JPH11326303A - 化合物ライブラリをスクリーニングする方法 - Google Patents

化合物ライブラリをスクリーニングする方法

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JPH11326303A JP10186693A JP18669398A JPH11326303A JP H11326303 A JPH11326303 A JP H11326303A JP 10186693 A JP10186693 A JP 10186693A JP 18669398 A JP18669398 A JP 18669398A JP H11326303 A JPH11326303 A JP H11326303A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 質量分析計と組み合わせた前端クロマトグラ
フィーを用いて、化合物のライブラリをスクリーニング
して、標的レセプターに結合するライブラリメンバーを
同定しそして分類する方法を提供すること。 【解決手段】化合物ライブラリをスクリーニングして、
複数の推定リガンドの、標的レセプターへの相対親和性
または絶対親和性を決定する方法であって、以下の工程
(a)、(b)、(c)および(d)を包含する、方法：(a) 複数の
推定リガンドを含有する化合物ライブラリを提供する工
程；(b) 該化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィ
ー条件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レ
セプターを含有するカラムに連続的に付与して、それに
より、該標的レセプターを、該化合物ライブラリに連続
的に接触させて、溶出液を提供する工程；(c) 該溶出液
を、質量分析計に連続的または断続的に付与して、該溶
出液中に存在する推定リガンド成分の質量スペクトルを
提供する工程；および(d) 該質量スペクトルを評価し
て、該推定リガンド各々の破過時間を決定する工程。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願は、代理人整理番号0265
79-172として1998年３月27に出願された米国暫定特許出
願第 ／ , 号（表題「Micro-Scale Frontal Affi
nity Chromatography Methods for the Screening of C
ompound Libraries」）の利益を主張し、この出願の内
容は本明細書中で参考として援用されている。
【０００２】本発明は、化合物ライブラリ(例えば、コ
ンビナトリアルケミストリー技術を用いて作成した化合
物ライブラリ)をスクリーニングする方法に関する。本
発明の方法は、質量分析計と組み合わせた前端クロマト
グラフィーを用いて、化合物のライブラリをスクリーニ
ングして、標的レセプターに結合するライブラリメンバ
ーを同定しそして分類する。本発明の方法はまた、化合
物ライブラリを迅速にスクリーニングして、このライブ
ラリの任意のメンバーが、あらかじめ選択されたインジ
ケーター化合物と比較して、この標的レセプターに対し
て高い親和性を有するかどうかを決定する。
【０００３】
【従来の技術】本願において、以下の刊行物、特許およ
び特許出願が上付き番号として引用される：1 K. S. Lam, Anti-Cancer Drug Des. 1997, 12, 145-
167；2 P. M. Sweetnam et al., In Burger's Medicinal Ch
emistry and Drug Discovery; M. E. Wolff, Ed.; John
Wiley & Sons: New York. 1995; pp 697-731；3 R. H. Griffey et al., In Proceedings of the 45t
h ASMS Conference onMass Spectrometry and Allied T
opics, Palm Springs, CA, June 1-5, 1997;p. 400；4 L. Fang et al., In Proceedings of the 45th ASMS
Conference on MassSpectrometry and Allied Topics,
Palm Springs, CA, June 1-5, 1997; p. 401；5 Y. -H. Chu et al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118,
7827-7835；6 Y. -Z. Zhao et al., J. Med. Chem. 1997, 40, 400
6-4012；7 Y. F. Hsieh et al., J. Mol. Div. 1996 2, 189-19
6；8 R. W. Nelson et al., Anal. Chem. 1995, 67, 115
3-1158；9 D. C. Schriemer and L. Li, Anal. Chem. 1996, 6
8, 3382-3387；10 PCT/US97/07964 (International Publication No.
WO 97/43641), published November 20, 1997, entitle
d "Molecular Diversity Screening Device and Metho
d"；11 R. Wieboldt et al., Anal. Chem. 1997, 69,
1683-1691；12 R. B. van Breemen et al., Anal. Chem. 1997, 6
9, 2159-2164；13 M. L. Nedved et al., Anal. Chem. 1996, 68, 422
8-4236；14 PCT/US95/03355 (International Publication No.
WO 95/25737), published September 28, 1995, entitl
ed "Method for Identifying Members of Combinatoria
l Libraries"；15 PCT/EP97/02215 (International Publication No.
WO 97/43301), published November 20, 1997, entitle
d "Identification of Members of Combinatorial Libr
aries By Mass Spectrometry"。
【０００４】上記刊行物、特許および特許出願の内容
は、個々の各刊行物、特許または特許出願の内容を本明
細書中で参考として援用するために具体的かつ個別的に
示すような同じ程度まで、本明細書中で参考として援用
される。
【０００５】近年、非常に多くのコンビナトリアルケミ
ストリー技術が開発され、これらの技術により、多様な
化合物（chemical compound）の膨大なライブラリを迅
速に合成することが可能となった1。コンビナトリアル
ケミストリーでは、一連の化学反応は、典型的には、各
工程において、複数の試薬を使用して行われ、化合物の
１ライブラリが作成される。このような手法は、生物学
的スクリーニング用の多様な化合物の多数の集合体（co
llection）を提供することにより、生物学的に有用な特
性を有する新規化合物の発見を著しく促進する可能性が
ある。
【０００６】コンビナトリアルケミストリー技術を用い
て化合物の多数の集合体を迅速に作成するこの能力は、
化合物ライブラリをスクリーニングする新規方法の必要
性を生み出した。各化合物をアッセイにて個々にスクリ
ーニングし、所望の生物学的活性を有する化合物を同定
するための伝統的なアプローチは、時間および財源上の
制約のために、もはや実用的ではない。それゆえ、化合
物ライブラリを迅速にスクリーニングし得る、新規な方
法が必要である。
【０００７】このことに関して、化合物ライブラリをス
クリーニングする種々の方法が報告されている。典型的
には、これらのスクリーニング方法は、蛍光基または他
のレポーター基で標識されている標的レセプターの使用
に関する2。これらの方法では、この化合物ライブラリ
（典型的には、樹脂ビーズに結合する）が標識された標
的レセプターに曝され、そして標識された標的レセプタ
ーに結合するメンバーが同定され、そして物理的に分離
される。次いで、この標的レセプターに結合する特定の
リガンドが同定される。これらの方法の多くでは、ライ
ブラリの個々のメンバーを追跡するために、精巧な手順
が必要である。例えば、コンビナトリアルライブラリの
合成中には、個々のメンバーの構造を引き続いて決定す
るために、コード化されたタグがしばしば付加される。
あるいは、コンビナトリアルライブラリは、ある配列で
作成され得、続いて、このライブラリの個々のメンバー
はこの配列内の位置によって同定され得る。このような
方法は効果的であり得るものの、その合成およびスクリ
ーニング中に、ライブラリの個々のメンバーを追跡する
必要があることは、極めて面倒であり、使用できる合成
手順のタイプがしばしば限られる。さらに、これらの方
法の多くでは、その合成手順が固相上で行なわれる必要
があり、それにより、使用できる合成手順および試薬が
さらに限られる。
【０００８】代案として、コンビナトリアルライブラリ
の疑問に対する重要な手段として、質量分析が出現し
た。質量分析は、これまで、ライブラリの質を評価する
ために使用されており3、4、分子認識技術と組み合わせ
たとき、活性ライブラリ化合物の単離および特性付けに
おいて、ある程度の成功を収めている5-15。典型的に
は、化合物ライブラリを生物学的に活性なメンバーにつ
いてスクリーニングする場合、質量分析は、「捕捉およ
び解放（capture and release）」方法論と組み合わせ
て使用される。この方法論では、化合物の混合物が、そ
の標的レセプター(これは、しばしば、固体担体上に固
定化される)に提供され、得られたリガンド−レセプタ
ー複合体は、このライブラリのうちの非結合メンバーか
ら分離される。分離後、典型的には、このリガンド−レ
セプター複合体は、例えば、溶媒を用いて変性され、そ
して先に結合したリガンドを含む溶媒混合物が質量分析
計に提供されて、高親和性リガンドの同定を可能とす
る。
【０００９】例えば、コンビナトリアルライブラリをス
クリーニングするために、限外濾過がエレクトロスプレ
ー質量分析と組み合わせて使用される10-12。この方法
において、化合物ライブラリ中に存在するリガンドはレ
セプターに結合され、得られたリガンド−レセプター複
合体は、限外濾過により精製される。次いで、このリガ
ンド−レセプター複合体は、溶媒(例えば、メタノール)
を用いて解離され、そして先に結合したリガンドがエレ
クトロスプレー質量分析計により検出される。
【００１０】アフィニティーキャピラリー電気泳動(AC
E)もまた、コンビナトリアルライブラリをスクリーニン
グするために、質量分析とカップリングされる5。この
手順において、ACEは、非結合リガンドからリガンド−
レセプター複合体を分離するのに使用され、そして質量
分析は高親和性リガンドを同定するのに使用される。
【００１１】同様に、化合物ライブラリは、質量分析と
組み合わせたアフィニティークロマトグラフィーを用い
てスクリーニングされる。例えば、WO 97/43301は、コ
ンビナトリアルライブラリのメンバーを特徴付ける方法
を記載しており、この方法は、親和性の選択を質量分析
と組み合わせて使用する。具体的には、このライブラリ
のメンバーは、結合(すなわち、複合体の形成)を可能に
するドメインと接触される。結合後、典型的には、この
複合体は、この複合体を含むカラムから非結合メンバー
を洗い出すことにより、ライブラリの非結合メンバーか
ら分離される。次いで、この複合体は、結合したライブ
ラリ成分を溶出するために処理され、そして溶出された
成分は質量分析により分析される。記載された溶出方法
は、ディスプレーサー、カオトロピック試薬（chaotrop
e agent）、pH溶出、塩勾配、温度勾配、有機溶媒、選
択的変性および洗浄剤の使用を包含する。このような方
法を用いると、その称するところによれば、このライブ
ラリの弱く結合したメンバーがまず溶出され、そして質
量分析により分析され、続いて、より強く結合したメン
バーが溶出される。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】先に報告した化合物ラ
イブラリをスクリーニングする「捕捉および解放」方法
に付随して、いくつかの欠点が存在する。まず、リガン
ド−レセプター複合体から結合リガンドを「解放する」
のに使用される手順は、種々の結合リガンドの結合プロ
ファイルを変える場合があり、その結果、結合力の示唆
に誤りが生じる。例えば、ライブラリの結合メンバーを
解放するのにpH勾配を用いると、そのレセプター上の結
合部位の電気的特性を変えて、生理的条件下で強く結合
したリガンドが早まって解放される場合がある。それゆ
え、それらの相対的な解放時間に基づいた種々のリガン
ドについての結合力の特徴付けは、その解放条件が結合
条件とは異なるのであれば、誤った方向に導かれる場合
がある。従って、これらの方法は、化合物ライブラリの
最も活性の高いメンバーを正確に同定しない場合があ
る。さらに、化合物の解放に使用されるある条件(例え
ば、pH勾配)は、レセプターを不可逆的に変性し、それ
により、そのレセプター引き続いて化合物ライブラリの
スクリーニングに使用するのを妨げられる場合がある。
【００１３】さらに、「捕捉および解放」方法を使用す
るとき、各結合リガンドは、典型的には、比較的に短時
間で解放され、その結果、例えば、各リガンドに対する
溶出ピークまたは「スパイク」が得られる。従って、こ
のような方法を用いて生じる溶出液は、典型的には、い
ずれの特定の溶出ピークも見逃さないように、例えば、
質量分析によって、継続的にモニターされる。それゆ
え、ある特定の質量分析を用いて行い得る分析の数が限
られてくる。従って、「捕捉および解放」方法論に依存
しない化合物ライブラリのスクリーニング方法を開発す
ることが望まれている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの局面で
は、化合物ライブラリをスクリーニングして、複数の推
定リガンドの、標的レセプターへの相対親和性または絶
対親和性を決定する方法であって、以下の工程(a)、
(b)、(c)および(d)を包含する方法が提供される：
（ａ）複数の推定リガンドを含有する化合物ライブラリ
を提供する工程；（ｂ）該化合物ライブラリを、前端ク
ロマトグラフィー条件下にて、必要に応じて固相担体に
結合した標的レセプターを含有するカラムに連続的に付
与して、それにより、該標的レセプターを、該化合物ラ
イブラリに連続的に接触させて、溶出液を提供する工
程；（ｃ）該溶出液を、質量分析計に連続的または断続
的に付与して、該溶出液中に存在する推定リガンド成分
の質量スペクトルを提供する工程；および（ｄ）該質量
スペクトルを評価して、該推定リガンド各々の破過時間
を決定する工程。
【００１５】好適な実施態様によれば、上記方法は、以
下の工程(e)をさらに包含する：（ｅ）各ライブラリ中
の推定リガンドの前記カラム上での破過時間を、同じラ
イブラリ中の他の推定リガンドに対して相対的に比較す
ることによって、該各ライブラリー中の推定リガンド
の、前記標的レセプターへの親和性を、該同じライブラ
リ中の他の推定リガンドに対して相対的に決定する工
程。
【００１６】好適な実施態様によれば、上記方法は、以
下の工程(f)をさらに包含する：（ｆ）前記化合物ライ
ブラリ中の推定リガンドおよび前記標的レセプターに対
する解離定数Ｋdを決定する工程。
【００１７】本発明の別の局面では、複数の化合物ライ
ブラリをスクリーニングして、各ライブラリ内の複数の
推定リガンドの、標的レセプターへの相対親和性または
絶対親和性を決定する方法であって、以下の工程(a)、
(b)、(c)および(d)を包含する方法が提供される：
（ａ）複数の化合物ライブラリを提供する工程であっ
て、各ライブラリが、複数の推定リガンドを含有する、
工程；（ｂ）各化合物ライブラリを、前端クロマトグラ
フィー条件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標
的レセプターを含有する個々のカラムに連続的に付与し
て、それにより、該標的レセプターを、該化合物ライブ
ラリに連続的に接触させて、各カラムからの溶出液を提
供する工程；（ｃ）各カラムからの該溶出液を、質量分
析計に断続的に付与して、該溶出液中に存在する推定リ
ガンド成分の質量スペクトルを提供する工程；および
（ｄ）該質量スペクトルを評価して、各化合物ライブラ
リ中の該推定リガンド各々の破過時間を決定する工程。
【００１８】好適な実施態様では、上記方法は、以下の
工程(e)をさらに包含する：（ｅ）各ライブラリ中の推
定リガンド各々の前記カラム上での破過時間を、同じラ
イブラリ中の他の推定リガンドに対して相対的に比較す
ることによって、該各ライブラリー中の推定リガンド各
々の、前記標的レセプターへの相対親和性を決定する工
程。
【００１９】好適な実施態様では、上記方法は、以下の
工程(f)をさらに包含する：（ｆ）前記化合物ライブラ
リ中の推定リガンドおよび前記標的レセプターに対する
解離定数Ｋdを決定する工程。
【００２０】好適な実施態様では、前記複数のカラム
は、２個〜約100個のカラムを包含する。
【００２１】好適な実施態様では、前記カラムからの溶
出液は、工程(c)の前に、補充希釈剤で希釈される。
【００２２】さらに好適な実施態様では、前記補充希釈
剤は、主要量の有機溶媒および少量の水性緩衝液を含有
する。
【００２３】さらにより好適な実施態様では、前記有機
溶媒は、アセトニトリル、メタノールおよびイソプロパ
ノールからなる群から選択される。
【００２４】本発明のさらに別の局面では、化合物ライ
ブラリをスクリーニングして、複数の推定リガンドの、
標的レセプターへの相対親和性を、１種またはそれ以上
のインジケーター化合物に対して相対的に決定する方法
であって、以下の工程(a)、(b)、(c)、(d)および(e)を
包含する方法が提供される：（ａ）複数の推定リガンド
を含有する化合物ライブラリを提供する工程；（ｂ）該
化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー条件下に
て、必要に応じて固相担体に結合した標的レセプターを
含有するカラムに連続的に付与して、該カラムを該化合
物ライブラリで平衡化する工程；（ｃ）少なくとも１種
のインジケーター化合物を提供する工程であって、該イ
ンジケーター化合物が、該標的レセプターへの所定の親
和性を有し、かつ該化合物ライブラリの非存在下におけ
る、所定の、該カラム上の破過時間を有する、工程；
（ｄ）(i)該化合物ライブラリおよび該インジケーター
化合物を含有する混合物または(ii)該インジケーター化
合物を、前端クロマトグラフィー条件下にて、該カラム
に連続的に付与して、溶出液を提供する工程；および
（ｅ）該溶出液を質量分析により分析して、該インジケ
ーター化合物の破過時間を決定する工程。
【００２５】好適な実施態様では、上記方法は、以下の
工程(f)をさらに包含する：（ｆ）工程(e)からの前記イ
ンジケーター化合物の破過時間を、前記化合物ライブラ
リ非存在下における、所定の、該インジケーター化合物
の破過時間と比較することにより、該化合物ライブラリ
の任意の推定リガンドの、前記標的レセプターへの親和
性が、該インジケーター化合物より高いかどうかを決定
する工程。
【００２６】好適な実施態様では、前記化合物ライブラ
リは、約50,000個未満の推定リガンドを含有する。
【００２７】さらに好適な実施態様では、前記化合物ラ
イブラリは、約５個〜約100個の推定リガンドを含有す
る。
【００２８】好適な実施態様では、前記化合物ライブラ
リ非存在下における、所定の、前記インジケーター化合
物の破過時間は、約５分間未満である。
【００２９】本発明のさらに別の実施態様では、複数の
化合物ライブラリをスクリーニングして、複数の推定リ
ガンドの、標的レセプターへの相対親和性を、１種また
はそれ以上のインジケーター化合物に対して相対的に決
定する方法であって、以下の工程(a)、(b)、(c)、(d)お
よび(e)を包含する方法が提供される：（ａ）複数の推
定リガンドを含有する複数の化合物ライブラリを提供す
る工程；（ｂ）各化合物ライブラリを、前端クロマトグ
ラフィー条件下にて、必要に応じて固相担体に結合した
標的レセプターを含有する個々のカラムに連続的に付与
して、該カラムを該化合物ライブラリで平衡化する工
程；（ｃ）少なくとも１種のインジケーター化合物を提
供する工程であって、該インジケーター化合物が、該標
的レセプターへの所定の親和性を有し、かつ該化合物ラ
イブラリの非存在下における、所定の、該カラム上の破
過時間を有する、工程；（ｄ）(i)該化合物ライブラリ
および該インジケーター化合物を含有する混合物または
(ii)該インジケーター化合物を、前端クロマトグラフィ
ー条件下にて、各カラムに連続的に付与して、溶出液を
提供する工程；および（ｅ）各カラムからの該溶出液を
質量分析により分析して、該インジケーター化合物の破
過時間を決定する工程。
【００３０】好適な実施態様では、上記方法は、以下の
工程(f)をさらに包含する：（ｆ）工程(e)からの前記イ
ンジケーター化合物の破過時間を、前記化合物ライブラ
リ非存在下における、所定の、該インジケーター化合物
の破過時間と比較することにより、化合物ライブラリの
任意の推定リガンドの、前記標的レセプターへの親和性
が、該インジケーター化合物より高いかどうかを決定す
る工程。
【００３１】好適な実施態様では、前記化合物ライブラ
リ非存在下における、所定の、前記インジケーター化合
物の破過時間は、約５分間未満である。
【００３２】好適な実施態様では、前記カラムからの溶
出液は、工程(e)の前に、補充希釈剤で希釈される。
【００３３】さらに好適な実施態様では、前記補充希釈
剤は、主要量の有機溶媒および少量の水性緩衝液を含有
する。
【００３４】さらにより好適な実施態様では、前記有機
溶媒は、アセトニトリル、メタノールおよびイソプロパ
ノールからなる群から選択される。
【００３５】好適な実施態様では、前記化合物ライブラ
リは、約10,000個未満の推定リガンドを含有する。
【００３６】さらに好適な実施態様では、前記化合物ラ
イブラリは、約５個〜約100個の推定リガンドを含有す
る。
【００３７】好適な実施態様では、前記化合物ライブラ
リは、炭水化物、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、アミノ
酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパ
ク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
ド、ポリヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイ
ド、グリコペプチド、グリコタンパク質、プロテオグリ
カン、およびそれらの合成アナログまたは誘導体からな
る群から選択される推定リガンドを含有する。
【００３８】好適な実施態様では、前記化合物ライブラ
リは、合成小分子有機化合物からなる群から選択される
推定リガンドを含有する。
【００３９】好適な実施態様では、前記標的レセプター
は、タンパク質、糖タンパク質、グリコサミノグリカ
ン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、レクチ
ン、セレクチン、細胞接着分子、毒素、細菌性線毛、輸
送タンパク質、シグナル伝達またはホルモン結合に関与
したレセプター、ホルモン、抗体、主要組織適合性複合
体、免疫グロブリンスーパーファミリー、カドフェリ
ン、DNAおよびDNAフラグメント、RNAおよびRNAフラグメ
ント、全細胞、組織、細菌、真菌、ウイルス、寄生生
物、プレオン、およびそれらの合成アナログまたは誘導
体からなる群から選択される。
【００４０】好適な実施態様では、前記標的レセプター
は、固相担体に結合される。
【００４１】さらに好適な実施態様では、前記標的レセ
プターは、前記固相担体に共有結合されるか、またはビ
オチン−アビジン結合またはビオチン−ストレプトアビ
ジン結合を介して結合される。
【００４２】さらに好適な実施態様では、前記固相担体
は、樹脂ビーズ、ガラスビーズ、シリカチップ、シリカ
キャピラリーおよびアガロースからなる群から選択され
る。
【００４３】好適な実施態様では、前記カラムは、約１
pmol〜約10 nmolの標的レセプター活性部位を含有す
る。
【００４４】好適な実施態様では、前記質量分析計は、
エレクトロスプレー質量分析計である。
【００４５】本発明は、化合物ライブラリをスクリーニ
ングする方法に関する。この化合物ライブラリは、例え
ば、コンビナトリアルケミストリー技術を含めた任意の
手段によるか、または発酵ブロス、植物抽出物、細胞抽
出物などから作成され得るかまたは得られえる。本発明
の方法は、質量分析(MS)と組み合わせた前端クロマトグ
ラフィー(FC)を使用して、化合物のライブラリをスクリ
ーニングし、標的レセプターに結合するライブラリメン
バーを同定しそして分類する。
【００４６】前端クロマトグラフィーにおいて、標的レ
セプターは、典型的には、適当な固体担体材料に固定化
されて、カラムに充填される。次いで、推定リガンド
（putative ligand）を含有する混合物がカラムに連続
的に注入される。標的レセプターへの親和性を有するリ
ガンドがこのカラムに結合するが、やがて各リガンドに
対するカラムの容量が限界を越えると、これらのリガン
ドはその注入濃度にて溶出するかまたは「破過する（br
eak-through）」。リガンドがカラムから一度溶出し始
めると、リガンドは連続的に溶出液中に存在する。標的
レセプターに対して殆どまたは全く親和性がない化合物
は、そのレセプターへのより高い親和性を有するリガン
ドと比較してより早く溶出液中に破過する。
【００４７】本発明では、FC溶出液を連続的または断続
的にモニターするために、質量分析(MS)を使用する。MS
を用いると、カラム上の各リガンドの同定および破過時
間が決定され得る。それゆえ、FC-MSは、ライブラリー
の各メンバーの、標的レセプターへの相対親和性を、リ
ガンド−レセプター結合条件下で、そのライブラリー他
のメンバーと比較して決定することを可能とする。本発
明の装置を用いると、化合物ライブラリの各メンバー
の、標的レセプターへの相対親和性の正確な分類を確定
し得る。
【００４８】従って、本発明は、その方法局面の１つに
おいて、化合物ライブラリをスクリーニングして、複数
の推定リガンドの、標的レセプターへの相対親和性を決
定する方法に関し、該方法は、以下の工程(a)、(b)、
(c)および(d)を包含する： （ａ）複数の推定リガンドを含有する化合物ライブラリ
を提供する工程； （ｂ）該化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー
条件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レセ
プターを含有するカラムに連続的に付与して、それによ
り、該標的レセプターを、該化合物ライブラリに連続的
に接触させて、溶出液を提供する工程； （ｃ）該溶出液を、質量分析計に連続的または断続的に
付与して、該溶出液中に存在する推定リガンド成分の質
量スペクトルを提供する工程；および （ｄ）該質量スペクトルを評価して、該推定リガンド各
々の破過時間を決定する工程。
【００４９】好ましい実施態様では、上記方法は、さら
に、以下の工程(e)を包含する： （ｅ）推定リガンドの前記カラム上での破過時間を、他
の推定リガンドに対して相対的に比較することによっ
て、該化合物ライブラリー中の推定リガンドの、前記標
的レセプターへの親和性を、その化合物ライブラリ中の
他の推定リガンドに対して相対的に決定する工程。
【００５０】他の好ましい実施態様では、上記方法は、
さらに、以下の工程(f)を包含する： （ｆ）前記化合物ライブラリ中の推定リガンドおよび前
記標的レセプターに対する解離定数Ｋdを決定する工
程。
【００５１】好ましくは、上記方法で使用される化合物
ライブラリは、約10,000個未満の推定リガンドを含有す
る。より好ましくは、この化合物ライブラリは、約５個
〜約100個の推定リガンドを含有する。
【００５２】本発明の１実施態様では、前記化合物ライ
ブラリは、好ましくは、炭水化物、単糖類、オリゴ糖
類、多糖類、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポ
リペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、レ
チノイド、ステロイド、グリコペプチド、グリコタンパ
ク質、プロテオグリカン、およびそれらの合成アナログ
または誘導体などからなる群から選択される推定リガン
ドを含有する。
【００５３】別の実施態様では、前記化合物ライブラリ
は、合成小分子有機化合物からなる群から選択される推
定リガンドを含有する。
【００５４】好ましくは、前記標的レセプターは、タン
パク質、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテ
オグリカン、インテグリン、酵素、レクチン、セレクチ
ン、細胞接着分子、毒素、細菌性線毛、輸送タンパク
質、シグナル伝達またはホルモン結合に関与したレセプ
ター、ホルモン、抗体、主要組織適合性複合体（majorh
istocompatability complex）、免疫グロブリンスーパ
ーファミリー、カドフェリン、DNAまたはDNAフラグメン
ト、RNAおよびRNAフラグメント、全細胞（wholecel
l）、組織、細菌、真菌、ウイルス、寄生生物、プレオ
ン（preon）、およびそれらの合成アナログまたは誘導
体からなる群から選択される。
【００５５】さらに、前記標的レセプターは、好ましく
は、固相担体に結合される。さらに好ましくは、前記標
的レセプターは、前記固相担体に共有結合されるか、ま
たはビオチン−アビジン結合またはビオチン−ストレプ
トアビジン結合を介して結合される。
【００５６】好ましくは、本発明で使用される固相担体
は、樹脂ビーズ、ガラスビーズ、シリカチップ、シリカ
キャピラリーおよびアガロースからなる群から選択され
る。
【００５７】本発明の方法で使用されるカラムは、好ま
しくは、約１ pmol〜約10 nmolの標的レセプター活性部
位を含有する。
【００５８】本発明の方法では、カラムからの溶出液
は、好ましくは、質量分析による分析の前に、補充希釈
剤で希釈される。好ましくは、前記補充希釈剤は、主要
量の有機溶媒および少量の水性緩衝液を含有する。前記
有機溶媒は、好ましくは、アセトニトリル、メタノール
およびイソプロパノールからなる群から選択される。
【００５９】好ましくは、本発明の方法で使用される質
量分析計は、エレクトロスプレー質量分析計である。
【００６０】さらに、カラムを一度破過すれば、リガン
ドはFC条件下において連続的に溶出するので、FC-MS
は、溶出液をコンスタントにモニターする必要がない。
従って、各カラムを断続的にモニターするための単一の
質量分析計を用いて、複数のFC-MS分析が同時に行なわ
れ得る。
【００６１】従って、本発明は、別の方法局面におい
て、複数の化合物ライブラリをスクリーニングして、各
ライブラリ内の複数の推定リガンドの、標的レセプター
への相対親和性を決定する方法を提供し、該方法は、以
下の工程(a)、(b)、(c)および(d)を包含する： （ａ）複数の化合物ライブラリを提供する工程であっ
て、各ライブラリが、複数の推定リガンドを含有する、
工程； （ｂ）各化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー
条件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レセ
プターを含有する個々のカラムに連続的に付与して、そ
れにより、該標的レセプターを、該化合物ライブラリに
連続的に接触させて、各カラムからの溶出液を提供する
工程； （ｃ）各カラムからの該溶出液を、質量分析計に断続的
に付与して、該溶出液中に存在する推定リガンド成分
（constituent putative ligand）の質量スペクトルを
提供する工程；および （ｄ）該質量スペクトルを評価して、各化合物ライブラ
リ中の該推定リガンド各々の破過時間を決定する工程。
【００６２】好ましい実施態様では、上記方法は、さら
に、以下の工程(e)を包含する： （ｅ）前記推定リガンドの前記カラム上での破過時間
を、同じライブラリ中の他の推定リガンドに対して相対
的に比較することによって、該各ライブラリー中の推定
リガンドの、前記標的レセプターへの親和性を、該同じ
ライブラリ中の他の推定リガンドに対して相対的に決定
する工程。
【００６３】別の好ましい実施態様では、上記方法は、
さらに、以下の工程(f)を包含する： （ｆ）前記化合物ライブラリ中の推定リガンドおよび前
記標的レセプターに対する解離定数Ｋdを決定する工
程。
【００６４】好ましくは、複数のカラムを使用する本発
明の方法では、２個〜約100個のカラムが用いられる。
より好ましくは、２個〜約50個のカラムが使用され、さ
らにより好ましくは、２個〜約10個のカラムが使用され
る。
【００６５】他の実施態様では、本発明は、ライブラリ
の任意のメンバーの、標的レセプターへの親和性が、あ
らかじめ選択したインジケーター化合物よりも高いかど
うかを決定するために、この化合物ライブラリをスクリ
ーニングする方法を提供する。この実施態様を用いる
と、化合物ライブラリは、所定の最小レベルの、標的レ
セプターへの親和性を有するリガンドを含むライブラリ
を同定するために迅速にスクリーニングされ得る。
【００６６】従って、本発明は、他の方法局面におい
て、化合物ライブラリをスクリーニングして、複数の推
定リガンドの、標的レセプターへの相対親和性を、１種
またはそれ以上のインジケーター化合物に対して相対的
に決定する方法を提供し、該方法は、以下の(a)、(b)、
(c)、(d)および(e)を包含する： （ａ）複数の推定リガンドを含有する化合物ライブラリ
を提供する工程； （ｂ）該化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー
条件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レセ
プターを含有するカラムに連続的に付与して、該カラム
を該化合物ライブラリで平衡化する工程； （ｃ）少なくとも１種のインジケーター化合物を提供す
る工程であって、該インジケーター化合物が、該標的レ
セプターへの所定の親和性を有し、かつ該化合物ライブ
ラリの非存在下における、所定の、該カラム上の破過時
間を有する、工程； （ｄ）(i)該化合物ライブラリおよび該インジケーター
化合物を含有する混合物または(ii)該インジケーター化
合物を、前端クロマトグラフィー条件下にて、該カラム
に連続的に付与して、溶出液を提供する工程；および （ｅ）該溶出液を質量分析により分析して、該インジケ
ーター化合物の破過時間を決定する工程。
【００６７】好ましい実施態様では、上記方法は、さら
に、以下の工程(f)を包含する： （ｆ）工程(e)からの前記インジケーター化合物の破過
時間を、前記化合物ライブラリ非存在下における、所定
の、該インジケーター化合物の破過時間と比較すること
により、該化合物ライブラリの任意の推定リガンドの、
前記標的レセプターへの親和性が、該インジケーター化
合物より高いかどうかを決定する工程。
【００６８】好ましくは、インジケーター化合物が使用
される場合、前記化合物ライブラリは、約50,000個未満
の推定リガンドを含有する。より好ましくは、前記化合
物ライブラリは、約５個〜約100個の推定リガンドを含
有する。
【００６９】好ましくは、本発明の方法で使用されるイ
ンジケーター化合物は、前記化合物ライブラリの非存在
下において、所定の破過時間（約５分間未満）を有す
る。
【００７０】インジケーター化合物が使用される場合に
はまた、複数のカラムを使用してもよい。従って、本発
明は、なお他の方法局面において、複数の化合物ライブ
ラリをスクリーニングして、複数の推定リガンドの、標
的レセプターへの相対親和性を、１種またはそれ以上の
インジケーター化合物に対して相対的に決定する方法を
提供し、該方法は、以下の(a)、(b)、(c)、(d)および
(e)を包含する： （ａ）複数の推定リガンドを含有する複数の化合物ライ
ブラリを提供する工程； （ｂ）各化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー
条件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レセ
プターを含有する個々のカラムに連続的に付与して、該
カラムを該化合物ライブラリで平衡化する工程； （ｃ）少なくとも１種のインジケーター化合物を提供す
る工程であって、該インジケーター化合物が、該標的レ
セプターへの所定の親和性を有し、かつ該化合物ライブ
ラリの非存在下における、所定の、該カラム上の破過時
間を有する、工程； （ｄ）(i)該化合物ライブラリおよび該インジケーター
化合物を含有する混合物または(ii)該インジケーター化
合物を、前端クロマトグラフィー条件下にて、各カラム
に連続的に付与して、溶出液を提供する工程；および （ｅ）各カラムからの該溶出液を質量分析により分析し
て、該インジケーター化合物の破過時間を決定する工
程。
【００７１】好ましい実施態様では、上記方法は、さら
に、以下の工程(f)を包含する： （ｆ）工程(e)からの前記インジケーター化合物の破過
時間を、前記化合物ライブラリ非存在下における、所定
の、該インジケーター化合物の破過時間と比較すること
により、化合物ライブラリの任意の推定リガンドの、前
記標的レセプターへの親和性が、該インジケーター化合
物より高いかどうかを決定する工程。
【００７２】
【発明の実施の形態】本発明は、質量分析と組み合わせ
て前端クロマトグラフィーを用いて、化合物ライブラリ
をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法を
記述するとき、以下の用語は、他に指示がなければ、以
下の意味を有する。ここで定義していない全ての用語
は、当該技術分野で認められている通常の意味を有す
る。
【００７３】定義 「破過時間(break through time)」との用語は、空隙容
量の溶出と、前端クロマトグラフィー中での特定の化合
物の溶出に対応する前端との間にかかる時間を意味す
る。
【００７４】「化合物ライブラリ」との用語は、いずれ
かの方法により作成したまたは得た１個またはそれ以上
の推定リガンドの混合物または集合体を意味する。好ま
しくは、このライブラリは、１個より多い推定リガンド
またはメンバーを含有する。
【００７５】「エレクトロスプレー」との用語は、流動
溶液からの気相イオンの発生を意味する。エレクトロス
プレーは、典型的には、補助的な噴霧化または溶媒エバ
ポレーションを伴ってまたはそれなしで、電場にて、大
気圧で行われる。
【００７６】「流出液」との用語は、前端クロマトグラ
フィーカラムから出現するかまたは出てくる溶媒または
溶液を意味する。
【００７７】「前端クロマトグラフィー条件」との用語
は、クロマトグラフィー中において、その標的レセプタ
ーが推定リガンドに連続的に接触するように、推定リガ
ンドの溶液を、この標的レセプターを含むカラムに、一
定濃度で、連続的に適用するかまたは注入したクロマト
グラフィー条件を意味する。
【００７８】「インジケーター化合物」との用語は、そ
の標的レセプターに対する既知の親和性または特異性お
よび前端クロマトグラフィー条件下にて測定可能な破過
時間を有する化合物を意味する。
【００７９】「リガンド」との用語は、レセプターの１
個またはそれ以上の特定の部位に結合する分子または分
子群を意味する。代表的なリガンドには、例えば、炭水
化物、モノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサ
ッカライド、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポ
リペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド(DNAおよび
DNAフラグメント、RNAおよびRNAフラグメントを含めて)
など；脂質、レチノイド、ステロイド、グリコペプチ
ド、グリコタンパク質、プロテオグリカンなど；および
それらの合成アナログまたは誘導体(ペプチド擬態物、
小分子有機化合物などを含めて)、およびそれらの混合
物が挙げられる。「推定リガンド」との用語は、標的レ
セプターに対するその親和性または特異性(もしあれば)
が決定されていないリガンドを意味する。
【００８０】「マイクロカラム」との用語は、約１mm以
下の内径を有するカラムを意味する。
【００８１】「選択イオンクロマトグラム」との用語
は、単一イオンの強度から構成されるイオン豊富度−時
間のプロットを意味する。選択イオンクロマトグラム
は、走査または選択イオンモニターモードから作成でき
る。
【００８２】「選択イオンモニター」との用語は、質量
分析計(例えば、四極子)を用いて、あらかじめ選択した
少数のイオンを検出することを意味する。
【００８３】「固体担体」または「固相担体」との用語
は、直接または結合アームを介して、標的レセプターが
結合またはカップリングできる不活性材料または分子を
意味する。
【００８４】「合成小分子有機化合物」との用語は、一
般に、約1000未満、好ましくは、約500未満の分子量を
有する有機化合物を意味し、これらは、有機合成技術
(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術)により調
製される。
【００８５】「補充希釈剤」または「補充流れ」とは、
流出液がエレクトロスプレー質量分析計に入る前に、カ
ラムからの流出液と組み合わせた溶液または溶媒を意味
する。
【００８６】「標的レセプター」または「レセプター」
との用語は、特異的な部位にて、リガンドに結合できる
分子または分子群を意味する。標的レセプターの代表的
な例には、例えば、タンパク質、糖タンパク質、グリコ
サミノグリカン、プロテオグリカン、インテグリン、酵
素、レクチン、セレクチン、細胞接着分子、毒素、細菌
性線毛、輸送タンパク質、シグナル伝達またはホルモン
結合に関与したレセプター、ホルモン、抗体、主要組織
適合性複合体(MHC)、免疫グロブリンスーパーファミリ
ー、カドヘリン、DNAまたはDNAフラグメント、RNAおよ
びRNAフラグメント、全細胞、組織、細菌、真菌、ウイ
ルス、寄生生物、プレオン(preon)、および上記のいず
れかの合成アナログまたは誘導体が包含される。
【００８７】「標的レセプター活性部位」との用語は、
特定の標的レセプター上の目的の結合部位を意味する。
【００８８】「全イオンクロマトグラム」との用語は、
走査における全てのイオン強度の合計から構成されるイ
オン豊富度−時間のプロットを意味する。全イオンクロ
マトグラムでは、走査数は、時間と線形的に関連してい
る。
【００８９】「空隙容量」または「Ｖ0」との用語は、
注入時点から検出時点まで、前端クロマトグラフィーカ
ラムを破過する溶液の容積を意味する。その標的レセプ
ターに親和性がない推定リガンドは、典型的には、この
空隙容量で、カラムから溶出する。
【００９０】本発明で使用する化合物ライブラリは、例
えば、コンビナトリアルケミストリー技術、発酵方法、
植物および細胞抽出手順など(これらに限定されない)を
含めたいずれかの手段により、作成できるかまたは得る
ことができる。コンビナトリアルライブラリを作成する
方法は、当該技術分野で周知である。例えば、E. R.Fel
der, Chimia 1994, 48, 512-541; Gallopら、J. Med. C
hem. 1994, 37, 1233-1251; R. A. Houghten, Trends G
enet. 1993, 9, 235-239; Houghtenら、Nature 1991, 3
54, 84-86; Lamら、Nature 1991, 354, 82-84; Carell
ら、Chem. Biol. 1995, 3, 171-183; Maddenら、Perspe
ctives in Drug Discovery and Design2, 269-282; Cwi
rlaら、Biochemistry 1990, 87, 6378-6382; Brenner
ら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 5381-5383;
Gordonら、J. Med. Chem. 1994,37, 1385-1401; Lebl
ら、Biopolymers 1995, 37 177-198；およびそれらで引
用された参考文献を参照せよ。これらの参考文献の各内
容は、その全体を、本明細書中で参考として援用されて
いる。
【００９１】標的レセプターに結合できるいずれのタイ
プの分子も、この化合物ライブラリに存在できる。例え
ば、本発明を用いてスクリーニングした化合物ライブラ
リは、天然に生じる分子(例えば、炭水化物、モノサッ
カライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、ア
ミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タ
ンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチド、ポリヌクレオチド(DNAおよびDNAフラグメン
ト、RNAおよびRNAフラグメントを含めて)など；脂質、
レチノイド、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク
質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子
の合成アナログまたは誘導体(例えば、ペプチド擬態物
など)；および天然に生じない分子(例えば、コンビナト
リアルケミストリー技術を用いて作成した「小分子」有
機化合物)；ならびにそれらの混合物を含有できる。
「小分子有機化合物」との用語は、一般に、約1000未満
の分子量、好ましくは、約500未満の分子量を有する有
機化合物を意味する。
【００９２】本発明の方法の特定の利点は、例えば、１
個の異性体(例えば、鏡像異性体またはジアステレオマ
ー)が標的レセプターに結合しているかどうか、あるい
は異性体が標的レセプターに対して異なる親和性を有す
るかどうかを決定するために、ラセミ混合物を含む化合
物ライブラリがスクリーニングできることにある。この
ことに関して、これらの異性体が標的レセプターに対し
て異なる親和性を有するなら、各異性体について、異な
る破過時間が認められる。
【００９３】本発明で使用する化合物ライブラリは、典
型的には、複数のメンバーまたは推定リガンドを含有す
る。インジケーター化合物を使用するとき、この化合物
ライブラリは、好ましくは、約50,000個未満のメンバー
を含有し、さらに好ましくは、この化合物ライブラリ
は、約10,000個未満のメンバーを含有する。インジケー
ター化合物を使用しないとき、この化合物ライブラリ
は、好ましくは、約10,000個未満のメンバー、さらに好
ましくは、１個〜約1,000個のメンバー、そしてさらに
より好ましくは、約５個〜約100個のメンバーを含有す
る。
【００９４】本発明の方法は、リガンドと結合するかま
たは複合体化するいずれかの標的レセプターまたはドメ
インに対する、化合物ライブラリのメンバーの親和性を
分析するのに有用である。例えば、この標的レセプター
は、タンパク質、糖タンパク質、グリコサミノグリカ
ン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素、レクチ
ン、セレクチン、細胞接着分子、毒素、細菌性線毛、輸
送タンパク質、シグナル伝達またはホルモン結合に関与
したレセプター、ホルモン、抗体、主要組織適合性複合
体(MHC)、免疫グロブリンスーパーファミリー、カドヘ
リン、DNAもしくはDNAフラグメント、RNAおよびRNAフラ
グメント、全細胞、組織、細菌、真菌、ウイルス、寄生
生物、プレオンなど、あるいは上記のもののいずれかの
合成アナログまたは誘導体からなる群から選択され得る
が、これらに限定されない。
【００９５】本発明の方法を使用するとき、その標的レ
セプターは、必要に応じて、固体担体に結合またはカッ
プリングされる。好ましくは、この標的レセプターは、
この固体担体に共有結合的に結合またはカップリングさ
れる。しかしながら、ある場合、例えば、この標的レセ
プターとして全細胞または微生物を使用する場合、この
細胞または微生物は、例えば、そのカラムの流出末端に
おいて多孔性フリットを用いることにより、このカラム
内に含有させてもよい。レセプターに対する担体は、当
該技術分野で周知であり、多くは市販されている。本発
明では、任意のこのような通常の担体が使用できる。代
表的な担体には、例えば、樹脂ビーズ、ガラスビーズ、
シリカチップおよびキャピラリー、アガロースなどが挙
げられる。この固体担体としてシリカキャピラリーを使
用するとき、この標的レセプターは、このカラムの壁に
直接結合される。本発明で使用するのに好ましい固体担
体には、多孔性樹脂ビーズが挙げられる。特に好ましい
固体担体は、多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼンポ
リマービーズ(例えば、POROSビーズ(これは、Perseptiv
e Biosystems、Farmingham、MAから入手できる))であ
る。
【００９６】この標的レセプターは、当該技術分野で認
められている任意の手順を用いて、この担体に結合また
はカップリングできる。例えば、この標的レセプター
は、直接固定化法(すなわち、スルフヒドリル基、アミ
ノ基またはカルボキシル基などを介した共有結合)、結
合アームまたはスペーサーアームによる共有結合、ビオ
チン−アビジン結合、ビオチン−ストレプトアビジン結
合、抗体結合、GST-グルタチオン結合、イオン交換吸
収、疎水性相互作用、マルトース結合タンパク質に融合
した組み換えタンパク質としての標的レセプターの発
現、アフィニティーカラムに選択的に結合するペプチド
との標的レセプターの融合などを用いて、結合できる。
このような方法は、当該技術分野で周知であり、そして
これらの方法の多くの実施するキットは、市販されてい
る。例えば、Stammersら、FEBS Lett. 1991, 283, 298-
302; Hermanら、Anal. Biochemistry 1986, 156, 48; S
mithら、FEBS Lett. 1987, 215, 305; Kilmartinら、J.
Cell. Biol. 1982, 93, 576-582; Skinnerら、J. Bio
l. Chem. 1991, 266, 14163-14166; Hoppら、Bio/Techn
ology 1988, 6, 1204-1210; H. M. Sassenfeld, TIBTEC
H 1990, 8, 88-93; Hankeら、J. General Virology 199
2, 73, 654-660; Ellisonら、J. Biol. Chem. 1991,２
６７， ２１１５Ｏ−２１１５７； Ｕ． Ｋ． Ｐａ
ｔｉ， Ｇｅｎｅ １９９２， １１４， ２８５−２
８８； Ｗａｄｚｉｎｓｋｉら、J.Biol Chem. 1992, 2
67, 16883-16888; Fieldら、Mol. Cell. Biol. 1988,
8, 2159-2165; Gerardら、Biochemistry 1990, 29, 927
4-9281; Ausselbergsら、Fibrinolysis 1993, 7, 1-13;
Hoppら、Biotechnology 1988, 6, 1205-1210; Blanar
ら、Science 1992, 256, 1014-1018; Linら、J. Org. C
hem. 1991, 56, 6850-6856; Zastrowら、J. Biol. Che
m. 1992, 267, 3530-3538; Goldsteinら、EMBO Jml. 19
92, 11, OOOO-OOOO; Limら、J. Infectious Disease 19
90, 162, 1263-1269; Goldsteinら、Virology 1992, 19
0, 889-893;および IBI FLAG Epitope Vol.1: No. 1, S
ept. 1992に記載の論文；およびそれらで引用された参
考文献を参照せよ。これらの各参考文献の内容は、その
全体について、本明細書中で参考として援用されてい
る。
【００９７】本発明の好ましい実施態様では、この標的
レセプターは、ビオチン−アビジン結合、ビオチン−ス
トレプトアビジン結合または関連したタイプの結合を用
いて、この固体担体に結合される。この手順では、この
標的レセプターは、典型的には、スペーサーアームを含
むビオチン試薬でビオチン化される。ビオチン化した標
的レセプターは、次いで、アビジン含有固体担体と接触
される。得られたビオチン−アビジン複合体は、標的レ
セプターを固体担体に結合する。
【００９８】生体分子をビオチン化する手順は、当該技
術分野で周知であり、種々のビオチン試薬は、市販され
ている。例えば、E. A. Bayerら、Meth. Enzymol. 199
0, 184, 51; U. Bickelら、Bioconj. Chem. 1995, 6, 2
11; H. Hagiwaraら、J. Chromatog. 1992, 597, 331;"A
vidin-Biotin Chemistry Handbook"(Pierce, Rockford,
ILから入手可能, Catalog Item No. 15055)；およびそ
れらで引用された参考文献を参照せよ。好ましいビオチ
ン試薬は、NHS-LC-ビオチン(Pierceから入手できる)で
ある。このような試薬を用いたビオチン含入の程度は、
例えば、DC Schemerおよび L. Li、Anal. Chem. 1996、
68、3382-3387に記述のようなマトリックス補助レーザ
ー脱着/イオン化により、または「Avidin-Biotin Chemi
stry Handbook」(Pierce)に記述のような当該技術分野
で認められる他の方法により、モニターできる。好まし
くは、標的レセプター１個あたり、平均して、約１個〜
約50個のビオチン、さらに好ましくは、約１個〜約10個
のビオチンが含入される。
【００９９】このビオチン化標的レセプターは、典型的
には、アビジン含有またはストレプトアビジン含有固体
担体または関連した物質とカップリングされる。このよ
うな担体は市販されており、または当該技術分野で認め
られる手順により、調製できる。好ましいアビジン含有
担体は、Ultralink固定化アビジン(Pierceから入手でき
る)およびPOROS 20固定化ストレプトアビジン(Persepti
ve Biosystemsから入手できる)を含む。このビオチン化
標的レセプターは、典型的には、適切な緩衝液(例え
ば、リン酸緩衝生理食塩水(pH ７))中にて、約４℃〜約
37℃の範囲の温度で、約0.5〜４時間にわたって、レセ
プターをアビジン含有担体と接触させることにより、こ
の担体とカップリングされる。好ましくは、このビオチ
ン化標的レセプターをアビジン含有担体とカップリング
した後、この担体上の任意の残留アビジン結合部位は、
この固体担体を過剰の遊離ビオチンと接触させることに
より、ブロックされる。
【０１００】標的レセプターは、固体担体材料をカラム
に導入する前または後のいずれかにて、この固体担体と
結合またはカップリングできる。例えば、ビオチン化標
的レセプターは、アビジン含有またはストレプトアビジ
ン含有固体担体と接触またはインキュベートでき、そし
て標的レセプターを含有する得られた固体担体は、引き
続いて、カラムに導入される。他方、アビジン含有また
はストレプトアビジン含有固体担体は、まず、カラムに
導入でき、次いで、ビオチン化標的レセプターをカラム
に循環させて、カラムにて、標的レセプターを含有する
固体担体が形成される。これらの方法のいずれかもま
た、この標的レセプターを固体担体にカップリングす
る、他の任意の前述の手順と共に、使用できる。
【０１０１】固体担体材料は、任意の通常の手順を用い
て、このカラムに導入できる。典型的には、この固体担
体は、適切な希釈剤にスラリー化され、そして得られた
スラリーは、このカラムに圧密されるかまたはポンプ上
げされる。適切な希釈剤には、例えば、リン酸緩衝化生
理食塩水(PBS)溶液のような緩衝液(好ましくは、例え
ば、アジ化ナトリウムのような防腐剤を含有する)など
が挙げられる。
【０１０２】一般に、この標的レセプターの活性は、本
発明で使用するカラムのサイズを決定する。すなわち、
この標的レセプターが、単位カラム容量につき、より高
い活性を有するときには、より小さいカラム容量が使用
できる。典型的には、本発明で使用するカラムは、約10
μm〜約4.6 mmの範囲の内径(i.d.)を有する。好ましく
は、カラムの内径は、約100μm〜約250μmの範囲であ
る。カラムは、典型的には、その長さが約１cm〜約30c
m、好ましくは、約２cm〜約20cmの範囲である。好まし
くは、カラムは、カラム１個あたり、約１pmol〜約10nm
olの標的レセプター活性部位、さらに好ましくは、カラ
ム１個あたり、約10pmol〜約250pmolの標的レセプター
活性部位を含有する。
【０１０３】インジケーター化合物を使用するなら、カ
ラムの長さおよびそのi.d.はまた、インジケーター化合
物のＫdに依存する(すなわち、インジケーターが、標的
レセプターに対してより高い親和性を有するときには、
より小さいカラムが使用できる)。好ましくは、インジ
ケーターを使用するとき、カラムの長さおよびi.d.は、
インジケーター化合物が空隙容量後に測定可能な量を溶
出するように、選択される。
【０１０４】本発明で使用するカラムの本体は、いずれ
の通常のカラム本体材料から構成してもよく、これに
は、例えば、ポリ(エーテルエーテルケトン)(PEEK)、融
合シリカ、シリコンマイクロチップ、ステンレス鋼、ナ
イロン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン(T
eflon)などが含まれる。好ましくは、カラム本体は、ポ
リ(エーテルエーテルケトン)から構成される。
【０１０５】標的レセプターを含む固体担体を、カラム
に導入するかまたはカラム内で形成した後、カラムは、
典型的には、適切な希釈剤でフラッシュされて、任意の
非結合標的レセプターまたは不純物が除去される。カラ
ムをフラッシュするのに適切な希釈剤には、例えば、リ
ン酸塩緩衝化生理食塩水、TRIS緩衝液などが挙げられ
る。望ましいなら、非結合標的レセプターまたは不純物
の除去を促進するために、この緩衝液には、洗浄剤を含
有させてもよい。
【０１０６】カラムをフラッシュした後、カラムは、典
型的には、前端クロマトグラフィーに適切で質量分析と
適合する緩衝液を用いて、平衡化される。質量分析に使
用するには、一般に、揮発性緩衝液が好ましい。前端ク
ロマトグラフィーのためには、緩衝液は、典型的には、
レセプター−リガンドの相互作用を促進するように、選
択される。FC-MSで使用するのに適切な緩衝液には、例
えば、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウムなどが挙げ
られる。
【０１０７】カラムの平衡化に続いて、化合物ライブラ
リは、次いで、連続的に、前端クロマトグラフィー条件
下にて、カラムに適用される。典型的には、化合物ライ
ブラリは、カラムに適用するとき、適切な希釈剤中の、
ライブラリメンバーまたは推定リガンドの溶液を含有す
る。典型的には、希釈剤は、カラムを平衡化するのに使
用する緩衝溶液である。一般に、希釈剤中のライブラリ
メンバーの濃度は、約0.01μM〜約50μMの範囲である。
好ましくは、ライブラリメンバーの濃度は、約0.1μM〜
約10μMの範囲である。
【０１０８】前端クロマトグラフィーを行なうプロセス
は、当該技術分野で周知である。例えば、K.-I. Kasai
ら、Journal of Chromatography 1986、376、33-47；D.
S. Hageら、Journal of Chromatography B、1997、66
9、449-525およびそれらで引用された参考文献を参照せ
よ。これらの参考文献の開示は、その全体として本明細
書中で参考として援用される。典型的には、化合物ライ
ブラリは、標的レセプターを含むカラムに、連続的に適
用または注入される。これらの条件下では、標的レセプ
ターは、化合物ライブラリの各メンバーに、連続的に接
触または挑戦される。カラムは、化合物ライブラリをカ
ラムに連続的に適用することにより、動的平衡に導かれ
る。標的レセプターに対して異なる結合定数を有するラ
イブラリメンバーは、このカラムにて、異なる破過時間
またはホールドアップ容量を示す。すなわち、標的レセ
プターに対する高い親和性を有するこれらのメンバー
は、それらが、初期注入濃度でカラムから溶出するかそ
れを破過するまでに、カラムでの長い破過時間または高
いホールドアップ容量を有する。帯状(zonal)クロマト
グラフィー法と異なり、前端クロマトグラフィーを用い
ると、ライブラリメンバーの物理的な分離は起こらな
い。
【０１０９】前端クロマトグラフィー中では、カラム
は、典型的には、約０℃〜約90℃、好ましくは、約４℃
〜約60℃、さらに好ましくは、約20℃〜約40℃の範囲の
温度にされる。
【０１１０】リガンドが、標的レセプターに対して非常
に高い親和性を有するとき、カラムは、FC-MS分析を行
なう前に、化合物ライブラリであらかじめ平衡化するの
が望ましい。カラムが平衡に到達することが可能になる
のに充分な期間、すなわち、約0.25時間〜24時間にわた
って、カラムに化合物ライブラリを注入するか、または
カラムに化合物ライブラリを注入し、その流れを止め、
そしてこの分析を行なう前に、１日までの期間にわたっ
て、系を平衡化するかのいずれかにより、カラムは、あ
らかじめ平衡化できる。望ましいなら、一連のストップ
−フローサイクルもまた、行なうことができる。
【０１１１】本発明の方法では、流出液を分析するため
に、カラムには、質量分析計が連結される。質量分析計
は、流出液中に存在するライブラリメンバーの検出およ
び同定の両方を可能にするので、本発明で特に有用であ
る。このことに関して、質量分析計は、ライブラリの溶
出メンバーを、それらの質量/電荷比に基づいて、同定
する。
【０１１２】カラムからの流出液を質量分析により分析
する前に、流出液は、必要に応じて、補充希釈剤または
「補充流れ」で希釈され、合わせた流れは、例えば、エ
レクトロスプレー質量分析計に導かれる。典型的には、
補充希釈剤は、主要量の有機溶媒および少量の水性緩衝
液を含有する。有機溶媒は、安定で効果的なエレクトロ
スプレーを促進するように、選択される。この補充希釈
剤で使用するのに適切な代表的な有機溶媒には、例え
ば、アセトニトリル、メタノール、イソプロパノールな
どが挙げられる。好ましい有機溶媒は、アセトニトリル
である。典型的には、使用する補充希釈剤の量は、流出
液と補充希釈剤とを合わせた流速が約100μL/分未満と
なるように調節される。好ましくは、質量分析計に入る
合計流速は、約100 nL/分〜約20μL/分の範囲である。
【０１１３】質量分析計を用いて流出液を分析する方法
は、当該技術分野で周知である。本発明では、溶液中に
存在する成分を直接的または間接的に分析できるいずれ
のタイプの質量分析計も使用でき、これには、例えば、
エレクトロスプレー質量分析計(ES-MS)、大気圧化学電
離(APCI)、膜導入質量分析(MIMS)、連続流高速原子衝撃
(cf-FAB)、熱噴霧法、粒子ビーム、移動ベルト界面など
が含まれる。エレクトロスプレー質量分析は、特に好ま
しい。エレクトロスプレー質量分析を行なう装置および
方法は、例えば、S.J. Gaskell、「Electrospray：Prin
ciples and Practice」、J. Mass. Spectrom. 1997、3
2、677-688およびそれらで引用した参考文献に記載され
ている。この質量分析計は、いずれのタイプ(すなわ
ち、走査型またはダイナミック型)でもあり得、これに
は、例えば、四極子、飛行時間、イオントラップ、FTIC
Rなどが含まれる。
【０１１４】典型的には、質量分析計のパラメーター
は、溶出する化合物に対して最も高い感度を与えるよう
に、設定される。一般に、エレクトロスプレー質量分析
計を使用するとき、このような調整には、例えば、噴霧
圧、乾燥ガス流速、イオン伝達およびエレクトロスプレ
ー針位置の最適化が含まれる。例えば、噴霧圧は、典型
的には、約０psi〜約60psiの範囲であり、そして乾燥ガ
ス流速は、約０L/分〜約50L/分の範囲である。全イオン
クロマトグラムは、典型的には、リアルタイムで測定さ
れ記録される。カラムの大きさ、化合物ライブラリの濃
度、および流速は、一般に、その操作時間を決定する。
典型的な操作時間は、約１分間〜約60分間の範囲であ
る。
【０１１５】前端クロマトグラフィーが完結すると、カ
ラムは、典型的には、競合リガンドと共にまたはそれな
しで、大容量の結合緩衝液で洗浄することにより、再生
される。このことに関して、本発明の方法の特定の利点
は、操作のいずれの時点でも、標的レセプターを変性す
る必要がないことにある。従って、カラムは、一般に、
識別可能な活性損失または標的レセプターの浸出なし
に、何回も再使用できる。
【０１１６】前端クロマトグラフィーを行なうための適
切な装置は、弁理士処理番号026579-175として本願と同
日に出願された「Apparatus for Screening Compound L
ibraries」の表題の米国特許出願第 ／ , 号に記
載されており、この出願の開示内容は、その全体につい
て、本明細書中で参考として援用されている。本発明の
スクリーニング方法を行なうための代表的な装置を、図
１に例示する。図１に示すように、緩衝溶液を含む第一
レザバ１および化合物ライブラリの緩衝溶液を含む第二
レザバ２は、管３を介して、バルブ４に連結されてい
る。図１では、レザバ１および２はシリンジであるが、
任意の同様のレザバも使用できる。バルブ４は、レザバ
１または２からの溶液を、廃物容器５またはカラム６の
流入末端に導くことを可能にする。カラム６は、固相担
体、カラム壁に結合しているかまたはその他の方法でカ
ラム内に保持された標的レセプターを含有する。カラム
６の流出末端は、混合ティー７に連結され、これはま
た、管９を介して、レザバ８(補充希釈剤を含有する)に
連結されている。カラム６からの流出液は、混合ティー
７にて、レザバ８からの補充希釈剤と混合されて、その
流出物は、管10を介して、エレクトロスプレー質量分析
計11に導かれる。レザバ１、２および８からの流れを制
御するために、プランジャー12には、例えば、ポンプを
介して、圧力が適用される。
【０１１７】この他の実施態様では、本発明は、ライブ
ラリの任意のメンバーが、あらかじめ選択したインジケ
ーター化合物またはインジケーター化合物の混合物の結
合を妨害する標的レセプターに対して親和性を有するか
どうかを決定するために、化合物ライブラリをスクリー
ニングする方法を提供する。この実施態様では、カラム
を化合物ライブラリで平衡化した後、標的レセプターに
対して公知の親和性を有するインジケーター化合物の破
過時間が決定され、そして化合物ライブラリの存在しな
い状態でのインジケーター化合物に対する破過時間と比
較される。インジケーター化合物が、化合物ライブラリ
との平衡後に、より短い破過時間を有するなら、化合物
ライブラリは、標的リガンドに対してインジケーター化
合物よりも高い全体親和性を有する１種またはそれ以上
のリガンドを含有する。インジケーター化合物は、カラ
ムでの比較的に短い破過時間を有するように選択できる
ので、この実施態様の非常に有利な点は、化合物ライブ
ラリが急速に、例えば、５分間未満でスクリーニングさ
れて、標的レセプターに対して所定の最小レベルの親和
性を有するライブラリが同定できることにある。ライブ
ラリを、この標的レセプターに対して所定の最小レベル
の親和性を有するものとして同定するとき、ライブラリ
は、FC-MSを用いてさらに分析することができ、そのこ
とにより標的レセプターに結合するリガンドが同定でき
る。
【０１１８】インジケーター化合物を使用することの１
つの利点は、インジケーター化合物しかモニターする必
要がないので、各ライブラリのスクリーニング時間が著
しく短縮されることである。さらに、インジケーター化
合物は、目的の活性部位にて、標的レセプターと結合す
るので、インジケーターの破過時間の変化は、ライブラ
リのメンバーがインジケーター化合物と同じ活性部位に
結合するときにのみ、認められる。従って、標的レセプ
ターへのライブラリの非特異的結合は、間違った指示を
与えない。
【０１１９】本発明のこの実施態様で使用するインジケ
ーター化合物は、典型的には、標的レセプターに対して
比較的に弱い親和性を有するように、選択される。これ
により、インジケーター化合物は、カラムを急速に溶出
するかまたは破過でき、それにより、この流出液をモニ
ターするのに必要な時間が短縮される。化合物ライブラ
リなしで、カラムの破過時間が約５分間未満のインジケ
ーター化合物が好ましい。他方、標的レセプターに対し
て強い親和性を有するインジケーターが使用でき、それ
により、より小さいカラムが使用可能となる。強い親和
性を有するインジケーター化合物を使用する場合、化合
物ライブラリは、典型的には、より高い濃度で、カラム
に適用される。化合物ライブラリなしでのインジケータ
ー化合物のカラムでの破過時間は、本明細書で記述のFC
-MS法を用いて決定される。インジケーター化合物の標
的レセプターに対する親和性は、通常の方法(例えば、
微小熱量測定など)を用いて、または本発明のFC-MS法を
用いて、決定できる。好ましくは、インジケーター化合
物はまた、化合物ライブラリのメンバーと比較して、独
特の質量を有し、その結果、インジケーター化合物は、
質量分析により明らかに同定することができる。一般
に、インジケーター化合物および四極子質量分析計を用
いると、インジケーター化合物の質量だけがモニターさ
れて、感度が良好となる。
【０１２０】特定の標的レセプターと共に使用するのに
適切なインジケーター化合物の代表的な例には、例え
ば、Salmonella paratyphi B O-抗原の3,6-ジデオキシ-
D-ガラクトース(アベクオース)エピトープを認識するモ
ノクローナル抗体と共に使用するためのαAbe(1-3)αTa
l-OCH3(Ｋd＝0.2 mM)、L-セレクチンと共に使用するた
めのフィチン酸(phytic acid)(Ｋd＝１μM)などが包含
される。さらに、１種より多いインジケーター化合物を
使用してもよい。インジケーターはまた、他の分子とカ
ップリングまたは複合体化(conjugate)でき、あるいは
その検出を促進する原子または同位体を含有していても
よい。例えば、インジケーター化合物は、質量スペクト
ルが44単位づつ異なるピークを含み、それにより、イン
ジケーター化合物の検出を促進するように、ポリエチレ
ングリコール(PEG)と複合体化できる。
【０１２１】インジケーター化合物を用いると、その破
過時間は、まず、このインジケーター化合物を、前端ク
ロマトグラフィー条件下にて、標的レセプターを含むカ
ラムに適用することにより、決定される。このカラム
は、次いで、典型的には、スクリーニングする化合物ラ
イブラリで平衡化される。一般に、この化合物ライブラ
リは、このライブラリのメンバーの全てをこのカラムに
破過させるのに充分な時間にわたって、このカラムに適
用されるかまたは注入される。ある場合、例えば、非常
に強い結合リガンドが存在する場合には、このライブラ
リの全てのメンバーが平衡に達するわけではない。この
期間中には、その溶出液は、分析のために、質量分析計
に供給でき、または再使用または廃棄用に回収できる。
一旦、このカラムがこの化合物ライブラリで平衡化(ま
たは部分平衡化)されると、この化合物ライブラリおよ
びインジケーター化合物を含有する混合物は、本明細書
で記述の前端クロマトグラフィー操作を用いて、このカ
ラムに適用または注入される。好ましくは、このインジ
ケーター化合物は、この混合物中にて、約１ nM〜約10
μMの範囲の量で、さらに好ましくは、約10 nM〜約100
nMの範囲の量で存在する。このカラムからの溶出液は、
このインジケーター化合物のこの化合物ライブラリ平衡
カラムへの破過時間を決定するために分析され、この時
間は、このインジケーター化合物の所定の破過時間と比
較されて、この化合物ライブラリが、このインジケータ
ー化合物と比較して、この標的レセプターに対してより
高い親和性を有するかどうかが確認される。
【０１２２】他方、このカラムをこの化合物ライブラリ
で平衡化した後、このインジケーター化合物は、単独
で、このカラムに適用または注入できる。この方法によ
れば、非常に強く結合したリガンドまたは緩慢な排出速
度のものを検出することが可能となる。
【０１２３】このインジケーター化合物を質量分析を用
いて検出することに加えて、他の検出方法を使用するこ
ともまた、考慮される。例えば、インジケーター化合物
は、このカラムからの溶出液中で、例えば、蛍光、赤外
吸収、UV−可視吸収、核磁気共鳴(NMR)、原子スペクト
ル(すなわち、AAS、ICP-OESなど)、フローサイトメトリ
ーなどを用いて、検出できる。
【０１２４】本発明の装置によれば、各カラムを断続的
にモニターする単一の質量分析計を用いて、複数のFC-M
S分析を同時に行なうことが可能となる。「捕捉および
解放」方法(これは、典型的には、各リガンドに対する
溶出ピークまたは「スパイク」を提供する)と異なり、F
C-MSは、絶え間ない溶出液のモニターを必要としない。
これは、一旦、ライブラリメンバーがこのカラムを破過
すると、そのメンバーは、引き続いて、この溶出液中に
存在し、そして質量分析計により検出できるからであ
る。従って、各カラムを断続的にモニターする単一の質
量分析計を用いて、複数のFC-MS分析を同時に行なうこ
とができる。例えば、本発明の方法を用いると、少なく
とも約100個のカラムを同時に操作できる。
【０１２５】複数のカラムを使用すると、各カラムは、
典型的には、次のカラムへと切り替える前に、短時間に
わたってモニターされる。例えば、四極子質量分析計を
用いると、各カラムは、典型的には、次のカラムに切り
替える前に、約0.5秒間〜約10秒間、好ましくは、約１
秒間〜約５秒間にわたって、順次、モニターされる。各
カラムからの溶出液は、質量分析計を用いて、本明細書
で記述のように分析される。一般に、複数のカラムから
得た全てのデータを収集するには、単一の操作ファイル
が使用され、それにより、複合全イオンクロマトグラム
が作成される。引き続いて、カラムの切り替えと質量分
析データの獲得とを同時に行なうことにより、各カラム
について、別の全イオンクロマトグラムが再作成され
る。
【０１２６】好ましい実施態様では、各カラムは、この
カラム溶出液のエレクトロスプレー質量分析計への注入
のために、個々のエレクトロスプレー針を有する。速く
反復的な針前進シーケンスを可能にする複数のエレクト
ロスプレー針のいずれかの幾何学的な配列が使用でき
る。複数の溶出液をエレクトロスプレー質量分析計に注
入するために適当な装置は、弁理士処理番号026579-176
として本願と同日に出願された「Device for Delivery
of Multiple Liquid Sample Streams to a MassSpectro
meter」の表題の米国特許出願第 ／ , 号に記載
されており、この出願の開示内容は、その全体が本明細
書中で参考として援用されている。他方、線形移動列の
エレクトロスプレー針(噴霧器)などを使用してもよい。
例えば、Q.Xueら、Anal. Chem. 1997、69、426-430およ
びそこに引用されている参考文献を参照せよ。これらの
開示内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０１２７】複数のカラムを用いて化合物ライブラリを
スクリーニングする代表的な装置を、図２に例示する。
図２に示すように、複数のカラム13の各カラムは、管14
および混合ティー15を介して、化合物ライブラリの結合
緩衝溶液を含む第一レザバ16および結合緩衝液を含む第
二レザバ17に連結されている。図２では、レザバ16およ
び17は注射器であるが、いずれの類似のレザバも使用で
きる。各カラム13は、固相担体に結合した標的レセプタ
ーを含有する。レザバ17中の緩衝溶液は、この化合物ラ
イブラリの導入前後に、カラム13を洗浄するために使用
される。各カラム13の流出末端は、混合ティー18に連結
され、これはまた、管20を介して、レザバ19(補充希釈
剤を含有する)に連結されている。各カラム13からの溶
出液は、混合ティー18にて、レザバ19からの補充希釈剤
と混合されて、その流出物は、管20およびバルブ21を経
て、電気動作マルチポート選択バルブ23を介して、エレ
クトロスプレー質量分析計22に導かれ、または廃物/回
収容器24に導かれる。レザバ16、17および19からの流れ
を制御するために、プランジャー25には、例えば、ポン
プを介して、圧力が適用される。
【０１２８】他方、図３に例示する他の実施態様では、
混合ティー18からの流出物は、質量分析のために、管20
を介して、個々のエレクトロスプレー針26へと導くこと
ができる。
【０１２９】インジケーター化合物を用いて化合物ライ
ブラリを評価するために、複数のカラムを使用すると、
各カラムの操作時間が比較的に短い(すなわち、１カラ
ムあたり、典型的には、約３分間)ので、各カラムは、
所望であれば、順次操作できる。インジケーター化合物
を用いると、複数のカラムの連続操作は、それによって
このインジケーター化合物の保持時間をさらに正確に決
定できるので、有利であり得る。
【０１３０】複数のカラムを用いて、インジケーター化
合物と共に、化合物ライブラリを順次スクリーニングす
る代表的な装置を、図４に例示する。図４で示すよう
に、複数のレザバ27(例えば、注射器)は、クランプ28
で、一定位置に保持されている。各レザバ27は、適当な
希釈剤中の化合物ライブラリおよびインジケーター化合
物の混合物(または、代わりに、単に、このインジケー
ター)を含有する。各レザバ27の末端は、管29を介し
て、固相担体に結合した標的レセプターを含有するカラ
ム30の流入末端に連結されている。各カラム30の流入末
端は、管31を介して、電気動作マルチポート流れ選択バ
ルブ32に連結され、これは、カラム30からの溶出液の流
れを制御する。バルブ32を用いると、これらのカラムか
らの溶出液は、管34を介して、廃物容器33に導かれる
か、または管36を介して、混合ティー35に導かれ得る。
混合ティー35はまた、管37を介して、補充希釈剤を含有
するレザバ36に連結されている。各カラム30からの溶出
液は、混合ティー35にて、レザバ36からの補充希釈剤と
混合され、その流出物は、管38を介して、エレクトロス
プレー質量分析計39に導かれる。レザバ27からカラム30
への流れを制御するために、孤立ブロック40を使用して
もよい。例えば、ポンプを介して、孤立ブロック40に圧
力を適用すると、各レザバ27のプランジャー41は、個々
に、順次低下して、それにより、このレザバの内容物
は、管29を介して、対応するカラム30へと注入される。
各カラム30から発生する溶出液は、順次、分析用の質量
分析計39へと導かれる。
【０１３１】本発明の方法はまた、化合物ライブラリの
一定の個々のメンバーの絶対親和性または解離定数Ｋd
を容易に決定できる。このことに関して、この標的レセ
プターに対して親和性を有するリガンドは、以下の等式
に従って、その濃度およびＫ d値に関連した容量(すなわ
ち、破過時間)で、このカラムを破過する：
【０１３２】
【数１】 ここで、Ｂtは、このカラムの動的結合能を表わす；
[Ｘ]0は、リガンドの化合物ライブラリへの注入濃度で
ある；Ｋdは、リガンドの解離定数である；Ｖ0は、空隙
容量である；そしてＶxは、リガンドの破過に対応する
前面の中間点での容量を表わす。この簡単な等式は、一
旦、Ｂtおよびリガンド濃度が既知となると、そのＶx−
Ｖ0を１回測定することから、リガンドの解離定数が決
定できることを意味している。
【０１３３】Ｂtを決定するために、代表的な化合物(例
えば、化合物Ｘ)は、種々の濃度で、このカラムに注入
され、対応するＶx−Ｖ0値が測定される。([Ｘ](Ｖx−
Ｖ0)) -1対[Ｘ]-1のプロットが作成され、ここで、y−切
片は、このカラムの動的結合能(Ｂt)を意味する(Linewe
aver-Burkプロットと類似している)。
【０１３４】一旦、このカラムの動的結合能が決定され
ると、この化合物ライブラリの個々のメンバーの解離定
数は、１回のFC-MS操作から決定できる。例えば、化合
物に対するＫd(ここで、[Ｘ]＜＜(Ｋd)x)は、Ｂt/(Ｖx
−Ｖ0)から容易に決定される。このライブラリのうち解
離定数の低いメンバーについては、Ｋdを決定するに
は、それらの濃度を知るか、またはこの化合物ライブラ
リを高い希釈割合で注入する必要がある。
【０１３５】以下の実施例は、本発明を例示するために
提供されており、いずれの様式でも、本発明の範囲を限
定するものとしては解釈されない。他に述べられていな
ければ、全ての温度は摂氏である。
【０１３６】
【実施例】以下の実施例では、以下の略語は、以下の意
味を有する。略語を定義していないなら、それは、一般
に受け入れられている意味を有する。
【０１３７】Ｂt＝動的結合能 ℃＝摂氏 cm＝センチメートル eq.＝当量 FAB＝高速原子衝撃 FC＝前端クロマトグラフィー ｇ＝グラム Ｋd＝解離定数 Ｌ＝リットル MALDI＝マトリックス補助レーザー脱着/イオン化 meq.＝ミリ当量 mg＝ミリグラム mL＝ミリリットル mM＝ミリモーラー mmol＝ミリモル MS＝質量分析 m/z＝質量電荷比 N＝規定度 PBS＝リン酸塩緩衝化生理食塩水 PEEK＝ポリ(エーテルエーテルケトン) pmol＝ピコモル TIC＝全イオンクロマトグラム μg＝マイクログラム μL＝マイクロリットル μm＝マイクロメートル μM＝マイクロモーラー Ｖ0＝空隙容量。
【０１３８】（実施例１） FC-MSを用いたオリゴ糖ラ
イブラリのスクリーニング 本実施例では、６種のオリゴ糖の混合物を含有する化合
物ライブラリを、エレクトロスプレー質量分析計と組み
合わせた前端クロマトグラフィーを用いてスクリーニン
グして、モノクローナル抗体(これは、Salmonella para
typhi B O-抗原の3,6-ジデオキシ-D-ガラクトース(アベ
クオース)エピトープを認識する)に対するオリゴ糖の相
対親和性を決定した。
【０１３９】この化合物ライブラリは、以下の６種のオ
リゴ糖からなっていた：αGalNAc(1-->3)βGal-OGr(化
合物１)；αGal(1-->3)[αFuc(1-->2)]βGal-OGr(化合
物２)；αMan(1-->3)[αMan(1-->6)]βMan-OGr(化合物
３)；αAbe(1-->3)αTal-OCH3(化合物４)；αGal(1-->
2)[αAbe(1-->3)]αMan-OCH3(化合物５)；およびαGlc
(1-->4)βGlc(1-->4)αGal(1-->2)-[αAbe(1-->3)]αMa
n(1-->3)αGlc(1-->4)βGlc-OCH3(化合物６)、ここで、
GrはO(CH2)8CO2CH3である。化合物１〜３は、それぞ
れ、1987年12月７日にR.U. Lemieuxらに発行された米国
特許第4,362,720号；1979年１月30日にR.U. Lemieuxら
に発行された米国特許第4,137,401号；およびK.J. Kaur
らの「Use of N-Acetylglucosaminyltransferases I ab
d II in the Preparative Synthesis of Oligosacchari
des」、Carbohydr. Res. 1991、210、145-153に記載の
手順を用いて得られ、これらの開示内容は、それらの全
体が本明細書中で参考として援用されている。化合物４
〜６は、D.R. Bundleら、「Modulation of Antibody Af
finity by Synthetic Modifications of the Most Expo
sedPyranose Residue of A Trisaccharide Epitope」、
Bioorg. Med. Chem. 1994、2、1221-1229に記載の手順
を用いて得られ、その開示内容は、その全体が本明細書
中で参考として援用されている。化合物１〜３は、この
抗体に対する特異性がないことが知られている。他方、
化合物４〜６は、認識のための最小必要条件(アベクオ
ース)を含み、この抗体に対する一定範囲に及ぶ親和性
を有する。化合物４〜６に対するＫd値を、滴定ミクロ
熱量測定により測定し、以下の表１に示す。
【０１４０】この実験で使用するモノクローナル抗体
は、D.R. Bundleら、「Molecular Recognition of a Sa
lmonella Trisaccharide Epitope by Monoclonal Antib
ody Se155.4」 Biochem. 1994、33、5172-5182に記載の
ようにして、生成した。この抗体(0.5 mg)を、長鎖スペ
ーサーアームを含むビオチン試薬(NHS-LCビオチン、Pie
rce)でビオチン化した。ビオチン取込みの程度は、マト
リックス補助レーザー脱着/イオン化によりモニター
し、その反応は、14ビオチン/IgG(平均)で停止した。次
いで、このビオチン化抗体を、重炭酸塩緩衝液(pH 8.5)
中にて１時間にわたり、Ultralink固定化アビジン(Pier
ce、Cat. No. 53119)25μLでインキュベートすることに
より、ビーズ担体と結合させた。これらのビーズを、次
いで、この重炭酸塩緩衝液で充分に洗浄した。UV定量化
により、約45μg抗体/25μLビーズの固定化が得られた
ことが明らかとなった。このビーズを、次いで、内径50
0μm×11.5 cmのポリ(エーテルエーテルケトン)(PEEK)
カラム本体(約23μLカラム容量)にスラリー充填した。
【０１４１】この実験では、混合ティーは、カラム溶離
液および有機補充流れ用のカラム末端固定室および混合
室として、二重の役割を果たした。このカラムを、次い
で、エレクトロスプレー質量分析計(Hewlett-Packardシ
リーズ1100 MSD、単一四極子)に直接連結した。
【０１４２】前端クロマトグラフィーモードで操作する
ために、カラムは、まず、酢酸アンモニウム緩衝液(NH4
OAc、２ mM、pH 6.7)でフラッシュした。フラッシュ
後、この流れを、酢酸アンモニウム緩衝液中に６種のオ
リゴ糖(それぞれ、１μMで存在する)の混合物を含有す
る第二溶液に切り替えた。全ての溶液は、８μL/分/注
射器(１cc注射器)の流速で、多注射器ポンプ(PHD 200、
Harvard Apparatus)を用いて同時に注入した。流れの切
り替えには、Rheodyneバルブ(Model 9725)を使用した。
このカラム溶出液を、このティーにて、この補充流れ
(アセトニトリル中の10％２mM NH4OAc緩衝液)と合わせ
て、16μL/分の流速で質量分析計に入れた。
【０１４３】この混合物を分析するために、この質量分
析計を、m/z 100からm/z 1500まで走査した。陽イオン
検出の走査モードで、データを集めた。図５Ａに示すよ
うに、50分間の操作時間から、全イオンクロマトグラム
(TIC)を作成した。これは、僅か400 pmolの各オリゴ糖
の消費を表わしていた。次いで、特定のm/z値における
ピークを、このTICを生じる質量スペクトルの分析によ
り同定し、図５Ｂに示したTICから、６個の化合物の全
ての選択イオンクロマトグラムを再作成した。化合物１
〜３は、実線で示したように、このカラムを同時に破過
した。次いで、図５Ｃ、５Ｄおよび５Ｅに示したTIC
(I、IIおよびIIIの時点)の時間部分から、質量スペクト
ルを作成した。これらの質量スペクトルは、種々のオリ
ゴ糖のこのカラムを通しての進行を図示している。化合
物４の破過開始を表わすスペクトルは、示していない。
【０１４４】上で述べたように、この標的レセプターに
対して親和性がないリガンドは、その空隙容量(Ｖ0)で
破過するのに対して、この標的レセプターに対して親和
性がある化合物は、以下の等式に従って、その濃度およ
びＫd値に関連した容量で、遅れて破過する：
【０１４５】
【数２】 ここで、Ｂtは、このカラムの動的結合能を表わす；
[Ｘ]0は、リガンドの化合物ライブラリへの注入濃度で
ある；Ｋdは、リガンドの解離定数である；Ｖ0は、空隙
容量である；そしてＶxは、リガンドの破過に対応する
前面の中間点での容量を表わす。
【０１４６】Ｂtを決定するために、化合物５を、種々
の濃度でこのカラムに注入し、対応するＶ−Ｖ0値を測
定した。([Ａ]0(Ｖ−Ｖ0))-1対[Ａ]0 -1のプロットが作
成され、ここで、Ａは、図６で示すように、化合物５で
ある。y−切片は、520 pmolのＢtを示した。各抗体分子
は、２個の結合部位を有し、従って、これは、タンパク
質260 pmolの活性能に相当する(これは、結合したタン
パク質の全量の93％を表わす)。そのｘ切片は、化合物
５に対する11.2μMのＫdを意味し、これは、表１で示す
ミクロ熱量測定により決定した値に匹敵する。
【０１４７】混合物のスクリーニング前に、このカラム
の能力を知ることにより、単一の前端クロマトグラムか
ら、解離定数が決定できる。[Ｘ]＜＜(Ｋd)xの化合物に
ついては、そのＫdは、Ｂt/(Ｖ−Ｖ0)から容易に決定で
きる。例えば、化合物４は、図５Ｂのクロマトグラムか
ら決定したように、0.2 mMのＫdを有することが明らか
となった。低い解離定数の化合物は、そのＫdを決定す
るためには、その濃度を知るかまたはこの混合物を高い
希釈割合で注入する必要がある。化合物６のＫ dは、１
μMの濃度では、同じクロマトグラムから、1.5μMであ
ることが分かった。
【０１４８】このカラムを、大量の結合緩衝液で洗浄す
ることにより、系外で再生した。本実施例で使用したカ
ラムを、150回の操作にかけたところ、活性の損失また
は抗体の浸出は認められなかった。
【０１４９】この実験から得た結果を、表１に示す。
【０１５０】
【表１】 表１の結果は、化合物ライブラリの種々の推定リガンド
の標的レセプターに対する親和性がこのライブラリの他
の推定リガンドと比較して決定できること、そして推定
リガンドおよび標的レセプターに対する解離定数Ｋdが
決定できることを立証している。これらの結果は、さら
に、文献Ｋd値とFC-MS操作によって作成したＫd値との
間に、適当な相関があることを立証している。
【０１５１】（実施例２） FC-MSおよびインジケータ
ー化合物を用いたオリゴ糖ライブラリのスクリーニング 本実施例では、化合物ライブラリをスクリーニングする
ためのインジケーター化合物の使用を示す。本実施例で
使用した抗体は、実施例１で使用したものと同じ、すな
わち、Salmonella paratyphi B O-抗原の3,6-ジデオキ
シ-D-ガラクトース(アベクオース)エピトープを認識す
るモノクローナル抗体であった。そのカラムもまた、実
施例１のカラムと実質的に同じであり、本明細書で記述
のように調製しそして操作した。
【０１５２】この実験では、３種の溶液を調製した。溶
液Ａは、２ mMのNH4OAc中に以下の４種のオリゴ糖を含
有していた：αGalNAc(1-->3)βGal-OGr(化合物１)；α
Gal(1-->3)[αFuc(1-->2)]βGal-OGr(化合物２)；αMan
(1-->3)[αMan(1-->6)]βMan-OGr(化合物３)；αAbe(1-
->3)αTal-OCH3(化合物４)、ここで、GrはO(CH2)8CO2CH
3である。溶液Ｂは、２ mMのNH4OAc中にαGal(1-->2)
[αAbe(1-->3)]αMan-OCH3(化合物５)を含有しており、
そして溶液Ｃは、２ mMのNH4OAc中に化合物１〜５を含
有していた。全ての溶液中では、化合物１、２および３
は、１μMで存在しており、化合物４は、0.16μMで存在
しており、そして化合物５は、15μMで存在していた。
本実施例では、化合物４は、インジケーター化合物とし
て使用し、そして化合物５は、化合物ライブラリの１メ
ンバーを代表するように使用した。残りの化合物は、Ｖ
0を決定するために使用した。
【０１５３】化合物１〜４を含有する溶液Ａを、実施例
１に記述したカラムに注入した。この溶出液をモニター
するために、四極子質量分析計を使用した。この質量分
析計は、各化合物の(M＋Na)+ピークにて、選択イオンモ
ニター(SIM)モードで操作した。図５Ａは、化合物１〜
４(すなわち、溶液Ａ)の注入から作成した選択イオンク
ロマトグラムを示す。化合物４の破過容量は、3.0±0.1
μLであった。このカラムを、結合緩衝液(すなわち、２
mMのNH4OAc)で約10分間フラッシュすることにより再生
し、その時点で、化合物４の実質的に全ての痕跡を取り
除いた。
【０１５４】図１の装置を用いて、溶液Ｂ(化合物５)お
よび溶液Ｃ(化合物１〜５)を、別個の注射器に充填し
た。化合物５の動的平衡が達成されるまで、溶液Ｂをこ
のカラムに注入した。この時点で、この流れを、溶液Ｃ
を保持する注射器に切り替え、四極子質量分析計を用い
て、図７Ｂの選択イオンクロマトグラムを作成した。図
７Ｂに示すように、このカラムを化合物５であらかじめ
平衡化することにより、インジケーター化合物４の破過
容量において、(1.1±0.3μlまでの)測定可能なシフト
が生じる。このことは、化合物５が、この抗体に対し
て、インジケーター化合物４よりも低いＫdを有するリ
ガンドであるという事実と一致している(上記表１を参
照)。従って、このインジケーター化合物を単にモニタ
ーすることにより、この代表的なライブラリは、この標
的レセプターに対して高い親和性を有する化合物を含む
という事実が、容易に明らかとなる。
【０１５５】この実験でのインジケーター化合物(化合
物４)を、代表的なライブラリ(化合物５)の溶液に添加
したが、このことは必ずしも必要ではないことを記して
おく。このライブラリ(溶液Ｂ)が、強く保持された化合
物(すなわち、低いＫdすなわち排出速度)を含む状況で
は、溶液Ｃを溶液Ａで置き換えてもよい(すなわち、こ
のインジケーターを、このライブラリと混合する必要は
ない)。
【０１５６】（実施例３） FC-MSを用いたオリゴ糖ラ
イブラリのスクリーニング 本実施例では、４種のオリゴ糖の混合物を含む化合物ラ
イブラリを、エレクトロスプレー質量分析計と組み合わ
せた前端クロマトグラフィーを用いてスクリーニングし
て、これらのオリゴ糖のコレラ毒素Ｂサブユニットに対
する相対親和性を決定した。
【０１５７】この化合物ライブラリは、以下の４種のオ
リゴ糖からなっていた：αGalNAc(1-->3)βGal-OGr(化
合物１)；αGal(1-->3)[αFuc(1-->2)]βGal-OGr(化合
物２)；αMan(1-->3)[αMan(1-->6)]βMan-OGr(化合物
３)；およびGM1オリゴ糖(化合物７、ここで、GrはO(C
H2)8CO2CH3である)。化合物７は、コレラ毒素Ｂサブユ
ニットに対する天然リガンドであり、A. Schonら、「Th
ermodynamics of Intersubunit Interactions in Chole
ra Toxin upon Binding to the Oligosaccharide Porti
on of Its Cell Surface Receptor, Ganglioside GM1」
Biochem. 1989、28、5019-5024に記述の操作を用いて
得、その開示内容は、その全体が本明細書中で参考とし
て援用されている。コレラ毒素Ｂサブユニットは、LIST
Biochemicals、Campbell、CAから得た。
【０１５８】0.01インチ(250μm)の内径のPEEK管の12 c
m部分から、カラムを作成した(約６μLのカラム容量)。
このカラムに、POROS 20固定化ストレプトアビジン粒子
(Perseptive Biosystems、Framingham、MAから入手でき
る)を充填した。
【０１５９】コレラ毒素Ｂサブユニット(五量体タンパ
ク質)をビオチン化して、MALDIで測定した約１個〜２個
のビオチン/モノマーを得た。このビオチン化タンパク
質の希釈溶液(４μM)を、結合したコレラ毒素Ｂサブユ
ニットの全量が、洗浄後、およそ200 pmol(UV定量によ
り決定した)になるように、あらかじめ充填したカラム
に注入した。
【０１６０】化合物１〜３および７を含有する溶液を調
製した。全ての化合物は、２ mM NH 4OAc(pH 6.9)中に２
μMで存在した。図１で示したものと類似の装置を用い
て、このカラムを、まず、結合緩衝液(２ mMのNH4OAc)
で平衡化した。次いで、化合物１〜３および７を含有す
る溶液を、８μL/分で、このカラムに注入した。その溶
出液を、典型的な補充流れ(アセトニトリル中の10％２m
M NH4OAc)と合わせて、エレクトロスプレー単一四極子
質量分析計に通した。負イオン検出を用いて、データを
走査モードで集めた。
【０１６１】全イオンクロマトグラムを作成し、続い
て、図８に示すように、化合物１〜３および７のそれぞ
れについて、選択イオンクロマトグラムを再構成した。
図８で例示したように、化合物１〜３は、この系の空隙
容量で破過した(約４分間×８μL/分＝32μL)のに対
し、化合物７(GM1オリゴ糖)は、約300μLで破過した。
それゆえ、GM1オリゴ糖(Ｋd＝100 nM)は、コレラ毒素Ｂ
サブユニットに対して、化合物１〜３よりも強い親和性
を有しており、化合物１〜３は、コレラ毒素Ｂサブユニ
ットに対して、ほとんどまたは全く親和性がない。
【０１６２】次いで、この結合緩衝液中にて、第二混合
物を調製し、類似の様式で、FC-MSにより分析した。こ
の混合物は、合成的に調製したGM1アナログ、すなわ
ち、βGal(1-->3)βGalNAc(1-->)-OCH2CH2O-(<--2)αNe
u5Ac(化合物８)を、不純形態(すなわち、未確認の中間
体および反応副生成物を含有する)で含有していた。化
合物８は、P. Fgediら, "A Novel Promoter for the Ef
ficient Construction of1,2-trans Linkages in Glyco
side Synthesis, Using Thioglycosides as Glycosyl D
onors" Carbohydr. Res. 1986, 149, C9-C12; A. Marra
ら, Stereoselective Synthesis of 2-Thioglycosides
of N-Acetylneuraminic Acid", Carbohydr.Res. 1989,
187. 35-42;および L. Layら, "Synthesis of the Prop
yl Glycoside of the Trisaccharide α-L-Fuc１p０-(1
-->2)-β-D-Gal１p０-(1-->3)-β-D-Gal１p０NAc. Comp
onents of a Tumor Antigen Recognized by the Antibo
dy Mbr1 " Helv. Chim. Acta. 1994, 77, 509-514; に
記載の方法により調製され、その開示内容は、その全体
が本明細書中で参考として援用されている。この混合物
を、このカラムに注入し、この質量分析計を、化合物３
および８を代表する負イオン上にて、選択イオンモニタ
ーモードで操作するように設定した。図９に示すように
これらのイオンについて、選択イオンクロマトグラムを
作成した。図９は、化合物３が、空隙容量(m/z 673.2)
で破過したことを示す。質量/電荷が717.2 uのイオンに
ついては、さらに複雑なパターンが認められた。これら
のイオンの一定の断片もまた、空隙容量(約25％)で破過
したのに対して、残りの75％は、著しく遅れて破過した
(約11分)。このツーフロントプロフィール(two-front p
rofile)は、コレラ毒素Ｂサブユニットに結合していな
い同質量不純物が、25％のレベルで存在していることを
示している。それゆえ、FC-MSは、同質量の非結合不純
物の存在を確認できる。これらの不純物の合理的に正確
な定量化もまた、達成できる。
【０１６３】
【発明の効果】本発明によれば、質量分析計と組み合わ
せた前端クロマトグラフィーを用いて、化合物のライブ
ラリを迅速にスクリーニングし、それによって、標的レ
セプターに結合するライブラリメンバーを同定し、分類
することが可能となった。
【０１６４】前述の記述から、この組成物および方法の
種々の改良および変更は、当業者に想起される。添付の
請求の範囲に入るこのような改良の全ては、本発明に含
まれることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、質量分析計と組み合わせた前端クロマ
トグラフィーを用いる、化合物ライブラリをスクリーニ
ングするための代表的な装置を例示する。
【図２】図２は、質量分析計と組み合わせた複数の前端
クロマトグラフィーカラムを用いる、化合物ライブラリ
をスクリーニングするための代表的な装置を例示する。
【図３】図３は、質量分析計と組み合わせた複数の前端
クロマトグラフィーカラムを用いる、化合物ライブラリ
をスクリーニングするための別の代表的な装置を例示す
る。
【図４】図４は、質量分析計と組み合わせた複数の前端
クロマトグラフィーカラムを用いる、インジケーター化
合物を用いて化合物ライブラリを連続的にスクリーニン
グするための代表的な装置を例示する。
【図５Ａ】図５Ａは、Salmonella paratyphiＢＯ-抗原
中の3,6-ジデオキシ-D-ガラクトース(アベクオース(abe
quose))エピトープを認識する炭水化物結合抗体への種
々の親和性を有する代表的な６種のオリゴ糖を用いて、
FC-MS走査から得られた全イオンクロマトグラム(TIC)を
示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、図５Ａで示したTICから再構成さ
れた、６種のオリゴ糖についての選択イオンクロマトグ
ラムを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、図５Ａで示したTICのタイムスラ
イスから作成した質量スペクトルを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、図５Ａで示したTICのタイムスラ
イスから作成した質量スペクトルを示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、図５Ａで示したTICのタイムスラ
イスから作成した質量スペクトルを示す。
【図６】図６は、αGal(1 --> 2)[αAbe(1 --> 3)]αMa
n-OCH3についての([Ａ]0(Ｖ−Ｖ0))-1対[Ａ]0 -1のプロ
ットを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、化合物ライブラリ非存在下で、イ
ンジケーター化合物を用いたFC-MS走査から得られた選
択イオンクロマトグラムを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、化合物ライブラリ存在下で、イン
ジケーター化合物を用いたFC-MS走査から得られた選択
イオンクロマトグラムを示す。
【図８】図８は、コレラ毒素Ｂサブユニットへの種々の
親和性を有する４種の代表的なオリゴ糖を用いて、FC-M
S走査から得られた選択イオンクロマトグラムを示す。
【図９】図９は、合成的に調製したGM1アナログを用い
たFC-MS走査から得られた選択イオンクロマトグラムを
示す。
【符号の説明】
１、１６ 第１レザバ ２、１７ 第２レザバ ３、１９ 第３レザバ ５、２４、３３ 廃物容器 ６、１３、３０ カラム １１、２２、３９ エレクトロスプレー質量
分析計 ２７ レザバ ３６ 補充希釈剤を含むレザバ ２６ エレクトロスプレー針 ３２ 電気作動マルチポート流
れ選択バルブ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 596121219 201， 1204 Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ Ｒ ｏａｄ Ｎ．Ｗ．， Ｃａｌｇａｒｙ， Ａｌｂｅｒｔａ， Ｃａｎａｄａ Ｔ２Ｎ ３Ｐ５ (72)発明者 デイビッド シー． シュリーマー カナダ国 ティー５エム ２ジー８， ア ルバータ， エドモントン， 109 アベ ニュー 13619

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 化合物ライブラリをスクリーニングし
    て、複数の推定リガンドの、標的レセプターへの相対親
    和性または絶対親和性を決定する方法であって、以下の
    工程(a)、(b)、(c)および(d)を包含する、方法： (a) 複数の推定リガンドを含有する化合物ライブラリを
    提供する工程； (b) 該化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー条
    件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レセプ
    ターを含有するカラムに連続的に付与して、それによ
    り、該標的レセプターを、該化合物ライブラリに連続的
    に接触させて、溶出液を提供する工程； (c) 該溶出液を、質量分析計に連続的または断続的に付
    与して、該溶出液中に存在する推定リガンド成分の質量
    スペクトルを提供する工程；および (d) 該質量スペクトルを評価して、該推定リガンド各々
    の破過時間を決定する工程。
  2. 【請求項２】 さらに、以下の工程(e)を包含する、請
    求項１に記載の方法： (e) 各ライブラリ中の推定リガンドの前記カラム上での
    破過時間を、同じライブラリ中の他の推定リガンドに対
    して相対的に比較することによって、該各ライブラリー
    中の推定リガンドの、前記標的レセプターへの親和性
    を、該同じライブラリ中の他の推定リガンドに対して相
    対的に決定する工程。
  3. 【請求項３】 さらに、以下の工程(f)を包含する、請
    求項１に記載の方法： (f) 前記化合物ライブラリ中の推定リガンドおよび前記
    標的レセプターに対する解離定数Ｋdを決定する工程。
  4. 【請求項４】 複数の化合物ライブラリをスクリーニン
    グして、各ライブラリ内の複数の推定リガンドの、標的
    レセプターへの相対親和性または絶対親和性を決定する
    方法であって、以下の工程(a)、(b)、(c)および(d)を包
    含する、方法： (a) 複数の化合物ライブラリを提供する工程であって、
    各ライブラリが、複数の推定リガンドを含有する、工
    程； (b) 各化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー条
    件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レセプ
    ターを含有する個々のカラムに連続的に付与して、それ
    により、該標的レセプターを、該化合物ライブラリに連
    続的に接触させて、各カラムからの溶出液を提供する工
    程； (c) 各カラムからの該溶出液を、質量分析計に断続的に
    付与して、該溶出液中に存在する推定リガンド成分の質
    量スペクトルを提供する工程；および (d) 該質量スペクトルを評価して、各化合物ライブラリ
    中の該推定リガンド各々の破過時間を決定する工程。
  5. 【請求項５】 さらに、以下の工程(e)を包含する、請
    求項４に記載の方法： (e) 各ライブラリ中の推定リガンド各々の前記カラム上
    での破過時間を、同じライブラリ中の他の推定リガンド
    に対して相対的に比較することによって、該各ライブラ
    リー中の推定リガンド各々の、前記標的レセプターへの
    相対親和性を決定する工程。
  6. 【請求項６】 さらに、以下の工程(f)を包含する、請
    求項４に記載の方法： (f) 前記化合物ライブラリ中の推定リガンドおよび前記
    標的レセプターに対する解離定数Ｋdを決定する工程。
  7. 【請求項７】 前記複数のカラムが、２個〜約100個の
    カラムを包含する、請求項４に記載の方法。
  8. 【請求項８】 化合物ライブラリをスクリーニングし
    て、複数の推定リガンドの、標的レセプターへの相対親
    和性を、１種またはそれ以上のインジケーター化合物に
    対して相対的に決定する方法であって、以下の工程
    (a)、(b)、(c)、(d)および(e)を包含する、方法： (a) 複数の推定リガンドを含有する化合物ライブラリを
    提供する工程； (b) 該化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー条
    件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レセプ
    ターを含有するカラムに連続的に付与して、該カラムを
    該化合物ライブラリで平衡化する工程； (c) 少なくとも１種のインジケーター化合物を提供する
    工程であって、該インジケーター化合物が、該標的レセ
    プターへの所定の親和性を有し、かつ該化合物ライブラ
    リの非存在下における、所定の、該カラム上の破過時間
    を有する、工程； (d) (i)該化合物ライブラリおよび該インジケーター化
    合物を含有する混合物または(ii)該インジケーター化合
    物を、前端クロマトグラフィー条件下にて、該カラムに
    連続的に付与して、溶出液を提供する工程；および (e) 該溶出液を質量分析により分析して、該インジケー
    ター化合物の破過時間を決定する工程。
  9. 【請求項９】 さらに、以下の工程(f)を包含する、請
    求項８に記載の方法： (f) 工程(e)からの前記インジケーター化合物の破過時
    間を、前記化合物ライブラリ非存在下における、所定
    の、該インジケーター化合物の破過時間と比較すること
    により、該化合物ライブラリの任意の推定リガンドの、
    前記標的レセプターへの親和性が、該インジケーター化
    合物より高いかどうかを決定する工程。
  10. 【請求項１０】 前記化合物ライブラリが、約50,000個
    未満の推定リガンドを含有する、請求項９に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 前記化合物ライブラリが、約５個〜約
    100個の推定リガンドを含有する、請求項１０に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 前記化合物ライブラリ非存在下におけ
    る、所定の、前記インジケーター化合物の破過時間が、
    約５分間未満である、請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 複数の化合物ライブラリをスクリーニ
    ングして、複数の推定リガンドの、標的レセプターへの
    相対親和性を、１種またはそれ以上のインジケーター化
    合物に対して相対的に決定する方法であって、以下の工
    程(a)、(b)、(c)、(d)および(e)を包含する、方法： (a) 複数の推定リガンドを含有する複数の化合物ライブ
    ラリを提供する工程； (b) 各化合物ライブラリを、前端クロマトグラフィー条
    件下にて、必要に応じて固相担体に結合した標的レセプ
    ターを含有する個々のカラムに連続的に付与して、該カ
    ラムを該化合物ライブラリで平衡化する工程； (c) 少なくとも１種のインジケーター化合物を提供する
    工程であって、該インジケーター化合物が、該標的レセ
    プターへの所定の親和性を有し、かつ該化合物ライブラ
    リの非存在下における、所定の、該カラム上の破過時間
    を有する、工程； (d) (i)該化合物ライブラリおよび該インジケーター化
    合物を含有する混合物または(ii)該インジケーター化合
    物を、前端クロマトグラフィー条件下にて、各カラムに
    連続的に付与して、溶出液を提供する工程；および (e) 各カラムからの該溶出液を質量分析により分析し
    て、該インジケーター化合物の破過時間を決定する工
    程。
  14. 【請求項１４】 さらに、以下の工程(f)を包含する、
    請求項１３に記載の方法： (f) 工程(e)からの前記インジケーター化合物の破過時
    間を、前記化合物ライブラリ非存在下における、所定
    の、該インジケーター化合物の破過時間と比較すること
    により、化合物ライブラリの任意の推定リガンドの、前
    記標的レセプターへの親和性が、該インジケーター化合
    物より高いかどうかを決定する工程。
  15. 【請求項１５】 前記化合物ライブラリ非存在下におけ
    る、所定の、前記インジケーター化合物の破過時間が、
    約５分間未満である、請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記化合物ライブラリが、約10,000個
    未満の推定リガンドを含有する、請求項１、４または１
    ３のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記化合物ライブラリが、約５個〜約
    100個の推定リガンドを含有する、請求項１６に記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】 前記化合物ライブラリが、炭水化物、
    単糖類、オリゴ糖類、多糖類、アミノ酸、ペプチド、オ
    リゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシ
    ド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオ
    チド、脂質、レチノイド、ステロイド、グリコペプチ
    ド、グリコタンパク質、プロテオグリカン、およびそれ
    らの合成アナログまたは誘導体からなる群から選択され
    る推定リガンドを含有する、請求項１、４、９または１
    ３のいずれか１項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記化合物ライブラリが、合成小分子
    有機化合物からなる群から選択される推定リガンドを含
    有する、請求項１、４、９または１３のいずれか１項に
    記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記標的レセプターが、タンパク質、
    糖タンパク質、グリコサミノグリカン、プロテオグリカ
    ン、インテグリン、酵素、レクチン、セレクチン、細胞
    接着分子、毒素、細菌性線毛、輸送タンパク質、シグナ
    ル伝達またはホルモン結合に関与したレセプター、ホル
    モン、抗体、主要組織適合性複合体、免疫グロブリンス
    ーパーファミリー、カドフェリン、DNAおよびDNAフラグ
    メント、RNAおよびRNAフラグメント、全細胞、組織、細
    菌、真菌、ウイルス、寄生生物、プレオン、およびそれ
    らの合成アナログまたは誘導体からなる群から選択され
    る、請求項１、４、９または１３のいずれか１項に記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】 前記標的レセプターが、固相担体に結
    合される、請求項１、４、９または１３のいずれか１項
    に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記標的レセプターが、前記固相担体
    に共有結合されるか、またはビオチン−アビジン結合ま
    たはビオチン−ストレプトアビジン結合を介して結合さ
    れる、請求項２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記固相担体が、樹脂ビーズ、ガラス
    ビーズ、シリカチップ、シリカキャピラリーおよびアガ
    ロースからなる群から選択される、請求項２１に記載の
    方法。
  24. 【請求項２４】 前記カラムが、約１ pmol〜約10 nmol
    の標的レセプター活性部位を含有する、請求項１、４、
    ９または１３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記カラムからの溶出液が、工程(c)
    の前に、補充希釈剤で希釈される、請求項１または４に
    記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記補充希釈剤が、主要量の有機溶媒
    および少量の水性緩衝液を含有する、請求項２５に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】 前記有機溶媒が、アセトニトリル、メ
    タノールおよびイソプロパノールからなる群から選択さ
    れる、請求項２６に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記カラムからの溶出液が、工程(e)
    の前に、補充希釈剤で希釈される、請求項９または１３
    に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記補充希釈剤が、主要量の有機溶媒
    および少量の水性緩衝液を含有する、請求項２８に記載
    の方法。
  30. 【請求項３０】 前記有機溶媒が、アセトニトリル、メ
    タノールおよびイソプロパノールからなる群から選択さ
    れる、請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記質量分析計が、エレクトロスプレ
    ー質量分析計である、請求項１、４、９または１３のい
    ずれか１項に記載の方法。
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