JPH10510720A

JPH10510720A - Protein detection method

Info

Publication number: JPH10510720A
Application number: JP9514730A
Authority: JP
Inventors: デンブレークヘンリエッテカタリーナファン; グラーフレーンデルトヘンドリックデ; ヤコブヴィーゼル; オーイェンアルベルトヨハネスヨゼフファン
Original assignee: ギストブロカデスベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1995-10-13
Filing date: 1996-10-14
Publication date: 1998-10-20
Also published as: EP0796328A2; AU7294396A; WO1997013853A2; WO1997013853A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、関心の対象となっているタンパク質をコードしているDNA 断片の同定法で、この方法においては該タンパク質の産生が可能な真核生物から入手できるDNA によって形質転換された細菌宿主細胞の形態のcDNAライブラリーを、タンパク質の存在を示す試験によって、該タンパク質の発現についてスクリーニングし、この宿主細胞のスクリーニングが、形質転換DNA がプラスミドの一部となった後に行われることを特徴とする方法を提供する。このcDNAライブラリーは、真核生物に由来するものが好ましい。この真核生物は、好ましくは、真菌又は酵母細胞であり、より好ましくはアスペルギルス属であり、最も好ましくは多くのアスペルギルス・ニガー群の一員である。スクリーニングされる酵素は、好ましくはセルラーゼ、エンドキシラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を示す酵素である。 (57) [Summary] The present invention is a method for identifying a DNA fragment encoding a protein of interest, in which bacterial host cells transformed with DNA available from a eukaryote capable of producing the protein. A cDNA library of the form described above is screened for expression of the protein by a test indicating the presence of the protein, and the screening of the host cells is performed after the transforming DNA becomes part of the plasmid. Provide a way. This cDNA library is preferably derived from a eukaryote. The eukaryote is preferably a fungal or yeast cell, more preferably of the genus Aspergillus, and most preferably a member of the many Aspergillus niger groups. The enzyme to be screened is preferably an enzyme exhibiting cellulase, endoxylanase or arabinoxylan degrading activity.

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質検出法発明の分野本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 配列を決定する方法に関する。発明の背景最近のバイオテクノロジーの大きな試みのひとつは、ある機能を果たす新規酵素を発見することである。酵素には、例えば食品産業、洗剤、デンプン転化、動物飼料、及び各種産業における加工助剤のような領域において、多くの用途がある。それに加え、酵素的転化は、いくつかの医薬化合物の合成などの様々な作業のための化学的転化の代用となる。一般に酵素は、費用効果的であり、特異的かつ環境に優しい触媒として、一般性を増しつつある。従って、酵素の用途の範囲を広げるような新規酵素活性を見つけること、又は特定の用途により適した酵素を見つけることは、酵素産業のひとつの大きな試みである。新規酵素の探求は、従来は、天然の多様性を研究することで行われてきた。現在市販されているほとんどの酵素は、微生物を起源としている。細菌、酵母及び真菌のような微生物は、特定の活性を持つ酵素を分泌する。様々な生態環境の適所(ecological niches)に由来する微生物をスクリーニングすることによって、今日使用されている酵素類が発見された。しかしこのスクリーニング法には、いくつかの欠点がある。例えば、天然に見出された微生物は、通常、酵素の全配列 (whole array)を分泌する。従って必要とされる酵素は、合成された酵素のごくわずかな割合に相当する。更に微生物は、毒素又は所望でない酵素のような、必要としない化合物を合成する。興味のある遺伝子をクローニングし、その後適当な宿主に導入するために、組換えDNA 技術が適用される。従来の遺伝子クローニング法は、コードされたタンパク質（例えば酵素）の精製、部分的アミノ酸の配列決定、及びその後の興味のある遺伝子の分子クローニングを含み、退屈な作業であった。クローニング後に、興味のある遺伝子を、大規模発酵に適した宿主において発現することができる。この従来の酵素クローニング法に加え、他の方法も使用されている。特定の生物に由来するゲノムDNA は、大腸菌(E．コリ)におけるクローニング、その後の特異的活性のスクリーニングによって、同定することができる。セルラーゼ及びキシラナーゼを含む多数の酵素が、この方法で同定された（Sashihar a N.らの論文、Bact、158:503-506 頁(1984)；Fukumori Fらの論文、Gene、76:2 89-298頁(1989)；Sakka K らの論文、Agric.Biol.Chem.、53:905-910頁(1989)； Zappe H らの論文、Appl.Microbiol.Biotechnol.、27:57-63頁(1987)；Sakka K らの論文、Agric.Biol.Chem.、54:337-342頁(1990)；Srivastava Rらの論文、FE MSMicrobiol.Lett．、78:201-206頁(1991)；Shendye A 及びRao M の論文、FEMS Microbiol.Lett.、108:297-302頁(1993)）。しかしこの方法は、そのDNA が大腸菌において直接発現されるような微生物に限定されている。通常、例えば真菌及び酵母などの真核生物のような無関係の生物に由来した遺伝子は、調節配列の無効又はイントロンの存在のために、発現されない。これらの問題点のいくつかを克服するために、cDNAが、大腸菌ファージにおいて発現されていて、これは、抗体又は酵素活性によって検出されるような機能的タンパク質をもたらしている。しかし抗体の使用（例えば、欧州特許第EP 05061 90号及びその係属出願第EP94202442.3号を参照）には、純粋な酵素が利用可能であることが必要である一方で、溶菌斑の酵素活性は、非常に低く（Karlovsky 及びWolfの論文、Methods Mol.Cell.Biol.、4:40-45 頁(1993)）、酵素活性の即時検出に不適なものにしている。第三の方法は、酵母におけるcDNAの発現である（第WO 93/11249 号；Dalboge 及びHeldt-Hansenの論文、Mol.Gen.Genet 、243:253-260 頁(1994)）。しかしこの方法は、活性酵素を産生するコロニーの割合が少ないために、効果的でない：この方法では、2.5 ×10⁵〜5 ×10⁵クローンが、スクリーニングされなければならない。別の欠点は、この方法が、スクリーニングを行う前に、大腸菌から酵母へ遺伝物質を転移し、かつその後このクローニング操作の停止のために酵母から大腸菌へと戻し転移することが必要な点である。それに加え、酵素活性のレベルは、低い。発明の要約本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 断片を同定する方法を提供し、この方法では、該タンパク質を産生可能な真核生物から入手できるcDNAで形質転換された細菌の宿主細胞の形態のcDNAライブラリーを、タンパク質の存在を示す試験によって、該タンパク質の発現に関してスクリーニングし、この宿主細胞のスクリーニングが、形質転換DNA がプラスミドの一部となった後に行われることを特徴とする。このcDNAライブラリーは、真核生物に由来することが好ましい。前記真核生物は、好ましくは真菌又は酵母細胞であり、より好ましくはアスペルギルス種であり、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー群の一員である。スクリーニングされる酵素は、好ましくはセルラーゼ、エンドキシラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を示す酵素である。発明の詳細な説明本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 断片の同定法を提供する。この方法は、関心を持たれているタンパク質を産生することが可能な真核生物から入手することができるDNA で形質転換された細菌宿主細胞の形態のcDNAライブラリーを、該タンパク質の発現に関してスクリーニングすることを含む。この目的のために、該タンパク質の存在を示す試験が用いられる。この宿主細胞のスクリーニングは、形質転換DNA が、プラスミドの一部となった後に行われる。微生物における真核生物遺伝子の発現クローニングの現在の方法と比べ、この方法は、迅速であり、直接的でありかつ非常に効果的である。驚くべきことに、現在の方法の10⁵〜10⁶クローンではなく、10²〜10⁴クローンのスクリーニングによって、多くの陽性クローンが認められてる。本方法の別の驚くべき利点は、現在のコロニースクリーニング法のほとんどとは対照的に、関心を持たれている可能性のある遺伝子産物を含む細菌の内容物が放出されるような、更なる溶菌工程を導入する必要が無いという点である。本発明の方法は全て、原核細胞において行うことができ、遺伝物質を、この方法のいずれかの時点で真核生物に転移する必要が無い。このcDNAライブラリーは、関心を持たれている真核生物の、好ましくは真菌の mRNAから調製される。特に関心を持たれている真菌の例は、アスペルギルス属のものであり、更に詳細に述べると、アスペルギルス・ニガーである。黒色アスペルギルスの名称に関する最近の変化から、本願明細書の用語アスペルギルス・ニガーは、Raper 及びFennell によって定義されたアスペルギルス・ニガー群に認めることができる全ての（黒色）アスペルギルスを含むと定義される（1965年、アスペルギルス属(The Genus Aspergillus)、The Williams & Wilkins Company 、ボルチモア、293-344 頁）。 cDNA調製に使用されるmRNAは、構成的に存在するか、もしくは誘導することができる。本発明の方法は非常に効率的であるので、コロニーの大部分は、関心を持たれているタンパク質を産生するであろう。従って、現在の方法と比べて、本方法は、低レベルのmRNAを有するタンパク質を取扱う際にも、使用することができる。このライブラリーは、ベクターにおいて作製される。このベクターは、例えばプラスミド及びファージベクターのような、遺伝物質の転移及び／又は発現に適したいずれかのビヒクルであることができる。このライブラリーが、ファージベクターによって作製される場合は、ZAP （登録商標）ベクター又はその誘導体が好ましく、λUni-ZAP （登録商標）XRがより好ましい。この方法で得られた一次ライブラリーは、適当な宿主細胞、好ましくはE.coli、更に好ましくはE.coli XL1 Blue MRF’を用いて、増幅される。その後このファージは、好ましくは、糸状菌ヘルパーファージ及びE.coli SO LRのようなE.coli宿主菌株による重複感染によって、ファージミドへと変換される。この方法において、二本鎖ファージミドが形成される。本願明細書において用語“ファージミド”は、プラスミドに変換されたファージゲノムを意味する。スクリーニング以前に、全てのプラークがファージミドに変換されるので、低レベルmRNAを有する興味のあるクローンが、活性に関して、陰性として誤って退けられることはない。従って当業者には、プラーク期のスクリーニングが不必要であることは明らかであろう。本発明の同定法において、関心を持たれているDNA は、該タンパク質の精製、アミノ酸配列決定及び該遺伝子の分子クローニングという、退屈な作業を通じてではなく、これがコードしているタンパク質の発現によって、同定される。発現クローニングのひとつの技術は、プレートアッセイであり、これはcDNAライブラリーを、陽性コロニーのスクリーニングが可能な組成の培地上に播種する。関心を持たれているタンパク質のスクリーニングは、純化タンパク質を必要とせず、活性検出に適したアッセイの入手のみが必要である。これは、例えばセルラーゼ活性が、カルボキシメチルセルロースを含有する上層(overlay)を用い、その後コンゴレッドで染色して肉眼で見えるようにすることで検出できるというような、標準的アッセイであることができる。同様に、アラビノキシラン分解酵素の検出は、エンバクスペルト(oat spelt)キシランを含有するプレートに形成された沈殿によって達成することができる。ヨウ素を用いるデンプンの透明化画分(cle aring zone）によるアミラーゼの検出、４級アンモニウムイオンを用いるペクチンの透明化画分によるポリガラクツロナーゼの検出などを含む、多くの適当なプレートアッセイが、文献に公表されている。しかしDNA がコードしているタンパク質の発現によってDNA を同定することができるような適当な種類のアッセイのいずれかを、本発明の方法で使用することができる。あるいは、例えば適当な標準的アッセイが適用できないような場合には、目的に合わせたアッセイを、タンパク質活性の検出のために開発することができる。本発明の方法を用いて検出される酵素の例は、アミラーゼ、アラビノキシラン分解酵素、カタラーゼ、セルラーゼ、ガラクタナーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ及びキシラナーゼを含む。関心を持たれているクローンの同定は、更なる溶菌工程を導入せずに可能である。従って本発明は、原核微生物における、真核生物遺伝子の発現クローニングの、迅速で、効果的かつ直接的方法を提供する。更に、本発明は、本発明の方法を用いて同定することができる、単離された核酸断片を提供する。本発明の核酸断片は、DNA 又はRNA を含み、好ましくはDNA を含む。この核酸断片には、１回以上の単離工程が施される。このような単離工程は、当該技術分野で公知のいずれかの適当な手段により行うことができる。本発明の好ましいDNA 断片は、配列番号１、３、５、７及び９に示された配列を有する。しかし本発明の核酸断片は、これらの好ましい断片に限定されるものではない。むしろ本発明は、配列番号１、３、５、７及び９のDNA 配列によってコードされたポリペプチドの活性の一部又は全てを有するポリペプチドをコードしているような、関連した核酸断片を包含し；すなわち、配列番号１又は３のDN A 配列に関連した本発明の配列は、（少なくとも）CMCase活性を有するポリペプチドをコードし；配列番号５又は７のDNA 配列に関連した本発明の配列は、（少なくとも）キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし；並びに配列番号９のDNA 配列に関連した本発明の配列は、（少なくとも）アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチドをコードしている。従って、本発明は、配列番号１、３、５、７又は９の核酸配列と、高い配列の相同性を有する、単離された核酸、好ましくはDNA の断片の変異体も提供する。従ってこれらは、典型的には、配列番号１、３、５、７又は９と、実質的に相同である。典型的にはこのような変異体断片は、配列番号１、３、５、７又は９と、少なくとも80％の配列の相同性を有する。同様にこのような変異体断片は、欠失、置換又は挿入がコードされたポリペプチドの活性を損なわない限りは、１個以上のアミノ酸の欠失、置換又は挿入により、配列番号１、３、５、７又は９とは異なることができる。従って、これらのコードされたポリペプチドは、配列番号２、４、６、８又は10のポリペプチドの活性の一部又は全てを保持する。本発明は、更に、配列番号１、３、５、７及び９の分解変異体；すなわち、配列番号２、４、６、８又は10のポリペプチドをコードしているが、異なる核酸配列を有する変異体を包含している。本発明の変異体の核酸断片は、いずれかの微生物から得ることができるが、これらは好ましくは、真菌又は酵母から得、更に好ましくはアスペルギルス属の真菌から、最も好ましくはA ・ニガーvar.ニガー、A ・ニガーvar.ツビゲンシス又はA ・アキュレアツスから得る。本発明の方法を用いて同定される核酸は、組換え核酸の構成に使用することができる。典型的には、これらは、組換え核酸ベクターの形態である。当業者は、関心を持たれている宿主細胞において（過剰に）産生される適当なベクターを調製することができるであろう。好ましい宿主細胞は、細菌（例えばE.coli）、酵母（例えばK.ラクチス）、及び真菌（例えばアスペルギルス）細胞を含む。ベクターは、典型的には１個以上の複製起点を含むので、細菌、酵母又は真菌細胞のような宿主細胞において複製される（これは、分子生物学の標準的技術により、例えば大腸菌において、構成体が複製及び操作されるのを可能にする。）。更にベクター、特に発現ベクターは、通常5'末端から3'末端へと配列した、少なくとも下記の要素を含む：核酸配列の発現を指示するプロモーター、及び任意にプロモーターの調節部位、転写開始部位、翻訳開始コドン、並びに本発明の核酸配列である。このベクターは、更に１種以上の選択マーカー遺伝子、例えば１種以上の抗生物質耐性遺伝子なども含む。このようなマーカー遺伝子は、形質転換体の同定を可能にする。任意に、この構成体は、該プロモーターのエンハンサーも含むことができる。このベクターは、更にポリアデニル化シグナルを、典型的にはこの機能的ポリペプチドをコードしている核酸の3'末端側に含むことができる。このベクターは、更に関心を持たれているポリペプチドをコードしている配列の3'末端側に、転写ターミネーターを含むことができる。このベクターは、更に１個以上のイントロン又は他の非コード配列を、例えば本発明のポリペプチドをコードしている配列の3'末端側に含むことができる。典型的なベクターは、本発明の核酸配列が、該配列の発現が可能なプロモーターに、操作できるように連結している。“操作できるような連結”とは、プロモーター、及び該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸配列が、そのコード配列を該プロモーターの制御下で発現することができるような関係を持つような接合部位を意味する。従って、プロモーター及びコード配列の間の、5'末端側の非コード配列のような要素であることができる。このような配列が、プロモーターによるコード配列の正確な制御を増強するか、もしくは損なわないような場合には、これらを前記ベクターに含むことができる。更に本発明は、本発明の核酸でコードされたポリペプチド類を提供する。これらのポリペプチドは、部分的、実質的又は完全に単離されていて、前述のようにセルラーゼ、キシラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を有す。本発明の好ましいポリペプチドは、その配列が配列番号２、４、６、８又は10であるものを含む。しかし本発明は、これらの配列に限定されるものではなく；むしろ、前述の活性の一部又は全てを、典型的には配列番号２、４、６、８又は10のポリペプチド活性を実質的に有する、本発明の核酸断片によってコードされた全てのポリペプチドを包含している。従って、配列番号２又は４のポリペプチドに関連した本発明の変異体ポリペプチドは、セルラーゼ活性を有し；配列番号６又は８のポリペプチドに関連した変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有し；並びに、配列番号10のポリペプチドに関連した変異体ポリペプチドは、アラビノキシラン分解活性を有す。特に本発明は、配列番号２、４、６、８又は10に関連した配列を有する変異体ポリペプチドを提供する。典型的には、このような変異体は、配列番号２、４、６、８又は10と高度の配列同一性、例えば少なくとも70％の相同性を有し、その結果、これらは典型的には、配列番号２、４、６、８又は10のポリペプチドと実質的に相同である。同様に本発明の変異体ポリペプチドは、前述のように、欠失、挿入又は置換が該ポリペプチドの活性を損なわない限りは、１個以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換によって、配列番号２、４、６、８又は10と異なることができる。本発明のポリペプチドは、本発明の組換え核酸から、本発明のポリペプチドの発現をもたらすような条件下での、適当な宿主細胞の培養によって；及び任意に、こうして産生されたポリペプチドの回収によって、産生することができる。このポリペプチドは、当該技術分野において公知のいずれか適当な方法で、回収することができる。実験細菌の増殖、DNA 単離、ハイブリダイゼーション、制限酵素による消化及びDN A 配列決定のような、標準的組換えDNA 技術は、Sambrookらの論文（分子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク、19 89年）に従った。実施例実施例I E.coliにおけるアスペルギルス・ニガーのcDNA発現ライブラリーの作製実施例I.1 mRNAの導入及び単離欧州特許出願公開第EP-A-0463706号に記載された方法で、酵母エキスを含まないもの、及びエンバクスペルトのキシランの代わりに粗コムギのアラビノキシラン分画を２％含むものについて、A.ニガーN 400 培養体を、各々69及び81時間培養し、その後ろ過により菌糸体を収集し、次に滅菌した生理食塩水で洗浄した。その後この菌糸体を、液体窒素下で凍結し、次にミクロディスメンブレーター(M icrodismembrator)（ブラウン社）を用いて粉末とした。RNA をCsCl勾配を用いて２回遠心分離した以外は、Sambrookらの論文(1989)に記載されたグアニジンチオシアネート／CsClプロトコールに従って、全RNA を、菌糸粉末から単離した。ポリA+ mRNA を、下記の点を変更したオリゴ(dT)- セルロースクロマトグラフィー(Aviv及びLeder の論文(1972)、Sambrookらの論文(1989))により、全RNA 5mg から単離した：SDS を、全ての溶液から省き、かつ試料負荷バッファーには、ジメチルスルホキシド9 容量％を添加した。実施例I.2 cDNA ライブラリーの作製ポリA+ mRNA ７μg から、cDNAを合成し、かつZAP（登録商標）-cDNA 合成キット（ストラータジーン社）を用い、製造業者の使用説明書に従って、バクテリオファージλUni-ZAP XRに結合した。該cDNAをUni-ZAP XRベクターアームに結合した後、このファージDNA を、Packagene （登録商標）抽出物（プロメガ社）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、パッケージングした。ベクターアーム 1.2 μg へのcDNA 120ngの結合、及びその後のこの反応混合物のパッケージングにより、3.5 ×10⁴の組換えファージからなる一次ライブラリーを得た。この一次ライブラリーを、E.coli XL1- Blue MRF'を用いて増幅し、滴定し、かつ４℃ で保存した。実施例I.3 ファージのファージミドへの変換 Maniatisらによって明らかにされた方法で（Maniatisらの論文(1982)、分子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、64頁）、プレーティング細菌としてE.coli B B4 を用い、直径85mmのNZYCM （1.5％寒天）プレート上で、アガロース0.7 ％を含有するNZYCM トパガロース(topagarose)中にファージを播種することによって、ファージを増殖した。一晩37℃でインキュベートした後、密集したプレートが得られ、これからファージを、SMバッファー5ml を添加することによって溶出し、かつこのプレートを、４℃で２時間、断続的に振盪し続けた。上清を収集した後、4,000 ×g、４℃で、10分間遠心分離し、溶液から細菌を除去した。その上清に、クロロホルム0.3 ％を添加し、プラーク形成単位(pfu)を測定した。このファージストックは、約10¹⁰pfu/mlを含んでいた。 A.ニガーのcDNAを有する組換えUni-ZAP XRクローンを、ストラータージーン社のcDNA合成キットに含まれた糸状菌ヘルパーファージEXASSIST（登録商標）及び E.coli SOLR 菌株で、製造業者の使用説明書に従って、重複感染し、Bluescript ファージミドに変換した。長期保存のために、約100 クローン／μl の懸濁液を含むグリセロールストックを、-80℃で保存した。実施例II E.coliにおけるアスペルギルス・アキュレアツスのcDNAの発現ライブラリーの作製アスペルギルス・アキュレアツスCBS 101.43の発現ライブラリーを、実施例I のA.ニガーのライブラリーの場合と同様の方法で作製した。A.アキュレアツスCB S 101.43は、Timberlake微量元素、酵母エキス0.1 ％及びダイズオカラ１％を含有する最少培地を用い、30℃で、40、52、64及び76時間増殖した。最少培地は、１リットルにつき、NaNO₃6g、KH₂PO₄1.5g、KCl 0.5g 及びMgSO₄0.5gを含有した。 40及び52時間の菌糸体から、全RNA 及びポリA+ RNAを、実施例I の方法で単離した。このcDNAライブラリーから、約150,000 の一次プラークを増幅した。ファージは、濃度2.2 ×10⁷pfu/ml で保存した。ファージを、実施例I の方法で、ファージミドに変換した。24のランダムクローンからプラスミドを単離した。これらは全て、大きさが0.6 〜2.0kb の間で変動する挿入断片を有した。実施例III セルラーゼ産生コロニーに関するプラスミドcDNAライブラリーのスクリーニングこのスクリーニング法は、Woodらの方法（酵素学的方法(Methods in Enzymolo gy)、160:59-74頁）を基に変更した。 20mlの 2×TY、CMC(シグマ社C-4888)0.2 ％、寒天1.5 ％及び100 μg/mlアンピシリンを含むプレートを用いた。細胞を、１プレートにつき約200 コロニーを含む5ml の上層に播種した。この上層を、50℃に保ち、かつ2×TY、0.2 ％ CMC 、0.75％寒天及び100 μg/mlアンピシリンを含んだ。プレートを、50℃に保たれた、0.5 ％アガロース、0.2 ％CMC及び100 μg/mlアンピシリンを含む5ml で覆った。プレートを乾燥し、かつ37℃で48時間インキュベートした。次に、コンゴレッド0.1 ％（アルドリッヒ社、C8,445.3）5ml を、このプレートに注いだ。１〜２時間染色した後、プレートを、5M NaCl 5ml で、0.5 〜１時間脱色した。 A.ニガーcDNAライブラリー（実施例I ）の約12,000コロニーを播種した。CMC に関するスクリーニングは、89コロニーが、コンゴレッドでの染色後にハロ(hal o)を生じることを示した。コロニーを、大、中及び小ハロの３種類に分けた。各種類から、３コロニーを増殖し、プラスミドを単離し、かつcDNAを配列決定した。いずれも、完全な長さのcDNAの複製を構成していた。これらのプラスミドを、２種のクラスに分けた。各クラスから、１個のコロニーを、CBS(バーン(Baarn) 、オランダ)に寄託した。小ハロを形成するコロニーは、1995年８月３日に寄託し、かつ寄託番号はCBS 589.95であった。大ハロを形成するコロニーは、1995年９月21日に寄託し、かつ寄託番号はCBS 662.95であった。挿入部分のDNA 配列を、これらによってコードされたアミノ酸配列と共に、それぞれ配列番号１及び３に示した。実施例IV アラビノキシラン分解活性を生じるコロニーにおけるプラスミドcDNA ライブラリーのスクリーニング実施例IV.1 エンドキシラナーゼ活性のスクリーニングこの方法は、実施例III において、セルラーゼ産生コロニーについて用いたものと同様の方法であった。下層は、2×TY、寒天1.5％及びアンピシリン100μg/m lを含む。細胞は、2×TY、エンバクスペルトキシラン（シグマ社、X-062 7）0.2 ％、寒天0.75％及びアンピシリン100 μg/mlを含む上層に播種した。最上層は、 pH7.4 の25mMリン酸バッファー中に、アガロース0.5 ％、RBB-キシラン（シグマ社、M5019）0.1 ％及びアンピシリン100 μg/mlを含んでいた。実施例I で得られたA.ニガーcDNAライブラリーから、約2000コロニーを播種した。46コロニーが、ハロを生じた。RBB-キシラン0.3 ％の最上層を伴う2 ×TYプレート上で再度スクリーニングした後には、24コロニーが、再びハロを生じた。これらを、制限酵素による消化で分析し、かつ２種のクラスに分けた。各クラスの６個のコロニーについて、一部配列決定した。両方の（クローンの）cDNA型を、1995年８月３日に、CBS に寄託し、寄託番号はCBS 590.95及びCBS591.9であった。挿入部分のDNA 配列を、これらがコードしたアミノ酸配列と共に、それぞれ配列番号５及び７に示した。実施例IV.2 エンバクスペルトのキシランのスクリーニングこのプラスミドライブラリーを、更に、エンバクスペルトのキシラン２％を含有する最少培地プレート上に播種した。37℃で２日間保った後、いくつかのコロニーがハロを生じ、これはエンドキシラナーゼの産生を示した。他のコロニーは、コロニーの周囲に沈殿環を生じた。後者のコロニーの５個について、部分的に配列決定した。これらは、その単離が係属出願である欧州特許第EP94202442.3号に開示された、アラビノキシランを分解するcDNAに類似していた。A.ニガーaxdA cDNAを含むコロニーを、1995年８月３日に、CBS に寄託し、寄託番号はCBS 592 .95であった。この挿入部分のDNA 配列を、これがコードしているアミノ酸配列と共に、配列番号９に示した。これらの実施例は、明らかにされたシステムが、原核生物における、真核生物 DNA の、迅速で、直接的かつ効果的な発現クローニングのために使用することができることを示している。 Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for determining the DNA sequence encoding a protein of interest. BACKGROUND OF THE INVENTION One of the recent major attempts in biotechnology is to discover new enzymes that perform certain functions. Enzymes have many uses in areas such as the food industry, detergents, starch conversion, animal feed, and processing aids in various industries. In addition, enzymatic conversion is a substitute for chemical conversion for various tasks, such as the synthesis of some pharmaceutical compounds. In general, enzymes are becoming increasingly popular as cost-effective, specific and environmentally friendly catalysts. Thus, finding new enzyme activities that expand the range of uses for enzymes or finding enzymes that are more suitable for particular applications is one major attempt in the enzyme industry. The search for new enzymes has traditionally been carried out by studying natural diversity. Most enzymes currently on the market are of microbial origin. Microorganisms such as bacteria, yeasts and fungi secrete enzymes with specific activities. By screening microorganisms from the ecological niches of various ecological environments, enzymes used today have been discovered. However, this screening method has several disadvantages. For example, microorganisms found in nature usually secrete the entire array of enzymes. Thus, the required enzymes represent a very small proportion of the synthesized enzymes. In addition, microorganisms synthesize compounds that are not needed, such as toxins or unwanted enzymes. To clone the gene of interest and subsequently introduce it into a suitable host, recombinant DNA technology is applied. Traditional gene cloning methods have been a tedious task, involving purification of the encoded protein (eg, an enzyme), partial amino acid sequencing, and subsequent molecular cloning of the gene of interest. After cloning, the gene of interest can be expressed in a host suitable for large-scale fermentation. In addition to this conventional enzyme cloning method, other methods have also been used. Genomic DNA from a particular organism can be identified by cloning in E. coli, followed by screening for specific activity. A number of enzymes, including cellulases and xylanases, have been identified in this way (Sashihar a N. et al., Bact. 158: 503-506 (1984); Fukumori F et al., Gene, 76 : 2 89-298 (1989); Sakka K et al., Agric. Biol. Chem., 53 : 905-910 (1989); Zappe H et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 27 : 57-63 (1987); Sakka K et al., Agric. Biol. Chem., 54 : 337-342 (1990); Srivastava R et al., FE MS Microbiol. Lett. , 78 : 201-206 (1991); Paper of Shendye A and Rao M, FEMS Microbiol. Lett., 108: 297-302 (1993)). However, this method is limited to microorganisms whose DNA is directly expressed in E. coli. Usually, genes from unrelated organisms, such as eukaryotes such as fungi and yeast, are not expressed due to invalid regulatory sequences or the presence of introns. To overcome some of these problems, cDNA has been expressed in E. coli phage, resulting in a functional protein as detected by antibody or enzymatic activity. However, the use of antibodies (see, for example, EP 0 506 190 and its co-pending application EP 94202442.3) requires that pure enzymes be available, while enzymatic activity of plaques Is very low (Karlovsky and Wolf, Methods Mol. Cell. Biol. Four: 40-45 (1993)), making it unsuitable for the immediate detection of enzyme activity. A third method is the expression of cDNA in yeast (WO 93/11249; Dalboge and Heldt-Hansen, Mol. Gen. Genet, 243: 253-260 (1994)). However, this method is not effective due to the low percentage of colonies producing the active enzyme: 2.5 × 10 ^Five ~ 5 × 10 ^Five Clones must be screened. Another disadvantage is that this method requires that the genetic material be transferred from E. coli to yeast before screening, and then transferred back from yeast to E. coli to stop this cloning operation. . In addition, the level of enzyme activity is low. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a method for identifying a DNA fragment encoding a protein of interest, comprising transforming a cDNA obtainable from a eukaryote capable of producing the protein. A cDNA library in the form of a bacterial host cell is screened for expression of the protein by testing for the presence of the protein, and the host cells are screened after the transforming DNA becomes part of the plasmid. It is characterized by the following. This cDNA library is preferably derived from a eukaryote. Said eukaryote is preferably a fungal or yeast cell, more preferably an Aspergillus species, most preferably a member of the Aspergillus niger group. The enzyme to be screened is preferably an enzyme exhibiting cellulase, endoxylanase or arabinoxylan degrading activity. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a method for identifying a DNA fragment encoding a protein of interest. This method screens a cDNA library in the form of a bacterial host cell transformed with DNA available from a eukaryote capable of producing the protein of interest for expression of the protein. Including doing. For this purpose, tests indicating the presence of the protein are used. This screening of host cells is performed after the transforming DNA has become part of the plasmid. Compared to current methods of expression cloning of eukaryotic genes in microorganisms, this method is fast, direct and very effective. Surprisingly, 10 of the current methods ^Five ~Ten ⁶ 10 not clones ^Two ~Ten ^Four Many positive clones have been identified by screening the clones. Another surprising advantage of the present method is that, in contrast to most of the current colony screening methods, the additional release of bacterial contents, including gene products that may be of interest, There is no need to introduce a lysis step. All of the methods of the invention can be performed in prokaryotic cells, without the need to transfer genetic material to eukaryotes at any point in the method. The cDNA library is prepared from eukaryotic, preferably fungal, mRNA of interest. Examples of fungi of particular interest are those of the genus Aspergillus, and more particularly Aspergillus niger. Due to recent changes in the name of Aspergillus niger, the term Aspergillus niger as defined herein is defined to include all (black) Aspergillus that can be found in the Aspergillus niger group defined by Raper and Fennell (1965). Year, The Genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp. 293-344). The mRNA used for cDNA preparation can be constitutively present or can be derived. Because the method of the invention is so efficient, the majority of the colonies will produce the protein of interest. Thus, compared to current methods, the method can also be used when dealing with proteins having low levels of mRNA. This library is made in a vector. The vector can be any vehicle suitable for transfer and / or expression of genetic material, for example, plasmid and phage vectors. When this library is prepared by a phage vector, a ZAP (registered trademark) vector or a derivative thereof is preferable, and λUni-ZAP (registered trademark) XR is more preferable. The primary library obtained in this way is amplified using a suitable host cell, preferably E. coli, more preferably E. coli XL1 Blue MRF '. The phage is then converted to a phagemid, preferably by superinfection with a filamentous fungal helper phage and an E. coli host strain such as E. coli SOLR. In this way, a double-stranded phagemid is formed. As used herein, the term "phagemid" refers to the phage genome converted to a plasmid. Before screening, all plaques are converted to phagemids, so that clones of interest with low levels of mRNA are not mistakenly rejected as negative for activity. Thus, it will be apparent to one skilled in the art that plaque phase screening is unnecessary. In the identification method of the present invention, the DNA of interest is identified by the expression of the protein it encodes, rather than through the tedious work of purifying the protein, determining the amino acid sequence, and molecular cloning the gene. Is done. One technique for expression cloning is a plate assay, in which a cDNA library is seeded onto a medium of a composition that allows for the screening of positive colonies. Screening for proteins of interest does not require purified proteins and only requires the availability of assays suitable for activity detection. This can be a standard assay, for example, where cellulase activity can be detected by using an overlay containing carboxymethylcellulose followed by staining with Congo Red and visualization. Similarly, detection of arabinoxylan-degrading enzymes can be achieved by precipitation formed on plates containing oat spelt xylan. Many suitable plate assays, including detection of amylase by the clarifying zone of starch using iodine and detection of polygalacturonase by the clarifying fraction of pectin using quaternary ammonium ions, Published in the literature. However, any suitable type of assay capable of identifying DNA by expression of the protein encoded by the DNA can be used in the methods of the invention. Alternatively, tailored assays can be developed for the detection of protein activity, for example where a suitable standard assay is not applicable. Examples of enzymes detected using the method of the present invention include amylase, arabinoxylan degrading enzyme, catalase, cellulase, galactanase, lipase, oxidase, pectinase, phosphatase, protease and xylanase. Identification of the clone of interest is possible without introducing an additional lysis step. Thus, the present invention provides a rapid, efficient and direct method for expression cloning of eukaryotic genes in prokaryotic microorganisms. Further, the present invention provides an isolated nucleic acid fragment that can be identified using the method of the present invention. The nucleic acid fragment of the present invention contains DNA or RNA, and preferably contains DNA. This nucleic acid fragment is subjected to one or more isolation steps. Such an isolation step can be performed by any suitable means known in the art. Preferred DNA fragments of the present invention have the sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9. However, the nucleic acid fragment of the present invention is not limited to these preferred fragments. Rather, the invention encompasses related nucleic acid fragments, such as encoding polypeptides having some or all of the activity of the polypeptide encoded by the DNA sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, and 9. That is, a sequence of the present invention related to the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 encodes a polypeptide having (at least) CMCase activity; a sequence of the present invention related to the DNA sequence of SEQ ID NO: 5 or 7 Encodes a polypeptide having (at least) xylanase activity; and the sequences of the present invention relative to the DNA sequence of SEQ ID NO: 9 encode polypeptides having (at least) arabinoxylan degrading activity. Accordingly, the present invention also provides variants of isolated nucleic acids, preferably fragments of DNA, having high sequence homology to the nucleic acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, or 9. Thus, they are typically substantially homologous to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, or 9. Typically, such variant fragments will have at least 80% sequence homology to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9. Similarly, such variant fragments may have one or more amino acid deletions, substitutions or insertions, as long as the deletion, substitution or insertion does not impair the activity of the encoded polypeptide. 5, 7, or 9 can be different. Thus, these encoded polypeptides retain some or all of the activity of the polypeptide of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10. The invention further provides a degradation variant of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, and 9; that is, encoding a polypeptide of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10, but having a different nucleic acid sequence Includes variants. The nucleic acid fragments of the mutants of the invention can be obtained from any microorganism, but they are preferably obtained from fungi or yeasts, more preferably from fungi of the genus Aspergillus, and most preferably A. niger var. From A. niger var. Tubergensis or A. acuretus. Nucleic acids identified using the methods of the invention can be used in the construction of recombinant nucleic acids. Typically, these are in the form of a recombinant nucleic acid vector. One of skill in the art will be able to prepare a suitable vector to be produced (in excess) in the host cell of interest. Preferred host cells include bacterial (eg, E. coli), yeast (eg, K. lactis), and fungal (eg, Aspergillus) cells. Vectors typically contain one or more origins of replication, so that they are replicated in a host cell such as a bacterial, yeast or fungal cell. Allows the body to be replicated and manipulated.) Furthermore, vectors, especially expression vectors, usually comprise at least the following elements, arranged from the 5 'end to the 3' end: a promoter that directs the expression of the nucleic acid sequence, and optionally a regulatory site, a transcription start site, Initiation codon, as well as the nucleic acid sequence of the invention. The vector also contains one or more selectable marker genes, such as one or more antibiotic resistance genes. Such a marker gene allows for the identification of transformants. Optionally, the construct may also include an enhancer for the promoter. The vector can further include a polyadenylation signal, typically at the 3 'end of the nucleic acid encoding the functional polypeptide. The vector may further include a transcription terminator at the 3 'end of the sequence encoding the polypeptide of interest. The vector may further include one or more introns or other non-coding sequences, for example, at the 3 'end of the sequence encoding the polypeptide of the invention. A typical vector has the nucleic acid sequence of the invention operably linked to a promoter capable of expressing the sequence. "Operably linked" refers to a conjugation such that the promoter and the nucleic acid sequence encoding the polypeptide or protein have a relationship such that the coding sequence can be expressed under the control of the promoter. Means part. Thus, it can be an element such as a non-coding sequence at the 5 'end between the promoter and the coding sequence. If such sequences enhance or do not impair the precise control of the coding sequence by the promoter, they can be included in the vector. The present invention further provides polypeptides encoded by the nucleic acids of the invention. These polypeptides can be partially, substantially or completely isolated and have cellulase, xylanase or arabinoxylan degrading activity, as described above. Preferred polypeptides of the invention include those whose sequence is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 or 10. However, the invention is not limited to these sequences; rather, it substantially reduces some or all of the aforementioned activities, typically the polypeptide activity of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, or 10. And all the polypeptides encoded by the nucleic acid fragments of the present invention. Thus, a variant polypeptide of the invention related to the polypeptide of SEQ ID NO: 2 or 4 has cellulase activity; a variant polypeptide related to the polypeptide of SEQ ID NO: 6 or 8 has xylanase activity And a variant polypeptide related to the polypeptide of SEQ ID NO: 10 has arabinoxylan degrading activity. In particular, the present invention provides variant polypeptides having a sequence related to SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 or 10. Typically, such variants have a high degree of sequence identity, eg, at least 70% homology, to SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, or 10, so that they typically have , SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 or 10. Similarly, the variant polypeptides of the present invention may have one or more amino acid deletions, insertions, or substitutions as set forth in SEQ ID NOs: It can be different from 2, 4, 6, 8 or 10. The polypeptide of the present invention may be obtained by culturing a suitable host cell from a recombinant nucleic acid of the present invention under conditions that result in expression of the polypeptide of the present invention; and, optionally, of the polypeptide thus produced. It can be produced by recovery. The polypeptide can be recovered by any suitable method known in the art. EXPERIMENTAL Standard recombinant DNA techniques, such as bacterial growth, DNA isolation, hybridization, digestion with restriction enzymes and DNA sequencing, are described in Sambrook et al. (Molecular Cloning, Experimental Manual, Cold Spring Harbor Press, New York). , 1989). EXAMPLES Example I Preparation of a cDNA Expression Library of Aspergillus niger in E. coli Example I.1 Introduction and Isolation of mRNA Yeast extract by the method described in EP-A-0463706. A. niger N400 cultures were cultured for 69 and 81 hours, respectively, for those containing no agar and for 2% of the arabinoxylan fraction of crude wheat in place of the xylan of oat spelled, and then the mycelium was collected by filtration And then washed with sterile saline. The mycelium was then frozen under liquid nitrogen and then powdered using a Microdismembrator (Brown). Total RNA was isolated from mycelial powder according to the guanidine thiocyanate / CsCl protocol described in Sambrook et al. (1989) except that the RNA was centrifuged twice using a CsCl gradient. Poly A + mRNA was isolated from 5 mg of total RNA by oligo (dT) -cellulose chromatography (Aviv and Leder (1972), Sambrook et al. (1989)) with the following modifications. All solutions were omitted and the sample loading buffer was supplemented with 9% dimethyl sulfoxide by volume. Example I.2 Preparation of cDNA Library cDNA was synthesized from 7 μg of poly A + mRNA, and a bacteriophage λUni was prepared according to the manufacturer's instruction using the ZAP®-cDNA synthesis kit (Stratagene). -Bound to XAP XR. After ligation of the cDNA into the Uni-ZAP XR vector arm, the phage DNA was packaged using Packagene® extract (Promega) according to the manufacturer's instructions. Binding of 120 ng of cDNA to 1.2 μg of vector arm and subsequent packaging of this reaction mixture resulted in 3.5 × 10 ^Four A primary library consisting of the recombinant phages was obtained. This primary library was amplified using E. coli XL1-Blue MRF ', titrated and stored at 4 ° C. Example I.3 Conversion of phage to phagemid In a manner described by Maniatis et al. (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Experimental Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, p. 64). Phage was propagated by plating E. coli B B4 as a plating bacterium on 85 mm diameter NZYCM (1.5% agar) plates in NZYCM topagarose containing 0.7% agarose. . After overnight incubation at 37 ° C., a confluent plate was obtained, from which the phages were eluted by adding 5 ml of SM buffer and the plate was kept shaking intermittently at 4 ° C. for 2 hours. After collecting the supernatant, the solution was centrifuged at 4,000 × g and 4 ° C. for 10 minutes to remove bacteria from the solution. Chloroform 0.3% was added to the supernatant, and plaque forming units (pfu) were measured. This phage stock contains approximately 10 ^Ten It contained pfu / ml. Recombinant Uni-ZAP XR clones with A. niger cDNA were used to isolate the filamentous fungal helper phage EXASSIST® and E. coli SOLR strains contained in the Stratagene cDNA synthesis kit and used by the manufacturer. Co-infected and converted to Bluescript phagemid as described. Glycerol stocks containing approximately 100 clones / μl of suspension were stored at −80 ° C. for long-term storage. Example II Preparation of an Expression Library of Aspergillus aculeatus cDNA in E. coli An expression library of Aspergillus acureatos CBS 101.43 was prepared in the same manner as in the case of the library of A. niger in Example I. A. acuretus CBS 101.43 was grown for 40, 52, 64 and 76 hours at 30 ° C. in a minimal medium containing trace elements of Timberlake, 0.1% of yeast extract and 1% of soybean okara. The minimum medium is NaNO per liter. _Three 6g, KH _Two PO _Four 1.5g, KCl 0.5g and MgSO _Four 0.5g was contained. Total RNA and polyA + RNA were isolated from the mycelium at 40 and 52 hours by the method of Example I. Approximately 150,000 primary plaques were amplified from this cDNA library. Phage was at a concentration of 2.2 x 10 ⁷ Stored at pfu / ml. Phage was converted to phagemid as described in Example I. Plasmids were isolated from 24 random clones. These all had inserts varying in size between 0.6 and 2.0 kb. Example III Screening of a Plasmid cDNA Library for Cellulase-Producing Colonies This screening method was performed according to the method of Wood et al. (Methods in Enzymology, 160: 59-74). A plate containing 20 ml of 2 × TY, 0.2% of CMC (Sigma C-4888), 1.5% of agar, and 100 μg / ml ampicillin was used. Cells were seeded in a 5 ml top layer containing approximately 200 colonies per plate. The upper layer was kept at 50 ° C. and contained 2 × TY, 0.2% CMC, 0.75% agar and 100 μg / ml ampicillin. Plates were covered with 5 ml containing 0.5% agarose, 0.2% CMC and 100 μg / ml ampicillin kept at 50 ° C. Plates were dried and incubated at 37 ° C. for 48 hours. Next, 5 ml of Congo Red 0.1% (Aldrich, C8,445.3) was poured into the plate. After staining for 1-2 hours, the plates were destained with 5 ml of 5M NaCl for 0.5-1 hour. About 12,000 colonies of the A. niger cDNA library (Example I) were inoculated. Screening for CMC showed that 89 colonies developed halo after staining with Congo red. Colonies were divided into three types: large, medium and small halo. From each species, three colonies were grown, the plasmid was isolated, and the cDNA was sequenced. All constituted full-length cDNA replication. These plasmids were divided into two classes. One colony from each class was deposited with CBS (Baarn, The Netherlands). A colony forming a small halo was deposited on August 3, 1995, and had a deposit number of CBS 589.95. The colony forming the large halo was deposited on September 21, 1995, and had a deposit number of CBS 662.95. The DNA sequence of the insert, along with the amino acid sequence encoded by them, are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively. Example IV Screening of Plasmid cDNA Library in Colonies Producing Arabinoxylan Degrading Activity Example IV.1 Screening for Endoxylanase Activity This method was similar to that used in Example III for cellulase producing colonies. The lower layer contains 2 × TY, 1.5% agar and 100 μg / ml ampicillin. Cells were seeded on the upper layer containing 2 × TY, 0.2% oat spell toxan (Sigma, X-0627), 0.75% agar and 100 μg / ml ampicillin. The top layer contained 0.5% agarose, 0.1% RBB-xylan (Sigma, M5019) and 100 μg / ml ampicillin in 25 mM phosphate buffer, pH 7.4. From the A. niger cDNA library obtained in Example I, about 2000 colonies were inoculated. Forty-six colonies developed halos. After rescreening on a 2 × TY plate with a 0.3% top layer of RBB-xylan, 24 colonies regenerated halo. These were analyzed by restriction enzyme digestion and divided into two classes. Six colonies of each class were partially sequenced. Both cDNA types (of the clones) were deposited with the CBS on August 3, 1995, with the deposit numbers CBS 590.95 and CBS 591.9. The DNA sequence of the insert, together with the amino acid sequence encoded by them, is shown in SEQ ID NOs: 5 and 7, respectively. Example IV.2 Screening for oat spelled xylan The plasmid library was further seeded on minimal medium plates containing 2% oat spelled xylan. After holding at 37 ° C. for 2 days, some colonies developed halos, indicating endoxylanase production. Other colonies formed a precipitate ring around the colony. Five of the latter colonies were partially sequenced. These were similar to the arabinoxylan-degrading cDNA disclosed in European Patent No. EP 94202442.3, the isolation of which is pending. A colony containing the A. niger axdA cDNA was deposited with the CBS on August 3, 1995, under the deposit number CBS 592.95. The DNA sequence of this insert, together with the amino acid sequence it encodes, is shown in SEQ ID NO: 9. These examples show that the disclosed system can be used for rapid, direct and efficient expression cloning of eukaryotic DNA in prokaryotes.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 9/42 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デグラーフレーンデルトヘンドリックオランダエヌエル−6862セーカーオーステルベークコルネリスコーニングストラート８ (72)発明者ヴィーゼルヤコブオランダエヌエル−6703セーカーワーヘニンヘンヒンケロールドセウェーグ５ (72)発明者ファンオーイェンアルベルトヨハネスヨゼフオランダエヌエル−2275イックスイックスフォールブルフオーヴェルブルフカーデ 78──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI C12N 9/42 C12N 9/42 // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:66) (C12N 1/21 C12R 1:19) ( 81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ) , MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL , PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN. O Steerbeek Cornelis Cornings Trat 8 (72) Inventor Wiesel Jakob Enuel-6703 Netherlands Saker Wa Henningen Hinkelold de Seweg 5 (72) Inventor Juan Aujen Albert-Johannes-Joseph Netherlands Ener-2275 Ixquix Svoorburg Owerburgka Mode 78

Claims

[Claims] 1. A method for identifying a DNA fragment that encodes a protein of interest. Thus, with respect to expression of the protein, a test that can indicate the presence of the protein Using DNA obtained from a eukaryote capable of producing the protein. Screening a cDNA library in the form of transformed bacterial host cells. This screening was performed after the transforming DNA became part of the plasmid. The way it is done. 2. 2. The method of claim 1, wherein said eukaryote is a fungus or a yeast cell. 3. The fungus is of the genus Aspergillus, preferably A. niger. the method of. 4. The protein is an enzyme, preferably a cellulase activity, an arabinoxylan component. The enzyme according to any one of claims 1 to 3, which is an enzyme having decomposing activity or xylanase activity. The method described in the section. 5. An isolated nucleic acid fragment encoding a polypeptide having cellulase activity The sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 or the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 A fragment comprising a sequence that has at least 90% sequence identity with the isolated sequence. 6. An isolated nucleic acid encoding a polypeptide having xylanase activity A fragment of the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 7, or A fragment comprising a sequence having at least 90% sequence identity with the indicated sequence. 7. An isolated polypeptide encoding a polypeptide having arabinoxylan degrading activity A nucleic acid fragment comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 9 or the sequence shown in SEQ ID NO: 9 Fragment comprising a sequence that has at least 90% sequence identity with the isolated sequence. 8. Cellulase which differs by substitution, deletion or deletion of one or more amino acids, and A variant of the fragment according to claim 5, which encodes a polypeptide having activity. Isolated nucleic acid fragments. 9. Xylana which differs by substitution, deletion or deletion of one or more amino acids, and 7. A variant of the fragment according to claim 6, which encodes a polypeptide having a zeolytic activity. An isolated nucleic acid fragment. 10. Substitution, deletion or deletion of one or more amino acids, and The fragment according to claim 7, which encodes a polypeptide having silanolytic activity. An isolated nucleic acid fragment that is a mutant. 11． A recombinant nucleic acid comprising the nucleic acid fragment according to any one of claims 5 to 10. 12． 11. The nucleic acid of any one of claims 5 to 10, in substantially pure form, or Depends on deletion, substitution or insertion of one or more amino acids, but is still substantially the same A polypeptide encoded by a variant thereof having activity. 13. A nucleic acid fragment identified by the method according to any one of claims 1 to 4, Is a fragment according to any one of claims 8 to 10, or a recombinant nucleic acid according to claim 11. Harbor, recombinant host cells. 14. A condition under which the host cell of claim 13 results in expression of said polypeptide. Culturing at the same time, and recovering the polypeptide, Production method.