JPH1114585A - 酸化還元酵素を用いる測定方法 - Google Patents
酸化還元酵素を用いる測定方法Info
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- JPH1114585A JPH1114585A JP9180338A JP18033897A JPH1114585A JP H1114585 A JPH1114585 A JP H1114585A JP 9180338 A JP9180338 A JP 9180338A JP 18033897 A JP18033897 A JP 18033897A JP H1114585 A JPH1114585 A JP H1114585A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酸化還元酵素-メディエータ混合物層を形成
させた作用極および対極よりなる2電極タイプのバイオ
センサを用いる測定方法において、測定範囲を拡げ、そ
の精度を向上せしめた測定方法を提供する。 【解決手段】 酸化還元酵素-メディエータ混合物層を
形成させた作用極および対極の表面に被測定溶液を接触
させた後、0.8〜1.2Vの印加電位を加えて一定時間経過
後の電流値を測定する。
させた作用極および対極よりなる2電極タイプのバイオ
センサを用いる測定方法において、測定範囲を拡げ、そ
の精度を向上せしめた測定方法を提供する。 【解決手段】 酸化還元酵素-メディエータ混合物層を
形成させた作用極および対極の表面に被測定溶液を接触
させた後、0.8〜1.2Vの印加電位を加えて一定時間経過
後の電流値を測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酸化還元酵素を用
いる測定方法に関する。更に詳しくは、酸化還元酵素を
メディエータ(電子伝達体)との混合物として用いる測定
方法に関する。
いる測定方法に関する。更に詳しくは、酸化還元酵素を
メディエータ(電子伝達体)との混合物として用いる測定
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】グルコースオキシダーゼ(GOD)によって
代表される酸化還元酵素を用いるバイオセンサにおいて
は、酸化還元酵素は作用極および対極上に固定化される
が、この場合GOD等はメディエータとの混合物層を形成
させて用いられることがある。ここで、酸化還元酵素と
してはGOD以外にも、アルコールオキシダーゼ、乳酸オ
キシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グルコースデヒ
ドロナーゼ、アルコールデヒドロナーゼ、ピルビン酸デ
ヒドロナーゼ等が用いられ、またメディエータとして
は、フェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン等が用
いられる。
代表される酸化還元酵素を用いるバイオセンサにおいて
は、酸化還元酵素は作用極および対極上に固定化される
が、この場合GOD等はメディエータとの混合物層を形成
させて用いられることがある。ここで、酸化還元酵素と
してはGOD以外にも、アルコールオキシダーゼ、乳酸オ
キシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グルコースデヒ
ドロナーゼ、アルコールデヒドロナーゼ、ピルビン酸デ
ヒドロナーゼ等が用いられ、またメディエータとして
は、フェリシアン化カリウム、パラベンゾキノン等が用
いられる。
【０００３】ここで用いられるGOD-メディエータ混合物
層は、次のように作用する。GODは酸素の共存下でグル
コースを酸化し、その際発生するH2O2を作用極上で更に
酸化し、このとき発生する酸化電流値を測定することに
よって、グルコース濃度を間接的に求めている。 グルコース＋O2 → グルコノラクトン＋H2O2 H2O2 → O2＋2H+＋2e-
層は、次のように作用する。GODは酸素の共存下でグル
コースを酸化し、その際発生するH2O2を作用極上で更に
酸化し、このとき発生する酸化電流値を測定することに
よって、グルコース濃度を間接的に求めている。 グルコース＋O2 → グルコノラクトン＋H2O2 H2O2 → O2＋2H+＋2e-
【０００４】この場合、被測定溶液が希釈されるバッチ
式測定法、FIA(フロー・インジェクション・アナリシ
ス)方式測定法においては、水溶液中の溶存酸素濃度が8
ppm(0.3mM、25℃)程度でも、制限透過膜の付与等の手段
を用いることにより、十分に検量性を確保することがで
きる。
式測定法、FIA(フロー・インジェクション・アナリシ
ス)方式測定法においては、水溶液中の溶存酸素濃度が8
ppm(0.3mM、25℃)程度でも、制限透過膜の付与等の手段
を用いることにより、十分に検量性を確保することがで
きる。
【０００５】しかしながら、被測定溶液の希釈のない原
液サンプルの場合には、酵素反応が溶存酸素濃度に律速
されるため、グルコース濃度として約100mg/dl付近迄し
か直線検量範囲を示さない。そして、例えば使い捨てグ
ルコースバイオセンサなどにあっては、多くの場合原液
サンプルについての測定が行われる。
液サンプルの場合には、酵素反応が溶存酸素濃度に律速
されるため、グルコース濃度として約100mg/dl付近迄し
か直線検量範囲を示さない。そして、例えば使い捨てグ
ルコースバイオセンサなどにあっては、多くの場合原液
サンプルについての測定が行われる。
【０００６】メディエータとして、例えばフェリシアン
化カリウムを用いた場合には、グルコースとの反応で発
生したフェロシアン化イオンが作用極で酸化され、酸化
電流を生ずる。 グルコース＋2Fe(CN)6 ---＋H2O→ グルコン酸＋2H+＋2F
e(CN)6 ---- 2Fe(CN)6 ---- → 2Fe(CN)6 ---＋2e-
化カリウムを用いた場合には、グルコースとの反応で発
生したフェロシアン化イオンが作用極で酸化され、酸化
電流を生ずる。 グルコース＋2Fe(CN)6 ---＋H2O→ グルコン酸＋2H+＋2F
e(CN)6 ---- 2Fe(CN)6 ---- → 2Fe(CN)6 ---＋2e-
【０００７】フェリシアン化カリウムの添加量(濃度約1
0〜1500mM/約0.5〜10μl)は任意に設定することができ
るため、センサの検量範囲は溶存酸素に律速されなくな
る。
0〜1500mM/約0.5〜10μl)は任意に設定することができ
るため、センサの検量範囲は溶存酸素に律速されなくな
る。
【０００８】このような酸化還元酵素-メディエータ混
合物層をそれぞれ形成させた作用極および対極間には、
通常0.4〜0.7Vの電圧を印加することにより測定が行わ
れている。このような値の印加電圧をかけることによ
り、メディエータと電極間で電子の移動が起り、それが
電流値として検出される訳であるが、そもそも0.4〜0.7
Vという印加電圧の値は、更に参照極を加えた3電極タイ
プの場合から導かれている。即ち、3電極タイプのバイ
オセンサでは、参照極に対する作用極の電位が重要であ
り、それの最適値0.4〜0.7Vのみが問題となり、作用極-
対極間の電位差には殆んど注意が払われてはいなかった
のである。
合物層をそれぞれ形成させた作用極および対極間には、
通常0.4〜0.7Vの電圧を印加することにより測定が行わ
れている。このような値の印加電圧をかけることによ
り、メディエータと電極間で電子の移動が起り、それが
電流値として検出される訳であるが、そもそも0.4〜0.7
Vという印加電圧の値は、更に参照極を加えた3電極タイ
プの場合から導かれている。即ち、3電極タイプのバイ
オセンサでは、参照極に対する作用極の電位が重要であ
り、それの最適値0.4〜0.7Vのみが問題となり、作用極-
対極間の電位差には殆んど注意が払われてはいなかった
のである。
【０００９】そこで、作用極および対極よりなる2電極
タイプのバイオセンサにおいても、3電極タイプで最適
値とされる0.4〜0.7Vという電圧を作用極-対極間に印加
し、測定することが一般に行われている。しかしなが
ら、2電極タイプで作用極-対極間に0.4〜0.7Vの電圧を
印加した場合には、メディエータの電極における電子交
換の際の能力が不足し、酵素反応の結果生ずるメディエ
ータの還元物の電極による酸化が十分に行われないた
め、バイオセンサとしての測定範囲が狭くなり、精度が
低下するという問題がみられた。
タイプのバイオセンサにおいても、3電極タイプで最適
値とされる0.4〜0.7Vという電圧を作用極-対極間に印加
し、測定することが一般に行われている。しかしなが
ら、2電極タイプで作用極-対極間に0.4〜0.7Vの電圧を
印加した場合には、メディエータの電極における電子交
換の際の能力が不足し、酵素反応の結果生ずるメディエ
ータの還元物の電極による酸化が十分に行われないた
め、バイオセンサとしての測定範囲が狭くなり、精度が
低下するという問題がみられた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、酸化
還元酵素-メディエータ混合物層を形成させた作用極お
よび対極よりなる2電極タイプのバイオセンサを用いる
測定方法において、測定範囲を拡げ、その精度を向上せ
しめた測定方法を提供することにある。
還元酵素-メディエータ混合物層を形成させた作用極お
よび対極よりなる2電極タイプのバイオセンサを用いる
測定方法において、測定範囲を拡げ、その精度を向上せ
しめた測定方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】かかる本発明の目的は、
酸化還元酵素-メディエータ混合物層を形成させた作用
極および対極の表面に被測定溶液を接触させた後、0.8
〜1.2Vの印加電位を加えて一定時間経過後の電流値を測
定することによって達成される。
酸化還元酵素-メディエータ混合物層を形成させた作用
極および対極の表面に被測定溶液を接触させた後、0.8
〜1.2Vの印加電位を加えて一定時間経過後の電流値を測
定することによって達成される。
【００１２】
【発明の実施の形態】作用極および対極は、セラミック
ス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料(例え
ば、微生物生産ポリエステル等)などの絶縁性基板上に
設けられる。作用極および対極は、スクリーン印刷法、
蒸着法、スパッタリング法などによってパラジウム、
銀、白金、金、カーボン等から形成される。その後、各
電極の中央部分が樹脂製絶縁膜などによって被覆され
る。作用極および対極は、一般に同一平面上に形成され
るが、これらは対面構造をとることもできる。
ス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料(例え
ば、微生物生産ポリエステル等)などの絶縁性基板上に
設けられる。作用極および対極は、スクリーン印刷法、
蒸着法、スパッタリング法などによってパラジウム、
銀、白金、金、カーボン等から形成される。その後、各
電極の中央部分が樹脂製絶縁膜などによって被覆され
る。作用極および対極は、一般に同一平面上に形成され
るが、これらは対面構造をとることもできる。
【００１３】作用極および対極上への混合物層の形成
は、水１ml当りGOD約1〜50mg、好ましくは約1〜20mg(16
5800単位/gの場合)およびフェリシアン化カリウム約1〜
100mg、好ましくは約10〜60mgまたはパラベンゾキノン
約1〜200mg、好ましくは約50〜180mgを溶解させた水溶
液約0.5〜10μl、好ましくは約6〜8μlを滴下法、スピ
ンコート法などによって作用極および対極上に滴下する
ことによって行われ、そこに約0.05〜10μm、好ましく
は約0.1〜2μmの膜厚の混合物層を室温条件下で形成さ
せる。
は、水１ml当りGOD約1〜50mg、好ましくは約1〜20mg(16
5800単位/gの場合)およびフェリシアン化カリウム約1〜
100mg、好ましくは約10〜60mgまたはパラベンゾキノン
約1〜200mg、好ましくは約50〜180mgを溶解させた水溶
液約0.5〜10μl、好ましくは約6〜8μlを滴下法、スピ
ンコート法などによって作用極および対極上に滴下する
ことによって行われ、そこに約0.05〜10μm、好ましく
は約0.1〜2μmの膜厚の混合物層を室温条件下で形成さ
せる。
【００１４】グルコース濃度の測定は、このようにして
作製されたグルコースバイオセンサに所定濃度のグルコ
ース水溶液を滴下して約1〜60秒間程度反応させた後、
そこに0.8〜1.2V、好ましくは1.0〜1.2Vの電圧を印加
し、例えば印加20秒後の電流値を測定することによって
行われる。印加電位を加えた後、一定時間(約5〜15秒
間)経過後の電流値が測定される点は、従来法と同じで
ある。グルコースバイオセンサ以外のバイオセンサにつ
いても、同様に0.8〜1.2Vの印加電圧を加えて測定が行
われる。
作製されたグルコースバイオセンサに所定濃度のグルコ
ース水溶液を滴下して約1〜60秒間程度反応させた後、
そこに0.8〜1.2V、好ましくは1.0〜1.2Vの電圧を印加
し、例えば印加20秒後の電流値を測定することによって
行われる。印加電位を加えた後、一定時間(約5〜15秒
間)経過後の電流値が測定される点は、従来法と同じで
ある。グルコースバイオセンサ以外のバイオセンサにつ
いても、同様に0.8〜1.2Vの印加電圧を加えて測定が行
われる。
【００１５】
【発明の効果】作用極および対極上に酸化還元酵素-メ
ディエータ混合物層を設けたバイオセンサを用いての測
定に際し、これら電極間に0.8〜1.2Vの電位を印加する
ことによって、低濃度から高濃度の被測定溶液について
直線性の良い検量線を得ることができる。
ディエータ混合物層を設けたバイオセンサを用いての測
定に際し、これら電極間に0.8〜1.2Vの電位を印加する
ことによって、低濃度から高濃度の被測定溶液について
直線性の良い検量線を得ることができる。
【００１６】
【実施例】次に、実施例について本発明を説明する。
【００１７】実施例 ポリエチレンテレフタレートフィルム(厚さ0.188mm)上
に、スクリーン印刷法によって、いずれもカーボン製の
対極および作用極を膜厚5μmで形成させた。次いで、こ
れらの各電極の中央部分を厚さ5μmのポリエステル樹脂
製絶縁膜で覆った。
に、スクリーン印刷法によって、いずれもカーボン製の
対極および作用極を膜厚5μmで形成させた。次いで、こ
れらの各電極の中央部分を厚さ5μmのポリエステル樹脂
製絶縁膜で覆った。
【００１８】このような構成の作用極および対極上に、
水１mlにGOD(165800単位/g)10mgおよびフェリシアン化
カリウム48mgを溶解させた水溶液を8μl滴下して室温条
件下で乾燥させ、グルコースバイオセンサを作製した。
水１mlにGOD(165800単位/g)10mgおよびフェリシアン化
カリウム48mgを溶解させた水溶液を8μl滴下して室温条
件下で乾燥させ、グルコースバイオセンサを作製した。
【００１９】作製されたグルコースバイオセンサに、所
定濃度のグルコース水溶液20μl(pH5.0)を滴下し、80秒
間静置した後、所定の電位を印加し、印加10秒後の電流
値を測定した。測定には、ポテンショガルバノスタット
(HA501)およびファンクションジネレータ(北斗電工製HB
104)が用いられた。各センサは１サンプル毎に使い捨て
とした。印加電圧0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.
4,1.6または1.8Vにおけるグルコース水溶液濃度と出力
(単位:μA)との関係は、次の表および図1のグラフに示
される。 濃度 印加電圧(V) (mg/dl) 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.6 1.8 0 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.8 3.7 12.0 16.3 47.6 93.0 100 8.3 10.0 10.0 9.4 10.0 11.3 11.0 17.6 21.5 53.6 91.0 500 32.4 38.0 41.0 47.1 47.1 48.8 48.5 50.2 51.6 64.5 101.5 800 43.3 52.0 62.0 69.3 76.5 76.6 78.5 81.5 83.0 91.5 108.5 1000 53.5 61.0 76.0 85.0 90.4 93.0 95.3 96.5 97.7 99.7 121.0 1200 54.9 67.0 88.0 98.5 105.5 108.0 111.5 112.7 113.7 123.7 133.0 1600 62.1 74.0 97.0 106.7 121.3 127.3 137.3 146.3 151.7 153.7 167.3 2000 66.7 80.0 101.0 110.0 129.3 141.0 147.3 159.8 165.7 173.0 189.0
定濃度のグルコース水溶液20μl(pH5.0)を滴下し、80秒
間静置した後、所定の電位を印加し、印加10秒後の電流
値を測定した。測定には、ポテンショガルバノスタット
(HA501)およびファンクションジネレータ(北斗電工製HB
104)が用いられた。各センサは１サンプル毎に使い捨て
とした。印加電圧0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.
4,1.6または1.8Vにおけるグルコース水溶液濃度と出力
(単位:μA)との関係は、次の表および図1のグラフに示
される。 濃度 印加電圧(V) (mg/dl) 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.6 1.8 0 0.7 0.8 0.9 1.0 1.5 2.8 3.7 12.0 16.3 47.6 93.0 100 8.3 10.0 10.0 9.4 10.0 11.3 11.0 17.6 21.5 53.6 91.0 500 32.4 38.0 41.0 47.1 47.1 48.8 48.5 50.2 51.6 64.5 101.5 800 43.3 52.0 62.0 69.3 76.5 76.6 78.5 81.5 83.0 91.5 108.5 1000 53.5 61.0 76.0 85.0 90.4 93.0 95.3 96.5 97.7 99.7 121.0 1200 54.9 67.0 88.0 98.5 105.5 108.0 111.5 112.7 113.7 123.7 133.0 1600 62.1 74.0 97.0 106.7 121.3 127.3 137.3 146.3 151.7 153.7 167.3 2000 66.7 80.0 101.0 110.0 129.3 141.0 147.3 159.8 165.7 173.0 189.0
【００２０】この結果から、次のようなことがいえる。 (1)印加電圧が0.7V以下の場合には、グルコース水溶液
濃度が500mg/dl以下では検量線に直線性はみられるが、
800mg/dl以上では直線性がなくなり、更に1000mg/dl以
上ではほぼ横ばい状態となる。 (2)印加電圧が1.3V以上の場合には、低濃度領域では電
気分解に起因すると思われる出力が発生し、検量線の直
線性がなくなる。 (3)これに対して、印加電圧が0.8〜1.2Vの範囲内では、
低濃度から高濃度迄直線性の良い検量線が得られてい
る。
濃度が500mg/dl以下では検量線に直線性はみられるが、
800mg/dl以上では直線性がなくなり、更に1000mg/dl以
上ではほぼ横ばい状態となる。 (2)印加電圧が1.3V以上の場合には、低濃度領域では電
気分解に起因すると思われる出力が発生し、検量線の直
線性がなくなる。 (3)これに対して、印加電圧が0.8〜1.2Vの範囲内では、
低濃度から高濃度迄直線性の良い検量線が得られてい
る。
【図１】所定の印加電圧におけるグルコース濃度水溶液
と出力との関係を示すグラフである。
と出力との関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【請求項１】 酸化還元酵素-メディエータ混合物層を
形成させた作用極および対極の表面に被測定溶液を接触
させた後、0.8〜1.2Vの印加電位を加えて一定時間経過
後の電流値を測定することを特徴とする酸化還元酵素を
用いる測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18033897A JP3528521B2 (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | 酸化還元酵素を用いる測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18033897A JP3528521B2 (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | 酸化還元酵素を用いる測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1114585A true JPH1114585A (ja) | 1999-01-22 |
| JP3528521B2 JP3528521B2 (ja) | 2004-05-17 |
Family
ID=16081484
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18033897A Expired - Fee Related JP3528521B2 (ja) | 1997-06-20 | 1997-06-20 | 酸化還元酵素を用いる測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3528521B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE45764E1 (en) | 2001-09-14 | 2015-10-20 | Arkray, Inc. | Concentration measuring method, concentration test instrument, and concentration measuring apparatus |
-
1997
- 1997-06-20 JP JP18033897A patent/JP3528521B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE45764E1 (en) | 2001-09-14 | 2015-10-20 | Arkray, Inc. | Concentration measuring method, concentration test instrument, and concentration measuring apparatus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3528521B2 (ja) | 2004-05-17 |
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Legal Events
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