JPH1057057A - 有機塩素化合物分解用組換プラスミド及び形質転換体 - Google Patents
有機塩素化合物分解用組換プラスミド及び形質転換体Info
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- JPH1057057A JPH1057057A JP8222184A JP22218496A JPH1057057A JP H1057057 A JPH1057057 A JP H1057057A JP 8222184 A JP8222184 A JP 8222184A JP 22218496 A JP22218496 A JP 22218496A JP H1057057 A JPH1057057 A JP H1057057A
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- Processing Of Solid Wastes (AREA)
- Purification Treatments By Anaerobic Or Anaerobic And Aerobic Bacteria Or Animals (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 組込プラスミドを宿主細胞に導入した遺伝子
組換菌を用いて、有機化合物による汚染水、土壌の修復
を行うものである。 【解決手段】 有機塩素化合物に対するシュードモナス
フルオレッセンスＩＰ０１由来のクメン分解酵素をコ
ードする遺伝子の部分遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ
４Ｂおよび有機硫黄化合物分解酵素をコードする遺伝子
ｄｓｏＡＢＣＤＥＦから選択された遺伝子断片の１また
は２からなる遺伝子断片を含む組換プラスミドである。 【効果】 有機塩素化合物分解用組換プラスミドは、有
機塩素化合物分解能の高い酵素を生合成させることがで
きる。また、有機塩素化合物分解用形質転換体は、組換
プラスミドにより形質転換されているので、有機塩素化
合物分解能が高い。
組換菌を用いて、有機化合物による汚染水、土壌の修復
を行うものである。 【解決手段】 有機塩素化合物に対するシュードモナス
フルオレッセンスＩＰ０１由来のクメン分解酵素をコ
ードする遺伝子の部分遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ
４Ｂおよび有機硫黄化合物分解酵素をコードする遺伝子
ｄｓｏＡＢＣＤＥＦから選択された遺伝子断片の１また
は２からなる遺伝子断片を含む組換プラスミドである。 【効果】 有機塩素化合物分解用組換プラスミドは、有
機塩素化合物分解能の高い酵素を生合成させることがで
きる。また、有機塩素化合物分解用形質転換体は、組換
プラスミドにより形質転換されているので、有機塩素化
合物分解能が高い。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、宿主細胞に有機塩
素化合物に対する分解能を付与することができる有機塩
素系化合物分解用プラスミド、該プラスミドを保有する
細胞及び該細胞を用いることを特徴とする有機塩素化合
物の分解方法に関する。
素化合物に対する分解能を付与することができる有機塩
素系化合物分解用プラスミド、該プラスミドを保有する
細胞及び該細胞を用いることを特徴とする有機塩素化合
物の分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】トリクロロエチレン、テトラクロロエチ
レン等の塩素化エチレンは工業用洗浄剤や溶剤として広
く使用されているが、これらによる土壌、地下水汚染が
指摘されており、毒性があるこれらによる汚染浄化が早
急に求められている。従来トリクロロエチレン、テトラ
クロロエチレンのような有機塩素化合物の除去方法とし
ては、活性炭などによる吸着処理や、光や熱による分解
処理、また汚染された地下水や土壌の処理方法として真
空脱気処理などの物理的処理によって有機塩素化合物を
除去する方法が施行または提案されているが、最近にお
いてはコストや操作性の面から微生物を用いた分解処理
法が注目されてきている。
レン等の塩素化エチレンは工業用洗浄剤や溶剤として広
く使用されているが、これらによる土壌、地下水汚染が
指摘されており、毒性があるこれらによる汚染浄化が早
急に求められている。従来トリクロロエチレン、テトラ
クロロエチレンのような有機塩素化合物の除去方法とし
ては、活性炭などによる吸着処理や、光や熱による分解
処理、また汚染された地下水や土壌の処理方法として真
空脱気処理などの物理的処理によって有機塩素化合物を
除去する方法が施行または提案されているが、最近にお
いてはコストや操作性の面から微生物を用いた分解処理
法が注目されてきている。
【０００３】有機塩素化合物を分解する微生物として
は、メタン、プロパン、メタノールを代謝するメチロシ
スティス属やメチロモナス属のメタン資化菌、ニトロソ
モナス属のアンモニア資化菌、トルエン、フェノールを
代謝するシュードモナス属のトルエン、フェノール資化
菌等が知られている。しかし、これらの微生物は単独で
有機塩素化合物を分解することができず、各々の分解経
路を維持するためにメタンやトルエン等の誘導物質を添
加する必要があり、これらの微生物を用いて水、土壌を
液相で接触させて処理を行った際に添加した誘導物質を
除去する必要がある。また上記の様な有機塩素化合物分
解能を有する自然菌の分解能は低く、効率よく有機塩素
系化合物を分解できないという問題点がある。
は、メタン、プロパン、メタノールを代謝するメチロシ
スティス属やメチロモナス属のメタン資化菌、ニトロソ
モナス属のアンモニア資化菌、トルエン、フェノールを
代謝するシュードモナス属のトルエン、フェノール資化
菌等が知られている。しかし、これらの微生物は単独で
有機塩素化合物を分解することができず、各々の分解経
路を維持するためにメタンやトルエン等の誘導物質を添
加する必要があり、これらの微生物を用いて水、土壌を
液相で接触させて処理を行った際に添加した誘導物質を
除去する必要がある。また上記の様な有機塩素化合物分
解能を有する自然菌の分解能は低く、効率よく有機塩素
系化合物を分解できないという問題点がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、有機塩素化
合物に対する分解能を有したクメン分解酵素をコードす
る遺伝子と有機硫黄化合物分解酵素をコードする遺伝子
を一つのベクターに組み込んだ組換プラスミドを作製
し、この組換プラスミドを宿主細胞に導入した遺伝子組
換菌を用いて、有機塩素化合物を効率よく分解させ、有
機塩素化合物による汚染水、土壌の修復を行うことを目
的とするものである。
合物に対する分解能を有したクメン分解酵素をコードす
る遺伝子と有機硫黄化合物分解酵素をコードする遺伝子
を一つのベクターに組み込んだ組換プラスミドを作製
し、この組換プラスミドを宿主細胞に導入した遺伝子組
換菌を用いて、有機塩素化合物を効率よく分解させ、有
機塩素化合物による汚染水、土壌の修復を行うことを目
的とするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、自然界よ
り分離したクメンを分解するシュードモナス フルオレ
ッセンスＩＰ０１がクメンとの共酸化条件下で、また有
機硫黄化合物を分解するアシネトバクター属細菌２０Ｂ
がジメチルスルフィドとの共酸化条件下においてそれぞ
れが有機塩素化合物を分解することを発見し、このクメ
ン分解酵素および有機硫黄化合物分解酵素が有機塩素化
合物も分解することを発見した。
り分離したクメンを分解するシュードモナス フルオレ
ッセンスＩＰ０１がクメンとの共酸化条件下で、また有
機硫黄化合物を分解するアシネトバクター属細菌２０Ｂ
がジメチルスルフィドとの共酸化条件下においてそれぞ
れが有機塩素化合物を分解することを発見し、このクメ
ン分解酵素および有機硫黄化合物分解酵素が有機塩素化
合物も分解することを発見した。
【０００６】そこで、このシュードモナス フルオレッ
センスＩＰ０１のクメン酸化酵素遺伝子群の部分遺伝子
ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂのアミノ酸配列（ＤＤＢＪ，
ＥＭＢＬ，ＧｅｎｅＢａｎｋ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ ａｃｃｅｓｓｉ
ｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ３７８２８に登録）をコードす
る塩基配列を含んでいるプラスミドを作製し、このプラ
スミドを細胞に導入し、該アミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遺伝子を含むプラスミドを保有している
細胞を育種し、この細胞を用いることによって有機塩素
化合物を分解除去できるようにし、本発明の１部を完成
した。
センスＩＰ０１のクメン酸化酵素遺伝子群の部分遺伝子
ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂのアミノ酸配列（ＤＤＢＪ，
ＥＭＢＬ，ＧｅｎｅＢａｎｋ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅ ａｃｃｅｓｓｉ
ｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ３７８２８に登録）をコードす
る塩基配列を含んでいるプラスミドを作製し、このプラ
スミドを細胞に導入し、該アミノ酸配列をコードする塩
基配列を有する遺伝子を含むプラスミドを保有している
細胞を育種し、この細胞を用いることによって有機塩素
化合物を分解除去できるようにし、本発明の１部を完成
した。
【０００７】更にまた、アシネトバクター属細菌２０Ｂ
株の有機硫黄分解酵素遺伝子ｄｓｏＡＢＣＤＥＦのアミ
ノ酸配列（ＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，ＧｅｎｅＢａｎｋ ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａ
ｓｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ Ｄ８５０８３
に登録）をコードする塩基配列を含んでいるプラスミド
を作製し、このプラスミドを細胞に導入し、該アミノ酸
をコードする塩基配列を有する遺伝子を含むプラスミド
を保有している細胞を育種し、この細胞を用いることに
よって有機塩素化合物を分解除去できるようにし、本発
明の１部を完成した。
株の有機硫黄分解酵素遺伝子ｄｓｏＡＢＣＤＥＦのアミ
ノ酸配列（ＤＤＢＪ，ＥＭＢＬ，ＧｅｎｅＢａｎｋ ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａ
ｓｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ Ｄ８５０８３
に登録）をコードする塩基配列を含んでいるプラスミド
を作製し、このプラスミドを細胞に導入し、該アミノ酸
をコードする塩基配列を有する遺伝子を含むプラスミド
を保有している細胞を育種し、この細胞を用いることに
よって有機塩素化合物を分解除去できるようにし、本発
明の１部を完成した。
【０００８】更に、本発明者らは研究を重ねた結果、前
記シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１のクメン
酸化酵素遺伝子群の部分遺伝子ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４
Ｂのアミノ酸配列をコードする塩基配列と、アシネトバ
クター属細菌２０Ｂの有機硫黄分解酵素遺伝子ｄｓｏＡ
ＢＣＤＥＦのアミノ酸配列を含んでいるプラスミドを作
製し、これらのプラスミドを細胞に導入して形質転換体
を作成し、該アミノ酸をコードする塩基配列を有する遺
伝子を含むプラスミドを保有している形質転換体の細胞
を育種し、この細胞を用いることによって有機塩素化合
物を分解除去できることを、意外にも発見し、本発明を
完成するに至った。
記シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１のクメン
酸化酵素遺伝子群の部分遺伝子ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４
Ｂのアミノ酸配列をコードする塩基配列と、アシネトバ
クター属細菌２０Ｂの有機硫黄分解酵素遺伝子ｄｓｏＡ
ＢＣＤＥＦのアミノ酸配列を含んでいるプラスミドを作
製し、これらのプラスミドを細胞に導入して形質転換体
を作成し、該アミノ酸をコードする塩基配列を有する遺
伝子を含むプラスミドを保有している形質転換体の細胞
を育種し、この細胞を用いることによって有機塩素化合
物を分解除去できることを、意外にも発見し、本発明を
完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明の目的は、シュードモナ
ス フルオレッセンスＩＰ０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＩＰ０１）由来のクメン
分解酵素をコードする構造遺伝子の部分遺伝子ｃｕｍＡ
１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂを活性部位とし、薬剤耐性遺伝子、自
律的複製に必要な遺伝子および複製開始部位を含む広宿
主域複製領域とを結合させた有機塩素化合物分解用組換
プラスミド、この組換プラスミドを保有した細胞を用い
ることを特徴とする有機塩素化合物の分解、及び有機塩
素化合物による汚染浄化方法である。
ス フルオレッセンスＩＰ０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＩＰ０１）由来のクメン
分解酵素をコードする構造遺伝子の部分遺伝子ｃｕｍＡ
１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂを活性部位とし、薬剤耐性遺伝子、自
律的複製に必要な遺伝子および複製開始部位を含む広宿
主域複製領域とを結合させた有機塩素化合物分解用組換
プラスミド、この組換プラスミドを保有した細胞を用い
ることを特徴とする有機塩素化合物の分解、及び有機塩
素化合物による汚染浄化方法である。
【００１０】本発明の他の目的は、アシネトバクター属
細菌２０Ｂ株由来の有機硫黄化合物分解酵素をコードす
る構造遺伝子ｄｓｏＡＢＣＤＥＦを活性部位とし、薬剤
耐性遺伝子、自律的複製に必要な遺伝子および複製開始
部位を含む広宿主域複製領域とを結合させた有機塩素化
合物分解用組換プラスミド、この組換プラスミドを保有
した細胞を用いることを特徴とする有機塩素化合物の分
解、及び有機塩素化合物による汚染浄化方法である。
細菌２０Ｂ株由来の有機硫黄化合物分解酵素をコードす
る構造遺伝子ｄｓｏＡＢＣＤＥＦを活性部位とし、薬剤
耐性遺伝子、自律的複製に必要な遺伝子および複製開始
部位を含む広宿主域複製領域とを結合させた有機塩素化
合物分解用組換プラスミド、この組換プラスミドを保有
した細胞を用いることを特徴とする有機塩素化合物の分
解、及び有機塩素化合物による汚染浄化方法である。
【００１１】本発明の更に別の目的は、シュードモナス
フルオレッセンスＩＰ０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＩＰ０１）由来のクメン分
解酵素をコードする構造遺伝子の部分遺伝子ｃｕｍＡ１
Ａ２Ａ３Ａ４Ｂと、アシネトバクター属細菌２０Ｂ由来
の有機硫黄化合物分解酵素をコードする構造遺伝子ｄｓ
ｏＡＢＣＤＥＦを活性部位とし、薬剤耐性遺伝子、自律
的複製に必要な遺伝子および複製開始部位を含む広宿主
域複製領域とを結合させた有機塩素化合物分解用組換プ
ラスミド、この組換プラスミドを保有した細胞を用いる
ことを特徴とする有機塩素化合物の分解、及び有機塩素
化合物による汚染浄化方法である。
フルオレッセンスＩＰ０１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＩＰ０１）由来のクメン分
解酵素をコードする構造遺伝子の部分遺伝子ｃｕｍＡ１
Ａ２Ａ３Ａ４Ｂと、アシネトバクター属細菌２０Ｂ由来
の有機硫黄化合物分解酵素をコードする構造遺伝子ｄｓ
ｏＡＢＣＤＥＦを活性部位とし、薬剤耐性遺伝子、自律
的複製に必要な遺伝子および複製開始部位を含む広宿主
域複製領域とを結合させた有機塩素化合物分解用組換プ
ラスミド、この組換プラスミドを保有した細胞を用いる
ことを特徴とする有機塩素化合物の分解、及び有機塩素
化合物による汚染浄化方法である。
【００１２】本発明における分解の対象となる有機塩素
化合物は塩素化エチレンであり、その中には、モノ、
ジ、トリ、テトラクロロエチレンが含まれるが、特にト
リクロロエチレン、叉はテトラクロロエチレンが適して
いる。
化合物は塩素化エチレンであり、その中には、モノ、
ジ、トリ、テトラクロロエチレンが含まれるが、特にト
リクロロエチレン、叉はテトラクロロエチレンが適して
いる。
【００１３】本発明で使用する遺伝子の、遺伝子断片ｃ
ｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂ、ｄｓｏＡＢＣＤＥＦは、ＤＤ
ＢＪ，ＥＭＢＬ，ＧｅｎｅＢａｎｋ ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅにおいてａｃ
ｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ３７８２８及びａｃ
ｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ８５０８３として登
録されている。遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂは
クメンを３−イソプロピルカテコールに酸化するクメン
ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子であると認めら
れ、インドールをインジゴへ酸化することも認められて
いる。
ｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂ、ｄｓｏＡＢＣＤＥＦは、ＤＤ
ＢＪ，ＥＭＢＬ，ＧｅｎｅＢａｎｋ ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅにおいてａｃ
ｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ３７８２８及びａｃ
ｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ８５０８３として登
録されている。遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂは
クメンを３−イソプロピルカテコールに酸化するクメン
ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子であると認めら
れ、インドールをインジゴへ酸化することも認められて
いる。
【００１４】また、遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥＦは、
ジメチルスルフィドをジメチルスルホキサイドに、ジメ
チルスルホキサイドをジメチルスルホンに酸化するジメ
チルスルフィドモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子
であると認められ、上記のクメンジオキシゲナーゼと同
様にインドールをインジゴへ酸化することも認められて
いる。このクメンジオキシゲナーゼ、及びジメチルスル
フィドモノオキシゲナーゼがトリクロロエチレンを分解
すると考えられる。クメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ
１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂについては、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ３（１９９６）に詳
述されている。
ジメチルスルフィドをジメチルスルホキサイドに、ジメ
チルスルホキサイドをジメチルスルホンに酸化するジメ
チルスルフィドモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子
であると認められ、上記のクメンジオキシゲナーゼと同
様にインドールをインジゴへ酸化することも認められて
いる。このクメンジオキシゲナーゼ、及びジメチルスル
フィドモノオキシゲナーゼがトリクロロエチレンを分解
すると考えられる。クメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ
１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂについては、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ３（１９９６）に詳
述されている。
【００１５】クメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２
Ａ３Ａ４Ｂを得るには、前記シュードモナス フルオレ
ッセンス ＩＰ０１から制限酵素により切り出すことが
できる。この菌株からの遺伝子ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４
Ｂの切り出しは、前記菌株を例えば下記の無機培地（ｐ
Ｈ７．０）でクメンを唯一炭素源として培養、増殖さ
せ、ＳＤＳ−アルカリ溶菌法により染色体ＤＮＡを調製
し、ついで染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断
することにより行うことができる。
Ａ３Ａ４Ｂを得るには、前記シュードモナス フルオレ
ッセンス ＩＰ０１から制限酵素により切り出すことが
できる。この菌株からの遺伝子ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４
Ｂの切り出しは、前記菌株を例えば下記の無機培地（ｐ
Ｈ７．０）でクメンを唯一炭素源として培養、増殖さ
せ、ＳＤＳ−アルカリ溶菌法により染色体ＤＮＡを調製
し、ついで染色体ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断
することにより行うことができる。
【００１６】無機培地： Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２．２ ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．８ ｇ ＮＨ4 ＮＯ3 ３．０ ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０．０ ｍｇ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １０．０ ｍｇ ＣａＣｌ2 １０．０ ｍｇ 蒸留水 全量で１０００ ｍｌとする このような方法により切りだしたクメン分解遺伝子の制
限酵素地図を図１に示す。
限酵素地図を図１に示す。
【００１７】有機硫黄化合物分解酵素遺伝子断片ｄｓｏ
ＡＢＣＤＥＦを得るには、前記アシネトバクター属細菌
２０Ｂの染色体から制限酵素により同様に切り出すこと
ができる。この菌株からの遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥ
Ｆ前記菌株を例えばコハク酸を唯一炭素源とした下記の
無機培地（ｐＨ７．０）でジメチルスルフィドを唯一硫
黄源として培養、増殖させ、ＳＤＳ−アルカリ用菌法に
より染色体ＤＮＡを調製し、ついで染色体ＤＮＡをＸｂ
ａＩ、ＳａｌＩで切断することにより行うことができ
る。
ＡＢＣＤＥＦを得るには、前記アシネトバクター属細菌
２０Ｂの染色体から制限酵素により同様に切り出すこと
ができる。この菌株からの遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥ
Ｆ前記菌株を例えばコハク酸を唯一炭素源とした下記の
無機培地（ｐＨ７．０）でジメチルスルフィドを唯一硫
黄源として培養、増殖させ、ＳＤＳ−アルカリ用菌法に
より染色体ＤＮＡを調製し、ついで染色体ＤＮＡをＸｂ
ａＩ、ＳａｌＩで切断することにより行うことができ
る。
【００１８】無機培地： （ＣＨ2 ＣＯＯＮａ）2 ・６Ｈ2 Ｏ １０．０ ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２．２ ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．８ ｇ ＮＨ4 ＮＯ3 ３．０ ｇ ＭｇＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １０．０ ｍｇ ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ １０．０ ｍｇ ＣａＣｌ2 １０．０ ｍｇ 蒸留水 全量で１０００ ｍｌとする このような方法で切りだした有機硫黄化合物分解酵素遺
伝子の制限酵素地図を図２に示す。
伝子の制限酵素地図を図２に示す。
【００１９】本発明のクメン分解酵素遺伝子断片を含む
有機塩素分解用組換プラスミドは次のＤＮＡ断片をリガ
ーゼで連結して構築できる。 １）シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１染色体
由来のクメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ
４Ｂ遺伝子 ２）薬剤耐性遺伝子 ３）広宿主域複製領域を含む遺伝子
有機塩素分解用組換プラスミドは次のＤＮＡ断片をリガ
ーゼで連結して構築できる。 １）シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１染色体
由来のクメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ
４Ｂ遺伝子 ２）薬剤耐性遺伝子 ３）広宿主域複製領域を含む遺伝子
【００２０】薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐
性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が採用
できる。これら薬剤耐性遺伝子は、ｐＢＲ３２２、ｐＡ
ＣＹＣ１７７、ｐＫＴ２４０などのプラスミドから分離
できる。広宿主域複製領域遺伝子は、組換プラスミドが
グラム陰性細菌内で独立して増殖し、安定して保持され
るのに必要な遺伝子であり、プラスミドｐＢＲ３２２、
ＲＳＦ１０１０由来のものなどを採用できるが、これら
に限定されない。
性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が採用
できる。これら薬剤耐性遺伝子は、ｐＢＲ３２２、ｐＡ
ＣＹＣ１７７、ｐＫＴ２４０などのプラスミドから分離
できる。広宿主域複製領域遺伝子は、組換プラスミドが
グラム陰性細菌内で独立して増殖し、安定して保持され
るのに必要な遺伝子であり、プラスミドｐＢＲ３２２、
ＲＳＦ１０１０由来のものなどを採用できるが、これら
に限定されない。
【００２１】本発明の有機硫黄化合物分解酵素遺伝子断
片を含む有機塩素分解用組換プラスミドは次のＤＮＡ断
片をリガーゼで連結して構築できる。 １）アシネトバクター属細菌２０Ｂ株染色体由来の有機
硫黄化合物分解酵素遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥＦ遺伝
子 ２）薬剤耐性遺伝子 ３）広宿主域複製領域を含む遺伝子
片を含む有機塩素分解用組換プラスミドは次のＤＮＡ断
片をリガーゼで連結して構築できる。 １）アシネトバクター属細菌２０Ｂ株染色体由来の有機
硫黄化合物分解酵素遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥＦ遺伝
子 ２）薬剤耐性遺伝子 ３）広宿主域複製領域を含む遺伝子
【００２２】薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐
性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が採用
できる。これら薬剤耐性遺伝子は、ｐＢＲ３２２、ｐＡ
ＣＹＣ１７７、ｐＫＴ２４０などのプラスミドから分離
できる。広宿主域複製領域遺伝子は、組換プラスミドが
グラム陰性細菌内で独立して増殖し、安定して保持され
るのに必要な遺伝子であり、プラスミドｐＢＲ３２２、
ＲＳＦ１０１０由来のものなどを採用できるが、これら
に限定されない。
性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が採用
できる。これら薬剤耐性遺伝子は、ｐＢＲ３２２、ｐＡ
ＣＹＣ１７７、ｐＫＴ２４０などのプラスミドから分離
できる。広宿主域複製領域遺伝子は、組換プラスミドが
グラム陰性細菌内で独立して増殖し、安定して保持され
るのに必要な遺伝子であり、プラスミドｐＢＲ３２２、
ＲＳＦ１０１０由来のものなどを採用できるが、これら
に限定されない。
【００２３】本発明のクメン分解酵素をコードする遺伝
子断片および有機硫黄化合物分解酵素をコードする遺伝
子を含む有機塩素分解用組換プラスミドは次のＤＮＡ断
片をリガーゼで連結して構築できる。 １）シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１染色体
由来のクメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ
４Ｂ遺伝子 ２）アシネトバクター属細菌２０Ｂ株染色体由来の有機
硫黄化合物分解酵素遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥＦ遺伝
子 ３）薬剤耐性遺伝子 ４）広宿主域複製領域を含む遺伝子
子断片および有機硫黄化合物分解酵素をコードする遺伝
子を含む有機塩素分解用組換プラスミドは次のＤＮＡ断
片をリガーゼで連結して構築できる。 １）シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１染色体
由来のクメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ
４Ｂ遺伝子 ２）アシネトバクター属細菌２０Ｂ株染色体由来の有機
硫黄化合物分解酵素遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥＦ遺伝
子 ３）薬剤耐性遺伝子 ４）広宿主域複製領域を含む遺伝子
【００２４】薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐
性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が採用
できる。これら薬剤耐性遺伝子は、ｐＢＲ３２２、ｐＡ
ＣＹＣ１７７、ｐＫＴ２４０などのプラスミドから分離
できる。広宿主域複製領域遺伝子は、組換プラスミドが
グラム陰性細菌内で独立して増殖し、安定して保持され
るのに必要な遺伝子であり、プラスミドｐＢＲ３２２、
ＲＳＦ１０１０由来のものなどを採用できるが、これら
に限定されない。
性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が採用
できる。これら薬剤耐性遺伝子は、ｐＢＲ３２２、ｐＡ
ＣＹＣ１７７、ｐＫＴ２４０などのプラスミドから分離
できる。広宿主域複製領域遺伝子は、組換プラスミドが
グラム陰性細菌内で独立して増殖し、安定して保持され
るのに必要な遺伝子であり、プラスミドｐＢＲ３２２、
ＲＳＦ１０１０由来のものなどを採用できるが、これら
に限定されない。
【００２５】前記した本発明の組換プラスミドは、いず
れもｔａｃ、叉はｌａｃプロモータなどのプロモータに
より有機塩素化合物の分解能を発現させるのが望まし
い。ｌａｃリプレッサーにより調節されるｔａｃ、叉は
ｌａｃプロモータは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピレノシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質がｌａｃリプ
レッサーを不活性化することによって転写を誘発する。
組換プラスミドの宿主細胞への導入は、カルシウムおよ
びルビジウム処理による法、エレクトロポーレーション
法、ヘルパープラスミドを用いた伝達法、Ｈａｎａｈａ
ｎの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａｌ
ａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９
８２）等の常法によって行うことが可能である。
れもｔａｃ、叉はｌａｃプロモータなどのプロモータに
より有機塩素化合物の分解能を発現させるのが望まし
い。ｌａｃリプレッサーにより調節されるｔａｃ、叉は
ｌａｃプロモータは、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピレノシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質がｌａｃリプ
レッサーを不活性化することによって転写を誘発する。
組換プラスミドの宿主細胞への導入は、カルシウムおよ
びルビジウム処理による法、エレクトロポーレーション
法、ヘルパープラスミドを用いた伝達法、Ｈａｎａｈａ
ｎの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａｌ
ａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９
８２）等の常法によって行うことが可能である。
【００２６】宿主細胞としては、組換プラスミドが安定
に保持される大腸菌などのグラム陰性細菌が望ましい。
本発明の有機塩素化合物分解用形質転換体は、前記した
組換プラスミドを導入した形質転換体であり、この形質
転換体を用いて有機塩素系化合物、特にトリクロロエチ
レンを効率よく分解できる。この有機塩素化合物の分解
は、これらを含む培地中で形質転換体を好気培養する方
法により行うことができる。
に保持される大腸菌などのグラム陰性細菌が望ましい。
本発明の有機塩素化合物分解用形質転換体は、前記した
組換プラスミドを導入した形質転換体であり、この形質
転換体を用いて有機塩素系化合物、特にトリクロロエチ
レンを効率よく分解できる。この有機塩素化合物の分解
は、これらを含む培地中で形質転換体を好気培養する方
法により行うことができる。
【００２７】有機塩素化合物分解用形質転換体の培養
は、宿主細胞の生育に適した条件で行われるが、炭素源
および窒素源としてトリプトン、ペプトン、酵母エキス
等、無機塩として塩化ナトリウム、塩化カリウム等を用
いて、培地ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６〜７、温度１
５〜４０℃、好ましくは３５℃前後で好気的に培養する
のが好ましい。
は、宿主細胞の生育に適した条件で行われるが、炭素源
および窒素源としてトリプトン、ペプトン、酵母エキス
等、無機塩として塩化ナトリウム、塩化カリウム等を用
いて、培地ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６〜７、温度１
５〜４０℃、好ましくは３５℃前後で好気的に培養する
のが好ましい。
【００２８】
【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明を詳述
するが、本発明は、本実施例によって限定されるもので
はない。 実施例 １ 本実施例において遺伝子操作に関する一般的な技法は、
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２に準じた。シュードモナス
フルオレッセンスＩＰ０１の染色体ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄIII で切断し、このＤＮＡをＨｉｎｄIII で切
断したプラスミドｐＵＣ１１９に組み込み、エセリシア
コリ ＭＶ１１８４に導入して図３に示す形質転換体
を得た。大腸菌の形質転換法は従法に従えばよいが、な
るべく遺伝子導入効率の高い形質転換法、例えば、Ｈａ
ｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５
７−５８０（１９８３）に準じて行うことが望ましい。
この形質転換体にインドールを気体状で与え、菌体内で
インジゴを生成して強く青変した菌体を培養した。この
菌体中には、図１に示した制限酵素地図で示される遺伝
子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４ＢがｐＵＣ１１９に組み
込まれたプラスミドｐＩ１０７が保持されている。この
大腸菌をエセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐＩＰ１０
７）と呼ぶ。
するが、本発明は、本実施例によって限定されるもので
はない。 実施例 １ 本実施例において遺伝子操作に関する一般的な技法は、
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２に準じた。シュードモナス
フルオレッセンスＩＰ０１の染色体ＤＮＡを制限酵素
ＨｉｎｄIII で切断し、このＤＮＡをＨｉｎｄIII で切
断したプラスミドｐＵＣ１１９に組み込み、エセリシア
コリ ＭＶ１１８４に導入して図３に示す形質転換体
を得た。大腸菌の形質転換法は従法に従えばよいが、な
るべく遺伝子導入効率の高い形質転換法、例えば、Ｈａ
ｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５
７−５８０（１９８３）に準じて行うことが望ましい。
この形質転換体にインドールを気体状で与え、菌体内で
インジゴを生成して強く青変した菌体を培養した。この
菌体中には、図１に示した制限酵素地図で示される遺伝
子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４ＢがｐＵＣ１１９に組み
込まれたプラスミドｐＩ１０７が保持されている。この
大腸菌をエセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐＩＰ１０
７）と呼ぶ。
【００２９】実施例 ２ 実施例１で得た形質転換体を用いて、トリクロロエタン
の分解実験を次の様に行った。エセリシア コリ ＭＶ
１１８４（ｐＩＰ１０７）を２×ＹＴ培地（バクトトリ
プトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、蒸留
水１リットル）で３７℃にて培養した。抗生物質はアン
ピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。
６００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５に達した時点で
ＩＰＴＧを終濃度で２５ｎｇ／ｍｌ添加し、６００ｎｍ
での吸光度が１．０〜２．０に達した時点で遠心分離に
より集菌し、菌体を無機培地（ｐＨ７．０）に懸濁し
た。
の分解実験を次の様に行った。エセリシア コリ ＭＶ
１１８４（ｐＩＰ１０７）を２×ＹＴ培地（バクトトリ
プトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、蒸留
水１リットル）で３７℃にて培養した。抗生物質はアン
ピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。
６００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５に達した時点で
ＩＰＴＧを終濃度で２５ｎｇ／ｍｌ添加し、６００ｎｍ
での吸光度が１．０〜２．０に達した時点で遠心分離に
より集菌し、菌体を無機培地（ｐＨ７．０）に懸濁し
た。
【００３０】この菌懸濁液５ｍｌをジーエルサイエンス
社製の１３ｍｌ容バイアル瓶にいれ、テフロンコートブ
チルゴム栓をし、アルミキャップでシールした後、菌懸
濁液中の終濃度が１０、５０、１００ｍｇ／ｌとなるよ
うにトリクロロエチレンをテフロンコートブチルゴム栓
を通して添加した。このバイアル瓶を３０℃、３００ｒ
ｐｍで振とう培養し、定期的にバイアル瓶の気相をガス
タイトシリンジで０．１ｍｌサンプリングし、トリクロ
ロエチレンの分解試験を行った。トリクロロエチレンの
分解量の分析は、下記ガスクロマトグラフィーの条件で
行った。
社製の１３ｍｌ容バイアル瓶にいれ、テフロンコートブ
チルゴム栓をし、アルミキャップでシールした後、菌懸
濁液中の終濃度が１０、５０、１００ｍｇ／ｌとなるよ
うにトリクロロエチレンをテフロンコートブチルゴム栓
を通して添加した。このバイアル瓶を３０℃、３００ｒ
ｐｍで振とう培養し、定期的にバイアル瓶の気相をガス
タイトシリンジで０．１ｍｌサンプリングし、トリクロ
ロエチレンの分解試験を行った。トリクロロエチレンの
分解量の分析は、下記ガスクロマトグラフィーの条件で
行った。
【００３１】カラム充填物 ：ＧＡＳＵＫＵＲ
Ｏ Ｐａｃｋ５４（ジーエルサイエンス社製） ガスクロマトグラフィー：Ｇ−５０００（日立製作所社
製） 検出器 ：ＦＩＤ検出器 カラム温度 ：１８０℃ 試料導入部温度 ：１５０℃ 検出器温度 ：２００℃ キャリヤーガス ：窒素
Ｏ Ｐａｃｋ５４（ジーエルサイエンス社製） ガスクロマトグラフィー：Ｇ−５０００（日立製作所社
製） 検出器 ：ＦＩＤ検出器 カラム温度 ：１８０℃ 試料導入部温度 ：１５０℃ 検出器温度 ：２００℃ キャリヤーガス ：窒素
【００３２】対照としては、シュードモナス フルオレ
ッセンスＩＰ０１を用いた。結果を図４に示す、図４の
結果から、実施例の形質転換体は、いずれも対照のもの
と比べ約４〜１０倍の分解速度でトリクロロレチレンを
分解しており、本発明の組換形質転換体が、トリクロロ
エチレンの分解に非常に有効であることがわかる。
ッセンスＩＰ０１を用いた。結果を図４に示す、図４の
結果から、実施例の形質転換体は、いずれも対照のもの
と比べ約４〜１０倍の分解速度でトリクロロレチレンを
分解しており、本発明の組換形質転換体が、トリクロロ
エチレンの分解に非常に有効であることがわかる。
【００３３】実施例 ３ アシネトバクター属細菌２０Ｂ株の染色体ＤＮＡを制限
酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで切断し、このＤＮＡをＸｂａ
Ｉ、ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１１８に組み込み、エセ
リシア コリ ＭＶ１１８４に導入して図５に示す形質
転換体を得た。大腸菌の形質転換法は従法に従えばよい
が、なるべく遺伝子導入効率の高い形質転換法、例え
ば、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６
６，５５７−５８０（１９８３）に準じて行うことが望
ましい。この形質転換体にインドールを気体状で与え、
菌体内でインジゴを生成して強く青変した菌体を培養し
た。この菌体中には、図２に示した制限酵素地図で示さ
れる遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥＦがｐＵＣ１１８に組
み込まれたプラスミドｐ２０ＸＳが保持されている。こ
の大腸菌をエセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐ２０Ｘ
Ｓ）と呼ぶ。
酵素ＸｂａＩ、ＳａｌＩで切断し、このＤＮＡをＸｂａ
Ｉ、ＳａｌＩで切断したｐＵＣ１１８に組み込み、エセ
リシア コリ ＭＶ１１８４に導入して図５に示す形質
転換体を得た。大腸菌の形質転換法は従法に従えばよい
が、なるべく遺伝子導入効率の高い形質転換法、例え
ば、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６
６，５５７−５８０（１９８３）に準じて行うことが望
ましい。この形質転換体にインドールを気体状で与え、
菌体内でインジゴを生成して強く青変した菌体を培養し
た。この菌体中には、図２に示した制限酵素地図で示さ
れる遺伝子断片ｄｓｏＡＢＣＤＥＦがｐＵＣ１１８に組
み込まれたプラスミドｐ２０ＸＳが保持されている。こ
の大腸菌をエセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐ２０Ｘ
Ｓ）と呼ぶ。
【００３４】実施例 ４ 実施例３で得た形質転換体を用いて、トリクロロエタン
の分解実験を次の様に行った。エセリシア コリ ＭＶ
１１８４（ｐ２０ＸＳ）を２×ＹＴ培地（バクトトリプ
トン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、蒸留水
１リットル）で３７℃にて培養した。抗生物質はアンピ
シリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。６
００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５に達した時点でＩ
ＰＴＧを終濃度で２５ｎｇ／ｍｌ添加し、６００ｎｍで
の吸光度が１．０〜２．０に達した時点で遠心分離によ
り集菌し、菌体を無機培地（ｐＨ７．０）に懸濁した。
の分解実験を次の様に行った。エセリシア コリ ＭＶ
１１８４（ｐ２０ＸＳ）を２×ＹＴ培地（バクトトリプ
トン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、蒸留水
１リットル）で３７℃にて培養した。抗生物質はアンピ
シリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。６
００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５に達した時点でＩ
ＰＴＧを終濃度で２５ｎｇ／ｍｌ添加し、６００ｎｍで
の吸光度が１．０〜２．０に達した時点で遠心分離によ
り集菌し、菌体を無機培地（ｐＨ７．０）に懸濁した。
【００３５】この菌懸濁液５ｍｌをジーエルサイエンス
社製の１３ｍｌ容バイアル瓶にいれ、テフロンコートブ
チルゴム栓をし、アルミキャップでシールした後、菌懸
濁液中の終濃度が１０、５０、１００ｍｇ／ｌとなるよ
うにトリクロロエチレンをテフロンコートブチルゴム栓
を通して添加した。このバイアル瓶を３０℃、３００ｒ
ｐｍで振とう培養し、定期的にバイアル瓶の気相をガス
タイトシリンジで０．１ｍｌサンプリングし、トリクロ
ロエチレンの分解試験を行った。トリクロロエチレンの
分解量の分析は、下記ガスクロマトグラフィーの条件で
行った。
社製の１３ｍｌ容バイアル瓶にいれ、テフロンコートブ
チルゴム栓をし、アルミキャップでシールした後、菌懸
濁液中の終濃度が１０、５０、１００ｍｇ／ｌとなるよ
うにトリクロロエチレンをテフロンコートブチルゴム栓
を通して添加した。このバイアル瓶を３０℃、３００ｒ
ｐｍで振とう培養し、定期的にバイアル瓶の気相をガス
タイトシリンジで０．１ｍｌサンプリングし、トリクロ
ロエチレンの分解試験を行った。トリクロロエチレンの
分解量の分析は、下記ガスクロマトグラフィーの条件で
行った。
【００３６】カラム充填物 ：ＧＡＳＵＫＵＲ
Ｏ Ｐａｃｋ５４（ジーエルサイエンス社製） ガスクロマトグラフィー：Ｇ−５０００（日立製作所社
製） 検出器 ：ＦＩＤ検出器 カラム温度 ：１８０℃ 試料導入部温度 ：１５０℃ 検出器温度 ：２００℃ キャリヤーガス ：窒素
Ｏ Ｐａｃｋ５４（ジーエルサイエンス社製） ガスクロマトグラフィー：Ｇ−５０００（日立製作所社
製） 検出器 ：ＦＩＤ検出器 カラム温度 ：１８０℃ 試料導入部温度 ：１５０℃ 検出器温度 ：２００℃ キャリヤーガス ：窒素
【００３７】対照としては、アシネトバクター属細菌２
０Ｂ株を用いた。結果を図９に示す、図６の結果から、
実施例の形質転換体は、いずれも対照のものと比べ約４
〜１０倍の分解速度でトリクロロレチレンを分解してお
り、本発明の組換形質転換体が、トリクロロエチレンの
分解に非常に有効であることがわかる。
０Ｂ株を用いた。結果を図９に示す、図６の結果から、
実施例の形質転換体は、いずれも対照のものと比べ約４
〜１０倍の分解速度でトリクロロレチレンを分解してお
り、本発明の組換形質転換体が、トリクロロエチレンの
分解に非常に有効であることがわかる。
【００３８】実施例 ５ シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１の染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断し、このＤＮＡをＨ
ｉｎｄIII で切断したプラスミドｐＵＣ１１９に組み込
み、組換プラスミドｐＩＰ１０７を得た。次にアシネト
バクター属細菌２０Ｂの染色体ＤＮＡを制限酵素Ｘｂａ
Ｉ、ＳａｌＩで切断し、このＤＮＡをＸｂａＩ、Ｓａｌ
Ｉで切断したプラスミドｐＵＣ１１８に組み込み、組換
プラスミド２０ＸＳを得た。次に、プラスミドｐ２０Ｘ
Ｓを制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｃIIで切断し、この切断
されたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩ、ＳｍａＩで切断
したプラスミドｐＩＰ１０７とライゲーションを行い、
図７に示すプラスミドｐ１０７２０を得た。
ＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIII で切断し、このＤＮＡをＨ
ｉｎｄIII で切断したプラスミドｐＵＣ１１９に組み込
み、組換プラスミドｐＩＰ１０７を得た。次にアシネト
バクター属細菌２０Ｂの染色体ＤＮＡを制限酵素Ｘｂａ
Ｉ、ＳａｌＩで切断し、このＤＮＡをＸｂａＩ、Ｓａｌ
Ｉで切断したプラスミドｐＵＣ１１８に組み込み、組換
プラスミド２０ＸＳを得た。次に、プラスミドｐ２０Ｘ
Ｓを制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｃIIで切断し、この切断
されたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｂａＩ、ＳｍａＩで切断
したプラスミドｐＩＰ１０７とライゲーションを行い、
図７に示すプラスミドｐ１０７２０を得た。
【００３９】これをエセリシア コリ ＭＶ１１８４に
導入して形質転換体を得た。大腸菌の形質転換法は、従
法に従えばよいが、なるべく遺伝子導入効率の高い形質
転換法、例えば、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９８３）に準じて
行うことが望ましい。この形質転換体にインドールを気
体状で与え、菌体内でインジゴを生成して強く青変した
菌体を培養した。この菌体中には、図１及び図２に示し
た制限酵素地図で示される遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ
３Ａ４Ｂ、ｄｓｏＡＢＣＤＥＦがｐＵＣ１１９に組み込
まれたプラスミドｐＩ０７２０が保持されている。この
大腸菌をエセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐ１０７２
０）と呼ぶ。
導入して形質転換体を得た。大腸菌の形質転換法は、従
法に従えばよいが、なるべく遺伝子導入効率の高い形質
転換法、例えば、Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１６６，５５７−５８０（１９８３）に準じて
行うことが望ましい。この形質転換体にインドールを気
体状で与え、菌体内でインジゴを生成して強く青変した
菌体を培養した。この菌体中には、図１及び図２に示し
た制限酵素地図で示される遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ
３Ａ４Ｂ、ｄｓｏＡＢＣＤＥＦがｐＵＣ１１９に組み込
まれたプラスミドｐＩ０７２０が保持されている。この
大腸菌をエセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐ１０７２
０）と呼ぶ。
【００４０】実施例 ６ 実施例５で得た形質転換体を用いて、トリクロロエタン
の分解実験を次の様に行った。エセリシア コリ ＭＶ
１１８４（ｐ１０７２０）を２×ＹＴ培地（バクトトリ
プトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、蒸留
水１リットル）で３７℃にて培養した。抗生物質はアン
ピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。
６００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５に達した時点で
ＩＰＴＧを終濃度で２５ｎｇ／ｍｌ添加し、６００ｎｍ
での吸光度が１．０〜２．０に達した時点で遠心分離に
より集菌し、菌体を無機培地（ｐＨ７．０）に懸濁し
た。
の分解実験を次の様に行った。エセリシア コリ ＭＶ
１１８４（ｐ１０７２０）を２×ＹＴ培地（バクトトリ
プトン１６ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、蒸留
水１リットル）で３７℃にて培養した。抗生物質はアン
ピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加した。
６００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５に達した時点で
ＩＰＴＧを終濃度で２５ｎｇ／ｍｌ添加し、６００ｎｍ
での吸光度が１．０〜２．０に達した時点で遠心分離に
より集菌し、菌体を無機培地（ｐＨ７．０）に懸濁し
た。
【００４１】この菌懸濁液５ｍｌをジーエルサイエンス
社製の１３ｍｌ容バイアル瓶にいれ、テフロンコートブ
チルゴム栓をし、アルミキャップでシールした後、菌懸
濁液中の終濃度が５０、１００ｍｇ／ｌとなるようにト
リクロロエチレンをテフロンコートブチルゴム栓を通し
て添加した。このバイアル瓶を３０℃、３００ｒｐｍで
振とう培養し、定期的にバイアル瓶の気相をガスタイト
シリンジで０．１ｍｌサンプリングし、トリクロロエチ
レンの分解試験を行った。トリクロロエチレンの分解量
の分析は、下記ガスクロマトグラフィーの条件で行っ
た。
社製の１３ｍｌ容バイアル瓶にいれ、テフロンコートブ
チルゴム栓をし、アルミキャップでシールした後、菌懸
濁液中の終濃度が５０、１００ｍｇ／ｌとなるようにト
リクロロエチレンをテフロンコートブチルゴム栓を通し
て添加した。このバイアル瓶を３０℃、３００ｒｐｍで
振とう培養し、定期的にバイアル瓶の気相をガスタイト
シリンジで０．１ｍｌサンプリングし、トリクロロエチ
レンの分解試験を行った。トリクロロエチレンの分解量
の分析は、下記ガスクロマトグラフィーの条件で行っ
た。
【００４２】カラム充填物 ：ＧＡＳＵＫＵＲ
Ｏ Ｐａｃｋ５４（ジーエルサイエンス社製） ガスクロマトグラフィー：Ｇ−５０００（日立製作所社
製） 検出器 ：ＦＩＤ検出器 カラム温度 ：１８０℃ 試料導入部温度 ：１５０℃ 検出器温度 ：２００℃ キャリヤーガス ：窒素
Ｏ Ｐａｃｋ５４（ジーエルサイエンス社製） ガスクロマトグラフィー：Ｇ−５０００（日立製作所社
製） 検出器 ：ＦＩＤ検出器 カラム温度 ：１８０℃ 試料導入部温度 ：１５０℃ 検出器温度 ：２００℃ キャリヤーガス ：窒素
【００４３】対照としては、クメン分解酵素遺伝子群お
よび有機硫黄化合物分解酵素遺伝子群をそれぞれ導入し
た低質転換体、エセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐＩ
Ｐ１０７）、エセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐ２０
ＸＳ）を用いた。図８および図９の結果から、実施例の
形質転換体は、いずれも対照のものと比べ約１．５〜２
倍の分解速度でトリクロロレチレンを分解しており、本
発明の組換形質転換体が、トリクロロエチレンの分解に
非常に有効であることがわかる。
よび有機硫黄化合物分解酵素遺伝子群をそれぞれ導入し
た低質転換体、エセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐＩ
Ｐ１０７）、エセリシア コリ ＭＶ１１８４（ｐ２０
ＸＳ）を用いた。図８および図９の結果から、実施例の
形質転換体は、いずれも対照のものと比べ約１．５〜２
倍の分解速度でトリクロロレチレンを分解しており、本
発明の組換形質転換体が、トリクロロエチレンの分解に
非常に有効であることがわかる。
【００４４】
【発明の効果】本発明の有機塩素化合物分解プラスミド
は、シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１由来の
遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂおよび／またはア
シネトバクター属細菌２０Ｂ由来の遺伝子断片ｄｓｏＡ
ＢＣＤＥＦを有機塩素化合物分解能が発現する活性部位
として含有しているので、有機塩素化合物分解能の高い
酵素を生合成させることができる。本発明の有機塩素化
合物分解用形質転換体は、上記組換プラスミドにより形
質転換されているので、有機塩素化合物分解能が高い。
本発明の有機塩素化合物分解方法は、上記形質転換体を
用いているので、有機塩素化合物を簡単かつ迅速に効率
よく分解することができる。
は、シュードモナス フルオレッセンスＩＰ０１由来の
遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂおよび／またはア
シネトバクター属細菌２０Ｂ由来の遺伝子断片ｄｓｏＡ
ＢＣＤＥＦを有機塩素化合物分解能が発現する活性部位
として含有しているので、有機塩素化合物分解能の高い
酵素を生合成させることができる。本発明の有機塩素化
合物分解用形質転換体は、上記組換プラスミドにより形
質転換されているので、有機塩素化合物分解能が高い。
本発明の有機塩素化合物分解方法は、上記形質転換体を
用いているので、有機塩素化合物を簡単かつ迅速に効率
よく分解することができる。
【図１】本発明のクメン分解遺伝子の制限酵素地図であ
る。
る。
【図２】本発明の有機硫黄化合物分解酵素遺伝子の制限
酵素地図である。
酵素地図である。
【図３】本発明の実施例１に示す大腸菌の形質転換体の
作成フロー図である。
作成フロー図である。
【図４】本発明の実施例２に示す形質転換体のトリクロ
ロエチレンの分解率のグラフである。
ロエチレンの分解率のグラフである。
【図５】本発明の実施例３に示す形質転換体の作成フロ
ー図である。
ー図である。
【図６】本発明の実施例４に示す形質転換体のトリクロ
ロエチレンの分解率のグラフである。
ロエチレンの分解率のグラフである。
【図７】本発明の実施例５に示す形質転換体の作成フロ
ー図である。
ー図である。
【図８】本発明の形質転換体の菌懸濁液中の終濃度５０
ｍｇ／ｌにおけるトリクロロエチレンの分解率のグラフ
である。
ｍｇ／ｌにおけるトリクロロエチレンの分解率のグラフ
である。
【図９】本発明の形質転換体の菌懸濁液中の終濃度１０
０ｍｇ／ｌにおけるトリクロロエチレンの分解率のグラ
フである。
０ｍｇ／ｌにおけるトリクロロエチレンの分解率のグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 9/02 9/02 Ｂ０９Ｂ 3/00 ＺＡＢＥ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:39） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (12)
- 【請求項１】 クメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ
２Ａ３Ａ４Ｂおよび有機硫黄化合物分解酵素遺伝子断片
ｄｓｏＡＢＣＤＥＦからなる群から選択された遺伝子断
片の１または２からなる遺伝子断片を含む組換プラスミ
ド。 - 【請求項２】 遺伝子断片の１または２からなる遺伝子
断片がクメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ
４Ｂおよび有機硫黄化合物分解酵素遺伝子断片ｄｓｏＡ
ＢＣＤＥＦからなる遺伝子断片である請求項１に記載の
組換プラスミド。 - 【請求項３】 クメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ
２Ａ３Ａ４Ｂおよび有機硫黄化合物分解酵素遺伝子断片
ｄｓｏＡＢＣＤＥＦからなる群から選択された遺伝子断
片の１または２からなる遺伝子断片、薬剤耐性遺伝子、
グラム陰性細菌内で複製可能な遺伝子を含み、グラム陰
性細菌内で複製可能な有機塩素化合物分解用組換プラス
ミド。 - 【請求項４】 遺伝子断片の１または２からなる遺伝子
断片が、クメン分解酵素遺伝子断片ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３
Ａ４Ｂおよび有機硫黄化合物分解酵素遺伝子断片ｄｓｏ
ＡＢＣＤＥＦからなる遺伝子断片である請求項３に記載
の組換プラスミド。 - 【請求項５】 有機硫黄化合物分解酵素遺伝子断片が、
有機硫黄化合物に対する分解能を有するアシネトバクタ
ー属細菌２０Ｂ由来の有機硫黄化合物分解酵素をコード
する遺伝子ｄｓｏＡＢＣＤＥＦである請求項１ないし４
のいずれかに記載の組換プラスミド。 - 【請求項６】 クメン分解酵素遺伝子断片が、クメンに
対する分解能を有するシュードモナス フルオレッセン
スＩＰ０１由来のクメン分解酵素をコードする遺伝子の
部分遺伝子ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ｂである請求項１な
いし４のいずれかに記載の組換プラスミド。 - 【請求項７】 クメンに対する分解能を有するシュード
モナス フルオレッセンスＩＰ０１由来のクメン分解酵
素をコードする遺伝子の部分遺伝子ｃｕｍＡ１Ａ２Ａ３
Ａ４Ｂ、アシネトバクター属細菌２０Ｂ由来の有機硫黄
化合物分解酵素をコードする遺伝子ｄｓｏＡＢＣＤＥ
Ｆ、薬剤耐性遺伝子、グラム陰性細菌内で複製可能な遺
伝子を含み、グラム陰性細菌内で複製可能な有機塩素化
合物分解用組換プラスミド。 - 【請求項８】 請求項１ないし７記載の遺伝子を含むプ
ラスミドを宿主細菌に導入したことを特徴とし、有機塩
素化合物に対する分解活性を付与、または強化した遺伝
子組換菌。 - 【請求項９】 請求項１ないし８記載のプラスミドを保
有していることを特徴とする細胞。 - 【請求項１０】 請求項７ないし９記載の有機塩素化合
物が、塩素化エチレンである有機塩素化合物分解用組換
プラスミド。 - 【請求項１１】 請求項７ないし１０記載の塩素化エチ
レンが、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、
ジクロロエチレン、モノクロロエチレンである有機塩素
化合物分解用組換プラスミド。 - 【請求項１２】 請求項７ないし１０記載の有機硫黄化
合物が、ジメチルスルフィド、ジエチルスルフィド、ジ
メチルスルホキシドである有機塩素化合物分解用組換プ
ラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8222184A JPH1057057A (ja) | 1996-08-23 | 1996-08-23 | 有機塩素化合物分解用組換プラスミド及び形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8222184A JPH1057057A (ja) | 1996-08-23 | 1996-08-23 | 有機塩素化合物分解用組換プラスミド及び形質転換体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1057057A true JPH1057057A (ja) | 1998-03-03 |
Family
ID=16778482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8222184A Withdrawn JPH1057057A (ja) | 1996-08-23 | 1996-08-23 | 有機塩素化合物分解用組換プラスミド及び形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1057057A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4590976A (en) * | 1983-10-28 | 1986-05-27 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Exhaust apparatus for electric lamps |
| JP2007215403A (ja) * | 2005-11-21 | 2007-08-30 | Asahi Breweries Ltd | 微生物を用いた環境汚染物質の分解方法 |
-
1996
- 1996-08-23 JP JP8222184A patent/JPH1057057A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4590976A (en) * | 1983-10-28 | 1986-05-27 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Exhaust apparatus for electric lamps |
| JP2007215403A (ja) * | 2005-11-21 | 2007-08-30 | Asahi Breweries Ltd | 微生物を用いた環境汚染物質の分解方法 |
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