JPH1075673A - トランスジェニック・サトイモ科植物の製造方法および除草剤耐性サトイモ科植物 - Google Patents
トランスジェニック・サトイモ科植物の製造方法および除草剤耐性サトイモ科植物Info
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- JPH1075673A JPH1075673A JP8232892A JP23289296A JPH1075673A JP H1075673 A JPH1075673 A JP H1075673A JP 8232892 A JP8232892 A JP 8232892A JP 23289296 A JP23289296 A JP 23289296A JP H1075673 A JPH1075673 A JP H1075673A
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 サトイモ科植物において、耐性マーカー遺伝
子および有用遺伝子が染色体に組み込まれた形質転換細
胞のみよりなる形質転換サトイモ科植物の製造方法およ
び除草剤耐性サトイモ科植物を提供する。 【構成】 サトイモ科植物のカルスにパーティクルガン
を用いて耐性マーカー遺伝子および有用遺伝子を導入
し、プロトコーム様多芽体を経由して、形質転換細胞の
みよりなるサトイモ科植物を製造する方法、および除草
剤耐性サトイモ科植物に関する。
子および有用遺伝子が染色体に組み込まれた形質転換細
胞のみよりなる形質転換サトイモ科植物の製造方法およ
び除草剤耐性サトイモ科植物を提供する。 【構成】 サトイモ科植物のカルスにパーティクルガン
を用いて耐性マーカー遺伝子および有用遺伝子を導入
し、プロトコーム様多芽体を経由して、形質転換細胞の
みよりなるサトイモ科植物を製造する方法、および除草
剤耐性サトイモ科植物に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、有用遺伝子が染色
体に組み込まれた形質転換細胞のみよりなるサトイモ科
植物の製造方法および除草剤耐性サトイモ科植物に関す
る。
体に組み込まれた形質転換細胞のみよりなるサトイモ科
植物の製造方法および除草剤耐性サトイモ科植物に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】広く植物への外来遺伝子導入法として
は、アグロバクテリウムを用いる方法とエレクトロポレ
ーンョンによる方法とが知られている。また、近年、ト
ウモロコシや小麦などの単子葉植物の形質転換にパーテ
ィクルガン法が利用され始めている。
は、アグロバクテリウムを用いる方法とエレクトロポレ
ーンョンによる方法とが知られている。また、近年、ト
ウモロコシや小麦などの単子葉植物の形質転換にパーテ
ィクルガン法が利用され始めている。
【０００３】この方法は、金やタングステンなどの金属
微粒子の表面にＤＮＡをコーティングし、この粒子を音
速以上の高速度に加速して植物細胞に打ち込み、形質転
換するものである。このパーテイクルガンを用いて単子
葉類のラン科植物等への形質転換体の作出例（特開平７
−２５５３００号）は見られるが、カラスビシャクおよ
びそれが属するサトイモ科植物での成功例はこれまで報
告されていない。
微粒子の表面にＤＮＡをコーティングし、この粒子を音
速以上の高速度に加速して植物細胞に打ち込み、形質転
換するものである。このパーテイクルガンを用いて単子
葉類のラン科植物等への形質転換体の作出例（特開平７
−２５５３００号）は見られるが、カラスビシャクおよ
びそれが属するサトイモ科植物での成功例はこれまで報
告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】サトイモ科植物に属す
るカラスビシャクの塊茎は、生薬の半夏の原料として重
要である。近年、輸入される塊茎の品質が低下してお
り、大量増殖法による種苗の増産あるいは遺伝的な手法
による積極的な品種改良が望まれている。大量増殖法
（クローン増殖法）に関しては、本発明者らにより既に
報告（ Y.Shoyama etal.,Planta Medica (1983) 49,14-
16 、Y.Shoyama et al.,Biotechnology in Agriculture
and Forestry,Vol 19 High-Tech and Micropropagati
on III(ed byY.P.S.Bajaj) pp.464-480)があるが、カラ
スビシャクを始めとしたサトイモ科植物において、外来
遺伝子を導入し優れた特性を付与することはこれまで不
可能であった。それは、サトイモ科植物は単子葉植物で
あるためアグロバクテリウムによる感染を受けないこ
と、あるいはプロトプラストからの植物体再生技術が確
立されていないためエレクトロポレーンョン法を用いる
ことが困難であること等の理由からであった。
るカラスビシャクの塊茎は、生薬の半夏の原料として重
要である。近年、輸入される塊茎の品質が低下してお
り、大量増殖法による種苗の増産あるいは遺伝的な手法
による積極的な品種改良が望まれている。大量増殖法
（クローン増殖法）に関しては、本発明者らにより既に
報告（ Y.Shoyama etal.,Planta Medica (1983) 49,14-
16 、Y.Shoyama et al.,Biotechnology in Agriculture
and Forestry,Vol 19 High-Tech and Micropropagati
on III(ed byY.P.S.Bajaj) pp.464-480)があるが、カラ
スビシャクを始めとしたサトイモ科植物において、外来
遺伝子を導入し優れた特性を付与することはこれまで不
可能であった。それは、サトイモ科植物は単子葉植物で
あるためアグロバクテリウムによる感染を受けないこ
と、あるいはプロトプラストからの植物体再生技術が確
立されていないためエレクトロポレーンョン法を用いる
ことが困難であること等の理由からであった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、形質転換
細胞のみよりなるサトイモ科植物を製造するために、そ
のカルスにパーテイクルガンを用いて遺伝子導入し、プ
ロトコーム様多芽体を経由して、目的とするトランスジ
ェニックなサトイモ科植物を製造することに成功し、本
発明を完成するにいたった。
細胞のみよりなるサトイモ科植物を製造するために、そ
のカルスにパーテイクルガンを用いて遺伝子導入し、プ
ロトコーム様多芽体を経由して、目的とするトランスジ
ェニックなサトイモ科植物を製造することに成功し、本
発明を完成するにいたった。
【０００６】サトイモ科植物、特にカラスビシャクは、
カルスからプロトコーム様多芽体を経由して再分化植物
を形成することが知られているが、この場合、カルス表
面の単一細胞から多数のプロトコーム様多芽体を形成す
ると考えられている（ Y.Shoyama et al., Biotechnolo
gy in Agriculture and Forestry,Vol 19 High-Techan
d Micropropagation III(ed by Y.P.S.Bajaj) pp.464-4
80)。そこで、本発明者らは、サトイモ科植物であるカ
ラスビシャクのカルスに遺伝子導入をはかり、カルス表
面の単一細胞から形質転換されたプロトコーム様多芽体
を取得し、更に、この多芽体を再分化培地で培養するこ
とにより最終的に形質転換細胞のみからなるトランスジ
ェニック・サトイモ科植物を得ることに成功した。
カルスからプロトコーム様多芽体を経由して再分化植物
を形成することが知られているが、この場合、カルス表
面の単一細胞から多数のプロトコーム様多芽体を形成す
ると考えられている（ Y.Shoyama et al., Biotechnolo
gy in Agriculture and Forestry,Vol 19 High-Techan
d Micropropagation III(ed by Y.P.S.Bajaj) pp.464-4
80)。そこで、本発明者らは、サトイモ科植物であるカ
ラスビシャクのカルスに遺伝子導入をはかり、カルス表
面の単一細胞から形質転換されたプロトコーム様多芽体
を取得し、更に、この多芽体を再分化培地で培養するこ
とにより最終的に形質転換細胞のみからなるトランスジ
ェニック・サトイモ科植物を得ることに成功した。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下に、本発明の方法について具
体的に説明する。サトイモ科植物、特にカラスビシャク
のプロトコーム様多芽体は、葉切片、塊茎切片、葉切片
由来のカルス等から誘導されるプロトコーム様の不定芽
のことで、ラン科植物、例えばデンドロビューム、カト
レア、シンビジューム等のプロトコーム様球体に極めて
類似したものである。本プロトコーム様多芽体は、切断
して増殖培地で培養することにより、切断した多芽体表
面の単細胞から多数の２次多芽体を形成し、再分化培地
にて再分化植物を形成する。
体的に説明する。サトイモ科植物、特にカラスビシャク
のプロトコーム様多芽体は、葉切片、塊茎切片、葉切片
由来のカルス等から誘導されるプロトコーム様の不定芽
のことで、ラン科植物、例えばデンドロビューム、カト
レア、シンビジューム等のプロトコーム様球体に極めて
類似したものである。本プロトコーム様多芽体は、切断
して増殖培地で培養することにより、切断した多芽体表
面の単細胞から多数の２次多芽体を形成し、再分化培地
にて再分化植物を形成する。
【０００８】パーテイクルガンによる遺伝子導入方法は
通常の方法によるが、プロトコーム様多芽体はカルス表
面の細胞から形成されるため、ＤＮＡをコーティングし
た金粒子あるいはタングステン粒子はカルス表面の細胞
に到達しなくてはならない。このため、パーテイクルガ
ンの発射圧力と発射速度を精密に調節する必要がある。
有用遺伝子、例えば耐病性、耐寒性、害虫耐性、花色、
形態等に係わる遺伝子を導入する場合は、これら有用遺
伝子とプロモーター、ターミネーターを連結して植物内
で発現可能なカセットとする。このカセットと同じく植
物内で発現可能な選抜マーカー遺伝子のカセットを同一
のベクター上に保持させるか、あるいは別々のベクター
上に保持させ混合して導入する。
通常の方法によるが、プロトコーム様多芽体はカルス表
面の細胞から形成されるため、ＤＮＡをコーティングし
た金粒子あるいはタングステン粒子はカルス表面の細胞
に到達しなくてはならない。このため、パーテイクルガ
ンの発射圧力と発射速度を精密に調節する必要がある。
有用遺伝子、例えば耐病性、耐寒性、害虫耐性、花色、
形態等に係わる遺伝子を導入する場合は、これら有用遺
伝子とプロモーター、ターミネーターを連結して植物内
で発現可能なカセットとする。このカセットと同じく植
物内で発現可能な選抜マーカー遺伝子のカセットを同一
のベクター上に保持させるか、あるいは別々のベクター
上に保持させ混合して導入する。
【０００９】サトイモ科植物、特にカラスビシャクでマ
ーカー遺伝子や有用遺伝子を発現させるためには、プロ
モーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイル
ス35Ｓプロモーターが使用可能であり、ターミネーター
としては、ノパリンシンターゼが使用できる。レポータ
ー遺伝子として大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ（Ｇ
ＵＳ）遺伝子を選び、これをカリフラワーモザイクウイ
ルス35Ｓプロモーター、およびノパリンシンターゼター
ミネーター制御下に置いたプラスミドＤＮＡ pBI221
（図１）等を発現ベクターとして用いることができる。
ーカー遺伝子や有用遺伝子を発現させるためには、プロ
モーターとしては、例えばカリフラワーモザイクウイル
ス35Ｓプロモーターが使用可能であり、ターミネーター
としては、ノパリンシンターゼが使用できる。レポータ
ー遺伝子として大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ（Ｇ
ＵＳ）遺伝子を選び、これをカリフラワーモザイクウイ
ルス35Ｓプロモーター、およびノパリンシンターゼター
ミネーター制御下に置いたプラスミドＤＮＡ pBI221
（図１）等を発現ベクターとして用いることができる。
【００１０】サトイモ科植物は単子葉植物であるので、
形質転換細胞の選抜に用いる選抜マーカー遺伝子とし
て、例えば、イネ、トウモロコシ等の単子葉類でその有
用性が認められているビアラホス耐性（ｂａｒ）遺伝子
が考えられる。ビアラホス耐性遺伝子は、除草剤である
ビアラホスを無毒化する酵素フォスフィノスリシンアセ
チルトランスフェラーゼをコードしている。本酵素遺伝
子をマーカー遺伝子として選択し、先の例と同様に、こ
の耐性遺伝子をカリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロ
モーター、およびノパリンシンターゼターミネーター制
御下に置いたプラスミドＤＮＡpARK22（図２）を構築し
（T.Sawasaki,et al., Transgenic Research,3,279-286
(1994)）発現ベクターとして用いる。
形質転換細胞の選抜に用いる選抜マーカー遺伝子とし
て、例えば、イネ、トウモロコシ等の単子葉類でその有
用性が認められているビアラホス耐性（ｂａｒ）遺伝子
が考えられる。ビアラホス耐性遺伝子は、除草剤である
ビアラホスを無毒化する酵素フォスフィノスリシンアセ
チルトランスフェラーゼをコードしている。本酵素遺伝
子をマーカー遺伝子として選択し、先の例と同様に、こ
の耐性遺伝子をカリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロ
モーター、およびノパリンシンターゼターミネーター制
御下に置いたプラスミドＤＮＡpARK22（図２）を構築し
（T.Sawasaki,et al., Transgenic Research,3,279-286
(1994)）発現ベクターとして用いる。
【００１１】ＤＮＡをコーティングした金粒子を発射し
たカルスは、第１段階として、高濃度の選抜薬剤を含む
プロトコーム様多芽体形成培地で培養し選抜する。第２
段階として、低濃度の選抜薬剤を添加した選抜用再分化
培地で培養し形質転換植物を選抜する。以上の２段階選
抜で形質転換体のみが効率よく選抜される。選抜薬剤の
種類および濃度は、導入した耐性マーカー遺伝子の種類
および植物の種類により異なるが、例えばカラスビシャ
クにｂａｒ遺伝子を導入した場合は、選抜薬剤であるビ
アラホスを第１段階では２ｍｇ／ｌ程度、第２段階では
１ｍｇ／ｍｌ程度添加するのが好ましい。
たカルスは、第１段階として、高濃度の選抜薬剤を含む
プロトコーム様多芽体形成培地で培養し選抜する。第２
段階として、低濃度の選抜薬剤を添加した選抜用再分化
培地で培養し形質転換植物を選抜する。以上の２段階選
抜で形質転換体のみが効率よく選抜される。選抜薬剤の
種類および濃度は、導入した耐性マーカー遺伝子の種類
および植物の種類により異なるが、例えばカラスビシャ
クにｂａｒ遺伝子を導入した場合は、選抜薬剤であるビ
アラホスを第１段階では２ｍｇ／ｌ程度、第２段階では
１ｍｇ／ｍｌ程度添加するのが好ましい。
【００１２】本発明の実施例においては生薬の半夏の原
料植物であるカラスビシャクのカルスを用いた場合につ
いて述べるが、本発明はカラスビシャクに限らず、プロ
トコーム様多芽体を形成することができるサトイモ科植
物に関するものである。以下実施例をあげて本発明を更
に詳細に説明する。
料植物であるカラスビシャクのカルスを用いた場合につ
いて述べるが、本発明はカラスビシャクに限らず、プロ
トコーム様多芽体を形成することができるサトイモ科植
物に関するものである。以下実施例をあげて本発明を更
に詳細に説明する。
【００１３】
【実施例１】カルスのビアラホス耐性度の検討 選抜マーカー遺伝子としてｂａｒ遺伝子を用いることと
し、カラスビシャクのカルスからプロトコーム様多芽体
が形成する過程におけるビアラホス選抜濃度の検討を行
った。カルスは前述のY.Shoyamaらの方法（Biotechnolo
gy in Agriculture and Forestry,Vol 19 High-Tech a
nd Micropropagation III(ed by Y.P.S.Bajaj) pp.464-
480）に従って調製し、２, ４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２, ４−Ｄ）を５ｍｇ／ｌ加えたムラシゲ・スクー
グ培地（ＭＳ培地）を、プロトコーム様多芽体形成培地
として用いた。この培地に、更に、それぞれ０、0.5 、
1.0 、1.5 、2.0 、3.0 ｍｇ／ｌの濃度となるようにビ
アラホスを添加し、カラスビシャクのカルスを置床し
た。25℃、16時間日長下で培養を行い、１カ月後に観察
した。その結果、ビアラホスの濃度が２ｍｇ／ｌにおい
て、全カルスがプロトコーム様多芽体を形成することな
く枯死した（表１）。したがって、プロトコーム様多芽
体形成培地における遺伝子導入後のカルスに対する選抜
は、ビアラホスを２ｍｇ／１添加した培地を用いること
とした。
し、カラスビシャクのカルスからプロトコーム様多芽体
が形成する過程におけるビアラホス選抜濃度の検討を行
った。カルスは前述のY.Shoyamaらの方法（Biotechnolo
gy in Agriculture and Forestry,Vol 19 High-Tech a
nd Micropropagation III(ed by Y.P.S.Bajaj) pp.464-
480）に従って調製し、２, ４−ジクロロフェノキシ酢
酸（２, ４−Ｄ）を５ｍｇ／ｌ加えたムラシゲ・スクー
グ培地（ＭＳ培地）を、プロトコーム様多芽体形成培地
として用いた。この培地に、更に、それぞれ０、0.5 、
1.0 、1.5 、2.0 、3.0 ｍｇ／ｌの濃度となるようにビ
アラホスを添加し、カラスビシャクのカルスを置床し
た。25℃、16時間日長下で培養を行い、１カ月後に観察
した。その結果、ビアラホスの濃度が２ｍｇ／ｌにおい
て、全カルスがプロトコーム様多芽体を形成することな
く枯死した（表１）。したがって、プロトコーム様多芽
体形成培地における遺伝子導入後のカルスに対する選抜
は、ビアラホスを２ｍｇ／１添加した培地を用いること
とした。
【００１４】 表１ カルスのビアラホス耐性度の検討 ────────────────────── ビアラホス濃度（ｍｇ／ｌ） 生育状況 ────────────────────── ０ ＋＋ ０．５ ＋＋ １．０ ＋＋ １．５ ＋ ２．０ − ３．０ − ────────────────────── − は枯死を表す。
【００１５】
【実施例２】プロトコーム様多芽体のビアラホス耐性度
の検討 選抜マーカー遺伝子としてｂａｒ遺伝子を用いることと
し、プロトコーム様多芽体から再分化植物が形成する過
程において、好ましいビアラホスの添加濃度の検討を行
った。プロトコーム様多芽体から植物体を再分化させる
ときに用いる基本培地として、ナフタレン酢酸（ＮＡ
Ａ）を１ｍｇ／ｌ加えたＭＳ培地を用いた。この培地
に、更に、それぞれ０、0.5 、1.0 、1.5 、2.0 、3.0
、5.0 ｍｇ／ｌの濃度となるようにビアラホスを添加
し、実施例１で得られたカラスビシャクのプロトコーム
様多芽体を置床した。25℃、16時間日長下で培養を行
い、１カ月後に観察した。その結果、ビアラホスを１ｍ
ｇ／１添加した実験区ではプロトコーム様多芽体は再分
化する事無く全て枯死した（表２）。したがって、再分
化培地における選抜は、ビアラホスを１ｍｇ／１添加し
た培地を用いることとした。
の検討 選抜マーカー遺伝子としてｂａｒ遺伝子を用いることと
し、プロトコーム様多芽体から再分化植物が形成する過
程において、好ましいビアラホスの添加濃度の検討を行
った。プロトコーム様多芽体から植物体を再分化させる
ときに用いる基本培地として、ナフタレン酢酸（ＮＡ
Ａ）を１ｍｇ／ｌ加えたＭＳ培地を用いた。この培地
に、更に、それぞれ０、0.5 、1.0 、1.5 、2.0 、3.0
、5.0 ｍｇ／ｌの濃度となるようにビアラホスを添加
し、実施例１で得られたカラスビシャクのプロトコーム
様多芽体を置床した。25℃、16時間日長下で培養を行
い、１カ月後に観察した。その結果、ビアラホスを１ｍ
ｇ／１添加した実験区ではプロトコーム様多芽体は再分
化する事無く全て枯死した（表２）。したがって、再分
化培地における選抜は、ビアラホスを１ｍｇ／１添加し
た培地を用いることとした。
【００１６】 表２ プロトコーム様多芽体のビアラホス耐性度の検討 ─────────────────────── ビアラホス濃度（ｍｇ／ｌ） 生育状況 ─────────────────────── ０ ＋＋ ０．５ ＋ １．０ − １．５ − ２．０ − ３．０ − ５．０ − ─────────────────────── − は枯死を表す。
【００１７】
【実施例３】パーティクルガンによる遺伝子導入条件の
検討 表皮細胞への効率的な導入を行うために、発射圧力の検
討を行った。プラスミドＤＮＡとしてpBI221（図１）を
用い、プラスミド上にコードされるβ−グルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）遺伝子をレポーターとして、４−ブロモ−
３−クロロ−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を基質
とした組織染色を森川らの方法（植物細胞工学、４、43
〜48（1992））により検討した。
検討 表皮細胞への効率的な導入を行うために、発射圧力の検
討を行った。プラスミドＤＮＡとしてpBI221（図１）を
用い、プラスミド上にコードされるβ−グルクロニダー
ゼ（ＧＵＳ）遺伝子をレポーターとして、４−ブロモ−
３−クロロ−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸を基質
とした組織染色を森川らの方法（植物細胞工学、４、43
〜48（1992））により検討した。
【００１８】遺伝子導入には、窒素圧式のレーボック商
工株式会社モデル 190のパーティクルガンを用いた。ま
た、金粒子は平均直径 1.1ミクロン（株式会社徳力本店
製）を用い、金粒子とＤＮＡの処理方法は森川らの方法
に準じた。すなわち、カラスビシャクのカルスをプロト
コーム様多芽体形成培地の中央、直径３ｃｍ以内に置床
し、プラスミドＤＮＡ20μｇを５ｍｇの金粒子にエタノ
ール沈殿法によりコーティングし、１弾あたり金粒子
0.2ｍｇ、ＤＮＡ 0.8μｇの条件下で発射した。25℃、1
6時間光照射下で24時間培養後、基質液にカルスを移し
発色を観察した（表３）。
工株式会社モデル 190のパーティクルガンを用いた。ま
た、金粒子は平均直径 1.1ミクロン（株式会社徳力本店
製）を用い、金粒子とＤＮＡの処理方法は森川らの方法
に準じた。すなわち、カラスビシャクのカルスをプロト
コーム様多芽体形成培地の中央、直径３ｃｍ以内に置床
し、プラスミドＤＮＡ20μｇを５ｍｇの金粒子にエタノ
ール沈殿法によりコーティングし、１弾あたり金粒子
0.2ｍｇ、ＤＮＡ 0.8μｇの条件下で発射した。25℃、1
6時間光照射下で24時間培養後、基質液にカルスを移し
発色を観察した（表３）。
【００１９】 表３ パーティクルガンによる遺伝子導入条件の検討 ────────────────────────── 試料間距離 発射速度（ｍ／秒） ───────────────── （ｃｍ） ３２０ ３４０ ３６０ ────────────────────────── ８ ＋＋ ＋ ＋＋ 10 ＋ − ＋＋＋ 12 − − − ────────────────────────── ＋，− は遺伝子の発現量を表す。
【００２０】表３の結果より、発射速度 360ｍ／秒、試
料間距離10ｃｍの条件下で、最も発色スポットが多く認
められたことから、本条件をカルスへの遺伝子導入の発
射条件に設定した。
料間距離10ｃｍの条件下で、最も発色スポットが多く認
められたことから、本条件をカルスへの遺伝子導入の発
射条件に設定した。
【００２１】
【実施例４】カルスの前培養条件の検討 遺伝子発現効率に影響を及ぼすファクターとしてカルス
の前培養期間を検討した。即ち、カルスを遺伝子導入条
件に設定してから遺伝子導入までの前培養期間を設定す
る目的で、２、４−Ｄを５ｍｇ／ｌ加えたＭＳ培地を分
注したシャーレにカラスビシャクのカルスを直径３ｃｍ
に広げ置床し、25℃、16時間光照射下で１、３、７日間
培養を行った後、実施例３と同様に遺伝子を導入した。
導入カルスを実施例３と同様に染色して発色スポット数
を測定した（表４）。
の前培養期間を検討した。即ち、カルスを遺伝子導入条
件に設定してから遺伝子導入までの前培養期間を設定す
る目的で、２、４−Ｄを５ｍｇ／ｌ加えたＭＳ培地を分
注したシャーレにカラスビシャクのカルスを直径３ｃｍ
に広げ置床し、25℃、16時間光照射下で１、３、７日間
培養を行った後、実施例３と同様に遺伝子を導入した。
導入カルスを実施例３と同様に染色して発色スポット数
を測定した（表４）。
【００２２】
【００２３】表４の結果より、３日間の前培養において
多くの発色が見られたので、カルスの前培養期間を３日
間とした。
多くの発色が見られたので、カルスの前培養期間を３日
間とした。
【００２４】
【実施例５】ビアラホス耐性カラスビシャクの選抜と導
入遺伝子の確認 ２、４−Ｄを５ｍｇ／ｌ加えたＭＳ培地を分注したシャ
ーレにカラスビシャクのカルスを直径３ｃｍに広げ置床
し、25℃、16時間光照射下で３日間前培養する。培養カ
ルスに発射速度 360ｍ／秒、試料間隔10ｃｍの条件下で
ＤＮＡとしてpARK22（図２）をコートした金粒子をシャ
ーレ当たり２回発射した。次に、実施例１で検討した第
１段階の選抜培地である２ｍｇ／ｌのビアラホスを添加
したプロトコーム様多芽体形成培地へ移植した。１カ月
間同条件下で培養後、分化したプロトコーム様多芽体を
選抜した。その後、実施例２で検討した第２段階の選抜
培地である１ｍｇ／ｌのビアラホスを添加した再分化培
地に移植した。３カ月同条件下の培養により、一部のプ
ロトコーム様多芽体からビアラホスに耐性を示す形質転
換カラスビシャクが得られた。
入遺伝子の確認 ２、４−Ｄを５ｍｇ／ｌ加えたＭＳ培地を分注したシャ
ーレにカラスビシャクのカルスを直径３ｃｍに広げ置床
し、25℃、16時間光照射下で３日間前培養する。培養カ
ルスに発射速度 360ｍ／秒、試料間隔10ｃｍの条件下で
ＤＮＡとしてpARK22（図２）をコートした金粒子をシャ
ーレ当たり２回発射した。次に、実施例１で検討した第
１段階の選抜培地である２ｍｇ／ｌのビアラホスを添加
したプロトコーム様多芽体形成培地へ移植した。１カ月
間同条件下で培養後、分化したプロトコーム様多芽体を
選抜した。その後、実施例２で検討した第２段階の選抜
培地である１ｍｇ／ｌのビアラホスを添加した再分化培
地に移植した。３カ月同条件下の培養により、一部のプ
ロトコーム様多芽体からビアラホスに耐性を示す形質転
換カラスビシャクが得られた。
【００２５】遺伝子の導入を確かめるためにビアラホス
耐性カラスビシャクの葉から全ＤＮＡを抽出精製した鋳
型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ビアラホス耐性遺伝
子内部 402bpを特異的に増幅するプライマーＢを用い
て、形質転換および非形質転換カラスビシャクより抽出
精製したゲノムＤＮＡとＰＣＲ反応を行ったところ、ビ
アラホス耐性カラスビシャクのみから約 400 bp のＤＮ
Ａ断片の増幅をみた（図３）。
耐性カラスビシャクの葉から全ＤＮＡを抽出精製した鋳
型ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ビアラホス耐性遺伝
子内部 402bpを特異的に増幅するプライマーＢを用い
て、形質転換および非形質転換カラスビシャクより抽出
精製したゲノムＤＮＡとＰＣＲ反応を行ったところ、ビ
アラホス耐性カラスビシャクのみから約 400 bp のＤＮ
Ａ断片の増幅をみた（図３）。
【００２６】
【実施例６】フォスフィノスリシンアセチルトランスフ
ェラーゼ活性の確認 形質転換カラスビシャクおよび非形質転換カラスビシャ
クの葉から粗酵素を抽出し、導入したｂａｒ遺伝子の発
現をフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ
活性により調査した。即ち、１−14ＣアセチルＣｏＡと
基質であるフォスフィノスリシンを加えた溶液に粗酵素
液を添加し反応を行う。反応液を薄層クロマトグラフィ
ーに付し、展開溶媒で展開後、薄層クロマトグラフィー
にフィルムをカバーして暗室にて１週間保存する。形質
転換カラスビシャクのみに１−14Ｃアセチルフォスフィ
ノスリシンのスポットが認められた（図４）。この結
果、形質転換カラスビシャクに外来の酵素であるフォス
フィノスリシンアセチルトランスフェラーゼが発現する
ことが確認された。
ェラーゼ活性の確認 形質転換カラスビシャクおよび非形質転換カラスビシャ
クの葉から粗酵素を抽出し、導入したｂａｒ遺伝子の発
現をフォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ
活性により調査した。即ち、１−14ＣアセチルＣｏＡと
基質であるフォスフィノスリシンを加えた溶液に粗酵素
液を添加し反応を行う。反応液を薄層クロマトグラフィ
ーに付し、展開溶媒で展開後、薄層クロマトグラフィー
にフィルムをカバーして暗室にて１週間保存する。形質
転換カラスビシャクのみに１−14Ｃアセチルフォスフィ
ノスリシンのスポットが認められた（図４）。この結
果、形質転換カラスビシャクに外来の酵素であるフォス
フィノスリシンアセチルトランスフェラーゼが発現する
ことが確認された。
【００２７】
【実施例７】ビアラホス耐性の確認 形質転換カラスビシャクと非形質転換カラスビシャクの
茎葉をビアラホス10ｍｇ／ｌの水溶液に各々浸漬して、
10日間、25℃、16時間日長下でインキュベートした。非
形質転換カラスビシャクは完全に枯死したが、形質転換
カラスビシャクは枯死することなく生存していた。この
結果から、形質転換カラスビシャクは明らかにビアラホ
ス耐性を獲得したことが確認された。
茎葉をビアラホス10ｍｇ／ｌの水溶液に各々浸漬して、
10日間、25℃、16時間日長下でインキュベートした。非
形質転換カラスビシャクは完全に枯死したが、形質転換
カラスビシャクは枯死することなく生存していた。この
結果から、形質転換カラスビシャクは明らかにビアラホ
ス耐性を獲得したことが確認された。
【００２８】
【発明の効果】従来、サトイモ科植物、特にカラスビシ
ャクにおいて、形質転換法が確立していなかったことか
ら、サトイモ科植物に交配以外の方法で有用遺伝子を染
色体に組み込むことは不可能であった。しかし、本発明
により、カラスビシャクおよびプロトコーム様多芽体を
形成することができるサトイモ科植物において、有用遺
伝子が染色体に組み込まれ、かつキメラでない形質転換
植物を製造することができるようになった。
ャクにおいて、形質転換法が確立していなかったことか
ら、サトイモ科植物に交配以外の方法で有用遺伝子を染
色体に組み込むことは不可能であった。しかし、本発明
により、カラスビシャクおよびプロトコーム様多芽体を
形成することができるサトイモ科植物において、有用遺
伝子が染色体に組み込まれ、かつキメラでない形質転換
植物を製造することができるようになった。
【図１】遺伝子導入に供したプラスミドＤＮＡ pBI221
を表す。図中、Ｐ３５Ｓはカリフラワーモザイクウィル
ス35Ｓプロモーター、ＧＵＳはβ−グルクロニダーゼ遺
伝子、Ｔｎｏｓはノパリンシンターゼターミネータ部分
を表す。
を表す。図中、Ｐ３５Ｓはカリフラワーモザイクウィル
ス35Ｓプロモーター、ＧＵＳはβ−グルクロニダーゼ遺
伝子、Ｔｎｏｓはノパリンシンターゼターミネータ部分
を表す。
【図２】ビアラホス耐性遺伝子の導入に用いたプラスミ
ドＤＮＡ pARK22 を表す。図中、Ｐ３５Ｓはカリフラワ
ーモザイクウィルス35Ｓプロモーター、ｂａｒはビアラ
ホス耐性（フォスフィノスリシンアセチルトランスフェ
ラーゼ）遺伝子、Ｔｎｏｓはノパリンシンターゼターミ
ネータ部分を表す。
ドＤＮＡ pARK22 を表す。図中、Ｐ３５Ｓはカリフラワ
ーモザイクウィルス35Ｓプロモーター、ｂａｒはビアラ
ホス耐性（フォスフィノスリシンアセチルトランスフェ
ラーゼ）遺伝子、Ｔｎｏｓはノパリンシンターゼターミ
ネータ部分を表す。
【図３】形質転換カラスビシャクにおけるビアラホス耐
性遺伝子の存在を示すＰＣＲ増幅産物のアガロース電気
泳動の結果を示す。レーン１は非形質転換カラスビシャ
クの、レーン２〜７は形質転換カラスビシャクの、ゲノ
ムＤＮＡを鋳型として用いた。また、ビアラホス耐性遺
伝子を特異的に増幅するプライマーとして、プライマー
Ｂを用いた。矢印はＰＣＲにより増幅されたビアラホス
耐性遺伝子を示す。
性遺伝子の存在を示すＰＣＲ増幅産物のアガロース電気
泳動の結果を示す。レーン１は非形質転換カラスビシャ
クの、レーン２〜７は形質転換カラスビシャクの、ゲノ
ムＤＮＡを鋳型として用いた。また、ビアラホス耐性遺
伝子を特異的に増幅するプライマーとして、プライマー
Ｂを用いた。矢印はＰＣＲにより増幅されたビアラホス
耐性遺伝子を示す。
【図４】フォスフォノスリシンアセチールトランスフェ
フーゼ活性を調査した結果を表す。１−14ＣアセチルＣ
ｏＡと基質溶液とを粗酵素液で反応させ、薄層クロマト
グラフィーによりアセチルフォスフィノスリシン（Acet
yl-PPT）を確認した。レーン１は非形質転換カラスビシ
ャク、レーン２〜７は形質転換カラスビシャクを示す。
フーゼ活性を調査した結果を表す。１−14ＣアセチルＣ
ｏＡと基質溶液とを粗酵素液で反応させ、薄層クロマト
グラフィーによりアセチルフォスフィノスリシン（Acet
yl-PPT）を確認した。レーン１は非形質転換カラスビシ
ャク、レーン２〜７は形質転換カラスビシャクを示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 サトイモ科植物のカルスにパーティクル
ガンを用いて選択マーカー遺伝子および有用遺伝子を導
入し、プロトコーム様多芽体を経由して、形質転換細胞
のみよりなるサトイモ科植物を製造する方法 - 【請求項２】 選抜マーカー遺伝子としてフォスフィノ
スリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を用い、プ
ロトコーム様多芽体の形成前後に形質転換細胞の２段階
選抜を行うことを特徴とする請求項１記載の方法 - 【請求項３】 形質転換細胞の２段階選抜が、プロトコ
ーム様多芽体形成培地および再分化培地にビアラホスを
添加して行うことを特徴とする請求項１、２記載の方法 - 【請求項４】 サトイモ科植物がカラスビシャクである
請求項１〜３記載の方法 - 【請求項５】 請求項２、３に記載の方法により取得さ
れた、ビアラホス耐性を有するサトイモ科植物 - 【請求項６】 サトイモ科植物がカラスビシャクである
請求項５記載の植物
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8232892A JPH1075673A (ja) | 1996-09-03 | 1996-09-03 | トランスジェニック・サトイモ科植物の製造方法および除草剤耐性サトイモ科植物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8232892A JPH1075673A (ja) | 1996-09-03 | 1996-09-03 | トランスジェニック・サトイモ科植物の製造方法および除草剤耐性サトイモ科植物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1075673A true JPH1075673A (ja) | 1998-03-24 |
Family
ID=16946486
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8232892A Pending JPH1075673A (ja) | 1996-09-03 | 1996-09-03 | トランスジェニック・サトイモ科植物の製造方法および除草剤耐性サトイモ科植物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1075673A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104186322A (zh) * | 2014-08-28 | 2014-12-10 | 徐伟明 | 一种千年健的组织培养基及其增殖方法 |
| CN120289602A (zh) * | 2025-04-23 | 2025-07-11 | 淮北师范大学 | 一种半夏NAC类转录因子PtNAC61及其编码基因和应用 |
-
1996
- 1996-09-03 JP JP8232892A patent/JPH1075673A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104186322A (zh) * | 2014-08-28 | 2014-12-10 | 徐伟明 | 一种千年健的组织培养基及其增殖方法 |
| CN120289602A (zh) * | 2025-04-23 | 2025-07-11 | 淮北师范大学 | 一种半夏NAC类转录因子PtNAC61及其编码基因和应用 |
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