JPH11246536A - Mefenacet compound, immunological reactive material, hybridoma and determination of mefenacet - Google Patents
Mefenacet compound, immunological reactive material, hybridoma and determination of mefenacetInfo
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- JPH11246536A JPH11246536A JP10047393A JP4739398A JPH11246536A JP H11246536 A JPH11246536 A JP H11246536A JP 10047393 A JP10047393 A JP 10047393A JP 4739398 A JP4739398 A JP 4739398A JP H11246536 A JPH11246536 A JP H11246536A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、メフェナセット化
合物、免疫学的反応体、ハイブリドーマ及びメフェナセ
ットの測定方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a mefenacet compound, an immunological reactant, a hybridoma, and a method for measuring mefenacet.
【0002】[0002]
【従来の技術】酸アミド系除草剤である「メフェナセッ
ト」、すなわち2−(1,3−ベンゾチアゾール−2−
イルオキシ)−N−メチルアセトアニリドは、式(2)2. Description of the Related Art Mefenacet, an acid amide herbicide, that is, 2- (1,3-benzothiazole-2-)
(Iloxy) -N-methylacetanilide is represented by the formula (2)
【0003】[0003]
【化2】 Embedded image
【0004】で表される構造を有する化合物である。該
化合物は、水田に使用される除草剤として有用で、ヒエ
に対して卓効を示す。A compound having a structure represented by the following formula: The compound is useful as a herbicide used in paddy fields and has a prominent effect on barnyard millet.
【0005】現在、メフェナセットは、他の水田除草剤
と混合製剤にして、イネ移植前後に1回の散布で効果の
ある「一発処理剤」として広く用いられていることか
ら、その周辺の河川や土壌への汚染が予想され、そのモ
ニタリングが重要な課題となっている。殊に、この製剤
は田植時に集中して散布されるので、水田から流亡して
水田排水溝や河川におけるメフェナセットの濃度が高く
なるのを避け得ない。従って、この時期において水中濃
度をモニタリングすることは特に重要である。[0005] At present, mefenacet is widely used as a "one-shot treatment" which is effective in a single application before and after rice transplantation in a mixed preparation with other paddy herbicides. It is expected that soil and soil will be contaminated, and its monitoring is an important issue. In particular, since this formulation is applied in a concentrated manner at the time of rice transplanting, it is inevitable that the concentration of mefenacet in the drainage ditch or river of the paddy field is increased due to runoff from the paddy field. Therefore, it is particularly important to monitor the water concentration at this time.
【0006】従来、これら除草剤の分析には、機器分析
法が用いられ、例えば、水中濃度のモニタリングの場合
には、試料から農薬を抽出・精製した後に、ガスクロマ
トグラフィーを用いた測定が行われてきた。これらの方
法は、精度の点では問題はないものの、操作が煩雑で測
定に時間がかかるため、環境中や食物中に残留するメフ
ェナセットを、より迅速、簡便かつ経済的にモニタリン
グすることのできる、新しい測定法の開発が求められて
いた。Conventionally, instrumental analysis has been used for the analysis of these herbicides. For example, in the case of monitoring the concentration in water, measurement using gas chromatography is performed after extracting and purifying pesticides from a sample. I have been. Although these methods have no problem in terms of accuracy, the operation is complicated and the measurement takes time, so that mefenacet remaining in the environment and in food can be monitored more quickly, easily and economically. The development of a new measurement method was required.
【0007】一方、免疫学的測定法は、抗原抗体反応を
利用して抗原の測定を行うもので、測定精度が優れてい
るばかりでなく、迅速、簡便かつ経済的な測定法であ
る。従来、免疫学的測定法は、臨床診断の分野で患者の
病態の解析法の一つとして、大きな役割を担ってきた
が、環境中に残留する農薬等の物質の測定にも、次第に
適用されるようになってきた。しかし、メフェナセット
への適用は、その必要性が高かったのにも拘わらず、従
来は全く行われておらず、適当な抗体はもとより、抗体
を調製するためのハプテンも得られていなかった。[0007] On the other hand, the immunological measurement method, which measures an antigen using an antigen-antibody reaction, is not only excellent in measurement accuracy, but also a quick, simple and economical measurement method. Conventionally, immunoassays have played a major role in the field of clinical diagnosis as one of the methods for analyzing the condition of patients, but are gradually applied to the measurement of substances such as pesticides remaining in the environment. It has become. However, despite its high necessity for application to mefenacet, it has not been conventionally performed at all, and haptens for preparing antibodies as well as suitable antibodies have not been obtained.
【0008】[0008]
【発明が解決しようとする課題】農薬は農作物の栽培を
容易にし、安定した生産性を確保し、しかも、生産物の
品質を確保するのに極めて重要な役割を果たしている。
しかし、一般消費者にとって農薬の使用に伴う環境汚
染、食品への残留、人体への影響は大きな関心事になっ
ている。さらに、日本の食糧自給率は次第に下がり、多
くを輸入に頼っているのが実情である。このような輸入
農産物にもポストハーベスト農薬の使用による残留農薬
に対する危惧が高まっている。環境や食品に関する安全
性確保のためには、これらに含有される残留農薬の量を
迅速、かつ正確に測定することが必要である。Agrochemicals play an extremely important role in facilitating the cultivation of agricultural crops, ensuring stable productivity, and ensuring the quality of products.
However, for the general consumer, the use of pesticides, such as environmental pollution, residues in foods, and their effects on the human body are of great concern. In addition, Japan's food self-sufficiency rate has gradually declined, and the fact is that many rely on imports. Concerns about the use of post-harvest pesticides in pesticide residues have also increased in such imported agricultural products. In order to ensure the safety of the environment and food, it is necessary to quickly and accurately measure the amount of residual pesticides contained in these.
【0009】従来、残留農薬の測定に当たっては、主
に、試料から農薬を描出し、精製後、ガスクロマトグラ
フィーや高速液体クロマトグラフィーを用いて分析して
いる。これらの方法は、その感度や精度の点で優れてい
るものの、試料の調製が煩雑で多大の手間と時間を必要
とし、分析に熟練を要すること、並びに、測定装置や設
備費等に高額な費用を必要とする。環境や農産物に残留
する農薬の分析では短時間の内に結果を出す必要があ
り、精度面以外にも簡便性、迅速性、かつ経済性を備え
た新しい測定法が要望されている。Conventionally, in measuring pesticide residues, pesticides are mainly drawn from a sample, purified, and then analyzed using gas chromatography or high-performance liquid chromatography. Although these methods are excellent in terms of sensitivity and accuracy, preparation of a sample is complicated and requires a great deal of labor and time, skill is required for analysis, and expensive measurement equipment and equipment costs are required. Need expense. In the analysis of pesticides remaining in the environment and agricultural products, it is necessary to obtain results within a short time, and there is a demand for a new measurement method that is simple, quick, and economical in addition to accuracy.
【0010】そこで、本発明者らは、土壌や水田排水
溝、河川等の環境水中等におけるメフェナセットの濃度
の簡便、迅速な測定法として、メフェナセットに対して
反応性を有する抗体を用いる免疫化学的検出法の適用を
検討してきた。その結果、下記一般式(1)で表される
メフェナセット化合物を合成し、これをハプテンとして
用いて得られるメフェナセット化合物と担体との結合体
が、メフェナセットに反応する免疫学的反応体の調製に
適していることを見い出した。また、このようにして調
製された免疫学的反応体、例えばモノクローナル抗体が
メフェナセットと特異的に反応し、これらの免疫学的反
応体を用いる免疫学的測定法により、メフェナセットを
正確に測定することができることを見い出した。本発明
は、斯かる知見に基づき完成されたものである。Accordingly, the present inventors have developed an immunochemical method using an antibody reactive with mefenacet as a simple and rapid method for measuring the concentration of mefenacet in environmental water such as soil, paddy drains and rivers. We have considered the application of the detection method. As a result, a mefenacet compound represented by the following general formula (1) is synthesized, and a conjugate of a mefenacet compound and a carrier obtained by using the compound as a hapten is suitable for preparing an immunological reactant reacting with mefenacet. I found that In addition, the immunological reactants prepared in this manner, for example, monoclonal antibodies specifically react with mefenacet, and the mefenacet is accurately measured by an immunoassay using these immunological reactants. I found that I could do it. The present invention has been completed based on such findings.
【0011】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明によれば、一般式
(1)According to the present invention, the general formula (1)
【0012】[0012]
【化3】 Embedded image
【0013】[式中、nは1〜9の整数を示す。]で表
されるメフェナセット化合物が提供される。[Wherein, n represents an integer of 1 to 9. And a mefenacet compound represented by the formula:
【0014】また、本発明によれば、前記一般式(1)
で表されるメフェナセット化合物と担体又は標識物質と
の結合体が提供される。According to the present invention, the above-mentioned general formula (1)
And a conjugate of a mefenacet compound represented by the formula: and a carrier or a labeling substance.
【0015】また、本発明によれば、メフェナセット及
び前記一般式(1)で表されるメフェナセット化合物に
反応性を示す免疫学的反応体、例えばモノクローナル抗
体が提供される。Further, according to the present invention, there is provided an immunological reactant, for example, a monoclonal antibody, which is reactive with mefenacet and the mefenacet compound represented by the general formula (1).
【0016】また、本発明によれば、メフェナセット及
び前記一般式(1)で表されるメフェナセット化合物に
反応性を示す免疫学的反応体、例えばモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマが提供される。Further, according to the present invention, there is provided a hybridoma which produces an immunological reactant, for example, a monoclonal antibody, which is reactive with mefenacet and the mefenacet compound represented by the general formula (1).
【0017】また、本発明によれば、前記免疫学的反応
体を用いることを特徴とするメフェナセットの免疫学的
測定方法が提供される。Further, according to the present invention, there is provided a method for immunologically measuring mefenacet, which comprises using the immunological reactant.
【0018】本発明方法によれば、メフェナセット分析
の大幅な簡略化と測定時間の短縮が可能となり、多数の
検体を迅速、簡便かつ経済的に測定できるようになっ
た。According to the method of the present invention, the mefenacet analysis can be greatly simplified and the measurement time can be shortened, and a large number of samples can be measured quickly, easily and economically.
【0019】[0019]
【発明の実施の形態】以下、本発明のメフェナセット化
合物及びその合成方法、メフェナセット化合物と担体又
は標識物質との結合体及びその調製方法、ポリクローナ
ル抗体の調製方法、モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマの分離及びハイブリドーマの産生するモノク
ローナル抗体の調製方法、これらの抗体フラグメントの
調製方法、そして免疫学的分析測定の順に説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, a mefenacet compound of the present invention and a method for synthesizing the same, a conjugate of a mefenacet compound with a carrier or a labeling substance and a method for preparing the same, a method for preparing a polyclonal antibody, separation of a hybridoma producing a monoclonal antibody and A method for preparing a monoclonal antibody produced by a hybridoma, a method for preparing these antibody fragments, and an immunoassay will be described in this order.
【0020】本発明の一般式(1)で表されるメフェナ
セット化合物は、文献未記載の新規化合物である。一般
式(1)において、nは1〜9の整数、好ましくは2〜
5の整数である。The mefenacet compound of the present invention represented by the general formula (1) is a novel compound not described in any literature. In the general formula (1), n is an integer of 1 to 9, preferably 2 to
It is an integer of 5.
【0021】一般式(1)で表される本発明化合物は、
公知の方法に従って製造することができる。例えば、一
般式(3)The compound of the present invention represented by the general formula (1)
It can be manufactured according to a known method. For example, the general formula (3)
【0022】[0022]
【化4】 Embedded image
【0023】[式中、Xはハロゲン原子を示す。]で表
される2−ハロゲノベンゾチアゾールと一般式(4)[Wherein, X represents a halogen atom. 2-halogenobenzothiazole represented by the general formula (4)
【0024】[0024]
【化5】 Embedded image
【0025】[式中、Rはカルボキシル保護基を示す。
nは前記に同じ。]で表されるα−ヒドロキシアセトア
ニリド化合物とを反応させ、次いで得られる一般式
(5)[Wherein, R represents a carboxyl protecting group.
n is the same as above. With an α-hydroxyacetanilide compound represented by the general formula (5)
【0026】[0026]
【化6】 Embedded image
【0027】[式中、R及びnは前記に同じ。]で表さ
れる保護されたメフェナセット化合物から、カルボキシ
ル保護基Rを除去することによって製造される。Wherein R and n are as defined above. From the protected mefenacet compound represented by the formula:
【0028】前記一般式(3)において、ハロゲン原子
としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨ
ウ素原子を挙げることができる。In the general formula (3), examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.
【0029】また、前記一般式(4)において、カルボ
キシル保護基としては従来公知のものでよく、特に限定
されるものではないが、例えばメチル基、エチル基、t
ert−ブチル基、ベンジル基、tert−ブチルジメ
チルシリル基、トリメチルシリル基等を例示できる。In the formula (4), the carboxyl-protecting group may be a conventionally known carboxyl group, and is not particularly limited. Examples thereof include a methyl group, an ethyl group and a t-group.
Examples thereof include an tert-butyl group, a benzyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, and a trimethylsilyl group.
【0030】一般式(3)で表される2−ハロゲノベン
ゾチアゾールと一般式(4)で表されるα−ヒドロキシ
アセトアニリド化合物とを用い、当該分野で利用可能な
公知の方法を適宜利用することにより、一般式(5)で
表される保護されたメフェナセット化合物が製造され
る。Using a 2-halogenobenzothiazole represented by the general formula (3) and an α-hydroxyacetanilide compound represented by the general formula (4), appropriately using a known method available in the art. As a result, a protected mefenacet compound represented by the general formula (5) is produced.
【0031】例えば、N,N−ジメチルホルムアミド等
の不活性溶媒中で水素化ナトリウム等の塩基存在下、一
般式(3)で表される2−ハロゲノベンゾチアゾールと
一般式(4)で表されるα−ヒドロキシアセトアニリド
化合物とを室温で反応させることにより、一般式(5)
で表される保護されたメフェナセット化合物が容易に製
造される。For example, 2-halogenobenzothiazole represented by the general formula (3) and the compound represented by the general formula (4) in the presence of a base such as sodium hydride in an inert solvent such as N, N-dimethylformamide. By reacting the compound with an α-hydroxyacetanilide compound at room temperature.
The protected mefenacet compound represented by is easily produced.
【0032】また、特公昭61−4395号公報に記載
の酸受容体としてアルカリ金属水酸化物、アルカリ金属
炭酸塩、アルカリ金属アルコラート、又はアミン類の存
在下で行う方法や特公平1−41633号公報に記載の
高濃度水酸化ナトリウム溶液中、相間移動触媒存在下で
行う方法に準じて行ってもよい。Further, the method described in JP-B-61-4395, which is carried out in the presence of an alkali metal hydroxide, an alkali metal carbonate, an alkali metal alcoholate or an amine as an acid acceptor, is disclosed in JP-B-41-6333. It may be carried out according to the method described in the publication in a high-concentration sodium hydroxide solution in the presence of a phase transfer catalyst.
【0033】カルボキシル保護基Rの除去方法として
は、例えばアルカリもしくは酸の存在下で一般式(5)
の化合物を加水分解する方法が挙げられる。ここで塩基
性触媒としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等
のアルカリ金属水酸化物、カリウム tert−ブトキ
シド等の有機金属塩基等が例示できる。また、酸性触媒
としては、塩酸、硫酸等の鉱酸、酢酸、トリフルオロ酢
酸等のカルボン酸、p−トルエンスルホン酸等のスルホ
ン酸等が例示できる。この反応において、使用される溶
媒としては、例えばメタノール、エタノール等のアルコ
ール類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル
類、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類、ベンゼ
ン、トルエン等の芳香族炭化水素類、1,2−ジクロロ
エタン等のハロゲン化炭化水素類、水又はこれらの混合
溶媒等が挙げられる。該反応は通常0℃からその使用す
る溶媒の沸点温度までの温度範囲で、好ましくは室温程
度で進行し、一般に0.5〜24時間程度で完結する。As a method for removing the carboxyl protecting group R, for example, a compound represented by the general formula (5) in the presence of an alkali or an acid:
A method of hydrolyzing the compound of the formula (1). Here, examples of the basic catalyst include alkali metal hydroxides such as sodium hydroxide and potassium hydroxide, and organic metal bases such as potassium tert-butoxide. Examples of the acidic catalyst include mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, carboxylic acids such as acetic acid and trifluoroacetic acid, and sulfonic acids such as p-toluenesulfonic acid. In this reaction, as a solvent used, for example, alcohols such as methanol and ethanol, ethers such as tetrahydrofuran and dioxane, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, and 1,2- Examples thereof include halogenated hydrocarbons such as dichloroethane, water, and a mixed solvent thereof. The reaction usually proceeds in a temperature range from 0 ° C. to the boiling point of the solvent used, preferably at about room temperature, and is generally completed in about 0.5 to 24 hours.
【0034】また、カルボキシル保護基Rがベンジル基
である場合、その除去は加水素分解によっても行うこと
ができる。When the carboxyl protecting group R is a benzyl group, the removal can also be carried out by hydrogenolysis.
【0035】斯くして本発明のメフェナセット化合物が
製造される。Thus, the mefenacet compound of the present invention is produced.
【0036】上記各反応で得られる目的とする本発明の
化合物は、通常の分離手段により反応系内より分離さ
れ、更に精製することができる。この分離及び精製手段
としては、例えば蒸留法、再結晶法、カラムクロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過ク
ロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、プレパラ
ティブ薄層クロマトグラフィー、溶媒抽出法等を採用で
きる。The target compound of the present invention obtained in each of the above reactions can be separated from the reaction system by a usual separation means and further purified. As the separation and purification means, for example, distillation, recrystallization, column chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography, preparative thin-layer chromatography, solvent extraction, and the like can be employed.
【0037】前記反応において出発原料として用いられ
る一般式(3)で表される2−ハロゲノベンゾチアゾー
ルは、入手容易な公知の化合物である。The 2-halogenobenzothiazole represented by the general formula (3) used as a starting material in the above reaction is a known compound that is easily available.
【0038】また、一般式(4)で表されるα−ヒドロ
キシアセトアニリド化合物は、公知の方法を適宜利用す
ることにより、種々の方法によって製造することができ
る。その内の一つとして、R=エチル基、n=3である
一般式(4)の化合物を例にとり説明すると、例えば、
市販されているN−ベンジルアニリンに4−ブロモ酪酸
エチルを一般的に用いられるN−アルキル化反応に従い
縮合させて4−(N−ベンジルアニリノ)酪酸エチルを
得、加水素分解等の脱ベンジル化反応に従い4−アニリ
ノ酪酸エチルを得、更にこれにベンジルオキシアセチル
クロリドを用いてN−アシル化反応に従い4−[N−
(ベンジルオキシアセチル)アニリノ]酪酸エチルに導
き、最後に脱ベンジル化反応させることで、上記目的化
合物を得ることができる。The α-hydroxyacetanilide compound represented by the general formula (4) can be produced by various methods by appropriately utilizing a known method. As one of them, a compound of the general formula (4) where R = ethyl group and n = 3 will be described as an example.
Ethyl 4-bromobutyrate is condensed with commercially available N-benzylaniline according to a commonly used N-alkylation reaction to obtain ethyl 4- (N-benzylanilino) butyrate, and debenzylation such as hydrogenolysis. According to the N-acylation reaction, ethyl 4-anilinobutyrate was obtained.
The above-mentioned target compound can be obtained by introducing ethyl ((benzyloxyacetyl) anilino] butyrate and finally performing a debenzylation reaction.
【0039】前記一般式(1)で表されるメフェナセッ
ト化合物は、メフェナセットと特異的に反応する免疫学
的反応体(例えば、抗体、より具体的にはポリクローナ
ル抗体もしくはモノクローナル抗体、又はメフェナセッ
トと結合可能な部位を含むそれらのフラグメント、ある
いは抗血清等)の調製においてハプテンとして用いるこ
とができ、更に各種の免疫学的測定方法の開発に必要な
標識抗原の調製に用いることができる。ここで「ハプテ
ン」とは、抗体との結合能を有しているものの、それ単
独では免疫原性を有さず、担体と結合することによって
免疫原性を発現する物質を意味する。従って、一般にハ
プテンは、担体と結合するための官能基を有する。The mefenacet compound represented by the general formula (1) is capable of binding to an immunological reactant (eg, an antibody, more specifically, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, or a mefenacet) that specifically reacts with mefenacet. Hapten in the preparation of fragments thereof containing various sites, or antiserum, etc.), and can be used for the preparation of labeled antigens necessary for the development of various immunological assay methods. Here, “hapten” refers to a substance that has an ability to bind to an antibody, but has no immunogenicity by itself and expresses immunogenicity when bound to a carrier. Therefore, haptens generally have a functional group for binding to a carrier.
【0040】前記一般式(1)で表される本発明のメフ
ェナセット化合物と担体又は標識物質との結合体の調
製、抗血清及びポリクローナル抗体の調製、モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマの分離及びハイブリ
ドーマが産生するモノクローナル抗体の調製の方法は、
いずれも常法、例えば、続生化学実験講座(日本生化学
会編)又は免疫生化学研究法(日本生化学会編)に記載
の方法で行うことができる。Preparation of a conjugate of the mefenacet compound of the present invention represented by the general formula (1) and a carrier or a labeling substance, preparation of antiserum and polyclonal antibody, separation of a hybridoma producing a monoclonal antibody, and production of a hybridoma The method of preparing a monoclonal antibody
Any of these methods can be performed by a conventional method, for example, a method described in the Seikagaku Experimental Course (edited by the Biochemical Society of Japan) or the Immunobiochemical Research Method (edited by the Japanese Biochemical Society).
【0041】前記一般式(1)で表されるメフェナセッ
ト化合物との結合体を調製する際には、従来から、一般
に用いられている公知の担体を用いることができる。こ
こで、担体とは、ハプテンと結合(コンジュゲート化)
してハプテンに免疫原性を付与する物質を意味する。担
体としては、例えば生体高分子化合物、例えば、分子量
が約1万以上、好ましくは約4万〜100万のタンパク
質(例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、オボア
ルブミン、ポリリジン、キーホールリンペットヘモシア
ニン等)、又は多糖類(例えばデキストラン、アミロー
ス、アミロペクチン等)、あるいは細胞(例えば、哺乳
類の赤血球、BCG菌等)等を挙げることができる。In preparing the conjugate with the mefenacet compound represented by the general formula (1), a known carrier generally used can be used. Here, the carrier is bound to the hapten (conjugation)
Means that imparts immunogenicity to the hapten. As the carrier, for example, a biopolymer compound, for example, a protein having a molecular weight of about 10,000 or more, preferably about 40,000 to 1,000,000 (eg, serum albumin, immunoglobulin, ovalbumin, polylysine, keyhole limpet hemocyanin, etc.) Or polysaccharides (eg, dextran, amylose, amylopectin, etc.) or cells (eg, mammalian erythrocytes, BCG bacteria, etc.).
【0042】一方、前記一般式(1)で表されるメフェ
ナセット化合物は、前記担体と結合することのできる官
能基を有している。この官能基は、前記担体と結合する
ことのできるものであればよく、用いる担体に応じて適
宜選択することができる。On the other hand, the mefenacet compound represented by the general formula (1) has a functional group capable of binding to the carrier. The functional group may be any as long as it can bind to the carrier, and can be appropriately selected depending on the carrier used.
【0043】例えば、担体として高分子化合物であるタ
ンパク質を用いる場合は、そのアミノ基と結合すること
のできる官能基として、例えばカルボキシル基、アルデ
ヒド基、アミノ基、エポキシ基等を、またタンパク質の
チオール基と結合することのできる官能基として、例え
ばチオール基、マレイミド基等を挙げることができる。
また多糖類の場合には、水酸基と結合することのできる
官能基として、例えばカルボキシル基、アルデヒド基、
エポキシ基等を挙げることができる。For example, when a protein, which is a high molecular compound, is used as a carrier, a functional group capable of binding to the amino group includes, for example, a carboxyl group, an aldehyde group, an amino group, an epoxy group, and the like. Examples of the functional group capable of binding to a group include a thiol group and a maleimide group.
In the case of polysaccharides, as a functional group capable of binding to a hydroxyl group, for example, a carboxyl group, an aldehyde group,
Epoxy groups and the like can be mentioned.
【0044】本発明のメフェナセット化合物と担体との
結合は、従来公知の方法を用いて行うことができる。例
えば、担体として高分子化合物であるタンパク質を用い
る場合には、混合酸無水物法、活性エステル法、カルボ
ジイミド法等の従来公知の結合方法によって本発明メフ
ェナセット化合物とタンパク質との結合体を調製するこ
とができる。The binding of the mefenacet compound of the present invention to a carrier can be carried out by a conventionally known method. For example, when a protein which is a polymer compound is used as a carrier, a conjugate of the present mefenacet compound and a protein is prepared by a conventionally known bonding method such as a mixed acid anhydride method, an active ester method, and a carbodiimide method. Can be.
【0045】また、本発明においては、前記一般式
(1)で表されるメフェナセット化合物を標識物質と結
合させることができる。標識物質としては、公知の標識
を用いることができ、例えば、酵素(例えば、ペルオキ
シダーゼ、アルカリホスファターゼ等)、発光物質(例
えば、ルミノール、アクリジニウム誘導体等)、蛍光物
質(例えば、フルオレセイン、ユーロピウムキレート
等)を挙げることができる。斯かる標識物質は、上記と
同様の操作によって本発明のメフェナセット化合物と結
合させることができる。得られた結合体は、測定対象と
なるメフェナセットとの競合反応に用いることができ
る。In the present invention, the mefenacet compound represented by the general formula (1) can be bound to a labeling substance. As the labeling substance, known labels can be used. For example, enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), luminescent substances (eg, luminol, acridinium derivatives, etc.), fluorescent substances (eg, fluorescein, europium chelate, etc.) Can be mentioned. Such a labeling substance can be bound to the mefenacet compound of the present invention by the same operation as described above. The obtained conjugate can be used for a competitive reaction with mefenacet to be measured.
【0046】本発明の免疫学的反応体は、例えば次のよ
うにして調製される。The immunological reactant of the present invention is prepared, for example, as follows.
【0047】例えば、本発明による抗血清又はポリクロ
ーナル抗体の調製には、前記一般式(1)で表されるメ
フェナセット化合物と担体との結合体を免疫原に用いる
ことができる。免疫は、哺乳動物や鳥類(例えば、マウ
ス、ウサギ、又は鶏等)ヘ、通常の方法、例えば、免疫
原溶液を等量のフロイントの完全アジュバント又は不完
全アジュバントと乳化混合したものを接種(初回免疫)
し、以後2〜4週間の間隔で数回免疫することによって
行うことができる。その後、免疫した動物から血液を採
取し、ポリクローナル抗体を含む抗血清を調製する。そ
の後、DEAEイオン交換クロマトグラフィー又はプロ
テインGアフィニティークロマトグラフィー等により、
抗血清からポリクローナル抗体を精製することができ
る。For example, in preparing an antiserum or polyclonal antibody according to the present invention, a conjugate of a mefenacet compound represented by the above general formula (1) and a carrier can be used as an immunogen. Immunization is performed by inoculating a mammal or bird (eg, mouse, rabbit, or chicken) with a usual method, for example, by emulsifying and mixing an immunogen solution with an equal amount of Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant (first time). Immunity)
Thereafter, immunization can be performed several times at intervals of 2 to 4 weeks. Thereafter, blood is collected from the immunized animal, and an antiserum containing a polyclonal antibody is prepared. Then, by DEAE ion exchange chromatography or protein G affinity chromatography, etc.
A polyclonal antibody can be purified from the antiserum.
【0048】また、前記一般式(1)で表されるメフェ
ナセット化合物と担体との結合体を免疫原に用い、本発
明によるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を分離することができる。The hybridoma producing the monoclonal antibody according to the present invention can be isolated by using the conjugate of the mefenacet compound represented by the general formula (1) and a carrier as an immunogen.
【0049】例えば、最終免疫して数日後の動物(例え
ば、マウス)から脾臓を無菌的に取り出し、ステンレス
スチールメッシュ等で押しつぶして脾臓細胞を調製し、
細胞融合工程に用いる。細胞融合の他の一方の親細胞で
あるミエローマ細胞(骨髄腫細胞)は、各種の公知の細
胞株、例えば、P3・NS−1/1・Ag4.1[Eu
r.J.Immunol.,5;511−517(19
75)]、SP2/0−Ag14[Nature,27
6;269−270(1978)]、P3−X63−A
g8.653[J.Immunol.,123;154
8−1550(1979)]等を使用することができ
る。For example, a spleen is aseptically removed from an animal (eg, a mouse) several days after the final immunization, and crushed with a stainless steel mesh or the like to prepare spleen cells.
Used for the cell fusion step. Myeloma cells (myeloma cells), which are the other parent cell of the cell fusion, are various known cell lines, for example, P3 NS-1 / 1 Ag 4.1 [Eu
r. J. Immunol. , 5; 511-517 (19
75)], SP2 / 0-Ag14 [Nature, 27
6; 269-270 (1978)], P3-X63-A
g8.653 [J. Immunol. , 123; 154.
8-1550 (1979)].
【0050】細胞融合は、通常の方法、例えば、公知の
融合促進剤を含む培地[例えば、市販の細胞融合用ポリ
エチレングリコール(分子量1500;ベーリンガーマ
ンハイム社製)]中で、脾臓細胞とミエローマ細胞とを
よく混合することによって行うことができ、細胞の混合
比率も常法に従って、例えば、マウスの脾臓細胞に対し
てミエローマ細胞を約1/5〜1/10程度の割合で行
うことができる。融合後、選択用培地(例えば、HAT
培地)を用いて、ハイブリドーマのみを増殖させる。そ
れらの内、培養上清中に目的のモノクローナル抗体を分
泌しているハイブリドーマは、例えば、培養上清のメフ
ェナセットとの反応性を酵素結合免疫測定法(ELIS
A)でスクリーニングすることによって確認し、選択す
ることができる。また、これらのハイブリドーマは、通
常、細胞クローニング法、例えば、限界希釈法を用いて
分離でき、公知の培地で継代培養し、液体窒素中で容易
に長期間保存することができる。Cell fusion can be carried out by a conventional method, for example, by spleen cells and myeloma cells in a medium containing a known fusion promoter [eg, commercially available polyethylene glycol for cell fusion (molecular weight: 1500; manufactured by Boehringer Mannheim)]. The myeloma cells can be mixed with the spleen cells of the mouse at a ratio of about 1/5 to 1/10 according to a conventional method. After fusion, a selection medium (eg, HAT
Medium) to grow only the hybridomas. Among them, hybridomas secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant can be used, for example, to measure the reactivity of the culture supernatant with mefenacet by enzyme-linked immunosorbent assay (ELIS).
It can be confirmed and selected by screening in A). In addition, these hybridomas can be usually separated using a cell cloning method, for example, a limiting dilution method, can be subcultured in a known medium, and can be easily stored in liquid nitrogen for a long period of time.
【0051】また、ハイブリドーマ(モノクローナル抗
体産生細胞)の産生するモノクローナル抗体は、これを
培養することにより、容易に調製することができる。特
に、イン・ビトロの培養では、例えば、5%二酸化炭素
及び37℃条件下で培養に適した任意の培地を用いて培
養することができ、好適にはダルベコ培地に10%ウシ
胎児血清(以下「FBS」と略す)を含む培地(以下、
「ダルベコ/10%FBS培地」と略す)を用いること
ができる。またイン・ビボの培養では、用いたミエロー
マと同種の動物、例えば、マウスの腹腔中で培養するの
が好ましい。これらの培養上清又は腹水を各々モノクロ
ーナル抗体溶液として用いることができる。A monoclonal antibody produced by a hybridoma (monoclonal antibody-producing cell) can be easily prepared by culturing it. In particular, in the in vitro culture, for example, the culture can be performed using 5% carbon dioxide and any medium suitable for culture under the conditions of 37 ° C., and preferably, 10% fetal bovine serum (hereinafter referred to as “Dalbeco medium”). (Hereinafter abbreviated as “FBS”)
"Dulbeco / 10% FBS medium" can be used. In the in vivo culture, it is preferable to culture in the peritoneal cavity of an animal of the same species as the myeloma used, for example, a mouse. Each of these culture supernatants or ascites can be used as a monoclonal antibody solution.
【0052】また、抗血清や培養上清、あるいは腹水を
出発材料として、抗体を精製することもできる。抗体の
精製には、タンパク質の精製に一般的な方法、例えば硫
安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロ
マトグラフィー、プロテインAもしくはプロテインG結
合ポリマー等を用いるアフィニティークロマトグラフィ
ー、又は透析等の方法を適宜組み合わせて用いることが
できる。[0052] Antibodies can also be purified using antiserum, culture supernatant, or ascites as a starting material. For antibody purification, a method generally used for protein purification, such as ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, affinity chromatography using a protein A or protein G binding polymer, or a method such as dialysis. They can be used in appropriate combination.
【0053】本発明のメフェナセットの免疫学的測定方
法によれば、前記の免疫学的反応体(ポリクローナル抗
体又はモノクローナル抗体、あるいは抗血清)を用いて
実施するので、メフェナセットを正確に分析することが
できる。すなわち、本発明の免疫学的測定方法によっ
て、メフェナセットの存在の検出、半定量的測定又は定
量的測定を行うことができる。本発明による免疫学的測
定方法は、メフェナセットに特異的に反応する免疫学的
反応体を用いることを除けば、それ以外の点では従来公
知の免疫学的測定方法、例えば、酵素免疫測定方法、蛍
光免疫測定方法又は放射性免疫測定方法等を適用するこ
とができる。According to the method for immunologically measuring mefenacet of the present invention, the immunological reactant (polyclonal antibody or monoclonal antibody, or antiserum) is used, so that the mefenacet can be accurately analyzed. it can. That is, detection of the presence of mefenacet, semi-quantitative measurement, or quantitative measurement can be performed by the immunological measurement method of the present invention. The immunological assay method according to the present invention, except that an immunological reactant specifically reacting to mefenacet is used, otherwise, a conventionally known immunological assay method, for example, an enzyme immunoassay method, A fluorescent immunoassay, a radioimmunoassay, or the like can be applied.
【0054】本発明方法に従えば、環境水中等に残留し
ている可能性のある除草剤メフェナセットを測定するこ
とができる。被検試料は、メフェナセットを含有する試
料である限り特に限定されるものではない。According to the method of the present invention, mefenacet, a herbicide that may possibly remain in environmental water or the like, can be measured. The test sample is not particularly limited as long as it is a sample containing mefenacet.
【0055】本発明による免疫学的測定方法を、例え
ば、通常抗原標識法と呼ばれる方法、すなわち、上記抗
体もしくは抗体フラグメントを固相化した後、メフェナ
セット化合物と標識物質との結合体である標識化メフェ
ナセット化合物(標準品)と、試料中の検査対象化合物
メフェナセットとを競合阻害反応させる方法等に適用す
ることができる。ここでは、本発明による免疫学的測定
方法の内、抗原標識法について以下に説明する。The immunoassay according to the present invention is carried out, for example, by a method usually called an antigen labeling method, that is, after immobilizing the above-mentioned antibody or antibody fragment, labeling which is a conjugate of a mefenacet compound and a labeling substance. The present invention can be applied to a method of causing a competitive inhibition reaction between a mefenacet compound (standard) and a test compound mefenacet in a sample. Here, among the immunological measurement methods according to the present invention, the antigen labeling method will be described below.
【0056】本発明方法は、例えば、 (1)メフェナセットと特異的に反応する免疫学的反応
体、特に抗体もしくは抗体フラグメントを固相化する
(以下、「固相化抗体」と略す)工程; (2)被検試料が水性試料の場合には、その被検試料を
ろ紙等でろ過し、また被検試料が土壌等の場合には、被
検試料中に含まれていることのあるメフェナセットを抽
出することのできる有機溶媒で被検試料を抽出処理し、
検体を調製する工程; (3)前記固相化抗体と検体と標識化メフェナセット化
合物とを接触させ、反応させる工程; (4)固相化抗体に結合した標識化メフェナセット化合
物と、結合していない標識化メフェナセット化合物とを
分離する工程; (5)前記工程(4)で分離した、いずれか一方、好ま
しくは固相化抗体と結合した標識化メフェナセット化合
物に由来する信号を測定する工程からなる。The method of the present invention includes, for example, (1) a step of immobilizing an immunological reactant specifically reacting with mefenacet, particularly an antibody or an antibody fragment (hereinafter, abbreviated as “immobilized antibody”); (2) When the test sample is an aqueous sample, the test sample is filtered with a filter paper or the like. When the test sample is soil or the like, a mephena set that may be contained in the test sample is used. Extracting the test sample with an organic solvent capable of extracting
A step of preparing a specimen; (3) a step of bringing the solid-phased antibody and the specimen into contact with a labeled mefenacet compound to cause a reaction; and (4) a step of not binding to the labeled mefenacet compound bound to the solid-phased antibody. Separating a labeled mefenacet compound from the labeled mefenacet compound; and (5) measuring a signal derived from the labeled mefenacet compound bound to one or the other, preferably an immobilized antibody, separated in the step (4).
【0057】本発明方法を実施する場合には、前記のよ
うに、標識化メフェナセット化合物を用いてメフェナセ
ットの確認又は定量を行うことができる。メフェナセッ
ト化合物の標識には、公知の標識物、例えば、放射性同
位体(例えば、:32P、35S、3H等)、酵素(例え
ば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ
等)、ビタミン(例えば、ビオチン等)、蛍光物質(例
えば、FITC等)、又は化学発光物質(例えば、アク
リジニウム等)等を用いることができる。When the method of the present invention is carried out, as described above, mefenacet can be confirmed or quantified using a labeled mefenacet compound. For labeling the mefenacet compound, known labels, for example, radioisotopes (for example: 32 P, 35 S, 3 H, etc.), enzymes (for example, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), vitamins (for example, biotin, etc.) , A fluorescent substance (for example, FITC or the like), or a chemiluminescent substance (for example, acridinium) can be used.
【0058】また、本発明方法では、固相化抗体と標識
化メフェナセット化合物との反応が終了した後で、固相
化抗体に結合しなかった標識化メフェナセット化合物を
分離する。分離は、例えば、ろ過、遠心処理又は緩衝液
による洗浄によって行うことができる。In the method of the present invention, after the reaction between the immobilized antibody and the labeled mefenacet compound is completed, the labeled mefenacet compound not bound to the immobilized antibody is separated. Separation can be performed, for example, by filtration, centrifugation, or washing with a buffer.
【0059】分離後、例えば固相化抗体と結合した標識
化メフェナセット化合物からの信号を測定することがで
きる。信号を測定する際には、反応系を信号測定に適し
た条件に変えるのが好ましい。例えば、標識物として、
蛍光又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こら
ない条件で信号を検出する。前記の免疫学的測定法にお
いては、適当な対照液(例えば、固相化抗体とメフェナ
セット化合物との結合体)をコントロールとして使用す
ることができる。After separation, for example, a signal from the labeled mefenacet compound bound to the immobilized antibody can be measured. When measuring a signal, it is preferable to change the reaction system to conditions suitable for signal measurement. For example, as a sign,
When a fluorescent or chemiluminescent substance is used, a signal is detected under conditions where quenching does not occur. In the above immunoassay, an appropriate control solution (for example, a conjugate of an immobilized antibody and a mefenacet compound) can be used as a control.
【0060】[0060]
【実施例】以下、実施例を掲げて本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。EXAMPLES The present invention will now be described specifically with reference to examples, but these do not limit the scope of the present invention.
【0061】実施例14−[N−(ベンジルオキシアセチル)アニリノ]酪酸
エチル(12)の合成 Example 1 4- [N- (benzyloxyacetyl) anilino] butyric acid
Synthesis of ethyl (12)
【0062】[0062]
【化7】 Embedded image
【0063】N−ベンジルアニリン(6)(6.4g、
35ミリモル)と4−ブロモ酪酸エチル(7)(8.6
g、42ミリモル)とを炭酸カリウム(7.3g、54
ミリモル)存在下、アセトニトリル(100ml)中で
88時間加熱環流した。反応液をろ過し、ろ液を減圧下
で濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルに溶かし、1N
塩酸で洗浄後、酢酸エチル溶液を減圧下で濃縮して、4
−(N−ベンジルアニリノ)酪酸エチル(8)を得た。
橙黄色油状物、収量7g。N-benzylaniline (6) (6.4 g,
35 mmol) and ethyl 4-bromobutyrate (7) (8.6)
g, 42 mmol) and potassium carbonate (7.3 g, 54 mmol).
(Mmol) in acetonitrile (100 ml) for 88 hours. The reaction solution was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The obtained residue is dissolved in ethyl acetate, and 1N
After washing with hydrochloric acid, the ethyl acetate solution was concentrated under reduced pressure to give 4
Ethyl- (N-benzylanilino) butyrate (8) was obtained.
Orange-yellow oil, yield 7 g.
【0064】4−(N−ベンジルアニリノ)酪酸エチル
(8)(4.9g、16ミリモル)をメタノール(50
ml)に溶かし、10%パラジウム炭素(0.1g)を
加え、水素雰囲気下で撹拌した。反応終了後、ろ過し、
ろ液を減圧下で濃縮し、4−アニリノ酪酸エチル(9)
を得た。淡赤色油状物、収量3.7g。Ethyl 4- (N-benzylanilino) butyrate (8) (4.9 g, 16 mmol) was added to methanol (50
ml), 10% palladium on carbon (0.1 g) was added, and the mixture was stirred under a hydrogen atmosphere. After completion of the reaction, the mixture is filtered,
The filtrate is concentrated under reduced pressure, and ethyl 4-anilinobutyrate (9)
I got Pale red oil, yield 3.7 g.
【0065】4−アニリノ酪酸エチル(9)(3.7
g、17ミリモル)とピリジン(1.3g、17ミリモ
ル)とをベンゼン(30ml)に溶かし、水冷下撹拌し
た。この溶液にベンジルオキシアセチルクロリド(1
0)(3.2g、17ミリモル)を加え、室温に戻して
1時間撹拌した。反応液に水を加え、分液し、有機層を
1N塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食
塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃
縮した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3:2)で精製し、
4−[N−(ベンジルオキシアセチル)アニリノ]酪酸
エチル(11)を得た。黄色油状物、収量2.9g。Ethyl 4-anilinobutyrate (9) (3.7)
g, 17 mmol) and pyridine (1.3 g, 17 mmol) were dissolved in benzene (30 ml) and stirred under water cooling. To this solution was added benzyloxyacetyl chloride (1
0) (3.2 g, 17 mmol) was added, and the mixture was returned to room temperature and stirred for 1 hour. Water was added to the reaction solution, the layers were separated, and the organic layer was washed successively with 1N hydrochloric acid, water, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and saturated saline, dried over anhydrous magnesium sulfate and concentrated. The obtained oil was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 3: 2).
Ethyl 4- [N- (benzyloxyacetyl) anilino] butyrate (11) was obtained. Yellow oil, yield 2.9 g.
【0066】4−[N−(ベンジルオキシアセチル)ア
ニリノ]酪酸エチル(11)(2.7g、7.6ミリモ
ル)をメタノール(40ml)に溶かし、10%パラジ
ウム炭素(0.1g)、触媒量の60%過塩素酸を加
え、水素雰囲気下で撹拌した。反応終了後、ろ過し、ろ
液を減圧下で濃縮した。得られた油状物をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3:
2)で精製し、標記化合物(12)を得た。無色油状
物、収量1.6g。Ethyl 4- [N- (benzyloxyacetyl) anilino] butyrate (11) (2.7 g, 7.6 mmol) was dissolved in methanol (40 ml), 10% palladium on carbon (0.1 g), catalytic amount Was added and stirred under a hydrogen atmosphere. After completion of the reaction, the mixture was filtered, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. The obtained oil is subjected to silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 3:
Purification in 2) gave the title compound (12). Colorless oil, yield 1.6 g.
【0067】実施例2ベンゾチアゾリルオキシ−N−[3−(エトキシカルボ
ニル)プロピル]アセトアニリド(14)の合成 Example 2 Benzothiazolyloxy-N- [3- (ethoxycarbo
Synthesis of [nyl) propyl] acetanilide (14)
【0068】[0068]
【化8】 Embedded image
【0069】60%油性水素化ナトリウム(0.18
g、4.5ミリモル)をヘキサンで洗浄後、N,N−ジ
メチルホルムアミド(5ml)を加え、窒素雰囲気下で
撹拌した。この懸濁液に4−[N−(ベンジルオキシア
セチル)アニリノ]酪酸エチル(12)(1.0g、
3.8ミリモル)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液
(5ml)を氷冷下で加えた。室温に戻し、30分後、
2−クロロベンゾチアゾール(13)(0.70g、
4.2ミリモル)のN,N−ジメチルホルムアミド溶液
(10ml)を加えた。1.5時間後、希塩酸を加え、
エーテル(60ml、3回)で抽出した。有機層を飽和
食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧
下濃縮した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル=3:2)で精製
し、標記化合物(14)を得た。淡黄色油状物、収量
0.3g。60% oily sodium hydride (0.18
g, 4.5 mmol) was washed with hexane, N, N-dimethylformamide (5 ml) was added, and the mixture was stirred under a nitrogen atmosphere. Ethyl 4- [N- (benzyloxyacetyl) anilino] butyrate (12) (1.0 g,
(3.8 mmol) in N, N-dimethylformamide (5 ml) was added under ice-cooling. Return to room temperature and after 30 minutes,
2-chlorobenzothiazole (13) (0.70 g,
4.2 mmol) in N, N-dimethylformamide (10 ml) was added. 1.5 hours later, dilute hydrochloric acid was added,
Extracted with ether (60 ml, 3 times). The organic layer was washed with saturated saline, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated under reduced pressure. The obtained oil was purified by silica gel column chromatography (hexane: ethyl acetate = 3: 2) to obtain the title compound (14). Pale yellow oil, yield 0.3 g.
【0070】実施例3N−(ベンゾチアゾリルオキシメチル)−N−フェニル
カルバモイル酪酸(15)の合成 Example 3 N- (benzothiazolyloxymethyl) -N-phenyl
Synthesis of carbamoyl butyric acid (15)
【0071】[0071]
【化9】 Embedded image
【0072】ベンゾチアゾリルオキシ−N−[3−(エ
トキシカルボニル)プロピル]アセトアニリド(14)
(0.3g、0.75ミリモル)をエタノール(20m
l)に溶かし、0.6%(w/w)水酸化ナトリウム水
溶液(10ml、1.5ミリモル)を加え、室温で撹拌
した。6時間後、反応液を減圧下で濃縮し、残渣に水を
加えて、酢酸エチル(60ml、3回)で洗浄した。水
層を希塩酸で酸性にし、酢酸エチル(60ml、3回)
で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥後、濃縮して得られた固体残渣をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム:メタ
ノール=15:1)で精製し、標記化合物(15)を得
た。白色固体、収量0.2g。Benzothiazolyloxy-N- [3- (ethoxycarbonyl) propyl] acetanilide (14)
(0.3 g, 0.75 mmol) in ethanol (20 m
l), a 0.6% (w / w) aqueous sodium hydroxide solution (10 ml, 1.5 mmol) was added, and the mixture was stirred at room temperature. After 6 hours, the reaction solution was concentrated under reduced pressure, water was added to the residue, and the mixture was washed with ethyl acetate (60 ml, 3 times). The aqueous layer was acidified with diluted hydrochloric acid, and ethyl acetate (60 ml, 3 times)
Extracted. The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous magnesium sulfate, and concentrated. The solid residue obtained was purified by silica gel column chromatography (chloroform: methanol = 15: 1) to obtain the title compound (15). Was. White solid, yield 0.2 g.
【0073】1H−NMR:1.75-2.08 (2
H,m),2.43 (2H,t),3.81(2H,
t),4.83(2H,s),7.08-7.72(9
H,m)。 1 H-NMR: 1.75 to 2.08 (2
H, m), 2.43 (2H, t), 3.81 (2H,
t), 4.83 (2H, s), 7.08-7.72 (9
H, m).
【0074】実施例4メフェナセット化合物と担体タンパク質との結合体の調
製 免疫原としてウシ血清アルブミン(BSA)と本発明の
メフェナセット化合物(ハプテン)の結合体を混合酸無
水物法を用いて作製した。Example 4 Preparation of Conjugate of Mefenacet Compound and Carrier Protein
Mefenacet compounds of the present invention with bovine serum albumin (BSA) as a manufacturing immunogen was prepared using a mixed acid anhydride method a conjugate of (hapten).
【0075】上記実施例3で製造したN−(ベンゾチア
ゾリルオキシメチル)−N−フェニルカルバモイル酪酸
(15)の25mgを2mlの無水ジオキサンに溶解
し、0.05mlのN−メチルモルホリンを加えて10
℃で20分間撹拌し、更に0.02mlのクロロ蟻酸イ
ソブチルを少しづつ添加し15分間撹拌して、N−(ベ
ンゾチアゾリルオキシメチル)−N−フェニルカルバモ
イル酪酸(15)の混合酸無水物を調製した。一方、8
0mgのBSAを4.3mlの蒸留水に溶解したのち、
1NのNaOHでPH9.5に調整し、さらに10℃で
ジオキサン2.6mlを滴下した。このBSA溶液に、
1NのNaOH溶液でpH9に保ちながら先に調製した
(15)の混合酸無水物溶液を徐々に滴下し、4℃で4
時間撹拌した。反応終了後、4℃で一晩蒸留水に対して
透析した後、凍結乾燥してフリーザー内に貯蔵した。こ
うして得られたメフェナセット化合物とBSAとの結合
体を免疫原として使用した。25 mg of N- (benzothiazolyloxymethyl) -N-phenylcarbamoylbutyric acid (15) prepared in Example 3 was dissolved in 2 ml of anhydrous dioxane, and 0.05 ml of N-methylmorpholine was added. Ten
At 20 ° C. for 20 minutes, further add 0.02 ml of isobutyl chloroformate little by little, and stir for 15 minutes to obtain a mixed anhydride of N- (benzothiazolyloxymethyl) -N-phenylcarbamoylbutyric acid (15). Was prepared. On the other hand, 8
After dissolving 0 mg of BSA in 4.3 ml of distilled water,
The pH was adjusted to 9.5 with 1N NaOH, and 2.6 ml of dioxane was added dropwise at 10 ° C. In this BSA solution,
While maintaining the pH at 9 with a 1N NaOH solution, the mixed acid anhydride solution of (15) prepared above was gradually dropped, and the solution was added at 4 ° C for 4 hours.
Stirred for hours. After completion of the reaction, the mixture was dialyzed against distilled water at 4 ° C. overnight, lyophilized, and stored in a freezer. The conjugate of the thus obtained mefenacet compound and BSA was used as an immunogen.
【0076】また、コーティング抗原として用いるため
に、N−(ベンゾチアゾリルオキシメチル)−N−フェ
ニルカルバモイル酪酸(15)とウサギ血清アルブミン
(RSA)との結合体も同様の方法で調製した。For use as a coating antigen, a conjugate of N- (benzothiazolyloxymethyl) -N-phenylcarbamoylbutyric acid (15) and rabbit serum albumin (RSA) was prepared in the same manner.
【0077】実施例5モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作成と抗体の
作製 実施例4で調製した免疫原を1mg/mlになるように
生理的リン酸緩衝液に溶解し、アジュバントと等量混合
した後、Balb/cマウスに100μlをマウス腹腔
内に投与した。その後、2週間毎に追加免疫した。尾血
管から採取した血液の血清中の抗体力価が高くなったマ
ウスの脾臓を摘出し、DMEM培地(ダルベコ改変イー
グル培地)を入れたシャーレ内で摘出した脾臓をハサミ
で傷をつけ、注射筒で培地を脾臓内に注入して細胞を追
い出した。培地を遠沈管に移し、大きな組織片を沈降さ
せるために5分間静置した。脾臓細胞が浮遊している上
清を静かに取り、単細胞の懸濁液を300g、4分間遠
心して細胞を集め、脾臓細胞を調製した。マウスのミエ
ローマ細胞(P3X63Ag8.653)を細胞数の比
で5:1(ミエローマ細胞:脾臓細胞)になるように混
合し、300g、4分間遠心して細胞を集めた。次に、
DMEM培地に沈殿細胞を懸濁し、37℃に暖めておい
た50%ポリエチレングリコール(分子量1,500)
溶液1mlを60秒かけてゆっくり加え細胞融合を行っ
た。DMEM培地10mlを加えた後、牛胎児血清1m
lを添加した。遠心によって集められた細胞を細胞数が
5×105個/mlになるように調製した。細胞懸濁液
を96穴プラスチックプレートに100μl/ウェルの
量を分注して、37℃にて5%二酸化炭素の気相中でイ
ンキュべーションした。毎日ウェル中の培地の半量をH
AT培地で置換して、10日から14日間培養した。培
養液中の抗体の活性をELISA法で調べ、目的とする
抗体を産生しているウェルの細胞について、96穴のプ
ラスチックプレートで、HAT培地を用い、限界希釈法
によりハイブリドーマのクローニングを行った。クロー
ニングした結果、最終的に抗メフェナセット抗体を産生
している安定なハイブリドーマ2株を得た。これらの株
をそれぞれK73214及びK73354と名付け、こ
のハイブリドーマ株をDMEMに10%牛胎児血清を含
む培地で培養した。培養液の遠心上清をモノクローナル
抗体溶液とし、それぞれ「モノクローナル抗体K732
14」(以下単に「抗体K73214」という)及び
「モノクローナル抗体K73354」(以下単に「抗体
K73354」という)とした。調製したモノクローナ
ル抗体溶液はPBSで希釈して抗原固相化ELISA法
によりメフェナセットの反応性を調べた。Example 5 Preparation of monoclonal antibody-producing hybridoma and antibody production
The immunogen prepared in Preparation Example 4 was dissolved in a physiological phosphate buffer to a concentration of 1 mg / ml, mixed with an adjuvant in an equal amount, and then 100 μl of Balb / c mice was intraperitoneally administered to the mice. Thereafter, a booster was given every two weeks. The spleen of the mouse whose antibody titer in the serum of the blood collected from the tail blood vessel became high was excised, and the spleen excised in a Petri dish containing DMEM medium (Dulbeco's modified Eagle medium) was cut with scissors, The medium was injected into the spleen to drive out the cells. The medium was transferred to a centrifuge tube and left for 5 minutes to sediment large pieces of tissue. The supernatant in which the spleen cells were floating was gently removed, and the single cell suspension was centrifuged at 300 g for 4 minutes to collect the cells, thereby preparing spleen cells. Mouse myeloma cells (P3X63Ag8.653) were mixed at a cell ratio of 5: 1 (myeloma cells: spleen cells), and the cells were collected by centrifugation at 300 g for 4 minutes. next,
Precipitated cells are suspended in DMEM medium and warmed to 37 ° C. in 50% polyethylene glycol (molecular weight 1,500).
1 ml of the solution was slowly added over 60 seconds to perform cell fusion. After adding 10 ml of DMEM medium, 1 m of fetal bovine serum
1 was added. The cells collected by centrifugation were prepared so that the cell number was 5 × 10 5 cells / ml. The cell suspension was dispensed into a 96-well plastic plate in an amount of 100 μl / well and incubated at 37 ° C. in a gas phase of 5% carbon dioxide. Half of the medium in the wells is
The medium was replaced with AT medium and cultured for 10 to 14 days. The activity of the antibody in the culture solution was examined by ELISA, and the cells in the wells producing the desired antibody were cloned by a limiting dilution method using a HAT medium in a 96-well plastic plate using a HAT medium. As a result of cloning, finally, two stable hybridoma strains producing an anti-mefenacet antibody were obtained. These strains were named K73214 and K73354, respectively, and the hybridoma strains were cultured in a medium containing 10% fetal calf serum in DMEM. The centrifuged supernatant of the culture solution was used as a monoclonal antibody solution.
14 "(hereinafter simply referred to as" antibody K73214 ") and" monoclonal antibody K73354 "(hereinafter simply referred to as" antibody K73354 "). The prepared monoclonal antibody solution was diluted with PBS, and the reactivity of mefenacet was examined by an antigen-immobilized ELISA method.
【0078】以下にモノクローナル抗体とメフェナセッ
トとの反応性の測定例を示す。An example of the measurement of the reactivity between the monoclonal antibody and mefenacet is shown below.
【0079】1)96穴マイクロプレートにメフェナセ
ットとRSAとの結合体(100 ng/ml)を100
μl/ウェルの量を加えて4℃で一晩インキュベーショ
ンしてプレートに吸着させた。洗浄緩衝液で5回洗浄
後、3%スキムミルク溶液又は4倍希釈のブロックエー
ス(Block−Ace、大日本製薬(株)製)溶液の
250μl/ウェル量を加え、25℃で1時間インキュ
ベーションした後、プレートを洗浄した。1) 100 conjugates of mefenacet and RSA (100 ng / ml) were placed in a 96-well microplate.
A volume of μl / well was added and incubated overnight at 4 ° C. to adsorb to the plate. After washing 5 times with a washing buffer, 250 μl / well volume of a 3% skim milk solution or a 4-fold diluted Block Ace (Block-Ace, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 1 hour. The plate was washed.
【0080】2)モノクローナル抗体をPBSで3,0
00倍に希釈した溶液とメフェナセット溶液の各々50
μlをウェルに加え、1時間インキュベーションした
後、プレートを洗浄した。2) Monoclonal antibody was added to PBS at 3,0
50 times each of the 100-fold diluted solution and the mefenacet solution
μl was added to the wells and after 1 hour incubation, the plate was washed.
【0081】3)西洋ワサビペルオキシダーゼを結合し
た抗マウスIgGヤギ抗体(第二抗体)をPBSで5,
000倍に希釈し、100μl/ウェルを加え、25℃
で1時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し
た。3) Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG goat antibody (second antibody) was
Dilute 000-fold, add 100 μl / well, and add
After incubation for 1 hour, the plate was washed.
【0082】4)0.2%のo−フェニレンジアミン発
色溶液(100mMリン酸クエン酸緩衝液(PH5.
0)、0.003%過酸化水素水)の200μl/ウェ
ルを加え、25℃で10分間インキュベーションした
後、4N硫酸50μl/ウェルを加えて酵素反応を止
め、492nm及び630nmの吸光度をマイクロプレ
ートリーダーで測定した。抗メフェナセット抗体を用い
た場合のELISA法によるメフェナセットとRSAと
の結合体の濃度は100ng/mlを用い、抗体の3,
000倍希釈溶液とメタノールに溶解したメフェナセッ
ト標準ストック溶液を0.1ng/mlから3,000
ng/mlの濃度になるようにPBSで段階的に希釈し
た溶液をウェルに加え、第二抗体を5,000倍に希釈
したものを用いることにより作成したメフェナセットの
標準阻害曲線を図1に示す。阻害率は次式より算出して
示した。4) 0.2% o-phenylenediamine coloring solution (100 mM phosphate citrate buffer (PH5.
0), 0.003% aqueous hydrogen peroxide), 200 μl / well, and incubated at 25 ° C. for 10 minutes. Then, 50 μl / well of 4N sulfuric acid was added to stop the enzyme reaction, and the absorbance at 492 nm and 630 nm was measured using a microplate reader. Was measured. The concentration of a conjugate of mefenacet and RSA by ELISA when an anti-mefenacet antibody was used was 100 ng / ml.
A 1000-fold diluted solution and a mefenacet standard stock solution dissolved in methanol were prepared from 0.1 ng / ml to 3000
FIG. 1 shows a standard inhibition curve of mefenacet prepared by adding a solution serially diluted with PBS to a concentration of ng / ml to a well and using a 5,000-fold dilution of the second antibody. . The inhibition rate was calculated and shown by the following equation.
【0083】阻害率(%)=(標準試料の吸光度/コン
トロールの吸光度)×100 図2から明らかなように、両者のモノクローナル抗体は
非常に似た特性を示し、1〜50ng/mlの範囲でメ
フェナセットの測定が可能であり、50%阻害を示す価
(IC50値)は7ng/mlであった。Inhibition ratio (%) = (absorbance of standard sample / absorbance of control) × 100 As is clear from FIG. 2, both monoclonal antibodies show very similar properties, and are in the range of 1 to 50 ng / ml. Measurement of mefenacet was possible, and the titer showing 50% inhibition (IC 50 value) was 7 ng / ml.
【0084】実施例6モノクローナル抗体のメフェナセット構造類似化合物に
対する交差反応性 メフェナセットの構造の一部を構成しているベンゾチア
ゾール基あるいはアニリン基を有する化合物について抗
体K73214及び抗体K73354の交差反応性を調
べた。交差反応性は試験化合物のIC50値を求め、次式
より計算した。Example 6 A monoclonal antibody having a structure similar to the mefenacet structure
The cross-reactivity of the antibody K73214 and the antibody K73354 was examined for a compound having a benzothiazole group or an aniline group, which forms part of the structure of the cross-reactive mefenacet. The cross-reactivity was calculated from the following formula by determining the IC 50 value of the test compound.
【0085】交差反応率(%)=(メフェナセットのIC50
値/試験化合物のIC50値)×100 上記式を用いて交差反応率を算出した結果を表1に示
す。表1は、本発明による2種類の抗体K73214及
び抗体K73354のメフェナセット構造類似化合物と
の交差反応性を調べた結果を示す表である。Cross-reactivity (%) = (IC 50 of mefenacet)
Value / IC 50 value of test compound) × 100 The results of calculating the cross-reactivity rate using the above formula are shown in Table 1. Table 1 is a table showing the results of examining the cross-reactivity of two kinds of antibodies K73214 and K73354 according to the present invention with compounds having an analogous structure of mefenacet.
【0086】[0086]
【表1】 [Table 1]
【0087】表1から次のことが判る。すなわち、抗体
K73214及び抗体K73354は試験したメフェナ
セット構造類似化合物とほとんど反応しなかった。この
結果より両モノクローナル抗体のメフェナセットに対す
る結合様式は、この分子が有するベンゾチアゾール基と
メチルアニライド基を含む分子全体と結合すると推測さ
れ、メフェナセットに対して非常に特異性の高いモノク
ローナル抗体であるといえる。The following can be seen from Table 1. That is, the antibodies K73214 and K73354 hardly reacted with the mefenacet structural analog compound tested. From these results, it is assumed that the binding mode of both monoclonal antibodies to mefenacet is to bind to the entire molecule including the benzothiazole group and the methylanilide group possessed by this molecule, indicating that the monoclonal antibody is highly specific to mefenacet. I can say.
【0088】実施例7水試料へのメフェナセットの添加回収試験 水試料は神戸市の水道水、神戸大学農学部の近くを流れ
る河川水(小川)、校内の実験圃場の水田から採取した
水田水についてメフェナセットの添加回収試験を実施し
た。水道水及び河川水については採取した試料をそのま
ま用い、また、水田水については孔径が0.45μmの
メンブレンフィルターでろ過した試料を用い、各試料に
メフェナセットを1ng/mlから500ng/mlの範
囲の濃度になるように添加した。メフェナセットを添加
した試料は抗体K73214を用いて実施例5に示され
るELISA法によって測定し、得られた回収率を表2
に示す。表2は、既知濃度のメフェナセットを水試料に
添加し、本発明によるELISA法を用いて分析した際
の回収率結果を示す表である。Example 7 Addition and Recovery Test of Mefenacet to Water Samples Water samples were mefenacet for tap water in Kobe City, river water (brook) flowing near Kobe University's Faculty of Agriculture, and paddy water collected from a paddy field in an experimental field in the school. A recovery test was carried out. For tap water and river water, the collected sample was used as it is, and for paddy water, a sample filtered with a membrane filter having a pore size of 0.45 μm was used. For each sample, mefenacet was used in the range of 1 ng / ml to 500 ng / ml. It was added to a concentration. The sample to which mefenacet was added was measured by the ELISA method described in Example 5 using the antibody K73214, and the obtained recovery was shown in Table 2.
Shown in Table 2 is a table showing the results of the recovery rate when a mefenacet of a known concentration was added to a water sample and analyzed using the ELISA method according to the present invention.
【0089】[0089]
【表2】 [Table 2]
【0090】表2から次のことが判る。すなわち、水道
水の回収率は86%〜110%であり、よい結果が得ら
れた。河川水の回収率は68%〜93%でやや低めの結
果であった。水田水の回収率は68%〜104%であっ
た。河川水及び水田水からの回収率の低いことは試料に
含まれる物質によって、固相化抗原と抗体K73214
の反応が妨害されていると考えられる。The following can be seen from Table 2. That is, the recovery rate of tap water was 86% to 110%, and good results were obtained. The river water recovery was 68% to 93%, which was slightly lower. The recovery rate of paddy water was 68% to 104%. The low recovery rate from river water and paddy water depends on the substances contained in the sample, depending on the immobilized antigen and antibody K73214.
Is thought to be hindered.
【0091】実施例8メフェナセット製剤を散布した水田における水中濃度の
測定 神戸大学実験圃場内の水田にイネ苗を移植した。移植3
日後に、他の水田除草剤との混合製剤(商品名ウルフエ
ース粒剤17:0.17%ベンスルフロンメチル、5%
ベンチオカルブ、1%メフェナセット含有)を慣行使用
法に基づいて散布した。水田面水の深さを5cmになる
よう水田の一箇所から給水し、水田の数箇所から水をサ
ンプリングして1個の容器に集めた。メンブレンフィル
ターでろ過した試料の一部はそのままELISA法で測
定した。一方、その測定値の確認のために高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)による測定も実施した。H
PLCの試料はろ液の100mlを50mlのジクロロ
メタンで2回抽出を行い、無水硫酸ナトリウムを加えて
水を除き、ロータリエバポレーターで蒸発乾固した後、
5mlのメタノールを加えた試料をHPLCで測定し
た。試料の濃度はメフェナセット標準液からそれぞれ検
量線を作成して算出した。HPLCは島津LC−10A
Sとコスモジル5C−18−ARカラムを用い、移動
相:アセトニトリル:水=50:50、カラム温度:4
0℃、移動相流速:1ml/min、検出波長:216n
mの測定条件で測定した。これまでにメフェナセットの
使用経歴がない2箇所の試験用水田で実施した結果を図
2に示す。図2によれば、二箇所の水田水のメフェナセ
ットの濃度が経日的に減少し、ELISA及びHPLC
で測定した測定値は共に良く一致している。Example 8 The concentration of water in a paddy field sprayed with a mefenacet preparation was measured.
Measurement Rice seedlings were transplanted to paddy fields in the experimental field of Kobe University. Transplant 3
A day later, a mixed preparation with another paddy field herbicide (trade name: Wolface Granule 17: 0.17% bensulfuron-methyl, 5%
Benthiocarb (containing 1% mefenacet) was applied according to conventional usage. Water was supplied from one place in the paddy field so that the depth of the paddy water was 5 cm, water was sampled from several places in the paddy field, and collected in one container. A part of the sample filtered through the membrane filter was directly measured by the ELISA method. On the other hand, measurement by high-performance liquid chromatography (HPLC) was also performed to confirm the measured value. H
A sample of the PLC was extracted twice from 100 ml of the filtrate with 50 ml of dichloromethane, water was removed by adding anhydrous sodium sulfate, and the mixture was evaporated to dryness using a rotary evaporator.
A sample to which 5 ml of methanol was added was measured by HPLC. The concentration of the sample was calculated by preparing a calibration curve from each of the mefenacet standard solutions. HPLC is Shimadzu LC-10A
Using S and Cosmozil 5C-18-AR column, mobile phase: acetonitrile: water = 50: 50, column temperature: 4
0 ° C., mobile phase flow rate: 1 ml / min, detection wavelength: 216 n
The measurement was performed under the measurement conditions of m. FIG. 2 shows the results of a test conducted on two test paddy fields that have not been used in mefenacet. According to FIG. 2, the concentration of mefenacet in two paddy waters decreased daily, and ELISA and HPLC
The values measured in the above are well in agreement.
【0092】以上の結果から、次のことが明らかになっ
た。メフェナセットと担体蛋白質との結合体をマウスに
免疫して得られた脾臓細胞とミエローマ細胞を融合する
ことにより、メフェナセットと結合するモノクローナル
抗体を産生する融合細胞を選抜した。この細胞を培養し
た培養上清をモノクローナル抗体として用い、メフェナ
セットを測定するためのELISA法の最適条件を決定
した。このELISA法によって河川及び水田水へのメ
フェナセット添加回収試験の結果は良好な回収率が得ら
れ、さらに、水田水のメフェナセットの濃度の測定も可
能であった。このように河川水中や水田水中のメフェナ
セットの濃度をモニタリングするに当たっては、本EL
ISA法による簡便、迅速な方法が適していた。From the above results, the following became clear. By fusing spleen cells and myeloma cells obtained by immunizing mice with a conjugate of mefenacet and a carrier protein, a fusion cell producing a monoclonal antibody that binds to mefenacet was selected. Using the culture supernatant obtained by culturing the cells as a monoclonal antibody, the optimal conditions of the ELISA method for measuring mefenacet were determined. As a result of the addition test of mefenacet to river and paddy water, a good recovery rate was obtained by this ELISA method, and the mefenacet concentration of paddy water was also measured. In monitoring the concentration of mefenacet in river water and paddy water, the EL
A simple and quick method by the ISA method was suitable.
【図1】図1は、ELISA法を用いて、本発明による
2種類のモノクローナル抗体K73214及びモノクロ
ーナル抗体K73354と、メフェナセットとの反応性
を調べた結果を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results obtained by examining the reactivity of two kinds of monoclonal antibodies K73214 and K73354 according to the present invention with mefenacet using the ELISA method.
【図2】図2は、2箇所の試験水田において水田水中の
メフェナセット濃度の経日変化をELISA法及びHP
LC法で比較した結果を示すグラフである。[FIG. 2] FIG. 2 shows the results of the ELISA method and the HP method for the daily changes in the concentration of mefenacet in paddy water in two test paddy fields.
It is a graph which shows the result of having compared by LC method.
Claims (6)
ナセット化合物。1. A compound of the general formula (1) [In the formula, n represents an integer of 1 to 9. ] The mefenacet compound represented by these.
と担体又は標識物質との結合体。2. A conjugate of the mefenacet compound according to claim 1 and a carrier or a labeling substance.
フェナセット化合物に反応性を示す免疫学的反応体。3. An immunological reactant which is reactive to mefenacet and the mefenacet compound according to claim 1.
ある請求項3に記載の免疫学的反応体。4. The immunological reactant according to claim 3, wherein the immunological reactant is a monoclonal antibody.
するハイブリドーマ。A hybridoma producing the immunological reactant according to claim 3.
反応体を用いることを特徴とするメフェナセットの免疫
学的測定方法。6. An immunoassay for mefenacet, comprising using the immunological reactant according to claim 3 or 4.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10047393A JPH11246536A (en) | 1998-02-27 | 1998-02-27 | Mefenacet compound, immunological reactive material, hybridoma and determination of mefenacet |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10047393A JPH11246536A (en) | 1998-02-27 | 1998-02-27 | Mefenacet compound, immunological reactive material, hybridoma and determination of mefenacet |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH11246536A true JPH11246536A (en) | 1999-09-14 |
Family
ID=12773877
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP10047393A Pending JPH11246536A (en) | 1998-02-27 | 1998-02-27 | Mefenacet compound, immunological reactive material, hybridoma and determination of mefenacet |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH11246536A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10023741B2 (en) * | 2013-05-24 | 2018-07-17 | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | Heat-conductive silicone composition |
-
1998
- 1998-02-27 JP JP10047393A patent/JPH11246536A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10023741B2 (en) * | 2013-05-24 | 2018-07-17 | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | Heat-conductive silicone composition |
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