JPH11279193A - アデノシン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なアデノシン誘導体を提供する。 【解決手段】 本発明の化合物はプリン３様受容体物質
（Ｐ３様受容体という）に結合し得るアデノシン誘導体
である。本発明のアデノシン誘導体は、Ｐ３様受容体と
選択的に結合することができるので、Ｐ３様受容体及び
当該作用を有する物質のスクリーニング；プリン受容体
の薬理学的、生化学的、生理学的な作用・機構の研究；
医薬などに利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なアデノシン誘
導体に関する。より詳細には、プリン受容体３様物質と
結合し得るアデノシン誘導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】アデノシン 5'-三リン酸(Adenosine 5'-
triphospate, ATP)は１９２９年に発見され、生体のエ
ネルギーの源泉になっている物質であリ、その細胞内に
おける生化学的な重要性は過去何年にもわたり認識され
ている。その細胞内の働きに加えて、最近の十年でその
細胞表面に置ける受容体を介した細胞外の作用について
の知見が蓄積されつつある(N.Y. Acad. Sci. 603, 1-1
7, 1990)。ATPはその生理的作用をプリン(purine)受容
体を介して発現する（Receptor &Channel, 3, 283-289,
1995)。その受容体の分類は、主としてP1受容体及びP2
受容体に分かれ、いずれも細胞外のアデニン ヌクレオ
チドが結合すると言われている。また、その生体内の結
合性物質（リガンド）としては、P1についてはアデノシ
ン、P2についてはATP及びADPが知られている。そのた
め、P1受容体は通常アデノシン受容体とよばれ、アデノ
シンに選択的に結合し、サブクラスとして、A1, A2, A3
に分類される。A1とA3受容体はGI/G0蛋白と結合してade
nylate cyclase活性の抑制に関与する。一方、A2受容体
はGS蛋白と結合することにより、adenylate cyclase活
性の刺激を行う。さらに、近年では、P2受容体のサブタ
イプが薬理学、電気生理学、分子生物学を基盤として同
定されてきている。即ち、P2受容体はP2X(Ligand Gate
d), P2Y,U, Z(G蛋白結合性）のプリン受容体ファミリー
に分類される（pharmacol. rev.46, 143-156, 1994)。
例えば、神経系で言えば、ATPはプリン受容体の中のP2x
サブタイプに働き、ニューロンや平滑筋細胞を含んだ幅
広い細胞へのイオン運搬の増加作用を示す（Trends. Ph
armacol. Sci. 16, 168-174)。この、P2x受容体につい
ては、過去３年にラットにて６種のp2xのプリン受容体
のサブタイプがクローニングされてきている。

【０００３】このように、プリン受容体は大きくP１受
容体とP２受容体とに大別され、さらに細分化されてい
る。上記のP１受容体、特にアデノシン拮抗剤について
は、近年、抗パーキンソン病の治療薬や腎不全への治療
剤など、多くの試みがなされている。また、P2受容体に
ついては、たとえばP2X受容体とATPの結合はニューロン
に置ける交感神経伝達に深く関与している。また、P2X1
の場合はニューロンと平滑筋間での上記伝達に関与して
いる。したがって、そのリガンドの臨床応用としては神
経系の疾患、頻尿、鎮痛剤等が考慮されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、従来P1
及びP2受容体は医薬などへの応用が検討されているが、
１９９３年に従来のP1及びP2受容体と異なる第三の受容
体が提唱されている。本受容体は、ラットの動脈の交感
神経に局在しており、プリン受容体３様物質(以下、P3
様受容体という)と称され、種々のヌクレオシド、ヌク
レオチドにより活性化することが知られている。その相
対的効力の強さとしては2-chloroadenosine＞beta, gam
ma-methylene-ATP＞ATP＞Adenosineであり、また、別の
報告では、平滑筋弛緩作用の効力ではNECA＞Adenosine
＞ATP=ADP=AMP=inosisnと報告されている（Naunyn-schm
iedberg's arch.pharmacol, 338, 221-227, 1988; J. P
harmacol. 46, 337-341; Gen. Pharmacol. 23, 1067-10
71, 1992)。係るP3様受容体は従来のP1及びP2受容体と
異なるので、P3様受容体へ選択的に親和性を有する化合
物は、プリン受容体の薬理学的、生化学的、生理学的の
研究及び上記臨床応用への可能性が大きいと考えられて
いる。発明者らは従来、前記A1アデノシン受容体の精製
を各種の原料より手がけてきている（J. Biol. Chem. 2
64, 16545-16551, 1989; Eur, J. Biochem. 206, 171-1
77, 1992)。その一連の研究の中で、非選択的アデノシ
ン受容体アゴニストであり、ラットの脳内におけるユニ
ークなリガンドであるNECA(5'-N-ethylcarboxamidoaden
osine)に親和性のある新規な結合性蛋白質を発見し、上
記のP1及びP2と異なる性質を持つこと；リガンドへの結
合性を始めとして、上述のP3様受容体と類似しているこ
とを見い出している(Biochem & Biophysical Research
Com, 219, 469-474, 1996）。本発明者らはその研究を
鋭意継続することにより、上記P3様受容体に選択的に結
合する物質を見出し本発明を完成した。即ち、本発明
は、P3様受容体に結合し得る物質を提供することを目的
とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明の要旨は、下記一般式で示されるア
デノシン誘導体である。

【０００６】

【化２】 （式中、Ｒ¹及びＲ²は水酸基又は低級アルキニル基を示
す。但し、Ｒ¹及びＲ²の一方が低級アルキニル基のと
き、他方は水酸基であり；またＲ¹及びＲ²の一方が水酸
基のとき、他方は低級アルキニル基である）

【０００７】上記一般式で示される本発明の化合物にお
いて、好適な化合物は下記一般式（４）で示される化合
物である。

【０００８】

【化３】 （式中、Ｒ¹及びＲ²は前記と同じ）

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明のアデノシン誘導体は上記
の一般式で表され、Ｒ¹及びＲ²で示される低級アルキニ
ル基としては、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブ
チニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などが例示さ
れ、好ましくはエチニル基又は１−ヘキシニル基が例示
される。本発明の化合物は分子内の不斉炭素に基づく光
学異性体が存在するが、係る異性体及びそれらの混合物
は何れも本発明の範囲に包含されるものである。また、
本発明のアデノシン誘導体にはその塩が包含され、係る
塩としては、例えば塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の酸付
加塩が例示される。上記の一般式で示される本発明のア
デノシン誘導体は種々の方法で得ることができるが、例
えば、後記実施例に示されるように、下記の反応工程式
に示される方法にて合成することができる。

【００１０】

【化４】

【００１１】

【発明の効果】本発明のアデノシン誘導体は、後記試験
例に示されるように、P3様受容体と選択的に結合するこ
とができるので、P3様受容体及び当該作用を有する物質
のスクリーニングに利用することができ、ひいてはプリ
ン受容体の薬理学的、生化学的、生理学的な作用・機構
の研究に有用である。また、本発明のアデノシン誘導体
は医薬（例えば、血圧降下剤等）としての応用も期待で
きる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１(化合物２a,2bの合成)N⁶-ベンゾイル-9-(2,3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデオ
キシ-7-C-トリメチルシリル-b-D-アロ-ヘプト-5-イノフ
ラノシル)アデニン (2a)及びN⁶-ベンゾイル-9-(2,3-O-
イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-7-C-トリメチルシリ
ル-a-L-タロ-ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン (2b)
［N⁶-Benzoyl-9-(2,3-O-isopropylidene-6,7-dideoxy-7
-C-trimethylsilyl-b-D-allo-hept-5-ynofuranosyl)ade
nine (2a)及びN⁶-Benzoyl-9-(2,3-O-isopropylidene-6,
7-dideoxy-7-C-trimethylsilyl-a-L-talo-hept-5-ynofu
ranosyl)adenine (2b)］ EtMgBr (3 M THF溶液，5.62 mL)を、トリメチルシリル
アセチレン(trimethylsilyl acetylene)(2.54 mL)を含
むTHF溶液(20 mL)にアルゴン雰囲気下10 ℃で加え、同
温で２時間撹拌した。化合物1 (2.30 g, 5.62 mmol)のT
HF溶液(30 mL)を上記の溶液に-20 ℃で滴下し、同温で
２時間撹拌した。反応液にNH₄Cl水溶液(1M)を加え、酢
酸エチルで抽出し、有機層をNa₂SO₄で乾燥した．有機層
を濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカラムにより精製し、
2a (1.24 g)、2b (461 mg)及び2aと2bの混合物(282 mg)
を白色泡状物質として得た。 2aと2bの混合物：EI-MS, m/z 507 (M⁺)¹ H-NMR (CDCl₃) δ ppm, 8.83 and 8.78 (each s, 1H,
H2), 8.27 and 8.20 (each s, 1H, H8), 8.04 and 7.63
(m, total 5H, Ph), 6.05 and 5.97 (each d, 1H, H-
1', J = 4.4, 4.8 Hz), 5.20 and 5.18 (each d, 1H,
H-2'), 4.76 (d, 1H, H4'), 1.68, 1.42, 1.65, and 1.
38 (each s, 3H, Me), 0.22 and 0.12 (s,9H, TMS)

【００１３】実施例２（化合物３a、bの合成） 9-(2,3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-b-D-ア
ロ-ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン (3a)［9-(2,3-O
-Isopropylidene-6,7-dideoxy-b-D-allo-hept-5-ynofur
anosyl)adenine (3a)］ 化合物2a (1.24 g)をメタノ−ル性アンモニア(0 ℃で飽
和，40 mL)に溶解し、室温で26時間撹拌した。析出した
結晶をろ過し化合物3aを1.95 g(80%)を得た。 mp 257-258.5 ℃ (MeOHから再結晶) EI-MS, m/z 331 (M⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.31 (s, 1H, H2), 8.15
(s, 1H, H8), 7.36 (br s,2H, 6-NH₂), 6.29 (d, 1H,
5'-OH, J = 4.9 Hz), 6.16 (d, 1H, H1', J = 3.3Hz),
5.30 (dd, 1H, H2', J = 3.3, 6.0 Hz), 5.07 (dd, 1H,
H3', J = 1.7, 6.0 Hz), 4.41 (ddd, 1H, H5', J = 2.
2, 4.9 Hz), 4.18 (dd, 1H, H4', J = 2.2,1.7 Hz), 3.
38 (dd, 1H, -C≡CH, J = 2.0 Hz) 元素分析 C₁₅H₁₇N₅O₄として: 計算値：C, 54.38; H, 5.17; N, 21.14 実測値：C, 54.33; H, 5.10; N, 21.07

【００１４】 9-(2,3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデ
オキシ-a-L-タロ-ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン
(3b)［9-(2,3-O-Isopropylidene-6,7-dideoxy-a-L-talo
-hept-5-ynofuranosyl)adenine (3b)］ 化合物2b (458 mg)をメタノ−ル性アンモニア(0 ℃で飽
和，40 mL)に溶解し、室温で26時間撹拌した。反応液を
減圧下濃縮すると白色結晶が析出し、結晶をろ過し化合
物3bを260 mg (87%)を得た。 mp 232-234 ℃ (MeOHから再結晶) EI-MS, m/z 331 (M⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.33 (s, 1H, H2), 8.15
(s, 1H, H8), 7.36 (br s,2H, 6-NH₂), 6.17 (d, 1H, H
1', J = 2.8 Hz), 6.06 (d, 1H, 5'-OH, J = 6.6Hz),
5.29 (dd, 1H, H2', J = 2.8, 6.0 Hz), 5.01 (dd, 1H,
H3', J = 3.3, 6.0 Hz), 4.42 (ddd, 1H, H5', J = 2.
2, 6.1, 6.6 Hz), 4.16 (dd, 1H, H4', J =3.3, 6.1 H
z), 3.39 (dd, 1H, -C≡CH, J = 2.0 Hz). 元素分析 C₁₅H₁₇N₅O₄・0.25 H₂Oとして: 計算値：C, 53.65; H, 5.18; N, 20.85 実測値：C, 53.73; H, 5.10; N, 20.85.

【００１５】実施例３（化合物４a,bの合成） 9-(6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプト-5-イノフラノ
シル)アデニン (4a)［9-(6,7-Dideoxy-b-D-allo-hept-5
-ynofuranosyl)adenine (4a)］ 化合物3a (623 mg)を90%トリフルオロ酢酸(20 mL)に溶
解し、室温で１０分間撹拌した。反応液を減圧下留去
し、エタノ−ルで数回共沸した。残渣をシリカゲルカラ
ムで精製し、エタノ−ルから結晶化し化合物4aを431 mg
(79%)得た。 mp 242-243 ℃ EI-MS, m/z 291 (M⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.29 (s, 1H, H2), 8.13
(s, 1H, H8), 7.40 (br s,2H, 6-NH₂), 6.58 (d, 1H,
5'-OH, J = 3.3 Hz), 5.90 (d, 1H, H1', J = 7.7Hz),
5.45 (d, 1H, 2'-OH, J = 7.1 Hz), 5.33 (d, 1H, 3'-O
H, J = 3.9 Hz), 4.65 (ddd, 1H, H2', J = 7.1, 7.7 H
z), 4.48 (m, 1H, H5', J = 2.2, 3.3, 3.9Hz), 4.21
(dd, 1H, H3', J = 3.9 Hz), 3.98 (dd, 1H, H4', J =
3.9 Hz), 3.40 (dd, 1H, -C≡CH, J = 2.2 Hz) 元素分析 C₁₂H₁₃N₅O₄・0.25 H₂Oとして: 計算値：C, 48.73; H, 4.60; N, 23.68 実測値：C, 48.94; H, 4.60; N, 23.38.

【００１６】 9-(6,7-ジデオキシ-a-L-タロ-ヘプト-5
-イノフラノシル)アデニン (4b)［9-(6,7-Dideoxy-a-L-
talo-hept-5-ynofuranosyl)adenine (4b)］ 化合物3b (251 mg)を90%トリフルオロ酢酸(8 mL)に溶解
し、室温で１０分間撹拌した。反応液を減圧下留去し、
エタノ−ルで数回共沸した。残渣をシリカゲルカラムで
精製し、エタノ−ルから結晶化し化合物4bを213 mg (97
%)得た。 mp 214-215.5 ℃ EI-MS, m/z 291 (M⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.33 (s, 1H, H2), 8.16
(s, 1H, H8), 7.45 (br s,2H, 6-NH₂), 5.92 (d, 1H, H
1', J = 7.2 Hz), 5.48 (d, 1H, 2'-OH, J = 2.2Hz),
5.31 (d, 1H, 3'-OH, J = 3.3 Hz), 4.63 (ddd, 1H, H
2', J = 7.1, 2.2 Hz), 4.49 (dd, 1H, H5', J = 2.2,
3.8 Hz), 4.13 (dd, 1H, H3', J = 1.7, 3.3Hz), 3.96
(dd, 1H, H4', J = 1.7, 3.9 Hz), 3.32 (dd, 1H, -C≡
CH, J = 2.2Hz) 元素分析 C₁₂H₁₃N₅O₄として: 計算値：C, 49.48; H, 4.50; N, 24.04 実測値：C, 49.30; H, 4.60; N, 23.88.

【００１７】実施例４（化合物3c, dの合成） N⁶-ベンゾイル-9-(7-C-ブチル-2,3-O-イソプロピリ
デン-6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプト-5-イノフラノシ
ル)アデニン (2c), N⁶-ベンゾイル-9-(7-C-ブチル-2,3-
O-イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-a-L-タロ-ヘプト-
5-イノフラノシル)アデニン (2d)及び9-(7-C-ブチル-2,
3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプ
ト-5-イノフラノシル)アデニン (3c) 及び9-(7-C-ブチ
ル-2,3-O-イソプロピリデン-6,7-ジデオキシ-a-L-タロ-
ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン (3d)［N⁶-Benzoyl-
9-(7-C-butyl-2,3-O-isopropylidene-6,7-dideoxy-b-D-
allo-hept-5-ynofuranosyl)adenine (2c), N⁶-Benzoyl-
9-(7-C-butyl-2,3-O-isopropylidene-6,7-dideoxy-a-L-
talo-hept-5-ynofuranosyl)adenine (2d)及び9-(7-C-bu
tyl-2,3-O-isopropylidene-6,7-dideoxy-b-D-allo-hept
-5-ynofuranosyl)adenine(3c), 及び9-(7-C-butyl-2,3-
O-isopropylidene-6,7-dideoxy-a-L-talo-hept-5-ynofu
ranosyl)adenine (3d)］ EtMgBr (3 M THF溶液，17.7 mL)を、n-ヘキシン(n-hexy
ne) (6.1 mL)を含むTHF溶液(20 mL)にアルゴン雰囲気下
10 ℃で加え、同温で３時間撹拌した。化合物１ (2.17
g, 5.31 mmol)のTHF溶液(50 mL)を上記の溶液に-20 ℃
で滴下し、20℃で４時間撹拌した。反応液にNH₄Cl水溶
液(1 M)を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層をNa₂SO₄
で乾燥した。有機層を濃縮乾固し、残渣をシリカゲルカ
ラムにより精製し、2cと2dの混合物を白色泡状物質とし
て632 mg及び3cと3dの混合物を白色泡状物質として819
mg得た。 2cと2dの混合物：EI-MS, m/z 491 (M⁺)¹ H-NMR (CDCl₃) δ ppm, 8.83 and 8.78 (each s, 1H,
H2), 8.22 and 8.17 (each s, 1H, H8), 8.05 and 7.53
(each m, total 5H, Ph), 6.04 and 5.97 (eachd, 1H,
H-1', J = 4.4, 4.8 Hz), 5.20 (m, 2H, H2', H3'),
4.73 (dd, 1H, 5'-OH), 1.68, 1.42, 1.65, and 1.38
(each s, 3H, Me), 1.25 (m, total 14H,CH₂CH₂, 0.90
(m, total 3H, Me)

【００１８】 9-(7-C-ブチル-2,3-O-イソプロピリデ
ン-6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプト-5-イノフラノシ
ル)アデニン (3c), 及び9-(7-C-ブチル-2,3-O-イソプロ
ピリデン-6,7-ジデオキシ-a-L-タロ-ヘプト-5-イノフラ
ノシル)アデニン (3d)［9-(7-C-butyl-2,3-O-isopropyl
idene-6,7-dideoxy-b-D-allo-hept-5-ynofuranosyl)ade
nine (3c), 及び9-(7-C-butyl-2,3-O-isopropylidene-
6,7-dideoxy-a-L-talo-hept-5-ynofuranosyl)adenine
(3d)］ 化合物2cと2dの混合物 (800 mg)をメタノ−ル性アンモ
ニア(0 ℃で飽和，30 mL)に溶解し、室温で20時間撹拌
した。溶媒を留去した後，残渣をシリカゲルカラムによ
り精製し、3cと3dの混合物を白色泡状物質として527 mg
(84%)得た。 EI-MS, m/z 388 (M+H⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.31 (s, 1H, H2), 8.14
(s, 1H, H8), 7.36 (br s,2H, 6-NH₂), 6.13 (d, 2H,
5'-OH, H1', J = 3.3 Hz), 5.27 (dd, 1H, H2', J= 3.
3, 6.0 Hz), 5.04 (dd, 1H, H3', J = 1.6, 6.0 Hz),
4.38 (dd, 1H, H4',J = 1.6 Hz), 4.16 (ddd, 1H, H
5'), 2.16 (m, total 2H, CH2), 1.48 and 1.33 (each
s, 3H, Me), 1.33 (m, total 14H, CH₂CH₂, 0.84 (m, t
otal 3H, Me) 元素分析 C₁₉H₂₅N₅O₄として: 計算値：C, 58.90; H, 6.50; N, 18.08 実測値：C, 58.77; H, 6.41; N, 17.93

【００１９】実施例５（化合物４c、dの合成）9-(7-C-ブチル-6,7-ジデオキシ-b-D-アロ-ヘプト-5-イ
ノフラノシル)アデニン (4c)及び9-(7-C-ブチル-6,7-ジ
デオキシ-a-L-タロ-ヘプト-5-イノフラノシル)アデニン
(4d)［9-(7-C-butyl-6,7-dideoxy-b-D-allo-hept-5-yn
ofuranosyl)adenine (4c)及び9-(7-C-butyl-6,7-dideox
y-a-L-talo-hept-5-ynofuranosyl)adenine(4d)］ 化合物3cと3dの混合物 (1.86 g)を90%トリフルオロ酢酸
(20 mL)に溶解し、室温で４０分間撹拌した。反応液を
減圧下留去し、エタノ−ルで数回共沸した。残渣をシリ
カゲルカラムで精製し、部分精製された4c (765 mg)及
び 4d (205 mg)並びにその混合物(208 mg)得た。化合物
4c及び4dはさらに逆層C-18 HPLCにより精製した。 化合物4c mp 124-126 ℃ EI-MS, m/z 348 (M+H⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.31 (s, 1H, H2), 8.15
(s, 1H, H8), 7.55 (br s,2H, 6-NH₂), 5.90 (d, 1H, H
1', J = 7.3 Hz), 5.35 (m, 2H, 2', 3'-OH), 4.63 (d
dd, 1H, H2', J = 7.3, 5.5 Hz), 4.44 (dd, 1H, H5',
J = 1.5, 3.7 Hz),4.21 (d, 1H, H3', J = 5.1 Hz), 3.
95 (dd, 1H, H4', J = 1.5, 3.3 Hz) 元素分析 C₁₆H₂₁N₅O₄・5/4 H₂Oとして: 計算値：C, 51.95; H, 6.40; N, 18.83 実測値：C, 51.98; H, 6.10; N, 18.63

【００２０】化合物4d mp 113-116 ℃ EI-MS, m/z 348 (M+H⁺)¹ H-NMR (DMSO-d₆) δ ppm, 8.31 (s, 1H, H2), 8.14
(s, 1H, H8), 7.38 (br s,2H, 6-NH₂), 5.90 (d, 1H, H
1', J = 7.0 Hz), 5.43 (br s, 1H, 2'-OH), 5.25(br
s, 1H, 3'-OH), 4.64 (d, 1H, H2', J = 7.0 Hz), 4.45
(br s, 1H, H5'),4.13 (br s, 1H, H3'), 3.91 (dd, 1
H, H4') 元素分析 C₁₆H₂₁N₅O₄として: 計算値：C, 55.32; H, 6.09; N, 20.16 実測値：C, 55.03; H, 6.39; N, 19.87

【００２１】試験例１Ｐ３様受容体の精製 J.Biol. Chem., 264, 16545-16551 (1989)に記されてい
る方法と同様の方法でラット脳の膜画分を調製し、０℃
にて１０倍量の0.4% CHAPSを含む５０ｍＭトリス酢酸緩
衝液(pH7.2)と混合することにより、膜タンパク質を可
溶化した。40,000ｘｇにて１時間遠心分離した後、上清
を集め、0.1M 塩化ナトリウム及び0.1% CHAPSを含む50m
M トリス酢酸緩衝液(pH7.2)であらかじめ平衡化したヒ
ドロキシアパタイト カラムに添加した。0.1M 塩化ナト
リウム及び0.1% CHAPSを含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液
(pH7.2)でカラムを洗浄した後、0.1Mから0.5Mのリン酸
カリウム濃度勾配により吸着したタンパク質を溶出し
た。Ｐ３様受容体活性の測定はトリチウムラベルされた
ＮＥＣＡを用い、Biochem. Biophys. Res. Commun.,21
9, 469-474(1996)に記されている方法によって測定し
た。Ｐ３様受容体を含む画分を集め、限外濾過器を用い
て2.3倍に濃縮して以下の実験に用いた。最終的に得ら
れた精製標品は約2.7pmol/mg蛋白質のＰ３様受容体活性
を有する。

【００２２】試験例２本発明化合物による結合阻害実験 本発明の化合物のプリン受容体結合阻害実験を以下の方
法にて行った。 Ｐ３様受容体のＮＥＣＡ結合活性に対する化合物の
阻害効果はBiochem. Biophys. Res. Commun., 219, 469
-474 (1996)に記されている方法に準じて調べた。0.1%
CHAPS、4mM塩化マグネシウム、種々の濃度(1nM-100μM)
の試験化合物（一般式（４ａ）で示される本発明の化合
物、以下同様）及び32nMのトリチウムラベルされたＮＥ
ＣＡを含む50mM トリス酢酸緩衝液(pH7.2)中に精製した
Ｐ３様受容体0.12pmolを加え、０℃で１５時間インキュ
ベートした。反応液を0.3%ポリエチレンイミンで前処理
したフィルター(Whatman GF/B)で濾過することにより反
応を終了した。このフィルターを50mM トリス酢酸緩衝
液(pH7.2)で３回洗浄した後、バイアルに移し、５ｍｌ
のアクアゾル(Aquasol)を加えて液体シンチレーション
カウンターでトリチウムのカウントを測定した。Ｋｉ値
は、コンピュータープログラムのGraph Pad Prismを用
いて計算した。試験化合物のＰ３様受容体のＮＥＣＡ結
合活性に対するＫｉは１９ｎＭと求められた。

【００２３】 Ａ１及びＡ２ａアデノシン受容体のリ
ガンド結合活性測定には、J. Biol. Chem., 264, 16545
-16551(1989)に記されている方法で調製したラット脳の
膜画分を用いた。Ａ１アデノシン受容体の活性測定には
0.18mg、Ａ２ａアデノシン受容体の活性測定には0.55mg
の膜画分を用いた。Ａ１アデノシン受容体のリガンドに
は2.0nMのトリチウムラベルされたＤＰＣＰＸ(8-[4-
[[[2-aminoethyl)amino]carbonyl]methyl]phenyl]-1,3-
diprocyclopentyltheophylline)、Ａ２ａアデノシン受
容体には5.9nMのトリチウムラベルされたＣＧＳ２１６
８０を用い、上記と同様の方法で結合活性を測定した。
試験化合物は0.1μM以下の濃度でＡ１アデノシン受容体
のＤＰＣＰＸ結合活性を阻害せず(Ｋｉ； 12μM)、Ａ２
ａアデノシン受容体のＣＧＳ２１６８０結合活性は100
μMでも約40％しか阻害しなかった。

【００２４】 Ａ３アデノシン受容体のリガンド結合
活性測定にはＲＢＬ−２Ｈ３細胞から調製した膜画分0.
27mgを用いた。0.1% CHAPS、4mM 塩化マグネシウム、２
Ｕ／ｍｌアデノシンデアミナーゼ及び種々の濃度(10nM-
100μM)の試験化合物を含む50mM トリス酢酸緩衝液(pH
7.2)に100nM ＤＰＣＰＸと100μM ＡｐｐＮＨｐ(adenyl
ylimidodiphosphate)を加えた反応液（Ａ）と、10nM Ｉ
Ｂ−ＭＥＣＡ(N⁶-(3-iodobenzyl)-5'-N-methylcarbamol
yladenosine)、100nM ＤＰＣＰＸ及び100μM ＡｐｐＮ
Ｈｐを加えた反応液（Ｂ）それぞれに０．１５ｎＭの
¹²⁵IラベルされたＡＢ−ＭＥＣＡ(N⁶-(4-amimo-3-iodob
enzyl)adenosine-5'-N-methyluronamide)を加えて２５
℃で２時間インキュベートした。それ以外の条件は上記
の方法に準じた。Ａ３アデノシン受容体に由来するＡＢ
−ＭＥＣＡ結合量は反応液Ａと反応液Ｂそれぞれから得
られた結合活性の差から計算した。試験化合物はいずれ
の濃度でも、Ａ３アデノシン受容体のＡＢ−ＭＥＣＡ結
合活性を全く阻害しなかった。

【００２５】 Ａ２ｂアデノシン受容体の活性測定に
は、ＶＡ−１３細胞を用い、試験化合物を加えた時の細
胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を調べた。２４ウェルプレート
中で100,000細胞／ウェルの濃度で２日間培養し、細胞
を118mM 塩化ナトリウム、4.7mM塩化カリウム、1.2mM
塩化マグネシウム、1.5mM 塩化カルシウム、1.2mM リン
酸二水素カリウム、0.5mM ＥＤＴＡ及び10mM グルコー
スを含む20mM HEPES緩衝液(pH7.4)で洗浄した。つぎに
0.1mM Ｒｏ−２０−１７２４と２ユニット／ｍｌアデノ
シンデアミナーゼを含む同緩衝液を加えて３７℃で１０
分間プレインキュベートした後、種々の濃度(0-100μM)
の試験化合物を含む同緩衝液を加えて３７℃で１０分間
インキュベートした。緩衝液を除去し、0.1M 塩酸を添
加して反応を停止させた。１Ｍ水酸化ナトリウムで中和
させた後、氷冷した65%(v/v)エタノールで２回抽出し、
乾固させてからエンザイムイムノアッセイによりｃＡＭ
Ｐを定量した。試験化合物はいずれの濃度でもＡ２ｂア
デノシン受容体によるｃＡＭＰ濃度の上昇を誘起しなか
った。また、Ａ２ｂアデノシン受容体アゴニスト（ＮＥ
ＣＡ）によるｃＡＭＰ濃度上昇を阻害しなかった。 以上の結果から、本発明の化合物はＰ３様受容体と
特異的に結合し得る物質であることが明らかとなった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 斉藤 佳子 東京都府中市武蔵台３−13−４プラムハウ ス203

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式で示されるアデノシン誘導
   体。 【化１】 （式中、Ｒ¹及びＲ²は水酸基又は低級アルキニル基を示
   す。但し、Ｒ¹及びＲ²の一方が低級アルキニル基のと
   き、他方は水酸基であり；またＲ¹及びＲ²の一方が水酸
   基のとき、他方は低級アルキニル基である）
2. 【請求項２】 請求項１記載の化合物を用いるプリン
   受容体３様物質のスクリーニング方法。