【発明の詳細な説明】
成長ホルモン及びＸ−Lys を含む安定化医薬製剤
発明の分野
本発明は、成長ホルモンを含む安定化医薬製剤、該製剤を作る方法、並びに成
長ホルモンの製剤を安定化させるためのＸ−Lys(Ｘはアミノ酸残基を示す)の使
用に関する。
発明の背景
ヒト及び一般的な家畜からの成長ホルモンは、下垂体の前葉から合成され、分
泌される約191 アミノ酸の蛋白質である。ヒト成長ホルモンは191 アミノ酸から
なる。
成長ホルモンは、体の成長の調節ばかりでなく蛋白質、炭水化物及び脂質の代
謝の調節にも関連する。成長ホルモンの主な効果は成長を促進することである。
成長ホルモンにより影響を受ける器官系は、骨、結合組織、筋肉、並びに肝臓
、腸、及び腎臓のような内蔵を含む。
成長ホルモン遺伝子の組換え技術及びクローニングの発達が例えば工業スケー
ルにおけるヒト成長ホルモン(hGH)及びMet −hGH の生産を可能にするまで、ヒ
ト成長ホルモンは、ヒトの死体の下垂体からの抽出により得られうるのみであっ
た。成長ホルモンは、とりわけ、（成長ホルモン欠損、通常の短い身長及びター
ナー症候群のための）短い身長、成人の成長ホルモン欠損、不妊症、火傷の治療
、創傷治癒、ジストロフィー骨の癒合、骨粗しょう症、散在性の胃の出血、及び
偽関節の治療が提案されているが、成長ホルモンの極めて限定された供給は、小
人症の治療のための小児期及び思春期の
縦への成長促進への使用に制限される。
更に、成長ホルモンは、家畜の成長の速度を増加させ、ヒトの消費のために殺
されるべき動物の脂肪の比率を減小させることが提唱されている。
成長ホルモンの医薬製剤は不安定な傾向がある。脱アミド又はスルホキシド化
された産物のようなデグラデーション産物並びにダイマー又はポリマー形態が、
特に成長ホルモンの溶液において生成される。
hGH の支配的なデグラデーション反応は、（１）直接の加水分解により、又は
環式スクシニミド中間体を通して種々の量のＬ−asp −hGH ，Ｌ−iso −asp −
hGH ，Ｄ−asp −hGH 、及びＤ−iso −asp −hGH(引用文献１〜３)、及び（２
）位置14及び125 におけるメチオニン残基の酸化（引用文献４〜９）を形成する
。凍結乾燥状態及び溶液中におけるhGH の主なデグラデーション産物は脱アミド
化hGH である。
脱アミド化は特に位置149、少しだけ位置152 及び99におけるAsn において、
おこる。
hGH は、特に溶液中で、位置14及び125 においてむしろ容易に酸化される（４
〜８）。
スルホキシドを形成する溶液中でのhGH の酸化は通常、製剤中に溶かされた酸
素のためである。蒸留水中の酸素の溶解度は約 200μＭである（９）。４IU／ml
を含む製剤中のhGH の濃度は60nM hGHに相当する 1.3mg／mlであるので、酸素は
、通常の保存条件において、hGH の酸化のための化学量論的量の約3000倍超存在
するだろう。製剤をタッピング及びパッキングする前に緩衝液を脱気することに
よりこの問題を解決しようとする試みは可能でない。
現在、これらのhGH の脱アミド形態及び酸化形態は毒性もしくは
変化された生物活性又はレセプター結合特性を有すると信じられていないが、ス
ルホキシドのコンホメーション安定性がネイティブhGH に比べて削減される効果
があることが示されている。
hGH を含む安定な溶解された製剤の開発のため、脱アミド化の比率及びスルホ
キシドの形成並びに反応を調節するための手段を知ることが重要である。
デグラデーションの速度はhGH 製剤における温度、pH及び種々の添加物又は佐
剤による。
不安定さのため、成長ホルモンは、現在デグラデーションを最小にするために
、使用のために再構成されるまで凍結乾燥され、４℃における凍結乾燥形態にお
いて保存される。
hGH を含む凍結乾燥された医薬製剤は、現在、患者により再構成され、次にい
くらかのデグラデーションがおこるであろう４℃での14日までの期間、使用の間
、溶液として保存される。
更に、凍結乾燥された成長ホルモンの再構成の過程は、患者に困難を与える傾
向がある。
これにより、使用の前に可能な限り遅く成長ホルモンを再構成し、凍結乾燥状
態で製剤を保存及び輸送することが現在好ましい。製造元からの薬局へのつなが
りは、２年までの長い貯蔵寿命を許容する。例えば４℃の調節された低い温度に
おいて製剤を取り扱う傾向がある。
しかしながら、自己投薬のための貯蔵システムの広範囲の使用及び使用の広範
囲の分野は、“十分に”冷却することが常に利用できるとは限らない条件下で末
端使用者のために、十分に長い時間、安定である製剤を要求する。
好ましくは、製剤は、約１ヶ月間、更に薬包を用いる意図された期間、貯蔵装
置内に再構成された状態で１ヶ月間、凍結乾燥された
状態で末端使用者が利用するのに安定であるべきである。
これにより、一定の期間、更に溶液中での比較的高温での使用の期間、比較的
高温で凍結乾燥された状態で安定である成長ホルモンのより安定な製剤への必要
性がある。このような安定化は、最適な保存が先に示されるように利用し得ない
治療されるべき個人の家へ、病院から成長ホルモンの投与を移す場合に極めて重
要である。
更に、成長ホルモンの投与のパターンの貯蔵装置の使用への移行は、患者によ
り行われるべき取扱いを容易にするため、成長ホルモンを含む安定に溶かされた
製剤を要求する。成長ホルモンを含む安定に溶かされた製剤は、後に製剤の再構
成を避けたい患者により用いられる貯蔵装置内に適合する薬包の形態で直ちに用
いられるよう製造され得、従って、凍結乾燥された製剤、再構成のための適切な
ビヒクル、並びに製剤の滅菌再構成のための必要な技術及び滅菌装置を有する必
要がないであろう。
安全性の理由のため、製剤を用いる直前に、凍結乾燥製剤の再構成を避けるこ
とも要求されよう。
更に、成長ホルモン製剤の生産において凍結乾燥ステップを避けることも有利
であろう。凍結乾燥は時間を浪費し、コストのかかる工程であり、しばしば凍結
乾燥機の限られた能力のため生産の“ボトルネック”である。
これにより、貯蔵の間、及び１ヶ月までの使用の期間、溶解されたhGH 製剤が
安定であることを許容するために、デグラデーション過程の速度を減少させる必
要がある。
hGH を安定化する以前の試みはダイマーの形成を防ぐことに十分に成功してい
ない。ダイマー形成に関連する問題は、例えばBecker，G．W．Biotechnology an d Applied Biochemistry
9，478（1987）に記載される。
国際特許公報WO89/09614及びオーストラリア特許出願第30771/89号は、ヒト成
長ホルモン、グリシン及びマンニトールを含む安定な医薬製剤を開示する。この
ような製剤は、通常の処理及び凍結乾燥状態における保存の間並びに再構成後の
使用の期間、改良された安定性を示す。
公開されたヨーロッパ特許出願第303 746は、動物の成長ホルモンが、不溶物
の形成を減少させ、水性環境中の可溶活性を保護するために、種々の安定剤で安
定化され得ることを開示する。このような安定剤は、特定のポリオール、アミノ
酸、生理的pHにおいて荷電した側鎖を有するアミノ酸のポリマー、及びコリン塩
を含む。ポリオールは、非還元性糖、糖アルコール、糖酸、ペンタエリトリトー
ル、ラクトース、水溶性デキストラン及びFicollからなる群から選択され；アミ
ノ酸は、グリシン、サルコシン、リシンもしくはその塩、セリン、アルギニンも
しくはその塩、ベタイン、Ｎ，Ｎ，−ジメチル−グリシン、アスパラギン酸もし
くはその塩、グルタミン酸もしくはその塩からなる群から選択され；生理的pHに
おいて荷電した側鎖を有するアミノ酸のポリマーは、ポリリシン、ポリアスパラ
ギン酸、ポリグルタミン酸、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン
及びそれらの塩から選択され得；そしてコリン誘導体は、塩化コリン、クエン酸
二水素コリン、重酒石酸コリン、重炭酸コリン、クエン酸三コリン、アスコルビ
ン酸コリン、ホウ酸コリン、グルコン酸コリン、リン酸コリン、硫酸二コリン及
びムチン酸二コリンからなる群から選択される。
米国特許明細書第4,917,685号は、EP303746に言及されるのと同じ安定剤を用
いて安定化された成長ホルモンを含む移植されるようデザインされたデリバリー
製剤を開示する。
公開されたヨーロッパ特許出願第 374,120号は、hGH 及び３つの
水酸基を有するポリオールを含む安定化製剤を開示する。グリセロール及びトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが言及される。更に、ポリオールと一緒の
緩衝液としてのヒスチジンヒドロクロライドの存在が開示される。
国際特許公報WO93/12811は、アスパラギンを含む凍結乾燥粉体又は水溶液の形
態における成長ホルモンの安定化製剤を開示する。
国際特許公報WO93/12812は、ヒスチジンを含む凍結乾燥粉体又は水溶液の形態
における成長ホルモンの安定化製剤を開示する。この製剤において、脱アミド化
は、リン酸緩衝液を含む成長ホルモンの対応する製剤と比較して25〜30％、削減
される。
国際特許公報WO93/19776は、リン酸緩衝液を含む製剤より安定である緩衝物質
としてクエン酸塩を含む成長ホルモンを含む蛋白質製剤を開示する。その製剤は
、グリシン及びアラニンのようなアミノ酸及び／又はマンニトールもしくは他の
糖アルコール及び／又はグリセロール及び／又は他の炭水化物を含み得、任意に
ベンジルアルコールのような防腐剤も含み得る。
国際特許公報WO94/03198は、ヒト成長ホルモン、緩衝液、非イオン性界面活性
剤、及び任意に、中性塩、マンニトール、又は防腐剤を含む安定な水性製剤を開
示する。
発明の簡単な記載
驚くことに、Ｘ−Lys(式中、Ｘはアミノ酸残基を示す)を含むヒト成長ホルモ
ンの製剤が脱アミド化に対する極めて高い安定性を示すことが見い出された。そ
の製品の安定性は、凍結乾燥状態、又は溶解もしくは再溶解された製剤の形態に
おいて保存及び輸送するのを許容する。
本発明の医薬製剤は、いずれかの適切な方法で、例えば非経口も
しくは経口投与又は粘膜への投与により、例えば鼻への投与により、投与するた
めに製剤化され得る。本医薬製剤は、バイアルもしくは薬包又は予め充填された
シリンジもしくは貯蔵装置のようないずれかの他の適切な容器内に含まれる投与
量の形態で存在し得る。
これにより、本発明の製剤は、注入のための蒸留水もしくは水のような慣用的
ビヒクルを用いて後に再構成されるべき凍結乾燥粉体の形態、又は成長ホルモン
を含む溶液の形態であり得る。このようなビヒクルはｍ−クレゾール及びベンジ
ルアルコールのような慣用的防腐剤を含み得る。
Ｘは好ましくは天然のアミノ酸残基、更に好ましくは天然のα−アミノ酸残基
である。Ｘは好ましくはAla，Gly，Val，Glu，Met，Arg，Asp，Leu又はSer であ
り、最も好ましくはAla，Val，Glu，Met又はAsp である。
本発明の好ましい実施形態は、Ｘ−Lys(式中、Ｘはアミノ酸残基を示す)を含
み、そして更に成長ホルモンの緩衝水溶液の形態における担体を含むヒト成長ホ
ルモンの医薬製剤の形態である。このような製剤は直ちに用いられる形態であり
、いずれの大きなデグラデーションもなく水溶液として保存され、輸送され得る
。
成長ホルモンの溶液において用いられるべき緩衝液は、例えばヒスチジン、ク
エン酸、酒石酸又はリン酸緩衝液であり得る。
安定性の理由のため、溶液のpHは、好ましくは約２〜約８の間、更に好ましく
は５〜７、特に6.8 のpHの値に調節される。
安定性の効果を得るために、Ｘ−Lys(式中、Ｘはアミノ酸残基を示す)は好ま
しくは、100mMまでの量、更に好ましくは約１〜10mM、特に好ましくは２〜６mM
、最も好ましくは約３〜５mMの量で加えられる。
本発明の医薬製剤は、張度を調節するための塩及び任意のその処
理、例えば、凍結乾燥並びに使用前に製剤を再構成する場合の凍結乾燥製剤の迅
速かつ完全な溶解を容易にするための賦形剤を更に含み得る。
賦形剤は、ラクトース、トレハロース、及びスクロースのようなジサッカリド
、ソルビトールもしくはマンニトールのような糖アル
ポリサッカリド並びにポリエチレングリコールもしくはポリビニルアルコールの
ような多価アルコール、又はこれらの２以上の組合せから選択され得る。
更なる態様において、本発明は、成長ホルモン及びＸ−Lys(式中、Ｘは先の意
味を有する)を含む医薬製剤を調製する方法であって、ベンジルアルコールを任
意に含む脱イオン水中にＸ＝Lys(式中、Ｘは先に記載の意味を有する)を溶解し
、前記成長ホルモンを加え、そして任意にpHを約２〜約８に調節することにより
、Ｘ−Lys(式中、Ｘは先に記載の意味を有する）を含む溶液に前記成長ホルモン
を溶解することを特徴とする方法に関する。
そのpHは、成長ホルモンに逆効果を与えない酸、好ましくは生理的に許容され
る酸、例えば塩酸、硫酸もしくは硝酸のような無機酸又は酢酸のような有機酸を
加えることにより調節され得る。
本発明の方法の実施形態において、任意に塩及び賦形剤が添加され、その後そ
の溶液が容器内に充填され、凍結乾燥される。
本発明の更に他の態様は、成長ホルモンの安定化製剤の製剤化のためのＸ−Ly
s(式中、Ｘはアミノ酸残基を示す)の使用に関する。
本文脈において、“成長ホルモン”は、トリ、ウシ、ウマ、ヒト、ヒツジ、ブ
タ、サケ、マス又はマグロ成長ホルモンのようないずれかの源からの成長ホルモ
ン、好ましくはウシ、ヒト又はブタ成長
ホルモンであり得、ヒト成長ホルモンが最も好ましい。本発明により用いられる
成長ホルモンは、例えば慣用的方法で下垂体を抽出することにより、天然の源か
ら単離されたネイティブ成長ホルモン、又は例えばBiotech and Bioeng．36，１
−11（1990）においてE．B．Jensen及びS．Carlsenに記載されるような、組換え
技術により産生される成長ホルモンであり得る。“成長ホルモン”は、１以上の
アミノ酸残基が欠失された端を切り取られた形態の成長ホルモン；その置換が抗
原性もしくは作用の削減のようないずれの逆効果も有しない限り、ネイティブ分
子中の１以上のアミノ酸が他のアミノ酸残基、好ましくは天然のアミノ酸残基に
より置換されたそのアナログ；例えばMet −hGH のようなＮもしくはＣ末端伸長
部を有するその誘導体でもあり得る。好ましい成長ホルモンはhGH である。
成長ホルモンの“投与量”という言葉は、投与管理において治療効果を供する
量をいう。その製剤は、直ちに用いる製剤に基づいて計算して、少くとも約 0.1
mg／ml、好ましくは約10mg／ml超、好ましくは約１mg／ml〜約40mg／ml、更に好
ましくは約１mg／ml〜約25mg／ml、例えば１mg／ml〜約５mg／mlのhGH の量を含
むよう調製される。下垂体不全小人症を患うヒトへの投与におけるこれらの組成
物の使用のため、例えばこれらの製剤は、意図された治療のための現在予期され
た管理に対応して、約 0.1mg／ml〜約10mg／mlを含む。その濃度範囲は本発明に
重大ではなく、投与を監督する医師により種々であり得る。
本発明により用いられるべきＸ−Lys(式中、Ｘはアミノ酸残基を示す)は好ま
しくは、天然のαアミノ酸残基を含む。アミノ酸はｌ又はｄのアミノ酸又はそれ
らの混合物であり得る。
本文脈において、“高安定性”は、その製剤がリン酸緩衝液を含む慣用的製剤
より安定であり、好ましくはWO93/12812に開示される
ようなリン酸緩衝液と比較して約20％だけhGH の脱アミド化が削減される安定剤
としてヒスチジンを含む対応する製剤と同程度である場合に得られる。
本発明の方法に用いられる溶媒は、水、エチル、ｎ−プロピルもしくはイソプ
ロピル、ブチルアルコールのようなアルコール、又はそれらの混合物であり得る
。その溶媒はｍ−クレゾール又はベンジルアルコールのような防腐剤を含み得る
。
発明の詳細な記載
本発明は、本発明を詳説する以下の実施例により詳細に説明される。それらは
、添付の請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものとして考慮さ
れるべきでない。
実験部
実施例１脱アミド化の削減
脱アミド化の比率を、pH6.8 におけるヒスチジンと比較して、５mMのAla −Ly
s ，Gly −Lys ，Val −Lys ，Glu−Lys ，Met −Lys ，Arg −Lys 又はAsp −L
ys ，Lys −Lys 又はLys −Asp の存在下でpH6.8 において２mg／mlのhGH を含
むhGH 製剤について、４℃及び25℃において検査した。
hGH 製剤を、ジペプチド又はヒスチジンの10mM溶液２ml中に８mgのhGH を溶解
することにより調製した。これにより、２mlの 3.0％ベンジルアルコールを加え
て、２mg／mlのhGH ，５mMのジペプチド又はヒスチジン、1.5％のベンジルアル
コール、pH6.8（HCl又はNaOHを加えて調整）の最終製剤を供した。
次の表に示されるhGH 製剤を７日間、37℃で保存し、IE−HPLCにより脱アミド
化hGH の含有量について分析した。その結果は次の表
に示す。
開始材料中の脱アミド化hGH の含有量は2.0％であった。
先の表から、hGH の脱アミド化は、少くともヒスチジンの添加により観察され
るのと同じレベルまで、Ala −Lys ，Val −Lys ，Glu −Lys ，Met −Lys 又は
Asp −Lys の添加により削減されることが明らかであり（リン酸緩衝液と比較し
て25〜30％、先のWO93/12812と比較）、hGH のデグラデーションがリン酸緩衝液
と比較して少くとも同じレベルまでGly −Lys 又はArg −Lys の添加により削減
されることが明らかである。
先の結果は、脱アミド化の速度が、100mMまで、好ましくは１〜10mM、更に好
ましくは２〜６mM、そして最も好ましくは約３〜５mMの低濃度でAla −Lys ，Va
l −Lys ，Glu −Lys ，Met −Lys 又はAsp −Lys を加えることにより、かなり
大きな程度まで削減されることを示す。これにより脱アミド化の速度は、リン酸
緩衝液をAla
−Lys ，Val −Lys ，Glu −Lys ，Met −Lys 又はAsp −Lys と置換することに
より30％超、削減され得る。
防腐剤としてのベンジルアルコールの使用は、脱アミド化の速度に影響を与え
ないようである。
実施例２脱アミド化の削減
脱アミド化の比率を、pH6.8 におけるヒスチジンと比較して、５mMのAsp −Ly
s ，Val −Lys の存在下でpH6.8 において４mg／mlのhGH を含むhGH 製剤につい
て、37℃において検査した。
hGH 製剤を、ジペプチド又はヒスチジンの10mM溶液２ml中に８mgのhGH を溶解
することにより調製した。これにより、２mlの 3.0％ベンジルアルコールを加え
て、４mg／mlのhGH ，５mMのジペプチド又はヒスチジン、1.5％のベンジルアル
コール、pH6.8（HCl又はNaOHを加えて調整）の最終製剤を供した。
次の表に示されるhGH 製剤を７日間、37℃で保存し、IE−HPLCにより脱アミド
化hGH の含有量について分析した。その結果は次の表に示す。
開始材料中の脱アミド化hGH の含有量は 1.0％であった。
先の表から、hGH の脱アミド化は、少くともヒスチジンの添加により観察され
るのと同じレベルまで、Asp −Lys 及びVal −Lys の添加により削減されること
が明らかである（リン酸緩衝液と比較して25〜30％、先のWO93/12812と比較）。
先の結果は、脱アミド化の速度が、100mMまで、好ましくは１〜10mM、更に好
ましくは２〜６mM、そして最も好ましくは約３〜５mMの低濃度でAsp −Lys 又は
Val −Lys を加えることにより、かなり大きな程度まで削減されることを示す。
これにより脱アミド化の速度は、リン酸緩衝液をAsp −Lys 又はVal −Lys と置
換することにより30％超、削減され得る。
防腐剤としてのベンジルアルコールの使用は、脱アミド化の速度に影響を与え
ないようである。
Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a stabilized pharmaceutical formulation containing growth hormone, a method for making the same, and a method for stabilizing a growth hormone formulation. X-Lys (X represents an amino acid residue). BACKGROUND OF THE INVENTION Growth hormone from humans and common domestic animals is a protein of about 191 amino acids that is synthesized and secreted from the anterior pituitary gland. Human growth hormone consists of 191 amino acids. Growth hormone is involved not only in regulating body growth but also in regulating protein, carbohydrate and lipid metabolism. The main effect of growth hormone is to promote growth. Organ systems affected by growth hormone include bone, connective tissue, muscle, and internal organs such as liver, intestine, and kidney. Until the development of recombinant technology and cloning of the growth hormone gene allows the production of, for example, human growth hormone (hGH) and Met-hGH on an industrial scale, human growth hormone is obtained by extraction from the pituitary gland of human cadaver. Could only be done. Growth hormone includes, among others, short stature (for growth hormone deficiency, normal short stature and Turner syndrome), growth hormone deficiency in adults, infertility, treatment of burns, wound healing, dystrophic bone healing, osteoporosis, Although treatment of sporadic gastric bleeding and pseudoarthritis has been proposed, very limited supply of growth hormone has been shown to promote childhood and pubertal longitudinal growth for the treatment of dwarfism. Limited to use. In addition, growth hormone has been proposed to increase the rate of livestock growth and reduce the proportion of animal fat that must be killed for human consumption. Pharmaceutical formulations of growth hormone tend to be unstable. Degradation products, such as deamidated or sulfoxidated products, as well as dimeric or polymeric forms are produced, especially in solutions of growth hormone. The predominant degradation reaction of hGH is (1) by direct hydrolysis or through a cyclic succinimide intermediate, varying amounts of L-asp-hGH, L-iso-asp-hGH, D-asp-hGH, And D-iso-asp-hGH (refs. 1-3), and (2) oxidation of methionine residues at positions 14 and 125 (refs. 4-9). The major degradation product of hGH in lyophilized form and in solution is deamidated hGH. Deamidation occurs particularly at Asn at position 149, and only slightly at positions 152 and 99. hGH is rather easily oxidized at positions 14 and 125, especially in solution (4-8). Oxidation of hGH in solutions forming sulfoxides is usually due to oxygen dissolved in the formulation. The solubility of oxygen in distilled water is about 200 μM (9). Since the concentration of hGH in a formulation containing 4 IU / ml is 1.3 mg / ml, corresponding to 60 nM hGH, oxygen is more than about 3000 times the stoichiometric amount for oxidation of hGH under normal storage conditions. Will exist. Attempts to solve this problem by degassing the buffer before tapping and packing the formulation are not possible. Currently, it is not believed that these deamidated and oxidized forms of hGH have toxic or altered biological activity or receptor binding properties, but the reduced conformational stability of sulfoxide compared to native hGH. It is shown that there is. For the development of stable dissolved formulations containing hGH, it is important to know the rate of deamidation and the means for regulating sulfoxide formation and reaction. The rate of degradation is dependent on the temperature, pH and various additives or adjuvants in the hGH formulation. Due to instability, growth hormone is currently lyophilized until reconstituted for use and stored in lyophilized form at 4 ° C. to minimize degradation. Lyophilized pharmaceutical formulations containing hGH are now reconstituted by the patient and then stored as a solution during use for up to 14 days at 4 ° C. where some degradation will occur. Furthermore, the process of reconstitution of lyophilized growth hormone tends to present difficulties for the patient. Thereby, it is presently preferred to reconstitute the growth hormone as late as possible before use and to store and transport the formulation in a lyophilized state. The link from the manufacturer to the pharmacy allows a long shelf life of up to two years. There is a tendency to handle the formulation at a controlled low temperature, for example 4 ° C. However, the widespread use of storage systems for self-administration and the wide field of use are not long enough for end users under conditions where "sufficient" cooling is not always available. Require a formulation that is stable. Preferably, the formulation is stable for use by the end user in a lyophilized state for about one month, and also for one month when reconstituted in a storage device for the intended period of use with the package. Should be. Thus, there is a need for more stable formulations of growth hormone that are stable at relatively high temperatures and lyophilized for a period of time, and even during use at relatively high temperatures in solution. Such stabilization is crucial when transferring the administration of growth hormone from a hospital to the home of the individual to be treated, where optimal preservation is not available as indicated above. Furthermore, the shift in the pattern of growth hormone administration to the use of storage devices requires a stably dissolved formulation containing growth hormone to facilitate handling to be performed by the patient. The stably dissolved formulation containing growth hormone can be manufactured for immediate use in the form of a package that fits into a storage device used by patients who want to avoid reconstitution of the formulation at a later time, and thus the lyophilized formulation It would not be necessary to have a suitable vehicle for reconstitution, and the necessary technology and sterilization equipment for sterile reconstitution of the formulation. For safety reasons, it may also be required to avoid reconstitution of the lyophilized formulation immediately before using the formulation. Further, it would be advantageous to avoid the lyophilization step in the production of growth hormone formulations. Lyophilization is a time consuming and costly process and is often a "bottleneck" in production due to the limited capacity of freeze dryers. This requires a reduction in the speed of the degradation process to allow the dissolved hGH formulation to be stable during storage and for up to one month of use. Previous attempts to stabilize hGH have not been successful enough to prevent dimer formation. Problems related to dimer formation are described, for example, in Becker, G .; W. Biotechnology and Applied Biochemistry 9, 478 (1987). International Patent Publication No. WO 89/09614 and Australian Patent Application No. 30771/89 disclose stable pharmaceutical formulations comprising human growth hormone, glycine and mannitol. Such formulations exhibit improved stability during normal processing and storage in lyophilized conditions, and during use after reconstitution. Published European Patent Application No. 303 746 discloses that animal growth hormone can be stabilized with various stabilizers to reduce insoluble formation and protect soluble activity in aqueous environments. I do. Such stabilizers include certain polyols, amino acids, polymers of amino acids with charged side chains at physiological pH, and choline salts. The polyol is selected from the group consisting of non-reducing sugars, sugar alcohols, sugar acids, pentaerythritol, lactose, water-soluble dextran and Ficoll; the amino acids are glycine, sarcosine, lysine or a salt thereof, serine, arginine or a salt thereof, Selected from the group consisting of betaine, N, N, -dimethyl-glycine, aspartic acid or salts thereof, glutamic acid or salts thereof; polymers of amino acids having side chains charged at physiological pH include polylysine, polyaspartic acid, polyaspartic acid; Glutamic acid, polyarginine, polyhistidine, polyornithine and salts thereof; and the choline derivative may be choline chloride, choline dihydrogen citrate, choline bitartrate, choline bicarbonate, choline citrate, choline ascorbate, Choline borate Choline Con acid, choline phosphate, is selected from the group consisting of sulfate dihydrate choline and mucin dibasic choline. U.S. Patent No. 4,917,685 discloses a delivery formulation designed to be implanted that contains growth hormone stabilized using the same stabilizers as mentioned in EP 303746. Published European Patent Application No. 374,120 discloses a stabilized formulation comprising hGH and a polyol having three hydroxyl groups. Glycerol and tris (hydroxymethyl) aminomethane are mentioned. Further, the presence of histidine hydrochloride as a buffer with the polyol is disclosed. International Patent Publication No. WO 93/12811 discloses a stabilized formulation of growth hormone in the form of a lyophilized powder or aqueous solution containing asparagine. International Patent Publication No. WO 93/12812 discloses a stabilized formulation of growth hormone in the form of a lyophilized powder or aqueous solution containing histidine. In this formulation, deamidation is reduced by 25-30% compared to the corresponding formulation of growth hormone with phosphate buffer. International Patent Publication WO 93/19776 discloses a protein formulation containing growth hormone containing citrate as a buffer substance that is more stable than a formulation containing phosphate buffer. The formulation may contain amino acids such as glycine and alanine and / or mannitol or other sugar alcohols and / or glycerol and / or other carbohydrates, and may also optionally contain a preservative such as benzyl alcohol. International Patent Publication No. WO 94/03198 discloses a stable aqueous formulation comprising human growth hormone, a buffer, a non-ionic surfactant, and, optionally, a neutral salt, mannitol, or a preservative. BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION Surprisingly, it has been found that formulations of human growth hormone containing X-Lys (where X represents an amino acid residue) show extremely high stability to deamidation. The stability of the product allows it to be stored and transported in lyophilized form, or in the form of a dissolved or redissolved formulation. The pharmaceutical formulations of the present invention may be formulated for administration in any suitable way, for example by parenteral or oral administration or by mucosal administration, for example by nasal administration. The pharmaceutical preparation may be in the form of a dosage contained in a vial or package, or any other suitable container such as a pre-filled syringe or storage device. Thus, the formulations of the present invention may be in the form of a lyophilized powder to be subsequently reconstituted with a conventional vehicle such as distilled water or water for injection, or in the form of a solution containing growth hormone. . Such vehicles may include conventional preservatives such as m-cresol and benzyl alcohol. X is preferably a natural amino acid residue, more preferably a natural α-amino acid residue. X is preferably Ala, Gly, Val, Glu, Met, Arg, Asp, Leu or Ser, most preferably Ala, Val, Glu, Met or Asp. A preferred embodiment of the present invention is in the form of a pharmaceutical preparation of human growth hormone comprising X-Lys (where X represents an amino acid residue) and further comprising a carrier in the form of a buffered aqueous solution of growth hormone. Such formulations are in a ready-to-use form and can be stored and transported as an aqueous solution without any significant degradation. The buffer to be used in the solution of growth hormone can be, for example, a histidine, citrate, tartrate or phosphate buffer. For reasons of stability, the pH of the solution is preferably adjusted to a value between about 2 and about 8, more preferably between 5 and 7, especially 6.8. To obtain a stability effect, X-Lys (where X represents an amino acid residue) is preferably in an amount up to 100 mM, more preferably about 1-10 mM, particularly preferably 2-6 mM, most preferably Is added in an amount of about 3-5 mM. Pharmaceutical formulations of the present invention may be used to facilitate salt adjustment of tonicity and any treatment thereof, such as lyophilization and rapid and complete dissolution of the lyophilized formulation when reconstituting the formulation prior to use. May be further included. Excipients include disaccharides such as lactose, trehalose, and sucrose, sugar alcohols such as sorbitol or mannitol. It may be selected from polysaccharides and polyhydric alcohols such as polyethylene glycol or polyvinyl alcohol, or a combination of two or more thereof. In a further embodiment, the present invention is directed to a method of preparing a pharmaceutical formulation comprising growth hormone and X-Lys, wherein X has the above meaning, wherein X is in deionized water optionally comprising benzyl alcohol. X-Lys (where X has the meaning described above), add the growth hormone, and optionally adjust the pH to about 2 to about 8 to obtain X-Lys (where X Has the meaning described above). The pH can be adjusted by adding acids which do not adversely affect the growth hormone, preferably physiologically acceptable acids, for example inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid or nitric acid, or organic acids such as acetic acid. In an embodiment of the method of the invention, optionally salts and excipients are added, after which the solution is filled into containers and lyophilized. Yet another aspect of the present invention relates to the use of X-Lys (where X represents an amino acid residue) for the formulation of a stabilized preparation of growth hormone. In the present context, "growth hormone" is a growth hormone from any source, such as avian, bovine, horse, human, sheep, pig, salmon, trout or tuna growth hormone, preferably bovine, human or porcine growth hormone And human growth hormone is most preferred. Growth hormone used in accordance with the present invention may be native growth hormone isolated from natural sources, for example by extracting the pituitary gland by conventional methods, or, for example, Biotech and Bioeng. 36 , 1-11 (1990). B. Jensen and S.M. It can be a growth hormone produced by recombinant technology, as described in Carlsen. "Growth hormone" is a truncated form of growth hormone in which one or more amino acid residues have been deleted; the native molecule as long as the substitution does not have any adverse effect, such as antigenicity or reduced action. It can also be an analogue thereof in which one or more amino acids have been replaced by another amino acid residue, preferably a naturally occurring amino acid residue; a derivative thereof having an N- or C-terminal extension such as, for example, Met-hGH. The preferred growth hormone is hGH. The term "dose" of growth hormone refers to an amount that provides a therapeutic effect in the administration of a dose. The formulation is calculated to be at least about 0.1 mg / ml, preferably greater than about 10 mg / ml, preferably from about 1 mg / ml to about 40 mg / ml, more preferably from about 1 mg / ml to about 40 mg / ml, based on the formulation used immediately. It is prepared to contain an amount of hGH of about 25 mg / ml, for example 1 mg / ml to about 5 mg / ml. Due to the use of these compositions in the administration to humans suffering from pituitary dwarfism, for example, these formulations may have a concentration of about 0.1 mg / ml, corresponding to the currently anticipated management for the intended treatment. From about 10 mg / ml. The concentration range is not critical to the invention and may vary depending on the physician supervising the administration. X-Lys (where X represents an amino acid residue) to be used according to the present invention preferably comprises a natural α-amino acid residue. The amino acids can be l or d amino acids or mixtures thereof. In the present context, "high stability" means that the formulation is more stable than a conventional formulation comprising a phosphate buffer, preferably about 20% compared to a phosphate buffer as disclosed in WO 93/12812. Only obtained when the deamidation of hGH is comparable to the corresponding formulation containing histidine as a stabilizer which is reduced. The solvent used in the method of the present invention can be water, an alcohol such as ethyl, n-propyl or isopropyl, butyl alcohol, or a mixture thereof. The solvent may contain a preservative such as m-cresol or benzyl alcohol. Detailed Description of the Invention The present invention is described in detail by the following examples, which illustrate the invention. They should not be considered as limiting the scope of the invention, which is defined by the appended claims. Experimental part Example 1 Reduction of deamidation The deamidation ratio was compared with histidine at pH 6.8 by comparing 5 mM Ala-Lys, Gly-Lys, Val-Lys, Glu-Lys, Met-Lys, HGH formulations containing 2 mg / ml hGH at pH 6.8 in the presence of Arg-Lys or Asp-Lys, Lys-Lys or Lys-Asp were tested at 4 ° C and 25 ° C. An hGH formulation was prepared by dissolving 8 mg of hGH in 2 ml of a 10 mM solution of dipeptide or histidine. This provided 2 ml of 3.0% benzyl alcohol to give a final formulation of 2 mg / ml hGH, 5 mM dipeptide or histidine, 1.5% benzyl alcohol, pH 6.8 (adjusted by adding HCl or NaOH). The hGH formulations shown in the following table were stored at 37 ° C. for 7 days and analyzed by IE-HPLC for the content of deamidated hGH. The results are shown in the following table. The content of deamidated hGH in the starting material was 2.0%. From the above table, the deamidation of hGH is reduced by the addition of Ala-Lys, Val-Lys, Glu-Lys, Met-Lys or Asp-Lys to at least the same level as observed with the addition of histidine. (25-30% compared to phosphate buffer, compared to WO 93/12812 above), and the degradation of hGH to at least the same level compared to phosphate buffer. It is clear that the reduction is achieved by the addition of Lys or Arg-Lys. The previous results indicate that the rate of deamidation can be as low as Ala-Lys, Val-Lys, Glu at concentrations as low as 100 mM, preferably 1-10 mM, more preferably 2-6 mM, and most preferably about 3-5 mM. It shows that the addition of -Lys, Met-Lys or Asp-Lys results in a considerable reduction. Thus, the rate of deamidation can be reduced by more than 30% by replacing the phosphate buffer with Ala-Lys, Val-Lys, Glu-Lys, Met-Lys or Asp-Lys. The use of benzyl alcohol as a preservative does not appear to affect the rate of deamidation. Example 2 Reduction of deamidation The deamidation ratio was 4 mg / ml hGH at pH 6.8 in the presence of 5 mM Asp-Lys, Val-Lys compared to histidine at pH 6.8. The hGH formulation was tested at 37 ° C. An hGH formulation was prepared by dissolving 8 mg of hGH in 2 ml of a 10 mM solution of dipeptide or histidine. This gave 2 ml of 3.0% benzyl alcohol to give a final formulation of 4 mg / ml hGH, 5 mM dipeptide or histidine, 1.5% benzyl alcohol, pH 6.8 (adjusted by adding HCl or NaOH). The hGH formulations shown in the following table were stored at 37 ° C. for 7 days and analyzed by IE-HPLC for the content of deamidated hGH. The results are shown in the following table. The content of deamidated hGH in the starting material was 1.0%. It is clear from the above table that the deamidation of hGH is reduced by the addition of Asp-Lys and Val-Lys to at least the same level as observed with the addition of histidine (phosphate buffer). 25-30% compared to WO93 / 12812). The previous result shows that the rate of deamidation is to add Asp-Lys or Val-Lys at a low concentration of up to 100 mM, preferably 1-10 mM, more preferably 2-6 mM, and most preferably about 3-5 mM. Indicates that the reduction is to a considerable extent. This can reduce the rate of deamidation by more than 30% by replacing the phosphate buffer with Asp-Lys or Val-Lys. The use of benzyl alcohol as a preservative does not appear to affect the rate of deamidation.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
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ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ
Ｋ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 セーレンセン，ハンス，ホルメガーズ
デンマーク国，デーコー−2830 ビルム,
ヨアチム レノースバイ 21
(72)発明者 オルセン，オレ，ビルステズ
デンマーク国，デーコー−2700 ブロエン
ショイ，ベケスコバイ 38
(72)発明者 ティム，ラルス
デンマーク国，デーコー−2820 ゲントフ
テ，スキフテバイ 22────────────────────────────────────────────────── ───
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PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, S
K, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN
(72) Inventor Seirensen, Hans, Holmegaze
Denmark-2830 Burm, Denmark
Joachim Renorthby 21
(72) Inventor Olsen, Ole, Vilsted
Denmark, Denmark-2700 Broen
Shoy, Bekeskovy 38
(72) Tim Lars
Daek 2820 Gentov, Denmark
Te, Skiftebay 22