。他のクフェア・ホオケリアーナのクローンであるＣＭＴ１３の５’末端からの予備ＤＮＡ配列を本明細書の第６図に示す。ＣＭＴ１３はＣＭＴ７と広範な配列同一性を示すが、ＤＮＡ配列を一直線にすると数個のギャップがあることが明らかにされ、合わせると合計およそ48個のヌクレオチドとなり、ＣＭＴ１３クローンにはＣＭＴ７クローンに存在する配列が欠落している。ＣＭＴ１３はＣＵＰＨ ‐４クローンとも呼ばれる。種々のクフェア・ホオケリアーナ植物組織から単離したＲＮＡのノーザン分析によると、ＣＵＰＨ‐２遺伝子とＣＵＰＨ‐４遺伝子が成長中の種子組織で高濃度で発現していることが示される。葉など、その他のクフェア・ホオケリアーナ組織中でのＣＵＰＨ‐２クローンとＣＵＰＨ‐４クローンの発現は検出されなかった。他のクローンであるＣＭＴ１０のＤＮＡ配列は WO 94/10288の第９図に示されている。他のＣＵＰＨ‐１型クローン由来のフラグメントで言及すると、ＣＭＴ１０はＣＭＴ９と90％を超えるがおよそ99％より低い配列同一性を有する。ＣＭＴ１０はＣＵＰＨ‐５型クローンとも呼ばれる。Ｂ．クフェア・パルストリスクフェア・ホオケリアーナについて先に記載したのと同様にクフェア・パルストリスの成長中の種子から総ＲＮＡを単離する。およそ６×10⁶ pfu を含むラムダZipLox（ＢＲＬ社、メリーランド州ゲーサーズバーグ）ｃＤＮＡライブラリーを総ＲＮＡから構築する。クフェア・ホオケリアーナ由来のチオエステラーゼをコードする領域ＣＵＰＨ‐１（ＣＭＴ‐９）、ＣＵＰＨ‐２（ＣＭＴ‐７）およびＣＵＰＨ‐５（ＣＭＴ‐１０）を含む混合プローブを使用して、未増幅ライブラリーからのおよそ 500,000個のプラークをスクリーニングした。（これらのクローンのＤＮＡ配列は WO 94/10288中に提供されている。）。低厳密性ハイブリダイゼーション条件を使用する。すなわち、ホルムアミド30％と２×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝0.15ＭＮａＣｌ、0.015Ｍクエン酸ナトリウム）の溶液中で室温でハイブリダイゼーションを行う。82個の推定陽性のクローンを同定し、そのうち30個をプラーク精製した。ＭＣＴ３４と呼ばれるクローンの核酸配列と翻訳したアミノ酸配列を第１図に示す。このクローンの翻訳したアミノ酸配列はクフェア・ホオケリアーナＣＵＰＨ‐４クローン（WO 94/10288 第８図のＭＴ‐１３）とおよそ80％同一である。Ｃ．ニクズク（ミリスチカ・フラグランス）クフェア種について先に記載したのと同様に、ニクズクの成長中の種子から総ＲＮＡを単離する。およそ６×10⁶ pfuを含むラムダ Zap（ストラタジーン社、カリフォルニア州ラ・ジョラ）ｃＤＮＡライブラリーを総ＲＮＡから構築する。カリフォルニア・ゲッケイジュのチオエステラーゼのＣ12を好むアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼをコードする配列(WO 94/10288の第１図)のおよそ 900bpを含むｐＣＧＮ３８２２のＢａｍＩ／ＰｓｔＩフラグメントを放射標識し、以下のハイブリダイゼーション条件下でニクズクｃＤＮＡライブラリーのプローブとして使用する：50％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、５％硫酸デキストラン中で30℃で終夜ハイブリダイゼーション。ハイブリダイゼーションを行ったフィルターを30℃ で 0.1％ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で洗浄し、オートラジオグラフを行う。推定陽性のクローン５個が同定され、そのうち３個に第３図に示した配列が含まれ、これをＭＹＲＦ‐２またはＭｆＦａｔＢ１の記号で表し、そのうち１個に第２図に示した配列が含まれ、これをＭＹＲＦ‐１またはＭｆＦａｔＢ２の記号で表す。その他の推定陽性のクローンの配列によると、アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼをコードしていないことが示された。ＭＹＲＦ‐１クローンとＭＹＲＦ‐２クローンの配列解析によると、ＭＹＲＦ ‐１は実質上ＭＹＲＦ‐２の切断型であり、ＭＹＲＦ‐１の最初のプロリン残基がＭＹＲＦ‐２配列の97番目のアミノ酸に対応することが示される。これらのクローンのもう一つの主な相違はチオエステラーゼをコードする領域の３’末端に見られる。ＭＹＲＦ‐１クローンにはＭＹＲＦ‐２配列の1624〜1626番目のヌクレオチドにあるＴＡＧ停止コドンが欠損し、従って翻訳されたＭＹＲＦ‐１のアミノ酸配列は、次に利用できる枠内停止コドンに達するまでＭＹＲＦ‐２の３’ 非翻訳領域内に伸びる（ＭＹＲＦ‐１の1087〜1089番目のヌクレオチドのＴＧＡ）。Ｄ．クスノキ〔シナモマム・カンフォーラ(Cinnamomum camphora)〕ＰＣＲによって生成するクラスＩＩクスノキ・チオエステラーゼをコードする領域のＤＮＡ配列と翻訳されたアミノ酸配列は WO 92/20236の第５Ｂ図に示されている。クスノキのクローンの成熟タンパク質領域を含むＤＮＡフラグメントはＰＣＲによって成長中のクスノキの胚由来のＲＮＡを用いて調製した逆転写ｃＤＮＡから得られる。ＣLONEＡMP（商標）システム(GIBCO BRL社、メリーランド州ゲーサーズバーグ)を用いてクローン化に有用な配列を含む正（センス）ＰＣＲプライマーおよび逆（アンチセンス）である #4164および #4165を調製する。オリゴヌクレオチド4164にはWO 92/20236第５Ｂ図の配列の 119〜138 番目のヌクレオチドをコードするクスノキ・チオエステラーゼに対応する20個のヌクレオチド領域が含まれる。オリゴヌクレオチド4165には、WO 92/20236 第５Ｂ図の1391 〜1410番目のヌクレオチドで表されるクスノキ・チオエステラーゼ３’非翻訳配列と相補的な20個のヌクレオチド領域が含まれる。4164と4165の配列は以下のとおりである：ＰＣＲによって4164と4165について得られるクスノキＰＣＲフラグメントのＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列を第４図に示す。配列はクスノキ・チオエステラーゼの成熟タンパク質をコードする領域の開始部分にあるXbaI部分で開始する。例２ −大腸菌中のＣ14:0アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼの発現Ａ．クフェア・パルストリスクフェア・パルストリスのアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼをコードする配列を発現するための大腸菌中の構築物を調製する。ｃＤＮＡクローンＭＣＴ３４をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のテンプレートとして用いてＳｔｕＩ部位５ ’を第１図に示す配列の 108番目のアミノ酸にあると推定される成熟タンパク質開始部分に挿入する。ＰＣＲ用の正プライマーであるＭＣＴ３４Ｆ１には第１図に示すクフェア・パルストリスの配列の437〜454番目のヌクレオチドに対応するＤＮＡ配列並びにＳｐｈＩおよびＳｔｕＩ制限消化部位を挿入するための配列が含まれる。「Ｍ１３正」と呼ばれるＭ１３配列プライマーは逆反応、すなわちアンチセンス反応を開始させるために使用する。ＰＣＲプライマーの配列は以下のとおりである：その結果得られるＰＣＲ生成物をＳｔｕＩ／ＸｂａＩフラグメントとしてｐＵＣ１１８中にクローン化し、その結果、クローンＭＣＴ３４ＬＺが得られ、これによって大腸菌中でクフェア・パルストリス・チオエステラーゼがｌａｃＺ融合タンパク質として発現される。クフェア・パルストリス・チオエステラーゼを発現するための他の構築物として、キアゲン（チャッツワース社、カリフォルニア）ｐＱＥベクターを用いて大腸菌中のｃＤＮＡクローンＭＣＴ３４を調製するが、これはヒスチジン・タグを通して高濃度の発現とタンパク質精製能を提供する。上記のＭＣＴ３４Ｆ１正プライマーおよびＭ１３正プライマーを用いてＰＣＡから得られるＤＮＡ生成物をＳｐｈＩおよびＳｎａＢＩで消化し、ＳｐｈＩおよびＳｍａＩで消化したｐＱＥ３０（キアゲン）中でクローン化してＭＣＴ３４ＨＴが得られる。脂質組成を分析するため、ＭＣＴ３４ＬＺを大腸菌ｆａｄＤおよび中鎖特異性アシル‐ＣｏＡシンターゼ欠損大腸菌変異腫（Overath ら、「Eur．J．Biochem 」（1969）7:559-574）中で形質転換する。チオエステラーゼ構築物を含む細胞と、対照細胞の同様の培養を30℃でＯＤ₆₀₀が約 0.5となるまで培養する。チオエステラーゼ発現の誘発は、ＩＰＴＧを 0.2〜0.4 ｍＭとなるように加えた後、さらに30〜120 分間培養することによって達成できる。増殖が遅い培養に対しては、ＩＰＴＧ添加後に比較的長い培養期間が要求される。大腸菌細胞の試料 4.5 ｍＬをテフロン・コーティング・キャップのついた15ｍＬのガラスバイアルに移す。１：１クロロホルム／メタノール中のＣ11:0遊離脂肪酸、Ｃ15:0遊離脂肪酸およびＣ17:0ＴＡＧ各１ｍｇ／ｍｌを含む１ｍｇ／ｍｌの標準溶液 100μｌを試料に加えた後、氷酢酸 200μｌおよび１：１クロロホルム／メタノール10ｍｌを添加する。この試料をボルテックス・ミキサーで撹拌して完全に混合し、完全に相分離するため 1000rpmで５分間遠心分離した。下相（クロロホルム）を注意深く取り除き、ロータリー・エバポレータ(Rotovap)で使用するのに適した清浄なフラスコに移す。この試料がほぼ乾燥するまで溶媒を留去する。溶媒が除去された後、中鎖脂肪酸が優先的に蒸発するらしいので、バイアルを室温に保つのに丁度よい量の熱を用い、クロロホルムを完全には除去しないことが重要である。残液を測定し、テフロンキャップの付いた２ｍｌのガラスバイアルに移す。ロータリー・エバポレータで使用したバイアルをクロロホルム／メタノールで洗浄し、クロロホルム／メタノール試料を残液と合わせる（全体積 600μｌ）。総脂肪酸を分析するため、試料のアリコート 100μｌに５％硫酸メタノール溶液１ｍｌを加え、この試料を５ｍｌバイアルに移し、その試料を90℃の水浴中で２時間インキュベートすることによってメタノール溶媒分解する。試料を放冷した後、0.9％ＮａＣｌ１ｍｌとヘキサン 300μｌを加える。試料をボルテックス・ミキサーで撹拌して完全に混合し、1000rpmで５分間遠心分離する。上層（ヘキサン）を注意深く取り除き、ガラス製のコーン・インサートの付いたプラスチック製のオートサンプラー用バイアルの中に入れた後、クリンプシールでバイアルに蓋をする。遊離脂肪酸を分析するため、上記のメタノール溶媒分解に先立ち、リン脂質から遊離脂肪酸を分離するため以下の薄層クロマトグラフィー（Choと Cronan（19 94）「J．Bacteriol．」1793-1795）を適用する。ロータリー・エバポレータ残渣のアリコート 100μｌと上記の洗浄液をシリカ‐Ｇ薄層板の２展開路（50μｌ／展開路）に塗布する。薄層板を石油エーテル／エーテル／酢酸(70／30／２、V /V)でおよそ15〜20分間展開する。リン脂質は原線に残り、中性脂肪は溶媒先端付近まで移動する。脂質はヨウ素でほんの短い間染色され、印を付け、印を付けた範囲のシリカをテフロンキャップの付いた２ｍｌの試験管に移す。２本のレーンの範囲を合わせ、試料を上記のようにメタノール溶媒分解する。炭素数10以下の成分の分離を良くするため昇温プログラムを用いてガス液クロマトグラフィー（ＧＣ）で試料を分析する。使用する昇温プログラムは、140℃ で３分間停止後、５℃／分で 230℃まで昇温し、230℃を11分間維持する。試料はヒューレット・パッカード5890（カリフォルニア、パロアルト）ガスクロマトグラフで分析する。脂肪酸分の計算は内部標準に基づいて行う。結果を下の表１に示す。上の結果より、クフェア・パルストリスＭＣＴ３４ＬＺクローンで形質転換した細胞中で14:0および14:1脂肪酸の産生がかなり増大していることが立証される。Ｂ．クフェア・ホオケリアーナＣＵＰＨ‐４大腸菌中でクフェア・ホオケリアーナＣＵＰＨ‐４チオエステラーゼをｌａｃＺとして発現するための構築物もクフェア・パルストリス構築物のために上に記載したものなどのＰＣＲおよびクローニング技術を用いて調製される。Ｃ．ニクズク大腸菌中で二種類のニクズク（ミリスチカ・フラグランス）クラスＩＩ型チオエステラーゼ、ＭＹＲＦ‐１（ＭｆＦａｔＢ２）およびＭＹＲＦ‐２（ＭｆＦａｔＢ１）をｌａｃＺ融合タンパク質として発現するための構築物を調製する。ＭｆＦａｔＢ１およびＭｆＦａｔＢ２をＳａｌＩおよびＸｈｏＩで消化してＭｆＦａｔＢ１配列の131 番目のアミノ酸（第３図）もしくはＭｆＦａｔＢ２配列の35 番目のアミノ酸（第２図）からチオエステラーゼをコードする配列を含むクローン・フラグメントをｃＤＮＡクローンの３’末端を通して切り取る。切り取ったチオエステラーゼをコードするフラグメントをＳａｌＩ消化ｐＵＣ８中に挿入し、その結果ｐＣＧＮ３８５６（ＭｆＦａｔＢ１）およびｐＣＧＮ３８５５（ＭｆＦａｔＢ２）が生成する。これらの構築物はほぼ熟成したチオエステラーゼ・タンパク質の配列のｌａｃＺ融合をコードする（カリフォルニア・ゲッケイジュのチオエステラーゼ・タンパク質との相同性によってＭｆＦａｔＢ１タンパク質の 130 番目のアミノ酸を成熟タンパク質Ｎ末端として選択した）。この融合タンパク質を大腸菌Ｋ１２のｆａｄ⁺およびｆａｄＤ株中で発現させる。総30℃で終夜培養後のＭＹＲＦ‐１およびＭＹＲＦ‐２形質転換Ｋ２７（ｆａｄＤ）の液体培養中の脂肪酸の分析を下の表２に提供する。Ｄ．クスノキ上記のクスノキのＰＣＲフラグメントをｐＡＭＰベクター中でクローン化して得たクスノキ・チオエステラーゼ・フラグメントをＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化したｐＢＣＳＫ+ （ストラタジーン社）中でクローン化し、ｐＣＧＮ５２２０を得る。上記のように脂質組成を分析するため、ｐＣＧＮ５２２０を用いて大腸菌ｆａｄＤを形質転換する。この分析結果を下の表２に提供する。対照と比較すると、14:0脂肪酸および16:1脂肪酸はニクズク、クスノキ、クフェア・ホオケリアーナの各クローンに対して劇的に上昇している。12:0および14 :1での増大もニクズク、クスノキのクローンで観察され、また16:0および18:1での増大もクフェア・ホオケリアーナＣＵＰＨ‐４クローンについて見られる。Ｅ．チオエステラーゼ活性の測定チオエステラーゼ活性を測定するため、アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ構築物を含む大腸菌の細胞と、対照細胞の同様の培養を30℃でＯＤ₆₀₀が約 0.5となるまで培養する。ｌａｃＺ融合構築物中でのチオエステラーゼ発現の誘発は、ＩＰＴＧを 0.4ｍＭとなるように加えた後、さらに１〜２時間培養することによって達成できる。成長が遅い培養に対しては、ＩＰＴＧ添加後に比較的長い培養期間が要求される。各培養の10ｍｌのアリコート（細胞＋培養液を含む）の種々の炭素鎖長アシル ‐ＡＣＰ基質を以下のように測定する。細胞を遠心分離によって収集し、0.5ｍｌの測定緩衝液で再懸濁し、超音波処理によって溶菌する。細胞細片は、さらに遠心分離を行うことによって除去できる。次いでこの上清を Pollardら、「Arch ．Biochem & Biophys.」（1991）281:306-312によるチオエステラーゼ活性測定に使用する。8:0、10:0、12:0、14:0、16:0、18:0および18:1アシル‐ＡＣＰ基質を用いたクフェア、ニクズクおよびクスノキのチオエステラーゼ・クローンについてのチオエステラーゼ活性の測定結果を下の表３に提供する。結果は対照細胞と比較したチオエステラーゼ発現細胞の比活性として提供する。 14:0および16:0に対して、対照細胞と比較した加水分解活性のかなりの上昇がクフェア・パルストリスＭＣＴ３４ＨＴ形質転換細胞で観察される。ニクズクＭＹＲＦ‐１クローンおよびＭＹＲＦ‐２クローンによって形質転換された細胞も 14:0および16:0に対する活性にかなりの上昇と、それほどではないが18:0と18:1 で上昇が示される。クスノキＣＩＮＣ‐１クローンの発現によって、主に14:0に対する活性が上昇し、16:0加水分解活性も上昇するが、それよりは小さい。例３ −植物形質転換用の構築物Ａ．ナピン発現カセットナピン発現カセットであるｐＣＧＮ１８０８は同時係属の米国特許出願第 07/ 742,834 号に記載され、その開示を参照により本明細書に組み込む。ｐＣＧＮ１８０８を変更してフランキング制限部位を含ませることにより、発現配列だけの運動を可能とし、バイナリーベクターの抗生物質耐性マーカーは可能としない。ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む合成オリゴヌクレオチドについてＨｉｎｄＩＩＩ部位が１ヶ所だけ回復するようにｐＣＧＮ１８０８の独特のＨｉｎｄＩＩＩ部分でアニーリングおよび連結反応を行う。その結果得られるプラスミドのｐＣＧＮ３２００には、配列解析によって確認されるように唯一のＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ制限部位がナピン３’‐調節配列の３’末端に含まれる。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩによる消化とＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化したｐＩＣ１９Ｒ（Marshら（1984）「Gene」32:481-485）連結反応ナピン発現カセットの大部分をｐＣＧＮ３２００からサブクローニングしてｐＣＧＮ３２１２を作成する。ナピン・プロモーター領域の極度な５’配列をｐＣＧＮ３２００をテンプレートとして使用し、またＳａｃＩ部分と、ナピン５’‐プロモーターおよびｐＣＧＮ３２００のｐＵＣバックボーンとの接合部をフランキングする２個のプライマーを使用してＰＣＲによってｐＣＧＮ１８０８構築物から再構築する。正プライマーにはＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、およびＫｐｎＩ制限部位並びにナピン５’‐配列（ＥｃｏＲＶ部分由来）の 408〜423 のヌクレオチドが含まれ、逆プライマーには５’‐プロモーター中の唯一のＳａｃＩ部分を含む 718から 739番目のナピン配列の相補体が含まれる。製造者の仕様書に従ってパーキンエルマー／シータス社のサーモサイクラーを用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲフラグメントをＨｉｎｃＩＩで消化したｐＵＣ８中で平滑断端フラグメントとしてサブクローニングしてｐＣＧＮ３２１７を作成する（Vieiraと Messing（1982）「Gene」19:259-268）。ナピン挿入物を横切るｐＣＧＮ３２１７の配列決定によると、ＰＣＲによって不適当なヌクレオチドが導入されなかったことが検証される。ＣｌａＩおよびＳａｃＩによる消化とＣｌａＩおよびＳａｃＩで消化したｐＣＧＮ３２１２との結合によって、ｐＣＧＮ３２１７中のナピン５‐配列をナピン発現カセットの残りと結合させる。その結果得られる発現カセットｐＣＧＮ３２２１をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ナピン発現配列をゲルで精製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＩＣ２０Ｈと結合させる（Marsn、前出）。最終の発現カセットはｐＣＧＮ３２２３であり、それにはアンピシリン耐性の背景にｐＣＧＮ１８０８で見られるのとほぼ等しい 1.725ナピン５’および 1.265の３’調節配列が含まれる。調節領域はＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩおよびＫｐｎＩ制限部位と側面を接し、唯一のＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、およびＸｈｏＩクローン化部位が５’および３’非クローン化領域の間に位置する。Ｂ．オレオシン発現カセットオレオシン遺伝子由来の５’および３’領域の調節下での転写用の配列のクローン化のためのカセットを調製する。ブラシカ・ナプスのオレオシン遺伝子の配列は LeeとHuang(「Plant Phys．」（1991）96:1395-1397)によって提供されている。出版された配列のプライマーはＰＣＲ反応中で使用され、ブラシカ・ナプス栽培変種ウェスター由来のオレオシン遺伝子の５’および３’調節領域が得られる。二種類のＰＣＲ反応が行われ、そのうち一つはオレオシン遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ上流にあるおよそ 950 のヌクレオチドを増幅するため、もう一つはオレオシン遺伝子のＴＡＡ停止コドンを含みその下流にあるおよそ 600bp をＰＣＲ増幅するためであった。このＰＣＲ生成物を製造者プロトコルに従ってプラスミド・ベクターｐＡＭＰ１（ＢＲＬ社）中でクローン化してオレオシン５ ’フランキング領域を含むプラスミドｐＣＧＮ７６２９と３’領域を含むｐＣＧＮ７６３０を生成した。これらのＰＣＲプライマーには５’および３’フランキング領域を共に発現カセット中でクローン化するのに便利な制限部位が含まれる。ｐＣＧＮ７６２９由来の５’フランキング領域を含むＰｓｔＩフラグメントをＰｓｔＩ消化ｐＣＧＮ７６３０中でクローン化してプラスミドｐＣＧＮ７６３４を生成した。オレオシン発現カセット全体を含むｐＣＧＮ７６３４由来のＢｓｓＨＩＩ（ニューイングランド・バイオラブズ社）フラグメントをＢｓｓＨＩＩ消化ｐＢＣＳＫ+（ストラタジーン社）中でクローン化してオレオシン・カセットをプラスミドｐＣＧＮ７６３６中に提供した。ｐＣＧＮ７６３６中のオレオシン・カセットの配列を第７図に提供する。このオレオシン・カセットはＢｓｓＨＩＩ、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩの各制限部位と両側を接し、ワックス・シンターゼ、レダクダーゼ、あるいは他の関心のあるＤＮＡ配列を５’および３’オレオシン領域の間に挿入するためのＳａｌＩ、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩの各部位を含む。Ｃ．クフェア・パルストリスアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ発現構築物植物種子中でナピンおよびオレオシン調節領域の調節制御下でクフェア・パルストリスのチオエステラーゼｃＤＮＡクローンＭＣＴ３４を発現するための構築物は以下のように調製する。ＳａｌＩ部位５’をＡＴＧ開始コドンに、またＮｓｉＩ部位をＭＣＴ３４翻訳停止コドンの３’近傍に挿入するのにオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅によってＭＣＴ３４由来のチオエステラーゼをコードする領域が得られる。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド・プライマーにはＳａｌＩ部位（ＣｐＭｅｔ‐１正プライマー）とＮｓｉＩ部位（ＣｐＳｔｏｐ‐１逆プライマー）が含まれていた。加えて、これらのプライマーにはＣLONEＡMP（商標）システムを用いてクローン化するための「ＣＡＵ」（正プライマー）と「ＣＵＡ」（逆プライマー）反復配列が含まれる。これらのＰＣＲプライマーの配列は以下のとおりである：その結果得られたＰＣＲ生成物をｐＡＭＰ中でクローン化し、ＤＮＡ配列を決定してＰＣＲ生成物を検証する。クフェア・パルストリスのチオエステラーゼｐＡＭＰクローン（ｐＣＧＮ３８６０）をＳａｌＩおよびＮｓｉＩで消化し、チオエステラーゼをコードするフラグメントを単離し、ＳａｌＩ／ＰｓｔＩで消化したｐＣＧＮ３２２３（ナピン発現カセット）またはｐＣＧＮ７６３６（オレオシン発現カセット）中でクローン化すると、それぞれｐＣＧＮ３８６１とｐＣＧＮ３８６２が得られる。クフェア・パルストリス発現構築物によって植物を形質転換するためのバイナリーベクターをＡｓｐ７１８でｐＣＧＮ３８６１およびｐＣＧＮ３８６２を消化し、得られるフラグメントをＡｓｐ７１８で消化したｐＣＧＮ１５７８（McBrid eら、（1990）「Plant Mol．Biol.」14:269-276）に挿入することによって調製すると、それぞれｐＣＧＮ３８６３とｐＣＧＮ３８６４が得られる。Ｄ．ニクズクのアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ発現構築物植物種子中でナピンおよびオレオシン調節領域の調節制御下でニクズク・チオエステラーゼｃＤＮＡクローンであるＭｆＦａｔＢ１（ｐＣＧＮ３８５６またはＭＹＲＦ‐２）を発現するための構築物は以下のように調製する。ＭｆＦａｔＢ１由来のチオエステラーゼをコードする領域は、ＢａｍＨＩ部位５’をＡＴＧ開始コドンに、またＸｈｏＩ部位３’をＭｆＦａｔＢ１翻訳停止コドンに挿入するのにオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅によって得られる。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド・プライマーにはＢａｍＨＩ部位（正プライマーまたはセンス・プライマー）とＸｈｏＩ部位（逆プライマーまたはアンチセンス・プライマー）が含まれていた。加えて、これらのプライマーにはＣLONEＡMP（商標）システムを用いてクローン化するための「ＣＡＵ」（正プライマー）と「ＣＵＡ」（逆プライマー）反復配列が含まれる。これらのＰＣＲプライマーの配列は以下のとおりである：その結果得られたＰＣＲ生成物をｐＡＭＰ中でクローン化し、ＤＮＡ配列を決定してＰＣＲ生成物を検証する。ニクズクのチオエステラーゼｐＡＭＰクローン（ＴＡ４３１）をＸｈｏＩで消化し、ＢａｍＨＩで部分消化する。チオエステラーゼをコードするフラグメントを単離し（1.3 kbバンド）、ＢｇｌＩＩ／Ｘｈｏで消化したｐＣＧＮ３２２３（ナピン発現カセット）中でクローン化すると、ｐＣＧＮ３８６８が得られる。ニクズク発現構築物によって植物を形質転換するためのバイナリーベクターをＡｓｐ７１８でｐＣＧＮ３８６８を消化し、得られるナピン５’／ニクズクＴＥ／ナピン３’フラグメント(4.2kb)をＡｓｐ７１８部位でｐＣＧＮ１５７８ＰＡＳＳに挿入することによって調製する。｛ｐＣＧＮＩ５７８ＰＡＳＳはｐＣＧＮ１５７８（McBrideら、前出）からｐＣＧＮ１５７８ポリリンカー領域を以下の制限部位を含むｐＣＧＮ１５７８ポリリンカー領域で置換することによって調製する。Ａｓｐ７１８、Ａｓｃ、Ｐａｃ、Ｓｗａ、ＳｓｅおよびＨｉｎｄＩＩＩ。｝その結果得られる構築物であるｐＣＧＮ３８５４はＣ14脂肪酸を産生するため植物の形質転換に使用する。オレオシン・プロモーターの調節制御下でニクズクのチオエステラーゼを発現するための構築物は以下のように調製する。ｐＣＧＮ３８６８（上記のナピン５ ’／ニクズクＴＥ／ナピン３’発現構築物）をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、その結果得られる、５’から３’に配向してナピン３’調節領域に接合した、ニクズクのチオエステラーゼをコードする領域を含むフラグメントをＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐＣＧＮ７６３６（上記のオレオシン・カセット）に挿入する。その結果得られる構築物のｐＣＧＮ３８５８をＡｓｐ７１８で消化し、ＢａｍＨＩで部分消化してオレオシン５’、ニクズク・チオエステラーゼをコードする領域、およびナピン３’調節領域の約 320のヌクレオチドを含む約2.6 kbのフラグメントを生成する。この 2 .6kbのフラグメントをＡｓｐ７１８／ＢａｍＨＩｄ消化したｐＣＧＮ１５７８中でクローン化して、植物の形質転換とニクズクのチオエステラーゼ発現のためのバイナリーベクターであるｐＣＧＮ３８５７が得られる。Ｅ．クスノキのアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ発現構築物ナピン・プロモーターの調節制御下でクスノキ・チオエステラーゼを発現する構築物を説明する。ｐＣＧＮ３８２６（WO 92/20236に記載のカリフォルニア・ゲッケイジュのＣ12を好むアシル‐ＡＣＰチオエステラーゼ・クローン）をＸｂａＩおよびＳａｌＩによって消化してプラスミド・ベクターのバックボーンとを有するＤＮＡフラグメントを生成することによってカリフォルニア・ゲッケイジュのチオエステラーゼをコードする輸送ペプチドが得られる。ｐＣＧＮ５２２０（実施例２Ｄ）をＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化して得られるカリフォルニア・ゲッケイジュ輸送：：クスノキ成熟コード化フラグメントをＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩで消化したｐＣＧＮ３２２３（ナピン発現カセット）に挿入すると、ｐＣＧＮ５２３２が生成する。ｐＣＧＮ５２３２をＮｏｔＩで消化し、また平滑末端を生じさせるためにクレノウで消化して生成するナピン５’／カリフォルニア・ゲッケイジュ輸送：：クスノキ成熟／ナピン３’フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩで消化しクレノウで平滑断端化したｐＣＧＮ１５７８に挿入する。その結果得られる構築物のｐＣＧＮ５２３３は、植物の形質転換とクスノキ・チオエステラーゼ発現のためのバイナリーベクターである。例４植物の形質転換Ａ．アブラナ属の形質転換アブラナ属は、Radkeら(「Plant Cell Reports」（1992）11:499-505、Theor ．Appl．Genet．（1988）75:685-694)によって報告されているように、あるいは下記で詳細に説明するように形質転換できる。ブラシカ・ナプスの種子を95％エタノールに２分間浸漬し、ツイーン20 １滴を含む 1.0％水酸化ナトリウム溶液中で45分間表面滅菌し、滅菌蒸留水中で３回すすぐ。次いで種子をピリドキシン（50μｇ／ｌ）、ニコチン酸（50μｇ／ｌ）、グリシン（200μｇ／ｌ）、0.6％フィトアガール（ギブコ）ｐＨ5.8 を加えた 1/10濃度のムラシゲ最小有機培地（ギブコ、ニューヨーク州グランドアイランド）を入れたマゼンタ・ボックスに入れる。種子を強度およそ65μアインシュタイン／平方メートル／秒（μＥｍ²Ｓ^-1）の低温蛍光および赤色光を光周期16時間とした22℃のパーシヴァル・チャンバ内で発芽させる。５〜７日を経た種子から胚軸を摘出し、長さおよそ 4mmに細切し、フィーダー・プレート上に敷く（Horschら、「Science」（1985） 227:1229-1231）。ＭＳ塩基（カリフォルニア・バイオロジカル、ノースカロライナ州バーリントン）約 30ｍｌ、100ｍｇ／１イノシトール、1.3ｍｇ／１塩酸チアミン、３％ショ糖、２，４‐Ｄ（1.0ｍｇ／ｌ）、0.6％ w/vフィトアガールを含むＫＨ₂ＰＯ₄ 200ｍｇを圧熱滅菌前にｐＨを 5.8に調整したもの（ＭＳ 0/1/0培地）を含むタバコ懸濁培養 1.0ｍｌをペトリ皿(100×25ｍｍ)に敷くことによって使用１日前にフィーダー・プレートを調製する。使用前にフィーダー層の頂上に無菌ろ紙ディスク（ワットマン 3ｍｍ）を置く。タバコ懸濁培養を２，４‐Ｄ(0.2ｍｇ／ｌ)、キネチン(0.1ｍｇ／ｌ)を入れたフィーダー・プレートについて記載されているように培養液10ｍｌを新鮮ＭＳ培地 100ｍｌに移すことによって毎週継代培養を行う。フィーダー細胞を使用しない実験では、胚軸外植片を切断し、ＭＳ 0/1/0培地頂上のろ紙上に置く。すべての胚軸外植片を強度30μＥＭ^-2Ｓ^-1ないし65μＥＭ²Ｓ^-1の連続光をあて、フィーダー・プレート上で22℃、24時間予備培養する。バイナリープラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ10 1 株の単一コロニーをＭＧ／Ｌブロス５ｍｌに移し、30℃で終夜培養する。胚軸外植片を１×10⁸個／ｍｌの細菌を入れたＭＧ／Ｌブロス7〜12ｍｌに浸漬し、10 〜25分後、フィーダー・プレート上に置く。ＭＧ／Ｌブロス１リットル中にはマンニトール５ｇ、Ｌ‐グルタミン酸１ｇまたはグルタミン酸ナトリウム 1.5ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄0.25ｇ、ＮａＣｌ 0.10ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.10ｇ、ビオチン１ｍｇ、トリプトン５ｇ、および酵母エキス２.5ｇが含まれ、このブロスをｐＨ 7.0 に調整する。アグロバクテリウムと48時間共存培養後、胚軸外植片をフィルターで滅菌したカルベニシリン(500ｍｇ／ｌ、圧熱滅菌後に添加)および硫酸カナマイシン（ベーリンガー・マンハイム、インディアナ州インディアナポリス）を各25ｍｇ／ｌ含むＢ５ 0/1/0カルス・インキュベーション培地に移す。 65μＥＭ^-2Ｓ^-1の連続光で３〜７日間培養後、カルス組織が切断面上に見えるようになると、胚軸外植片を苗条誘発培地Ｂ５ＢＺ（３ｍｇ／１ベンジルアミノプリン、１ｍｇ／１セラチン、１％ショ糖、0.6％フィトアガールを加えｐＨを 5.8に調整したＢ５塩とビタミン）に移す。また、この培地にはカルベニシリン(500ｍｇ／ｌ)および硫酸カナマイシン（25ｍｇ／ｌ）も含まれる。胚軸外植片を２週間毎に新鮮苗条誘発培地に継代培養する。苗条は１から３ヶ月後に胚軸カルスから再生する。少なくとも高さ１ｃｍの緑色苗条をカルスから摘出し、Ｂ５塩およびビタミン、１％ショ糖、カルベニシリン(300ｍｇ／ｌ)、硫酸カナマイシン（50ｍｇ／ｌ）および 0.6％w/vフィトアガールを含む培地上に置く。２〜４週間後、緑色のままの苗条を基部から切断し、発根誘発培地（Ｂ５塩およびビタミン、１％ショ糖、２ｍｇ／１インドール酪酸、50ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシンおよび 0.6％w/vフィトアガール）を含むマゼンタ・ボックスに移す。緑色の発根した苗条をチオエステラーゼ活性について試験する。Ｂ．シロイスナズナの形質転換 Valverkensら(「Proc．Nat．Acad．Sci．」（1988）85:5536-5540)によって記載されたアグロバクテリウムを媒介とする形質転換によって形質転換シロイスナズナ植物が得られる。構築物をＥＨＡ101 株（Hoodら、「J．Bacteriol」（1986 ）168:1291-1301）などのアグロバクテリウムの細胞中でHolstersらの方法（「M ol．Gen．Genet.」（1978）163:181-187）によって形質転換する。Ｃ．ラッカセイの形質転換 1988年７月27日出願された欧州特許出願第 332 855号および同時出願中の USS N 07/225,332に記載されるように、関心のあるＤＮＡ配列を粒子ボンバードを介して少なくともプロモーター領域、関心のある遺伝子、および終結領域を備える発現カセットとして植物ゲノムに導入できる。簡単に述べると、大きさが 0.5〜３μｍの範囲のタングステン粒子または金粒子を発現カセットのＤＮＡで被覆する。このＤＮＡは水性混合物や乾燥ＤＮＡ／粒子沈殿物の形態とすることができる。ボンバードの標的に使用する組織は子葉外植片、根の成長点、未成熟の小葉、葯などから得られる。バイオリスティクス（商標）粒子銃（デュポン、デラウェア州ウィルミントン）を用いてＤＮＡ被覆粒子による組織のボンバードを行う。円筒開口部からの距離が１ｃｍから４ｃｍの範囲で可変の円筒部に粒子を入れる。ボンバードする組織を停止プレートの下に配置し、20ｃｍまでの距離でこの組織について試験を行う。発射の瞬間、組織はナイロン網、あるいはメッシュが10μｍから 300μｍの範囲のナイロン網の組合せによって保護される。ボンバード後、Atreyaら（「Plant Science Letters」（1984）4:379-383）の方法に従って植物を再生する。簡単に述べると、胚軸組織または子葉分節をＭＳ培地(Murashigeと Skoog、「Physio．Plant.」（1962）15:473)（子葉分節に対してはＭＳ＋2.0 ｍｇ／ｌの６‐ベンジルアデニン（ＢＡ））上に置き、暗中で 25±２℃、１週間インキュベートした後、連続低温白色蛍光(6.8Ｗ／ｍ²)に移す。培養10日目、小植物を無菌土壌を入れた植木鉢に移し、３〜５日間日陰に置き、最後に温室へ移動する。形質転換していると推定される苗条を根付かせる。外来性ＤＮＡの植物ゲノムへの組込みは、当業者に公知の種々の方法によって確認できる。例５ −形質転換植物の分析Ａ．ニクズク（ＭＹＲＦ‐２）発現構築物ナピン・プロモーターの調節制御下でニクズク・チオエステラーゼ・クローンＭＹＲＦ‐２を発現させるための構築物であるｐＣＧＮ３８５４を含む形質転換ブラシカ・ナプス植物（ＱＬ01由来の低リノレン酸変種）から成熟した種子を収穫し、モル％脂肪酸組成を決定するため分析を行った。結果を下の表４に示す。分析したすべての形質転換植物にＣ14脂肪族アシル基が存在し、Ｃ14の濃度は 13.5から 21.73モル％の範囲である。Ｃ16の濃度には、さらに大きい上昇が見られ、Ｃ16脂肪酸のＣ14脂肪酸に対する比はおよそ２：１までの範囲である。一般に、Ｃ16／Ｃ14比はＣ14含有量の増加につれて減少し、およそ１．３：１の低い比が観察される。これらの形質転換植物種子中のＣ14とＣ16の濃度のグラフを第１１図に示す。非形質転換の対照植物中のバックグラウンド濃度はおよそ 0.1モル％である。ＱＬ01の非形質転換種子中のＣ16濃度はおよそ４モル％である。形質転換体3854-3由来の個々の種子を切開して半種子脂質分析にかけた。この分析結果を下の表５に示す。 3854-3および 3854-11由来の他の単一種子の脂肪酸組成データ（モル％脂肪酸）を第８図に示す。これらのデータによると、ニクズク・チオエステラーゼによって23％に達するＣ14濃度と38％に達するＣ16濃度が得られることが示される。加えて、18:0脂肪酸濃度の比較的小さい上昇が観察され、濃度がＱＬ01の非形質転換種子中の１モル％から形質転換種子中の９モル％まで上昇している。形質転換種子中の総飽和脂肪酸濃度はおよそ55から60モル％の範囲である。Ｂ．クスノキ発現構築物ナピン・プロモーターの調節制御下でクスノキ・チオエステラーゼのクローンＣＩＮＣ‐１を発現するための構築物であるｐＣＧＮ５２３３を含む形質転換したブラシカ・ナプス植物から成熟した種子を収穫し、モル％脂肪酸組成を決定するため分析を行った。結果を下の表６に示す。一種類を除いて、分析したすべての形質転換植物中で、対照植物のバックグラウンド濃度より上昇したＣ14脂肪族アシル基の百分率が見られる。Ｃ14の濃度はおよそ 2.0モル％から11.5モル％の範囲である。形質転換体5233-5および5233-6から得た単一種子データを第９図に示す。これらのデータによると、クスノキＦａｔＢチオエステラーゼを発現する種子中に20 ％を超えるＣ14濃度が得られることが示される。Ｃ16:0濃度が非形質転換対照植物由来の種子中の６モル％から15モル％まで上昇している。程度は劣るが、12:0 脂肪族アシル基の上昇も見られる。比較的低いＣ14濃度では、Ｃ16濃度がＣ14濃度の２〜３倍に達する可能性がある。比較的高いＣ14濃度では、Ｃ16濃度はＣ14濃度以下である。これらの形質転換植物種子中のＣ14とＣ16の濃度のグラフを第１１図に示す。これらの種子中で40モル％に達する総飽和脂肪酸含量が検出される。Ｃ．クフェア・パルストリス発現構築物 3863‐形質転換体から得たプール種子によると、およそ37モル％に達するＣ14 濃度が現れる。形質転換体3863-10、3863-7、3863-4、3863-8、3863-2および386 3-5由来の他の個々の種子の脂肪酸組成の分析データを第１０図に示す。これらのデータによると、クフェア・パルストリスＦａｔＢ２チオエステラーゼ・クローンの発現によって40％を超えるＣ14濃度が得られることが示される。ほとんどの3863形質転換体種子中でＣ14濃度はＣ16濃度をおよそ２：１の比で上回る。しかし、Ｃ14濃度が低い場合（およそ１５％未満）、通常Ｃ16濃度はＣ14濃度よりも高い。ニクズク、クフェア・パルストリスおよびクスノキＴＥ形質転換植物種子中のＣ14とＣ16の濃度のグラフを第１１図に示す。Ｄ．オレオシン・プロモーター／Ｃ14チオエステラーゼ構築物クフェア・パルストリス（3864）もしくはニクズク（3857）Ｃ14チオエステラーゼを発現するブラシカ・ナプス形質転換植物由来のプール種子試料の分析（モル％脂肪酸）を第１２図に示す。ナピン・プロモーター構築物のように、ニクズク・チオエステラーゼが発現すると、およそ２：１のＣ14／Ｃ16脂肪酸の比率でＣ14脂肪酸およびＣ16脂肪酸の産生量が増える。クフェア・パルストリスＣ14チオエステラーゼが発現すると、ナピン／クフェア・パルストリスＣ14構築物で見られたように、通常Ｃ14はＣ16よりも多量に産生される。一般に、オレオシン・プロモーターの調節制御下でチオエステラーゼを発現させることによって得られるＣ14脂肪酸およびＣ16脂肪酸の濃度は、ナピン・プロモーターを用いて得られる濃度よりも低い。Ｅ．Ｃ14チオエステラーゼおよび中鎖ＬＰＡＡＴを発現する植物種子がおよそ20モル％の14:0と13モル％の16:0からなるナピン／クフェア・パルストリス形質転換体3863-6をココヤシの中鎖を好むＬＰＡＡＴ発現構築物であるｐＣＧＮ５５１１を含むブラシカ・ナプス形質転換体と交雑させる。(WO 95/2 7791参照。)その結果得られるＦ１植物由来の分離プール種子の脂肪族アシル組成分析から、平均濃度10モル％の14:0および７モル％の16:0が明らかにされる。 3863-6植物および5511×3863-6交雑の結果得られるＦ１植物由来のプール分離種子試料についてｓｎ‐２位置の脂肪族アシル組成を決定する。ｓｎ‐２を分析するため、成熟種子から蒸留した油をアシル移動を最小限に抑えるために Brockerhoffら（「Meth．Enzymol.」（1975）35:315-325）から変更したリパーゼ消化プロトコルに供する。これによると、ｓｎ‐２とｓｎ−１＋３結合位置のアシル組成が識別される。この変更を簡単に述べると次の通りである。すなわち、ｐＨを中性に下げ、反応時間を短縮し、その後試料を酸性のｐＨに保ち、消化生成物をホウ酸塩含浸薄層板上でクロマトグラフィーを行う。次いでクロマトグラフィーによる分離生成物を溶出し、前記のように脂肪酸のメチルエステルとして分析する。このように、中鎖のＣ12脂肪酸やＣ14脂肪酸あるいはＣ 22:1脂肪酸などの長鎖脂肪酸などのｓｎ‐２位置の脂肪酸の百分率を決定する。この変法は、立体化学で定義された構造のＴＡＧを用いて検証し、以下のように実施する。油と有機溶媒は負排除量ピペッターによっては正しく送出できないため、一般にリパーゼ法では、正排除量ピペッターだけを使用する。そのうえ、試料をあからさまに乾燥する場合は注意しなくてはならない。Ｃ10以下の長さのアシル基が存在する場合、完全に乾燥することは避ける。脂肪酸混入の一因となるプラスチック容器や調理用ガラス器具は避けるべきである。必要なら、ガラス器具をクロロホルム／メタノール２／１ (v/v)で予備リンスする。 15ｍｌのスクリュー・キャップ（テフロン・コーティング）付きバイアル中で、0.1Ｍトリス塩酸（ｐＨ７）２ｍｌ、2.2％ w/v ＣａＣｌ₂ 0.2ｍｌ、0.05％ w/v胆汁酸塩（シグマ） 0.5ｍｌ、油もしくはＴＡＧ試料10μｌ（個体の場合は 10μｇ）を化合させる。超音波槽中で短時間音波破砕して少なくとも油のいくらかを分散させる。数分後、懸濁液は濁った外観を呈する。リゾプス・アルヒザスのリパーゼ(シグマ、L4384)などの活性のあるリパーゼ懸濁液を用いてリパーゼを調製し、氷上（４℃）に保持する。（懸濁液は凍結すると失活する。）不飽和脂肪酸を含む油を用い、消化度をヨウ素染色によるシステム１ＴＬＣ（下記参照）によって視覚化して、全手順を通して様々な水希釈の懸濁液を試すことにより酵素バッチを検査する。希釈が正しければ、ＴＡＧのおよそ50％が消化される筈である。（それ以上の消化はＭＡＧ生成物への攻撃が増大する危険がある。）典型的な場合では、シグマ・リゾプス・アルヒザス・リパーゼ懸濁液を水で約 600,000単位／ｍｌに希釈すると、適切な濃度が得られる。各反応を個別に行う。100μｌの水希釈リパーゼを添加して反応を開始させ、バイアルに蓋をし、直ちにボルテックス・ミキサーによる連続混合を開始し、これを 1.5分間行う。層形成を避けるため、混合操作中に撹拌を数回断続する。1. 5分間の「インキュベーション」中に白色沈殿が形成される。沈殿には溶出した脂肪酸のカルシウム塩が含まれ、また沈殿は反応が進行していることを示す。 1.5分間の混合インキュベーションの終わりに、6ＭＨＣｌ 0.5ｍｌを加えて短時間混合することによって反応を停止させる。クロロホルム／メタノール２／１ v/v 2.6ｍｌを直ちに加え、十分に振盪し、その他のリパーゼ消化を行う間、氷中に入れる。このとき、白色沈殿がすでに完全に再溶解されていることに注意する。氷中からすべてのバイアルを取り出し、もう一度よく混合し、層をくっきりさせるため短時間回転させる。消化生成物は下層にある。パスツール・ピペットを用いて下層を新しい15ｍｌバイアルに取り出す。元の消化混合物を 1.6ｍｌの純粋なクロロホルムで再抽出し、よく混ぜ、回転をさせ、この下層を先に取り出した下層と合わせる。合わせた下油層を窒素気流中で丁度十分な熱をかけてほぼ乾燥させ、試料が冷えすぎるのを避ける。アシル移動用の薄層板は、ホウ酸を予備負荷し蛍光指示薬を含まない 500μｍ分取用Ｓｉｌ‐Ｇである。予備負荷は、５％ w/vホウ酸の１／１ v/vアセトニトリル／メタノール溶液を少なくとも90分間展開することによって行う。この薄層板を乾燥し、使用時まで室温で保存する。湿気の多い気候では、加熱「活性化」が必要となろう。二溶媒系が適しているが、溶媒の極度の揮発性のため、長時間展開すると分解能が低下するので、溶媒が薄層板の上端に達していなくても正確に１時間展開する。系１−ｎ‐ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸、７０／３０／１v/v 系２−ジエチルエーテル／酢酸、１００／１ v/v 系１はＴＡＧ、ＤＡＧ、脂肪酸、ＭＡＧを回収できるので、リパーゼの反応を評価、監視するのに使用する。系２は通常の用途に用い、ｓｎ‐２決定においてＭＡＧ生成物の純度が最高となる。薄層板に試料を負荷する前に、２試料を（左右に）塗布できるように鉛筆で中央に画線を入れる。（試料のクロマトグラフィーはホウ酸負荷と同じ方向に行う。）また、周辺効果を排除するため、両側から層を 0 .5ｃｍずつ取り除き、負荷の目印に下端から２ｃｍ上に線を引く。各乾燥試料をクロロホルム／メタノール２／１（v/v） 100μｌに再溶解し、薄層板半分の負荷線に沿って塗布する。その都度クロロホルム／メタノール２／１（v/v）100μ ｌで２回リンスし、試料の上に負荷する。負荷領域を風乾し、溶媒をセットする。薄層板をフード中で乾燥させる。生成物の分析に必要な最小限のアシル転位を確保するため、この操作をリパーゼ反応開始から中断しないで行う。ローダミン噴霧（約１％ w/vローダミン６Ｇアセトン溶液）により薄層板を発色させる。薄層板が全体的に中桃色になるまで噴霧し、数分間乾燥させ、紫外線下で目視する。脂質は橙色の背景上に黄色の蛍光を発する。望む帯の輪郭を鉛筆でなぞる。系２を使用する場合、ＭＡＧの帯は普通薄層板の50〜70％上の距離にあり、残りの生成物は上端にある。ＭＡＧ領域は何らかの鎖長分解能のために複数の帯状となるが、切り出すためには帯全体を一つの輪郭とすべきである。帯を清浄な紙の上に掻き取り、スクリューキャップ（テフロン・コーティング）付きの大型試験管に移す。クロロホルム／メタノール２／１（v/v） 10ｍｌを加えて振盪し、最低１時間静置する。ワットマンろ紙でろ過し、直接ロータリー・エバポレーター用のフラスコに入れる。試験管をその都度クロロホルム／メタノール２／１（v/v）５ｍｌで２回ずつすすぐ。（ローダミン染料は、残された場合、脂質と共に溶出し、最終の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）のヘキサン抽出まで全操作を通して脂質と共に移行する。）室温もしくは30℃までの温度でロータリー・エバポレーターで溶媒を留去して体積が約 100μｌとなるまで濃縮する。15ｍｌ容のスクリューキャップ付きバイアルに入れ、フラスコをクロロホルム／メタノール２／１（v/v）100μｌで２回すすいだ液を合わせ、Ｎ₂気流中でほぼ乾燥させる。ほぼ乾燥した試料に新たに調製した５％(w/v)硫酸のメタノール溶液２ｍｌを添加する。余り吸湿していない比較的新しいメタノールを使用すべきである。また、0.5ｍｇ／ｍｌＴＡＧ（例えばトリ‐17:0等）の所望の内部標準を含むトルエン１ｍｌも試料に加える。90℃で２時間インキュベートし、その間、最初の２分後にキャップを堅く締め、約15分後に再び締める。バイアルが冷却した後、0. 9％ w/v ＮａＣｌ２ｍｌおよびｎ‐ヘキサン 0.5ｍｌを加える。完全に混合し、数分間静置して層を分離させ、上層から試料を採取してＧＣバイアルに入れる。Browseら（「Anal．Biochem.」（1986）152:141-145）によって記載された脂肪酸のメチルエステル（ＦＡＭＥ）の分析法によって脂肪酸組成を決定する。ＭＡＧ帯の組成を原物質である油またはＴＡＧ試料のｓｎ‐２における組成とする。各アシル基の％に関する式（３ＴＡＧ‐ＭＡＧ）／２を用いて主な（ｓｎ ‐１およびｓｎ‐３）位置における平均組成を計算する。 3863-6から得られたＴ２種子のｓｎ‐２分析によると、14:0濃度はおよそ３モル％であることが分かる。ｓｎ‐２位置の16:0濃度は１モル％未満であった。55 11×3863-6植物由来のＦ１種子中のｓｎ‐２脂肪酸アシル基の分析によると、14 :0濃度はおよそ９モル％であることが示される。3863-6植物については、ｓｎ‐ ２位置の16:0濃度は１モル％未満であった。これらのデータから、植物Ｃ14チオエステラーゼの発現と同時に発生するココヤシ中鎖ＬＰＡＡＴの発現によってミリスチン酸エステルのｓｎ‐２位置への組込みが増大し、14:0の分布を効果的に無作為化する一方で、ｓｎ‐２位置の16:0は影響を受けないことが分かる。従って、形質転換植物種子油中のＣ14脂肪酸量を全体的に上昇させるためにはＬＰＡＡＴとＣ14チオエステラーゼの組合せが特に望ましい。上記の結果はチオエステラーゼ活性をコードするＤＮＡ配列を得る能力を示し、その配列は種子脂肪酸組成を操作するための植物種子細胞中で発現することができる。このように、かなりの濃度のＣ14脂肪酸Ｃ14の産生が得られる。こうして産生される新規の種子油は全油として工業的用途があり、あるいは業界で周知の方法を用いて精留し、その油に含まれるＣ14脂肪酸の原材料を提供することができる。本明細書で言及したすべての公刊文書および出願特許は、本発明が関係する当業者の技術水準を示す。すべての公刊文書および出願特許は、個々の公刊文書または出願特許が参照により具体的かつ個別に組み込まれることが示されるのと同様に、これを参照により本明細書に組み込む。上記の発明を明確に理解する目的で図面および実施例によってある程度詳細に述べたが、添付の請求の範囲内で、ある程度の変更および修正を実施できることは自明であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ｃ１２Ｒ 1:91 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ホーキンス，デボラーアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デイビス，グランドアベニュ 230

Claims

【特許請求の範囲】１．植物種子トリグリセリド中でＣ14脂肪酸を産生する方法において、ゲノム内部にＤＮＡ構築物を組込んだ植物を栽培させることを含み、前記構築物が５’から３’の転写方向に植物種子細胞内で機能するプロモーターと、他の中鎖アシル‐ＡＣＰ基質と比較してＣ14:0アシル‐ＡＣＰ基質に優先的な加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、植物細胞内で機能する転写終結領域とを含んで成る前記方法。２．前記植物が油種子作物である請求項１記載の方法。３．前記油種子作物がアブラナ属植物である請求項２記載の方法。４．前記タンパク質が植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼである請求項１記載の方法。５．植物チオエステラーゼをコードする前記配列がクフェア、ニクズクまたはクスノキ由来である請求項４記載の方法。６．前記植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼがＣ14アシル‐ＡＣＰ基質に優先的な加水分解活性を有する請求項４記載の方法。７．前記植物チオエステラーゼをコードする配列がクフェア・パルストリス由来である請求項６記載の方法。８．前記プロモーターが植物種子組織中で優先的に発現する遺伝子由来である請求項１記載の方法。９．前記植物種子トリグリセリドが少なくとも５モル％のＣ14脂肪族アシル基を含むものである請求項１記載の方法。１０．前記植物種子トリグリセリドが少なくとも20モル％のＣ14脂肪族アシル基を含むものである請求項１記載の方法。１１．前記植物種子トリグリセリドが少なくとも40モル％のＣ14脂肪族アシル基を含むものである請求項１記載の方法。１２．請前記植物種子トリグリセリドが増量したＣ16脂肪族アシル含量をさらに含むものである請求項１記載の方法。１３． 14:0脂肪族アシル基の濃度が16:0脂肪族アシル基の濃度よりも高いものである請求項１２記載の方法。１４． 14:0脂肪族アシル基の濃度が16:0脂肪族アシル基の濃度よりも低いものである請求項１２記載の方法。１５．総脂肪酸中に最低 5.0モル％のミリスチン酸エステルを含む植物種子において、前記ミリスチン酸エステルがトリグリセリド分子の少なくとも１部分に組込まれ、前記植物の野生型種子が脂肪酸中に 1.0モル％未満のラウリン酸エステルを含む植物種子。１６．脂肪酸中に最低約20モル％のミリスチン酸エステルを含む請求項１５記載の植物種子。１７．脂肪酸中に最低約40モル％のミリスチン酸エステルを含む請求項１５記載の植物種子。１８．植物種子油において、前記油のアシル基の最低 5.0モル％がミリスチン酸アシル基であり、前記油が請求項１５記載の種子由来である植物種子油。１９．総脂肪酸中に最低 5.0モル％のミリスチン酸エステルを含むアブラナ属の種子。２０．植物種子油において、前記油のアシル基の最低 5.0モル％がミリスチン酸アシル基であり、前記油が請求項１９記載のアブラナ属の種子由来である植物種子油。２１．他の中鎖アシル‐ＡＣＰ基質と比較してＣ14アシル‐ＡＣＰ基質に優先的な活性を有する植物アシル‐ＡＣＰチオエステラーゼをコードする配列を含むＤＮＡ構築物。２２．前記植物がクフェア種である請求項２１記載による構築物。２３．前記種がクフェア・パルストリスである請求項２２記載の構築物。２４．前記チオエステラーゼが第１図に示すアミノ酸配列を含むものである請求項２３記載の構築物。２５．前記植物がニクズクである請求項２２記載の構築物。２６．前記チオエステラーゼが第２図または第３図に示すアミノ酸配列を含むものである請求項２５記載の構築物。