JPH1099087A - インターロイキン−１ベータ転換酵素様アポプロシス性プロテアーゼ−６ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アポトーシスを遺伝子学の分野から制御する
物質および方法の開発が望まれている。 【解決手段】 本発明によれば、ＩＣＥ ＬＡＰ−６を
コードするヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドおよび
ＤＮＡ（ＲＮＡ）および組換え技術によりこのようなポ
リペプチドを産生する方法が開示され、ＩＣＥ ＬＡＰ
−６はまた、ウイルス感染症、腫瘍形成に対する感受
性、および胚形成および組織恒常性の制御における病気
および欠陥の治療に関して利用することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、部分的には、新た
に同定されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド；該
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変異体および誘
導体；該ポリヌクレオチドおよびポリペプチドならびに
その変異体および誘導体の製法；該ポリペプチドのアゴ
ニストおよびアンタゴニスト；ならびに該ポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、変異体、誘導体、アゴニストおよ
びアンタゴニストの使用に関する。特に、これらの点お
よび他の点に関して、本発明はヒトインターロイキン−
１ベータ転換酵素アポトーシス性プロテアーゼ−６（以
下、「ＩＣＥ ＬＡＰ−６」と称する）のポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】最近
になって、インターロイキン−１β転換酵素（ＩＣＥ）
がプロ−ＩＬ−１βの成熟および活性ＩＬ−１βへの切
断に関与し、さらに有機体が不要な細胞を排除する工程
である、プログラムされた細胞死（またはアポトーシ
ス）に関与していることが判明した。アポトーシスまた
はプログラムされた細胞死は、後生動物の正常な成長お
よび恒常性における重要な生理学的過程である。

【０００３】後生動物、セノラブディティス・エレガン
ス（Caenorhabditis elegans）において、プログラムさ
れた細胞死の遺伝経路が動態された（Ｅllis,Ｒ.Ｅ.
ら、Ａnnu.Ｒev.Ｃell Ｂiol.，７：６６３−６９８
（１９９１））。２つの遺伝子、ｃｅｄ−３およびｃｅ
ｄ−４が、細胞がセノラブディティス・エレガンスにて
プログラムされた細胞死を受けるのに必須な遺伝子であ
る（Ｅllis,Ｈ.Ｍ.およびＨorvitz,Ｈ.Ｒ.,Ｃell，４
４：８１７−８２９（１９８６）。セノラブディティス
・エレガンスのＣed−３に相同的な一連のシステインプ
ロテアーゼが、アポトーシス機構にて「実行者」の役割
を果たすことが明らかになっている（Ｍartin,Ｓ.Ｊ.お
よびＧreen,Ｄ.Ｒ.（１９９５）Ｃell ８２，３４９−
３５２；Ｃhinnaiyan,Ａ.ａ.Ｄ.，ＶＭ.（１９９６）Ｃ
urrent Ｂiology ６；Ｈenkart,Ｐ.（１９９６）Ｉmmun
ity ４，１９５−２０１）。これら２つの遺伝子の機能
を排除する劣性変異は、セノラブディティス・エレガン
スの成長の間の正常なプログラムされた細胞死を妨げ
る。ｃｅｄ−３蛋白質の公知の脊椎動物の対応物がＩＣ
Ｅである。ｃｅｄ−３とＩＣＥの間のアミノ酸全体の同
一性は２８％であり、１１５個のアミノ酸の領域で（ｃ
ｅｄ−３の残基２４６−３６０およびＩＣＥの残基１６
４−２７８）、最高の同一性（４３％）を示す。この領
域は保存ペンタペプチド、ＱＡＣＲＧ（ｃｅｄ−３の残
基３５６−３６０）を有し、それはＩＣＥの機能に不可
欠であるシステインを含有する。

【０００４】ｃｅｄ−３とＩＣＥの間の類似性は、ｃｅ
ｄ−３がシステインプロテアーゼとして機能するだけで
なく、ＩＣＥが脊椎動物のプログラムされた細胞死遺伝
子として作用する可能性のあることを示唆する。ｃｅｄ
−３と脊椎動物の対応物であるＩＣＥが、胚成長の間の
プログラムされた細胞死を調節する（Ｇagliarnini,Ｖ.
ら、Ｓcience，２６３：８２６−８２８（１９９
４））。

【０００５】ｃｅｄ−３とｃｅｄ−４の変異により、通
常、セノラブディティス・エレガンスの胚形成の間に死
亡する細胞のアポトーシスの可能性がなくなる（Ｙuan,
Ｊ.Ｙ.およびＨorvitz,Ｈ.Ｒ.（１９９０）Ｄev Ｂiol
１３８，３３−４１）。ｃｅｄ−４の哺乳動物の相同物
は同定されていないが、ｃｅｄ−３はインターロイキン
−１β転換酵素（ＩＣＥ）（Ｙuan,Ｊ.ら（１９９３）
Ｃell７５，６４１−６５２）、プロ−ＩＬ−１βの活
性サイトカインへのプロセッシングおよび活性化に関与
するシステインプロテアーゼと配列類似性を共にしてい
る（Ｃerretti,Ｄ.Ｐ.ら（１９９２）Ｓcience 256，９
７−１００，Ｔhornbery,Ｎ.Ａ.ら（１９９２）Ｎature
356，７６８−７７４）。最近、システインプロテアー
ゼの新たな遺伝子科を構成する、ＩＣＥ／Ｃed−３の多
くの相同物が特徴付けられた。今日まで、ＩＣＥ／Ｃed
−３科の７種の構成員が同定されており、ＩＣＥ（Ｃer
retti,Ｄ.Ｐ.ら（１９９２）Ｓcience 256，９７−１０
０）、ＴＸ／ＩＣＨ２／ＩＣＥ rel-II（Ｍunday,Ｎ.
Ａ.ら（１９９５）Ｊ Ｂiol Ｃhem 270，１５８７０−
１５８７６；Ｆaucheu,Ｃ.ら（１９９５）Ｅmbo Ｊ 1
4，１９１４−１９２２；Ｋamens,Ｊら（１９９５）Ｊ
Ｂiol Ｃhem 270，１５２５０−１５２５６１２；ＩＣ
Ｅ ｒｅｌ−III（Ｍunday,Ｎ.Ａ.ら（１９９５）Ｊ Ｂi
ol Ｃhem 270，１５８７０−１５８７６、ＩＣＥ１／Ｎ
edd-２（Ｋumar,Ｓ.ら（１９９４）Ｇenes and Ｄevelo
pment 8，１６１３−１６２６；Ｗang,Ｌ.ら（１９９
４）Ｃell78，７３９−７５０）、Ｙama／ＣＰＰ３２／
Ａpopain（Ｔewari,Ｍ.ら（１９９５）Ｃell 81，８０
１−８０９；Ｆernandes-Ａlnemri,Ｔ.ら（１９９４）
Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 269，３０７６１−３０７６４；Ｎich
olson,Ｄ.Ｗ.ら（１９９５）Ｎature 376，３７−４
３）、Ｍch２ Ｆernandes-Ａlnemri,Ｔ.ら（１９９４）
Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.269，３０７６１−３０７６４）および
ＩＣＥ−ＬＡＰ３／Ｍch３／ＣＭＨ−１（Ｄuan,Ｈ.ら
（１９９６）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem. 271，３５０１３−３５
０３５；Ｆernandes-Ａlnemri,Ｔ.ら（１９９５）Ｃanc
er Ｒesearch 55，６０４５−６０５２；Ｌippke,Ｊ.
Ａ.ら（１９９６）Ｔhe Ｊournal of Ｂiological Ｃhe
mistry 271，１８２５−１８２８）。すべての科の構成
員はＩＣＥ／Ｃed−３と配列相同性を分担し、システイ
ン残基が触媒作用を示す活性部位ＱＡＣＲＧペンタペプ
チドを有する。種々の細胞におけるこれらプロテアーゼ
の異所発現がアポトーシスを引き起こす。ＩＣＥ／ｃｅ
ｄ−３遺伝子科の系統発生的分析により３つの亜科が明
らかにされた（Ｃhinnaiyan,Ａ.a.Ｄ.,ＶＭ.（１９９
６）Ｃurrent Ｂiology 6；Ｕan,Ｈ.ら（１９９６）Ｊ.
Ｂiol.Ｃhem. 271，３５０１３−３５０３５）。Ｙam
a、ＩＣＥ−ＬＡＰ３およびＭch２はセノラブディティ
ス・エレガンスＣed−３と密接に関連づけられ、Ｃed−
３亜科を構成する。ＩＣＥおよびＩＣＥ関連遺伝子、Ｉ
ＣＥ ｒｅｌIIおよびＩＣＥ ｒｅｌIIIはＩＣＥ亜科を
形成するのに対して、ＩＣＨ１およびそのマウス相同
体、ＮＥＤＤ−２はＮＥＤＤ−２亜科を形成する。構造
的始原型インターロイキン−１β転換酵素との類似性に
基づき、ＩＣＥ／Ｃed−３科構成員は、処理され活性な
ヘテロ二量体酵素を形成することのできるチモゲーンと
して合成される（Ｔhrornberry,Ｎ.Ａ.ら（１９９２）
Ｎature 356，７６８−７７４）。どの科の構成因子が
アポトーシス刺激に対する応答にて実際に活性化される
かを決定することは重要であろう。前の研究で、プロ−
Ｙamaおよびプロ−ＩＣＥ−ＬＡＰ３が、Ｆas／ＡＰＯ
−１のエンゲージメントまたはストーラスポリン（stau
rosporine）での処理を包含する種々の死刺激に対する
応答にて活性サブユニットにプロセシングされることが
証明された（Ｄuan,Ｈ.ら（１９９６）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.
271，３５０１３−３５０３５；Ｃhinnaiyan,Ａ.Ｍ.ら
（１９９６）Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry 27
1，４５７３−４５７６）。さらには、細胞傷害Ｔ細胞
介在アポトーシスの主たるエフェクターの一つであるセ
リンプロテアーゼグランザイムＢが、in vitroにて、Ｙ
ama（ＩＣＥでなく）を直接活性化することが明らかに
された（Ｑuan,Ｌ.ら（１９９６）ＰＮＡＳ ９３，Ｉn
Ｐress；Ｄarmon,Ａ.Ｊ.ら（１９９５）Ｎature 377，
４４６−４４８）。

【０００６】ＩＣＥｍＲＮＡが、末梢血液単球、末梢血
液リンパ球、末梢血液好中球、休止および活性化末梢血
液Ｔリンパ球、胎盤、Ｂリンパ芽球系統ＣＢ２３および
単球白血病細胞系統ＴＨＰ−１細胞を包含する種々の組
織にて検出されており（Ｃerretti,Ｄ.Ｐ.ら、Ｓcience
256：９７−１００（１９９２）、それはＩＣＥがプロ
−ＩＬ−１βに加えてさらなる基質を有するかもしれな
いことを示している。ＩＣＥが作用して細胞死を引き起
こす基質は、現在のところ解っていない。一の可能性は
それがセノラブディティス・エレガンス細胞死遺伝子ｃ
ｅｄ−４の脊椎動物の相同体であるかもしれないことで
ある。また、ＩＣＥは、細胞の生存に不可欠な蛋白質を
蛋白質分解作用で切断することにより細胞死を直接誘起
するかもしれない。

【０００７】哺乳動物遺伝子ｂｃｌ−２がリンパ球と称
される免疫細胞を細胞スイサイドから保護することが判
明した。さらに、ｃｒｍＡであるウシポックスウイルス
遺伝子蛋白質産物がＩＣＥ蛋白質分断活性を阻害する。

【０００８】治療目的に、例えば抗ウイルス剤、抗腫瘍
剤として、また胚の成長および組織恒常性、機能障害お
よび疾患におけるこのような因子の役割を調節するため
にアポトーシスを引き起こすのに有用な因子が必要とさ
れているのは明らかである。さらには、治療目的に、例
えば、特にアルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関
節リウマチ、敗血性ショック、敗血症、卒中、慢性炎
症、急性炎症、ＣＮＳ炎症、骨粗鬆症、虚血性再潅流傷
害、心血管疾患に伴う細胞死、多発性嚢胞腎病、心血管
疾患における内皮細胞のアポトーシス、変性肝臓病、Ｍ
Ｓ、ＡＬＳ、小脳変性、虚血性傷害、心筋梗塞、ＡＩＤ
Ｓ、脊髄形成異常症候群、脳損傷、再生不能性貧血、男
性型禿頭症および頭部傷害損傷などのアポトーシスによ
り惹起されるかまたはアポトーシスに付随する疾患を治
療するために、アポトーシスを減少または休止させるの
に有用な因子に関する必要があるのは明らかである。し
たがって、インターロイキン−１ベータ転換酵素アポト
ーシス性プロテアーゼであり、機能不全または疾患の予
防、改善または矯正において機能しうるこのような因子
を同定および特質化する必要がある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】これらおよび他の目的に
対して、本発明の目的の一つは、図１に示されるアミノ
酸配列または寄託されたクローンによりコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列と、図２に示されるその配列
などの他の蛋白質の公知アミノ酸配列の間の相同性によ
り、とりわけ、新規なＩＣＥ ＬＡＰ−６と同定される
ポリペプチドを提供することである。

【００１０】本発明の別の目的は、ＩＣＥ ＬＡＰ−６
をコードするポリヌクレオチド、特に、本明細書にてＩ
ＣＥ ＬＡＰ−６と称されるポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドおよびその寄託されたクローンのポリ
ヌクレオチドを提供することである。

【００１１】本発明のこの態様の特に好ましい具体例に
おいて、該ポリヌクレオチドは図３に示されるヒトＩＣ
Ｅ ＬＡＰ−６をコードする領域を有してなる。本発明
のこの態様によれば、図３のまたは実施例１に示される
プライマーを用いて誘導されるヒトｃＤＮＡにより発現
される成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸分
子、あるいは図１のまたは寄託クローンによりコードさ
れるポリペプチドより誘導されるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドが提供される。

【００１２】本発明のこの態様により、ｍＲＮＡ、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡを含むヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６をコ
ードする単離された核酸分子、およびさらに本発明のこ
の態様の別の具体例においては、生物学的、診断的、臨
床的または治療上有用なその変異体、類似体または誘導
体、または変異体、類似体および誘導体のフラグメント
を含むそのフラグメントが提供される。そのうち、本発
明のこの態様の特に好ましい具体例は、ヒトＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６の天然に存在する対立遺伝子変異体である。

【００１３】治療目的、例えば、ウイルス感染症を治療
するため、抗腫瘍剤として、また胚形成および組織恒常
性を調節するために用いられる、ＩＣＥ ＬＡＰ−６ポ
リペプチド、特にヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチド
を提供することも本発明の目的の一つである。本発明の
この態様によれば、本明細書においてＩＣＥ ＬＡＰ−
６と称されるヒト起源の新規なポリペプチド、ならびに
生物学的、診断的、または治療上有用なそのフラグメン
ト、変異体および誘導体、そのフラグメントの変異体お
よび誘導体、および前記の類似体が提供される。

【００１４】そのうち、本発明のこの態様の特に好まし
い具体例は、ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６遺伝子の天然に存
在する対立遺伝子によりコードされるヒトＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６の変異体である。本発明の別の目的は、前記ポリ
ペプチド、ポリペプチドフラグメント、変異体および誘
導体、変異体および誘導体のフラグメントおよび前記の
類似体を産生法を提供することである。

【００１５】本発明のこの態様の好ましい具体例におい
て、前記ＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドの製造法であ
って、宿主にてヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６を発現する条件
下、外因性由来のヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６をコードする
ポリヌクレオチドをその中に組み入れた宿主細胞を培養
し、ついで発現されたポリペプチドを回収することから
なる方法が提供される。ＩＣＥ ＬＡＰ−６はまた天然
供給源から多くの周知の技術のうちのいずれかを用いて
精製できる。

【００１６】本発明の別の目的により、研究、生物学
的、臨床的、診断的および治療的目的のための前記ポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドを利用した生成物、組
成物、プロセスおよび方法が提供される。

【００１７】本発明のこの態様の好ましい具体例によ
り、とりわけ、ＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドまたは
ＩＣＥ ＬＡＰ−６をコードするｍＲＮＡを測定するこ
とによる細胞におけるＩＣＥ ＬＡＰ−６発現の評価；i
n vitro、ex vivoまたはin vivoで細胞を前記ＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにさらす
ことによる、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤として、また胚形
成および組織恒常性の制御；ＩＣＥ ＬＡＰ−６遺伝子
における欠失などの遺伝子変異および異常のアッセイ；
およびＩＣＥ ＬＡＰ−６機能の促進またはＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６機能障害の改善のためのＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドの生物への投与のため
の生成物、組成物および方法が提供される。例えば、癌
細胞および固体腫瘍細胞増殖を含む不完全な細胞増殖を
標的とするアゴニストをこれらの疾患の治療に用いるこ
とができる。このような目標設定は、抗体融合を用いる
遺伝子治療により達成される。アゴニストはまた、小胞
リンパ腫、Ｐ５３突然変異に関連する癌、自己免疫障
害、例えば、ＳＬＥ、免疫性糸球体腎炎など；ホルモン
依存性腫瘍、例えば胸部癌、前立腺癌および卵巣癌な
ど；および例えばヘルペスウイルス、ポックスウイルス
およびアデノウイルスなどのウイルス性感染症の治療に
用いられる。

【００１８】本発明のこの態様および他の態様の好まし
い具体例によれば、ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６配列とハイ
ブリッド形成するプローブが提供される。本発明のこの
態様の好ましい別の具体例において、ＩＣＥ ＬＡＰ−
６ポリペプチドに対する抗体が提供される。この点に関
するある種の特に好ましい具体例において、抗体はヒト
ＩＣＥ ＬＡＰ−６に対して高度に選択的である。

【００１９】本発明の他の態様によれば、ＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６アゴニストが提供される。そのうち、特に好まし
いアゴニストは、ＩＣＥ ＬＡＰ−６を模倣する分子、
ＩＣＥ ＬＡＰ−６結合分子またはレセプター分子と結
合する分子、およびＩＣＥ ＬＡＰ−６−誘発性応答を
惹起または促進する分子である。また特に好ましいアゴ
ニストは、ＩＣＥ ＬＡＰ−６またはＩＣＥ ＬＡＰ−６
ポリペプチドと、あるいはＩＣＥ ＬＡＰ−６活性およ
び／または遺伝子発現の他の調節剤と相互作用し、これ
により、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の一の効果またはＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６の一以上の効果を増強または促進する分子であ
る。

【００２０】本発明のさらに別の態様によれば、ＩＣＥ
ＬＡＰ−６アンタゴニストが提供される。そのうち、
特に好ましいアンタゴニストは、ＩＣＥ ＬＡＰ−６を
模倣してＩＣＥ ＬＡＰ−６レセプターまたは結合分子
と結合するが、一のＩＣＥ ＬＡＰ−６誘発性応答また
はそれ以上のＩＣＥ ＬＡＰ−６の効果を惹起しないも
のである。また、特に好ましいアンタゴニストは、ＩＣ
Ｅ ＬＡＰ−６と結合または相互作用して一のＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６の効果またはそれ以上のＩＣＥ ＬＡＰ−６の
効果を阻害するか、またはＩＣＥ ＬＡＰ−６の発現を
防止する分子である。

【００２１】本発明のさらに別の態様において、in vit
roでの細胞、ex vivoでの細胞およびin vivoでの細胞、
または多細胞生物に対する投与用のＩＣＥ ＬＡＰ−６
ポリヌクレオチドまたはＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチ
ドを含んでなる組成物が提供される。本発明のこの態様
の特に好ましい具体例において、組成物は、疾患の治療
のための宿主生物におけるＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプ
チドの発現についてのＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリヌクレオ
チドを含有してなる。この点に関して特に好ましいの
は、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の異所内因性活性に関連した機
能障害を治療するヒト患者における発現である。

【００２２】本発明の他の目的、特性、利点および態様
は、以下の記載から当業者に明らかになるであろう。し
かし、以下の記載および実施例は本発明の好ましい具体
例を示し、単なる例示として提示したものである。開示
された発明の精神および範囲内での種々の変更および修
飾は、以下の記載および本開示の他の部分の記載から当
業者に明らかになるであろう。

【００２３】定義 以下の例示的説明は、本明細書、特に実施例において頻
繁に用いられる用語の理解を助けるために提供されるも
のである。その説明は便宜上挙げるものであって、本発
明を制限するものではない。ＤＮＡの消化は、ＤＮＡの
ある種の配列でのみ作用する制限酵素によるＤＮＡの触
媒的開裂を意味する。本明細書において言及する種々の
制限酵素は商業上入手可能であり、その反応条件、コフ
ァクターおよび使用のための他の要件は、当業者には公
知かつ慣例的である。

【００２４】分析を目的とする場合、典型的には、１μ
ｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２０μｌ
の反応緩衝液中、約２単位の酵素で消化する。プラスミ
ド構築のためにＤＮＡフラグメントを単離する目的で
は、典型的には５ないし５０μｇのＤＮＡを２０ないし
２５０単位の酵素で比例したより大きな容量中で消化す
る。特定の制限酵素についての適当な緩衝液および基質
量は、以下に示されるような、標準的実験室マニュアル
に記載され、それは商業上の供給者により特定されてい
る。

【００２５】３７℃で約１時間のインキュベーション時
間が通常用いられるが、条件は標準的手順、供給者の指
示および特定の反応にしたがって変動する。消化後、反
応を分析し、フラグメントをアガロースまたはポリアク
リルアミドゲルを介し、当業者に慣用的な周知方法を用
いて精製する。遺伝子エレメントは、一般に、ポリペプ
チドをコードする領域または宿主細胞における転写また
は翻訳またはポリペプチドの発現について重要な他のプ
ロセスを調節する領域を有してなるポリヌクレオチド、
またはポリペプチドをコードする領域および発現を調節
するそれに操作可能に結合した領域の両方の領域を有し
てなるポリヌクレオチドを意味する。

【００２６】遺伝子エレメントはエピソームエレメント
として；すなわち、宿主細胞ゲノムに物理的に依存しな
い分子として複製するベクター中に含まれてもよい。こ
れらは、ミニ染色体、例えば真核細胞におけるメトトレ
キサート選択によるトランスフェクションされたＤＮＡ
の増幅中に発生するものなどに含まれていてもよい。遺
伝子エレメントはまた、その天然の状態ではないが、む
しろ単離、クローニングおよび精製されたＤＮＡの形態
にて宿主細胞中またはベクターへの導入などの操作後に
宿主細胞ゲノム中に含まれていてもよい。

【００２７】同一性または類似性は、当業界で公知のよ
うに、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保
存されたアミノ酸置換の第二のポリペプチドの配列との
比較により測定される２つのポリペプチド間の関係であ
る。さらに、これも当業界で公知のように、「同一性」
はこのような配列の２列の間の適合性の同一性により決
定される２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオ
チド配列の間の配列相関性の程度を意味する。同一性お
よび類似性は両方とも容易に計算できる［Ｃomputation
al Ｍolecular Ｂioloby、Ｌesk，Ａ.Ｍ.編、Ｏxford
Ｕniversity Ｐress，Ｎew Ｙork，１９８８；Ｂiocomp
uting：Ｉnformatics and Ｇenome Ｐrojects、Ｓmith,
Ｄ.Ｗ.編、Ａcademic Ｐress，Ｎew Ｙork，１９９３；
ＣomputerＡnalysis of Ｓequence Ｄata、Ｐart Ｉ、
Ｇriffin，Ａ.Ｍ.およびＧriffin，Ｈ.Ｇ.編、Ｈumana
Ｐress，Ｎew Ｊersey，１９９４；Ｓequence Ａnalysi
sin Ｍolecular Ｂiology、von Ｈeinje,Ｇ.、Ａcademi
c Ｐress、１９８７；およびＳequence Ａnalysis Ｐri
mer、Ｇribskov，Ｍ.およびＤevereux，Ｊ編、ＭＳtock
ton Ｐress，Ｎew Ｙork，１９９１］。２つのポリヌク
レオチドまたはポリペプチド配列の間の同一性および類
似性を測定する種々の方法が存在するが、「同一性」お
よび「類似性」なる用語は、当業者には周知である［Ｓ
equenceＡnalysis in Ｍolecular Ｂiology、von Ｈein
je，Ｇ.、Ａcademic Ｐress、１９８７；Ｓequence Ａn
alysis Ｐrimer、Ｇribskov，Ｍ.およびＤevereux，Ｊ.
Ｍ編、Ｍ Ｓtockton Ｐress，Ｎew Ｙork，１９９１；
およびＣarillo，Ｈ.およびＬipman，Ｄ.、ＳＩＡＭ
Ｊ.Ａpplied.Ｍath.、４８：１０７３（１９８８）］。
２配列間の同一性または類似性を確認するために通常用
いられる方法は、Ｃarillo，Ｈ.およびＬipman，Ｄ.、
ＳＩＡＭ Ｊ.Ａpplied.Ｍath.、４８：１０７３（１９
８８）に開示されているものを包含するが、これに限定
されない。同一性を確認する好ましい方法は、試験する
２配列間で最大の一致が得られるようにデザインされ
る。同一性および類似性の測定する方法は、コンピュー
タープログラムにおいて集成される。２つの配列間の同
一性および類似性を測定する好ましいコンピュータープ
ログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ［Ｄevereu
x，Ｊ.ら、Ｎucleic Ａcids、Ｒesearch １２（１)：
３８７（１９８４）］、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮお
よびＦＡＳＴＡ［Ａtschul，Ｓ.Ｆ.ら、Ｊ.Ｍolec.Ｂio
l. ２１５：４０３（１９９０）］を包含するが、これ
に限定されない。

【００２８】「単離」は、「人工的に」その自然状態か
ら変更されること、すなわち、天然に存在する場合に、
そのもとの環境から変化するかまたは取り出されるか、
またはその両方を意味する。例えば、生体において天然
に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単
離」されていないが、その自然状態の共存物質から分離
された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは本発
明において用いる用語の意味で「単離」されている。例
えば、ポリヌクレオチドの場合、「単離」なる語は、そ
れが天然に存在する染色体および細胞から分離されるこ
とを意味する。

【００２９】単離の一部としてまたは単離後、このよう
なポリヌクレオチドを他のポリヌクレオチド、例えばＤ
ＮＡと、突然変異のために結合させて、融合蛋白質を形
成するか、または例えば宿主における増殖または発現の
ために結合させることができる。単離されたポリヌクレ
オチドは単独またはベクターなどの他のポリヌクレオチ
ドと一緒になって、培養物中または全生物中、宿主細胞
中に導入することができる。培地中または全生物中宿主
細胞中に導入して、これらは天然に存在する形態または
環境にないのでこのようなＤＮＡはこの用語を本明細書
で用いる意味で単離される。同様に、ポリヌクレオチド
およびポリペプチドは培地処方、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの例えば細胞中への導入用溶液、化学ま
たは酵素反応用組成物または溶液、例えば天然に存在し
ない組成物中に存在し、ここに、ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは本明細書で用いる範囲内で単離され
る。

【００３０】「ライゲーション」は２またはそれ以上の
ポリヌクレオチド（ほとんどの場合、二本鎖ＤＮＡであ
る）の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを
意味する。ライゲーションに関する技術は当業界で周知
であり、ライゲーションのプロトコルは、標準的実験室
マニュアルおよび文献、例えば、Ｓambrookら、MOLECUL
AR CLONIN，A LABORATORY MANUAL、第２版、Ｃold Ｓpr
ing Ｈarbor Ｌabooratory Ｐress，Ｃold Ｓpring Ｈa
rbor，Ｎew Ｙork（１９８９）（「Ｓambrook」）およ
びマニアティス（Ｍaniatis）ら、１４６頁、下記］に
記載されている。

【００３１】「オリゴヌクレオチド」は比較的短いポリ
ヌクレオチドを意味する。しばしばこの用語は一本鎖デ
オキシリボヌクレオチドを意味するが、とりわけ、一本
鎖または２本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイ
ブリッドおよび二本鎖ＤＮＡにも言及し得る。一本鎖Ｄ
ＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオ
チドは、例えば自動化オリゴヌクレオチド合成器に付す
などの化学的方法により合成されることがしばしばであ
る。しかし、オリゴヌクレオチドは、in vitro組換えＤ
ＮＡ媒介技術を含む種々の他の方法や細胞および生物に
おけるＤＮＡの発現によっても合成できる。

【００３２】まず、化学的に合成されるＤＮＡは典型的
には５'ホスフェートなしで得られる。このようなオリ
ゴヌクレオチドの５'末端は、組換え体ＤＮＡ分子を形
成するのに典型的に用いられるＤＮＡリガーゼを用いる
ライゲーション反応によるホスホジエステル結合を形成
するための基質でない。このようなオリゴヌクレオチド
のライゲーションが望ましい場合には、キナーゼおよび
ＡＴＰを用いる方法などの標準的技法によりホスフェー
トを付加できる。

【００３３】化学的に合成されるオリゴヌクレオチドの
３'末端は、一般に遊離ヒドロキシル基を有し、Ｔ４ Ｄ
ＮＡリガーゼなどのリガーゼの存在下で容易に他のポリ
ヌクレオチド、例えば他のオリゴヌクレオチドの５'ホ
スフェートとホスホジエステルと結合を形成する。周知
のように、この反応は望ましい場合には、他のポリヌク
レオチドの５'ホスフェートをライゲーションする前に
除去することにより選択的に防止できる。

【００３４】プラスミドは、一般に、本明細書において
は前の小文字のｐおよび／またはその後に続く大文字お
よび／または数字で表され、当業界で周知の標準的命名
例に従う。本発明に開示する出発プラスミドは、商業上
入手可能であり、制限なく公に入手可能であるか、また
は入手可能なプラスミドから公開された方法にしたがっ
て構築できる。本発明にしたがって使用できる多くのプ
ラスミドおよび他のクローニングおよび発現ベクターは
当業者には周知であり、容易に入手可能である。さら
に、当業者は本発明における使用に適した他の多くのプ
ラスミドも容易に構築できる。本発明におけるこのよう
なプラスミドおよび他のベクターの性質、構造および使
用は、本発明の開示から当業者には容易に明らかとなる
であろう。

【００３５】ポリヌクレオチドは一般に未修飾ＲＮＡま
たはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであるポリリ
ボヌクレオチドまたはポリデオキリボヌクレオチドを意
味する。したがって、例えば本明細書において用いるポ
リヌクレオチドは、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮ
Ａ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一
本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域のの
混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本
鎖であるかまたは一本鎖および二本鎖領域の混合物であ
るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を意味す
る。

【００３６】加えて、本明細書において用いるポリヌク
レオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤ
ＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。このような領
域における鎖は同じ分子または異なる分子に由来しても
よい。領域は全部または１またはそれ以上の分子を含む
が、より典型的には数個の分子の領域のみを包含する。
三重らせん領域の分子の一つはオリゴヌクレオチドであ
ることが多い。

【００３７】本明細書において用いる場合、ポリヌクレ
オチドなる語は、１またはそれ以上の修飾された塩基を
有する前記のようなＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。こ
のように、安定性のためにまたは他の理由のために修飾
された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明にい
うところの「ポリヌクレオチド」である。さらに、２例
だけを挙げると、イノシンなどの希少な塩基、またはト
リチル化塩基などの修飾塩基を有してなるＤＮＡまたは
ＲＮＡも、本明細書にいうポリヌクレオチドである。

【００３８】当業者に公知の多くの有用な目的に供する
非常に多くの修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対してなされ
てきたことは明らかであろう。本明細書において用いる
際のポリヌクレオチドなる語は、このような化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態のポリヌクレオチ
ド、ならびにウイルスおよび例えば単純および複合体細
胞を含む細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形
態を包含する。

【００３９】本明細書において用いるポリペプチドは以
下に記載するようなすべてのポリペプチドを包含する。
ポリペプチドの基本的構造は周知であり、当業界の種々
のテキストおよび他の公開物において記載されている。
この意味で、本明細書において用いるこの用語は、直鎖
中ペプチド結合により互いに結合した２またはそれ以上
のアミノ酸を含むいかなるペプチドまたは蛋白質をも意
味する。本明細書において用いる場合、この用語は、当
該分野において、通常、例えばペプチド、オリゴペプチ
ドおよびオリゴマーと称される短鎖、および一般に当該
分野において蛋白質と称される長鎖の両方を意味し、こ
れには多種の型がある。

【００４０】ポリペプチドは、通常、２０種の天然に存
在するアミノ酸と称される２０種のアミノ酸以外のアミ
ノ酸を含有することがしばしばであり、多くのアミノ酸
は、末端アミノ酸を含めて、所定のポリペプチドにおい
て、自然のプロセス、例えばプロセッシングおよび他の
翻訳後の修飾だけでなく、当業界で周知の化学的修飾技
術により修飾される。ポリペプチドにおいて天然に存在
する一般的な修飾でさえ多過ぎて、本明細書にて余すと
ころなく列挙することはできないが、基本テキストおよ
びより詳細な専攻論文、ならびに多くの研究文献に記載
されており、それは当業者には周知である。

【００４１】公知修飾のうち、本発明のポリペプチドに
おいて存在するものをいくつかを列挙すると、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共
有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の
形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシ
ル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素
化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白分解的プロ
セッシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セ
レノイル化、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡ媒
介の蛋白質へのアミノ酸付加およびユビキチン化であ
る。

【００４２】このような修飾は当業者には周知であり、
科学文献中に詳細に記載されている。一般的な修飾のい
くつか、例えば、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グ
ルタミン酸のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化
およびＡＤＰ−リボシル化は、大抵の基本テキスト、例
えばPROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES第
２版、Ｔ.Ｅ.Ｃreighton，Ｗ.Ｈ.Ｆreemanおよび共同研
究者、Ｎew Ｙork（１９９３）に記載されている。この
問題に関して、例えば、Ｗold，Ｆ.、Ｐosttranslation
al Ｐrotein Ｍodifications：Ｐerspective and Ｐros
pects、ｐ１−１２ POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODI
FICATION OF PROTEINS、Ｂ.Ｃ.Ｊohnson編、Ａcademic
Ｐress，Ｎew Ｙork（１９８３）：Ｓeifterら、Ａnaly
sis forprotein and nonprotein cofactors，Ｍeth.Ｅn
zymol.、１８２：６２６−６４６（１９９０）およびＲ
attanら、Ｐroteins Ｓynthesis：Ｐosttranslational
Ｍodifications and Ａging，Ａnn.Ｎ.Ｙ.Ａcad.Ｓci.
６６３：４８−６２（１９９２）などによる多くの詳細
な論評が入手可能である。

【００４３】周知のように、また前記のように、ポリペ
プチドは必ずしも全体的に直鎖でなくてもよい。例え
ば、ポリペプチドはユビキチン化の結果分枝していても
よく、また一般に自然のプロセッシングおよび人工的操
作によりもたらされる自然に起こらない事象を含む翻訳
後事象の結果として側鎖を有しても、有していなくても
よい環状でもよい。環状、分枝および分枝環状ポリペプ
チドは、非翻訳の自然のプロセスおよび完全に合成的手
法によっても合成しうる。

【００４４】修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およ
びアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド中
のいかなるところでも起こりうる。実際、ポリペプチド
におけるアミノまたはカルボキシル基、または両方の共
有結合修飾による阻害は、天然に存在するポリペプチド
および合成ポリペプチドに共通であり、このような修飾
は本発明のポリペプチドにおいても存在しうる。例え
ば、蛋白分解プロセッシングの前に、イー・コリにおい
て形成されるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとん
ど一定不変的にＮ−ホルミルメチオニンである。

【００４５】ポリペプチド中に存在する修飾は、それが
どのように形成されたかによることがしばしばである。
クローン化された遺伝子の宿主中での発現により形成さ
れたポリペプチドに関して、例えば多くの部分での修飾
の性質および程度は、宿主細胞の翻訳後の修飾能力およ
びポリペプチドアミノ酸配列において存在する修飾シグ
ナルにより測定される。例えば、周知のように、グリコ
シル化はしばしばイー・コリなどの細菌宿主においては
存在しない。したがって、グリコシル化が望ましい場合
には、ポリペプチドはグリコシル化宿主、一般的には真
核細胞において発現しなければならない。昆虫細胞は哺
乳動物細胞と同じく翻訳後グリコシル化を行うことが多
いので、この理由から特にグリコシル化の本来のパター
ンを有する哺乳動物蛋白質を効率良く発現するために、
昆虫細胞発現系が開発されてきた。同様の考察が他の修
飾にも適用される。

【００４６】同じ型の修飾が所定のポリペプチドの数個
所で同じまたは異なる程度で存在してもよいのは明らか
である。また、所定のポリペプチドは多くのタイプの修
飾を含みうる。一般に、本明細書において用いる場合、
ポリヌクレオチドなる用語はこのような修飾すべてを包
含し、特に宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現に
より合成されたポリペプチドにおいて存在するものを包
含する。

【００４７】本明細書で用いるポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの変異体なる用語は、各々、対照標準のポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドである。この意味での変異体
を以下に記載し、本開示のあらゆるところでより詳細に
記載する。 （１）別の対照標準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配
列が異なっているポリヌクレオチド。一般に、違いは、
対照標準のヌクレオチド配列と変異体のヌクレオチド配
列が全体として緊密に類似し、多くの領域で同一になる
ように制限される。

【００４８】以下に記載するように、変異体のヌクレオ
チド配列における変化は静的である。すなわち、これは
ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸を変更し
ない。変更がこの型の静的変化に限られる場合、変異体
は対照標準と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードする。また以下に記載するように、変異体のヌク
レオチド配列における変化は対照標準のポリヌクレオチ
ドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変
更してもよい。このようなヌクレオチドの変化は、以下
に記載するような、対照標準の配列によりコードされる
ポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合
および切断をもたらす。

【００４９】（２）別の対照標準ポリペプチドとアミノ
酸配列が異なるポリペプチド。一般に、違いは、対照標
準ポリペプチドと変異体の配列が全体として緊密に類似
しており、多くの領域で同一であるように制限される。
変異体および対照標準ポリペプチドは、１またはそれ以
上の置換、付加、欠失、融合および切断によりアミノ酸
配列が異なっていて、これはいかなる組み合わせでも存
在しうる。

【００５０】レセプター分子は、本明細書で用いる場
合、本発明のＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドと特異的
に結合または相互作用する分子を意味し、伝統的なレセ
プターが好ましいが、これだけでなく、本発明のポリペ
プチドと特異的に結合または相互作用する他の分子（そ
れぞれ、「結合分子」および「相互作用分子」、および
「ＩＣＥ ＬＡＰ−６結合分子」および「ＩＣＥ ＬＡＰ
−６相互作用分子」ともいう）も包含する。本発明のポ
リペプチドとレセプターまたは結合または相互作用分子
を含むこのような分子間の結合は、本発明のポリペプチ
ドに限定され、これが非常に好ましく、あるいは本発明
のポリペプチドに関して高度に特異的であり、これは非
常に好ましく、あるいは本発明のポリペプチドを含む蛋
白質のグループに対して高度に特異的であり、これは好
ましく、あるいは少なくともその内の１つが本発明のポ
リペプチドを含むいくつかの蛋白質のグループに対して
特異的である。レセプターはまた天然に存在しない、例
えば抗体および本発明のポリペプチドと特異的に結合す
る抗体由来の化学物質でありうる。

【００５１】

【発明の実施の形態】本発明は以下においてより詳細に
記載する新規ＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドおよびポ
リヌクレオチドに関する。特に、本発明は、ヒトインタ
ーロイキン−１ベータ転換酵素アポトーシスプロテアー
ゼポリペプチドに対するアミノ酸配列相同性により関連
付けられる、新規ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチド
およびポリヌクレオチドに関する。本発明は、各々、図
３および１に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列
を有するＩＣＥ ＬＡＰ−６に関する。図３および１に
示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、各々、ヒ
トＫ５６２（赤白血病）細胞系統ｃＤＮＡライブラリー
から得られるｃＤＮＡの配列決定により得られることは
明らかである。

【００５２】ポリヌクレオチド 本発明の一態様によれば、図１の推定アミノ酸配列を有
するＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドおよび寄託クロー
ンによりコードされるポリペプチドをコードする単離ポ
リヌクレオチドが提供される。本発明の別の態様によれ
ば、図１の推定アミノ酸配列を有するＩＣＥ ＬＡＰ−
６ポリペプチドおよび寄託クローンによりコードされる
ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供
される。

【００５３】実施例１に示されるポリヌクレオチドプラ
イマー配列などの、本明細書に提示した情報を用いる
と、ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドをコードする
本発明のポリヌクレオチドは、標準的クローニングおよ
びスクリーニング操作、例えば出発物質としてヒト好中
球および腎組織由来の細胞からのｍＲＮＡを用いてｃＤ
ＮＡをクローニングする方法を用いて得られる。本発明
の一例として、実施例１に記載されるような本発明のポ
リヌクレオチド配列が見いだされた。ＩＣＥ ＬＡＰ−
６はまた、他の組織およびｃＤＮＡライブラリー、例え
ば、活性化ヒト好中球、赤白血病および腎細胞などのヒ
ト細胞、組織および細胞系の細胞に由来するライブラリ
ーより得ることもできる。

【００５４】本発明のヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６は、図１
のヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６をコードするｃＤＮＡを配列
決定した結果からわかるように、ヒトインターロイキン
−１ベータ転換酵素アポトーシスプロテアーゼ科の他の
蛋白質と構造的に関連する。図３のｃＤＮＡは実施例１
に記載するようにして得られた。図１のポリペプチドお
よび寄託クローンによりコードされるポリペプチドは、
各々、約４５.８ｋＤａの推定分子量を有する蛋白質で
ある。

【００５５】本発明のポリヌクレオチドはｍＲＮＡなど
のＲＮＡの形態であるか、例えばクローニングにより得
られるかまたは化学的合成技術またはその組み合わせに
より産生されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮ
Ａの形態であってもよい。ＤＮＡは二本鎖であっても一
本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡはまたセンスストラ
ンドとして知られているコーディングストランドである
か、またはアンチセンスストランドとして知られている
非コーディングストランドであってもよい。ポリペプチ
ドをコードするコーディング配列は、実施例１に示され
るプライマーセットを用いて誘導されるポリヌクレオチ
ドまたは図３のポリヌクレオチドのコーディング配列と
同一であってもよい。それは、遺伝コードの重複（縮
重）の結果として、図１のｃＤＮＡのポリペプチドまた
は寄託クローンによりコードされるポリペプチドをコー
ドする異なる配列を有するポリヌクレオチドである。

【００５６】図１のポリペプチドまたは寄託クローンに
よりコードされるポリペプチドをコードする本発明のポ
リヌクレオチドは、成熟ポリペプチドに対するコーディ
ング配列、それ自身だけでなく、成熟ポリペプチドに対
するコーディング配列とさらに別のコーディング配列、
例えばリーダーまたはセクレトリー配列、例えばプレま
たはプロまたはプレプロ蛋白配列などをコードするコー
ディング配列；前記の付加コーディング配列を有するか
または有しない成熟ポリペプチドのコーディング配列
と、別の非コーディング配列（例えば、イントロンおよ
び非コーディング５'および３'配列、例えば、転写、例
えばスプライシング、ポリアデニル化シグナルを含むｍ
ＲＮＡプロセッシング、リボソーム結合およびｍＲＮＡ
の安定性において役割を有する転写された非翻訳配列を
包含するが、これに限定されない）；例えば付加的機能
をもたらすものなどの付加アミノ酸をコードする別のコ
ーディング配列を包含するが、これに限定されない。こ
のように、例えばポリペプチドをマーカー配列、例えば
ペプチドと融合させて、融合ポリペプチドの精製を促進
する。本発明のこの態様の好ましい具体例において、マ
ーカー配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱ
Ｅベクター（Ｑiagen,Ｉnc.）中に提供された標識であ
り、その多くは商業的に入手可能である。Ｇentzら、Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.，Ｕ.Ｓ.Ａ.、８６：８２１−８
２４（１９８９）に記載さているように、例えば、ヘキ
サヒスチジンにより融合蛋白質の簡便な精製法が得られ
る。ＨＡ標識はインフルエンザ血球凝集素蛋白質由来の
エピトープに対応し、これは例えばＷilsonら、Ｃell
３７：７６７（１９８４）に記載されている。

【００５７】また、自己触媒反応を介してまたは他の酵
素により、その先駆体分子よりプロセッシングした成熟
ＩＣＥ ＬＡＰ−６を得、２つのサブユニットを産生
し、それは活性ヘテロ二量体（両サブユニット）または
四量体（かかるヘテロ二量体の２組）を形成する。前記
載事項にしたがって、本明細書において用いる「ポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、本
発明のポリペプチド、特に図１の示されるアミノ酸配列
または寄託クローンによりコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列を有するヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６をコード
する配列を含むポリヌクレオチドを包含する。この用語
は、ポリペプチドをコードする１つの連続領域または非
続領域（例えば、イントロンにより中断される）と、さ
らにコーディングおよび／または非コーディング配列を
含む付加領域を含有するポリヌクレオチドを包含する。

【００５８】本発明はさらに、図１の推定アミノ酸配列
または寄託クローンによりコードされるポリペプチドの
アミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント、類
似体および誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの
変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、天然に
存在する変異型、例えば、天然に存在する対立遺伝子変
異体、または天然に存在することが知られていない変異
体であってもよい。このようなポリヌクレオチドの天然
に存在しない変異体は、ポリヌクレオチド、細胞または
生物に適用されるものを含む変異誘発技術により形成さ
れる。

【００５９】この点に関して、変異体の中でもヌクレオ
チド置換、欠失または付加により前記ポリヌクレオチド
と異なるものが好ましい。置換、欠失または付加は１ま
たはそれ以上のヌクレオチドに関与する。変異体はコー
ディング領域または非コーディング領域またはその両方
で変更されている。コーディング領域における変更は同
類または非同類アミノ酸置換、欠失または付加をもたら
す。この点に関して本発明の特に好ましい具体例は、図
１に示されるＩＣＥ ＬＡＰ−６のアミノ酸配列または
寄託クローンによりコードされるポリペプチドのアミノ
酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チド；その変異体、類似体、誘導体およびフラグメン
ト、ならびに変異体、類似体および誘導体のフラグメン
トである。

【００６０】この点に関してさらに特に好ましいのは、
図１のＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドまたは寄託クロ
ーンによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を
有するＩＣＥ ＬＡＰ−６変異体、類似体、誘導体およ
びフラグメント、およびフラグメントの変異体、類似体
および誘導体をコードするポリヌクレオチドであり、そ
の場合、数個、５ないし１０、１ないし５、１ないし
３、２、１または０個のアミノ酸残基がいずれかの組み
合わせで置換、欠失または付加されている。特に、これ
らのうち特に好ましいのは、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の性質
および活性を変更しない置換、付加および欠失である。
この点において特に好ましいのは、同類置換である。最
も好ましいのは、置換を含まない図１のアミノ酸配列ま
たは寄託クローンによりコードされるポリペプチドのア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドである。

【００６１】本発明のさらに好ましい具体例は、図１に
示されるアミノ酸配列または寄託クローンによりコード
されるポリペプチドのアミノ酸配列を有するＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと
少なくとも７０％同一であるポリヌクレオチド、および
このようなポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチ
ドである。また、最も好ましいのは、ヒトｃＤＮＡのＩ
ＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドと少なくとも８０％同一である領域を含むポリヌ
クレオチドおよびこれに相補的であるポリヌクレオチド
である。この点に関して、少なくとも９０％同一である
ポリヌクレオチドが特に好ましく、これらの好ましいポ
リヌクレオチドのうち、少なくとも９５％同一であるも
のが特に好ましい。さらには、少なくとも９５％同一で
あるもののうち少なくとも９７％同一であるものがより
好ましく、少なくとも９８％同一であるこれらのポリヌ
クレオチドのうち、少なくとも９９％同一であるものが
特に好ましく、少なくとも９９％同一であるものがさら
に好ましい。

【００６２】この点に関して特に好ましい具体例は、図
３のｃＤＮＡによりコードされるか、寄託クローンのポ
リヌクレオチド配列によりコードされるか、または実施
例１に記載のプライマーを用いて誘導される成熟ポリペ
プチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持す
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明はさらに、前記配列とハイブリッド形成するポリ
ヌクレオチドに関する。この点に関して、本発明は特に
厳しい条件下で前記ポリヌクレオチドとハイブリッド形
成するポリヌクレオチドに関する。本明細書で用いる場
合、「厳しい条件」なる用語は、配列間に少なくとも９
５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する
場合にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味
する。

【００６３】本明細書において本発明のポリヌクレオチ
ド試験に関してさらに議論するように、例えば本発明の
ポリヌクレオチドは前記のように、ＩＣＥ ＬＡＰ−６
をコードする完全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単
離し、ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６遺伝子と配列高類似性を
有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単
離するためにｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのハイブリダ
イゼーションプローブとして用いられる。このようなプ
ローブは、一般に、少なくとも１５塩基を有してなるで
あろう。好ましくは、このようなプローブは少なくとも
３０塩基を有し、少なくとも５０塩基を有してもよい。
特に好ましいプローブは少なくとも３０塩基を有し、５
０またはそれ以下の塩基を有する。

【００６４】例えば、ＩＣＥ ＬＡＰ−６遺伝子のコー
ディング領域は、オリゴヌクレオチドプローブを合成す
るために、公知のＤＮＡ配列を用いてスクリーニングす
ることにより単離される。ついで、本発明の遺伝子配列
と相補的な配列を有する標識したオリゴヌクレオチドを
用い、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのラ
イブラリーをスクリーンし、ライブラリーのどの構成因
子がプローブとハイブリッド形成するかを決定する。本
発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、特に本
明細書においてポリヌクレオチドアッセイに関してさら
に議論するように、ヒト疾患に対する治療法および診断
法の発見のための研究試薬および物質として用いられ
る。

【００６５】ポリヌクレオチドは成熟蛋白質＋付加アミ
ノまたはカルボキシル末端アミノ酸、または成熟ポリペ
プチドの内部のアミノ酸（成熟形態が例えば１以上のポ
リペプチド鎖を有する場合）であるポリペプチドをコー
ドする。このような配列は、蛋白質の前駆体から成熟形
態へのプロセッシングに関与し、蛋白質の交換を促進
し、蛋白質の半減期を延長または短縮し、あるいは置換
または産生のための蛋白質の操作を容易にする。一般
に、in situのケースとして、付加アミノ酸を細胞酵素
により成熟蛋白質から除去する。

【００６６】１またはそれ以上のプロ配列と融合した成
熟形態のポリペプチドを有する前駆体蛋白質は、不活性
形態のポリペプチドであってもよい。プロ配列を除去し
た場合、このような不活性な前駆体は一般に活性化され
る。プロ配列の一部または全部は活性化の前に除去され
る。一般に、かかる前駆体をプロ蛋白質と称する。

【００６７】要するに、本発明のポリヌクレオチドは、
成熟蛋白質、成熟蛋白質＋リーダー配列（プレ蛋白質と
も称する）、プレ蛋白質のリーダー配列でない１または
それ以上のプロ配列を有する成熟蛋白質の前駆体、また
はプロ蛋白質の前駆体であり、リーダー配列および１ま
たはそれ以上のプロ配列を有し、一般に活性な成熟形態
のポリペプチドを産生するプロセッシング段階中に除去
されるプレプロ蛋白質をコードする。

【００６８】寄託体 ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６ ｃＤＮＡを含有する寄託体は、
前記したＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionに寄託
されている。また前記されているように、ヒトｃＤＮＡ
寄託体は本明細書にて「寄託クローン」または「寄託ク
ローンのｃＤＮＡ」という。寄託クローンは、１９９６
年５月３０日に、米国メリランド州２０８５２、ロック
ビル、パーク・レイン・ドライブ１２３０１番、Ａmeri
can Ｔype ＣultureＣollectionに寄託された。

【００６９】寄託体は完全長ＩＣＥ ＬＡＰ−６ ｃＤＮ
Ａを有するｐＢluscript ＳＫ（−）プラスミド（Ｓtra
tagene，Ｌa Ｊolla，ＣＡ）であり、寄託後は、「１０
９５１５０」と称される。寄託は特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下になされ
ている。菌株は特許付与後に制限なくまたは無条件に公
衆に解放される。寄託は単に当業者の便宜のためになさ
れるのであって、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１２の下に要求さ
れるように、寄託が権限の付与に必要とされることを認
めるものではない。

【００７０】寄託体に含まれるポリヌクレオチドの配列
ならびにそれによってコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、本明細書の配列の記載との不一致の事象を
調整するものである。寄託体を産生し、使用し、または
販売するにはライセンスが必要であり、かかるライセン
スは本明細書の記載により付与されるものではない。

【００７１】ポリペプチド本発明はさらに図１の推定ア
ミノ酸配列および寄託クローンによりコードされるポリ
ペプチドのアミノ酸配列を有するヒトＩＣＥ ＬＡＰ−
６ポリペプチドに関する。本発明はまたこれらのポリペ
プチドのフラグメント、類似体および誘導体にも関す
る。「フラグメント」「誘導体」、および「類似体」な
る用語が、図１のポリペプチドまたは寄託クローンによ
りコードされるポリペプチドにいう場合、これはこのよ
うなポリペプチドと本質的に同じ生物学的機能または活
性を保持するポリペプチドを意味する。したがって、類
似体はプロ蛋白質部分の開裂により活性化されて、活性
な成熟ポリペプチドを産生できるプロ蛋白質を包含す
る。本発明のポリペプチドは、組換え型ポリペプチド、
天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであっても
よい。好ましい一具体例において、組換えポリペプチド
が好ましい。

【００７２】図１のポリペプチドまたは寄託クローンに
よりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体
または類似体は、（ｉ）１またはそれ以上のアミノ酸残
基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存ア
ミノ残基）で置換されているものであり、このような置
換アミノ酸残基が遺伝コードよりコードされるものであ
ってもなくてもよいか、または（ii）１またはそれ以上
のアミノ酸残基が置換基を包含するものであるか、また
は（iii）成熟ポリペプチドが他の化合物、例えばポリ
ペプチドの半減期を増加させるような化合物（例えば、
ポリエチレングリコール）と融合しているものである
か、または（iv）さらに別のアミノ酸が成熟ポリペプチ
ドまたはプロ蛋白質配列の精製に用いられるリーダーま
たはセクレトリー配列などの成熟ポリペプチドと融合し
ているものである。このようなフラグメント、誘導体お
よび類似体は本明細書の記載から当業者の範囲内であ
る。

【００７３】この点に関して本発明の特に好ましい具体
例は、図１に示されるＩＣＥ ＬＡＰ−６のアミノ酸配
列または寄託クローンによりコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異体、類
似体、誘導体およびフラグメント、およびフラグメント
の変異体、類似体および誘導体である。また、この点に
関して本発明の特に好ましい具体例は、ＩＣＥ ＬＡＰ
−６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その変異
体、類似体、誘導体およびフラグメント、ならびにフラ
グメントの変異型、類似体および誘導体である。

【００７４】そのうち、好ましい変異体は、同類アミノ
酸置換により対照標準と異なるものである。このような
置換は、同様の特質を有する別のアミノ酸によりポリペ
プチドにおける特定のアミノ酸を置換するものである。
同類置換として典型的に見られるのは、脂肪族アミノ酸
Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の相互の置
換；ＳｅｒおよびＴｈｒのヒドロキシル残基の交換、Ａ
ｓｐおよびＧｌｕの酸性残基の交換、ＡｓｎおよびＧｌ
ｎアミド残基の間の置換、ＬｙｓおよびＡｒｇの塩基性
残基の交換およびＰｈｅ、Ｔｙｒの芳香族残基間の置換
である。

【００７５】この点に関して図１のＩＣＥ ＬＡＰ−６
ポリペプチドのアミノ酸配列または寄託クローンにより
コードされるアミノ酸配列を有する変異体、類似体、誘
導体およびフラグメント、およびフラグメントの変異
体、類似体および誘導体が特に好ましく、この場合、数
個、５ないし１０、１ないし５、１ないし３、２、１ま
たは０個のアミノ酸が、いずれかの組み合わせて置換、
欠失または付加されている。特に、これらのうち特に好
ましいのは、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の性質および活性を変
更しない置換、付加および欠失である。この点において
特に好ましいのは、同類置換である。最も好ましいの
は、置換を含まない図１のアミノ酸配列または寄託クロ
ーンによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を
有するポリペプチドである。

【００７６】本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドは、好ましくは、単離された形態で提供され、好ま
しくは等質性になるよう精製される。本発明のポリペプ
チドは図１のポリペプチドまたは寄託クローンによりコ
ードされるポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）なら
びに図１のポリペプチドまたは寄託クローンによりコー
ドされるポリペプチドと少なくとも８０％の同一性を有
するポリペプチド；さらに好ましくは、図１のポリペプ
チドマ寄託クローンによりコードされるポリペプチドと
少なくとも９０％の類似性（より好ましくは少なくとも
９０％の同一性）を有するポリペプチド、さらにその上
好ましくは、図１のポリペプチドまたは寄託クローンに
よりコードされるポリペプチドと少なくとも９５％の類
似性（さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）を
有するポリペプチドを包含し、このようなポリペプチド
の部分であって、一般に少なくとも３０アミノ酸、より
好ましくは少なくとも５０アミノ酸を含有するポリペプ
チドの部分も包含する。

【００７７】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は一部をペプチド合成により対応する完全長のポリペプ
チドを産生するのに用いてもよい；したがって、フラグ
メントは、完全長のポリペプチドを産生するための中間
体として用いられる。本発明のポリペプチドのフラグメ
ントまたは一部を用い、本発明の完全長のポリヌクレオ
チドを合成してもよい。

【００７８】フラグメント本発明のこの態様の好ましい
具体例のうち、ＩＣＥ ＬＡＰ−６のフラグメントを含
むポリペプチドが好ましく、最も好ましくは、図１に示
されるアミノ酸配列または寄託クローンによりコードさ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を有するＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６のフラグメント、図１のＩＣＥ ＬＡＰ−６また
は寄託クローンによりコードされるポリペプチドの変異
体および誘導体のフラグメント、例えば図５のアミノ酸
配列である。この点に関して、フラグメントは、前記し
たＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドおよびその変異体ま
たは誘導体のアミノ酸配列の全部ではないが一部と完全
に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。

【００７９】このようなフラグメントは「フリースタン
ディング」、すなわち他のアミノ酸またはポリペプチド
の一部でないかまたはこれと融合しないか、あるいは一
部または一領域を形成するより大きなポリペプチド内に
含まれる。より大きなポリペプチド中に含まれる場合、
本発明のフラグメントは最も好ましくは単一の連続領域
を形成する。しかし、数個のフラグメントが単一の大き
なポリペプチドに含まれていてもよい。例えば、ある好
ましい具体例は、宿主での発現についてデザインされた
前駆体ポリペプチド中に含まれ、ＩＣＥ ＬＡＰ−６フ
ラグメントのアミノ末端に融合したヘテロローガスなプ
レおよびプロ−ポリペプチド領域およびフラグメントの
カルボキシル末端に融合したさらに別の領域を有する本
発明のＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドのフラグメント
に関する。したがって、本明細書で意図する意味の一態
様においてフラグメントはＩＣＥ ＬＡＰ−６由来の融
合ポリペプチドまたは融合蛋白質の一部を意味する。

【００８０】本発明のポリペプチドフラグメントの代表
例として、約５−１５、１０−２０、１５−４０、３０
−５５、４１−６５、４１−８０、４１−９０、５０−
１００、７５−１００、９０−１１５、１００−１２５
および１１０−１１３アミノ酸長を有するものが挙げら
れる。

【００８１】本明細書において、「約」は一端または両
端で数個、５、４、３、２または１個のアミノ酸が多い
かまたは少ない範囲を意味する。例えば、本明細書にて
約４０−９０個のアミノ酸とは、４０±数個、５、４、
３、２または１個のアミノ酸ないし９０±数個、５、
４、３、２または１個のアミノ酸残基、すなわち、４０
−数個のアミノ酸ないし９０＋数個のアミノ酸の広い範
囲から４０＋数個のアミノ酸ないし９０−数個のアミノ
酸の狭い範囲までのポリペプチドフラグメントを意味す
る。

【００８２】この状況において非常に好ましいのは、前
記範囲に一端または両端で５個のアミノ酸のプラスマイ
ナスがある範囲である。特に好ましいのは、前記範囲に
一端または両端で３個のアミノ酸のプラスマイナスがあ
る範囲である。特に好ましいのは、前記範囲に一端また
は両端で１個のアミノ酸のプラスマイナスの範囲があ
り、付加または欠失のないものである。この点すべてに
関してもっとも好ましいのは、約５−１５、１０−２
０、１５−４０、３０−５５、４１−６５、４１−８
０、４１−９０、５０−１００、７５−１００、９０−
１１５、１００−１２５および１１０−１１３アミノ酸
長のフラグメントである。

【００８３】本発明の特に好ましいフラグメントは、Ｉ
ＣＥ ＬＡＰ−６の切断変異体である。切断変異体は、
図１のアミノ酸配列または寄託クローンによりコードさ
れるポリペプチドのアミノ酸配列を有するＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６ポリペプチド、ただしアミノ末端を含む一連の残
基（すなわち、連続領域、または部分）の欠失、または
カルボキシル末端を含む一連の残基、または二倍切断変
異体にて、２つの連続した残基であって、一方がアミノ
末端を含み、もう一方がカルボキシル末端を含むものを
除いて、その変異体または誘導体を包含する。「約」に
て説明した大きさの範囲を有するフラグメントが、切断
フラグメントの好ましい具体例であり、一般のフラグメ
ントの中で特に好ましい。

【００８４】本発明のこの態様において好ましいのは、
ＩＣＥ ＬＡＰ−６の構造または機能的特質により特徴
づけられるフラグメントである。この点に関して本発明
の好ましい具体例は、ＩＣＥ ＬＡＰ−６のアルファヘ
リックスおよびアルファヘリックス形成領域（「アルフ
ァ領域」）、ベータシートおよびベータシート形成領域
（「ベータ領域」）、ターンおよびターン形成領域
（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域
（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、アルフ
ァ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、柔軟性領域、表
面形成領域および高抗原性インデックス領域を有してな
るフラグメントを包含する。

【００８５】そのうち、この点に関して非常に好ましい
フラグメントは、前記のいくつかの特徴など、いくつか
の構造的特徴が組み合わさったＩＣＥ ＬＡＰ−６の領
域を有するものである。この点に関して、図１または寄
託クローンによりコードされるポリペプチドの約１０な
いし２０、約４０ないし約５０、約７０ないし約９０お
よび約１００ないし約１１３の残基により特定される領
域であって、すべてターン領域、親水性領域、柔軟性領
域、表面形成領域および高抗原性インデックス領域に非
常に特徴的なアミノ酸組成により特徴づけられるものが
特に好ましい領域である。このような領域はより大きな
ポリペプチド中に含まれるかまたはそれ自身前記のよう
な本発明の好ましいフラグメントである。この項で用い
る「約」なる語は、一般的にフラグメントに関してすで
に記載した意味を有する。

【００８６】さらに好ましい領域は、ＩＣＥ ＬＡＰ−
６の活性を媒介するものである。この点に関して、非常
に好ましいのは、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の化学的、生物学
的または他の活性を有するフラグメントであって、同様
の活性または向上した活性を有するかまたは望ましくな
い活性が減少ものである。この点に関して非常に好まし
いのは、配列または位置または両方の配列が相同であ
り、図２に示される関連するポリペプチドなどの関連ポ
リペプチドの配列の領域を活性化する領域を含有するフ
ラグメントであり、ヒトインターロイキン−１ベータ転
換酵素アポトーシスプロテアーゼを包含する。この点に
関して特に好ましいフラグメントは、前記のような切断
変異体である。

【００８７】本発明はまた、なかでも前記したフラグメ
ントをコードするポリヌクレオチド、フラグメントをコ
ードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリ
ヌクレオチド、特に厳しい条件下でハイブリッド形成す
るもの、フラグメントをコードするポリヌクレオチドの
増幅用のＰＣＲプライマーなどのポリヌクレオチドに関
する。この点で好ましいポリヌクレオチドは、前記好ま
しいフラグメントに対応するものである。好ましいポリ
ヌクレオチドフラグメントは図３および４の配列から誘
導される。

【００８８】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞およ
び組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関す
る。宿主細胞は、ポリヌクレオチドを組み込み、本発明
のポリペプチドを発現するように遺伝子操作できる。例
えば、ポリヌクレオチドを感染、形質導入、トランスフ
ェクション、トランスベクションおよびトランスフォー
メーションの公知の技術を用いて宿主細胞中に導入す
る。ポリヌクレオチドは単独または他のポリヌクレオチ
ドと共に導入される。このような他のポリヌクレオチド
は、独立して導入されるか、同時導入されるか、または
本発明のポリヌクレオチドと合わせて導入される。

【００８９】このように、例えば本発明のポリヌクレオ
チドを宿主細胞中に選択マーカーをコードする他の別の
ポリヌクレオチドで例えば哺乳動物細胞中、同時トラン
スフェクションおよび選択についての標準的技術を用い
てトランスフェクションする。この場合、ポリヌクレオ
チドは一般的に宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれる
であろう。

【００９０】別法として、ポリヌクレオチドを宿主中の
増殖用選択マーカーを含有するベクターと結合させても
よい。ベクター構築物は前記技術により宿主細胞中に導
入される。一般に、プラスミドベクターは、沈殿物、例
えばリン酸カルシウム沈殿物、または荷電脂質との複合
体などのＤＮＡとして導入される。エレクトロポレーシ
ョンもポリヌクレオチドを宿主中に導入するために用い
られる。ベクターがウイルスの場合、これはin vitroで
パッケージされるか、またはパッケージング細胞中に導
入され、パッケージされたウイルスを細胞中に導入す
る。本発明のこの態様にしたがって、ポリヌクレオチド
を産生し、ポリヌクレオチドを細胞中に導入するのに適
した広範囲に及ぶ技術は当業界で周知であり慣例的であ
る。このような技術は、Ｓambrookら（前掲）に記載さ
れ、これはこれらの技術を詳述した多くの標準的実験マ
ニュアルを説明するものである。

【００９１】本発明のこの態様に関して、ベクターは、
例えばプラスミドベクター、一本または二本鎖ファージ
ベクター、一本または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイル
スベクターである。このようなベクターは、ポリヌクレ
オチド、好ましくはＤＮＡとして、ＤＮＡおよびＲＮＡ
の細胞中への導入について周知の技術により細胞中に導
入される。ベクターは、ファージおよびウイルスベクタ
ーの場合、好ましくは、感染および形質導入について周
知の技術によりパッケージされたまたは封入されたウイ
ルスとして細胞中に導入される。ウイルスベクターは複
製受容または複製欠陥のいずれであってもよい。後者の
場合、ウイルス複製は、一般に、補体宿主細胞において
のみ起こるであろう。

【００９２】ベクターのうち好ましいものは、ある点に
おいて、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
を発現するベクターである。一般に、このようなベクタ
ーは、発現されるポリヌクレオチドと操作可能に結合し
た宿主中の発現に有効なシス−作用制御領域を含む。適
当なトランス−作用ファクターは、宿主細胞中に導入さ
れる際、宿主により供給されるか、補足ベクターにより
供給されるかまたはベクターそれ自身により供給される
かのいずれかである。

【００９３】この点に関して好ましい一態様において、
ベクターは特異的発現を提供する。このような特異的発
現は、誘発性発現またはある型の細胞でのみ発現する
か、または誘発性かつ細胞特異性なものである。誘発性
ベクターの中で特に好ましいのは、操作が簡単な環境因
子、例えば温度および栄養添加物により発現を誘発でき
るベクターである。原核および真核細胞宿主における使
用についての構成および誘発可能な発現ベクターを含む
本発明のこの態様に適した種々のベクターは、周知であ
り、当業者により慣例的に用いられるものである。

【００９４】遺伝子操作した宿主細胞は、通常の栄養培
地中で培養でき、これは、特にプロモーターの活性化、
形質転換体の選択または遺伝子の増幅に適するように修
飾される。一般に発現のために選択された宿主細胞につ
いて今までに用いられている温度、ｐＨなどの培養条件
は、当業者に明らかなように、本発明のポリペプチドの
発現に適しているであろう。

【００９５】非常に多種の発現ベクターを本発明のポリ
ペプチドの発現に用いることができる。このようなベク
ターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベク
ター、例えばバクテリアプラスミド、バクテリオファー
ジ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、バクロウ
イルス、シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）などの
パポバウイルス、ワクイニアウイルス、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイ
ルスなどのウイルス由来のベクター、およびその組み合
わせ由来のベクター、例えばプラスミドおよびバクテリ
オファージ遺伝子エレメント由来のもの、例えばコスミ
ッドおよびファージミッドを包含し、これらはすべて本
発明のこの態様にしたがって発現に用いられる。一般
に、宿主においてポリペプチドを発現するため、ポリヌ
クレオチドの維持、増殖または発現に適したいかなるベ
クターもこの点に関して発現に用いることができる。

【００９６】適当なＤＮＡ配列は種々の周知の慣例技術
よりベクター中に挿入される。一般に、発現用ＤＮＡ配
列は、ＤＮＡ配列および１またはそれ以上の制限エンド
ヌクレアーゼを有する発現ベクターの開裂により発現ベ
クターに結合させ、次に制限フラグメントをＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて一緒に結合させる。この目的に用いる
ことができる制限およびライゲーション法は当業者には
周知であり、慣例的である。この点に関して、また当業
者に周知であり慣例的である別の技術を用いた発現ベク
ターの構築に適当な方法は、Ｓambrookら（前掲）に非
常に詳しく説明されている。

【００９７】発現ベクター中のＤＮＡ配列を、例えば、
プロモーターを含む適当な発現調整配列に操作可能に結
合させ、ｍＲＮＡ転写を方向付ける。このようなプロモ
ーターの代表例は、ごく僅かの周知のプロモーターを列
挙すると、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コ
リｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０
初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスＬＴ
Ｒのプロモーターを包含する。記載していない多くのプ
ロモーターが本発明のこの態様における使用に適し、周
知であり、本明細書の考察および実施例により説明され
たようにしてより容易に用いられると考えられる。

【００９８】一般に、発現構築物は、転写開始または終
止部位、および転写された領域に、翻訳のためのリボソ
ーム結合部位を含有する。構築物により発現された成熟
転写物のコーディング部分は翻訳されるポリペプチドの
ほぼ末端に位置する開始および終止コドンに翻訳開始Ａ
ＵＧを含む。加えて、構築物は、発現を調節し、引き起
こす調節領域を含む。一般に、多くの通常実施されてい
る方法にしたがって、このような領域は、レプレッサー
結合部位およびエンハンサーなどの転写を調節すること
により作用する。

【００９９】増殖および発現用ベクターは、選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーは増殖に適しているか、
またはベクターはこの目的のために付加的なマーカーを
含有する。この点に関して、発現ベクターは、形質転換
された宿主細胞の選択のための表現型特質を提供するた
めに好ましくは１またはそれ以上の選択マーカー遺伝子
を含む。好ましいマーカーは、真核細胞培養について、
ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、あるい
はイー・コリおよび他のバクテリアの培養に関して、テ
トラサイクリンまたはアンピシリン耐性を含む。

【０１００】本明細書に記載するような適当なＤＮＡ配
列を含むベクター、ならびに適当なプロモーターまたは
調節配列を、所望のポリペプチドの発現に適した種々の
周知の技術を用いて適当な宿主中に導入する。適当な宿
主の代表例は、イー・コリ、ストレプトマイセスおよび
サルモネラ・チフィムリウム細胞などの細菌細胞；酵母
細胞などの真菌細胞；ドロソフィラＳ２およびスポドプ
テラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳおよび
Ｂowes黒色腫細胞などの動物細胞；および植物細胞を包
含する。種々の発現構築物に対する宿主は周知であり、
当業者は本発明の開示により本発明のこの態様にしたが
ってポリペプチドを発現するための宿主を容易に選択で
きる。

【０１０１】より詳細には、本発明は組換え構築物、例
えば１またはそれ以上の前記配列を含む発現構築物も包
含する。構築物は、ベクター、例えばプラスミドまたは
ウイルスベクターであって、その中に本発明の配列が挿
入されているものを含む。配列を正または逆の順序に挿
入する。この点に関して好ましい具体例において、構築
物はさらに、例えば配列に操作可能に結合したプロモー
ターなどを含む調節配列を有する。多数の適当なベクタ
ーおよびプロモーターが当業者に公知であり、本発明に
おける使用に適した多くの商業上入手可能なベクターが
ある。

【０１０２】以下の商業的に入手可能なベクターを例示
のために記載する。細菌においての使用に好ましいベク
ターはＱiagenから入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６
０、ｐＱＥ−９；Ｓtratageneから入手可能なｐＢＳベ
クター、ファージスクリプトベクター、ブルースクリプ
トベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８
Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ｐharmaciaから入手可能なｐｔｒｃ
９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ
５４０、ｐＲＩＴ５である。好ましい真核細胞ベクター
は、Ｓtratageneから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ
２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；および
Ｐharmaciaから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭ
ＳＧ、ｐＳＶＬである。これらのベクターは、本発明の
態様にしたがって用いるために、当業者に利用可能な商
業上入手可能であり、かつ周知のベクターを単に例示と
して列挙したものである。例えば本発明のポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドの導入、維持、増殖または発現
に適した他のプラスミドまたはベクターも本発明のこの
態様において宿主にて用いることができる。

【０１０３】プロモーター領域は、例えば候補プロモー
ターフラグメント；すなわちプロモーターを含有するフ
ラグメントを導入するための制限部位（複数）の下流の
クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（「ＣＡＴ」）転写単位などのプロモーター領域を欠く
リポーター転写単位を含有するベクターを用いて所望の
遺伝子から選択できる。周知のように、ｃａｔ遺伝子の
上流の制限部位でプロモーター含有フラグメントのベク
ター中に導入すると、標準ＣＡＴアッセイにより検出可
能なＣＡＴ活性の産生を引き起こす。この目的に適した
ベクターは周知で容易に入手可能である。２つのこのよ
うなベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７であ
る。したがって、本発明のポリヌクレオチドの発現用プ
ロモーターは、周知で容易に入手可能なプロモーターだ
けでなく、前記技術により、リポーター遺伝子を用いて
容易に得られるプロモーターも包含する。

【０１０４】そのうち、本発明にしたがってポリヌクレ
オチドおよびポリペプチドの発現に適した公知の細菌プ
ロモーターは、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロ
モーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモ
ーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプ
ロモーターである。そのうち、この点に関して適当な公
知の真核細胞プロモーターは、サイトメガロウイルス
（「ＣＭＶ」）即時型プロモーター、ＨＳＶチミジンキ
ナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモー
ター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、例えばラ
ウス肉腫ウイルス（「ＲｏＳＶ」）のプロモーター、お
よびメタロチオネイン−Ｉプロモーターなどのメタロチ
オネインプロモーターを包含する。

【０１０５】宿主細胞における発現についての適当なベ
クターおよびプロモーターの選択は、公知方法であり、
発現ベクター構築、ベクターの宿主細胞中への導入およ
び宿主における発現に必要な技術は当業界で慣例の技術
である。本発明はまた前記構築物を有する宿主細胞に関
する。宿主細胞は、哺乳動物細胞などのより高等な真核
細胞、または酵母細胞などのより低級な真核細胞、ある
いは宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞とすることがで
きる。

【０１０６】構築物の宿主細胞中への導入はリン酸カル
シウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン
媒介トランスフェクション、カチオン性脂質−媒介トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、形質導
入、感染または他の方法により行うことができる。この
ような方法は、多くの標準実験室マニュアル、例えば、
ＳＡＭＢＯＯＫに記載されている。

【０１０７】宿主細胞中の構築物は常法で用いることが
でき、組換え体配列によりコードされる遺伝子産物を生
じる。別法として、本発明のポリペプチドは通常のペプ
チド合成器により合成できる。成熟蛋白質は、哺乳動物
細胞、酵母、細菌、または他の細胞において適当なプロ
モーターの調節下で発現できる。また、細胞を含まない
翻訳系を用い、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用
いてこのような蛋白質を産生することもできる。原核お
よび真核宿主について用いる適当なクローニングおよび
発現ベクターは、Ｓambrookら（前掲）に記載されてい
る。

【０１０８】一般に、組換え発現ベクターは、複製起
点、下流構造配列の転写を方向付けるために高度に発現
された遺伝子由来のプロモーター、およびベクターに接
触させた後ベクターを含有する細胞の単離を行うための
選択マーカーを含む。そのうち、適当なプロモーター
は、３−ホスホグリセレートキナーゼ（「ＰＧＫ」）、
ａ−ファクター、酸ホスファターゼ、および熱ショック
蛋白質などの糖分解酵素をコードする遺伝子から誘導で
きるものである。選択マーカーはイー・コリのアンピシ
リン耐性遺伝子およびエス・セレビシエのｔｒｐ１遺伝
子を包含する。

【０１０９】高等な真核細胞による本発明のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡの転写はエンハンサー配列をベク
ター中に挿入することに増加させてもよい。エンハンサ
ーは、所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活
性を増加させるように作用する、通常、約１０ないし３
００ｂｐのＤＮＡの、ＤＮＡのシス−作用エレメントで
ある。エンハンサーの例は、複製起点ｂｐ１００ないし
２７０の後側に位置するＳＶ４０エンハンサー、サイト
メガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起
点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイ
ルスエンハンサーを包含する。

【０１１０】本発明のポリペプチドのヘテロローガスな
構造配列をコードする本発明のポリヌクレオチドは一般
に標準的技術を用いて、これが発現用プロモーターに操
作可能に結合するようにベクター中に挿入される。ポリ
ペプチドは転写開始部位が適当にリボソーム結合部位の
５’に位置するように配置される。リボソーム結合部位
は発現されるポリペプチドの翻訳を開始するＡＵＧに対
して５’である。一般に、開始コドン、通常はＡＵＧで
始まり、リボソーム結合部位と開始ＡＵＧの間にある他
のオープンリーディングフレームは存在しない。また、
一般に、ポリペプチドの末端に翻訳終止コドンがあり、
転写領域の３’末端に適切に配置されたアデニル化シグ
ナルおよび転写終止シグナルが存在する。

【０１１１】翻訳された蛋白質の小胞体のルーメン中、
細胞質隙中または細胞外環境への分泌については、適当
な分泌シグナルが発現されたポリペプチド中に組み込ま
れている。シグナルはポリペプチドに対して内因性であ
るかまたはヘテロローガスなシグナルであってもよい。

【０１１２】ポリペプチドは例えば融合蛋白質などの修
飾された形態で発現され、分泌シグナルだけでなく、付
加的なヘテロローガスな機能領域も包含する。したがっ
て、例えば付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域
は、精製中またはそれに続く操作および保存中、宿主細
胞における安定性および保存性を向上させるためにポリ
ペプチドのＮ−末端に添加される。また、領域をポリペ
プチドに付加して精製を促進してもよい。このような領
域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去してもよい。
ペプチド部をポリペプチドに付加し、分泌または排出を
誘起するか、または安定性を向上させるかまたは精製を
容易にすることは、当業界で周知の慣例的技術である。

【０１１３】本発明によるポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの増殖、維持または発現に適当な原核宿主は、
エシェリヒア・コリ、バチルス・サチリスおよびサルモ
ネラ・チフィムリウムを包含する。種々のシュードモナ
ス、ストレプトマイセスおよびスタフィロコッカスがこ
の点で適当な宿主である。さらにまた、この点に関して
当業者に公知の多数の他の宿主も用いうる。

【０１１４】代表的であるが制限的でない例として、細
菌の用途に有用な発現ベクターは、選択可能なマーカー
および周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴ
ＣＣ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む市販のプラ
スミド由来の細菌の複製起源を含みうる。このような市
販のベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐharmacia
Ｆine Ｃhemicals、ウプサラ、スウェーデン）および
ＧＥＭ１（Ｐromega Ｂiotec，マディソン、ウイスコン
シン州、米国）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「主
鎖」セクションを、適当なプロモーターおよび発現させ
る構造配列と合す。

【０１１５】適当な宿主株の形質転換および宿主株の細
胞濃度への増殖後、選択されたプロモーターを適当な手
段（例えば、温度シフトまたは化学誘発因子）により誘
発させ、細胞をさらなる期間培養する。細胞を典型的に
は遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段によ
り破砕し、得られた粗抽出物をさらに精製する。

【０１１６】蛋白質の発現に用いた微生物細胞は、凍結
−解凍サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞
溶解剤を含むいずれか都合のよい方法で破砕することが
でき、このような方法は当業者には周知である。種々の
哺乳動物細胞培養系はまた、発現にも用いることができ
る。哺乳動物発現系の例は、Ｇluzmanら、Ｃell 23：１
７５（１９８１）に記載されているサル腎臓線維芽細胞
のＣＯＳ−６系統を包含する。適合性ベクターの発現能
を有する他の細胞系は、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、Ｃ
ＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト腎臓２９３およびＢＨＫ細胞系を
包含する。

【０１１７】哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適当
なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに必要なリ
ボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスド
ナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および発
現に必要な５’フランキング非転写配列を含む。この点
に関して、ＳＶ４０スプライス部位、およびＳＶ４０ポ
リアデニル部位由来のＤＮＡ配列は、これらのタイプの
所望の非形質転換転写遺伝子エレメントについて用いら
れる。

【０１１８】ＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチドは硫酸ア
ンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンま
たはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマト
グラフィーを包含する周知の方法により組換え細胞から
回収し、かつ精製できる。最も好ましくは、高速液体ク
ロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。ポ
リペプチドが単離および／または精製中に変性する場
合、蛋白質の再生に周知の技術を用いて、活性なコンフ
ォメーションを再生してもよい。

【０１１９】本発明のポリペプチドは天然に精製された
産物、または化学合成法の産物、および細菌、酵母、高
等植物、昆虫および哺乳物細胞を含む原核または真核細
胞宿主から組換え技術により産生される産物を包含す
る。組換え体産生法において用いた宿主に応じて、本発
明のポリペプチドはグリコシル化されるかまたはグリコ
シル化されなくてもよい。加えて、場合によっては宿主
媒介プロセスの結果として本発明のポリペプチドはまた
初期メチオニンアミノ酸残基を包含してもよい。

【０１２０】ＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドは、本発明にしたがって種々の用途、特
にＩＣＥ ＬＡＰ−６の化学的および生物学的性質を利
用する用途に用いられる。さらに別の用途は、細胞、組
織および生物の障害の診断および治療に関する。本発明
のこの態様を以下の考察でさらに説明する。

【０１２１】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、相補ポリヌクレオチドを検出するため
の、例えば診断薬としてのＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリヌク
レオチドの使用に関する。機能不全に関連する成熟形態
のＩＣＥ ＬＡＰ−６の検出により、ＩＣＥ ＬＡＰ−６
の産生不足、過剰産生または産生の変化の結果として起
こる疾患または疾患に対する感受性の診断の付加しまた
は特定しうる診断手段が得られる。ヒトＩＣＥ ＬＡＰ
−６遺伝子において突然変異を有する個体は、種々の技
術によりＤＮＡレベルで検出される。診断用核酸を血
液、尿、唾液、組織生検および剖検物質などの患者細胞
から得る。ゲノムＤＮＡを検出に直接用いるか、または
ＰＣＲを用いて分析前に酵素的に増幅する［Ｓaikiら、
ネイチャーＮature、３２４：１６３−１６６（１９８
６）］。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同様に用いてもよい。
例として、ＩＣＥ ＬＡＰ−６発現および突然変異の同
定および分析にＩＣＥ ＬＡＰ−６をコードする核酸と
相補的なＰＣＲプライマーを用いることができる。例え
ば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較して、増
幅された産物の大きさの変化により検出できる。点突然
変異は、増幅されたＤＮＡを放射標識したＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６ＲＮＡと、あるいは放射標識したＩＣＥ ＬＡＰ
−６アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリッド形成するこ
とにより同定できる。完全に一致した配列はＲＮaseＡ
消化によるかまたは融点の違いにより一致しないものか
ら区別できる。

【０１２２】このような対照標準遺伝子と突然変異を有
する遺伝子の間の配列の違いは、直接的ＤＮＡ配列決定
により明らかにされる。加えて、クローン化されたＤＮ
Ａセグメントを特異的ＤＮＡセグメントを検出するプロ
ーブとして用いてもよい。この方法の感度は、ＰＣＲま
たは他の適当な増幅法の使用により著しく向上させるこ
とができる。例えば、配列化プライマーを二本鎖ＰＣＲ
産物または修飾ＰＣＲにより生じた一本鎖鋳型分子と共
に用いる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用
いた常法によるかまたは蛍光標識を用いた自動配列化法
により行う。

【０１２３】ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子試験は変
性剤を含むかまたは含まないゲル中のＤＮＡフラグメン
トの電気泳動移動度の変化の検出により達成される。小
さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動に
より可視化できる。異なる配列のＤＮＡフラグメント
は、異なるＤＮＡフラグメントの移動度がゲル中の異な
る位置でその比融点または部分融解温度にしたがって遅
れる変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別される［例え
ば、Ｍyersら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８
５）参照］。

【０１２４】特定の位置での配列の変化は、ヌクレアー
ゼ保護分析、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化
学的開裂法により明らかにされる［例えば、Ｃotton
ら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ、８５：４３９７
−４４０１（１９８５）参照］。

【０１２５】このように、特定のＤＮＡ配列の検出は、
ハイブリッド形成、ＲＮase保護、化学的開裂、直接的
ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用、例えば、制限フ
ラグメント長多形性（「ＲＦＬＰ」）およびゲノムＤＮ
Ａのサザンブロッティングにより達成される。より一般
的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列化に加えて、突然変
異も正常分析により検出できる。

【０１２６】本発明のさらに別の態様によれば、ウイル
ス感染、腫瘍形成に関連した疾患の測定法および胚形成
および組織恒常性の制御法が提供される。ウイルス感
染、腫瘍形成に関連した疾患、および胚形成および組織
恒常性の制御、およびウイルス感染、腫瘍形成に対する
感受性および胚形成および組織恒常性の制御における疾
患および欠陥のように、ＩＣＥ ＬＡＰ−６における変
異は、ウイルス感染、腫瘍形成、および胚形成および組
織恒常性の制御における病気および欠陥に対して感受性
を示し、前記核酸配列はこのような感受性を確認するた
めのアッセイにおいて用いられる。このように、例えば
試験は前記したヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６蛋白質における
変異、例えば欠失、切断、挿入、フレームシフトなどを
決定するのに用いられ、このような変異は、ウイルス感
染、腫瘍形成、ならびに胚形成および組織恒常性の制御
における疾患および欠陥に対する感受性の指標である。

【０１２７】例えば、変異はＤＮＡ配列検定により確認
される。血液を含む（これに限定されない）組織サンプ
ルをヒト患者から得る。サンプルを当業界で公知の方法
により処理してＲＮＡを捕捉する。ｍＲＮＡ上に存在す
るポリアデノシン鎖とハイブリッド形成するポリチミジ
ン残基からなるオリゴヌクレオチドプライマーを添加す
ることによりＲＮＡサンプルから、第一鎖ｃＤＮＡを合
成する。逆転写酵素およびデオキシヌクレオチドを添加
して第一鎖ＤＮＡの合成を可能とする。プライマー配列
を本発明のＩＣＥ ＬＡＰ−６蛋白質のＤＮＡ配列に基
づいて合成する。プライマー配列は一般に少なくとも１
５個の連続塩基からなり、少なくとも３０または５０個
の連続配列を含有する。

【０１２８】本発明の遺伝子中に突然変異を有する個体
はまた、種々の技術によりＤＮＡレベルで検出される。
診断用核酸を血液、尿、唾液、組織生検および剖検物質
などの患者細胞から得る。ゲノムＤＮＡを検出に直接用
いるか、またはＰＣＲを用いて分析前に酵素的に増幅す
る［Ｓaikiら、Ｎature、３２４：１６３−１６６（１
９８６）］。ＲＴ−ＰＣＲも突然変異の検出に用いるこ
とができる。ＲＴ−ＰＣＲを、例えばＧｅｎｅＳｃａｎ
などの自動検出システムと組み合わせて用いるのが特に
好ましい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同様の目的、ＰＣＲ
またはＲＴ−ＰＣＲに用いてもよい。一例として、ＩＣ
Ｅ ＬＡＰ−６をコードする核酸と相補的なＰＣＲプラ
イマーを用いて、突然変異を同定し分析することができ
る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較
して、増幅された産物の大きさの変化により検出でき
る。点突然変異は、増幅されたＤＮＡを放射標識したＲ
ＮＡと、あるいは放射標識したアンチセンスＤＮＡ配列
とハイブリッド形成することにより同定できる。完全に
一致した配列はＲＮaseＡ消化によるかまたは融点の違
いにより一致しないものから区別できる。

【０１２９】周知の方法により選択されたプライマーを
患者由来のサンプルから単離されたＩＣＥ ＬＡＰ−６
ｃＤＮＡの増幅に用いる。本発明はまた、５'および／
または３'末端から除去された１、２、３または４個の
ヌクレオチドに関して選択されたプライマーを提供す
る。プライマーを用いて患者から単離された遺伝子を増
幅し、その遺伝子をＤＮＡ配列の解明するための種々の
技術に付す。このように、ＤＮＡ配列における突然変異
を診断してもよい。

【０１３０】対照標準遺伝子と変異を有する遺伝子の間
の配列の違いは、直接ＤＮＡ配列決定方法により明らか
にされる。加えて、クローン化されたＤＮＡセグメント
を、特異的ＤＮＡセグメントを検出するプローブとして
用いてもよい。この方法の感度は、ＰＣＲと組み合わせ
た場合に非常に向上する。例えば、配列決定プライマー
を二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより生じた一本
鎖鋳型分子と共に用いる。配列決定は、放射標識したヌ
クレオチドを用いた常法によるかまたは蛍光標識を用い
た自動配列化法により行う。

【０１３１】ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子試験は変
性剤を含むかまたは含まないゲル中のＤＮＡフラグメン
トの電気泳動移動度の変化の検出により達成される。小
さな配列の欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動に
より可視化できる。異なる配列のＤＮＡフラグメント
は、異なるＤＮＡフラグメントの移動度がゲル中の異な
る位置でその比融点または部分融解温度にしたがって遅
れる変性ホルムアミド勾配ゲル上で区別される［例え
ば、Ｍyersら、Ｓcience、２３０：１２４２（１９８
５）参照］。

【０１３２】特定の位置での配列の変化は、ヌクレアー
ゼ保護分析、例えばＲＮaseおよびＳ１保護または化学
的開裂法により明らかにされる［例えば、Ｃottonら、
ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、８５：４３９７−４４０１（１９８
５）参照］。このように、特定のＤＮＡ配列の検出およ
び／または配列のレベルの定量化は、ハイブリッド形
成、ＲＮase保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列化また
は制限酵素の使用［例えば、リストリクション・フラグ
メント・レングス・ポリモルフィズム（ＲＦＬＰ）］お
よびＤＮＡのサザンブロッティングにより達成される。

【０１３３】本発明は疾患、特にアルツハイマー病、パ
ーキンソン病、慢性関節リウマチ、敗血性ショック、敗
血症、卒中、慢性炎症、急性炎症、ＣＮＳ炎症、骨粗鬆
症、虚血再潅流傷害、心血管疾患に伴う細胞死、多発性
嚢胞腎病、心血管疾患における内皮細胞のアポトーシ
ス、変性肝炎、ＭＳ、ＡＬＳ、小脳変性、虚血性障害、
心筋梗塞、ＡＩＤＳ、脊髄形成異常症候群、再生不能性
貧血、男性型禿頭症および頭部傷害損傷、ならびにウイ
ルス感染症および癌に対する感受性の診断または検出
法、異常な胚発育および組織恒常性の制御法であって、
正常な対照サンプルと比較して、図１の配列または寄託
クローンのポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドの発現の変更を患者由来のサンプルから測定するこ
とからなる方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現
は、当業界でポリヌクレオチドの定量について周知の方
法、例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮase保護、ノ
ザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション
法のいずれかを用いて測定できる。

【０１３４】通常のゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定
に加えて、変異もin situ分析により検出できる。メタ
フェーズの染色体スプレッドに対するｃＤＮＡクローン
の蛍光正常部位雑種（ＦＩＳＨ）を正確な染色体配置を
得るために用いることができる。

【０１３５】どのようにこれを行うかとして、ＩＣＥ
ＬＡＰ−６ＤＮＡをＱＩＡＥＸ IIＤＮＡ精製キット
（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉnc.，Ｃhatsworth，ＣＡ）で消化
し、精製し、Ｓuper Ｃｏｓ１コスミッドベクター（Ｓ
ＴＲＡＴＥＧＥＮＥ，Ｌa Ｊolla，ＣＡ）とライゲート
する。Ｑiagenプラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，
Ｉnc.，Ｃhatsworth，ＣＡ）を用いてＤＮＡを精製し、
１ｍｇをＢiotin−ｄＡＴＰの存在下で、ＢioＮick標識
キット（ＧibcoBＲＬ，Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.，Ｇ
aithersburg，ＭＤ）を用いてｎｉｃｋ翻訳により標識
する。ビオチニル化はＧＥＮＥ−ＴＥＣＴ検出システム
（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ Ｌaboratories，Ｉnc.，Ｐalo
Ａlto，ＣＡ）で検出される。正常部位雑種はＯＮＣＯ
Ｒ ライトハイブリダイゼーションキット（ＯＮＣＯ
Ｒ，Ｇaithersberg，ＭＤ）を用いて、スライド上で行
って、メタフェーズ染色体上に単一の配列を検出する。
正常なドナーの末梢血を３日間２０％ＦＣＳ、３％ＰＨ
Ａおよびペニシリン／ストレプトマイシンで補足したＲ
ＰＭＩ１６４０中で培養し、１０^-6Ｍメトトレキサート
で１７時間同調し、補足していないＲＰＭＩで２回洗浄
する。細胞を１０^-3Ｍチミジンと共に７時間インキュベ
ートする。細胞をコルセミド（０.５μｇ／ｍｌ）と共
に２０分間インキュベートした後、メタフェーズで停止
させ、続いて７５ｍＭＫＣｌ中１５分間３７℃で低張溶
解を行う。細胞ペレットを次にスピンさせ、カルノイ固
定液（３：１メタノール／酢酸）中で固定する。

【０１３６】１滴の懸濁液をスライド上に添加すること
によりメタフェーズスプレッドを調製し、乾燥する。ヒ
ト胎盤ＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）を遮断しながら１０ｍｌ
のハイブリダイゼーションミックス（５０％ホルムアミ
ド、２×ＳＳＣ、１％硫酸デキストラン）中に懸濁した
１００ｍｇのプローブを添加することによりハイブリダ
イゼーションを行う。プローブ混合物を、予め７０％ホ
ルムアミド／２×ＳＳＣ中７０℃で変性させた、予め暖
めておいたスライド（３７℃）上に置く前に、１０分間
７０℃の水浴中で変性させ、１時間３７℃でインキュベ
ートし、一連のエタノール中で脱水し、４℃に冷却す
る。

【０１３７】スライドを１６時間３７℃で加湿した室内
でインキュベートする。スライドを５０％ホルムアミド
／２×ＳＳＣ中１０分間４１℃で、２×ＳＳＣ中７分間
３７℃で洗浄する。スライドを製造主のプロトコルに従
ってＦＩＴＣ−アビジン（ＯＮＣＯＲ，Ｇaitehrberg，
ＭＤ）と共にインキュベートすることによりハイブリダ
イゼーションプローブを検出する。染色体をスライド作
成媒体中に懸濁したプロピリジウムヨウ素で対比染色す
る。Ｌeitz ＯＲＴＨＯＰＬＡＮ２−エピフルオレッセ
ンス顕微鏡を用いてスライドを可視化し、イマジェネテ
ィクス・コンピューターおよびマッキントッシュプリン
ターを用いて５つのコンピューターイメージを得る。

【０１３８】配列を正確な染色体位置に位置決定した場
合、染色体上の配列の物理的位置は、遺伝地図データと
相関させることができる。このようなデータは、例え
ば、ブイ・マッククジック（Ｖ．ＭcＫusick）、メンデ
リアン・インヘリタンス・イン・マン（Ｍendelian Ｉn
heritance in Ｍan）（コンピューターを介してオンラ
インで公に入手可能）において見られる。同じ染色体領
域に位置決定された遺伝子と病気間の関係を、周知の方
法を用いた関係分析により同定する。特記しないかぎ
り、形質転換は、Ｇraham，Ｆ.およびＶan der Ｅb，
Ａ.、Ｖirology、５２：４５６−４５７（１９７３）の
方法に記載されているように行う。

【０１３９】染色体試験 本発明の配列は染色体の同定に関して重要である。配列
は各ヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、ハ
イブリッド形成できる。さらに、現在染色体上の特定の
位置を同定することが必要とされている。染色体位置の
マーキングについて、実際の配列データ（繰り返し多形
性）に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとんど利用
できない。本発明によるＤＮＡの染色体に対する位置決
定はこれらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関させる
重要な第一段階である。

【０１４０】この点に関して好ましい具体例において、
本発明において開示するｃＤＮＡを用い、ＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６遺伝子のゲノムＤＮＡをクローン化する。これ
は、種々の周知の技術および一般に商業的に入手できる
ライブラリーを用いて達成される。ゲノムＤＮＡを、こ
の目的についての周知の技術を用い、in situ染色体マ
ッピングについて用いる。典型的には、正常部位染色体
決定について通常の手順にしたがい、良好な正常部位雑
種シグナルを付与するゲノムプローブを同定するのに試
行錯誤が必要である。

【０１４１】場合によっては、さらに、ｃＤＮＡからＰ
ＣＲプライマー（好ましくは１５−２５ｂｐ）を調製す
ることにより配列を染色体についてマッピングできる。
遺伝子の３'非翻訳領域のコンピューター分析を行い、
ゲノムＤＮＡにて１より多いエクソンに及ばないプライ
マーを迅速に選択する（そうでなければ、増幅工程が複
雑になる）。これらのプライマーを、各ヒト染色体を含
有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに用
いる。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するこれ
らのハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを産す
る。

【０１４２】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特定の染色体に対する特定のＤＮＡの選定に対する
迅速な方法である。同じオリゴヌクレオチドプライマー
に関して本発明を用いて、同様の方法で特異的染色体ま
たは大きなゲノムクローンのプールからのフラグメント
のパネルに関してサブローカライゼーションを達成でき
る。その染色体をマッピングするのに同様に用いること
ができる他のマッピング法は、正常部位雑種、標識した
フロー種の染色体に関するプレスクリーニングおよび染
色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するための正常
部位雑種による予備選択を包含する。

【０１４３】メタフェーズ染色体のスプレッドに対する
ｃＤＮＡクローンの蛍光正常部位雑種（「ＦＩＳＨ」）
は一段階における正確な染色体位置を得るのに用いるこ
とができる。この技術は、５０または６０の短いｃＤＮ
Ａに関して用いることができる。この技術の総説に関し
ては、Ｖermaら、HUMAN CHROMOSOMES：A MANUAL OF BAS
IC TECHNIQUES，Ｐergamon Ｐress，Ｎew Ｙork（１９
８８）を参照のこと。

【０１４４】配列を正確な染色体位置についてマッピン
グすると、染色体上の配列の物理的位置は遺伝子地図デ
ータと相関させることができる。このようなデータは、
例えばＶ．ＭcＫusick、Ｍendelian Ｉnheritance in
Ｍanにおいて見られる。同じ染色体領域についてマッピ
ングされた遺伝子と病気の間の関係を次に関係分析（物
理的に隣接する遺伝子の共有）により同定する。

【０１４５】次に、感染および未感染個体間のｃＤＮＡ
またはゲノム配列における違いを測定する必要がある。
変異が感染個体のいくつかまたはすべてにおいて観察さ
れるが、正常な個体においては観察されない場合、変異
は疾患の決定因子であり得る。

【０１４６】物理的マッピングおよび遺伝子マッピング
技術の最近の分解能に関して、疾患に関連する染色体領
域に正確に局在化されたｃＤＮＡは、５０と５００の間
の潜在的決定遺伝子の１つであり得る。（これは、１メ
ガベースマッピングレゾリューションおよび１遺伝子／
２０ｋｂと仮定する）。

【０１４７】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、正常および異常なレベルの測定を含む、
細胞および組織におけるＩＣＥ ＬＡＰ−６蛋白質のレ
ベルを検出するための定量的および半定量的な診断アッ
セイに関する。このように、例えば正常な対照組織サン
プルと比較したＩＣＥ ＬＡＰ−６蛋白質の過剰発現を
検出するための本発明による診断アッセイを用いて、例
えば腫瘍または他の異常な細胞増殖もしくは増幅の存在
を検出することができる。宿主由来のサンプルにおけ
る、本発明のＩＣＥ ＬＡＰ−６蛋白質などの蛋白質の
レベルを決定するために用いることができるアッセイ法
は当業界で周知である。このようなアッセイ法は、ラジ
オイムノアッセイ、競合性結合アッセイ、ウェスタンブ
ロット分析およびＥＬＩＳＡ検定を包含する。これらの
うち、ＥＬＩＳＡが好ましいことが多い。ＥＬＩＳＡア
ッセイはまず、ＩＣＥＬＡＰ−６に特異的な抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体の調製を含む。加えて、モノ
クローナル抗体に結合するリポーター抗体を調製する。
リポーター抗体に、検出可能な試薬、例えば放射能、蛍
光またはホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素試薬
を結合させる。

【０１４８】ＥＬＩＳＡを行うために、サンプルを宿主
から摘出し、サンプル中の蛋白質と結合する固体支持
体、例えばポリスチレン皿上でインキュベートする。つ
いで、皿上のいずれのフリー蛋白質結合部位もウシ血清
アルブミンなどの非特異的蛋白質とともにインキュベー
トすることによりカバーする。次に、モノクローナル抗
体を皿中でインキュベートする。その間にそのモノクロ
ーナル抗体がポリスチレン皿に屁都合した本発明のＩＣ
Ｅ ＬＡＰ−６に結合する。すべての未結合モノクロー
ナル抗体を緩衝液で洗い出す。ホースラディッシュペル
オキシダーゼに結合したリポーター抗体を皿に入れ、そ
の結果リポーター抗体がＩＣＥ ＬＡＰ−６と結合した
モノクローナル抗体と結合する。ついで、未結合リポー
ター抗体を洗い流す。比色基質を含むぺルオキシダーゼ
活性用試薬を次に皿に加える。第一および第二の抗体に
よりＩＣＥ ＬＡＰ−６と結合した固定化されたぺルオ
キシダーゼは着色した反応性生物を産生する。所定の時
間内の発色量はサンプル中に存在するＩＣＥ ＬＡＰ−
６蛋白質の量を示す。定量的結果は典型的には標準曲線
を対照とすることにより得られる。

【０１４９】競合試験を用い、固体支持体に結合したＩ
ＣＥ ＬＡＰ−６に対して特異的な抗体および標識した
ＩＣＥ ＬＡＰ−６および宿主由来のサンプルを固体支
持体上にかけ、固体支持体上に結合した検出された標識
の量をサンプル中のＩＣＥＬＡＰ−６の量と相関させる
ことができる。

【０１５０】抗体 ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、ま
たはその類似体、またはこれを発現する細胞を免疫源と
して用い、これに対する抗体を産生する。これらの抗体
は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体で
あり得る。本発明はまた、キメラ、一本鎖、およびヒト
化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発
現ライブラリーの産物を包含する。種々の当業界で公知
の方法は、このような抗体およびフラグメントの産生に
用いられる。

【０１５１】本発明の配列に対応するポリペプチドに対
して産生された抗体はポリペプチドの動物中への直接注
射またはポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動
物に投与することにより得ることができる。ついで、こ
のように得られた抗体はそのポリペプチド自身に結合す
るであろう。このように、ポリペプチドのフラグメント
のみをコードする配列であっても全ネイティブポリペプ
チドを結合させる抗体の産生に用いることができる。こ
のような抗体を次にポリペプチドを発現する組織からの
ポリペプチドの単離に用いることができる。

【０１５２】モノクローナル抗体の調製に関して、連続
細胞系培養により産生される抗体をもたらすいかなる技
術も用いることができる。例は、ハイブリドーマ技術
［Ｋohler,Ｇ.およびＭilestein,Ｃ.、１９７５、Ｎatu
re、２５６：４９５−４９７］、トリオーマ技術、ヒト
Ｂ−細胞ハイブリドーマ技術［Ｋozborら、Ｉmmunology
Ｔoday４：７２（１９８３）］およびヒトモノクローナ
ル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術［Ｃole
ら、７７−９６頁、Ｍonoclonal Ａntibodies and Ｃan
cer Ｔherapy，Ａlan Ｒ.Ｌiss,Ｉnc.，（１９８５）］
を包含する。

【０１５３】一本鎖抗体の産生に関して記載した技術
（米国特許番号４９４６７７８）を適用し、本発明の免
疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を産生でき
る。また、トランスジェニックマウスまたは他の哺乳動
物などの他の生物を用い、本発明の免疫原性ポリペプチ
ド産物に対するヒト化抗体を発現させてもよい。

【０１５４】前記した抗体を用い、ポリペプチドを発現
するクローンを単離するかまたは同定し、あるいは抗体
をアフィニティークロマトグラフィーにより単離および
／または精製するための固体支持体上に結合させること
によって本発明のポリペプチドを精製してもよい。

【０１５５】このように、とりわけ、アルツハイマー
病、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、敗血症性ショ
ック、敗血症、卒中、慢性炎症、急性炎症、ＣＮＳ炎
症、骨粗鬆症、虚血再潅流傷害、心血管疾患に伴う細胞
死、多発性嚢胞腎病、心血管疾患における内皮細胞のア
ポトーシス、変性肝炎、ＭＳ、ＡＬＳ、小脳変性、虚血
性障害、心筋梗塞、ＡＩＤＳ、脊髄形成異常症候群、再
生不能性貧血、男性型禿頭症および頭部傷害損傷の治療
において、ＩＣＥ ＬＡＰ−６に対する抗体を用いても
よい。

【０１５６】ＩＣＥ ＬＡＰ−６結合分子およびアッセ
イ 本発明はまたＩＣＥ ＬＡＰ−６に結合するレセプター
分子などの分子の同定法を提供する。レセプター蛋白質
などのＩＣＥ ＬＡＰ−６に結合する蛋白質をコードす
る遺伝子は、当業界で公知の種々の方法、例えばリガン
ドパンニングおよびＦＡＣＳ分類により同定できる。こ
のような方法は、多くの実験室マニュアル、例えばＣol
iganら、Ｃurrent Ｐrotocols in Ｉmmunology １
（２）：第５章（１９９１）に記載されている。

【０１５７】例えば、発現クローニングをこの目的に関
して用いることができる。この目的のために、ポリアデ
ニル化ＲＮＡをＩＣＥ ＬＡＰ−６に対して反応性であ
る細胞から調製し、ｃＤＮＡライブラリーをこのＲＮＡ
から形成し、ライブラリーをプールの分け、そのプール
を個々にＩＣＥ ＬＡＰ−６に対して反応性でない細胞
中にトランスフェクションする。トランスフェクション
された細胞を次に標識したＩＣＥ ＬＡＰ−６と接触さ
せる（ＩＣＥ ＬＡＰ−６は放射性ヨウ素化または部位
特異性蛋白質キナーゼに対する認識部位の封入の標準法
を含む種々の公知技術により標識できる）。接触後、細
胞を固定化し、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の結合を測定する。
これらの方法は、都合よくは、ガラススライド上で行わ
れる。

【０１５８】プールはＩＣＥ ＬＡＰ−６結合細胞を産
生するｃＤＮＡと同定される。サブプールをこれらのポ
ジティブから調製し、宿主細胞中にトランスフェクショ
ンし、前記のようにスクリーンする。繰り返しサブプー
リングおよび再スクリーニングプロセスを用いて、レセ
プター分子などの推定結合分子をコードする１またはそ
れ以上の単一のクローンを単離することができる。

【０１５９】別法として、標識したリガンドを、レセプ
ター分子などのそれが結合する分子を発現する細胞から
調製された、膜または膜抽出物などの細胞抽出物にフォ
トアフィニティー結合させることができる。架橋物質を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）によ
り分割し、Ｘ線フィルムに暴露する。リガンドレセプタ
ーを含有する標識した錯体を励起し、ペプチドフラグメ
ントに分割し、蛋白質マイクロシーケンシングに付すこ
とができる。マイクロシーケンシングから得られるアミ
ノ酸配列を用い、推定レセプター分子をコードする遺伝
子を同定するためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーン
するための独特なまたは変性オリゴヌクレオチドプロー
ブをデザインすることができる。

【０１６０】本発明のポリペプチドはまた、細胞または
細胞を含まない調製物中レセプター分子などのＩＣＥ
ＬＡＰ−６結合分子のＩＣＥ ＬＡＰ−６結合能を評価
するために用いることができる。

【０１６１】アゴニストおよびアンタゴニスト−試験お
よび分子 本発明はまた細胞上のＩＣＥ ＬＡＰ−６の作用、例え
ばレセプター分子などのＩＣＥ ＬＡＰ−６結合分子と
の相互作用などを向上または遮断する化合物を同定する
ための化合物のスクリーニング法を提供する。アゴニス
トはＩＣＥ ＬＡＰ−６の自然な生物学的機能を亢進さ
せるかまたはＩＣＥ ＬＡＰ−６と同様に機能する化合
物であり、一方、アンタゴニストはこのような機能を減
少または消失させる。

【０１６２】例えば、細胞区画、例えば膜またはその調
製物、例えば膜調製物は、ＩＣＥＬＡＰ−６により調節
されるシグナル化または調節経路の分子などのＩＣＥ
ＬＡＰ−６と結合する分子を発現する細胞から調製され
る。調製物を標識したＩＣＥ ＬＡＰ−６とともに、Ｉ
ＣＥ ＬＡＰ−６アゴニストまたはアンタゴニストであ
る候補分子の非存在下または存在下でインキュベートす
る。候補分子の結合分子と結合する能力は、標識された
リガンドの結合の減少に反映される。無償で、すなわち
ＩＣＥ ＬＡＰ−６結合分子の結合に対するＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６の効果を誘発することなく結合する分子は良好な
アンタゴニストであることが多い。十分に結合し、ＩＣ
Ｅ ＬＡＰ−６と同じかまたは密接に関連した効果を惹
起する分子はアゴニストである。

【０１６３】有効なアゴニストおよびアンタゴニストの
ＩＣＥ ＬＡＰ−６様効果は、例えば候補分子と細胞ま
たは適当な細胞調製物との相互作用により第二のメッセ
ンジャーシステムの活性を測定し、その効果をＩＣＥ
ＬＡＰ−６またはＩＣＥ ＬＡＰ−６と同じ効果を惹起
する分子の効果と比較することにより測定する。この点
に関して有用な第二のメッセンジャーシステムはＡＭＰ
グアニレートサイクラーゼ、イオンチャネルまたはホス
ホイノシチド加水分解第二メッセンジャーシステムであ
るが、これに限定されない。

【０１６４】ＩＣＥ ＬＡＰ−６アンタゴニストに関す
るアッセイのもう一つの例として、競合的抑制アッセイ
について適当な条件下でＩＣＥ ＬＡＰ−６および有効
なアンタゴニストを膜結合ＩＣＥ ＬＡＰ−６レセプタ
ー分子または組換え型ＩＣＥＬＡＰ−６レセプター分子
と結合させる競合アッセイが挙げられる。ＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６は例えば放射能により標識でき、レセプター分子
と結合するＩＣＥ ＬＡＰ−６分子の数を正確に測定
し、有効なアンタゴニストの効果を評価できる。

【０１６５】有効なアンタゴニストは、小さな有機分
子、ペプチド、ポリペプチドおよび本発明のポリペプチ
ドと結合し、これによりその活性を抑制または消失させ
る抗体を包含する。有効なアンタゴニストはまた、小さ
な有機分子、ペプチド、ＩＣＥＬＡＰ−６誘発性活性を
誘導することなく、レセプター分子などの結合分子の同
じ部位に結合する密接に関連した蛋白質または抗体など
のポリペプチドであり、それにより、結合からＩＣＥ
ＬＡＰ−６を排除することによりＩＣＥ ＬＡＰ−６の
作用を防止する。

【０１６６】有効なアンタゴニストは、ポリペプチドの
結合部位に結合し、占有し、それによりレセプター分子
などの細胞結合分子との結合を防止し、その結果、正常
な生物学的活性を防止する、小さな分子を包含する。小
さな分子の例は、小さな有機分子、ペプチドまたはペプ
チド様分子を包含するが、これに限定されない。他のア
ンタゴニストは、ＩＣＥ ＬＡＰ−６に対する開裂部位
認識モチーフを含むオリゴペプチドである。

【０１６７】他の有効なアンタゴニストは、アンチセン
ス分子を包含する。アンチセンス技術は、アンチセンス
ＤＮＡまたはＲＮＡにより、あるいは三重らせんの形成
により、遺伝子発現を制御するのに用いることができ
る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏkano，Ｊ.、Ｎeur
ochem.、５６：５６０（１９９１）；OLIGODEOXYNUCLEO
TIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION，
ＣＲＣ Ｐress，ＢocaＲaton，ＦＬ（１９８８）に記載
されている。三重らせんの形成は、例えば、Ｌeeら、Ｎ
ucleic Ａcids Ｒesearch ６：３０７３（１９７９）；
Ｃooneyら、Ｓcience ２４１：４５６（１９８８）；お
よびＤervanら、Ｓcience ２５１：１３６０（１９９
１）において考察されている。方法はポリヌクレオチド
の相補ＤＮＡまたはＲＮＡに対する結合に基づく。例え
ば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドの５’コーディング部は約１０ないし４０塩基対
の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドをデザ
インするのに用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは
転写に関与する遺伝子の領域と相補的になるようデザイ
ンされ、それによりＩＣＥ ＬＡＰ−６の転写および産
生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
はｍＲＮＡとｉｎ ｖｉｖｏでハイブリッド形成し、ｍ
ＲＮＡ分子のＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリペプチド中への翻
訳を遮断する。前記したオリゴヌクレオチドはまた、ア
ンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがin vivoで発現され、
ＩＣＥ ＬＡＰ−６の産生を抑制するように細胞をデリ
バリーできる。

【０１６８】例えば、癌細胞および固体腫瘍細胞などを
含む不完全な細胞増殖を標的とするアゴニストはこれら
の病気の治療に用いられる。このような標的設定は抗体
融合を用いた遺伝子治療により達成される。アゴニスト
はまた、小胞リンパ腫、Ｐ５３突然変異に関連する癌、
自己免疫障害、例えば、ＳＬＥ、免疫介在糸球体腎炎な
ど；およびホルモン依存性腫瘍、例えば乳癌、前立腺癌
および卵巣癌など；およびウイルス性感染症、例えばヘ
ルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイル
スなどの治療に用いられる。アンタゴニストは例えば以
下に記載するような医薬上許容される担体との組み合わ
せにて用いられる。

【０１６９】アンタゴニストは、例えばＩＣＥ ＬＡＰ
−６ポリペプチドの作用を抑制するため、例えばアルツ
ハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、敗血
性ショック、敗血症、卒中、慢性炎症、急性炎症、ＣＮ
Ｓ炎症、骨粗鬆症、虚血再潅流傷害、心血管疾患に伴う
細胞死、多発性嚢胞腎病、心血管疾患における内皮細胞
のアポトーシス、変性肝炎、ＭＳ、ＡＬＳ、小脳変性、
虚血性障害、心筋梗塞、ＡＩＤＳ、脊髄形成異常症候
群、再生不能性貧血、男性型禿頭症および頭部傷害損傷
の治療に用いられる。アンタゴニストは例えば以下に記
載するような医薬上許容される担体との組み合わせにて
用いられる。

【０１７０】組成物 本発明はまた、前記のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドあるいはアゴニストまたはアンタゴニストを有して
なる組成物に関する。したがって、本発明のポリペプチ
ドは対象に対して投与するのに適した医薬担体などの、
細胞、組織または生物に関する使用についての非滅菌ま
たは滅菌担体（複数）と組み合わせて用いられる。この
ような組成物は、例えば医薬添加物または治療上有効量
の本発明のポリペプチドと医薬上許容される担体または
賦形剤を含んでなる。このような担体は、食塩水、緩衝
食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノー
ルおよびその組み合わせを包含する。処方は、投与様式
にあうものでなければならない。

【０１７１】キット 本発明はさらに、１またはそれ以上の本発明の前記組成
物の成分を充填した１またはそれ以上の容器からなる医
薬パックおよびキットに関する。 このような容器と一
緒に、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売
を制御する政府機関により処方された形態の注意書であ
って、製造業者がヒト投与用製品を使用または販売する
ことを許可したことを反映する注意書を添付できる。

【０１７２】投与 本発明のポリペプチドまたは他の化合物は単独で、また
は他の化合物、例えば治療化合物と組み合わせて用いら
れる。医薬組成物は、例えば局所、経口、肛門、膣、静
脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内経路よ
る投与を含むいずれか有効な都合のよい方法で投与され
る。

【０１７３】医薬組成物は、一般に、特定の適応症（複
数）の治療および／または予防に有効な量で投与され
る。一般に、組成物は、少なくとも１０μｇ／体重ｋｇ
の量で投与される。ほとんどの場合、一日あたり約８ｍ
ｇ／体重ｋｇを超えない量で投与する。好ましくは、ほ
とんどの場合、用量は、毎日約１０μｇ／体重ｋｇない
し約１ｍｇ／体重ｋｇである。最適用量は、各治療の種
類および適応について標準法により、その適応、重度、
投与経路、合併症などを考慮して決定されるのは明らか
である。

【０１７４】遺伝子治療 ＩＣＥ ＬＡＰ−６ポリヌクレオチド、ポリペプチド、
ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴニストは
本発明にしたがって、このようなポリペプチドのｉｎ
ｖｉｖｏでの発現により、しばしば「遺伝子治療」と称
する治療様式において用いられる。

【０１７５】このように、例えば患者からの細胞をex v
ivoでポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡな
どのポリヌクレオチドで遺伝子操作し、その遺伝子操作
をした細胞を次にポリペプチドで処置すべき患者に提供
する。例えば、細胞を本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクター
を用いてex vivoで遺伝子操作できる。このような方法
は当業界で周知であり、本発明におけるその使用は本明
細書の記載から明らかである。

【０１７６】同様に、細胞をin vivoでのポリペプチド
の発現に関して、当業界で公知の手順によりin vivoで
操作する。例えば、本発明のポリヌクレオチドを前記の
ように複製欠陥レトロウイルスベクターにおける発現用
に操作する。ついで、レトロウイルス発現構築物を単離
し、パッケージング細胞中に導入し、そのパッケージン
グ細胞が対照となる遺伝子を含有する感染性ウイルス粒
子を産生するように、本発明のポリペプチドをコードす
るＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクター
で形質導入する。これらのプロデューサー細胞を、in v
ivoにて細胞を操作し、in vivoにてポリペプチドを発現
させるために患者に投与する。このような方法によるこ
れらおよび他の本発明のポリペプチドの投与法は本発明
の教示により当業者には明らかである。

【０１７７】前記したレトロウイルプラスミドスベクタ
ーが由来するレトロウイルスは、モロニーネズミ白血病
ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例え
ば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワ
トリ白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト
免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウ
イルス、および乳房腫瘍ウイルスを包含するが、これに
限定されない。一例において、レトロウイルスプラスミ
ドベクターはモロニーネズミ白血病ウイルス由来であ
る。

【０１７８】このようなベクターはポリペプチドの発現
に関して１またはそれ以上のプロモーターを含む。用い
られる適当なプロモーターは、レトロウイルスＬＴＲ；
ＳＶ４０プロモーター；およびＭillerら、Ｂiotechniq
ues ７：９８０−９９０（１９８９）に記載されている
ＣＭＶプロモーター、または他のプロモーター（例え
ば、ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびβ−ア
クチンプロモーターを包含するがこれに限定されない真
核細胞プロモーターなどの細胞プロモーター）を包含す
るが、これに限定されない。用いられる他のウイルスプ
ロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジン
キナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウ
イルスプロモーターを包含するが、これに限定されな
い。適当なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる
教示から当業者には自明である。

【０１７９】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターの制御下にある。用いること
のできる適当なプロモーターは、アデノウイルスメジャ
ーレイトプロモーターなどのアデノウイルスプロモータ
ー；またはＣＭＶプロモーターなどのヘテロローガスプ
ロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）プロ
モーター；ＭＭＴプロモーター、メチタルチオネインプ
ロモーターなどの誘導プロモーター；熱ショックプロモ
ータ；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモータ
ー；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジン
キナーゼプロモーターなどのウイルスチミジンキナーゼ
プロモーター；レトロウイルスＬＴＲ（前記修飾レトロ
ウイルスＬＴＲを包含する）；β−アクチンプロモータ
ー；およびヒト成長ホルモンプロモーターを包含する
が、これに限定されない。プロモーターはまたポリペプ
チドをコードする遺伝子を制御するネイティブプロモー
ターであってもよい。

【０１８０】レトロウイルスプラスミドベクターをパッ
ケージング細胞系の形質導入に用いて、プロデューサー
細胞系を形成する。トランスフェクションされるパッケ
ージング細胞の例は、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ
^-２、Ｙ^-ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９^-１４Ｘ、ＶＴ^-１９^-
１７^-Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ⁺Ｅ−８６、Ｇ
Ｐ⁺ｅｎｖＡｍ１２、およびＭiller、Ｈuman Ｇene Ｔh
erapy １：５−１４頁（１９９０）に記載されているＤ
ＡＮ細胞系を包含するが、これに限定されない。ベクタ
ーはパッケージング細胞中に当業界で公知の手段により
形質導入される。このような手段は、エレクトポレーシ
ョン、リポソームの使用、およびＣaＰＯ₄沈降を包含す
るが、これに限定されない。別法として、レトロウイル
スプラスミドベクターをリポソーム中に封入するか、ま
たは脂質と結合させ、宿主に投与する。

【０１８１】プロデューサー細胞系は、ポリペプチドを
コードする核酸配列（複数）を含む感染性レトロウイル
スベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルス
ベクター粒子を用いて、真核細胞をin vitroまたはin v
ivoのいずれかで形質導入する。形質導入された真核細
胞はポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。形
質導入されてもよい真核細胞は胚幹細胞、胎生期癌細
胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細
胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞
を包含するが、これに限定されない。

【０１８２】

【実施例】

具体例実施例 以下の実施例により本発明をさらに記載する。実施例は
特定の具体例を引用して本発明を例示するためのみのも
のである。これらの例は本発明の特定の態様を説明する
ものであるが、開示された発明の範囲を制限するもので
はない。本明細書で用いるある種の用語は前記した定義
にて説明してある。あらゆる実施例は、特記しないかぎ
り、当業者に公知で慣例的な標準的技術を用いて行っ
た。以下の実施例の通常の分子生物学的技術は、［Ｓam
brookら、前掲］などの標準的実験室マニュアルに記載
されているようにして行うことができる。

【０１８３】以下の実施例における部または量はすべて
特記しないかぎり重量基準である。本明細書にて用いる
場合、「ＣＴＬ」は細胞毒性リンパ球を意味する。特記
しないかぎり、以下の実施例におけるフラグメントのサ
イズ分離は、Ｓambrookらおよび多くの他の文献、例え
ばＧoeddelら、Ｎucleic Ａcids Ｒes. ８：４０５７
（１９８０）のアガロースおよびポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準的技術を用いて行っ
た。特記しないかぎり、ライゲーションは標準的緩衝
液、インキュベーション温度および時間、ほぼ等モル量
のライゲーションされるＤＮＡフラグメントおよび０.
５μｇのＤＮＡあたり約１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ
（「リガーゼ」）を用いて行った。

【０１８４】実施例１ ヒト・ＩＣＥ ＬＡＰ−６のク
ローニング、発現および精製 要約 ＩＣＥ／ｃｅｄ−３遺伝子科の構成因子は、細胞死機序
のエフェクター成分であると考えられる。本明細書のこ
の実施例において、ＩＣＥ ＬＡＰ−６と命名されたこ
の科の新規構成因子を特徴づける。系統学的分析によ
り、ＩＣＥ ＬＡＰ−６はＣｅｄ−３亜科に分類され、
該亜科はＣｅｄ−３、Ｙａｍａ／ＣＰＰ３２／アポパイ
ン、Ｍｃｈ２およびＩＣＥ ＬＡＰ−３／Ｍｃｈ３／Ｃ
ＭＨ−１を包含する。ＩＣＥ ＬＡＰ−６は、他の科の
構成因子と共有されているＱＡＣＲＧペンタペプチドで
はなく活性部位ＱＡＣＧＧペンタペプチドを含んでい
る。ＩＣＥ ＬＡＰ−６の過剰発現は、ＭＣＦ乳癌細胞
におけるアポトーシスを誘発する。細胞毒性Ｔ細胞によ
り媒介されるアポトーシスの重要成分であるグランザイ
ムＢにより、ＩＣＥ ＬＡＰ−６は蛋白分解的にもプロ
セッシングされて活性システインプロテアーゼとなる。
ＩＣＥ ＬＡＰ−６はいったん活性化されると、死亡基
質であるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡ
ＲＰ）を開裂してサインアポトーシスフラグメントにす
ることができる。

【０１８５】ＭＣＦ７乳癌細胞中でのＩＣＥ ＬＡＰ−
６の過剰発現は、細胞死を引き起こし、推定上の触媒シ
ステイン残基の変異はそのアポトーシス能を失う。さら
にそのうえ、グランザイムＢはin vitroでＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６およびＹａｍａを直接活性化し、そのことは、グ
ランザイムＢが、いくつかのＩＣＥ／Ｃｅｄ−３科の構
成因子の活性化を通じてその細胞毒性効果を伝達するこ
とを示唆するものである。いったん活性化されると、Ｙ
ａｍａおよびＩＣＥ ＬＡＰ−６はともにＤＮＡ修復酵
素ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）
を開裂してサインアポトーシスフラグメントにすること
ができる。これらの結果を合わせると、ＩＣＥ ＬＡＰ
−６は、Ｃｅｄ−３亜科の他の構成因子と同様、アポト
ーシス機構において重要な役割を果たしている可能性が
ある。

【０１８６】ＩＣＥ ＬＡＰ−６のクローニング 確立されているＥＳＴ法（Ａdams,Ｍ.Ｄ.ら（１９９
１）Ｓcience 252，１６５１−１６５６；Ａdams,Ｍ.
Ｄ.ら（１９９２）Ｎature 355，６３２−６３４）によ
り作成されたＥＳＴを含むデータベースを検索して、Ｉ
ＣＥ ＬＡＰ−６の部分オープンリーディングフレーム
に対応したｃＤＮＡを、ＩＣＥ ＬＡｐ−３（Ｄuan,Ｈ.
ら（１９９６）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.271，３５０１３−３５
０３５）に対して相同的な配列として同定した。部分オ
ープンリーディングフレームをコードしている新規ｃＤ
ＮＡクローンを同定し、ＩＣＥ／ｃｅｄ−３遺伝子科の
構成因子との配列相同性を示した。２２個のポジティブ
クローンのうち、６個のクローンが、１２５２塩基対の
オープンリーディングフレームを含む２.３ｋｂのｃＤ
ＮＡを生じ、そのオープンリーディングフレームは、Ｉ
ＣＥ ＬＡＰ−６と命名された推定分子量４５.８ｋＤの
新規蛋白質をコードしていた（図１参照）。推定上のイ
ニシエーターメチオニン（ＧＣＣＡＴＧＧ；Ｍｅｔコド
ンに下線を付した）は、一致が得られている翻訳開始に
関するＫozakの配列（Ｋozak,Ｍ.（１９８９）Ｊ Ｃell
Ｂiol 108，２２９−２４１）と一致した。このクロー
ンは、ＩＣＥ ＬＡＰ−６のＣ末端の３００個のアミノ
酸をコードしているオープンリーディングフレームを含
んでいる。オリゴ−ｄ（Ｔ）によりプライミングされた
ヒト・慢性骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２のｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングすることにより全長のｃＤＮ
Ａｓを得た。ＰＣＲにより得られた、ＩＣＥＬＡＰ−６
のオープンリーディングフレームのヌクレオチド６１５
から９４０までに対応する³²Ｐ標識ＤＮＡフラグメント
を用いて、約１Ｘ１０⁶個の形質転換体をスクリーニン
グした（Ｓambrook,Ｊ.ら（１９８９）Ｍolecular Ｃlo
ning：ＡＬaboratory Ｍanual，Ｓecond Ｅdition，Ｃo
ld Ｓpring Ｈarbor ＬaboratoryＰress，Ｎew Ｙor
k）。修飾Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓequence，Ｕnit
edＳtates Ｂiochemical Ｃorporation）を用いるジデ
オキシ連鎖終結法により、２本鎖ＤＮＡの配列決定を行
った。ＤＮＡＳＴＡＲ Ｍegalianソフトウェアを用いて
配列の併置比較を行った。

【０１８７】ノーザンブロット ライブラリースクリーニングに使用したのと同じ³²Ｐ標
識ＩＣＥ ＬＡＰ−６プローブを用いて、製造者の指示
に従って、成人およびヒト・胎児の複数組織のノーザン
ブロット（Clontech）の分析物をハイブリダイゼーショ
ンさせた。

【０１８８】発現ベクター ＰＣＲによりＦＬＡＧタグを付したＣ末端（ＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６ ｆｌａｇ）またはＨｉｓ６タグを付したＣ末
端（ＩＣＥ ＬＡＰ−６ Ｈｉｓ）を得て、哺乳動物発現
ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉnvitrogen）中にサブクロー
ンした。５’ＰＣＲプライマー（ＧＡＡＣＧＧＧＧＴＡ
ＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＧＣＧＧＡＴＣＧＧＣ）
［配列番号：５］はＫｐｎＩ制限部位を含み、２個の
３’プライマー（ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＴ
ＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴ
ＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡＧ）
［配列番号：９］または（ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧ
ＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＡＴＧＴＴＴ
ＴＡＡＡＧＡＡＡＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＧＧＡＧ）［配
列番号：６］は、それぞれＦＬＡＧエピトープタグ（Ｄ
ＹＫＤＤＤＤＫ）またはＨｉｓ６タグをコードしてい
た。４プライマーＰＣＲに基づく方法（Higuchi,R/.et
al(1988)Nucleis Acids Research 16,7351-7367）を用
いる部位特異的突然変異法により、活性部位システイン
２８６のアラニンへの変更を行った。変異原性オリゴヌ
クレオチドはＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧ
ＣＣＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣ［配列
番号：７］およびＧＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣ
ＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＣ［配列
番号：８］であった。誘導された変異の存在およびＰＣ
Ｒ複製の忠実度を配列分析により確認した。

【０１８９】アポトーシスアッセイ ＭＣＦ７乳癌細胞を前に記載されているように（Ｃhinn
aiya,Ａ.Ｍ.ら（１９９５）Ｃell ８１，５０５−５１
２）一時的にトランスフェクションした。簡単には、
２．５ｘ１０⁵個のＭＣＦ７細胞を０.２５マイクロｇの
レセプタープラスミドｐＣＭＶベータガラクトシダーゼ
＋１マイクロｇの試験プラスミドと一緒に製造主の指示
により、リポフェクタミンを用いて６−ウェル組織培養
皿にてトランスフェクションした。トランスフェクショ
ンは１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ最小培地（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ）中で実施し、５時間後、１ｍｌの血清含有の生
長培地を加えた。２日後、細胞を０．５％グルタルアル
デヒドで固定し、４時間、Ｘ−ｇａｌで染色した。細胞
を位相差顕微鏡で可視化した。少なくとも３００のベー
タ−ガラクトシダーゼ−ポジティブ細胞を各トランスフ
ェクション（ｎ＝３）について計数し、丸くなる、凝集
するまたは皿から離れるを包含するアポトーシスを受け
ている吸着細胞の典型的な形態学的変形に基づきアポト
ーシスまたは非アポトーシスを同定した（Ｃohen,Ｊ.
Ｊ.（１９９３）Immunology Today １４，１２６−１３
０）。Ｈｉｓ６−タグを付したＹａｍａおよびＨis６−
タグを付したＩＣＥ ＬＡＰ−６および３５Ｓ−標識Ｙ
ａｍａおよびＩＣＥ ＬＡＰ−６蛋白質の発現または精
製を、製造主の指示に従ってＴＮＴキット（Ｐromega）
を用いてin vivoにおけるトランスクリプション／翻訳
により行った；鋳型プラスミドはＩＣＥ ＬＡＰ−６ Ｈ
isおよびＹａｍａ Ｈisであった（Ｔewari,Ｍ.ら（１９
９５）Ｃell ８１，８０１−８０９）。翻訳された蛋白
質を、前に記載されているようにクロマトグラフィーに
より精製した（Ｔewari,Ｍ.ら（１９９５）Ｃell８１，
８０１−８０９）。グランザムＢ精製のin vitroにて翻
訳されたプロ−ＩＣＥ ＬＡＰ−６またはプロ−Ｙａｍ
ａによるＩＣＥ ＬＡＰ−６およびＹａｍａの活性化
は、前に記載されているように（Ｑuan,Ｌ.Ｔ.ら（１９
９６）ＰＮＡＳ ９３，Ｉn Ｐress）。インキュベート
することによりなされる。簡単には、４８ｍｌの３５Ｓ
−標識蛋白質を２０ピコモルの精製グランザイムＢ（２
２）と総容量５０マイクロリットルにてインキュベート
した。４時間後、２０ｍｌの反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の分析用に取り出した。５２０ピコモルの抗−ＧｒａＢ
（Ｑuan,Ｌ.Ｔ.ら（１９９６）ＰＮＡＳ ９３，Ｉn Ｐr
ess）を反応混合物の残りに加え、グランザイムＢ活性
を中和した。１５分間インキュベートした後、１ｍｌ
（１５０ｍｇ）の精製したＰＡＲＰ（Ｔewari,Ｍ.ら
（１９９５）Ｃell ８１，８０１−８０９）を加え、反
応を２時間行った。ＰＡＲＰだけまたはＰＡＲＰ＋グラ
ンザイムＢおよび抗−ＧｒａＢを含有する対照反応を、
ＹａｍａまたはＩＣＥ ＬＡＰ−６を添加しないことを
除き、同じ条件下で行った。反応混合物は５０ｍＭ Ｈe
pes（ｐＨ７.４）、０.１Ｍ ＮaＣl，０.１％ＣＨＡＰs
および１０％シュークロースを有した。すべてのインキ
ュベーションを１０ｍＭ ＤＴＴ中３７℃で実施した。
前に記載されているように（Ｔewari,Ｍ.ら（１９９
５）Ｃell ８１，８０１−８０９）、抗−ＰＡＲＰモノ
クローナル抗体Ｃ２−１０でイムノブロットすることに
より分析した。

【０１９０】ＩＣＥ ＬＡＰ−６はＩＣＥ／ｃｅｄ−３
遺伝子科の新規な構成因子である ＧenＢankの蛋白質のデータベースを研究することで、
ＩＣＥ ＬＡＰ−６の推定されたアミノ酸配列が、特に
ＩＣＥの活性サブユニットに対応する領域にて、ＩＣＥ
／Ｃed−３科の構成因子と著しい類似性を有することが
わかった（Ｔhornberry,Ｎ.Ａ.ら（１９９２）Ｎature
３５６，７６８−７７４）。この領域にて、ＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６はセノラブディティス・エレガンスＣＥＤ−３
蛋白質と３１％の配列同一性（５５％配列類似性）を、
ＩＣＥ−ＬＡＰ３と３３％同一性（５２％配列類似性）
を、Ｍｃｈ２ａと３０％同一性（５６％類似性）を、お
よびＹａｍａと２９％配列同一性（５２％類似性）を共
有する。ＩＣＥ ＬＡＰ−６はまた、ＩＣＥおよびＩＣ
Ｅ関連遺伝子、ＩＣＥ rel ＩＩおよびＩＣＥ rel ＩＩ
Ｉと２５−２８％の配列同一性を有する。ＩＣＥ／ｃｅ
ｄ−３の系統発生的分析は、ＩＣＥ ＬＡＰ−６がＹａ
ｍａ、ＩＣＥ−ＬＡＰ３およびＭｃｈ２を含むＣｅｄ−
３亜科の構成因子であることを明らかにした（図６）。
Ｃｅｄ−３と同様に、ＩＣＥ ＬＡＰ−６は長いＮ−末
端推定プロドメインを含有する。ＩＣＥのＸ−線結晶構
造に基づき（Ｗalker,Ｎ.Ｐ.ら、（１９９４）Ｃell ７
８，３４３−３５２；Ｗilson，Ｋ.Ｐ.ら（１９９４）
Ｎature ３７０，２７０−２７５）、ＩＣＥのアミノ酸
残基Ｈｉｓ２３７、Ｇｌｙ２３８およびＣｙｓ２８５は
触媒作用に関連し、一方残基Ａｒｇ１７９、Ｇｌｎ２８
３およびＡｒｇ３４１はＰ１アスパラギン酸のカルボン
酸側鎖のための結合ポケットを形成する。これらの６個
の残基はこのようにクローンされたすべてのＩＣＥ／Ｃ
ｅｄ−３科の構成因子にて、ならびにＩＣＥ ＬＡＰ−
６に保存されている。しかし、Ｐ２−Ｐ４結合ポケット
を形成する残基は、科の構成因子の間に広範囲に保存さ
れておらず、このことはその残基が基質特異性を決定す
るかもしれないことを示唆する。意外にも、ＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６は、他の科構成因子により共有されているＱＡ
ＣＲＧの代わりに、独特な活性部位のペンタペプチドＱ
ＡＣＧＧを含有する（図２）。

【０１９１】ＩＣＥ ＬＡＰ−６の分布 ノーザンブロット分析により、ＩＣＥ ＬＡＰ−６が種
々のヒト組織にて構成的に発現されることがわかった。
２個のＩＣＥ ＬＡＰ−６ｍＲＮＡトランスクリプトが
見つかった。２．３キロ塩基のトランスクリプトがＫ５
６２ライブラリーより単離されたｃＤＮＡクローンに対
応する。約３ｋｂである他のトランスクリプトは別にス
プライスされたＩＣＥ ＬＡＰ−６イソフォームである
と考えられる。

【０１９２】ＭＣＦ７細胞中のＩＣＥ ＬＡＰ−６の過
剰発現はアポトーシスを誘発する ＩＣＥ ＬＡＰ−６の機能的役割を研究するために、Ｍ
ＣＦ７乳癌細胞を完全長のＩＣＥ ＬＡＰ−６蛋白質
（ＩＣＥ ＬＡＰ−６−ｆｌａｇ）をコードする発現ベ
クターで一過的にトランスフェクションし、つづいてア
ポトーシス特性について評価した。他のＩＣＥ／Ｃｅｄ
−３科の構成因子と同様、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の発現は
細胞死を引き起こした（図７）。

【０１９３】ＭＣＦ７細胞におけるＩＣＥ ＬＡｐ６の
過剰発現はアポトーシスを誘導する ＩＣＥ ＬＡＰ−６の機能的役割を研究するために、全
長のＩＣＥ ＬＡＰ−６蛋白（ＩＣＥ ＬＡＰ−６−フラ
ッグ）をコードしている発現ベクターでＭＣＦ７乳癌細
胞を一時的にトランスフェクションし、次いで、アポト
ーシス特性について評価した。他のＩＣＥ／Ｃｅｄ−３
科の構成因子と同様に、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の発現は細
胞死を引き起こした（図７）。ＩＣＥ ＬＡＰ−６でト
ランスフェクションされたＭＣＦ７細胞は、アポトーシ
スを受けている付着細胞に典型的な形態学的変化を示
し、丸く密になり、ディッシュから脱離した。ＩＣＥ
ＬＡＰ−６により誘導されたアポトーシスは、広スペク
トルＩＣＥ阻害剤ｚ−ＶＡＤｆｍｋにより阻害された
（Ｐronk,Ｇ.Ｊ.,（１９６６）Ｓcience 271，８０８−
８１０）。ＩＣＥの触媒Ｃｙｓ２８５に対応しているア
ミノ酸残基Ｃｙｓ２８６がアポトーシス活性に必須であ
るかどうかを決定するために、システイン残基がアラニ
ンに変化しているＩＣＥ ＬＡＰ−６由来の変異種を得
た。本明細書の他の場所に記載したようにして、リポー
ター遺伝子β−ガラクトシダーゼおよびＣ末端にフラッ
グタグを付したＩＣＥ ＬＡＰ−６（触媒システイン残
基が不活性化されている変異バージョン（ＩＣＥ ＬＡ
Ｐ−６ ｍｔ））またはＩＣＥでＭＣＦ７乳癌細胞を一
時的にトランスフェクションした。アポトーシス細胞の
パーセント値は３つの独立した実験から得た平均値であ
る。予想したように、ＩＣＥＬＡＰ−６由来の変異種の
過剰発現はＭＣＦ７細胞におけるアポトーシス変化を誘
導しなかった（図７）。さらにそのうえ、これらの結果
は、活性部位ＱＡＣＧＧペンタペプチドを有するＩＣＥ
／Ｃｅｄ−３ファミリーのメンバーはやはりアポトーシ
ス誘導能を有している可能性があり、おそらく酵素活性
を有している可能性がある。

【０１９４】グランザイムＢによるＩＣＥ ＬＡＰ−６
の蛋白分解活性化 ＩＣＥ／Ｃｅｄ−３遺伝子ファミリーのメンバーはプロ
酵素と同様に合成され、特定のアスパラギン酸残基にお
ける蛋白分解的開裂により活性化されてヘテロダイマー
酵素を生じる。ＩＣＥにおいて、この開裂はプロドメイ
ンを除去し、ｐ２０およびｐ１０サブユニットからなる
ヘテロダイマー複合体を生じる（Ｔhornberry,Ｎ.Ａ.ら
（１９９２）Ｎature 356，７６８−７７４）。同様
に、活性化されたＹａｍａは２個のサブユニットｐ１７
およびｐ１２からなり、それらは３２ｋＤのプロ酵素に
由来する（Ｎicholson,Ｄ.Ｗ.ら（１９９５）Ｎature 3
76，３７−４３）。死のシグナルがＩＣＥ／Ｃｅｄ−３
科の構成因子を活性化する機構はほとんど理解されてい
ない。しかしながら、グランザイムＢに関する最近の研
究により、細胞毒性Ｔ細胞はこの分泌セリンプロテアー
ゼを用いてＩＣＥ／Ｃｅｄ−３科の構成因子を直接活性
化しうることが示唆されている。グランザイムＢは蛋白
分解的にプロ−Ｙａｍａを活性化し、死の基質ＰＡＲＰ
を開裂して特徴的フラグメントにすることができること
が示されている（Ｄarmon,Ａ.Ｊ.ら（１９９５）Ｎatur
e 377，４４６−４４８）。対照的に、ＩＣＥはグラン
ザイムＢにより開裂されるが、活性化されない。かくし
て、ＩＣＥ１ ＬＡＰ−６がグランザイムＢの基質とし
て役立つかどうかが決定された。インビトロ転写／翻訳
によりＨｉｓ６タグを付したＩＣＥ ＬＡＰ−６および
Ｙａｍａを得て、次いで、本明細書の他の場所に記載の
ごとくＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーにより
精製した。精製されたインビトロ翻訳プロ−ＩＣＥ Ｌ
ＡＰ−６またはプロ−Ｙａｍａを精製グランザイムＢ
（Ｈanna,Ｗ.Ｌ.ら（１９９３）Ｐrotein Ｅxpr Ｐurif
4，３９８−４０４；Ｑuan,Ｌ.Ｔ.ら（１９９５）Ｊou
rnal of Ｂiological Ｃhemistry 270，１０３７７−１
０３７９）とともにインキュベーションした。３７℃で
４時間後、ＩＣＥ ＬＡＰ−６を蛋白分解的にプロセッ
シングして３つのフラグメントにした。２つの低分子バ
ンドはＩＣＥ ＬＡＰ−６の活性サブユニットを示し、
活性Ｙａｍａのｐ１７およびｐ１２サブユニットに対応
する。３２ｋＤａのバンドは中間体のようであり、その
中においてプロ−ドメインのみが除去される（類似の中
間体がＩＣＥ ＬＡＰ−３の活性化において得られる）
（Ｄuan,Ｈ.ら（１９９６）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.271，３５
０１３−３５０３５；Ｃhinnaiyan,Ａ.Ｍ.ら（１９９
６）Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry 271，４５７
３−４５７６）。次に、グランザイムＢにより媒介され
るＩＣＥ ＬＡＰ−６の開裂を、ＰＡＲＰの開裂に関す
るアッセイにより、活性酵素の生成についてアッセイし
た。ＰＡＲＰは多くの形態のアポトーシスの間に分解さ
れ、関与する酵素はＩＣＥ／Ｃｅｄ−３ファミリーのも
のであるらしい。グランザイムＢによるＰＡＲＰの直接
開裂の可能性を排除するために、グランザイムＢにより
プロセッシングされたＩＣＥ ＬＡＰ−６およびＹａｍ
ａをグランザイムＢの選択的阻害剤（抗−ＧｒａＢ）と
ともにインキュベーションした。ＰＡＲＰ開裂能により
調べた場合、グランザイムＢによりプロセッシングされ
たＹａｍａおよびＩＣＥ ＬＡＰ−６は両方とも活性を
有していた。ＩＣＥとは異なり、ＩＣＥ ＬＡＰ−６お
よびＣｅｄ−３サブファミリーの他のメンバーは、ＰＡ
ＲＰを開裂してシグネチャーアポトーシスフラグメント
にする能力を有している（Ｔewari,Ｍ.ら（１９９５）
Ｃell 81，８０１−８０９；Ｆernandes-Ａlnemri,Ｔ.
ら（１９９４）Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.269，３０７６１−３０
７６４；Ｎicholson,Ｄ.Ｗ.ら（１９９５）Ｎature 37
6，３７−４３；Ｆernandes-Ａlnemri,Ｔ.ら（１９９
５）Ｃancer Ｒesearch 55，６０４５−６０５２；Ｌip
pke,Ｊ.Ａ.ら（１９９６）Ｔhe Ｊournal of Ｂiologic
al Ｃhemistry 271，１８２５−１８２８；Ｆernandes-
Ａlnemri,Ｔ.ら（１９９５）Ｃancer Ｒes 55 ２７３７
−２７４２）。

【０１９５】システインプロテアーゼのＩＣＥ／Ｃｅｄ
−３科の新規構成因子が本発明により提供される。ＩＣ
Ｅ ＬＡｐ−６はユニークな活性部位ＱＡＣＧＧペンタ
ペプチドを有しており、Ｃｅｄ−３およびＹａｍａに最
も関連性のある亜科に分類される。哺乳動物細胞におけ
るＩＣＥ ＬＡＰ−６の異所発現はアポトーシスを引き
起こす。

【０１９６】重要なことに、Ｙａｍａと同様にＩＣＥ
ＬＡＰ−６はグランザイムＢによりインビトロで直接活
性化され、そのことは、細胞毒性Ｔ細胞が、感受性のあ
る標的細胞において１種以上のＩＣＥ／Ｃｅｄ−３科の
構成因子を活性化することによりアポトーシスを媒介し
うることを示唆する。Ｙａｍａ、ＩＣＥ−ＬＡＰ３およ
び今回のＩＣＥ ＬＡＰ−６は、アポトーシス刺激によ
り蛋白分解的に活性化されることが示された。

【０１９７】実施例２ ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６の遺伝
子治療的発現 線維芽細胞を被験者から皮膚生検により得る。得られた
組織を組織培地中に置き、小片に分ける。組織片を組織
培養フラスコの濡れた表面上におき、各フラスコ中およ
そ１０片をおく。フラスコを上下を逆さまにし、しっか
り蓋をし、室温で一夜放置する。室温で２４時間後、フ
ラスコの上下を逆にすると、組織片はフラスコの底に着
いたままであり、新しい培地（例えば、１０％ ＦＢ
Ｓ、ぺニシリンおよびストレプトマイシンを含むＨａｍ
Ｆ１２培地）を添加する。組織を次に３７℃で約１週間
インキュベートする。この時点で、新しい培地を添加
し、その後、数日ごとに換える。培地中でさらに２週間
後、単層の線維芽細胞が現れる。単層をトリプシン化
し、大きなフラスコに移す。

【０１９８】遺伝子治療用ベクターを、発現されるフラ
グメントのクローニング用制限酵素で消化する。自己ラ
イゲーションを防ぐために、消化されたベクターを子ウ
シ腸ホスファターゼで処理する。脱ホスホリル化直線状
ベクターをアガロースゲル上で分画し、精製する。活性
なＩＣＥ ＬＡＰ−６を発現できるＩＣＥ ＬＡＰ−６ｃ
ＤＮＡを単離する。必要ならば、ベクター中にクローニ
ングするためにフラグメントの端を修飾する。例えば、
５’オーバーハンギングをＤＮＡポリメラーゼで処理し
て、平滑末端を形成する。Ｓ１ヌクレアーゼを用いて、
３’オーバーハンギングを除去する。リンカーをＰＡＲ
ＰＴ４ＤＮＡリガーゼで平滑末端にライゲーションす
る。

【０１９９】等量のモロニーネズミ白血病ウイルス直線
状主鎖およびＩＣＥ ＬＡＰ−６フラグメントを混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させる。ライゲー
ション混合物をイー・コリの形質転換に用い、細菌を寒
天含有カナマイシン上に接種する。カナマイシン表現型
および制限分析によりベクターが適当に挿入された遺伝
子の性質を有することを同定する。

【０２００】パッケージング細胞を１０％子ウシ血清
（ＣＳ）、ぺニシリンおよびストレプトマイシンを含む
ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中融合濃度に
組織培地中で増殖させる。ＩＣＥ ＬＡＰ−６遺伝子を
含有するベクターを標準的技術により、パッケージング
細胞中に導入する。ＩＣＥ ＬＡＰ−６遺伝子を含有す
る感染性ウイルス粒子をパッケージング細胞から集め、
これをプロデューサー細胞と称する。

【０２０１】新しい培地をプロデューサー細胞に添加
し、適当なインキュベーション期間の後、融合プロデュ
ーサー細胞のプレートから収穫する。感染性ウイルス粒
子を含有する培地をミニポアフィルターを通して濾過
し、外れたプロデューサー細胞を除去する。濾過した培
地を次に線維芽細胞を感染させるのに用いる。培地を線
維芽細胞の準融合プレートから除去し、濾過した培地と
素早く置換する。ポリブレン（Ａldrich）を培地中に加
えて形質導入を促進する。適当なインキュベーションの
後、培地を除去し、新しい培地で置き換える。ウイルス
価が高い場合、実質的にすべての線維芽細胞が感染し、
選択は必要ない。力価が低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓ
などの選択マーカーを有するレトロウイルスを用いて形
質導入された細胞を増大用に選択する必要がある。

【０２０２】操作された線維芽細胞をラットに単独また
はシトデックス３ビーズなどのミクロキャリアビーズ上
で融合状態に増殖させた後にラットに注射する。注射し
た線維芽細胞はＩＣＥ ＬＡＰ−６産物を精製し、蛋白
質の生物学的作用を宿主に伝達する。

【０２０３】本発明は前記記載事項および実施例に記載
した以外の方法でも実施できることは明らかである。本
発明の種々の修飾および変更が前記内容のもとで可能で
あり、したがって、添付する請求の範囲内である。

【０２０４】

【配列表】

（１）一般的情報： （i）出願人：ウェイ−ウ ヘ、クリスティン・ケイ・キ
クニー、ビシュバ・エム・デォキシット、スティーブン
・エム・ルーベン （ii）発明の名称： インターロイキン−１ベータ転換
酵素様アポプトシス性プロテアーゼ−６ （iii）配列の数：９ （iv）連絡先： （Ａ）名称：スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ
ション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：１９４０６−２７９９ （v）コンピューター読取り可能な形態： （Ａ）媒体形態：ディスケット （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＦastＳＥＱバージョン１.５ （vi）現出願データ： （Ａ）出願番号：不明 （Ｂ）出願日：不明 （Ｃ）分類： （vii）先の出願データ （Ａ）出願番号：６０／０１８,９６１ （Ｂ）出願日：１９９６年６月５日 （Ａ）出願番号：６０／０２０,３４４ （Ｂ）出願日：１９９６年５月２３日 （Ａ）出願番号：６０／０１７,９４９ （Ｂ）出願日：１９９６年５月２０日 （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名：ハン，ウィリアム・テイ （Ｂ）登録番号：３４,３４４ （Ｃ）代理人等における処理番号：Ｐ５０４８３−２ （ix）テレコミュニケーションの情報： （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５２１９ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０ （Ｃ）テレックス：

【０２０５】（２） 配列番号：１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４１６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型：Ｎ−末端 （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：１： Met Asp Glu Ala Asp Arg Arg Leu Leu Arg Arg Cys Arg Leu Arg Leu 1 5 10 15 Val Glu Glu Leu Gln Val Asp Gln Leu Trp Asp Val Leu Leu Ser Arg 20 25 30 Glu Leu Phe Arg Pro His Met Ile Glu Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Arg Arg Asp Gln Ala Arg Gln Leu Ile Ile Asp Leu Glu Thr 50 55 60 Arg Gly Ser Gln Ala Leu Pro Leu Phe Ile Ser Cys Leu Glu Asp Thr 65 70 75 80 Gly Gln Asp Met Leu Ala Ser Phe Leu Arg Thr Asn Arg Gln Ala Gly 85 90 95 Lys Leu Ser Lys Pro Thr Leu Glu Asn Leu Thr Pro Val Val Leu Arg 100 105 110 Pro Glu Ile Arg Lys Pro Glu Val Leu Arg Pro Glu Thr Pro Arg Pro 115 120 125 Val Asp Ile Gly Ser Gly Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser 130 135 140 Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile Leu Ser Met Glu Pro Cys 145 150 155 160 Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly 165 170 175 Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg 180 185 190 Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr 195 200 205 Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Arg Gln Asp His 210 215 220 Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln 225 230 235 240 Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys 245 250 255 Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys 260 265 270 Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly 275 280 285 Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu 290 295 300 Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln 305 310 315 320 Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro 325 330 335 Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val 340 345 350 Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp 355 360 365 Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu 370 375 380 Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met 385 390 395 400 Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser 405 410 415

【０２０６】（２） 配列番号：２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１５７８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型： （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：２： GCCATGGACG AAGCGGATCG GCGGCTCCTG CGGCGGTGCC GGCTGCGGCT GGTGGAAGAG 60 CTGCAGGTGG ACCAGCTCTG GGACGTCCTG CTGAGCCGCG AGCTGTTCAG GCCCCATATG 120 ATCGAGGACA TCCAGCGGGC AGGCTCTGGA TCTCGGCGGG ATCAGGCCAG GCAGCTGATC 180 ATAGATCTGG AGACTCGAGG GAGTCAGGCT CTTCCTTTGT TCATCTCCTG CTTAGAGGAC 240 ACAGGCCAGG ACATGCTGGC TTCGTTTCTG CGAACTAACA GGCAAGCAGG AAAGTTGTCG 300 AAGCCAACCC TAGAAAACCT TACCCCAGTG GTGCTCAGAC CAGAGATTCG CAAACCAGAG 360 GTTCTCAGAC CGGAAACACC CAGACCAGTG GACATTGGTT CTGGAGGATT CGGTGATGTC 420 GGTGCTCTTG AGAGTTTGAG GGGAAATGCA GATTTGGCTT ACATCCTGAG CATGGAGCCC 480 TGTGGCCACT GCCTCATTAT CAACAATGTG AACTTCTGCC GTGAGTCCGG GCTCCGCACC 540 CGCACTGGCT CCAACATCGA CTGTGAGAAG TTGCGGCGTC GCTTCTCCTC GCTGCATTTC 600 ATGGTGGAGG TGAAGGGCGA CCTGACTGCC AAGAAAATGG TGCTGGCTTT GCTGGAGCTG 660 GCGCGGCAGG ACCACGGTGC TCTGGACTGC TGCGTGGTGG TCATTCTCTC TCACGGCTGT 720 CAGGCCAGCC ACCTGCAGTT CCCAGGGGCT GTCTACGGCA CAGATGGATG CCCTGTGTCG 780 GTCGAGAAGA TTGTGAACAT CTTCAATGGG ACCAGCTGCC CCAGCCTGGG AGGGAAGCCC 840 AAGCTCTTTT TCATCCAGGC CTGTGGTGGG GAGCAGAAAG ACCATGGGTT TGAGGTGGCC 900 TCCACTTCCC CTGAAGACGA GTCCCCTGGC AGTAACCCCG AGCCAGATGC CACCCCGTTC 960 CAGGAAGGTT TGAGGACCTT CGACCAGCTG GACGCCATAT CTAGTTTGCC CACACCCAGT 1020 GACATCTTTG TGTCCTACTC TACTTTCCCA GGTTTTGTTT CCTGGAGGGA CCCCAAGAGT 1080 GGCTCCTGGT ACGTTGAGAC CCTGGACGAC ATCTTTGAGC AGTGGGCTCA CTCTGAAGAC 1140 CTGCAGTCCC TCCTGCTTAG GGTCGCTAAT GCTGTTTCGG TGAAAGGGAT TTATAAACAG 1200 ATGCCTGGTT GCTTTAATTT CCTCCGGAAA AAACTTTTCT TTAAAACATC ATAAGGCCAG 1260 GGCCCCTCAC CCTGCCTTAT CTTGCACCCC AAAGCTTTCC TGCCCCAGGC CTGAAAGAGG 1320 CTGAGGCCTG GACTTTCCTG CAACTCAAGG ACTTTGNAGC CGGCACAGGG TCTGCTCTTT 1380 CTCTGCCAGT GACAGACAGG CTCTTAGCAG CTTCCAGATT GACGACAAGT GCTGAACAGT 1440 GGAGGAAGAG GGACAGATGA ATGCCGTGGA TTGCACGTGG NCTCTTGAGC AGTGGCTGGT 1500 CCAGGGCTAG TGACTTGGTG TCCCATGATC CCTGTGTTGG TCTCTAGGAG CAGGGATTAA 1560 CCTCTGCACT ACTGACAT 1578

【０２０７】（２） 配列番号：３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型： （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：３： CTGACTGCCA AGAAAATGGT GCTGGCTTTG CTGGAGCTGG CGCGGCAGGA CCACGGTGCT 60 CTGGACTGCT GCGTGGTGGT CATTCTCTCT CACGGCTGTC AGGCCAGCCA CCTGCAGTTC 120 CCAGGGGCTG TCTACGGCAC AGATGGATGC CCTGTGTCGG TCGAAAAGAT TGTGAACATC 180 TTCAATGGGA CCAGCTGCCC CAGCCTGGGA GGGAAGCCCA AGCTCTTTTT CATCCAGGCC 240 TGTGGTGGGG AGCAGAAAGA CCATGGGTTT GAGGTGGCCT CCACTTCCCC TGAAGACGAG 300 TCCCCTGGCA GTAACCCCGA GCCAGATGCC ACCCCGTTCC AGGAAGGTTT GAGGACCTTC 360 GACCAGCTGG ACGCCATATC TAGTTTGCCC ACACCCAGTG ACATCTTTGT GTCCTACTCT 420 ACTTTCCCAG GTTTTGTTTC CTGGAGGGAC CCCAAGAGTG GCTCCTGGTA CGTTGAGACC 480 CTGGACGACA TCTTTGAGCA GTGGGCTCAC TCTGAAGACC TGCAGTCCCT CCTGCTTAGG 540 GTCGCTAATG CTGTTTCGGT GAAAGGGATT TATAAACAGA TGCCTGGTTG CTTTAATTTC 600 CTCCGGAAAA AACTTTTCTT TTAAAACATC ATAAGGCAG 639

【０２０８】（２） 配列番号：４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型：Ｎ−末端 （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：４： Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Arg Gln Asp His Gly Ala Leu 1 5 10 15 Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His 20 25 30 Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser 35 40 45 Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu 50 55 60 Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln 65 70 75 80 Lys Asp His Gly Phe Glu Val Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser 85 90 95 Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu 100 105 110 Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser 115 120 125 Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg 130 135 140 Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe 145 150 155 160 Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val 165 170 175 Ala Asn Ala Val Ser Val Lys Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys 180 185 190 Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys Leu Phe Phe Met 195 200

【０２０９】（２） 配列番号：５の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型： （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：５： GAACGGGGTA CCGCCATGGA CGAAGCGGAT CGGC 34

【０２１０】（２） 配列番号：６の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型： （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：６： TGCTCTAGAT TAGTGGTGGT GGTGGTGGTG TGATGTTTTA AAGAAAAGTT TTTTCCGGAG 60

【０２１１】（２） 配列番号：７の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型： （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：７： AAGCTCTTTT TCATCCAGGC CGCGGGTGGG GAGCAGAAGA C 41

【０２１２】（２） 配列番号：８の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型： （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：８： GTCTTTCTGC TCCCCACCCG CGGCCTGGAT GAAAAAAGC 39

【０２１３】（２） 配列番号：９の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：６６塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （iii）仮定：なし （iv）アンチセンス：なし （v）フラグメントの型： （vi）供給源： （xi）配列の記載：配列番号：９： TGCTCTAGAT TACTTGTCAT CGTCGTCCTT GTAGTCTGAT GTTTTAAAGT TAAGTTTTTT 60 CCGGAG 66

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６の推定アミノ酸配列
を示す（配列番号：１）。活性部位のペンタペプチドＱ
ＡＣＧＧに下線を付す。推定アミノ酸（Ａｓｐ）切断部
位を太文字で示す。

【図２】 哺乳動物ＩＣＥ／ｃｅｄ−３科およびセノラ
ブディティス・エレガンス遺伝子Ｃｅｄ−３の公知構成
因子の配列を示す。ペンタペプチドＱＡＣＲＧを枠で囲
う。ＩＣＥのＸ−線結晶構造に基づき、触媒作用に関与
する保存残基を●で示し；▲はＰ１ Ａｓｐのカルボキ
シレートについての結合ポケットを表し；■はＰ２−Ｐ
４アミノ酸に隣接する残基を示す。

【図３】 ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６の核酸配列を示す
（配列番号：２）。

【図４】 ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６由来の変異体の核酸
配列を示す（配列番号：３）。

【図５】 ヒトＩＣＥ ＬＡＰ−６由来の変異体のアミ
ノ酸配列を示す（配列番号：４）。

【図６】 ＩＣＥ／ｃｅｄ−３遺伝子科の系統発生学的
分析を示す。

【図７】 ＭＣＦ７細胞にて、ＩＣＥ ＬＡＰ−６の過
剰発現が哺乳動物細胞にて細胞死を誘発することを示す
一時的にトランスフェクションされた乳癌細胞の分析結
果を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＤＳ Ｃ０７Ｋ 16/40 48/00 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ０７Ｋ 14/47 9/99 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＡＢ 9/64 ＡＢＸ 9/99 ＡＤＺ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 597034358 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・イ ンコーポレイテッド ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＯＭＥ ＳＣＩＥＮＣ ＥＳ， ＩＮＣ. アメリカ合衆国20850−3338メリーランド 州ロックビル、キー・ウエスト・アベニュ ー9410番 (71)出願人 597087206 ユニバーシティ・オブ・ミシガン ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＣＨＩ ＧＡＮ アメリカ合衆国48109−1280ミシガン州ア ナーバー、サウス・ステイト・ストリート 3003番 ウルバリーン・タワー2071 (72)発明者 ビシュバ・エム・ディキシット アメリカ合衆国48105ミシガン州アナーバ ー、ペッパー・パイク1300番 (72)発明者 ウェイ−ウー・ヘ アメリカ合衆国21045メリーランド州コロ ンビア、フリー・ストーン・コート6225番 (72)発明者 クリスティン・ケイ・キクリー アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州リ ンフィールド、リメリック・センター・ロ ード499番 (72)発明者 スティーブン・エム・ルーベン アメリカ合衆国20832メリーランド州オー ルニ、ヘリテイジ・ヒルズ・ドライブ 18528番

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）配列番号１のアミノ酸を含むポリペ
   プチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０
   ％の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレ
   オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
   とも１５個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群よ
   り選択される構成員を有してなる単離ポリヌクレオチ
   ド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである請求項
   １記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１に示すアミノ酸を有してなる
   ポリペプチドをコードする請求項２記載のポリヌクレオ
   チド。
5. 【請求項５】（ａ）配列番号２のヒトＤＮＡにより発現
   される同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレ
   オチドと少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレ
   オチド； （ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレ
   オチド；および （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドの少なく
   とも１５個の塩基を含むポリヌクレオチドからなる群よ
   り選択される構成員を有してなる単離ポリヌクレオチ
   ド。
6. 【請求項６】 請求項２に記載のＤＮＡを含有してなる
   ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のベクターを有してなる
   宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の宿主細胞より、前記Ｄ
   ＮＡによりコードされるポリペプチドを発現することか
   らなるポリペプチドの産生法。
9. 【請求項９】 ポリペプチドを発現する細胞の産生法で
   あって、該細胞が請求項８のベクターに含まれるヒトｃ
   ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発現するよう
   に、該細胞を該ベクターでトランスフォームまたはトラ
   ンスフェクションすることからなる該細胞の産生法。
10. 【請求項１０】 配列番号１に示すアミノ酸と少なくと
    も７０％同一であるアミノ酸配列を有してなるポリペプ
    チド。
11. 【請求項１１】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有し
    てなるポリペプチド。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載のポリペプチドに対
    するアゴニスト。
13. 【請求項１３】 請求項１０に記載のポリペプチドに対
    する抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載のポリペプチドの活
    性を阻害するアンタゴニスト。
15. 【請求項１５】 治療上有効量の請求項１０に記載のポ
    リペプチドを患者に投与することからなるＩＣＥ ＬＡ
    Ｐ−６を必要とする患者の治療法。
16. 【請求項１６】 治療上有効量のポリペプチドを、該ポ
    リペプチドをコードし、in vivoにて該ポリペプチドを
    発現するＤＮＡを患者に供給することによって投与する
    請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 治療上有効量の請求項１４に記載のア
    ンタゴニストを患者に投与することからなるＩＣＥ Ｌ
    ＡＰ−６ポリペプチドの阻害を必要とする患者の治療
    法。
18. 【請求項１８】 請求項１０のポリペプチドの発現に関
    連する疾患または疾患に対する感受性を診断する方法で
    あって、該ポリペプチドをコードする核酸配列における
    変異を測定することからなる方法。
19. 【請求項１９】 宿主由来のサンプル中の請求項１０に
    記載のポリペプチドの存在を分析することからなる診断
    法。
20. 【請求項２０】 請求項１０のポリペプチドに対するレ
    セプターに結合し、そのレセプターを活性化または阻害
    する化合物の同定方法であって、該ポリペプチドのレセ
    プター（該レセプターは化合物のレセプターへの結合に
    応答して検出可能なシグナルを付与しうる第二の成分と
    結合する）をその表面に発現する細胞を、該レセプター
    への結合を可能とする条件下で、スクリーンすべき化合
    物と接触させ；および該化合物と該レセプターの相互作
    用から生じるシグナルの存在または不在を検出すること
    により、化合物がレセプターと結合し、レセプターを活
    性化または抑制するかどうかを測定することからなる方
    法。