JPH1118800A - ラットチトクロームｐ−４５０分子種分別定量用キット - Google Patents
ラットチトクロームｐ−４５０分子種分別定量用キットInfo
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- JPH1118800A JPH1118800A JP9193402A JP19340297A JPH1118800A JP H1118800 A JPH1118800 A JP H1118800A JP 9193402 A JP9193402 A JP 9193402A JP 19340297 A JP19340297 A JP 19340297A JP H1118800 A JPH1118800 A JP H1118800A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ラットチトクロームＰ−４５０各分子種のｍ
ＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、及び該方法に使用され
るキットを提供する。 【解決手段】 核酸増幅法によるラットのチトクローム
Ｐ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析に内部標準として
使用される核酸であって、定量分析しようとする分子種
のｍＲＮＡ由来の増幅産物とは区別できる鎖長の増幅産
物を、定量分析しようとする分子種のｍＲＮＡと同じ効
率で与える核酸。該核酸を内部標準として使用する前記
ｍＲＮＡの定量分析方法。前記ｍＲＮＡ由来の核酸の増
幅に使用されるプライマーと、前記核酸を含有する分析
用キット。
ＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、及び該方法に使用され
るキットを提供する。 【解決手段】 核酸増幅法によるラットのチトクローム
Ｐ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析に内部標準として
使用される核酸であって、定量分析しようとする分子種
のｍＲＮＡ由来の増幅産物とは区別できる鎖長の増幅産
物を、定量分析しようとする分子種のｍＲＮＡと同じ効
率で与える核酸。該核酸を内部標準として使用する前記
ｍＲＮＡの定量分析方法。前記ｍＲＮＡ由来の核酸の増
幅に使用されるプライマーと、前記核酸を含有する分析
用キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は薬物等によるチトク
ロームＰ−４５０誘導能の有無を検定する過程で行われ
るラットにおける該分子種量の変動をｍＲＮＡ量として
定量分析する方法に関し、各分子種を分別するための特
異的なプライマー群と内部標準となりうる核酸を含むこ
とを特徴とする。
ロームＰ−４５０誘導能の有無を検定する過程で行われ
るラットにおける該分子種量の変動をｍＲＮＡ量として
定量分析する方法に関し、各分子種を分別するための特
異的なプライマー群と内部標準となりうる核酸を含むこ
とを特徴とする。
【０００２】
【従来の技術】チトクロームＰ−４５０（ＣＹＰ）は肝
ミクロゾームに存在する重要な薬物代謝酵素であり、毒
物・発癌性物質・ステロイドなどを含む広範な薬物の代
謝に関与している。種々の動物で多くのＰ−４５０分子
種の存在が確認されており［ＤＮＡ アンド セル バ
イオロジー（DNA and Cell Biology）、第１２巻、第１
〜５１頁（１９９３）］、これらは一般的に低い基質特
異性をもち、結果的に非常に多数の化学物質の酸化的代
謝を行っている。一般に代謝は薬物の水溶性を増して排
泄を促進すると共に、薬物の体内での化学変化により受
容体との親和性を低下させて薬力学的効果の減少あるい
は消失を引き起こす。しかし、逆に代謝により活性化す
る薬物の存在もよく知られており、また代謝過程で生成
した不安定かつ反応性の高い中間代謝物が細胞内のＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、蛋白質や脂質と反応し、毒性、発癌性、催
奇形性を発揮するような例が多数報告されている［キャ
ンサー リサーチ（Cancer Research ）、第４２巻、第
４８７５〜４９１７頁（１９８２）］。そのためＰ−４
５０の誘導または阻害は薬物代謝に量的に影響を及ぼす
だけでなく薬物代謝パターンも変化させ臨床的に重要な
意味を持っている。医薬品を開発する際、その薬物の薬
物代謝酵素系への影響の検討が薬物動態試験ガイドライ
ンの項目として挙げられている。安全性の高い医薬品を
開発するためにはＰ−４５０の主要な分子種ごとの誘導
の有無を検証するデータが有用である。従来Ｐ−４５０
の定量は抗体を用いて行われてきた。しかしＰ−４５０
は高い類似性を有する多くの分子種から成るため、個々
の分子種を完全に分別検出する抗体を得ることは困難で
ある。現在、ラットチトクロームＰ−４５０分子種に対
する抗体や抗体を用いた検出キットは第一化学薬品株式
会社やアマシャム社から市販されているが、その特異性
は厳密ではない。また、一部の分子種につき比較的特異
性の高い抗体が得られたとしても、優れた品質の抗体を
安定して十分量得ることは困難を伴う。また、現状の抗
体法は半定量的な検出法であり、シグナルの強弱により
Ｐ−４５０の誘導の有無を判定するのみである。更にＰ
−４５０は薬物投与等により単一の分子種の発現量が変
動するのでなく、複数の分子種が複雑に変動している
が、抗体法では個々の分子種に対する抗体を用意し、別
個に反応を行う必要があり繁雑である。現在、従来の抗
体による検査法に代り、特異性の面で優れ、高感度でか
つ簡便な定量法の確立が求められている。酵素蛋白の発
現を高感度に検出するための方法に該酵素をコードする
遺伝子の発現を測るＲＴ−ＰＣＲ法が挙げられる。ＲＴ
−ＰＣＲ法とはｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写反応により
ｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲによる核酸増幅を行う方法で
あり、定量的ＰＣＲ法を適用することによりｍＲＮＡの
定量分析を行うことができる。
ミクロゾームに存在する重要な薬物代謝酵素であり、毒
物・発癌性物質・ステロイドなどを含む広範な薬物の代
謝に関与している。種々の動物で多くのＰ−４５０分子
種の存在が確認されており［ＤＮＡ アンド セル バ
イオロジー（DNA and Cell Biology）、第１２巻、第１
〜５１頁（１９９３）］、これらは一般的に低い基質特
異性をもち、結果的に非常に多数の化学物質の酸化的代
謝を行っている。一般に代謝は薬物の水溶性を増して排
泄を促進すると共に、薬物の体内での化学変化により受
容体との親和性を低下させて薬力学的効果の減少あるい
は消失を引き起こす。しかし、逆に代謝により活性化す
る薬物の存在もよく知られており、また代謝過程で生成
した不安定かつ反応性の高い中間代謝物が細胞内のＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、蛋白質や脂質と反応し、毒性、発癌性、催
奇形性を発揮するような例が多数報告されている［キャ
ンサー リサーチ（Cancer Research ）、第４２巻、第
４８７５〜４９１７頁（１９８２）］。そのためＰ−４
５０の誘導または阻害は薬物代謝に量的に影響を及ぼす
だけでなく薬物代謝パターンも変化させ臨床的に重要な
意味を持っている。医薬品を開発する際、その薬物の薬
物代謝酵素系への影響の検討が薬物動態試験ガイドライ
ンの項目として挙げられている。安全性の高い医薬品を
開発するためにはＰ−４５０の主要な分子種ごとの誘導
の有無を検証するデータが有用である。従来Ｐ−４５０
の定量は抗体を用いて行われてきた。しかしＰ−４５０
は高い類似性を有する多くの分子種から成るため、個々
の分子種を完全に分別検出する抗体を得ることは困難で
ある。現在、ラットチトクロームＰ−４５０分子種に対
する抗体や抗体を用いた検出キットは第一化学薬品株式
会社やアマシャム社から市販されているが、その特異性
は厳密ではない。また、一部の分子種につき比較的特異
性の高い抗体が得られたとしても、優れた品質の抗体を
安定して十分量得ることは困難を伴う。また、現状の抗
体法は半定量的な検出法であり、シグナルの強弱により
Ｐ−４５０の誘導の有無を判定するのみである。更にＰ
−４５０は薬物投与等により単一の分子種の発現量が変
動するのでなく、複数の分子種が複雑に変動している
が、抗体法では個々の分子種に対する抗体を用意し、別
個に反応を行う必要があり繁雑である。現在、従来の抗
体による検査法に代り、特異性の面で優れ、高感度でか
つ簡便な定量法の確立が求められている。酵素蛋白の発
現を高感度に検出するための方法に該酵素をコードする
遺伝子の発現を測るＲＴ−ＰＣＲ法が挙げられる。ＲＴ
−ＰＣＲ法とはｍＲＮＡを鋳型とし、逆転写反応により
ｃＤＮＡを合成後、ＰＣＲによる核酸増幅を行う方法で
あり、定量的ＰＣＲ法を適用することによりｍＲＮＡの
定量分析を行うことができる。
【０００３】現在までに限られた種類のＰ−４５０分子
種について、個別に定量的ＰＣＲ法を適用したＲＴ−Ｐ
ＣＲ法により、その該遺伝子の発現量を推定した例はい
くつか報告されている。例えばラットＣＹＰ１Ａ１ｍＲ
ＮＡの誘導はキャンサー リサーチ、第５４巻、第６２
〜６８頁（１９９４）や、メソッズ イン エンザイモ
ロジー（Methods in Enzymology ）、第２７２巻、第４
０１〜４１２頁（１９９６）等により報告されている。
一方、半定量法ではＲＴ−ＰＣＲ法により複数のＰ−４
５０分子種相互の量的変動を見た例はある。例えばラッ
ト肝におけるＣＹＰ３Ａサブファミリーに属するＣＹＰ
３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ９、ＣＹＰ３Ａ１８並びにＣＹＰ３
Ａ２３各々近縁分子種について、ハウスキーピングジー
ンであるβ−アクチン遺伝子の発現量を標準としてその
相対量を求め、それぞれのＣＹＰ３Ａ遺伝子の発現量に
ついて推定した報告がある［アーカイブズ オブ バイ
オケミストリー アンド バイオフィジックス（Archiv
es of Biochemistry and Biophysics ）、第３３７巻、
第６２−６８頁（１９９７）］。また、ＣＹＰ１Ａ１、
ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１／２（両者を合せた量とし
て測定）、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ
１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ４Ａ１更にＦＡＣＯ（ファッ
ティ アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子）の発現量を、
ハウスキーピングジーンであるシクロフィリン遺伝子の
発現量を標準として推定した報告もある［バイオケミカ
ル ファーマコロジー（Biochemical Pharmacology）、
第５２巻、第７８１〜７９２頁（１９９６）］。しか
し、ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅効率は同一反応下でもプ
ライマーの配列、増幅される配列、増幅産物のサイズに
より大きく異なり、かつＰＣＲには反応生成物がある程
度以上増幅するとプラトーに達する現象があるため、増
幅産物のサイズやその塩基配列の全く異なる遺伝子の最
終増幅量の比はその初期比を反映していない場合が多
い。このためβ−アクチン遺伝子やシクロフィリン遺伝
子の発現量を標準とした方法はあくまでも増減の目安に
すぎない。
種について、個別に定量的ＰＣＲ法を適用したＲＴ−Ｐ
ＣＲ法により、その該遺伝子の発現量を推定した例はい
くつか報告されている。例えばラットＣＹＰ１Ａ１ｍＲ
ＮＡの誘導はキャンサー リサーチ、第５４巻、第６２
〜６８頁（１９９４）や、メソッズ イン エンザイモ
ロジー（Methods in Enzymology ）、第２７２巻、第４
０１〜４１２頁（１９９６）等により報告されている。
一方、半定量法ではＲＴ−ＰＣＲ法により複数のＰ−４
５０分子種相互の量的変動を見た例はある。例えばラッ
ト肝におけるＣＹＰ３Ａサブファミリーに属するＣＹＰ
３Ａ２、ＣＹＰ３Ａ９、ＣＹＰ３Ａ１８並びにＣＹＰ３
Ａ２３各々近縁分子種について、ハウスキーピングジー
ンであるβ−アクチン遺伝子の発現量を標準としてその
相対量を求め、それぞれのＣＹＰ３Ａ遺伝子の発現量に
ついて推定した報告がある［アーカイブズ オブ バイ
オケミストリー アンド バイオフィジックス（Archiv
es of Biochemistry and Biophysics ）、第３３７巻、
第６２−６８頁（１９９７）］。また、ＣＹＰ１Ａ１、
ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１／２（両者を合せた量とし
て測定）、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ
１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ４Ａ１更にＦＡＣＯ（ファッ
ティ アシルＣｏＡオキシダーゼ遺伝子）の発現量を、
ハウスキーピングジーンであるシクロフィリン遺伝子の
発現量を標準として推定した報告もある［バイオケミカ
ル ファーマコロジー（Biochemical Pharmacology）、
第５２巻、第７８１〜７９２頁（１９９６）］。しか
し、ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅効率は同一反応下でもプ
ライマーの配列、増幅される配列、増幅産物のサイズに
より大きく異なり、かつＰＣＲには反応生成物がある程
度以上増幅するとプラトーに達する現象があるため、増
幅産物のサイズやその塩基配列の全く異なる遺伝子の最
終増幅量の比はその初期比を反映していない場合が多
い。このためβ−アクチン遺伝子やシクロフィリン遺伝
子の発現量を標準とした方法はあくまでも増減の目安に
すぎない。
【０００４】特表平５−５０４８８６号公報には複数の
サイトカインのｍＲＮＡの定量分析に内部標準として使
用される核酸セグメントが例示されている。これらを用
いることにより、測定対象の核酸と内部標準とを同一の
プライマーで増幅する定量的ＰＣＲが可能である。しか
し、各サイトカインについて該内部標準より増幅される
反応生成物の増幅効率にはそれぞれ差があり、例えばＩ
Ｌ−１βとアポリポタンパク質−Ｅでは１０5 倍の差が
あることが示されている。このため同一内部標準を用い
て複数のサイトカインを定量分析する場合には、それぞ
れの測定対照につき逆転写反応時に添加する内部標準量
を変えて反応させる必要があり、更にＰＣＲの反応条件
を個々に変更する必要もあり繁雑である。また標的ｍＲ
ＮＡ由来増幅産物と内部標準由来増幅産物のサイズの関
係については、両産物のサイズが相違し、かつ好適な分
析系における固有の検出限界内にあるようデザインする
こととあるだけである。例えばＭ−ＣＳＦでは前者が１
７１ｂｐ、後者が３０２ｂｐとかなりの差があり、特別
な考慮は払われていない。ＰＣＲにおいては一般的に短
いフラグメントが優先的に増幅される傾向があり、その
ため両者の増幅効率に差が出る原因になりうる。更に、
ここに記載のサイトカインについてはｍＲＮＡ由来増幅
産物と内部標準由来増幅産物のサイズがお互いに類似し
ているものが多く、複数のサイトカインにつき定量分析
した場合誤りの原因になりやすい。すなわちＰＤＧＦ−
Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧ、ＩＬ−２、Ｐ
ＤＧＦ−ＲはｍＲＮＡ由来増幅産物は２１７〜２５８ｂ
ｐの間、内部標準由来増幅産物はすべて３００〜３０５
ｂｐであり増幅産物サイズからは簡単にはサイトカイン
の種類を判別できない。
サイトカインのｍＲＮＡの定量分析に内部標準として使
用される核酸セグメントが例示されている。これらを用
いることにより、測定対象の核酸と内部標準とを同一の
プライマーで増幅する定量的ＰＣＲが可能である。しか
し、各サイトカインについて該内部標準より増幅される
反応生成物の増幅効率にはそれぞれ差があり、例えばＩ
Ｌ−１βとアポリポタンパク質−Ｅでは１０5 倍の差が
あることが示されている。このため同一内部標準を用い
て複数のサイトカインを定量分析する場合には、それぞ
れの測定対照につき逆転写反応時に添加する内部標準量
を変えて反応させる必要があり、更にＰＣＲの反応条件
を個々に変更する必要もあり繁雑である。また標的ｍＲ
ＮＡ由来増幅産物と内部標準由来増幅産物のサイズの関
係については、両産物のサイズが相違し、かつ好適な分
析系における固有の検出限界内にあるようデザインする
こととあるだけである。例えばＭ−ＣＳＦでは前者が１
７１ｂｐ、後者が３０２ｂｐとかなりの差があり、特別
な考慮は払われていない。ＰＣＲにおいては一般的に短
いフラグメントが優先的に増幅される傾向があり、その
ため両者の増幅効率に差が出る原因になりうる。更に、
ここに記載のサイトカインについてはｍＲＮＡ由来増幅
産物と内部標準由来増幅産物のサイズがお互いに類似し
ているものが多く、複数のサイトカインにつき定量分析
した場合誤りの原因になりやすい。すなわちＰＤＧＦ−
Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＬＤＬ−Ｒ、ＨＭＧ、ＩＬ−２、Ｐ
ＤＧＦ−ＲはｍＲＮＡ由来増幅産物は２１７〜２５８ｂ
ｐの間、内部標準由来増幅産物はすべて３００〜３０５
ｂｐであり増幅産物サイズからは簡単にはサイトカイン
の種類を判別できない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】薬物動態試験の第一ス
テップで通常用いられるラットのＰ−４５０分子種の量
的変動の試験に当り、（１）同一反応条件下で複数の分
子種を簡便に検出できる、（２）試験結果に定量性があ
る、（３）作業量、試薬のコスト等が過大でない、等の
条件を満たす方法が確立されれば薬物のＰ−４５０各分
子種に及ぼす影響が詳細に把握でき有益である。したが
って本発明の目的は、上記条件を満たす定量分析方法の
確立、特にラットチトクロームＰ−４５０各分子種のｍ
ＲＮＡの定量分析に使用可能な該内部標準を用いた定量
的ＲＴ−ＰＣＲ法、並びに該方法に使用されるキットを
提供することにある。
テップで通常用いられるラットのＰ−４５０分子種の量
的変動の試験に当り、（１）同一反応条件下で複数の分
子種を簡便に検出できる、（２）試験結果に定量性があ
る、（３）作業量、試薬のコスト等が過大でない、等の
条件を満たす方法が確立されれば薬物のＰ−４５０各分
子種に及ぼす影響が詳細に把握でき有益である。したが
って本発明の目的は、上記条件を満たす定量分析方法の
確立、特にラットチトクロームＰ−４５０各分子種のｍ
ＲＮＡの定量分析に使用可能な該内部標準を用いた定量
的ＲＴ−ＰＣＲ法、並びに該方法に使用されるキットを
提供することにある。
【０００６】
【発明を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は核酸増幅法によるラットのチトクロ
ームＰ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析に内部標準と
して使用される核酸に関する発明であって、核酸増幅法
に使用されるプライマーによって定量分析しようとする
分子種のｍＲＮＡ由来の増幅産物とは区別できる鎖長の
増幅産物を、定量分析しようとする分子種のｍＲＮＡと
同じ効率で与えることができる核酸であることを特徴と
する。ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１、Ｃ
ＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３
Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２及びＣＹＰ４Ａ１のｍＲＮＡ定量に
用いられる核酸としては配列表の配列番号１８に示され
る塩基配列を有する核酸が挙げられる。また、本発明の
第２の発明は核酸増幅法によるラットのチトクロームＰ
−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析に使用されるキット
に関する発明であって、チトクロームＰ−４５０分子種
ｍＲＮＡ由来の核酸の増幅に使用されるプライマーと第
１の発明の核酸とを含有することを特徴とする。更に、
本発明の第３の発明は核酸増幅法によるラットのチトク
ロームＰ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析方法であっ
て、第１の発明の核酸を内部標準として使用することを
特徴とする。
発明の第１の発明は核酸増幅法によるラットのチトクロ
ームＰ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析に内部標準と
して使用される核酸に関する発明であって、核酸増幅法
に使用されるプライマーによって定量分析しようとする
分子種のｍＲＮＡ由来の増幅産物とは区別できる鎖長の
増幅産物を、定量分析しようとする分子種のｍＲＮＡと
同じ効率で与えることができる核酸であることを特徴と
する。ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１、Ｃ
ＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３
Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２及びＣＹＰ４Ａ１のｍＲＮＡ定量に
用いられる核酸としては配列表の配列番号１８に示され
る塩基配列を有する核酸が挙げられる。また、本発明の
第２の発明は核酸増幅法によるラットのチトクロームＰ
−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析に使用されるキット
に関する発明であって、チトクロームＰ−４５０分子種
ｍＲＮＡ由来の核酸の増幅に使用されるプライマーと第
１の発明の核酸とを含有することを特徴とする。更に、
本発明の第３の発明は核酸増幅法によるラットのチトク
ロームＰ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析方法であっ
て、第１の発明の核酸を内部標準として使用することを
特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明に使用されるプライマーの塩基配列は、例え
ばバイオケミカル ファーマコロジー、第５２巻、第７
８１〜７９２頁（１９９６）を参考にしており配列表の
配列番号１〜１６の一部又は全部である。これらのプラ
イマーを後記表１に示すように組合せてＲＴ−ＰＣＲを
実施することにより、９種のラットチトクロームＰ−４
５０の分子種ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ
１、ＣＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、Ｃ
ＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２およびＣＹＰ４Ａ１のｍＲＮ
Ａ量を定量分析することができる。
る。本発明に使用されるプライマーの塩基配列は、例え
ばバイオケミカル ファーマコロジー、第５２巻、第７
８１〜７９２頁（１９９６）を参考にしており配列表の
配列番号１〜１６の一部又は全部である。これらのプラ
イマーを後記表１に示すように組合せてＲＴ−ＰＣＲを
実施することにより、９種のラットチトクロームＰ−４
５０の分子種ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ
１、ＣＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、Ｃ
ＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２およびＣＹＰ４Ａ１のｍＲＮ
Ａ量を定量分析することができる。
【０００８】また、内部標準として使用される核酸は上
記のＲＴ−ＰＣＲ反応に添加された場合に試料中の標的
ｍＲＮＡ由来の増幅産物とは区別可能なサイズの増幅産
物を与えるものである。すなわち、該内部標準として使
用される核酸は目的とする標的ｍＲＮＡの増幅に用いら
れる２種のプライマーの塩基配列を有しており、かつそ
の間の距離は標的ｍＲＮＡのものとは異なっている。ま
た、該内部標準として使用される核酸は標的ｍＲＮＡと
同じ増幅効率で増幅産物を与えるよう配慮されなければ
ならない。そのためには内部標準の塩基配列を工夫し、
好適には内部標準由来増幅産物のサイズが標的ｍＲＮＡ
由来増幅産物の７５〜１２５％の範囲であることが望ま
しい。
記のＲＴ−ＰＣＲ反応に添加された場合に試料中の標的
ｍＲＮＡ由来の増幅産物とは区別可能なサイズの増幅産
物を与えるものである。すなわち、該内部標準として使
用される核酸は目的とする標的ｍＲＮＡの増幅に用いら
れる２種のプライマーの塩基配列を有しており、かつそ
の間の距離は標的ｍＲＮＡのものとは異なっている。ま
た、該内部標準として使用される核酸は標的ｍＲＮＡと
同じ増幅効率で増幅産物を与えるよう配慮されなければ
ならない。そのためには内部標準の塩基配列を工夫し、
好適には内部標準由来増幅産物のサイズが標的ｍＲＮＡ
由来増幅産物の７５〜１２５％の範囲であることが望ま
しい。
【０００９】このような内部標準核酸は、複数の標的ｍ
ＲＮＡの定量分析に使用できるものを作製することがで
き、例えば配列表の配列番号１８に示す塩基配列を有す
る核酸はラットチトクロームＰ−４５０の分子種のうち
上記の９種の定量分析に使用することができる。また該
核酸には配列表の配列番号１９と配列表の配列番号２０
に示すシクロフィリンを増幅するためのプライマー対の
配列（又は相補配列）も含まれている。肝臓中のシクロ
フィリンｍＲＮＡの発現量は比較的一定しており薬物投
与による影響を受けにくくハウスキーピングジーンと考
えられる。Ｐ−４５０分子種の増幅と共にシクロフィリ
ンについても定量ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、例え
ば試料中のＲＮＡの分解等試料の純度に起因する定量分
析結果の誤りを補正することが可能であり、より正確な
定量分析が可能なように工夫されているがシクロフィリ
ンに限定するものではなく、例えばβーアクチンやグリ
セルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼなどの薬物投
与による影響を受けにくいハウスキーピングジーンでも
よい。内部標準はＤＮＡ、ＲＮＡどちらの形態でもよい
が、逆転写反応の効率を考慮に入れた定量分析を行うた
めにはＲＮＡの方が望ましい。配列表の配列番号１７に
塩基配列を示すＤＮＡは、上記の配列表の配列番号１８
に示される塩基配列を含有し、その５’側にＳＰ６プロ
モーターを、また３’側にポリＡ配列を有している。該
ＤＮＡを鋳型とし、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いた
転写反応を行うことにより、配列表の配列番号１８に示
す塩基配列とポリＡ配列とを有するＲＮＡを合成するこ
とができる。ポリＡ配列を有する内部標準は逆転写反応
時オリゴ（ｄＴ）プライマーにて逆転写可能で便利であ
るがポリＡ配列がなくてもよい。また配列表の配列番号
１７のＤＮＡにはその５’端付近と３’端付近に制限酵
素認識配列（ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ）を含んでおり、こ
の間のＤＮＡを適当なベクターにクローニングすること
ができ、更に２７１〜２７６ｂｐの位置にも制限酵素認
識配列（ＢａｍＨＩ）を配置しＲＮＡに転写後ＤＮＡ鋳
型を除去するのに便利なよう工夫されているが、これら
は特になくてもよい。またＲＮＡに転写するためのＳＰ
６プロモーター配列はＴ７プロモーター配列やｍＲＮＡ
への転写に使用される他のプロモーターでもよく、また
ＤＮＡを内部標準として用いる際には特に必要としな
い。
ＲＮＡの定量分析に使用できるものを作製することがで
き、例えば配列表の配列番号１８に示す塩基配列を有す
る核酸はラットチトクロームＰ−４５０の分子種のうち
上記の９種の定量分析に使用することができる。また該
核酸には配列表の配列番号１９と配列表の配列番号２０
に示すシクロフィリンを増幅するためのプライマー対の
配列（又は相補配列）も含まれている。肝臓中のシクロ
フィリンｍＲＮＡの発現量は比較的一定しており薬物投
与による影響を受けにくくハウスキーピングジーンと考
えられる。Ｐ−４５０分子種の増幅と共にシクロフィリ
ンについても定量ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、例え
ば試料中のＲＮＡの分解等試料の純度に起因する定量分
析結果の誤りを補正することが可能であり、より正確な
定量分析が可能なように工夫されているがシクロフィリ
ンに限定するものではなく、例えばβーアクチンやグリ
セルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼなどの薬物投
与による影響を受けにくいハウスキーピングジーンでも
よい。内部標準はＤＮＡ、ＲＮＡどちらの形態でもよい
が、逆転写反応の効率を考慮に入れた定量分析を行うた
めにはＲＮＡの方が望ましい。配列表の配列番号１７に
塩基配列を示すＤＮＡは、上記の配列表の配列番号１８
に示される塩基配列を含有し、その５’側にＳＰ６プロ
モーターを、また３’側にポリＡ配列を有している。該
ＤＮＡを鋳型とし、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いた
転写反応を行うことにより、配列表の配列番号１８に示
す塩基配列とポリＡ配列とを有するＲＮＡを合成するこ
とができる。ポリＡ配列を有する内部標準は逆転写反応
時オリゴ（ｄＴ）プライマーにて逆転写可能で便利であ
るがポリＡ配列がなくてもよい。また配列表の配列番号
１７のＤＮＡにはその５’端付近と３’端付近に制限酵
素認識配列（ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ）を含んでおり、こ
の間のＤＮＡを適当なベクターにクローニングすること
ができ、更に２７１〜２７６ｂｐの位置にも制限酵素認
識配列（ＢａｍＨＩ）を配置しＲＮＡに転写後ＤＮＡ鋳
型を除去するのに便利なよう工夫されているが、これら
は特になくてもよい。またＲＮＡに転写するためのＳＰ
６プロモーター配列はＴ７プロモーター配列やｍＲＮＡ
への転写に使用される他のプロモーターでもよく、また
ＤＮＡを内部標準として用いる際には特に必要としな
い。
【００１０】一般的な定量分析方法は検体より抽出した
粗ＲＮＡ試料に既知量の内部標準ＲＮＡを段階的に希釈
したものを加え、オリゴ（ｄＴ）プライマー又はランダ
ムプライマーを用いて逆転写反応し各々一本鎖ｃＤＮＡ
とする。測定しようとするＰ−４５０分子種ごとに新た
にチューブを用意し、上記一本鎖ｃＤＮＡ液を分注、そ
れぞれの分子種に対応するプライマー対を加えＰＣＲに
てそれぞれ増幅する。この際の核酸増幅反応は特に限定
されず、ヌクレイック アシッド シークエンス−ベー
スド アンプリフィケーション［Nucleic Acid Sequenc
e-Based Amplification(NASBA)、特開平２−５８６４号
公報］であってもよく、その反応条件も特に限定されな
い。内部標準に関して増幅時同一の条件下ですべての分
子種が効率良く増幅するように、プライマーや内部配列
が設定されていることが簡便性という観点から重要とな
る。配列表の配列番号１７の転写産物であるＲＮＡ内部
標準は実施例２に示すように同一の条件下ですべてのラ
ットチトクロームＰ−４５０分子種の増幅効率がそろっ
ている。このため異なる分子種の定量分析においても、
逆転写反応を行う際に内部標準を広い濃度範囲に段階希
釈して用いる必要はなく、ＰＣＲの際にプライマーを変
えるだけで同一条件下で定量分析可能である。
粗ＲＮＡ試料に既知量の内部標準ＲＮＡを段階的に希釈
したものを加え、オリゴ（ｄＴ）プライマー又はランダ
ムプライマーを用いて逆転写反応し各々一本鎖ｃＤＮＡ
とする。測定しようとするＰ−４５０分子種ごとに新た
にチューブを用意し、上記一本鎖ｃＤＮＡ液を分注、そ
れぞれの分子種に対応するプライマー対を加えＰＣＲに
てそれぞれ増幅する。この際の核酸増幅反応は特に限定
されず、ヌクレイック アシッド シークエンス−ベー
スド アンプリフィケーション［Nucleic Acid Sequenc
e-Based Amplification(NASBA)、特開平２−５８６４号
公報］であってもよく、その反応条件も特に限定されな
い。内部標準に関して増幅時同一の条件下ですべての分
子種が効率良く増幅するように、プライマーや内部配列
が設定されていることが簡便性という観点から重要とな
る。配列表の配列番号１７の転写産物であるＲＮＡ内部
標準は実施例２に示すように同一の条件下ですべてのラ
ットチトクロームＰ−４５０分子種の増幅効率がそろっ
ている。このため異なる分子種の定量分析においても、
逆転写反応を行う際に内部標準を広い濃度範囲に段階希
釈して用いる必要はなく、ＰＣＲの際にプライマーを変
えるだけで同一条件下で定量分析可能である。
【００１１】配列表の配列番号１〜１６記載のオリゴヌ
クレオチドはラットチトクロームＰ−４５０各分子種を
特異的に増幅可能でそれぞれの増幅サイズが異なる。下
記表１に各配列が増幅可能なＰ−４５０分子種とその増
幅サイズ、更に配列表の配列番号１８に示す塩基配列を
含む内部標準を用いた際の内部標準由来の増幅産物のサ
イズを示す。内部標準由来増幅産物のサイズはｍＲＮＡ
由来増幅産物のそれに対して±２５％以内になるよう設
計されている。
クレオチドはラットチトクロームＰ−４５０各分子種を
特異的に増幅可能でそれぞれの増幅サイズが異なる。下
記表１に各配列が増幅可能なＰ−４５０分子種とその増
幅サイズ、更に配列表の配列番号１８に示す塩基配列を
含む内部標準を用いた際の内部標準由来の増幅産物のサ
イズを示す。内部標準由来増幅産物のサイズはｍＲＮＡ
由来増幅産物のそれに対して±２５％以内になるよう設
計されている。
【００１２】
【表１】 表 １ ───────────────────────────────── 上流プライマー下流プライマー 増幅される 増幅サイズ（bp) （配列番号） （配列番号） P-450 分子種 目的遺伝子 内部標準 ───────────────────────────────── １ ２ CYP1A1 ３３２ ２６４ ３ ４ CYP1A2 ２３７ ２６６ ５ ６ CYP2B1/2 ５５０ ４３８ ７ ８ CYP2C11 ２４９ ３００ ９ １０ CYP2E1 ４７４ ３７８ １１ １２ CYP3A1 ５８１ ４５６ １３ １４ CYP3A2 １１７ １４１ １５ １６ CYP4A1 ３４５ ２７５ ─────────────────────────────────
【００１３】配列表の配列番号５及び６記載のオリゴヌ
クレオチドで増幅した際に得られるｍＲＮＡ由来のフラ
グメントはＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２由来ｃＤＮＡ断
片の混合物である。両者の分別定量分析は該フラグメン
トを区別可能な制限酵素で切断し、残存フラグメントと
切断フラグメントの量比を求めることにより可能であ
る。本発明者らは制限酵素ＭｕｎＩがＣＹＰ２Ｂ１遺伝
子由来の増幅産物は切断しないがＣＹＰ２Ｂ２遺伝子由
来の増幅産物を切断することから分別可能であることを
見出した。
クレオチドで増幅した際に得られるｍＲＮＡ由来のフラ
グメントはＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２由来ｃＤＮＡ断
片の混合物である。両者の分別定量分析は該フラグメン
トを区別可能な制限酵素で切断し、残存フラグメントと
切断フラグメントの量比を求めることにより可能であ
る。本発明者らは制限酵素ＭｕｎＩがＣＹＰ２Ｂ１遺伝
子由来の増幅産物は切断しないがＣＹＰ２Ｂ２遺伝子由
来の増幅産物を切断することから分別可能であることを
見出した。
【００１４】増幅結果の解析法には特に限定はないが、
例えば核酸増幅反応液をアガロースゲル電気泳動に供し
た後、目的遺伝子由来増幅断片と内部標準由来増幅断片
とを比較定量分析する方法が使用できる。目的遺伝子由
来増幅断片と内部標準由来増幅断片量の測定方法は特に
限定されないが、ゲルを適当な核酸染色試薬、例えばエ
チジウムブロマイドやＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩで染色
し、ＵＶの照射によって蛍光として検出されるバンドの
位置より目的遺伝子由来増幅断片のバンドと、内部標準
由来増幅断片とを同定する。また、各バンドの蛍光シグ
ナル強度は、ＵＶ照射下写真撮影し肉眼で比較するか、
又は適当な装置、例えば蛍光イメージアナライザーにて
測定する。両者のシグナル強度が等しい時、目的遺伝子
初期量は内部標準添加量と等しい。標識物質、例えばラ
ジオアイソトープで増幅断片を標識して検出することも
可能であり、例えばラジオアイソトープ標識したプライ
マーを使用して増幅するか、あるいは増幅時［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰ等のモノヌクレオチドトリリン酸を添加
することによって増幅断片を標識しアガロースゲル電気
泳動後、目的のバンドをゲルから切り出し、液体シンチ
レーションカウンターによりアイソトープ量を測定した
り、バンドの切り出しをせずに直接イメージアナライザ
ーで解析し、バンド強度を測定する方法がある。
例えば核酸増幅反応液をアガロースゲル電気泳動に供し
た後、目的遺伝子由来増幅断片と内部標準由来増幅断片
とを比較定量分析する方法が使用できる。目的遺伝子由
来増幅断片と内部標準由来増幅断片量の測定方法は特に
限定されないが、ゲルを適当な核酸染色試薬、例えばエ
チジウムブロマイドやＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩで染色
し、ＵＶの照射によって蛍光として検出されるバンドの
位置より目的遺伝子由来増幅断片のバンドと、内部標準
由来増幅断片とを同定する。また、各バンドの蛍光シグ
ナル強度は、ＵＶ照射下写真撮影し肉眼で比較するか、
又は適当な装置、例えば蛍光イメージアナライザーにて
測定する。両者のシグナル強度が等しい時、目的遺伝子
初期量は内部標準添加量と等しい。標識物質、例えばラ
ジオアイソトープで増幅断片を標識して検出することも
可能であり、例えばラジオアイソトープ標識したプライ
マーを使用して増幅するか、あるいは増幅時［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰ等のモノヌクレオチドトリリン酸を添加
することによって増幅断片を標識しアガロースゲル電気
泳動後、目的のバンドをゲルから切り出し、液体シンチ
レーションカウンターによりアイソトープ量を測定した
り、バンドの切り出しをせずに直接イメージアナライザ
ーで解析し、バンド強度を測定する方法がある。
【００１５】ここで使用する標識物質とは増幅物質を検
出し得るものであるならば、放射性、非放射性を問わな
い。非放射性の標識物質としては、例えばビオチン、ジ
オキシゲニン等のハプテン、フルオレセイン、ローダミ
ン等の蛍光物質あるいはアクリジン等の化学発光物質が
挙げられる。これら標識物質によりオリゴヌクレオチド
を標識する場合はいずれも公知手段（特開昭５９−９３
０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）によ
り、標識化を行うことができる。またヌクレオチドトリ
リン酸を標識する場合は公知手段［プロシーディングズ
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
シーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA）、第８０巻、第４０４５頁（１９８３）、特開昭６
３−１５２３６４号公報］に準じて行うか、市販品を利
用することができる。また増幅産物の分離手段も特に限
定されず、上記のアガロースゲル電気泳動のほか、イオ
ン−ペア逆相ＨＰＬＣで分離しＯＤ２５６値より定量
［バイオ テクニックス（Bio Techniques）、第２０
巻、第２５０〜２５７頁（１９９６）］、直鎖ポリアク
リルアミド充てんキャピラリー電気泳動で分離し、Ｐ／
ＡＣＥシステム（Ｓｙｓｔｅｍ）〔ベックマン インス
ツルメント社(Beckman Instrument, Inc.)〕でレーザー
で誘導された蛍光を定量分析［アナリティカル バイオ
ケミストリー（Analytical Biochemistry ）、第２３６
巻、第１４６〜１５２頁（１９９６）］する等の方法も
利用できる。
出し得るものであるならば、放射性、非放射性を問わな
い。非放射性の標識物質としては、例えばビオチン、ジ
オキシゲニン等のハプテン、フルオレセイン、ローダミ
ン等の蛍光物質あるいはアクリジン等の化学発光物質が
挙げられる。これら標識物質によりオリゴヌクレオチド
を標識する場合はいずれも公知手段（特開昭５９−９３
０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報参照）によ
り、標識化を行うことができる。またヌクレオチドトリ
リン酸を標識する場合は公知手段［プロシーディングズ
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
シーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA）、第８０巻、第４０４５頁（１９８３）、特開昭６
３−１５２３６４号公報］に準じて行うか、市販品を利
用することができる。また増幅産物の分離手段も特に限
定されず、上記のアガロースゲル電気泳動のほか、イオ
ン−ペア逆相ＨＰＬＣで分離しＯＤ２５６値より定量
［バイオ テクニックス（Bio Techniques）、第２０
巻、第２５０〜２５７頁（１９９６）］、直鎖ポリアク
リルアミド充てんキャピラリー電気泳動で分離し、Ｐ／
ＡＣＥシステム（Ｓｙｓｔｅｍ）〔ベックマン インス
ツルメント社(Beckman Instrument, Inc.)〕でレーザー
で誘導された蛍光を定量分析［アナリティカル バイオ
ケミストリー（Analytical Biochemistry ）、第２３６
巻、第１４６〜１５２頁（１９９６）］する等の方法も
利用できる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるの
もではない。
明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるの
もではない。
【００１７】実施例１ 内部標準ＤＮＡとその転写産物である内部標準ＲＮＡの
調製例を示す。配列表の配列番号２１〜２８に示すオリ
ゴヌクレオチドを合成し５００ｎｇ／μｌに調製した。
８種のオリゴヌクレオチド溶液各１μｌと２. ５ｍＭｄ
ＮＴＰ等量混合物５μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆ
ｆｅｒ ５μｌ、５Ｕ／μｌＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａ
ｑTM ０．２５μｌを加え蒸留水にて全量５０μｌとし
た。２本鎖ＤＮＡ合成はＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ（宝酒造社製）にセットし９４
℃、５ｍｉｎから成る工程を１サイクル、その後９４℃
で２分、５５℃で２分、７２℃で３分から成る工程を７
サイクルで行った。本反応液２μｌをＰＣＲ反応液［１
×ＬＡ ＰＣＲTM ｂｕｆｆｅｒ、４００μＭｄＮＴＰ
等量混合物、２．５単位ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａ
ｑTM、２０ｐｍｏｌ上流プライマー（配列表の配列番号
２９）、２０ｐｍｏｌ下流プライマー（配列表の配列番
号３０）］に加え１００μｌとした。ＴａＫａＲａ Ｔ
ｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰにセットしＰＣＲは
９４℃、２分から成る工程を１サイクル、その後９４℃
で３０秒、５６℃で１分、７２℃で１分から成る工程を
３０サイクル行った。２％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロー
スゲル（宝酒造）を用いて電気泳動し増幅産物を含む部
分のゲルを切り出した。Ｓｕｐｒｅｃ−０１（宝酒造）
を用いてゲル中の増幅産物を精製し、イソプロピルアル
コール沈殿により回収した。上記行程により調製された
内部標準ＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１７に示
した。内部標準ＲＮＡの調製はＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ
ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒
造）を用い説明書記載の方法に従い調製した。内部標準
ＤＮＡ１００ｎｇより内部標準ＲＮＡを約５μｇ（１.
６×１０13コピー相当）が得られた。
調製例を示す。配列表の配列番号２１〜２８に示すオリ
ゴヌクレオチドを合成し５００ｎｇ／μｌに調製した。
８種のオリゴヌクレオチド溶液各１μｌと２. ５ｍＭｄ
ＮＴＰ等量混合物５μｌ、１０×Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆ
ｆｅｒ ５μｌ、５Ｕ／μｌＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａ
ｑTM ０．２５μｌを加え蒸留水にて全量５０μｌとし
た。２本鎖ＤＮＡ合成はＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ
Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰ（宝酒造社製）にセットし９４
℃、５ｍｉｎから成る工程を１サイクル、その後９４℃
で２分、５５℃で２分、７２℃で３分から成る工程を７
サイクルで行った。本反応液２μｌをＰＣＲ反応液［１
×ＬＡ ＰＣＲTM ｂｕｆｆｅｒ、４００μＭｄＮＴＰ
等量混合物、２．５単位ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａ
ｑTM、２０ｐｍｏｌ上流プライマー（配列表の配列番号
２９）、２０ｐｍｏｌ下流プライマー（配列表の配列番
号３０）］に加え１００μｌとした。ＴａＫａＲａ Ｔ
ｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰにセットしＰＣＲは
９４℃、２分から成る工程を１サイクル、その後９４℃
で３０秒、５６℃で１分、７２℃で１分から成る工程を
３０サイクル行った。２％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロー
スゲル（宝酒造）を用いて電気泳動し増幅産物を含む部
分のゲルを切り出した。Ｓｕｐｒｅｃ−０１（宝酒造）
を用いてゲル中の増幅産物を精製し、イソプロピルアル
コール沈殿により回収した。上記行程により調製された
内部標準ＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１７に示
した。内部標準ＲＮＡの調製はＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ
ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒
造）を用い説明書記載の方法に従い調製した。内部標準
ＤＮＡ１００ｎｇより内部標準ＲＮＡを約５μｇ（１.
６×１０13コピー相当）が得られた。
【００１８】実施例２ 配列表の配列番号１〜１６に示されるオリゴヌクレオチ
ドからなるプライマーセットと、実施例１で作製された
内部標準ＲＮＡを用い、それぞれＲＴ−ＰＣＲにて増幅
した。まず内部標準ＲＮＡを、大腸菌ｒＲＮＡ（３０ｎ
ｇ／μｌ）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ
塩化ナトリウム溶液を含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．５）で、［Ａ］１×１０7 コピー／μｌ、［Ｂ］４
×１０7 コピー／μｌ、［Ｃ］１．６×１０8 コピー／
μｌ、［Ｄ］６．４×１０8 コピー／μｌとなるよう希
釈した。なお、以降の実施例で用いた内部標準ＲＮＡは
このように希釈されたものを使用した。ＲＴ−ＰＣＲは
ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＬＡＰＣＲTM Ｋｉｔ（ＡＭ
Ｖ）Ｖｅｒ．１．１（宝酒造）を用い説明書記載の方法
を一部変更して行った。すなわち内部標準ＲＮＡ液５μ
ｌを最終１×ＲＮＡＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、５ｍＭ塩化
マグネシウム、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１００単位Ｒ
Ｎａｓｅ阻害剤、２５単位ＡＭＶ逆転写酵素、１２．５
ｐｍｏｌ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉ
ｍｅｒから成る逆転写反応液に加え１００μｌとし、内
部標準各希釈段階につき１本づつ計４本ＰＣＲチューブ
に分注した。ＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌ
ｅｒ ＭＰにセットし３０℃で１０分間、その後５５℃
で２０分間反応後、９５℃、５分間加熱し酵素反応を止
めた。本反応液を冷却後、チューブ当り１０μｌずつを
ＰＣＲ反応液［１×ＬＡ ＰＣＲTM ｂｕｆｆｅｒ（Ｍ
ｇ2+フリー）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１．２５
単位ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑTM、１０ｐｍｏｌ上流
プライマー、１０ｐｍｏｌ下流プライマー］４０μｌに
加えた。各プライマーの組合せは、表１に示す通りに行
い、内部標準ＲＮＡ各希釈段階につき８分子種、計３２
本ＰＣＲ反応液を作成し、ＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａ
ｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰにセットした。ＰＣＲは９４
℃、２分から成る工程を１サイクル、その後９４℃で３
０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒から成る工程を
２４サイクル行った。各々増幅反応液５μｌずつを、３
％ＮｕＳｉｅｖｅ アガロースゲルにアプライし、ミニ
ゲル電気泳動システムＭｕｐｉｄ−２（コスモバイオ）
にて１×ＴＡＥ緩衝液（０．４８％トリス、０．１１４
（Ｖ／Ｖ）％酢酸、０．０７％ＥＤＴＡ）中で１００Ｖ
で電気泳動した。泳動終了後０．１μｇ／ｍｌエチジウ
ムブロマイド液中で３０分染色後、水にて１時間脱色し
蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯＩＩＭｕｌｔｉ−
Ｖｉｅｗ（宝酒造）にて電気泳動結果を解析した。得ら
れたＤＮＡ断片の電気泳動パターンの写真を図１に示
す。図１中Ｍは分子量マーカー（１００ｂｐラダー）を
示し、各レーン上に示すＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは内部標準の濃
度を示す。本プライマーセットと内部標準ＲＮＡは同一
反応条件下、上記８分子種相互の１サイクル当りの増幅
効率がそろっており、複数の分子種の定量実験を同時進
行するのに優れていることが示された。
ドからなるプライマーセットと、実施例１で作製された
内部標準ＲＮＡを用い、それぞれＲＴ−ＰＣＲにて増幅
した。まず内部標準ＲＮＡを、大腸菌ｒＲＮＡ（３０ｎ
ｇ／μｌ）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ
塩化ナトリウム溶液を含む１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
７．５）で、［Ａ］１×１０7 コピー／μｌ、［Ｂ］４
×１０7 コピー／μｌ、［Ｃ］１．６×１０8 コピー／
μｌ、［Ｄ］６．４×１０8 コピー／μｌとなるよう希
釈した。なお、以降の実施例で用いた内部標準ＲＮＡは
このように希釈されたものを使用した。ＲＴ−ＰＣＲは
ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＬＡＰＣＲTM Ｋｉｔ（ＡＭ
Ｖ）Ｖｅｒ．１．１（宝酒造）を用い説明書記載の方法
を一部変更して行った。すなわち内部標準ＲＮＡ液５μ
ｌを最終１×ＲＮＡＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、５ｍＭ塩化
マグネシウム、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１００単位Ｒ
Ｎａｓｅ阻害剤、２５単位ＡＭＶ逆転写酵素、１２．５
ｐｍｏｌ Ｏｌｉｇｏ ｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｉ
ｍｅｒから成る逆転写反応液に加え１００μｌとし、内
部標準各希釈段階につき１本づつ計４本ＰＣＲチューブ
に分注した。ＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌ
ｅｒ ＭＰにセットし３０℃で１０分間、その後５５℃
で２０分間反応後、９５℃、５分間加熱し酵素反応を止
めた。本反応液を冷却後、チューブ当り１０μｌずつを
ＰＣＲ反応液［１×ＬＡ ＰＣＲTM ｂｕｆｆｅｒ（Ｍ
ｇ2+フリー）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、１．２５
単位ＴａＫａＲａ ＬＡ ＴａｑTM、１０ｐｍｏｌ上流
プライマー、１０ｐｍｏｌ下流プライマー］４０μｌに
加えた。各プライマーの組合せは、表１に示す通りに行
い、内部標準ＲＮＡ各希釈段階につき８分子種、計３２
本ＰＣＲ反応液を作成し、ＴａＫａＲａ Ｔｈｅｒｍａ
ｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＭＰにセットした。ＰＣＲは９４
℃、２分から成る工程を１サイクル、その後９４℃で３
０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒から成る工程を
２４サイクル行った。各々増幅反応液５μｌずつを、３
％ＮｕＳｉｅｖｅ アガロースゲルにアプライし、ミニ
ゲル電気泳動システムＭｕｐｉｄ−２（コスモバイオ）
にて１×ＴＡＥ緩衝液（０．４８％トリス、０．１１４
（Ｖ／Ｖ）％酢酸、０．０７％ＥＤＴＡ）中で１００Ｖ
で電気泳動した。泳動終了後０．１μｇ／ｍｌエチジウ
ムブロマイド液中で３０分染色後、水にて１時間脱色し
蛍光イメージアナライザーＦＭＢＩＯＩＩＭｕｌｔｉ−
Ｖｉｅｗ（宝酒造）にて電気泳動結果を解析した。得ら
れたＤＮＡ断片の電気泳動パターンの写真を図１に示
す。図１中Ｍは分子量マーカー（１００ｂｐラダー）を
示し、各レーン上に示すＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは内部標準の濃
度を示す。本プライマーセットと内部標準ＲＮＡは同一
反応条件下、上記８分子種相互の１サイクル当りの増幅
効率がそろっており、複数の分子種の定量実験を同時進
行するのに優れていることが示された。
【００１９】実施例３ 無処置６週齢雄ラット（日本ＳＲＬ）より肝臓を摘出
し、肝臓の一部をＴＲＩｚｏｌTM試薬（ＧｉｂｃｏＢＲ
Ｌ社製）に入れ説明書記載の方法に従い全ＲＮＡを抽
出、ＯＤ２６０値より濃度換算し５００ｎｇ／μｌに調
整した。これら全ＲＮＡをチューブ当り１μｌずつ添加
し、実施例１で作製された内部標準ＲＮＡ（[ Ａ] １×
１０7 コピー／μｌ、[ Ｂ] ４×１０7 コピー／μｌ、
[ Ｃ] １．６×１０8 コピー／μｌ、[ Ｄ] ６．４×１
０8 コピー／μｌのいずれかの溶液）５μｌと共に実施
例２と同様に逆転写を行った。ＣＹＰ１Ａ２については
内部標準の濃度Ｂにつき、ＣＹＰ２Ｂ１／２については
内部標準の濃度Ａにつき、ＣＹＰ２Ｃ１１については内
部標準の濃度Ｄにつき、ＣＹＰ２Ｅ１については内部標
準の濃度Ｃにつき、ＣＹＰ３Ａ１については内部標準の
濃度Ｃにつき、ＣＹＰ３Ａ２については内部標準の濃度
Ｂにつき、ＣＹＰ４Ａ１については内部標準の濃度Ａに
つき並びにシクロフィリンについては内部標準の濃度Ｃ
につき実施例２に示すＰＣＲ反応組成及び温度パラメー
ターで２０〜３０サイクルで増幅した。各々増幅反応液
を１ウェル当り５μｌ、３％ＮｕＳｉｅｖｅ アガロー
スゲルにアプライし電気泳動、エチジウムブロマイド液
中で染色し蛍光強度を測定した。図２にはＣＹＰ２Ｅ
１、図３にはＣＹＰ３Ａ１につき種々のサイクルにおけ
るｍＲＮＡ由来増幅産物（Ｍ）と内部標準由来増幅産物
（Ｃ）の蛍光強度比（Ｍ／Ｃ）をＰＣＲ時のサイクル数
（横軸）でプロットした例を示す。両者の増幅効率が等
しい時は蛍光強度比がサイクル数に関わらず一定にな
る。図に示したＣＹＰ２Ｅ１はいずれのサイクルでも蛍
光強度比が０．７５に、ＣＹＰ３Ａ１は１になる。図に
は示さなかったが他の分子種の蛍光強度比はＣＹＰ１Ａ
２は０．８、ＣＹＰ２Ｂ１／２は１、ＣＹＰ２Ｃ１１は
０．７、ＣＹＰ３Ａ２は１、ＣＹＰ４Ａ１も１、シクロ
フィリンは０．９でほぼ一定で定量が可能であることが
わかった。ＣＹＰ１Ａ１の無処置肝臓での発現は非常に
低くｍＲＮＡ由来増幅産物を検出できず、β−ナフトフ
ラボン誘導した肝臓を用いて同様の実験を行った。これ
についても内部標準の濃度Ｃでサイクル数に関わらず蛍
光強度比が１近くで一定になりｍＲＮＡ、内部標準それ
ぞれに由来する産物の増幅効率はほぼ一致していること
が確認された。
し、肝臓の一部をＴＲＩｚｏｌTM試薬（ＧｉｂｃｏＢＲ
Ｌ社製）に入れ説明書記載の方法に従い全ＲＮＡを抽
出、ＯＤ２６０値より濃度換算し５００ｎｇ／μｌに調
整した。これら全ＲＮＡをチューブ当り１μｌずつ添加
し、実施例１で作製された内部標準ＲＮＡ（[ Ａ] １×
１０7 コピー／μｌ、[ Ｂ] ４×１０7 コピー／μｌ、
[ Ｃ] １．６×１０8 コピー／μｌ、[ Ｄ] ６．４×１
０8 コピー／μｌのいずれかの溶液）５μｌと共に実施
例２と同様に逆転写を行った。ＣＹＰ１Ａ２については
内部標準の濃度Ｂにつき、ＣＹＰ２Ｂ１／２については
内部標準の濃度Ａにつき、ＣＹＰ２Ｃ１１については内
部標準の濃度Ｄにつき、ＣＹＰ２Ｅ１については内部標
準の濃度Ｃにつき、ＣＹＰ３Ａ１については内部標準の
濃度Ｃにつき、ＣＹＰ３Ａ２については内部標準の濃度
Ｂにつき、ＣＹＰ４Ａ１については内部標準の濃度Ａに
つき並びにシクロフィリンについては内部標準の濃度Ｃ
につき実施例２に示すＰＣＲ反応組成及び温度パラメー
ターで２０〜３０サイクルで増幅した。各々増幅反応液
を１ウェル当り５μｌ、３％ＮｕＳｉｅｖｅ アガロー
スゲルにアプライし電気泳動、エチジウムブロマイド液
中で染色し蛍光強度を測定した。図２にはＣＹＰ２Ｅ
１、図３にはＣＹＰ３Ａ１につき種々のサイクルにおけ
るｍＲＮＡ由来増幅産物（Ｍ）と内部標準由来増幅産物
（Ｃ）の蛍光強度比（Ｍ／Ｃ）をＰＣＲ時のサイクル数
（横軸）でプロットした例を示す。両者の増幅効率が等
しい時は蛍光強度比がサイクル数に関わらず一定にな
る。図に示したＣＹＰ２Ｅ１はいずれのサイクルでも蛍
光強度比が０．７５に、ＣＹＰ３Ａ１は１になる。図に
は示さなかったが他の分子種の蛍光強度比はＣＹＰ１Ａ
２は０．８、ＣＹＰ２Ｂ１／２は１、ＣＹＰ２Ｃ１１は
０．７、ＣＹＰ３Ａ２は１、ＣＹＰ４Ａ１も１、シクロ
フィリンは０．９でほぼ一定で定量が可能であることが
わかった。ＣＹＰ１Ａ１の無処置肝臓での発現は非常に
低くｍＲＮＡ由来増幅産物を検出できず、β−ナフトフ
ラボン誘導した肝臓を用いて同様の実験を行った。これ
についても内部標準の濃度Ｃでサイクル数に関わらず蛍
光強度比が１近くで一定になりｍＲＮＡ、内部標準それ
ぞれに由来する産物の増幅効率はほぼ一致していること
が確認された。
【００２０】実施例４ ６週齢雄ラット（日本ＳＲＬ）に、ペントバルビタール
を生理食塩水に溶かした溶液、１日１回５０ｍｇ／Ｋ
ｇ、４日間腹腔内に連投、また対照ラットには生理食塩
水を投与した。最終投与２時間後に断頭放血して肝臓を
摘出し、直ちに液体窒素で凍結後、使用直前まで−８０
℃にて保存した。凍った肝臓の一部をＴＲＩｚｏｌTM試
薬に入れ説明書記載の方法に従い全ＲＮＡを抽出、ＯＤ
２６０値より濃度換算し５００ｎｇ／μｌに調整した。
この全ＲＮＡをチューブ当り１μｌずつ添加し、実施例
１で作製された内部標準ＲＮＡ（［Ａ］１×１０7 コピ
ー／μｌ、［Ｂ］４×１０7 コピー／μｌ、［Ｃ］１．
６×１０8 コピー／μｌ、［Ｄ］６．４×１０8 コピー
／μｌのいずれかの溶液）５μｌと共に実施例２と同様
にＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ
２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ
１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ４Ａ１並びにシクロフィリン
につき同時にＲＴ−ＰＣＲを行った。各々増幅反応液を
５μｌずつ３％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルにアプラ
イし電気泳動、エチジウムブロマイド液中で染色、ＵＶ
照射下写真撮影した。図４（１）にはＣＹＰ２Ｂ１／２
（両者の混合増幅）とＣＹＰ２Ｃ１１の結果を示す。図
中ＰＢはペントバルビタール投与ラット肝より抽出した
全ＲＮＡを用いた場合の反応生成物を、Ｃｏｎｔ．は生
理食塩水投与ラット肝よりの反応生成物を示す。各レー
ン上のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは内部標準の濃度を示し、ゲル写
真横のｃ、ｍはそれぞれ内部標準由来の反応生成物とｍ
ＲＮＡ由来の反応生成物であることを示している。判定
の際は、まず内部標準由来のバンドとｍＲＮＡ由来のバ
ンドのシグナル強度が等しいレーンを捜す。すなわちＣ
ＹＰ２Ｂ１／２の場合ペントバルビタール投与時はＣレ
ーンが、生食投与時ではＡレーンが相当することより、
全ＲＮＡ１ｎｇ当りのＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２の合
計分子数は、生食投与分では１×１０5 コピーと推定さ
れるが、ペントバルビタール投与分では１．６×１０6
コピーと推定されることからペントバルビタール投与に
よりこれら両分子種では１６倍誘導されたと判定され
る。ＣＹＰ２Ｃ１１の場合、内部標準由来のバンドとｍ
ＲＮＡ由来のバンドのシグナル強度が等しいレーンはペ
ントバルビタール投与、生食投与のいずれもＣレーンで
あり両者共全ＲＮＡ１ｎｇ当り１．６×１０6 コピーの
ＣＹＰ２Ｃ１１分子を含むと推定され、薬物投与により
該分子種は誘導されなかったと判定される。なお、図に
は示さなかったがシクロフィリンの増幅産物量は両者等
しく、本実験に用いた全ＲＮＡの両者の純度はほぼ等し
いと判断されたため結果を補正する必要はない。
を生理食塩水に溶かした溶液、１日１回５０ｍｇ／Ｋ
ｇ、４日間腹腔内に連投、また対照ラットには生理食塩
水を投与した。最終投与２時間後に断頭放血して肝臓を
摘出し、直ちに液体窒素で凍結後、使用直前まで−８０
℃にて保存した。凍った肝臓の一部をＴＲＩｚｏｌTM試
薬に入れ説明書記載の方法に従い全ＲＮＡを抽出、ＯＤ
２６０値より濃度換算し５００ｎｇ／μｌに調整した。
この全ＲＮＡをチューブ当り１μｌずつ添加し、実施例
１で作製された内部標準ＲＮＡ（［Ａ］１×１０7 コピ
ー／μｌ、［Ｂ］４×１０7 コピー／μｌ、［Ｃ］１．
６×１０8 コピー／μｌ、［Ｄ］６．４×１０8 コピー
／μｌのいずれかの溶液）５μｌと共に実施例２と同様
にＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ１、ＣＹＰ
２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ
１、ＣＹＰ３Ａ２、ＣＹＰ４Ａ１並びにシクロフィリン
につき同時にＲＴ−ＰＣＲを行った。各々増幅反応液を
５μｌずつ３％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルにアプラ
イし電気泳動、エチジウムブロマイド液中で染色、ＵＶ
照射下写真撮影した。図４（１）にはＣＹＰ２Ｂ１／２
（両者の混合増幅）とＣＹＰ２Ｃ１１の結果を示す。図
中ＰＢはペントバルビタール投与ラット肝より抽出した
全ＲＮＡを用いた場合の反応生成物を、Ｃｏｎｔ．は生
理食塩水投与ラット肝よりの反応生成物を示す。各レー
ン上のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは内部標準の濃度を示し、ゲル写
真横のｃ、ｍはそれぞれ内部標準由来の反応生成物とｍ
ＲＮＡ由来の反応生成物であることを示している。判定
の際は、まず内部標準由来のバンドとｍＲＮＡ由来のバ
ンドのシグナル強度が等しいレーンを捜す。すなわちＣ
ＹＰ２Ｂ１／２の場合ペントバルビタール投与時はＣレ
ーンが、生食投与時ではＡレーンが相当することより、
全ＲＮＡ１ｎｇ当りのＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２の合
計分子数は、生食投与分では１×１０5 コピーと推定さ
れるが、ペントバルビタール投与分では１．６×１０6
コピーと推定されることからペントバルビタール投与に
よりこれら両分子種では１６倍誘導されたと判定され
る。ＣＹＰ２Ｃ１１の場合、内部標準由来のバンドとｍ
ＲＮＡ由来のバンドのシグナル強度が等しいレーンはペ
ントバルビタール投与、生食投与のいずれもＣレーンで
あり両者共全ＲＮＡ１ｎｇ当り１．６×１０6 コピーの
ＣＹＰ２Ｃ１１分子を含むと推定され、薬物投与により
該分子種は誘導されなかったと判定される。なお、図に
は示さなかったがシクロフィリンの増幅産物量は両者等
しく、本実験に用いた全ＲＮＡの両者の純度はほぼ等し
いと判断されたため結果を補正する必要はない。
【００２１】図４（２）はＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２
の分別定量の例である。すなわち内部標準無添加で実施
例１と同様にＲＴ−ＰＣＲを行った後、増幅反応液８μ
ｌに１０×Ｍバッファー１μｌ、１０ｍｇ／ｍｌウシ血
清アルブミン０．１μｌ ４Ｕ／μｌ ＭｕｎＩ酵素
（すべて宝酒造社製）１μｌを加え３７℃、１時間加温
し、そのうち６μｌをアガロースゲル電気泳動したパタ
ーンを示す写真である。ＣＹＰ２Ｂ１はＭｕｎＩ認識サ
イトを有さないため切断されず５５０ｂｐのフラグメン
トを与え、ＣＹＰ２Ｂ２は切断され４３８ｂｐと１１２
ｂｐのフラグメントを生ずる。ＣＹＰ２Ｂ１の５５０ｂ
ｐのバンドとＣＹＰ２Ｂ２の４３８ｂｐのバンドのシグ
ナル強度より各々の量比を求めたところ、ペントバルビ
タール投与群ではＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２の量比は
３：１、生理食塩水投与群では３：２であった。よっ
て、ペントバルビタール投与によりＣＹＰ２Ｂ１とＣＹ
Ｐ２Ｂ２は両者共誘導されているがＣＹＰ２Ｂ１の方が
よく誘導されていることがわかった。本実験の結果を表
２にまとめた。なお、ＣＹＰ１Ａ１は通常はほとんど発
現していないといわれており本実験でも検出されなかっ
た（１×１０4 コピー／ｎｇ全ＲＮＡ 以下）。
の分別定量の例である。すなわち内部標準無添加で実施
例１と同様にＲＴ−ＰＣＲを行った後、増幅反応液８μ
ｌに１０×Ｍバッファー１μｌ、１０ｍｇ／ｍｌウシ血
清アルブミン０．１μｌ ４Ｕ／μｌ ＭｕｎＩ酵素
（すべて宝酒造社製）１μｌを加え３７℃、１時間加温
し、そのうち６μｌをアガロースゲル電気泳動したパタ
ーンを示す写真である。ＣＹＰ２Ｂ１はＭｕｎＩ認識サ
イトを有さないため切断されず５５０ｂｐのフラグメン
トを与え、ＣＹＰ２Ｂ２は切断され４３８ｂｐと１１２
ｂｐのフラグメントを生ずる。ＣＹＰ２Ｂ１の５５０ｂ
ｐのバンドとＣＹＰ２Ｂ２の４３８ｂｐのバンドのシグ
ナル強度より各々の量比を求めたところ、ペントバルビ
タール投与群ではＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２の量比は
３：１、生理食塩水投与群では３：２であった。よっ
て、ペントバルビタール投与によりＣＹＰ２Ｂ１とＣＹ
Ｐ２Ｂ２は両者共誘導されているがＣＹＰ２Ｂ１の方が
よく誘導されていることがわかった。本実験の結果を表
２にまとめた。なお、ＣＹＰ１Ａ１は通常はほとんど発
現していないといわれており本実験でも検出されなかっ
た（１×１０4 コピー／ｎｇ全ＲＮＡ 以下）。
【００２２】
【表２】 表 ２ ─────────────────────────────────── Ｐ−450 mRNA推定発現量（コピー／ng全RNA ） ペントバルビタール 分子種 ─────────────────── による誘導 生理食塩水投 ペントバルビタール 与ラット肝 投与ラット肝 ─────────────────────────────────── CYP1A1 検出されず 検出されず 不 明 CYP1A2 4×105 4×106 ± CYP2B1 6×104 1.2×106 ×２０ CYP2B2 4×104 4×106 ×１０ CYP2C11 3×106 3×106 ± CYP2E1 8×105 8×106 ± CYP3A1 1.6×106 3.2×106 ×２ CYP3A2 4×105 8×106 ×２ CYP4A1 1×105 1×106 ± ───────────────────────────────────
【００２３】実施例５ β−ナフトフラボン投与によるＰ−４５０各分子種の変
動を実施例４と同様の方法にて行った。薬物はコーンオ
イルに懸濁し、６週齢、雄ラット（日本ＳＲＬ）に１日
１回１００ｍｇ／Ｋｇ、４日間腹腔内に連投、対照ラッ
トにはコーンオイルを投与した。図５にはＣＹＰ１Ａ１
とＣＹＰ１Ａ２の電気泳動パターンを写真として示す。
図中ＮＦはβ−ナフトフラボン投与ラット肝より抽出し
た全ＲＮＡを用いた場合の反応生成物を、Ｃｏｎｔ．は
コーンオイル投与ラット肝よりの反応生成物を示す。各
レーン上のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは内部標準の濃度を示し、ゲ
ル写真横のｃ、ｍはそれぞれ内部標準由来の反応生成物
とｍＲＮＡ由来の反応生成物であることを示している。
β−ナフトフラボンはＣＹＰ１Ａ遺伝子の発現を誘導す
ることが知られており、表３に示すようにＣＹＰ１Ａ
１、ＣＹＰ１Ａ２をそれぞれ１００倍以上と１６倍誘導
した。更に、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の発
現がそれぞれ８分の１、２分の１に抑制されることがわ
かった。ＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２の分別定量の結
果、ＣＹＰ２Ｂ１の発現はほとんど変化していないがＣ
ＹＰ２Ｂ２の発現が抑制されており検出されなかった。
動を実施例４と同様の方法にて行った。薬物はコーンオ
イルに懸濁し、６週齢、雄ラット（日本ＳＲＬ）に１日
１回１００ｍｇ／Ｋｇ、４日間腹腔内に連投、対照ラッ
トにはコーンオイルを投与した。図５にはＣＹＰ１Ａ１
とＣＹＰ１Ａ２の電気泳動パターンを写真として示す。
図中ＮＦはβ−ナフトフラボン投与ラット肝より抽出し
た全ＲＮＡを用いた場合の反応生成物を、Ｃｏｎｔ．は
コーンオイル投与ラット肝よりの反応生成物を示す。各
レーン上のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは内部標準の濃度を示し、ゲ
ル写真横のｃ、ｍはそれぞれ内部標準由来の反応生成物
とｍＲＮＡ由来の反応生成物であることを示している。
β−ナフトフラボンはＣＹＰ１Ａ遺伝子の発現を誘導す
ることが知られており、表３に示すようにＣＹＰ１Ａ
１、ＣＹＰ１Ａ２をそれぞれ１００倍以上と１６倍誘導
した。更に、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子の発
現がそれぞれ８分の１、２分の１に抑制されることがわ
かった。ＣＹＰ２Ｂ１とＣＹＰ２Ｂ２の分別定量の結
果、ＣＹＰ２Ｂ１の発現はほとんど変化していないがＣ
ＹＰ２Ｂ２の発現が抑制されており検出されなかった。
【００２４】
【表３】 表 ３ ─────────────────────────────────── Ｐ−450 mRNA推定発現量（コピー／ng全RNA ） β−ナフトフラボン 分子種 ────────────────── による誘導 コーンオイル β−ナフトフラボン 投与ラット肝 投与ラット肝 ─────────────────────────────────── CYP1A1 検出されず 1.6×106 ＞×１００ CYP1A2 4×105 6.4×106 ×１６ CYP2B1 5×104 5×104 ± CYP2B2 5×104 検出されず ＜×１／５ CYP2C11 6.4×106 8×105 ×１／８ CYP2E1 4×105 2×105 ×１／２ CYP3A1 1.6×106 1.6×106 ± CYP3A2 8×105 8×106 ± CYP4A1 1×105 1×105 ± ───────────────────────────────────
【００２５】実施例６ クロフィブレート投与によるＰ−４５０各分子種の変動
を実施例４と同様の方法にて行った。薬物はコーンオイ
ルに懸濁し、６週齢、雄ラット（日本ＳＲＬ）に１日１
回２５０ｍｇ／Ｋｇ、４日間腹腔内に連投、対照ラット
にはコーンオイルを投与した。図６にはＣＹＰ４Ａ１と
シクロフィリンの電気泳動パターンを写真として示す。
図中ＣＬＯはクロフィブレート投与ラット肝より抽出し
た全ＲＮＡを用いた場合の反応生成物を、Ｃｏｎｔ．は
コーンオイル投与ラット肝よりの反応生成物を示す。各
レーン上のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは内部標準の濃度を示し、ゲ
ル写真横のｃ、ｍはそれぞれ内部標準由来の反応生成物
とｍＲＮＡ由来の反応生成物であることを示している。
シクロフィリンの発現は両者等しい。クロフィブレート
はＣＹＰ４Ａ１を誘導することが知られており、表４に
示すように１６倍誘導した。更に、ＣＹＰ２Ｂ１を６
倍、ＣＹＰ２Ｂ２を８倍、ＣＹＰ３Ａ１を２倍誘導し、
一方ＣＹＰ１Ａ２の発現は４分の１に抑制されることが
わかった。
を実施例４と同様の方法にて行った。薬物はコーンオイ
ルに懸濁し、６週齢、雄ラット（日本ＳＲＬ）に１日１
回２５０ｍｇ／Ｋｇ、４日間腹腔内に連投、対照ラット
にはコーンオイルを投与した。図６にはＣＹＰ４Ａ１と
シクロフィリンの電気泳動パターンを写真として示す。
図中ＣＬＯはクロフィブレート投与ラット肝より抽出し
た全ＲＮＡを用いた場合の反応生成物を、Ｃｏｎｔ．は
コーンオイル投与ラット肝よりの反応生成物を示す。各
レーン上のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは内部標準の濃度を示し、ゲ
ル写真横のｃ、ｍはそれぞれ内部標準由来の反応生成物
とｍＲＮＡ由来の反応生成物であることを示している。
シクロフィリンの発現は両者等しい。クロフィブレート
はＣＹＰ４Ａ１を誘導することが知られており、表４に
示すように１６倍誘導した。更に、ＣＹＰ２Ｂ１を６
倍、ＣＹＰ２Ｂ２を８倍、ＣＹＰ３Ａ１を２倍誘導し、
一方ＣＹＰ１Ａ２の発現は４分の１に抑制されることが
わかった。
【００２６】
【表４】 表 ４ ────────────────────────────────── Ｐ−450 mRNA推定発現量（コピー／ng全RNA ） クロフィブレート 分子種 ────────────────── による誘導 コーンオイル クロフィブレート 投与ラット肝 投与ラット肝 ────────────────────────────────── CYP1A1 検出されず 検出されず 不 明 CYP1A2 4×105 1×105 ×１／４ CYP2B1 5×104 3×105 ×６ CYP2B2 5×104 4×105 ×８ CYP2C11 6.4×106 6.4×106 ± CYP2E1 4×105 4×105 ± CYP3A1 1.6×106 3.2×106 ×２ CYP3A2 8×105 8×106 ± CYP4A1 1×105 1.6×106 ×１６ ──────────────────────────────────
【００２７】
【発明の効果】本発明により医薬品開発初期に薬物代謝
の研究に繁用されるラットの肝臓において、薬物のＰ−
４５０主分子種の発現に及ぼす影響が簡便に分別定量が
可能となった。
の研究に繁用されるラットの肝臓において、薬物のＰ−
４５０主分子種の発現に及ぼす影響が簡便に分別定量が
可能となった。
【００２８】
【００２９】配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGGTTCTGG ATACCCAGCT G 21
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCTAGGGTTG GTTACCAGG 19
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTCACCTCAG GGAATGCTGT G 21
【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTTGACAATC TTCTCCTGAG G 21
【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAGTTCTTCT CTGGGTTCCT G 21
【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACTGTGGGTC ATGGAGAGCT G 21
【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGCTGCTGC TGAAACACGT G 21
【００３６】配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGATGACAGC GATACTATCA C 21
【００３７】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTCCTCGTCA TATCCATCTG 20
【００３８】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCAGCCAATC AGAAATGTGG 20
【００３９】配列番号：１１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATCCGATATG GAGATCAC 18
【００４０】配列番号：１２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAAGAAGTCC TTGTCTGC 18
【００４１】配列番号：１３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）配列：CGACTTGGAA
CCCATAGAC 19
CCCATAGAC 19
【００４２】配列番号：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CATGTCAAAT CTCCCTAAGC C 21
【００４３】配列番号：１５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTGACAAAG AACTACAGC 19
【００４４】配列番号：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGAGGAGTCT TGACCTGCCA G 21
【００４５】配列番号：１７ 配列の長さ：５７７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＰＣＲ断片） 配列： TGCATCGAAT TCATTTAGGT GACACTATAG AATACACCTG CTGCTGCTGA AACACGTGAT 60 CCGATATGGA GATCACCTTC GACATCACGG CTGATGGGAG TTCTTCTCTG GGTTCCTGCT 120 CCTCGTCATA TCCATCTGGA TCGGTGACAA AGAACTACAG CGTACGGTCA TCGTCACCTC 180 AGGGAATGCT GTGCTGGTTC TGGATACCCA GCTGCATCGA CTTGGAACCC ATAGACCGCT 240 GTGAAGACGA CGCGAAATTC AGCATTTTCA GGATCCACCG ATCTCACTCT CCTTTGATGC 300 GAATGCCAGC GTCAGAGTGA TAGTATCGCT GTCATCCGGC TTAGGGAGAT TTGACATGCA 360 TCATATGCAG ATACTCCCTG AAGCATACAG GTCCTGCTGG CAGGTCAAGA CTCCTCTCCT 420 CAGGAGAAGA TTGTCAACCC TGGTAACCAA CCCTAGGTAA TAGCGATGCG TAATGACCAC 480 ATTTCTGATT GGCTGCGCAG ACAAGGACTT CTTCCAGCTC TCCATGACCC ACAGTAAAAA 540 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAACTGCA GGTTCAG 577
【００４６】配列番号：１８ 配列の長さ：４９８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（ＲＮＡ） 配列： CUGCUGCUGC UGAAACACGU GAUCCGAUAU GGAGAUCACC UUCGACAUCA CGGCUGAUGG 60 GAGUUCUUCU CUGGGUUCCU GCUCCUCGUC AUAUCCAUCU GGAUCGGUGA CAAAGAACUA 120 CAGCGUACGG UCAUCGUCAC CUCAGGGAAU GCUGUGCUGG UUCUGGAUAC CCAGCUGCAU 180 CGACUUGGAA CCCAUAGACC GCUGUGAAGA CGACGCGAAA UUCAGCAUUU UCAGGAUCCA 240 CCGAUCUCAC UCUCCUUUGA UGCGAAUGCC AGCGUCAGAG UGAUAGUAUC GCUGUCAUCC 300 GGCUUAGGGA GAUUUGACAU GCAUCAUAUG CAGAUACUCC CUGAAGCAUA CAGGUCCUGC 360 UGGCAGGUCA AGACUCCUCU CCUCAGGAGA AGAUUGUCAA CCCUGGUAAC CAACCCUAGG 420 UAAUAGCGAU GCGUAAUGAC CACAUUUCUG AUUGGCUGCG CAGACAAGGA CUUCUUCCAG 480 CUCUCCAUGA CCCACAGU 498
【００４７】配列番号：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTTCGACATC ACGGCTGATG G 21
【００４８】配列番号：２０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGGACCTGT ATGCTTCAGG 20
【００４９】配列番号：２１ 配列の長さ：８１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGCTGCTGC TGAAACACGT GATCCGATAT GGAGATCACC TTCGACATCA CGGCTGATGG 60 GAGTTCTTCT CTGGGTTCCT G 81
【００５０】配列番号：２２ 配列の長さ：７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGACGATGAC CGTACGCTGT AGTTCTTTGT CACCGATCCA GATGGATATG ACGAGGAGCA 60 GGAACCCAGA GAAGAACTC 79
【００５１】配列番号：２３ 配列の長さ：８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACAGCGTACG GTCATCGTCA CCTCAGGGAA TGCTGTGCTG GTTCTGGATA CCCAGCTGCA 60 TCGACTTGGA ACCCATAGAC 80
【００５２】配列番号：２４ 配列の長さ：７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAAAGGAGAG TGAGATCGGT GGATCCTGAA AATGCTGAAT TTCGCGTCGT CTTCACAGCG 60 GTCTATGGGT TCCAAGTCG 79
【００５３】配列番号：２５ 配列の長さ：８２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACCGATCTCA CTCTCCTTTG ATGCGAATGC CAGCGTCAGA GTGATAGTAT CGCTGTCATC 60 CGGCTTAGGG AGATTTGACA TG 82
【００５４】配列番号：２６ 配列の長さ：８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGAGGAGTCT TGACCTGCCA GCAGGACCTG TATGCTTCAG GGAGTATCTG CATATGATGC 60 ATGTCAAATC TCCCTAAGCC 80
【００５５】配列番号：２７ 配列の長さ：８０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGGCAGGTC AAGACTCCTC TCCTCAGGAG AAGATTGTCA ACCCTGGTAA CCAACCCTAG 60 GTAATAGCGA TGCGTAATGA 80
【００５６】配列番号：２８ 配列の長さ：７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACTGTGGGTC ATGGAGAGCT GGAAGAAGTC CTTGTCTGCG CAGCCAATCA GAAATGTGGT 60 CATTACGCAT CGCTATTAC 79
【００５７】配列番号：２９ 配列の長さ： 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGCATCGAAT TCATTTAGGT GACACTATAG AATACACCTG CTGCTGCTGA AACACGTG 58
【００５８】配列番号：３０ 配列の長さ：６３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTGAACCTGC AGTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTACTGTGGG TCATGGAGAG 60 CTG 63
【図１】内部標準を鋳型に配列表の配列番号１〜１６に
示すプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った場
合の得られたＤＮＡ断片の電気泳動パターンを示す写真
である。
示すプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った場
合の得られたＤＮＡ断片の電気泳動パターンを示す写真
である。
【図２】ＲＴ−ＰＣＲ法により生成したＣＹＰ２Ｅ１ｍ
ＲＮＡ由来増幅産物（Ｍ）と内部標準由来増幅産物
（Ｃ）の蛍光強度比（Ｍ／Ｃ）を示す図である。
ＲＮＡ由来増幅産物（Ｍ）と内部標準由来増幅産物
（Ｃ）の蛍光強度比（Ｍ／Ｃ）を示す図である。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲ法により検出したＣＹＰ３Ａ１ｍ
ＲＮＡ由来増幅産物（Ｍ）と内部標準由来増幅産物
（Ｃ）の蛍光強度比（Ｍ／Ｃ）を示す図である。
ＲＮＡ由来増幅産物（Ｍ）と内部標準由来増幅産物
（Ｃ）の蛍光強度比（Ｍ／Ｃ）を示す図である。
【図４】（１）ペントバルビタール又は生理食塩水を投
与したラットの肝臓から調製したＲＮＡ及び内部標準Ｒ
ＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行った場合の、ＣＹＰ
２Ｂ１／２とＣＹＰ２Ｃ１１ｍＲＮＡ由来の増幅断片と
内部標準由来の増幅断片の電気泳動のパターンを示す写
真である。 （２）ペントバルビタールまたは生理食塩水を投与した
ラットの肝臓から調製したＲＮＡを鋳型にしてＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った場合の、ＣＹＰ２Ｂ１／２ｍＲＮＡ由来の
増幅断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した断片の電気泳動
のパターンを示す写真である。
与したラットの肝臓から調製したＲＮＡ及び内部標準Ｒ
ＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行った場合の、ＣＹＰ
２Ｂ１／２とＣＹＰ２Ｃ１１ｍＲＮＡ由来の増幅断片と
内部標準由来の増幅断片の電気泳動のパターンを示す写
真である。 （２）ペントバルビタールまたは生理食塩水を投与した
ラットの肝臓から調製したＲＮＡを鋳型にしてＲＴ−Ｐ
ＣＲを行った場合の、ＣＹＰ２Ｂ１／２ｍＲＮＡ由来の
増幅断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した断片の電気泳動
のパターンを示す写真である。
【図５】β−ナフトフラボン又はコーンオイルを投与し
たラットの肝臓から調製したＲＮＡ及び内部標準ＲＮＡ
を鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行った場合の、増幅したＣ
ＹＰ１Ａ１とＣＹＰ１Ａ２ｍＲＮＡ由来の増幅断片と内
部標準由来の増幅断片の電気泳動のパターンを示す写真
である。
たラットの肝臓から調製したＲＮＡ及び内部標準ＲＮＡ
を鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行った場合の、増幅したＣ
ＹＰ１Ａ１とＣＹＰ１Ａ２ｍＲＮＡ由来の増幅断片と内
部標準由来の増幅断片の電気泳動のパターンを示す写真
である。
【図６】クロフィブレート又はコーンオイルを投与した
ラットの肝臓から調製したＲＮＡ及び内部標準ＲＮＡを
鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行った場合の、ＣＹＰ４Ａ１
とシクリフィリンｍＲＮＡ由来の増幅断片と内部標準由
来の増幅断片の電気泳動のパターンを示す写真である。
ラットの肝臓から調製したＲＮＡ及び内部標準ＲＮＡを
鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを行った場合の、ＣＹＰ４Ａ１
とシクリフィリンｍＲＮＡ由来の増幅断片と内部標準由
来の増幅断片の電気泳動のパターンを示す写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日野 文嗣 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (11)
- 【請求項１】 核酸増幅法によるラットのチトクローム
Ｐ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析に内部標準として
使用される核酸であって、核酸増幅法に使用されるプラ
イマーによって定量分析しようとする分子種のｍＲＮＡ
由来の増幅産物とは区別できる鎖長の増幅産物を、定量
分析しようとする分子種のｍＲＮＡと同じ効率で与える
核酸であることを特徴とする核酸。 - 【請求項２】 ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２
Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、
ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２及びＣＹＰ４Ａ１から選択
されるラットのチトクロームＰ−４５０分子種の定量分
析に用いられる請求項１記載の核酸。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１８に示される塩基配
列を有する請求項２記載の核酸。 - 【請求項４】 ＲＮＡであることを特徴とする請求項１
〜３のいずれか１項に記載の核酸。 - 【請求項５】 核酸増幅法によるラットのチトクローム
Ｐ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析に使用されるキッ
トであって、チトクロームＰ−４５０分子種ｍＲＮＡ由
来の核酸の増幅に使用されるプライマーと、請求項１〜
４のいずれか１項に記載の核酸とを含有することを特徴
とするキット。 - 【請求項６】 ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２
Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、
ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２及びＣＹＰ４Ａ１から選択
されるラットのチトクロームＰ−４５０分子種の定量分
析に用いられる請求項５記載のキット。 - 【請求項７】 配列表の配列番号１及び２に示されるプ
ライマーからなるプライマー対、配列表の配列番号３及
び４に示されるプライマーからなるプライマー対、配列
表の配列番号５及び６に示されるプライマーからなるプ
ライマー対、配列表の配列番号７及び８に示されるプラ
イマーからなるプライマー対、配列表の配列番号９及び
１０に示されるプライマーからなるプライマー対、配列
表の配列番号１１及び１２に示されるプライマーからな
るプライマー対、配列表の配列番号１３及び１４に示さ
れるプライマーからなるプライマー対、配列表の配列番
号１５及び１６に示されるプライマーからなるプライマ
ー対より選択されるプライマー対と、請求項３又は請求
項４記載の核酸を含有することを特徴とする請求項６記
載のキット。 - 【請求項８】 核酸増幅法によるラットのチトクローム
Ｐ−４５０分子種ｍＲＮＡの定量分析方法であって、請
求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を内部標準とし
て使用することを特徴とする定量分析方法。 - 【請求項９】 ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２
Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ２、ＣＹＰ２Ｃ１１、ＣＹＰ２Ｅ１、
ＣＹＰ３Ａ１、ＣＹＰ３Ａ２及びＣＹＰ４Ａ１から選択
されるラットのチトクロームＰ−４５０分子種を定量分
析の対象とする請求項８記載の定量分析方法。 - 【請求項１０】 配列表の配列番号１及び２に示される
プライマーからなるプライマー対、配列表の配列番号３
及び４に示されるプライマーからなるプライマー対、配
列表の配列番号５及び６に示されるプライマーからなる
プライマー対、配列表の配列番号７及び８に示されるプ
ライマーからなるプライマー対、配列表の配列番号９及
び１０に示されるプライマーからなるプライマー対、配
列表の配列番号１１及び１２に示されるプライマーから
なるプライマー対、配列表の配列番号１３及び１４に示
されるプライマーからなるプライマー対、配列表の配列
番号１５及び１６に示されるプライマーからなるプライ
マー対より選択されるプライマー対と、請求項３又は請
求項４記載の核酸を使用することを特徴とする請求項９
記載の定量方法。 - 【請求項１１】 核酸増幅法としてＲＴ−ＰＣＲ法を使
用することを特徴とする請求項１０記載の定量分析方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9193402A JPH1118800A (ja) | 1997-07-04 | 1997-07-04 | ラットチトクロームｐ−４５０分子種分別定量用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9193402A JPH1118800A (ja) | 1997-07-04 | 1997-07-04 | ラットチトクロームｐ−４５０分子種分別定量用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1118800A true JPH1118800A (ja) | 1999-01-26 |
Family
ID=16307360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9193402A Pending JPH1118800A (ja) | 1997-07-04 | 1997-07-04 | ラットチトクロームｐ−４５０分子種分別定量用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1118800A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113012762A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-06-22 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 基于分子分类器的样本分类系统、试剂盒、方法及应用 |
-
1997
- 1997-07-04 JP JP9193402A patent/JPH1118800A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113012762A (zh) * | 2021-04-09 | 2021-06-22 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 基于分子分类器的样本分类系统、试剂盒、方法及应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040422 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040810 |