JPH10511267A - Synthesis of stereospecific oligonucleotide phosphorothioates - Google Patents

Synthesis of stereospecific oligonucleotide phosphorothioates

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JPH10511267A
JPH10511267A JP8519859A JP51985996A JPH10511267A JP H10511267 A JPH10511267 A JP H10511267A JP 8519859 A JP8519859 A JP 8519859A JP 51985996 A JP51985996 A JP 51985996A JP H10511267 A JPH10511267 A JP H10511267A
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タン，ジニャン
ロスキー，アリセン・エム
アグラワル，サディール
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Idera Pharmaceuticals Inc
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Abstract

(57)【要約】 立体特異的（Ｒｐ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成方法を開示する。この方法において、複数のデオキシリボヌクレオチドおよび５'末端または５'末端から２番目の位置にある一つのリボヌクレオチドを含むプライマーを鋳型にアニールさせる。この構造物をデオキシヌクレオシドα−三リン酸ＳｐジアステレオマーおよびＤＮＡポリメラーゼの混合物と接触させてＰＳ−Ｒｐオリゴデオキシヌクレオチド伸長物を生成させ、該プライマー中の該リボヌクレオチドの後で開裂することにより該オリゴデオキシヌクレオチドを一本鎖ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドとして遊離する。本発明の方法に従って調製したＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドもまた開示される。   (57) [Summary] Disclosed are methods for synthesizing stereospecific (Rp) phosphorothioate oligonucleotides. In this method, a primer comprising a plurality of deoxyribonucleotides and one ribonucleotide at the 5 'end or at the second position from the 5' end is annealed to the template. This construct is contacted with a mixture of deoxynucleoside α-triphosphate Sp diastereomer and DNA polymerase to form a PS-Rp oligodeoxynucleotide extension, which is cleaved after the ribonucleotide in the primer. The oligodeoxynucleotide is released as a single-stranded PS-Rp oligonucleotide. Also disclosed are PS-Rp oligonucleotides and oligonucleotides prepared according to the methods of the invention.

Description

【発明の詳細な説明】 立体特異的なオリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成 発明の背景 本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。さらに詳しくは、本発 明は立体特異的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの製造方法に関する。 オリゴデオキシヌクレオチドのホスホロチオエートアナログ（ＰＳオリゴヌク レオチド）は、アンチセンス手段として有用である（たとえば、アグラワル（Ａ grawal）ら（１９８９）Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.（ＵＳＡ）８６：７７９０〜 ７７９４参照）。これらアナログは、各インターヌクレオチドリン酸結合中のリ ン酸基上で非架橋性の酸素原子が硫黄原子で置換されている。かかる修飾は保存 的な置換であり、アンチセンス分子と標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション を有意に損なうことなくヌクレアーゼ耐性を増大させる。 ＰＳオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイトまたはＨ−ホスホネート法（ ともにＭetheds in Ｍolecular Ｂiology（アグラワル編）Ｖolume２０、ヒュー マナ・プレス（１９９３）トトワ、ニュージャージー）のいずれかを用いて化学 的に合成されている。そのような製造法では各インターヌクレオチド結合にキラ ル中心が導入され、これがｎ個のインターヌクレオチド結合当たり２n個のジア ステレオマーを生成させ、一般に約４０％のＲｐジアステレオマーと約６０％の Ｓｐジアステレオマーとの混合物という結果になる。 ホスホロチオエートは、ハイブリダイゼーション後にＲＮアーゼＨ活性を開始 する能力、逆転写酵素を阻害する能力、およびヌクレアーゼ耐性の増大などの多 くの有用な特性を有するが、ホスホロチオエート産物中にＲｐジアステレオマー およびＳｐジアステレオマーの両者が存在することは幾つかの理由から問題であ る。ＲｐジアステレオマーとＳｐジアステレオマーとは、異なる生物物理学的特 性、たとえば一本鎖および二本鎖核酸に対して異なる親和性を有する（たとえば 、コシック（Ｃossick）ら（１９８５）Ｂiochem.２４：３６３０〜３６３８； キム（Ｋim）ら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌett.３１４：２９〜３２を参照）。そ れ ゆえ、ある種の状況下では一方のジアステレオマーのみを調製するのが望ましい 。さらに、混合物中に両ジアステレオマーが存在すると、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動およびＨＰＬＣによりＰＳ−オリゴヌクレオチドを互いに分離したり 、ＰＳ−オリゴヌクレオチドを他の望まない反応生成物から分離したりするのが 困難になる。というのは、これらクロマトグラフィー法から得られるピークは、 ホスホジエステル結合した対応物よりも広くなる傾向があるからである。さらに 、立体特異性の欠如は、立体的な理由から、ＰＳ ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖がホス ホジエステル結合したＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖に比べて融点（Ｔm）が低いという ことの原因の一部を構成する（ラプランシュ（ＬaＰlanche）ら（１９８６）Ｎu cleic Ａcids Ｒes.１４：９０８１）。従って、新規薬剤の開発の観点からは、 かかるアナログの調製には立体化学的純度の問題と首尾よく取り組む必要がある 。 それゆえ、必要とされているのは、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの 立体特異的（ＲｐまたはＳｐ）ジアステレオマーの合成法である。発明の要約 本発明は、一つの側面において、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの立 体特異的Ｒｐジアステレオマーまたは異性体の合成方法を提供する。本明細書に おいて「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」または「ＰＳオリゴヌクレオ チド」とは、３'から５'へホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により 共有結合で連結された少なくとも５つのヌクレオチドを包含し、Ｓｐ異性体およ びＲｐ異性体の両者を含む。「ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチド」とは、ＰＳオリ ゴヌクレオチドの立体特異的（Ｒｐ）異性体のみをいう。 本発明の方法に従ってＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドを製造するには、ヌクレ オチド性プライマーを５'末端および３'末端を有する相補的なオリゴデオキシヌ クレオチド鋳型にアニールさせ、それによって部分的二本鎖／部分的一本鎖の構 造を生成させる。プライマーもまた３'末端および５'末端を有し、鋳型の３'部 分に相補的な核酸配列を含む。プライマーは、複数のデオキシリボヌクレオチド 、およびその３'末端または３'末端から２番目の位置に一つのリボヌクレオチド を 含む。 部分的二本鎖／部分的一本鎖の構造を、デオキシヌクレオシドα−三リン酸Ｓ ｐ異性体およびＤＮＡポリメラーゼの混合物と、鋳型の５'部分に相補的なＰＳ −Ｒｐオリゴヌクレオチドの酵素的合成を行うために必要な時間および条件下に て接触させ、それによって二本鎖産物を生成させる。幾つかの態様において、デ オキシヌクレオシドα−三リン酸Ｓｐ異性体は、デオキシグアノシン５'−（α −チオ）−三リン酸、デオキシアデノシン５'−（α−チオ）−三リン酸、デオ キシシチジン５'−（α−チオ）−三リン酸、およびチミジン５'−（α−チオ） −三リン酸よりなる群から選ばれる。「ＤＮＡポリメラーゼ」とは、一つのデオ キシリボヌクレオシドの３'末端を他のデオキシリボヌクレオシドの５'末端に共 有結合により連結させ、それによってＤＮＡを合成しうる酵素をいう。特定の態 様において、合成は、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素を用いて行う。 ついで、二本鎖産物を、ＲＮＡ／ＤＮＡ接合部のリボヌクレオチドの後で開裂 し、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドをプライマーおよび鋳型から遊離させる。幾 つかの態様において、開裂は、プライマー中のリボヌクレオチドが該プライマー の３'末端の位置にあるときに該プライマーと新たに合成されたＰＳ−Ｒｐオリ ゴヌクレオチドとの間で起こる。他の態様において、開裂は、プライマーの３' 末端から２番目のヌクレオチドと、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドとして伸長さ れた３'末端ヌクレオチドとの間で起こる。 本発明の幾つかの態様において、開裂はエンドヌクレオチド分解酵素、たとえ ばＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＵ２、ＲＮアー ゼＮ１およびＲＮアーゼＮ２を用いて行うが、他の態様では開裂はアルカリを用 いて行う。特定の態様において、強アルカリまたは塩基、たとえば水酸化ナトリ ウム、水酸化アンモニウム、水酸化リチウムまたは水酸化カリウムよりなる群か ら選ばれた水酸化ハロゲンをこの目的のために用いる。 本発明の他の側面は、本発明の方法に従って調製した立体特異的Ｒｐオリゴヌ クレオチドである。 本発明のさらに他の側面は、少なくとも一つの立体特異的Ｒｐホスホロチオエ ートインターヌクレオチド結合によりにより共有結合で連結された複数のデオキ シリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む。そのような立体特異的 Ｒｐホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｐホスホロチオエートに比べ 、またはＲｐおよびＳｐホスホロチオエートの混合物に比べ、マイトジェン性が 低いと思われる。一つの態様において、すべてのデオキシリボヌクレオチドが立 体特異的Ｒｐホスホロチオエートインターヌクレオチド結合により連結されてい る。図面の簡単な説明 本発明の上記および他の目的、その種々の特徴、並びに本発明そのものは、添 付の図面とともに以下の記載を読んだときに一層完全に理解される。該図面にお いて： 図１Ａは、立体特異的ＰＳオリゴヌクレオチドの合成のためのプロトコールの 一つの態様を示す模式図； 図１Ｂは、立体特異的ＰＳオリゴヌクレオチドの合成のためのプロトコールの 他の態様を示す模式図； 図２Ａは、ウシ血清中でのホスホジエステル（ＰＯ）オリゴヌクレオチド、立 体特異的ホスホロチオエート（ＰＳ−Ｒｐ）オリゴヌクレオチドおよび合成ホス ホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を示すオートラ ジオグラム； 図２Ｂは、ヒト血清中でのＰＯオリゴヌクレオチド、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレ オチドおよびＰＳオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を示すオートラジオグ ラム； 図３Ａは、ＤＮＡポリメラーゼＩの存在下でのＰＯオリゴヌクレオチド、ＰＳ −ＲｐオリゴヌクレオチドおよびＰＳオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を 示すオートラジオグラム； 図３Ｂは、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの存在下でのＰＯオリゴヌクレオチド、Ｐ Ｓ−ＲｐオリゴヌクレオチドおよびＰＳオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性 を示すオートラジオグラム； 図４Ａは、融点（Ｔm）により測定した、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡ標的へ のＰＳ−ＲｐオリゴヌクレオチドおよびＰＳオリゴヌクレオチドのハイブリダイ ゼーション親和性を示すグラフ； 図４Ｂは、円二色性により測定した、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡ標的へのＰ Ｓ−ＲｐオリゴヌクレオチドおよびＰＳオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼー ション親和性を示すグラフ； 図５は、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチド（◆）およびＰＳオリゴヌクレオチド （□）がｒＨＩＶ逆転写酵素を阻害する能力を示すグラフ； 図６は、ＰＳ−ＲｐオリゴヌクレオチドおよびＰＳオリゴヌクレオチドのＲＮ アーゼＨ消化に対する感受性を示すオートラジオグラムである。好ましい態様の詳細な説明 本発明は、立体特異的ＰＳ−オリゴヌクレオチドの合成法、とりわけ、酵素的 プロセスを用いた立体特異的（すべてＲｐ）オリゴヌクレオチドホスホロチオエ ートの製造方法を提供する。これらＲｐオリゴヌクレオチドは、非立体特異的な 対応物に比べて低親和性にてタンパク質に結合し、マイトジェン性が低いと思わ れる。 立体特異的ＰＳ−オリゴヌクレオチド（すべてＲｐ）を合成するための確立さ れた方法は、図１Ａおよび図１Ｂに概略を示してある。ＤＮＡポリメラーゼは、 単一のホスホロチオエートにより伸長してＲｐ結合を生成する間に２'−デオキ シヌクレオチド５'−（α−チオ）三リン酸のＳｐジアステレオマーのみを用い ることが示されている（エックスタイン（Ｅckstein）（１９８５）Ａnn.Ｒev. Ｂiochem.５４：３６７〜４０２）。しかしながら、そのような伸長は単一のホ スホロチオエート結合を導入する場合に限られる。 完全に立体特異的な分子の合成を行うため、立体特異的な分子の所望の配列に 相補的な相補的核酸配列を有する適当な鋳型および該鋳型の３'部分に相補的な 核酸配列を有するプライマーを設計する。鋳型の合成は、ホスホジエステル−リ ンカーオリゴヌクレオチドを製造するための当該技術分野で知られた方法を用い て行う。そのような有用な方法の一つでは、β−シアノエチルホスホルアミダイ ト化学（ボケージ（Ｂeaucage）、Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａna logs、Ｍetheds in Ｍolecular Ｂiology、Ｖol.２０（アグラワル編）ヒューマ ナ・プレス、トトワ、ニュージャージー（１９９３）３３〜６１頁）を用いる。 プライマーの合成のため、リボヌクレオシドホスホルアミダイトを「シントン（ synthon）」または構築ブロックとして用い、複数のデオキシリボヌクレオチド および図１に示す位置の一つの３'−リボヌクレオチドを導入する。このシント ンは、合成した立体特異的オリゴヌクレオチドをプライマーから開裂するのを可 能にするために導入する。合成後、脱シリル化などのＲＮＡプロトコール（ダマ ー（Ｄamha）ら、Ｐrotocols for Ｏligonucleotides and Ａnalogs、Ｍetheds in Ｍolecular Ｂiology 、Ｖol.２０（アグラワル編）ヒューマナ・プレス、ト トワ、ニュージャージー（１９９３）８１〜１１４頁）を用いて脱保護を行う。 本発明の方法に従い、当該技術分野でよく知られた方法、たとえば９０℃で３ 分間加熱し、ついで室温で１時間冷却することにより、プライマーを鋳型にアニ ールさせる。ついで、プライマーを伸長させて鋳型に相補的な核酸配列を有する オリゴヌクレオチドを生成させる。プライマーの伸長は、エックスタインによっ て記載されているように（Ａnn.Ｒev.Ｂiochem.（１９８５）５４：３６７〜４ ０２）、かかる合成をなしうる酵素、たとえばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ ＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩポリメラーゼ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およ び逆転写酵素を用い、４つのすべての２'−デオキシヌクレオシド５'−（α−チ オ）三リン酸、または２'−デオキシヌクレオシド５'−（α−チオ）三リン酸の アナログを用いて行う。 伸長後、新たに合成された立体特異的ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドを、プラ イマーからの開裂および鋳型からの遊離により遊離させる。遊離は、リボヌクレ オチド部位にてＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドをプライマーから開裂させ、ＰＳ −Ｒｐオリゴヌクレオチドを鋳型から解離させる手順を用いて行う。このリボヌ クレオチドは、伸長前のプライマーの３'末端から２番目の位置か（図１Ａ）ま たは３'末端の位置（図１Ｂ）である。有用な処理は、ＲＮＡを消化する強アル カリを用いた、またはＲＮＡ／ＤＮＡ接合部を開裂するエンドリボヌクレアーゼ または他の酵素を用いた開裂を含む。好ましいアルカリとしては、水酸化ナトリ ウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウム、または水酸化カリウムなどの水酸 化ハロゲンが挙げられ、最も好ましいのは水酸化アンモニウムまたは水酸化カリ ウムである。有用な酵素としては、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼ Ｔ２、ＲＮアーゼＵ２、ＲＮアーゼＮ１およびＲＮアーゼＮ２が挙げられ、これ らは市販されている。 開裂後、生成物を、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、超遠心分離、または 一本鎖オリゴヌクレオチドをそれ自体から、および二本鎖分子から分離するため の当該技術分野で知られた他の方法により精製する。ＰＡＧＥ、たとえば８Ｍ尿 素を含有する２０％ポリアクリルアミドゲル上のＰＡＧＥが、この目的のために 有用である。ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドを含有するバンドの精製は、該バン ドをたとえばＵＶシャドウイング（shadowing）により位置付けし、切り出し、 ついで脱塩することにより行う。一般に、約８ナノモルのプライマーおよび２. ５ナノモルの鋳型を用いて合成を行った場合には、約１ナノモルのＰＳ−Ｒｐオ リゴヌクレオチド産物が得られる。 本発明のオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現のモジュレーターとして有用であ る。たとえば、特定の遺伝子の機能を決定するため、本発明のオリゴヌクレオチ ドを組織培養系中の該遺伝子に対してターゲティングし、この調節効果を調べる ことができる。特定のタンパク質がある種の生物学的プロセスにおいて果たす役 割を決定することが目的であるなら、該タンパク質をコードする核酸をターゲテ ィングすることにより該タンパク質の産生を抑制する手段として本発明のオリゴ ヌクレオチドを用い、ついで該タンパク質の抑制によりもたらされる生物学的効 果を観察することができる。そのような状況では、研究されるのは組み込まれた オリゴヌクレオチドではなくタンパク質の産生を抑制することによる効果である 。このように、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることにより、標的遺伝子を 変異させることにより欠失変異体を生成させるという骨の折れる方法にとって代 わる容易に実行可能な代替法が提供される。 加えて、本発明のＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドは、そのキラルなＳｐ対応物 と同様にホスホトランスフェラーゼおよびヌクレオチジルトランスフェラーゼの 立体化学的なプローブとして有用である。なぜなら、これらオリゴヌクレオチド は、伸長しつつある鎖の３'−ヒドロキシルがピロリン酸を置換するときのヌク レオチド三リン酸のリンにおける単一の結合開裂によるか、または共有ヌクレオ チド酵素（covalent nucleotidyl enzyme）が関与する場合の２つの結合開裂に よる、伸長しつつあるポリマー中へのデオキシリボヌクレオチドの導入を識別し うるからである（ブロディ（Ｂrody）ら（１９８１）Ｂiochem.２０：１２４５ 〜１２５２に概説されている）。 本発明の方法に従って調製したＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドの比較安定性を 、該ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチド並びに配列相同な（sequence-comparable） ＰＯ−結合したオリゴヌクレオチドおよびＰＳ−結合したオリゴヌクレオチドを ヒトやウシの血清などのヌクレアーゼ源に暴露することにより決定した。図２Ａ に示す結果は、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドがウシ血清中でのインキュベーシ ョン６時間後から２４時間まで依然として存在しているのに対し、ＰＯオリゴヌ クレオチドは存在していないことを示している。ヒト血清では（図２Ｂ）、ＰＳ −ＲｐオリゴヌクレオチドおよびＰＳオリゴヌクレオチドはインキュベーション １２０分後も存在するが、ＰＯ−結合オリゴヌクレオチドはインキュベーション ６０分後に消化された。 同様の結果は、ＰＯオリゴヌクレオチド、ＰＳオリゴヌクレオチドおよびＰＳ −ＲｐオリゴヌクレオチドをＴ４ＤＮＡポリメラーゼＩ（図３Ａ）またはＤＮＡ ポリメラーゼ（図３Ｂ）とともにインキュベートした場合にも得られた。図３Ｂ に示すように、ＰＳオリゴヌクレオチドおよびＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドは ともにＤＮＡポリメラーゼＩの存在下でインキュベーション４時間後にも存在し たが、ＰＯオリゴヌクレオチドは１時間後には存在しなかった。 これら結果は、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドがホスホジエステル結合オリゴ ヌクレオチドに比べて安定であり、ウシ血清およびヒト血清中、およびＤＮＡポ リメラーゼおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼの存在下でＰＳオリゴヌクレオチドに 匹敵する安定性を有することを示している。 ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドおよび合成ＰＳ−オリゴヌクレオチドを、融点 （Ｔm）および円二色性を測定することにより、相補的なＲＮＡおよびＤＮＡ鋳 型に対する親和性についても比較した。図４Ａに示すように、ＰＳ−Ｒｐオリゴ ヌクレオチドおよびＰＳ−オリゴヌクレオチドはともに、ＤＮＡ鋳型に対して同 じＴmを示した（５１.８°および５１.９°）。しかしながら、ＲＮＡ鋳型に対 してはＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチド（６８.９°）は合成ＰＳ−オリゴヌクレ オチド（６４°）に比べて高い融点を示し、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドがそ の標的に対して一層大きな結合親和性を有することを示していた。図４Ｂは、Ｒ ＮＡ二本鎖についてのＣＤスペクトルの差異がＤＮＡ二本鎖についてのＣＤスペ クトルの差異よりも一層有意であることを示しており、ＲＮＡ標的の方がＤＮＡ 標的に比べてハイブリダイゼーション時のＰＳ−ＲｐオリゴヌクレオチドとＰＳ オリゴヌクレオチドの立体配置変化に対して一層感受性であることを示している 。 ＲｐジアステレオマーおよびＳｐジアステレオマーの混合物として存在するＰ Ｓオリゴヌクレオチドの一つの知られた配列非特異的な作用は、逆転写酵素の酵 素活性を阻害することである。ＰＳ−Ｒｐ異性体がジアステレオマー混合物と同 様の阻害活性を有するか否かを決定するため、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドお よびＰＳオリゴヌクレオチドを個々に逆転写酵素とともにインキュベートした。 図５に示すように、ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドは合成ＰＳ−オリゴヌクレオ チド混合物よりも強い逆転写酵素阻害剤であることがわかった。 ＰＳ−ＲｐオリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨによる分解応答を誘起する能力 がＰＳジアステレオマー混合物に匹敵するかどうかを決定するため、ＰＳ−Ｒｐ オリゴヌクレオチドをＲＮアーゼＨ消化にも供した。図６は、ＰＳ−Ｒｐオリゴ ヌクレオチドが合成ＰＳ−オリゴヌクレオチド混合物よりもＲＮアーゼＨの良好 な基質であることを示している。 さらに、これらオリゴヌクレオチドは相補的な核酸配列にハイブリダイズする ことができ、細胞により取り込まれることができる。それゆえ、立体特異的ＰＳ −Ｒｐオリゴヌクレオチドは、ＰＳオリゴヌクレオチドのジアステレオマーＲｐ ＋Ｓｐ混合物に比べて、改善されたとまではいえないにしても同様のアンチセン ス特性を有する。 以下の実施例は本発明を製造および実施するための好ましい態様を示すが、本 発明の範囲を限定するものではない。なぜなら、同様の結果を得るために別法を 利用できるからである。 実施例 １．ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドの合成 ３０μｌ容量の５０ｍＭトリス、ｐＨ９.０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2中で、８ナ ノモルのプライマー： （配列番号２）および２.５ナノモルの鋳型： （配列番号３）を、９０℃で３分間加熱し、ついで室温にて１時間冷却すること により前以てアニールした。反応容量を、５０ｍＭトリス、ｐＨ９.０、１０ｍ Ｍ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、１００ｍＭデオキシグアノシン５'−（α−チオ ）三リン酸、１００ｍＭデオキシアデノシン５'−（α−チオ）三リン酸、２０ ０ｍＭデオキシシチジン５'−（α−チオ）三リン酸および２００ｍＭチミジン ５'−（α−チオ）三リン酸（デュポン−ＮＥＮ、ボストン、マサチューセッツ ）を含有する１.５ｍｌに増大させた。２５００単位の配列グレードＴａｑＤＮ Ａポリメラーゼ（プロメガ（Ｐromega Ｃorp.）、マジソン、ウイスコンシン） を加えて反応を開始させた。混合物を３７℃で４時間インキュベートした。反応 混合物を脱塩し、水酸化アンモニウム溶液（２８〜３０％）で５５℃にて２４時 間、または０.３Ｍ ＫＯＨで３７℃にて１時間、処理した。他の試験では、脱塩 反応混合物を別にＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼ Ｕ２、ＲＮアーゼＮ１、またはＲＮアーゼＮ２（これらはシグマ・ケミカル、セ ントルイス、ミズーリから入手可能である）で９５℃にて約３分間処理する。生 成物を乾燥し、２０％変性ポリアクリルアミドゲル上のＰＡＧＥにより精製した 。生成 物をＵＶシャドウイングの下でゲルから切り出し、５００ｍＭ酢酸アンモニウム で溶出し、透析により脱塩した（図１に記載）。 ２．ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性 ウシ血清およびヒト血清中でのホスホジエステル結合した（ＰＯ）オリゴヌク レオチド、立体標準（stereoregular）（ＰＳ−Ｒｐ）オリゴヌクレオチド、お よび合成ＰＳ−オリゴヌクレオチド（ＰＳ）の安定性を以下のようにして試験し た。６０ピコモルの［32Ｐ］５'末端標識オリゴヌクレオチドを１００μｌのヒ ト血清（シグマ・ケミカル、セントルイス、ミズーリ）中、３７℃でインキュベ ートした。２０μｌのアリコートを０分、３０分、６０分および１２０分の時点 でサンプリングし、ついで２０μｌの２０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳおよび１００μｇのプロテイナー ゼＫとともに６５℃で１時間インキュベートした。試料をフェノール／クロロホ ルムで抽出し、エタノール沈殿し、ついで２０％アクリルアミド、８.３Ｍ尿素 を含有するゲル中のＰＡＧＥにより分析した。ゲルを酢酸／メタノール／水（１ ０：１０：８０、ｖ／ｖ／ｖ）溶液中に固定し、オートラジオグラフィーに供す る前に３時間乾燥させた。オートラジオグラムを図２Ａ（ウシ血清）および図２ Ｂ（ヒト血清）に示す。 さらに、ヌクレアーゼ耐性の比較研究をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ ポリメラーゼ（ＰｏｌＩ）を用いて行った。ＤＮＡポリメラーゼＩアッセイは、 ３０ピコモルの［32Ｐ］−５'末端標識したＰＯオリゴヌクレオチド、ＰＳオリ ゴヌクレオチド、またはＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチド、５０ｎｍトリス、ｐＨ ８.０、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、０.０５％ウシ血清アルブミン、お よび５単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（ワーシントン・バイオケミカル（Ｗorthin gton Ｂiochemical Ｃorp.）、フリーホールド、ニュージャージー）を含有する ２０μｌ容量中で行った。アリコートを０分の時点で取り、残りを３７℃でイン キュベートした。５μｌのアリコートを１時間、２時間、および４時間の時点で 取った。各時点でアリコート６μｌ停止溶液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭＥ ＤＴＡ、０.０５％ブロモフェノールブルー、０.０５％キシレンシアノール）を 加えた。ついで、２０％アクリルアミド、８.３％尿素ゲルを用いたＰＡＧＥに より分析した。その結果を図３Ａに示す。 Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼアッセイは、４５ピコモルの［32Ｐ］−５'末端標識 したＰＯオリゴヌクレオチド、ＰＳオリゴヌクレオチド、またはＰＳ−Ｒｐオリ ゴヌクレオチド、５０ｎＭトリス、ｐＨ８.０、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴ Ｔ、０.０５％ウシ血清アルブミン、および７.５単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ （プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）を含有する３０μｌ容量中で行った。 アリコートを０分の時点で取り、残りを３７℃でインキュベートした。５μｌの アリコートを５分、１５分、３０分、および６０分の時点で取った。各時点でア リコート６μｌ停止溶液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０５％ ブロモフェノールブルー、０.０５％キシレンシアノール）を加えた。ついで、 ２０％アクリルアミド、８.３％尿素ゲルを用いたＰＡＧＥにより試料を分析し た。その結果を図３Ｂに示す。 ３．融点試験 融点（Ｔm）試験を以下のようにして行った。１.０６×１０-6ＭのＰＳ−Ｒｐ オリゴヌクレオチドまたはＰＳオリゴヌクレオチドを１０ｍＭリン酸、１００ｍ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７中に入れ、３０〜７５℃の範囲の温度に供し、分光光度計 （ＧＢＣ９２０、ＧＢＣ、ビクトリア、オーストラリア）を用いてＡ260におけ る吸光度を測定した。その結果を図４Ａに示す。 ４．円二色性試験 円二色性試験を行い、相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ配列へのＰＳ−Ｒｐオリゴ ヌクレオチドおよびＰＳオリゴヌクレオチドの相対的な結合親和性を決定した。 １.０６×１０-6ＭのＰＳ−ＲｐオリゴヌクレオチドまたはＰＳオリゴヌクレオ チドを１０ｍＭリン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７中に入れ、分光偏光計（ Ｊ−７１０、ジャスコ（Ｊasco）、イーストン、メリーランド）を用いて２００ 〜３２０ｎｍＵＶ光に供した。その結果を図４Ｂに示す。 ５．ｒＨＩＶ逆転写酵素の阻害 ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドが逆転写酵素を阻害する相対的な能力を決定す るため、以下のアッセイを行った。１ｍＭの前以てアニールさせた［32Ｐ］−５ '末端標識プライマー： （配列番号５）および鋳型： （配列番号６）、５０ｍＭトリス、ｐＨ８.３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、０.２５ｍＭデオキシヌクレオシド５'三リン酸（ｄＮ ＴＰ）および種々の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する１０μｌの反応混合物 を調製した。０.８単位のｒＨＩＶ逆転写酵素（ワーシントン・バイオケミカル 、フリーホールド、ニュージャージー）を加えた後、混合物を３７℃で１時間イ ンキュベートした。１０ｍｌのホルムアミドで反応を阻止し、ついで２０％変性 ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。伸長生成物および残留プライ マーのバンドについてＣＰＭを測定し、阻害のパーセントを計算した。その結果 を図５に示す。 ６．ＲＮアーゼＨ活性アッセイ １ピコモルの［32Ｐ］−３'−末端標識した３９−ｍｅｒのＨＩＶ−Ｉ ｇａｇ ＲＮＡ： （配列番号３）を、１０ｍｌ緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７.５、１０ｍＭ Ｍ ｇＣｌ2、１００ｍＭ ＫＣｌ、０.１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセリン）中で１０ピ コモルのＰＳ−ＲｐオリゴヌクレオチドまたはＰＳオリゴヌクレオチドと前以て アニールさせた。反応液を同緩衝液で３０ｍｌの容量とし、４０単位のＲＮアー ゼＨ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、インディアナ）を加え た。７ｍｌのアリコートを時間０にて取った。混合物の残りに０.５単位のＲＮ アーゼＨを加え、これを３７℃で１５分間インキュベートした。７μｌのアリコ ートを取り、１０μｌのホルムアミドで１分、５分および１５分の時点にて反応 停止させた。混合物を２０％変性ポリアクリルアミドゲル上のＰＡＧＥにより分 析した（該ゲルをオートラジオグラフにかけた）。その結果を図６に示す。 ７．活性アッセイ ＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドの活性を、Ｈ９細胞、ＭＯＬＴ−３細胞または 他の細胞中でのＨＩＶ−１発現を抑制する能力をアッセイすることにより測定し た。このアッセイにおいて、１ｍｌ当たり５×１０5細胞を２.５〜５×１０8ウ イルス粒子のＨＩＶ−１株ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩＣで感染 させた。細胞当たり５００〜１０００ウイルス粒子の感染は、０.５〜１感染多 重度（ＭＯＩ）を表す。細胞の感染は、５％ＣＯ2を含む湿潤雰囲気中、３７℃ にてＲＰＭＩ１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミンおよ び、１ｍｌ当たり２５０μｌのゲンタマイシン）を含有する培地中で培養した細 胞にウイルスとアンチセンスオリゴマーを同時に添加することにより行う。４日 後、シンシチウム（ＭＯＬＴ−３細胞）およびウイルス抗原発現並びに細胞生存 度を測定することにより、細胞および上澄み液についてＨＩＶ−１発現レベルを 調べる。ＭＯＬＴ−３細胞で生成したシンシチウムの数は、細胞をトリチュレー トすることにより培養液中にシンシチウムが均一に分散するようにした後にカウ ントした。シンシチウムの平均数は、２つの培養液で幾つかの視野（fields）を カウントすることにより得る。細胞の生存度はトリパンブルーの存在下で測定し 、染料を排除した細胞を生存細胞としてカウントする。ＨＩＶ−１抗原発現の測 定はメタノール／アセトン中で固定した細胞で行う。簡単に説明すると、細胞を ペレット化し、ついでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１０6細胞／ｍｌの濃度 で再懸濁する。ついで、細胞をトキソプラズマ症スライド上にスポットし、空気 乾燥し、メタノール／アセトン（１：１、ｖ／ｖ）中に室温にて１５分間固定す る。ついで、スライドを１０％正常ヤギ血清とともに室温にて３０分間インキュ ベートし、ＰＢＳ（４回）で洗浄する。各ウエルにＨＩＶ−１ｐ２４またはｐ１ ７モノクローナル抗体を加え、スライドを湿室中、３７℃にて３０分間インキュ ベートする。スライドをＰＢＳ（４回）で洗浄し、フルオレセインイソチオシア ネート標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（カッペル・ラボラトリーズ（Ｃappel Ｌab orat ories）、コクランビル、ペンシルベニア）とともに室温にて３０分間インキュ ベートし、ついでＰＢＳで一夜洗浄する。スライドをエバンスブルーで対比染色 し、ＰＢＳで洗浄し、５０％グリセリンを載せ、ツァイス（Ｚeiss）蛍光顕微鏡 で調べた。オリゴマー処理した培養液および未処理培養液での蛍光を発した細胞 のパーセントを比較する。 ８．細胞取り込み ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に前以て２４時間プレーティング したヒト２９３、ＨｅＬａｓ3、およびＮＩＨ３Ｔ３サブコンフルエント細胞の 培養皿、またはＤＭＥＭ／イーグル平衡塩溶液培地（５×１０5細胞／ｍｌ；全 部で２ｍｌ）中で増殖させたＭＤＣＫまたはＨＥｐ−２細胞の培養皿を、35Ｓ− 標識したＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチドとともに１６時間インキュベートする。 細胞の分画は以下のようにして行う。細胞を培養プレートからトリプシンを用い て取り、回収し（１,５００ｒｐｍ、５分、４℃）、４ｍｌの冷リン酸緩衝食塩 水（ＰＢＳ）で洗浄する。細胞を４５０μｌの緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス−ＨＣ ｌ、ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ2）および５０μｌ の５％Ｎonidet Ｐ−４０（ＮＰ−４０）中、４℃にて１０分間溶解する。２０ ００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上層の細胞質画分（細胞質ゾルと細胞膜と を合わせたもの）を取り、ペレット（核）を５００μｌの緩衝液Ａ中に溶解し、 放射能を測定する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION          Synthesis of stereospecific oligonucleotide phosphorothioates Background of the Invention   The present invention relates to antisense oligonucleotides. For more information, Akira relates to a method for producing stereospecific phosphorothioate oligonucleotides.   Phosphorothioate analogs of oligodeoxynucleotides (PS Oligonucleotides) Reotide) is useful as an antisense tool (eg, Agrawal (A Grawal) et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 7790- 7794). These analogs are associated with each internucleotide phosphate bond. A non-crosslinkable oxygen atom is substituted with a sulfur atom on the acid group. Such modifications are preserved Hybridization between the antisense molecule and the target mRNA Increase nuclease resistance without significantly impairing   PS oligonucleotides can be prepared by the phosphoramidite or H-phosphonate method ( Both are Methods in Molecular Biology (Agrawal edition) Volume 20, Hugh Mana Press (1993) Totowa, New Jersey) Is synthesized. In such a production method, each internucleotide linkage has The center is introduced, which is 2 per n internucleotide linkages.nPieces of zia Stereomers are formed, generally about 40% Rp diastereomer and about 60% The result is a mixture with the Sp diastereomer.   Phosphorothioate initiates RNase H activity after hybridization Ability to inhibit, reverse transcriptase, and increase nuclease resistance Rp diastereomer in the phosphorothioate product with many useful properties And the presence of both Sp diastereomers are problematic for several reasons. You. The Rp diastereomer and the Sp diastereomer have different biophysical properties. Have different affinities for single- and double-stranded nucleic acids (eg, Cossick et al. (1985) Biochem. 24: 3630-3638; (See Kim et al. (1992) FEBS Lett. 314: 29-32). So Re Therefore, under certain circumstances it is desirable to prepare only one diastereomer . In addition, if both diastereomers are present in the mixture, To separate PS-oligonucleotides from each other by electrophoresis and HPLC. Or to separate PS-oligonucleotides from other unwanted reaction products. It becomes difficult. Because the peaks obtained from these chromatographic methods are: This is because they tend to be wider than their phosphodiester-bonded counterparts. further Lack of stereospecificity means that for steric reasons, PS DNA / RNA duplexes The melting point (Tm) Is low (LaPlanche et al. (1986) Nu) cleic Acids Res. 14: 9081). Therefore, from the viewpoint of developing new drugs, Preparation of such analogs needs to successfully address the issue of stereochemical purity .   Therefore, what is needed is a phosphorothioate oligonucleotide. It is a method for synthesizing stereospecific (Rp or Sp) diastereomers.Summary of the Invention   The invention, in one aspect, provides for the preparation of phosphorothioate oligonucleotides. Methods for synthesizing body-specific Rp diastereomers or isomers are provided. In this specification "Phosphorothioate oligonucleotide" or "PS oligonucleotide" "Tide" is defined as a phosphorothioate internucleotide linkage from 3 'to 5'. It comprises at least 5 nucleotides covalently linked and comprises Sp isomer and And both Rp isomers. “PS-Rp oligonucleotide” refers to a PS oligonucleotide. Refers only to stereospecific (Rp) isomers of gonucleotides.   To produce a PS-Rp oligonucleotide according to the method of the present invention, An oligodeoxynucleotide having a 5 ′ end and a 3 ′ end, Anneal to the nucleotide template, thereby producing a partially double-stranded / partially single-stranded configuration. Generate structure. The primer also has a 3 'end and a 5' end, the 3 ' Contains complementary nucleic acid sequences. The primer is composed of multiple deoxyribonucleotides And one ribonucleotide at the 3 'end or at the second position from the 3' end To Including.   The partially double-stranded / partially single-stranded structure is represented by the deoxynucleoside α-triphosphate S A mixture of the p-isomer and DNA polymerase and a PS complementary to the 5 'portion of the template The time and conditions required to carry out the enzymatic synthesis of the Rp oligonucleotide To produce a double-stranded product. In some embodiments, the The oxynucleoside α-triphosphate Sp isomer is deoxyguanosine 5 ′-(α -Thio) -triphosphate, deoxyadenosine 5 '-(α-thio) -triphosphate, deo Xycytidine 5 '-(α-thio) -triphosphate and thymidine 5'-(α-thio) -Selected from the group consisting of triphosphates. "DNA polymerase" refers to a single video The 3 'end of the xyribonucleoside is shared with the 5' end of another deoxyribonucleoside. Refers to an enzyme capable of synthesizing DNA by being linked by a covalent bond. Specific state In one embodiment, the synthesis comprises DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq This is performed using DNA polymerase or reverse transcriptase.   The double-stranded product is then cleaved after the ribonucleotide at the RNA / DNA junction To release the PS-Rp oligonucleotide from the primer and the template. How many In some embodiments, the cleavage is such that the ribonucleotide in the primer is The primer and the newly synthesized PS-Rp or It occurs with gonucleotides. In another embodiment, the cleavage is 3 ′ of the primer. The second nucleotide from the terminal and the PS-Rp oligonucleotide Occur between the 3 'terminal nucleotides.   In some embodiments of the invention, the cleavage is an endonucleolytic enzyme, e.g. For example, RNase A, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase In this case, the cleavage is carried out using an alkali. And do it. In certain embodiments, a strong alkali or base, such as sodium hydroxide Or ammonium hydroxide, lithium hydroxide or potassium hydroxide A selected halogen hydroxide is used for this purpose.   Another aspect of the invention relates to a stereospecific Rp oligonucleotide prepared according to the method of the invention. Creotide.   Yet another aspect of the invention relates to at least one stereospecific Rp phosphorothioe Multiple deoxs covalently linked by a single internucleotide linkage Includes oligonucleotides consisting of siribonucleotides. Such stereospecific Rp phosphorothioate oligonucleotides are compared to Sp phosphorothioate Or a mixture of Rp and Sp phosphorothioate has a higher mitogenicity Seems low. In one embodiment, all deoxyribonucleotides are present. Linked by body-specific Rp phosphorothioate internucleotide linkages You.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   The above and other objects of the invention, its various features, and the invention itself are A more complete understanding will be had when reading the following description in conjunction with the accompanying drawings. In the drawing And:   FIG. 1A shows the protocol for the synthesis of stereospecific PS oligonucleotides. Schematic diagram illustrating one embodiment;   FIG. 1B shows the protocol for the synthesis of stereospecific PS oligonucleotides. Schematic diagram showing another embodiment;   FIG. 2A shows a phosphodiester (PO) oligonucleotide in bovine serum, standing. Body-specific phosphorothioate (PS-Rp) oligonucleotides and synthetic phos Autora showing nuclease resistance of holothioate (PS) oligonucleotide Geogram;   FIG. 2B shows PO oligonucleotide, PS-Rp oligonucleotide in human serum. Autoradiograph showing nuclease resistance of otide and PS oligonucleotides Ram;   FIG. 3A shows PO oligonucleotide, PS in the presence of DNA polymerase I. -Nuclease resistance of Rp oligonucleotide and PS oligonucleotide Autoradiogram shown;   FIG. 3B shows PO oligonucleotide, P in the presence of T4 DNA polymerase. Nuclease resistance of S-Rp and PS oligonucleotides An autoradiogram indicating   FIG. 4A shows the melting point (TmTo complementary DNA and RNA targets as determined by Of PS-Rp oligonucleotides and PS oligonucleotides A graph showing the affinity for zation;   FIG. 4B shows P to complementary DNA and RNA targets as measured by circular dichroism. Hybridization of S-Rp oligonucleotide and PS oligonucleotide A graph showing the affinity for the protein;   FIG. 5 shows PS-Rp oligonucleotide (◆) and PS oligonucleotide Graph showing the ability of (□) to inhibit rHIV reverse transcriptase;   FIG. 6 shows the RN of PS-Rp oligonucleotide and PS oligonucleotide. It is an autoradiogram which shows the sensitivity to ase H digestion.Detailed description of preferred embodiments   The present invention relates to a method for the synthesis of stereospecific PS-oligonucleotides, Stereospecific (all Rp) oligonucleotide phosphorothioe using process Provided is a method for manufacturing a sheet. These Rp oligonucleotides are non-stereospecific. Binds protein with lower affinity than its counterpart and appears to have lower mitogenicity It is.   Establishment for synthesizing stereospecific PS-oligonucleotides (all Rp) The method used is outlined in FIGS. 1A and 1B. DNA polymerase 2'-deoxy while extended by a single phosphorothioate to form an Rp bond Using only the Sp diastereomer of the nucleotide 5 '-(α-thio) triphosphate (Eckstein (1985) Ann. Rev. Biochem. 54: 367-402). However, such elongation is It is limited to the case where a suholothioate bond is introduced.   To completely synthesize a stereospecific molecule, the desired sequence of the stereospecific molecule A suitable template having a complementary nucleic acid sequence and a 3 ′ portion complementary to the template. Design primers with nucleic acid sequences. The synthesis of the template is a phosphodiester- Using methods known in the art for producing linker oligonucleotides, Do it. One such useful method is the use of β-cyanoethyl phosphoramidite. Tokagaku (Beaucage, Protocols for Oligonucleotides and Ana logs,Methods in Molecular Biology, Vol.20 (Agrawar), Huma Na Pres, Totowa, New Jersey (1993) pages 33-61). For the synthesis of primers, the ribonucleoside phosphoramidite was replaced with a synthon ( synthon) "or as a building block, multiple deoxyribonucleotides And one 3′-ribonucleotide at the position shown in FIG. This Sint Allows cleavage of the synthesized stereospecific oligonucleotide from the primer. Introduced to make it possible. After synthesis, RNA protocols such as desilylation (dama -(Damha) et al., Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Metheds in Molecular Biology , Vol.20 (Agrawar), Humana Press, G Deprotection is performed using Towa, New Jersey (1993) pp. 81-114.   According to the method of the present invention, methods well known in the art, for example, For 1 minute and then cooled at room temperature for 1 hour to allow the primer to Control. Then, extend the primer to have a nucleic acid sequence complementary to the template Generate oligonucleotides. Primer extension is performed by Xstein. (Ann. Rev. Biochem. (1985) 54: 367-4). 02), an enzyme capable of performing such synthesis, for example, Taq DNA polymerase, D NA polymerase I (PolI polymerase), T4 DNA polymerase, and All 4′-deoxynucleoside 5 ′-(α-thio) E) triphosphate or 2′-deoxynucleoside 5 ′-(α-thio) triphosphate Perform using analog.   After extension, the newly synthesized stereospecific PS-Rp oligonucleotide was Release by cleavage from the immer and release from the template. Release is ribonucleic The PS-Rp oligonucleotide is cleaved from the primer at the otide site, Performed using a procedure that dissociates the Rp oligonucleotide from the template. This Ribonu The nucleotide is located at the second position from the 3 'end of the primer before extension (Figure 1A). Or the position of the 3 ′ end (FIG. 1B). Useful treatments include strong digestion of RNA. Endoribonuclease using potassium or cleaving RNA / DNA junction Or cleavage with other enzymes. Preferred alkalis include sodium hydroxide Hydroxides such as sodium, lithium, ammonium or potassium hydroxide And most preferably ammonium hydroxide or potassium hydroxide. Um. Useful enzymes include RNase A, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase N1 and RNase N2. Are commercially available.   After cleavage, the product is separated by chromatography, gel electrophoresis, ultracentrifugation, or To separate single-stranded oligonucleotides from themselves and from double-stranded molecules Purified by other methods known in the art. PAGE, eg 8M urine PAGE on a 20% polyacrylamide gel containing silicon was used for this purpose. Useful. Purification of the band containing the PS-Rp oligonucleotide Position, for example, by UV shadowing, cut out, Then, desalting is performed. Generally, about 8 nanomolar of the primer and 2. When synthesis was performed using a 5 nmol template, about 1 nmol of PS-Rp A lignonucleotide product is obtained.   The oligonucleotides of the present invention are useful as modulators of gene expression. You. For example, to determine the function of a particular gene, the oligonucleotides of the invention Target the gene in tissue culture and examine its regulatory effects be able to. The role that certain proteins play in certain biological processes If the purpose is to determine the percentage, target nucleic acid encoding the protein Of the present invention as a means for suppressing the production of the protein by The biological effects of using nucleotides and then inhibiting the protein The fruit can be observed. In such situations, it is built-in to be studied The effect is by suppressing the production of proteins, not oligonucleotides. . Thus, by using the oligonucleotide of the present invention, the target gene An alternative to the painstaking method of creating deletion mutants by mutation An easily feasible alternative is provided.   In addition, the PS-Rp oligonucleotides of the present invention have their chiral Sp counterparts. As well as phosphotransferase and nucleotidyltransferase Useful as a stereochemical probe. Because these oligonucleotides Is the nucleotide at which the 3'-hydroxyl of the growing chain displaces the pyrophosphate. By single bond cleavage at phosphorus of leotide triphosphate or by covalent nucleo Two bond cleavage when covalent nucleotidyl enzyme is involved The introduction of deoxyribonucleotides into the growing polymer (Brody et al. (1981) Biochem. 20: 1245). １２５1252).   Comparative stability of PS-Rp oligonucleotide prepared according to the method of the present invention The PS-Rp oligonucleotide as well as sequence-comparable PO-linked and PS-linked oligonucleotides Determined by exposure to a nuclease source such as human or bovine serum. FIG. 2A The results shown in the figure indicate that the PS-Rp oligonucleotide was incubated in bovine serum. From 6 hours to 24 hours, whereas PO Oligonus This indicates that nucleotide is not present. In human serum (FIG. 2B), PS -Rp oligonucleotide and PS oligonucleotide are incubated PO-linked oligonucleotides are still present after 120 minutes Digested after 60 minutes.   Similar results were obtained for PO oligonucleotides, PS oligonucleotides and PS oligonucleotides. -Rp oligonucleotide was converted to T4 DNA polymerase I (Figure 3A) or DNA It was also obtained when incubated with polymerase (FIG. 3B). FIG. 3B As shown in, the PS oligonucleotide and the PS-Rp oligonucleotide Both were present after 4 hours of incubation in the presence of DNA polymerase I. However, the PO oligonucleotide was absent after 1 hour.   These results indicate that the PS-Rp oligonucleotide was a phosphodiester-linked oligo. Stable compared to nucleotides and in bovine and human serum, and DNA PS oligonucleotides in the presence of remelase and T4 DNA polymerase It shows that it has comparable stability.   The PS-Rp oligonucleotide and the synthetic PS-oligonucleotide have a melting point (Tm) And circular dichroism to measure complementary RNA and DNA The affinity for the type was also compared. As shown in FIG. 4A, the PS-Rp oligo Both nucleotides and PS-oligonucleotides are identical to the DNA template. Ji Tm(51.8 ° and 51.9 °). However, RNA template As a result, the PS-Rp oligonucleotide (68.9 °) is a synthetic PS-oligonucleotide. It shows a higher melting point than otide (64 °), and the PS-Rp oligonucleotide Has a greater binding affinity for the target. FIG. The difference in the CD spectrum for the NA duplex is the CD spectrum for the DNA duplex. This indicates that the RNA target is more significant than the DNA PS-Rp oligonucleotide and PS during hybridization compared to target Demonstrates greater sensitivity to changes in oligonucleotide configuration .   P present as a mixture of Rp and Sp diastereomers One known sequence-nonspecific effect of S oligonucleotides is the reverse transcriptase enzyme. Inhibition of elementary activity. The PS-Rp isomer is the same as the diastereomer mixture. To determine whether or not they have the same inhibitory activity, And PS oligonucleotides were individually incubated with reverse transcriptase. As shown in FIG. 5, the PS-Rp oligonucleotide was a synthetic PS-oligonucleotide. It was found to be a stronger reverse transcriptase inhibitor than the tide mixture.   Ability of PS-Rp oligonucleotide to elicit RNase H degradation response To determine if is comparable to the PS diastereomer mixture, PS-Rp Oligonucleotides were also subjected to RNase H digestion. FIG. 6 shows PS-Rp oligos. Nucleotides have better RNase H than synthetic PS-oligonucleotide mixtures It is a good substrate.   In addition, these oligonucleotides hybridize to complementary nucleic acid sequences And can be taken up by cells. Therefore, stereospecific PS The Rp oligonucleotide is the diastereomer Rp of the PS oligonucleotide; + Sp mixtures have similar, if not improved, similar antisense properties. Has the characteristics of   The following examples illustrate preferred embodiments for making and practicing the present invention. It does not limit the scope of the invention. Because, to get a similar result, Because it can be used.                                  Example 1. Synthesis of PS-Rp oligonucleotide   30 μl volume of 50 mM Tris, pH 9.0, 10 mM MgClTwoInside, 8 na Nomol primer: (SEQ ID NO: 2) and 2.5 nmol of template: Heating (SEQ ID NO: 3) at 90 ° C. for 3 minutes and then cooling at room temperature for 1 hour Before annealing. The reaction volume is 50 mM Tris, pH 9.0, 10 m M MgClTwo5 mM DTT, 100 mM deoxyguanosine 5 ′-(α-thio ) Triphosphate, 100 mM deoxyadenosine 5 ′-(α-thio) triphosphate, 20 0 mM deoxycytidine 5 '-(α-thio) triphosphate and 200 mM thymidine 5 '-(α-thio) triphosphate (Dupont-NEN, Boston, Mass.) ) Was increased to 1.5 ml. 2500 unit sequence grade TaqDN A polymerase (Promega Corp., Madison, Wisconsin) Was added to start the reaction. The mixture was incubated at 37 ° C. for 4 hours. reaction The mixture is desalted and treated with ammonium hydroxide solution (28-30%) at 55 ° C. for 24 hours For 1 hour at 37 ° C. with or 0.3M KOH. In other tests, desalination The reaction mixture was separated into RNase A, RNase T1, RNase T2, RNase U2, RNase N1, or RNase N2 (these are Sigma Chemical, (Available from St. Louis, Mo.) at 95 ° C. for about 3 minutes. Living The product was dried and purified by PAGE on a 20% denaturing polyacrylamide gel . Generate The material is excised from the gel under UV shadowing and 500 mM ammonium acetate And desalted by dialysis (described in FIG. 1). 2. Nuclease resistance of PS-Rp oligonucleotides   Phosphodiester-linked (PO) oligonucleotides in bovine and human serum Reotide, stereoregular (PS-Rp) oligonucleotides, And the stability of the synthetic PS-oligonucleotide (PS) was tested as follows. Was. 60 picomoles of [32P] 5 'end-labeled oligonucleotide was Serum (Sigma Chemical, St. Louis, MO) at 37 ° C. I did it. 20 μl aliquots at 0, 30, 60 and 120 minutes And then 20 μl of 20 mM Tris, pH 7.8, 10 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS and 100 μg proteiner Incubated with ZeK at 65 ° C for 1 hour. Transfer the sample to phenol / chloropho Extraction with ethanol, precipitated with ethanol, then 20% acrylamide, 8.3M urea Was analyzed by PAGE in a gel containing The gel was treated with acetic acid / methanol / water (1 0:10:80, v / v / v) fixed in solution and subjected to autoradiography Before drying for 3 hours. The autoradiogram is shown in FIG. 2A (bovine serum) and FIG. B (human serum).   In addition, comparative studies of nuclease resistance were performed using T4 DNA polymerase and DNA Performed using polymerase (PolI). DNA polymerase I assay 30 picomoles of [32P] -5 ′ end-labeled PO oligonucleotide, PS oligonucleotide Gonucleotide or PS-Rp oligonucleotide, 50 nm Tris, pH 8.0, 5 mM MgClTwo5 mM DTT, 0.05% bovine serum albumin, And 5 units of DNA polymerase I (Worthington Biochemical (Worthin) gton Biochemical Corp.), Freehold, New Jersey) Performed in a 20 μl volume. An aliquot is taken at 0 minutes and the rest is Cubbed. Aliquots of 5 μl at 1, 2, and 4 hours I took it. Aliquots of 6 μl stop solution (95% formamide, 10 mM E DTA, 0.05% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol) added. Then, PAGE using 20% acrylamide and 8.3% urea gel More analyzed. The result is shown in FIG. 3A.   The T4 DNA polymerase assay measures 45 pmol [32P] -5 'end label PO oligonucleotide, PS oligonucleotide, or PS-Rp oligonucleotide Gonucleotide, 50 nM Tris, pH 8.0, 5 mM MgClTwo, 5 mM DT T, 0.05% bovine serum albumin, and 7.5 units of T4 DNA polymerase (Promega, Madison, Wisconsin) in a 30 μl volume. Aliquots were taken at 0 minutes and the rest were incubated at 37 ° C. 5 μl Aliquots were taken at 5, 15, 30, and 60 minutes. At each point Recoat 6 μl stop solution (95% formamide, 10 mM EDTA, 0.05% Bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol) was added. Then Samples were analyzed by PAGE using 20% acrylamide, 8.3% urea gel. Was. The result is shown in FIG. 3B. 3. Melting point test   Melting point (Tm) The test was performed as follows. 1.06 × 10-6M PS-Rp Oligonucleotide or PS oligonucleotide at 10 mM phosphate, 100 m M NaCl, pH 7, subjected to a temperature in the range of 30-75 ° C., (GBC920, GBC, Victoria, Australia)260Smell The absorbance was measured. The result is shown in FIG. 4A. 4. Circular dichroism test   Perform a circular dichroism test and compare the PS-Rp oligos to complementary RNA or DNA sequences. The relative binding affinities of nucleotides and PS oligonucleotides were determined. 1.06 × 10-6M-PS-Rp oligonucleotide or PS oligonucleotide The tide is placed in 10 mM phosphoric acid, 100 mM NaCl, pH 7, and the spectropolarimeter ( J-710, Jasco, Easton, Md.) Subjected to ~ 320 nm UV light. The result is shown in FIG. 4B. 5. Inhibition of rHIV reverse transcriptase   Determine the relative ability of PS-Rp oligonucleotides to inhibit reverse transcriptase Therefore, the following assay was performed. Annealed before 1 mM [32P] -5 'End-labeled primer: (SEQ ID NO: 5) and template: (SEQ ID NO: 6), 50 mM Tris, pH 8.3, 10 mM MgClTwo, 50 mM KCl, 5 mM DTT, 0.25 mM deoxynucleoside 5 ′ triphosphate (dN TP) and a 10 μl reaction mixture containing various concentrations of oligonucleotides Was prepared. 0.8 units of rHIV reverse transcriptase (Worthington Biochemical , Freehold, New Jersey) and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. Incubated. The reaction was stopped with 10 ml of formamide, followed by 20% denaturation Analysis was performed by polyacrylamide gel electrophoresis. Elongation product and residual ply CPM was measured on the mer band and the percent inhibition was calculated. as a result Is shown in FIG. 6. RNase H activity assay   One picomole of [32P] -3′-end labeled HIV-I gag of 39-mer  RNA: (SEQ ID NO: 3) in 10 ml buffer (20 mM Tris, pH 7.5, 10 mM M) gClTwo, 100 mM KCl, 0.1 mM DTT, 5% glycerin). With mol PS-Rp oligonucleotide or PS oligonucleotide in advance Annealed. The reaction solution was made up to a volume of 30 ml with the same buffer, and 40 units of RN Add Ze H (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) Was. A 7 ml aliquot was taken at time zero. 0.5 units of RN in the remainder of the mixture Ase H was added and this was incubated at 37 ° C. for 15 minutes. 7 μl aliquot And react with 10 μl of formamide at 1 min, 5 min and 15 min Stopped. The mixture was separated by PAGE on a 20% denaturing polyacrylamide gel. (The gel was autoradiographed). FIG. 6 shows the result. 7. Activity assay   The activity of the PS-Rp oligonucleotide was measured in H9 cells, MOLT-3 cells or Determined by assaying the ability to suppress HIV-1 expression in other cells Was. In this assay, 5 × 10 5 per mlFive2.5-5 x 10 cells8C Infected with HIV-1 strains HTLV-IIIB or HTLV-IIIC of irs particles I let it. Infection of 500 to 1000 viral particles per cell is 0.5 to 1 Represents severity (MOI). Cell infection is 5% COTwo37 ° C in a humid atmosphere containing RPMI 1640 (10% (v / v) fetal calf serum, 2 mM glutamine and And 250 μl of gentamicin per ml). This is performed by simultaneously adding the virus and the antisense oligomer to the cells. 4th Later, syncytium (MOLT-3 cells) and viral antigen expression and cell survival By measuring the degree, the HIV-1 expression level can be determined for the cells and the supernatant. Find out. The number of syncytia produced in MOLT-3 cells was determined by triturating the cells. After the syncytium has been evenly dispersed in the I did it. The average number of syncytia indicates that the two cultures have several fields. Obtained by counting. Cell viability was measured in the presence of trypan blue. The cells from which the dye has been eliminated are counted as viable cells. Measurement of HIV-1 antigen expression The determination is performed on cells fixed in methanol / acetone. In brief, cells Pellets are then pelleted in phosphate buffered saline (PBS).6Cell / ml concentration Resuspend with. The cells were then spotted on toxoplasmosis slides and air Dry and fix in methanol / acetone (1: 1, v / v) for 15 minutes at room temperature You. The slides were then incubated with 10% normal goat serum for 30 minutes at room temperature. Bait and wash with PBS (4 times). HIV-1 p24 or p1 in each well 7 Monoclonal antibody was added and slides were incubated in a humid chamber at 37 ° C for 30 minutes. Beate. Wash slides with PBS (4 times) and fluorescein isothiocyan Goat anti-mouse IgG labeled with nate (Cappel Labs) orat ories), Cochranville, Pennsylvania) for 30 minutes at room temperature. Bait and then wash with PBS overnight. Counterstain slides with Evans Blue And washed with PBS, loaded with 50% glycerin, and Zeiss fluorescence microscope I checked in. Fluorescent cells in oligomer-treated and untreated cultures Compare the percentages of 8. Cell uptake   Pre-plated in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) for 24 hours Human 293, HeLasThreeAnd NIH3T3 subconfluent cells Culture dishes or DMEM / Eagle balanced salt solution medium (5 × 10FiveCells / ml; total A culture dish of MDCK or HEp-2 cells grown in35S- Incubate with labeled PS-Rp oligonucleotide for 16 hours. Cell fractionation is performed as follows. Cells from the culture plate using trypsin And collected (1,500 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), 4 ml of cold phosphate buffered saline Wash with water (PBS). Transfer cells to 450 μl of buffer A (10 mM Tris-HC 1, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgClTwo) And 50 μl In 5% Nonidet P-40 (NP-40) at 4 ° C. for 10 minutes. 20 After centrifugation at 00 rpm for 5 minutes, the upper cytoplasmic fraction (cytosol and cell membrane And dissolve the pellet (nucleus) in 500 μl of buffer A, Measure the radioactivity.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アグラワル，サディール アメリカ合衆国01545マサチューセッツ州 シュルーズベリ、ランプライター・ドラ イブ61番────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, U G), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, B Y, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, FI , GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK , TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, VN (72) Inventor Agrawal, Sadir             United States 01545 Massachusetts               Shrewsbury, Lampwriter Dora             Eve 61

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．立体特異的Ｒｐホスホロチオエート（ＰＳ）インターヌクレオチド結合を有 するオリゴヌクレオチドの合成方法であって、 （ａ）プライマーを鋳型にアニールさせて部分的二本鎖／部分的一本鎖の構造を 生成させ、その際、 該鋳型は５'末端および３'末端を有し、複数のデオキシリボヌクレオチドを含 み、 該プライマーは３'末端および５'末端を有し、複数のデオキシリボヌクレオチ ドおよび５'末端の位置または５'末端から２番目の位置にある一つのリボヌクレ オチドを含み、該プライマーは該鋳型の５'部分に相補的な核酸配列を有し、 （ｂ）該構造を、デオキシヌクレオシドα−三リン酸Ｓｐジアステレオマーおよ びＤＮＡポリメラーゼの混合物と、該鋳型の５'部分に相補的なＰＳ−Ｒｐオリ ゴデオキシヌクレオチド伸長物の酵素的合成に必要な時間および該合成を可能に する条件下で接触させ、それによって二本鎖産物を生成させ、 （ｃ）該二本鎖産物を該リボヌクレオチドの後で開裂してＰＳ−Ｒｐオリゴデオ キシヌクレオチドを該鋳型および該プライマーから遊離させる ことを特徴とする方法。 ２．該ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ 、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素よりなる群から選ばれる、請求 項１に記載の方法。 ３．アルカリまたはエンドリボヌクレアーゼを用いて該リボヌクレオチドの後で 開裂することにより該ＰＳ−Ｒｐオリゴデオキシヌクレオチドを該鋳型および該 プライマーから遊離させる、請求項１に記載の方法。 ４．該アルカリが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、 および水酸化カリウムよりなる群から選ばれた水酸化ハロゲン塩である、請求項 ３に記載の方法。 ５．該塩基が、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＴ１、ＲＮアーゼＴ２、ＲＮアーゼＵ ２、ＲＮアーゼＮ１、およびＲＮアーゼＮ２よりなる群から選ばれた酵素である 、 請求項３に記載の方法。 ６．該デオキシヌクレオシドα−三リン酸Ｓｐジアステレオマーが、デオキシグ アノシン５'−（α−チオ）三リン酸、デオキシアデノシン５'−（α−チオ）三 リン酸、デオキシシチジン５'−（α−チオ）三リン酸、およびチミジン５'−（ α−チオ）三リン酸よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 ７．該プライマー中の該リボヌクレオチドが３'末端にある、請求項１に記載の 方法。 ８．該プライマー中の該リボヌクレオチドが３'末端から２番目の位置にある、 請求項１に記載の方法。 ９．請求項１に記載の方法に従って調製したＰＳ−Ｒｐオリゴヌクレオチド。 １０．少なくとも２つの立体特異的Ｒｐホスホロチオエートを含む、オリゴヌク レオチド。 １１．少なくとも一つの立体特異的Ｒｐホスホロチオエートインターヌクレオチ ド結合により共有結合で連結された複数のデオキシリボヌクレオチドを含む、オ リゴヌクレオチド。 １２．すべてのデオキシリボヌクレオチドが立体特異的Ｒｐホスホロチオエート インターヌクレオチド結合により連結されている、請求項１１に記載のオリゴヌ クレオチド。[Claims] 1. Has stereospecific Rp phosphorothioate (PS) internucleotide linkage An oligonucleotide synthesis method comprising: (A) Annealing a primer to a template to form a partially double-stranded / partially single-stranded structure Is generated,   The template has a 5 'end and a 3' end and contains multiple deoxyribonucleotides. See   The primer has a 3 'end and a 5' end and has a plurality of deoxyribonucleotides. And one ribonucleic acid at the 5 'end position or the second position from the 5' end Otide, said primer having a nucleic acid sequence complementary to the 5 'portion of said template, (B) converting the structure to a deoxynucleoside α-triphosphate Sp diastereomer and And a mixture of DNA polymerase and a PS-Rp oligonucleotide complementary to the 5 'portion of the template. Time required for enzymatic synthesis of godeoxynucleotide extension and enabling the synthesis Contacting under conditions that produce a double-stranded product, (C) cleaving the double-stranded product after the ribonucleotide to form a PS-Rp oligodeode; Releasing xynucleotides from the template and the primer A method comprising: 2. The DNA polymerase is T4 DNA polymerase, DNA polymerase I , Taq DNA polymerase, and reverse transcriptase. Item 1. The method according to Item 1. 3. After the ribonucleotide using an alkali or endoribonuclease Cleaving converts the PS-Rp oligodeoxynucleotide to the template and the 2. The method according to claim 1, wherein the method is released from the primer. 4. The alkali is ammonium hydroxide, sodium hydroxide, lithium hydroxide, And a hydroxide hydroxide salt selected from the group consisting of potassium hydroxide. 3. The method according to 3. 5. The base is RNase A, RNase T1, RNase T2, RNase U 2, an enzyme selected from the group consisting of RNase N1 and RNase N2 , The method of claim 3. 6. The deoxynucleoside α-triphosphate Sp diastereomer is Anosine 5 ′-(α-thio) triphosphate, deoxyadenosine 5 ′-(α-thio) triphosphate Phosphoric acid, deoxycytidine 5 ′-(α-thio) triphosphate, and thymidine 5 ′-( The method according to claim 1, wherein the method is selected from the group consisting of α-thio) triphosphate. 7. 2. The method of claim 1, wherein the ribonucleotide in the primer is at the 3 'end. Method. 8. The ribonucleotide in the primer is at the second position from the 3 'end, The method of claim 1. 9. A PS-Rp oligonucleotide prepared according to the method of claim 1. 10. Oligonucleotides comprising at least two stereospecific Rp phosphorothioates Leotide. 11. At least one stereospecific Rp phosphorothioate internucleotide Comprising a plurality of deoxyribonucleotides covalently linked by Rigo nucleotides. 12. All deoxyribonucleotides are stereospecific Rp phosphorothioates The oligonucleotide of claim 11, which is linked by an internucleotide linkage. Creotide.
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