JPH10510421A

JPH10510421A - Genetic basis of factor XIII activity

Info

Publication number: JPH10510421A
Application number: JP8517415A
Authority: JP
Inventors: フレッドマークハム，アレクサンダー
Original assignee: University of Leeds
Current assignee: University of Leeds
Priority date: 1994-12-08
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 1998-10-13
Also published as: WO1996017953A2; EP0796342A2; GB9424823D0; WO1996017953A3

Abstract

(57)【要約】本発明は第XIII因子活性を診断する方法に関する。より詳細には、本発明は、第XIII因子遺伝子内の変化を同定し、これらの変化を第XIII因子活性の増大または減少のいずれかとともに分離することがわかっている変化と相関させる、遺伝的基礎方法に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to a method for diagnosing factor XIII activity. More specifically, the present invention identifies genetic changes in the factor XIII gene and correlates these changes with changes known to segregate with either an increase or decrease in factor XIII activity. Regarding the basic method.

Description

【発明の詳細な説明】第XIII因子活性の遺伝的基礎本出願における単一発明概念は、第XIII因子活性の遺伝的理解に関し、その理解を応用すれば、１つの局面において、第XIII因子活性が低いか、または遺伝的に低いと予測される場合に、出血（haemorrhage）または流産（この場合、代表的には第XIII因子レベルが通常下がる）から保護するための方法および製品を提供し得；そして別の局面において、第XIII因子活性が高いか、または遺伝的に高いと予測される場合に、血液クロット形成から保護するための方法および製品を提供し得る。多くの因子が、血液凝固に関連する酵素増幅カスケード反応に関与することがよく確立されている。このカスケードの１つの因子は、血漿中に（プロ酵素として）、血小板および単球中に見出される第XIII因子である。これは、正常な止血には必須である。血漿第XIII因子は、２つの触媒的「ａ」サブユニットおよびそれに非共有結合した２つの非触媒的「ｂ」サブユニットからなる四量体として循環する。トロンビンおよびカルシウムの存在下では、この「ａ」および「ｂ」サブユニットが解離し、そして第XIII因子aが37個のＮ末端アミノ酸の除去によって活性型に変換される。第XIII因子aの活性型は、フィブリンのαサブユニットとγサブユニットとの間に分子間共有結合を導入することによってフィブリン単量体を架橋し、それにより架橋されたフィブリンの抗張力を増大させる、トランスグルタミナーゼである。活性化第XIII因子はまた、α2-プラスミン、フィブロネクチン、およびコラーゲンを架橋する。従って、これは、プラスミンによる分解に対して増大した耐性を有する機械的強度の高いクロットを産生し得る。第XIII因子遺伝子は、第６染色体のバンドp24-p25に位置決定されている。その遺伝子構造は160Kbを超えて広がり、そして14個のイントロンにより隔てられた15個のエキソンを含有することが見出される。ヒト胎盤ライブラリーから単離された第XIII因子cDNAは3,902塩基からなり、そのうちの2,196塩基が732アミノ酸のコード配列であり、5'側の81塩基および3'側の1,625塩基は非翻訳領域である。第XIII因子のαおよびβサブユニットをコードする遺伝子座の多型は驚くほど一般的である。この事実にも関わらず、第XIII因子欠損症は極めてまれな疾患である。実際、第XIII因子の先天性欠損症は、2×10⁶分の1の頻度で起こるまれな常染色体劣性疾患である。この情報は、この遺伝子座が多型であるにもかかわらず、多型の大部分は良性であることを暗示する傾向がある。しかし、この疾患と連鎖する多型は、第XIII因子活性の欠如および「ａ」サブユニットの完全な欠如により特徴付けられるが、しかし「ｂ」サブユニットの欠損も記載されている。この疾患の症状は、長期の出血（bleeding）、不完全な創傷治癒、および流産の危険性が高いことである。第XIII因子欠損症の診断は、異常な凝固時間の立証に依存する日常的な凝固試験が典型的には正常限界内に収まるので、困難である。実際、第XIII因子欠損症におけるクロッティングは正常であり、欠陥を有するのはそのクロットの質である。従って、この疾患の診断には、クロットの質を測定する手段が必要だということになる。第XIII因子欠損症では、血漿クロットは単にイオン結合のみで結合したフィブリンのポリマーに過ぎず、その結合は１％モノクロロ酢酸または5M尿素によって分散させ得る。第XIII因子によって架橋されたクロットは、これらの試薬には溶解しない。従って、これらの試薬中で溶解性が見出されるならば、第XIII因子活性が損なわれているか、または存在し得ないことになる。典型的には、この従来の診断を、第XIII因子のトランスグルタミナーゼ作用を評価するダンシルカダベリン-カゼインアッセイのような定量的酵素アッセイによって確認する。しかし、トランスグルタミナーゼ活性の定量的分析を、日常的な基礎に基づいて行なうことは困難である。なぜなら、血漿中に存在する第XIII因子が少量であり、その少量が酵素増幅カスケード機構の最初の部分を形成するからである。さらに、血漿内の第XIII因子レベルは、個体の生理状態に応じて変化する。例えば、総血液量は、定量的アッセイに顕著な影響を与え、そしてその総血液量は、環境条件および液体摂取/尿生産の比の結果として個体の相対的な水分補給/脱水状態によって決定される。従って、血漿中の第XIII因子レベルの信頼性のある決定は、提供することが困難である。しかし、母集団全体では、第XIII因子活性のレベルは正規分布することがわかっている。このことは、母集団内のいくつかの個体が平均量より低い第XIII因子活性を有し、そして逆に母集団内のいくつかの個体が平均量より高い第XIII因子活性を有することを暗示する。本発明が関係するのは、母集団のうちこれら２つのカテゴリー、とりわけこれら２つのカテゴリーの極限であるが、しかしこれらに限定されない。より詳細には、平均量より低い第XIII因子活性を有するカテゴリーに関して言えば、本発明は、平均量より低い第XIII因子活性を有するがしかし従来は第XIII 因子欠損症と診断されなかった個体に関係する。この段階では、従来、第XIII因子欠損症と診断される個体は予防的に処置され得、このような個体として出血（bleeding）から保護し、一般的に生活の質を改善する目的で、第XIII因子の注入を定期的に受けることに留意することが重要である。さらに、従来、第XIII因子欠損症と診断される女性は、妊娠を出産予定日まで維持することができず、それゆえ、予防的処置を受けるか否かにかかわらず、このような個体は妊娠の間中、より頻繁に大用量の第XIII因子注入が提供されることに留意することもまた重要である。本発明者らは、まれな常染色体第XIII因子欠損症を患う個体の第XIII因子遺伝子を研究し、そして本発明者らは第XIII因子欠損症の原因となる多くの変異を同定した。第XIII因子欠損症は常染色体劣性なので、各対立遺伝子に原因となる変異または多型を有する個体だけがこの疾患を示す。従って、本発明者らは、原因となる変異のデータバンクの収集を始めた。しかし、母集団内の第XIII因子活性は正規分布することがわかっているので、本発明者らは、例えば平均量より低い第XIII因子活性を有する個体は片親のみから原因となる変異を受け継いだのかもしれないと考えた。従って、そのような個体は、正常な第XIII因子遺伝子（または少なくとも原因でない多型）および原因となる多型の両方に関してヘテロ接合である。そこで本発明者らは、第XIII因子遺伝子の変化が母集団内の第XIII因子活性の正規分布の原因であると推測する。本発明者らはまた、１つの対立遺伝子において原因となる多型の遺伝が、母集団の平均未満に第XIII因子活性のレベルを減少させると推測する。これは、この疾患についての原因となる変異を１つ受け継いだ個体は、平均より低い第XIII因子活性を有するが従来は第XIII因子欠損症と診断されなかった第１のカテゴリーに分類されることを意味する。従ってこのカテゴリーの個体は、出血（haemorrhage）および女性の場合は、第XIII因子レベルの低下が当然予測される状態における流産に対して無防備である。このような状態は、第XIII因子レベルが低下することがよく知られている妊娠初期に見出される。以前にこれらの用語について説明しなかったが、本発明者らは、ある女性達における再発性の自然流産が第XIII因子欠損症に直接関連していて、それゆえにこの女性達は、従来は第XIII因子欠損症と診断されなかったが、彼女達は１つの対立遺伝子上に原因となる変異を保持していると考える。従って、この女性集団の同定および定期的な第XIII因子注入での彼女達の処置が、彼女達を再発性の自然流産から保護することになる。従って本発明の目的は、従来は第XIII因子欠損症と診断されなかった母集団（理想的には女性集団）のどの構成員が平均レベルより低い第XIII因子活性を有するかを診断する手段を提供することである。本発明の目的は、従来、第XIII因子欠損症と診断されない個体および/または女性を、出血（haemorrhage）および/または妊娠中の女性の流産から保護する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、従来、第XIII因子欠損症と診断されなかった個体および/または女性における出血（haemorrhage）および/または妊娠中の女性の流産を防止するための製品（この製品は第XIII因子である）の使用を提供することある。本発明者らの調査およびそれに続く多くの第XIII因子欠損症の原因となる変異の同定はまた、本発明者らに、第２のカテゴリー、すなわち平均量より高い第XI II因子活性を有する個体が、第XIII因子遺伝子に全く多型を示し得ないか、または原因となる多型を全く示し得ないか、あるいは高レベルな第XIII因子活性と典型的に関連する変異または多型を少なくとも１つは示し得るという推測を導いた。このような個体はクロットを産生する傾向が増大しており、それゆえ冠状動脈閉塞の危険性が高い。従って、第XIII因子遺伝子の一方または両方の対立遺伝子における多型の欠如の同定、あるいは一方または両方の対立遺伝子に良性の多型が存在することの同定、あるいは原因となる多型の欠如の同定、あるいは増大した第XIII因子活性とともに分離すると考えられる変異または多型の一方または両方の対立遺伝子における同定は、ある個体が冠状/動脈閉塞または実際に他のクロットに由来し生命をおびやかす病的状態（例えば、肺塞栓症または深静脈血栓症）を患う見込みを予測するための診断道具として使用され得る。そして、そのようにおびやかされていると疑われる個体を、ヘパリンまたはワルファリンのような抗凝固剤を用いて予防的に処置することにより、このようなクロットに由来する病的状態から保護し得る。従って、本発明のさらなる目的は、母集団のどの構成員が平均レベルより高い第XIII因子活性を有するかを診断する手段を提供することである。本発明の目的はまた、血液クロットを産生する傾向から保護し、それによりクロットに由来する病的状態から保護する方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、平均レベルより高い第XIII因子活性を有すると診断される個体をクロット産生から保護するための製品（この製品は抗凝固剤である）の使用を提供することである。従って、本発明は、その最も広い局面において、母集団内の個体の出血（blee ding）、出血（hemorrhage）、流産またはクロット形成に対する傾向を予測する目的で該個体の第XIII因子活性のレベルを診断する方法に関する。本出願に記載される遺伝的データはこの診断を容易にし、そして一旦診断が完了すれば、決定した第XIII因子活性レベルの予想される影響から保護するために、予防的処置が決定され得る。従って、本発明は、第XIII因子活性が遺伝的に決定され、それゆえ過少または過剰な活性の結果を予測し、それを予防的に処置し得るという理解にある。本発明の第１の局面によれば、従って、ある特定の個体の第XIII因子活性のレベルを診断する方法が提供され、この方法は、以下の工程：ａ）ある特定の個体から細胞の試料を採取すること、ｂ）その個体に由来する第XIII因子遺伝子の両対立遺伝子の遺伝子配列構造を決定すること、ｃ）決定したその配列構造を、第XIII因子遺伝子の公知の配列構造と比較すること、ｄ）なんらかの相違を同定すること、ｅ）これらの相違を、第XIII因子活性の減少または第XIII因子活性の増強のいずれかとともに分離することがわかっている相違と比較すること、ｆ）以下のように結論すること： i）少なくとも１つの相違が同定され、その相違が典型的に第XIII因子活性の減少とともに分離する例では、この個体が、第XIII因子レベルの減少が通常予想される状態の下で第XIII因子欠損症の症状を患いそうだと診断する、 ii）少なくとも１つの相違が同定され、その相違が典型的に第XIII因子活性の増大とともに分離する例でば、この個体が、クロットに由来する病的状態を患いそうだと診断する、 iii）いずれの対立遺伝子にも相違が認められず、そしていずれの対立遺伝子にも相違がないことが、増大した第XIII因子活性レベルをもたらすことが示されている例では、この個体を、クロットに由来する病的状態を患いそうだと診断する、 iv）いずれの対立遺伝子にも相違が認められず、そしていずれの対立遺伝子にも相違がないことが減少した第XIII因子活性レベルをもたらすことが示されている例では、この個体を、第XIII因子レベルの減少が通常予想される状態の下で第 XIII因子欠損症の症状を患いそうだと診断する、 v）増大した第XIII因子活性レベルに関連する相違が同定され、そして減少した第XIII因子活性に関連する相違が同定される例では、この相違のそれぞれの相対的優勢に従って、その個体を診断する、を含む。本発明の好ましい実施態様では、診断は、表３に詳述する相違と上記ｄ）で同定する相違の比較に関する。表３に記載の相違はホモ接合体状態または複合ヘテロ接合体状態で第XIII因子欠損症の原因であることがわかっている。疑念を残さぬように述べるが、上記ｃ）でいう「第XIII因子遺伝子の公知の配列構造」とは多型を一切含まない配列構造である。本発明のさらなる局面によれば、出血（bleeding）および/または出血（haemo rrhage）および/または女性の流産を防止する方法が提供される。この方法は、第XIII因子レベルの減少が通常予想される状態の下で第XIII因子欠損症の症状を患いそうだと診断された個体および/または上記女性に、定期的に第XIII因子注入を提供することを含む。本発明のさらなる局面によれば、従来は第XIII因子欠損症と診断されなかった個体および/または上記女性用の、出血（bleeding）および/または出血（haemor rhage）および/または女性の流産を防止するための医薬品の製造における第XIII 因子の使用が提供される。理想的には、上記女性は、第XIII因子活性のレベルがその母集団の平均を下回っている女性の部分母集団の一部を構成する。第XIII因子が合併症を引き起こしたり、アレルギー反応を引き起こしたり、疾患の伝達をもたらすことは知られていないという事実を考慮すると、妊娠していて、それゆえに第XIII因子レベルの減少にさらされているすべての女性に第XIII 因子を投与することは、商業的に好ましくあり得る。つまり本発明は、その最も広範な概念において、従来は第XIII因子欠損症と診断されなかった女性を、少なくとも妊娠初期の間（第XIII因子のレベルが低いことが知られている）は、第XI II因子で処置することに関する。本発明のさらなる局面によれば、平均レベルより高い第XIII因子活性を有すると遺伝子診断された個体におけるクロットに由来する病的状態を防止する方法が提供される。この方法は、上記個体に抗凝固剤を投与することを含む。本発明のさらなる局面によれば、平均量より高い第XIII因子活性を有すると遺伝子診断された個体のクロットに由来する病的状態を防止するための医薬品の製造における抗凝固剤の使用が提供される。本発明の診断法では、試験すべき個体から末梢血液試料を採取することが好ましい。本発明のなおさらなる局面によれば、第XIII因子活性の増大および/または第X III因子活性の減少に関係する変異を受ける第XIII因子遺伝子の領域に相補的なプライマーが提供される。好ましくは、上記変異の少なくとも一つはプライマーの3'末端に位置する。本発明のなおさらなる局面によれば、ある特定の個体の第XIII因子活性を診断するさらなる方法が提供される。この方法は以下を含む：ａ）ある特定の個体から細胞の試料を採取すること、ｂ）上記の本発明のプライマーの少なくとも１つが上記個体の第XIII因子遺伝子の少なくとも１対立遺伝子または両対立遺伝子に結合するかどうかを決定し、この方法で、上記個体の第XIII因子遺伝子の対立遺伝子に、第XIII因子遺伝子の既知の配列構造と比較して何らかの相違があるかどうかを同定すること、ｃ）次のように結論すること： i）少なくとも１つの相違が同定され、その相違が典型的に第XIII因子活性の減少とともに分離する例では、上記個体を、第XIII因子レベルの減少が通常予想される状態の下で第XIII因子欠損症の症状を患いそうだと診断する、 ii）少なくとも１つの相違が同定され、その相違が典型的に第XIII因子活性の増大とともに分離する例では、該個体を、クロットに由来する病的状態を患いそうだと診断する、 iii）いずれの対立遺伝子にも相違が認められず、いずれの対立遺伝子にも相違がないことが第XIII因子活性レベルの増大をもたらすことが明らかになっている例では、上記個体を、クロットに由来する病的状態を患いそうだと診断する、 iv）いずれの対立遺伝子にも相違が認められず、いずれの対立遺伝子にも相違がないことが第XIII因子活性レベルの減少をもたらすことが明らかになっている例では、その個体を、第XIII因子レベルの減少が通常予想される状態の下で第XI II因子欠損症の症状を患いそうだと診断する、 v）第XIII因子活性の増大に関連する相違が同定され、第XIII因子活性の減少に関連する相違が同定される例では、その相違のそれぞれの相対的優勢にしたがってその個体を診断する。理想的には、試験すべき個体の（各親に由来する）第XIII因子遺伝子の遺伝子配列構造をPCR技術を用いて決定する。例えば、理想的には、試験すべき個体のゲノムDNAをまずPCRで増幅する。より具体的に述べると、第XIII因子「ａ」サブユニットのエキソン1〜15をPCRプライマーを用いて個別に増幅する。表１に記載のプライマーを用いるか、もしくは表１に記載のプライマーに実質的に類似するプライマーであって、該プライマーのエキソン（各プライマーが対応するエキソン）増幅能に影響を与えない改変、付加、または欠失を有するものを用いて、エキソン1〜15を増幅することが好ましい。より具体的に述べると、試験すべき個体の第XIII因子遺伝子の遺伝子配列構造を決定する診断法には、上記遺伝子に関係するcDNAの準備が含まれる。さらに好ましくは、診断法には、上記cDNAの（理想的にはPCR法による）増幅がさらに含まれる。なおさらに好ましい診断法では、１つの対立遺伝子に欠失または挿入を保持する被験体から調製したPCR産物を、配列決定に先立って、pMOSBlue Ｔベクターなどのベクターにサブクローン化する。なおさらに好ましい診断法では、第XIII因子「ａ」遺伝子のcDNAの全コード領域を、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤと称する４つのオーバーラップするセグメントに分割し、各セグメントを（理想的にはPCRによって、それゆえ好ましくは表２に記載のオリゴヌクレオチドを用いるか、もしくはそれらに実質的に類似するオリゴヌクレオチドであって、そのオリゴヌクレオチドの機能的活性に影響を与えない改変、付加、または欠失を有するものを用いて）増幅することによって、第XIII 因子「ａ」遺伝子のcDNAを調べる。現在までに、「ａ」サブユニット欠損症の原因であり得る３つの変異が記述されている。１つの配列変化はスプライス欠失アクセプター部位における２塩基欠失である。この欠失は第XIII因子プレmRNAのスプライシングには著しい影響を与えないが、初期翻訳終結をもたらす翻訳フレームシフトを創出する。第２の変異は、スプライスドナー部位におけるＧからＡへの置換である。このスプライス部位変異がどのようにして第XIII因子欠損症を引き起こし得るのかという分子機構は決定されていない。第３の変異は、アルギニンコドン内のヌクレオチド598がＣからＴへのトランジションによって終止コドンTGAが生じるナンセンス変異である。本発明者らは、無関係な５家族出身の患者らにさらに８つの変異を同定した。見出された配列変化には、スプライシングのエラー、欠失/挿入事象、ナンセンス変異、ミスセンスおよびサイレント変異によるmRNA異常が含まれる。これらの変異を表３に記載する。本発明に関係するデータをどのように得たかを説明する方法をここに提供する。しかし、現在までに入手したデータは網羅的ではなく、むしろこの方法は、どのように第XIII因子活性に関係するデータバンクを提供する目的で本発明に関係するデータをさらに集め得るかを例示するものであることに留意することが重要である。以下の方法の項では、第XIII因子欠損症を患っていると診断された個体からどのようにしてデータを得たかを説明する。類似の技術を用いると、第XIII 因子活性および臨床状態の発生に関するデータを提供する目的で、冠状動脈閉塞やクロットに由来する疾患状態を患っている個体、または母集団の任意の構成員からデータを得ることができる。したがって、本発明に関するデータの収集は現在進行中であり、実際に今後何年も続けられ得ることは明らかである。したがって本発明の概念は、データの収集に限定されるのではなく、むしろ、第XIII因子遺伝子を用いて第XIII因子活性を予測し得るという理解、およびこの活性に関する知識を用いることによって、ある特定の個体の臨床的応答を所定の状態（例えば、妊娠初期における第XIII因子レベルの減少）、あるいはその特定の個体がクロットに由来する疾患状態を患う傾向のいずれかに対して決定し得るという理解に関するということになる。以下の方法において、表１は第XIII因子遺伝子の「ａ」サブユニットのエキソン1〜15を増幅するのに適したプライマーを示す。表２は第XIII因子遺伝子のcDNAの指定された領域を増幅するのに使用するプライマーを示す。表３は第XIII因子欠損症に関与する原因となる変異の要約である。表４は第XIII因子活性の増大および減少に関連する多型または変異を表す。患者Ｎは指定したコドンの正常な遺伝子型を表す。患者A1（女性）およびA2（男性）は重度の末梢血管疾患を有する。患者B1およびB2は３回を超える再発性流産を経験した女性である。図１はFXIIIaサブユニットに関する欠損症の原因となる変異を表す。図1aは正方向プライマーで配列決定したPG家族001エキソン３を表す。図1bは正方向プライマーで配列決定したSO家族005エキソン14を表す。図1cは正方向プライマーで配列決定したDS家族003エキソン11を表す。図1dは正方向プライマーで配列決定したDS家族003エキソン３を表す。図1eは正方向プライマーで配列決定したPC家族002エキソン10を表す。図1fは正方向プライマーで配列決定したDT家族004エキソン３を表す。図２はエキソンをスキップする事象を表す。図2ai レーン１ OX174マーカー（HaeIII切断）レーン２正常レーン３患者PG家族001 レーン４患者DT家族004 RT-PCRフラグメントA（表２から組み合わせたオリゴA1とA2で増幅）。図2bi レーン１ OX174マーカー（HaeIII切断）レーン２正常レーン３患者SO家族005 RT-PCRフラグメントD（表２のオリゴD1とD2で増幅）。図2aii 正方向プライマーA1（表２）で配列決定した正常対変異体のRT-PCRフラグメントAの配列。図2bii 逆方向プライマー（表２のD2）で配列決定した正常対変異体のRT-PCR フラグメントDの配列。図３はコドン34に関する配列データを示す。図４はコドン564に関する配列データを示す。図５はコドン651に関する配列データを示す。材料および方法被験体：ゲノムDNAと全RNAの単離：ヘパリンナトリウムを抗凝固剤として使用し、30mlの末梢血を被験体から採取した。標準的な手法を使用してゲノムDNAを抽出した。リンホプレップ(lymphoprep；Nycoma Pharma AS)を用い、製造者に指示に従って、全血から末梢血単核細胞(PBMC)を分離した。ChomczynskiおよびSacchi(1)に記載の酸グアニジニウムチオシアネート-フェノール法を用いてPBMCから全RNAを単離した。ゲノムDNAのPCR増幅：FXIIIaサブユニットエキソン1〜15を、50ngのゲノムDNA、 20μMのdNTP、１μMの各プライマー、1.0単位のTaq DNAポリメラーゼ(Promega) および反応緩衝液(Promega)を含む100μlの混合物中で、35サイクルのPCRによって個別に増幅した。各サイクルは、92℃で１分間の変性、58℃で１分間のアニーリング(42℃で１分間アニールさせたエキソン５およびエキソン13アンプリマーを除く)、および72℃で２分間の伸長からなった。72℃で５分間の最後の伸長工程の後、５μlのPCR産物を、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって分析した。 cDNAの合成とcDNAのPCR増幅(RT-PCR)：ランダムヘキサマー(Boehringer Mannhei m)およびモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素(Promega)を用いて、標準的な状態の下で、１μgの全RNAから第一鎖cDNAを作成した。10ngの逆転写RNAをPCR により前記のように増幅した。 PCR産物の配列分析：Wizard DNAクリーンアップカラム(Promega)を用いて、製造者の指示に従って、PCR産物を脱塩し、そして取り込まれなかったヌクレオチドから精製した。次に、25〜50fmolのDNAをPromega fmol cycle sequencingキットとγ³³P-末端標識アンプリマーを用いる直接サイクル配列決定のためのテンプレートとして使用した。その配列決定に先立って、１つの対立遺伝子に欠失または挿入を有する被験体から作成したPCR産物を、pMOSBlue Ｔベクターキット(Amers ham)を用いてサブクローン化した。結果無関係な５家族のそれぞれの発端者(proband)について、第XIII因子a遺伝子の 15エキソンすべてを、表１に記載のプライマーを用いて増幅した。各個体の各エキソンから得たPCR産物は、予想通りのサイズを有することを見出した(データは示さず)。このことは、これらの患者の第XIII因子a遺伝子のエキソン領域内には大きな挿入または欠失がないことを示した。FXIIIa cDNAをすべての患者について調べた。全コード領域をＡ、Ｂ、ＣおよびＤと呼ぶ４つのオーバーラップするセグメントに分割し、表２に示すオリゴヌクレオチドを用いるRT-PCRによって各フラグメントを増幅した。フラグメントＡ、Ｂ、ＣおよびＤに関するRT-PCR産物は、家族001の発端者PGのフラグメントＡと家族005の発端者SOのフラグメントＤを除いて、いずれの患者についても予想通りのサイズであった。これらについては下記のmRNA異常に関する項で詳述する。ゲノムDNAおよびcDNAから得たPCR産物を各アンプリマーを用いて直接的に配列決定した。そして、すべての発端者に検出された配列変化を表３に要約する。著しいmRNA異常３家族は、スプライス部位に影響する変異を有することが立証され、各家族の発端者はその配列変化に関してホモ接合であった。家族001の発端者PGのゲノムD NAに由来する増幅したエキソン３の配列分析によって、ドナースプライス部位においてそのエキソンの最後の位置に変異が存在し、正常な配列ATTG/gtgaがATTT/ gtgaに変化していることを見出した(図1a)。この患者のcDNAから増幅したRT-PCR フラグメントＡ(エキソン２からエキソン５にわたる(表２))は、予想される分子サイズより約200bp短いことがわかった(図2ai)。このRT-PCR産物の直接配列分析によって、成熟FXIIIa mRNAの215位と403位との間の189bpが失われていることが明らかになった(図2aii)。これは、エキソン３を含むエキソンをスキップする事象(エキソン２と４の完全なスプライシングを伴う)に相当する。さらに、フラグメントＡのエキソン３領域内に位置する単一のSau3A制限部位(GATC)が、Sau3AによるフラグメントＡの消化時に失われたことが示された(データは示さず)。エキソン３に相補的なプライマーを用いるさらなるRT-PCRが、エキソン３に由来する配列を含む転写物のかすかな検出を可能にした(結果は示さず)場合であっても、このRT-PCR結果から、この個体中で生成したFXIIIa mRNAの95％以上がエキソン３配列を欠くと仮定し得る。これはまた、この変異に関する患者PGのホモ接合性を確認するものである。この同じ変異は家族004の発端者DTにおいても同定された。患者DTはこの変異に関してヘテロ接合であり、母系からこれを受け継いでいた。このヘテロ接合性は、短縮型cDNAならびに正常な長さのcDNAが存在するRT-PCRフラグメントＡでも明白である(図2aiのレーン４)。このエキソン３をスキップする事象は、翻訳フレームを無傷のままに残している。成熟mRNA中の得られる189塩基のインフレーム「欠失」は、成熟XIIIaポリペプチドの63アミノ酸残基の短縮を引き起こすと予測し得る。第２のスプライス部位変異は、家族005の発端者SOにおいて同定された。この患者の増幅ゲノムDNAの配列分析によって、エキソン14のドナースプライス部位においてこのエキソンの最後の塩基に変異が存在し、正常な配列TCCG/gtaaがTCC A/gtaaに変化していることがわかった(図1b)。この配列変化は、この特定の患者について、Boardら(2)が発見した変化と合致する。この塩基変化は、Msp1制限部位CCGGの喪失をもたらすと予想され、このことは、増幅したエキソン14 DNAをMs p1で消化することによって確認された(データは示さず)。cDNAのこの領域(エキソン12からエキソン15までをカバーするフラグメントＤ)の得たRT-PCR産物は、予想されるサイズの718bpより約140bp短いことがわかった(図2bi)。このRT-PCR 産物の直接配列分析は、成熟FXIIIa mRNAの1993位と2129位との間の137bpが失われていることを示した(図1)。このRT-PCR産物の直接配列分析は、成熟FXIIIa mR NAの1993位と2129位との間の137bpが失われていることを示した(図2bii)。上記と同様に、今回は、エキソン13と15とが完全にスプライシングされている、エキソン14を含むエキソンをスキップする事象が観測された(図2iib)。このエキソン 14スキッピングはフレームシフトをもたらし、コドン635のアミノ酸リジンの後に翻訳終止コドンTGAを生じる。従って、最後の103アミノ酸残基を欠く、短縮型のFXIIIaポリペプチドが生成する。コード領域内の小さな変化ミスセンス変異：２つのミスセンス変異が同定された。発端者PC家族002は、コドン408における配列変化に関してホモ接合であることがわかった。Arg(408)が、CGGからCAGに変化して、Glnへアミノ酸変化した(図1c)。第２のミスセンス変異は、家族003の発端者DSおよびLSのコドン60に発見された。発端者DSおよびLS はこの塩基変化に関してヘテロ接合であった。この場合、配列AACはAAAに変化し、AsnからLysへのアミノ酸変化を導いた(図1d)。ナンセンス変異：家族003の発端者DSとLSのエキソン11において、１つのナンセンス変異が同定された。両発端者は、この配列変化に関してヘテロ接合であった (図1e)。ヌクレオチド1410でのＣ→Ａトランジションにより、Tyr(441)が停止コドン(TAA)に変換した。この変異は、これらの患者に父系により伝達された。欠失/挿入配列変化：家族004の発端者DTのゲノムDNAに由来する増幅エキソン３の配列分析は、同じPCR産物内に２つの異なる配列が存在することを示した。このことは、対立遺伝子の１つにおける欠失または挿入事象を示唆した。配列分析に先立って、そのPCR産物をpMOSBlue Ｔベクターにサブクローン化することによって、これを決定した。成熟FXIIIa mRNAの375位および376位のGGジヌクレオチドが、配列TCGTCCによって置換されていることがわかった(図1f)。この欠失/挿入事象は、376位でのSau3A部位GATCの喪失をもたらす。このことは、増幅したエキソン３ DNAのSau3A制限分析によって確認された(結果は記載せず)。発端者DT は、この配列変化に関してヘテロ接合であり、これを父系から受け継いだ。サイレント変異：２つのサイレント変異を見出した。家族001の発端者PGは、コドン331がCCCからCCAに、コドン567がGAGからGAAに変化していることが示された。この患者は、コドン331の変化についてはホモ接合であったが、コドン567の変化についてはヘテロ接合であった。FXIIIa遺伝子のコード領域の配列変化に加えて、すべての患者が、エキソン10の5'末端より23bp 5'側(イントロン９内)でＴからＣへ置換し、エキソン７の24bpから29bp下流(イントロン７内)にある６つのＴ残基からＴが１つ欠失していることがわかった(16；データは記載せず)。それぞれエキソン７と10をカバーするRT-PCRフラグメントＢおよびＣは、いずれの場合も予想されるサイズであったので、これらの配列変化は、ともに、これらの患者におけるFXIIIaプレRNAのスプライシングに影響しないと思われる。第XIII因子a遺伝子内の特定の多型性と(ａ)クロット誘発傾向の増大および(ｂ) 再発性流産との関連前記の方法(すなわち、前記のような、ポリメラーゼ連鎖反応による第XIII因子a遺伝子エキソン領域の増幅とそのPCR産物のヌクレオチド配列分析)を用いて、クロット誘発傾向の増大または再発性流産のいずれかとともに分離する多型または変異を同定した。これらの結果を表４ならびに図３、４および５に示す。表４ならびに図３、４および５に示す結果から、Pro564とGln651が、第XIII因子活性の増大、および従って、クロット形成の危険性の増大と関連することが理解される。対照的に、Leu34は、第XIII因子活性の減少、および従って再発性流産と関連している。考察本研究では、無関係な５家族に由来するFXIIIa遺伝子の10個の変異を報告する。これらの配列変化を、翻訳産物に対するその効果について考察する。家族001 および004の発端者PGのエキソン３のドナースプライス部位に見出されたＧ→Ｔ変異は、これらの個体におけるFXIIIa mRNAの異常スプライシング、および従って短縮型FXIIIaサブユニットポリペプチドに導く。このポリペプチドから失われるアミノ酸残基は、β-サンドイッチドメインのGlu-43からIle-105までであろう。従って、この短縮型ポリペプチドのβ-サンドイッチドメイン構造は、予想される２つの４本鎖逆平行β-サンドイッチとは著しく異なり得る(３)。この変化した構造は、サブユニットが二量化する能力に影響を及ぼし、これが、次いでこのタンパク質のインビボ半減期に影響し得ると思われる(４)。さらに、この短縮型ポリペプチドにおいて仮定されるβ-サンドイッチ構造は、活性化ペプチドが二量体の他のサブユニットのコアドメインと会合することを防ぎ、そしてこのことは、タンパク質が活性化する能力に関して重要性を有し得る(５)。家族003の発端者DSとLSに見出されたAsn60Lys変化もまた、β-サンドイッチ構造に対して同様の影響を有するようである。なぜなら、この変化は、極性アミノ酸から、より長い側鎖を有する高度に荷電した残基への変化であるからである。家族005の発端者SOにおいて同定された第２のスプライスドナー部位変異も、短縮型FXIIIa mRNAをもたらす異常スプライシングにつながる。このポリペプチド合成は、最初の６アミノ酸を除いて、バレル２全体と同様である。このドメインはタンパク質の活性化に関係しないが、重要な構造要素であると考えられる( ６)。家族003の発端者DSおよびLSにおいて観察されたナンセンス変異は、カルボキシル末端の291アミノ酸残基を欠く短縮型ポリペプチドを産生する初期翻訳終結を生じる。このことは、バレル１および２のすべて、ならびに欠いているコアドメインのカルボキシル末端の一部と相関する。FXIIIaのＸ線結晶学データによると、このことの結果は明らかに、活性部位腔における正確な構造形成の欠如ならびに二量化の喪失である。コアドメイン内で触媒トライアッド(具体的にはAsp-396(５))の直近に位置する高度に荷電したArg-408は、活性部位周辺の他のアミノ酸残基との水素結合または塩橋形成に関与し得る。グルタミンは極性非塩基性アミノ酸であるから、おそらく、家族002の発端者PC中に見出されたArg408Gln変化は、触媒トライアッド周辺のコンホメーション変化を生じ、コンホメーション変化が、次いで、タンパク質の活性に著しく影響すると思われる。この点変異(Asn60Lys)の真の影響は、これらの変異対立遺伝子の哺乳動物細胞中での発現と変化したタンパク質の3-D Ｘ線結晶構造の活性の分析によって最もよく調べることができる。家族004の発端者DTに認められる欠失/挿入は、翻訳フレームシフトを生じ、その結果、190アミノ酸残基のポリペプチドが合成される。このポリペプチドの最初の96残基のみが、FXIIIaサブユニットタンパク質配列と相関する。興味深いことに、ヌクレオチド配列TCGTCCもまた、成熟FXIIIa mRNAの354位〜369位に存在し、GGからTCGTCCへの変換は、特に、それが父系を通じて伝達されるので、この特定の家族におけるDNA複製エラーに起因して生じたのだろうということが注目される。現在までに同定されたFXIIIaサブユニット欠損症が引き起こす配列変化のすべてのうち、研究された７家族(20、22および本研究)中４家族が、スプライス部位での変異を示す(3/8変異に相当)。エキソン３のドナースプライス部位でのＧ→ Ｔ変異は、２家族(001および004)で同定された。そしてこの変異は、共通の配列変化であると立証し得る。また３家族(001、002および005)の発端者が、欠損症が引き起こす変異についてホモ接合であることがわかった。このことは、これらの配列変化が、家族003および004の患者の複合ヘテロ接合体に見出された変化よりも一般的であり得ることを示唆している。全般的にみて、FXIIIaサブユニット欠損は、遺伝的に異質であるように思われる。６つの正常多型性がアミノ酸レベルで記述され(17-19)、これらが４つの異なる対立遺伝子を生じさせる。この研究では、それぞれ家族001、022および004の発端者PG、PCおよびDTが、^★IB対立遺伝子を有し、家族005の発端者SOが^★1A対立遺伝子を有し、家族003の発端者DSとLSが、^★1A/^★1B対立遺伝子を有することがわかった(Suzuki(7)の定義による)。この研究ではこれ以上の多型はアミノ酸レベルで同定されていない。要約すると、無関係な５家族の６患者において８つの変異が同定された。これらの配列変化のうち４つは、短縮型ポリペプチドを生成すると予測される。２つのサイレント変異を含むFXIIIa mRNAの翻訳能は、コドン使用因子によって影響されないと予想される。Asp60Lys変化とArg408Gln変化の構造-機能関係に対する影響は、これらの変異対立遺伝子の哺乳動物細胞中での発現と生産されたタンパタ質の検査によって最もよく分析され得る。さらに、本発明者らは、クロット形成傾向の増大または再発性流産のいずれかに相関する第XIII因子a遺伝子中の特定の多型性または変異をも同定した。本明細書に記載の方法を用いることによって、第XIII因子遺伝子中の変異を同定することができた。本発明者らは、これに基づいて、ホモ接合状態または複合ヘテロ接合状態で第XIII因子欠損症の原因となる変異の表を編集することができた。第XIII因子欠損症を患っている個体において第XIII因子欠損症に関する原因変異が見出されると予想される。同様に、クロットに由来する疾患状態を患っている個体において、このような状態に関する原因変異が見出され、そして/または、そのような状態を患っている個体において第XIII因子欠損症に関する何らかの原因変異を欠くことが見出されると予想される。前記のように、第XIII因子が合併症を引き起こすか、または何らかの有害な効果を有することは知られていないので、特定の予測可能な状況下で、第XIII因子レベルの減少を経験しそうな集団のすべての個体に第XIII因子を投与することは望ましいことでありうる。対照的に、抗凝固剤は有害な効果を有し得るので、その投与は注意深く考慮されねばならない。従って本発明者らは、本特許出願に含まれる情報が、その注意深い考慮過程における別の工程であると提案する。なぜなら、与えられた個体の第XIII因子活性のレベルは遺伝子的に予測することができ、故に個体に抗凝固剤を投与することによって起こりそうな結果(有害かそうでないか)を予測できるからである。従って、本特許出願に記載の発明概念は広範な結果を有する。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Genetic Basis of Factor XIII Activity The single inventive concept in the present application relates to the genetic understanding of Factor XIII activity, and if that understanding is applied, in one aspect, Factor XIII activity May provide methods and products to protect against haemorrhage or miscarriage (where factor XIII levels are typically reduced) when the level is low or predicted to be genetically low. And in another aspect, methods and products for protecting against blood clot formation when factor XIII activity is high or predicted to be genetically high. It is well established that many factors are involved in the enzyme amplification cascade reactions associated with blood coagulation. One factor in this cascade is factor XIII, which is found in plasma (as a proenzyme) and in platelets and monocytes. This is essential for normal hemostasis. Plasma factor XIII circulates as a tetramer consisting of two catalytic "a" subunits and two non-catalytic "b" subunits non-covalently linked thereto. In the presence of thrombin and calcium, the "a" and "b" subunits dissociate and factor XIIIa is converted to the active form by removal of the 37 N-terminal amino acids. The activated form of factor XIIIa crosslinks fibrin monomers by introducing an intermolecular covalent bond between the α and γ subunits of fibrin, thereby increasing the tensile strength of the crosslinked fibrin And transglutaminase. Activated factor XIII also crosslinks α2-plasmin, fibronectin, and collagen. Thus, it can produce high mechanical strength clots with increased resistance to degradation by plasmin. The factor XIII gene is located on chromosome 6 in bands p24-p25. Its genetic structure extends beyond 160 Kb and is found to contain 15 exons separated by 14 introns. The factor XIII cDNA isolated from the human placenta library consists of 3,902 bases, of which 2,196 bases are a coding sequence of 732 amino acids, 81 bases on the 5 ′ side and 1,625 bases on the 3 ′ side are untranslated regions. is there. Polymorphisms in the loci encoding the α and β subunits of factor XIII are surprisingly common. Despite this fact, factor XIII deficiency is an extremely rare disease. In fact, factor XIII birth defects are 2 x 10 ⁶ It is a rare autosomal recessive disorder that occurs at one-half the frequency. This information tends to imply that, despite this locus being polymorphic, most of the polymorphisms are benign. However, the polymorphisms linked to this disease are characterized by a lack of factor XIII activity and a complete lack of the "a" subunit, but a deficiency of the "b" subunit has also been described. Symptoms of the disease are prolonged bleeding, incomplete wound healing, and an increased risk of miscarriage. Diagnosis of factor XIII deficiency is difficult because routine coagulation tests that rely on evidence of abnormal clotting times typically fall within normal limits. In fact, clotting in factor XIII deficiency is normal, and it is the quality of the clot that is defective. Thus, diagnosing this disease requires a means of measuring clot quality. In factor XIII deficiency, the plasma clot is simply a polymer of fibrin bound only by ionic bonds, the bonds of which can be dispersed by 1% monochloroacetic acid or 5M urea. Clots cross-linked by factor XIII do not dissolve in these reagents. Thus, if solubility is found in these reagents, factor XIII activity is impaired or may not be present. Typically, this conventional diagnosis is confirmed by a quantitative enzyme assay, such as the dansyl cadaverine-casein assay, which evaluates the transglutaminase action of factor XIII. However, it is difficult to perform a quantitative analysis of transglutaminase activity on a daily basis. This is because there is a small amount of factor XIII present in the plasma, which forms the first part of the enzyme amplification cascade mechanism. In addition, factor XIII levels in plasma will vary depending on the physiological condition of the individual. For example, total blood volume has a significant effect on quantitative assays, and its total blood volume is determined by an individual's relative hydration / dehydration status as a result of environmental conditions and the ratio of fluid intake / urine production. You. Therefore, a reliable determination of factor XIII levels in plasma is difficult to provide. However, in the entire population, levels of factor XIII activity have been found to be normally distributed. This implies that some individuals in the population have a lower than average amount of factor XIII activity, and conversely, some individuals in the population have a higher than average amount of factor XIII activity. I do. Relevant to the present invention are, but not limited to, these two categories of the population, especially the extremes of these two categories. More specifically, with respect to the category having a lower than average amount of factor XIII activity, the present invention relates to individuals having a lower than average amount of factor XIII activity, but which have not previously been diagnosed with a factor XIII deficiency. Involved. At this stage, individuals conventionally diagnosed with factor XIII deficiency may be treated prophylactically, and as such individuals may be protected from bleeding and generally to improve quality of life. It is important to note that we receive regular infusions of factor XIII. Furthermore, women conventionally diagnosed with factor XIII deficiency are unable to maintain pregnancy until the expected birth date, and therefore, whether or not they receive prophylactic treatment, It is also important to note that throughout the period, more frequent large doses of factor XIII infusion are provided. We studied the factor XIII gene in individuals suffering from rare autosomal factor XIII deficiency, and we identified a number of mutations responsible for factor XIII deficiency. Because factor XIII deficiency is autosomal recessive, only individuals with the causative mutation or polymorphism in each allele exhibit this disease. Therefore, we started collecting a databank of the causative mutations. However, since factor XIII activity in the population is known to be normally distributed, the present inventors, for example, individuals with factor XIII activity lower than the average amount inherited the causative mutation from only one parent I thought it might be. Thus, such individuals are heterozygous for both the normal factor XIII gene (or at least the non-causal polymorphism) and the causative polymorphism. Thus, the present inventors speculate that changes in the factor XIII gene are responsible for the normal distribution of factor XIII activity in the population. We also speculate that inheritance of the causative polymorphism in one allele reduces the level of factor XIII activity below the population mean. This means that individuals who have inherited one of the causative mutations for this disease have a lower than average factor XIII activity but fall into the first category, which was not previously diagnosed with factor XIII deficiency. Means Thus, individuals in this category are vulnerable to haemorrhage and, in the case of women, miscarriages in conditions where reduced factor XIII levels are naturally predicted. Such a condition is found in early pregnancy, where it is well known that factor XIII levels are reduced. Although not previously described for these terms, we believe that recurrent spontaneous abortion in some women is directly linked to factor XIII deficiency, and Although not diagnosed with factor XIII deficiency, they believe they carry the causative mutation on one allele. Thus, the identification of this female population and their treatment with regular factor XIII infusions will protect them from recurrent spontaneous abortions. Accordingly, an object of the present invention is to provide a means for diagnosing which members of a population (ideally a female population) that have not previously been diagnosed with factor XIII deficiency have factor XIII activity below the average level. To provide. It is an object of the present invention to provide a method of protecting individuals and / or women who have not been conventionally diagnosed with factor XIII deficiency from haemorrhage and / or miscarriage of pregnant women. It is a further object of the present invention to provide a product for preventing haemorrhage in individuals and / or women who have not previously been diagnosed with factor XIII deficiency and / or abortion of a pregnant woman (this product is a XIII Factor). Our investigation and subsequent identification of the mutations responsible for many factor XIII deficiencies also gave us a second category, namely individuals with factor XI II activity above the average amount. Have no or no causative polymorphisms in the factor XIII gene, or have at least one mutation or polymorphism typically associated with high levels of factor XIII activity. One led speculation that it could show. Such individuals have an increased tendency to produce clots and are therefore at increased risk of coronary artery occlusion. Thus, the identification of a lack of polymorphism in one or both alleles of the factor XIII gene, or the identification of the presence of a benign polymorphism in one or both alleles, or the identification of a causative polymorphism Identification of one or both alleles of mutations or polymorphisms that are thought to segregate, or alternatively, with increased factor XIII activity, may indicate a life-threatening condition in which an individual is derived from coronary / arterial occlusion or actually other clots (Eg, pulmonary embolism or deep vein thrombosis) can be used as a diagnostic tool to predict the likelihood of suffering. An individual suspected of having been so threatened can then be protected against pathological conditions derived from such clots by prophylactic treatment with an anticoagulant such as heparin or warfarin. It is therefore a further object of the present invention to provide a means for diagnosing which members of the population have higher than average levels of factor XIII activity. It is also an object of the present invention to provide a method of protecting against the production of blood clots, thereby protecting against pathological conditions derived from clots. It is a further object of the present invention to provide the use of a product, which is an anticoagulant, for protecting individuals diagnosed with higher than average levels of factor XIII activity from clot production. Thus, in its broadest aspect, the present invention provides a method for predicting the propensity of an individual within a population to bleed, hemorrhage, miscarriage or clot formation. How to diagnose. The genetic data described in this application facilitates this diagnosis, and once the diagnosis is completed, prophylactic treatment can be determined to protect against the expected effects of the determined factor XIII activity level. Thus, the present invention lies in the understanding that Factor XIII activity is genetically determined and therefore predicts the consequences of under or over activity and can treat it prophylactically. According to a first aspect of the present invention there is therefore provided a method of diagnosing the level of factor XIII activity in a particular individual, comprising the following steps: a) a sample of cells from the particular individual B) determining the gene sequence structure of both alleles of the factor XIII gene derived from the individual; c) comparing the determined sequence structure to the known sequence structure of the factor XIII gene D) identifying any differences; e) comparing these differences to those known to segregate with either reduced factor XIII activity or increased factor XIII activity; f) Conclusions as follows: i) In instances where at least one difference is identified and the differences typically segregate with decreased factor XIII activity, the individual is usually expected to have reduced factor XIII levels Diagnosing, under the condition, a symptom of factor XIII deficiency, ii) at least one difference has been identified, and if the difference typically segregates with increased factor XIII activity, the individual Diagnosing a clot-derived pathological condition, iii) no difference in any of the alleles, and the absence of any difference in alleles indicates increased levels of factor XIII activity. In the examples that have been shown to result, this individual is diagnosed as being susceptible to a clot-derived pathological condition, iv) no differences are found in any of the alleles, and no differences in any of the alleles In instances where absence has been shown to result in reduced levels of factor XIII activity, this individual may suffer from symptoms of factor XIII deficiency under conditions where reduced levels of factor XIII are normally expected. In cases where a disease associated with an increased level of factor XIII activity is identified and a difference associated with decreased factor XIII activity is identified, v. According to the respective relative predominance of this difference, Diagnosing the individual. In a preferred embodiment of the invention, the diagnosis relates to a comparison of the differences detailed in Table 3 with the differences identified in d) above. The differences listed in Table 3 have been found to be responsible for factor XIII deficiency in the homozygous or compound heterozygous state. Without giving any doubt, the “known sequence structure of the factor XIII gene” referred to in c) above is a sequence structure containing no polymorphism at all. According to a further aspect of the present invention there is provided a method of preventing bleeding and / or haemo rrhage and / or abortion of a woman. The method includes providing a regular factor XIII infusion to an individual and / or the woman diagnosed as having a symptom of factor XIII deficiency under conditions where a reduction in factor XIII levels is normally expected. Including doing. According to a further aspect of the invention, preventing bleeding and / or haemor rhage and / or miscarriage of women for individuals and / or women previously not diagnosed with factor XIII deficiency Use of factor XIII in the manufacture of a medicament for treating Ideally, the women will be part of a sub-population of women whose levels of factor XIII activity are below the average of the population. Given the fact that factor XIII is not known to cause complications, cause an allergic reaction, or lead to disease transmission, if you are pregnant and are therefore exposed to reduced levels of factor XIII It may be commercially preferred to administer factor XIII to all women who are. That is, the present invention, in its broadest concept, provides women previously not diagnosed with factor XIII deficiency with at least during the first trimester of pregnancy (lower levels of factor XIII are known). For treating with factor XI II. According to a further aspect of the present invention there is provided a method of preventing a clot-derived pathological condition in an individual genetically diagnosed as having a factor XIII activity above the average level. The method includes administering an anticoagulant to the individual. According to a further aspect of the present invention there is provided the use of an anticoagulant in the manufacture of a medicament for preventing a clot-derived pathological condition in an individual genetically diagnosed as having a factor XIII activity higher than the average amount. You. In the diagnostic method of the present invention, it is preferable to collect a peripheral blood sample from the individual to be tested. According to a still further aspect of the present invention there is provided a primer complementary to a region of the Factor XIII gene that is subject to a mutation associated with increasing Factor XIII activity and / or decreasing Factor XIII activity. Preferably, at least one of the above mutations is located at the 3 'end of the primer. According to a still further aspect of the present invention there is provided a further method of diagnosing Factor XIII activity in a particular individual. The method comprises: a) taking a sample of cells from a particular individual; b) at least one of the above-described primers of the invention wherein at least one or both alleles of the factor XIII gene of said individual. Determining whether there is any difference in the alleles of the factor XIII gene of the individual compared to the known sequence structure of the factor XIII gene, c. ) To conclude: i) In instances where at least one difference is identified and the differences typically segregate with decreased factor XIII activity, the individual is usually expected to have reduced factor XIII levels Diagnosing a symptom of factor XIII deficiency under the conditions used, ii) at least one difference is identified, and the difference typically segregates with increased factor XIII activity Diagnoses the individual as susceptible to a clot-derived pathological condition, iii) no difference in any of the alleles, and no difference in any of the alleles indicates the level of factor XIII activity Diagnoses the individual as likely to suffer from a clot-derived pathological condition, iv) no differences are found in any of the alleles, In cases where no difference is found to result in a decrease in the level of factor XIII activity, the individual may be deficient in a factor XI II deficiency under conditions where a decrease in factor XIII level is normally expected. V) differences that are associated with an increase in factor XIII activity and those that are associated with a decrease in factor XIII activity are diagnosed as susceptible to the symptoms of the disease; Dominated What to diagnose the individual. Ideally, the gene sequence structure of the factor XIII gene (from each parent) of the individual to be tested is determined using PCR techniques. For example, ideally, the genomic DNA of the individual to be tested is first amplified by PCR. More specifically, exons 1-15 of the factor XIII "a" subunit are individually amplified using PCR primers. The primers shown in Table 1 are used, or the primers are substantially similar to the primers shown in Table 1, and are modified or added without affecting the exon (each primer corresponds to an exon) amplification ability of the primer. It is preferable to amplify exons 1 to 15 using those having a deletion or a deletion. More specifically, a diagnostic method for determining the gene sequence structure of the factor XIII gene of an individual to be tested involves the preparation of cDNAs related to the gene. More preferably, the diagnostic method further includes amplification (ideally by PCR) of the cDNA. In an even more preferred diagnostic method, a PCR product prepared from a subject carrying a deletion or insertion in one allele is subcloned into a vector such as the pMOSBlue T vector prior to sequencing. In an even more preferred diagnostic method, the entire coding region of the Factor XIII "a" gene cDNA is divided into four overlapping segments designated A, B, C, and D, and each segment is (ideally, By PCR, the oligonucleotides listed in Table 2 are therefore preferably used, or oligonucleotides substantially similar thereto, which are modified, added or deleted without affecting the functional activity of the oligonucleotide. The cDNA of the factor XIII "a" gene is examined by amplifying (with the loss). To date, three mutations have been described that may be responsible for the "a" subunit deficiency. One sequence change is a two base deletion at the splice deletion acceptor site. This deletion does not significantly affect the splicing of the Factor XIII pre-mRNA, but creates a translation frameshift that results in early translation termination. The second mutation is a G to A substitution at the splice donor site. The molecular mechanism by which this splice site mutation can cause factor XIII deficiency has not been determined. The third mutation is a nonsense mutation where nucleotide 598 in the arginine codon undergoes a C to T transition resulting in a stop codon TGA. We have identified eight additional mutations in patients from five unrelated families. Sequence changes found include mRNA abnormalities due to splicing errors, deletion / insertion events, nonsense mutations, missense and silent mutations. These mutations are described in Table 3. A method is provided herein that describes how to obtain data relevant to the present invention. However, the data obtained to date is not exhaustive, but rather illustrates how this method can further gather data relevant to the present invention for the purpose of providing a databank related to factor XIII activity. It is important to note that this is the case. The following method section describes how data was obtained from an individual diagnosed as having a factor XIII deficiency. Similar techniques can be used to provide data on factor XIII activity and the occurrence of clinical conditions from individuals suffering from coronary artery occlusion or clot-derived disease states, or from any member of the population. Can be obtained. Thus, it is clear that data collection for the present invention is ongoing and, indeed, could continue for years to come. Thus, the concept of the present invention is not limited to the collection of data, but rather by using the understanding that factor XIII genes can be used to predict factor XIII activity, and by using knowledge of this activity, Understand that the clinical response of an individual can be determined either for a given condition (eg, decreased factor XIII levels in early pregnancy) or for the particular individual's tendency to suffer from a clot-derived disease condition. It is about. In the following method, Table 1 shows primers suitable for amplifying exons 1 to 15 of the "a" subunit of the factor XIII gene. Table 2 shows the primers used to amplify designated regions of the Factor XIII gene cDNA. Table 3 is a summary of the causative mutations involved in factor XIII deficiency. Table 4 shows the polymorphisms or mutations associated with increased and decreased factor XIII activity. Patient N represents the normal genotype of the designated codon. Patients A1 (female) and A2 (male) have severe peripheral vascular disease. Patients B1 and B2 are women who have experienced more than three recurrent miscarriages. FIG. 1 depicts the mutations responsible for the deficiency for the FXIIIa subunit. FIG. 1a shows PG family 001 exon 3 sequenced with forward primer. FIG. 1b represents SO family 005 exon 14 sequenced with forward primer. FIG. 1c shows DS family 003 exon 11 sequenced with forward primer. FIG. 1d represents DS family 003 exon 3 sequenced with forward primer. FIG. 1e depicts PC family 002 exon 10 sequenced with forward primer. FIG. 1f depicts DT family 004 exon 3 sequenced with forward primer. FIG. 2 illustrates the event of skipping exons. Figure 2ai Lane 1 OX174 marker (HaeIII cut) Lane 2 Normal Lane 3 Patient PG family 001 Lane 4 Patient DT family 004 RT-PCR fragment A (amplified with combined oligos A1 and A2 from Table 2). Figure 2bi Lane 1 OX174 marker (HaeIII cut) Lane 2 Normal Lane 3 Patient SO family 005 RT-PCR fragment D (amplified with oligos D1 and D2 in Table 2). Fig. 2aii Sequence of RT-PCR fragment A of normal versus mutant sequenced with forward primer A1 (Table 2). Fig. 2bii Sequence of RT-PCR fragment D of normal versus mutant sequenced with reverse primer (D2 in Table 2). FIG. 3 shows the sequence data for codon 34. FIG. 4 shows the sequence data for codon 564. FIG. 5 shows the sequence data for codon 651. Materials and methods Subjects: Isolation of genomic DNA and total RNA: 30 ml of peripheral blood was collected from subjects using sodium heparin as an anticoagulant. Genomic DNA was extracted using standard techniques. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were separated from whole blood using lymphoprep (Lymphoprep; Nycoma Pharma AS) according to the manufacturer's instructions. Total RNA was isolated from PBMC using the acid guanidinium thiocyanate-phenol method described by Chomczynski and Sacchi (1). PCR amplification of genomic DNA: 100 μl of a mixture of FXIIIa subunit exons 1-15 containing 50 ng of genomic DNA, 20 μM dNTPs, 1 μM of each primer, 1.0 unit of Taq DNA polymerase (Promega) and reaction buffer (Promega) , Were amplified individually by 35 cycles of PCR. Each cycle consisted of denaturation at 92 ° C. for 1 minute, annealing at 58 ° C. for 1 minute (excluding exon 5 and exon 13 amplimers annealed at 42 ° C. for 1 minute), and extension at 72 ° C. for 2 minutes. After a final extension step at 72 ° C. for 5 minutes, 5 μl of the PCR product was analyzed by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. cDNA synthesis and PCR amplification of cDNA (RT-PCR): 1 μg of total RNA under standard conditions using random hexamers (Boehringer Mannheim) and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Promega) First strand cDNA was made. 10 ng of reverse transcribed RNA was amplified by PCR as described above. Sequence analysis of PCR products: PCR products were desalted and purified from unincorporated nucleotides using a Wizard DNA cleanup column (Promega) according to the manufacturer's instructions. Next, 25 to 50 fmol of DNA was prepared using the Promega fmol cycle sequencing kit and γ ³³ Used as template for direct cycle sequencing using P-terminally labeled amplimers. Prior to its sequencing, PCR products generated from subjects having a deletion or insertion in one allele were subcloned using the pMOSBlue T vector kit (Amersham). result For each proband in each of the five unrelated families, all 15 exons of the factor XIIIa gene were amplified using the primers listed in Table 1. The PCR product from each exon of each individual was found to have the expected size (data not shown). This indicated that there were no large insertions or deletions in the exon region of the factor XIIIa gene in these patients. FXIIIa cDNA was examined for all patients. The entire coding region was divided into four overlapping segments called A, B, C and D, and each fragment was amplified by RT-PCR using the oligonucleotides shown in Table 2. The RT-PCR products for fragments A, B, C and D were of the expected size for all patients except fragment A of proband PG of family 001 and fragment D of proband SO of family 005. . These are described in detail in the section on mRNA abnormalities below. PCR products from genomic DNA and cDNA were sequenced directly using each amplimer. Table 3 summarizes the sequence changes detected in all probands. Significant mRNA abnormalities Three families were demonstrated to have mutations affecting splice sites, and the proband of each family was homozygous for its sequence change. Sequence analysis of amplified exon 3 from the genomic DNA of the proband PG of family 001 revealed a mutation at the last position of the exon at the donor splice site, changing the normal sequence ATTG / gtga to ATTT / gtga. (Figure 1a). The RT-PCR fragment A (from exon 2 to exon 5 (Table 2)) amplified from the cDNA of this patient was found to be approximately 200 bp shorter than the expected molecular size (FIG. 2ai). Direct sequence analysis of this RT-PCR product revealed that the mature FXIIIa mRNA had lost 189 bp between positions 215 and 403 (FIG. 2aii). This corresponds to an exon skipping event involving exon 3 (with complete splicing of exons 2 and 4). Furthermore, it was shown that a single Sau3A restriction site (GATC) located within the exon 3 region of fragment A was lost upon digestion of fragment A with Sau3A (data not shown). Even if further RT-PCR using primers complementary to exon 3 enabled faint detection of transcripts containing sequences from exon 3 (results not shown), this RT-PCR result From this it can be assumed that more than 95% of the FXIIIa mRNA produced in this individual lacks the exon 3 sequence. This also confirms the homozygosity of the patient PG for this mutation. This same mutation was also identified in proband DT of family 004. Patient DT was heterozygous for this mutation and inherited it from the mother. This heterozygosity is also evident in the truncated cDNA as well as in the RT-PCR fragment A where the normal length cDNA is present (lane 4 in FIG. 2ai). The event of skipping exon 3 leaves the translation frame intact. The resulting in-frame "deletion" of 189 bases in the mature mRNA can be expected to cause a shortening of 63 amino acid residues of the mature XIIIa polypeptide. A second splice site mutation was identified in proband SO of family 005. Sequence analysis of this patient's amplified genomic DNA revealed a mutation in the last base of this exon at the donor splice site of exon 14, changing the normal sequence TCCG / gtaa to TCC A / gtaa (FIG. 1b). This sequence change is consistent with the change discovered by Board et al. (2) for this particular patient. This base change was expected to result in the loss of the Msp1 restriction site CCGG, which was confirmed by digesting the amplified exon 14 DNA with Mspl (data not shown). The resulting RT-PCR product of this region of the cDNA (fragment D covering exon 12 to exon 15) was found to be approximately 140 bp shorter than the expected size of 718 bp (FIG. 2bi). Direct sequence analysis of this RT-PCR product indicated that 137 bp between positions 1993 and 2129 of the mature FXIIIa mRNA had been lost (FIG. 1). Direct sequence analysis of this RT-PCR product indicated that the mature FXIIIa mRNA had lost 137 bp between positions 1993 and 2129 (FIG. 2bii). Similarly to the above, this time, an exon skipping exon 14, including exon 14 where exons 13 and 15 were completely spliced, was observed (FIG. 2iib). This exon 14 skipping results in a frameshift resulting in a translation stop codon TGA after amino acid lysine at codon 635. Thus, a truncated FXIIIa polypeptide is generated that lacks the last 103 amino acid residues. Small alteration missense mutation in the coding region: Two missense mutations were identified. Proband PC family 002 was found to be homozygous for a sequence change at codon 408. Arg (408) was changed from CGG to CAG and amino acid changed to Gln (FIG. 1c). A second missense mutation was found in codon 60 of proband DS and LS in family 003. Probands DS and LS were heterozygous for this base change. In this case, the sequence AAC was changed to AAA, leading to an amino acid change from Asn to Lys (FIG. 1d). Nonsense mutations: One nonsense mutation was identified in exon 11 of proband DS and LS in family 003. Both probands were heterozygous for this sequence change (FIG. 1e). A C → A transition at nucleotide 1410 converted Tyr (441) to a stop codon (TAA). This mutation was transmitted to these patients by paternity. Deletion / insertion sequence changes: Sequence analysis of amplified exon 3 from genomic DNA of proband DT of family 004 showed that two different sequences were present in the same PCR product. This suggested a deletion or insertion event in one of the alleles. This was determined by subcloning the PCR product into the pMOSBlue T vector prior to sequence analysis. The GG dinucleotide at positions 375 and 376 of the mature FXIIIa mRNA was found to be replaced by the sequence TCGTCC (FIG. 1f). This deletion / insertion event results in the loss of the Sau3A site GATC at position 376. This was confirmed by Sau3A restriction analysis of the amplified exon 3 DNA (results not shown). The proband DT was heterozygous for this sequence change and inherited it from the paternal lineage. Silent mutation: Two silent mutations were found. The proband PG of family 001 showed that codon 331 changed from CCC to CCA and codon 567 changed from GAG to GAA. This patient was homozygous for codon 331 changes but was heterozygous for codon 567 changes. In addition to the sequence changes in the coding region of the FXIIIa gene, all patients had a T to C substitution 23 bp 5 'from exon 10 5' end (within intron 9) and a 24 bp to 29 bp downstream exon 7 (intron 9). It was found that one T was deleted from six T residues in (7) (16; data not shown). Since the RT-PCR fragments B and C, covering exons 7 and 10, respectively, were of the expected size in each case, these sequence changes do not both affect the splicing of FXIIIa preRNA in these patients. I think that the. Association of specific polymorphisms in the factor XIIIa gene with (a) increased propensity to induce clots and (b) recurrent miscarriage. Amplification of the gene exon region and nucleotide sequence analysis of its PCR product) were used to identify polymorphisms or mutations that segregate with either increased clot-induced propensity or recurrent miscarriage. The results are shown in Table 4 and FIGS. From the results shown in Table 4 and FIGS. 3, 4 and 5, it can be seen that Pro564 and Gln651 are associated with increased factor XIII activity and, therefore, increased risk of clot formation. In contrast, Leu34 is associated with decreased factor XIII activity, and thus recurrent miscarriage. Consideration In this study, we report 10 mutations in the FXIIIa gene from five unrelated families. These sequence changes are discussed for their effect on translation products. The G → T mutation found at the donor splice site of exon 3 of the proband PG of family 001 and 004 leads to aberrant splicing of FXIIIa mRNA in these individuals, and thus to a truncated FXIIIa subunit polypeptide. Amino acid residues missing from this polypeptide will be from Glu-43 to Ile-105 of the β-sandwich domain. Thus, the β-sandwich domain structure of this truncated polypeptide can be significantly different from the two anticipated four-stranded antiparallel β-sandwiches (3). This altered structure affects the ability of the subunit to dimerize, which could in turn affect the in vivo half-life of the protein (4). In addition, the postulated β-sandwich structure in this truncated polypeptide prevents the activating peptide from associating with the core domain of the other subunit of the dimer, which indicates the ability of the protein to activate (5). Asn60Lys alterations found in probands DS and LS of family 003 also appear to have a similar effect on β-sandwich structure. This is because the change is from a polar amino acid to a highly charged residue with a longer side chain. A second splice donor site mutation identified in proband SO of family 005 also leads to aberrant splicing resulting in truncated FXIIIa mRNA. This polypeptide synthesis is similar to barrel 2 overall, except for the first six amino acids. This domain is not involved in protein activation but is thought to be an important structural element (6). The nonsense mutations observed in probands DS and LS of family 003 result in early translation termination producing a truncated polypeptide lacking the carboxyl-terminal 291 amino acid residues. This correlates with all of barrels 1 and 2, as well as a portion of the carboxyl terminus of the missing core domain. According to the X-ray crystallographic data of FXIIIa, the result of this is clearly a lack of precise structure formation in the active site cavity as well as a loss of dimerization. Highly charged Arg-408, located in the core domain immediately adjacent to the catalytic triad (specifically, Asp-396 (5)), can form hydrogen bonds or salt bridges with other amino acid residues around the active site. Can be involved. Since glutamine is a polar non-basic amino acid, the Arg408Gln change found in the proband PC of family 002 probably results in a conformational change around the catalytic triad, which in turn causes the conformational change of the protein. It appears to significantly affect activity. The true effect of this point mutation (Asn60Lys) can be best examined by analyzing the expression of these mutant alleles in mammalian cells and the activity of the altered protein 3-D X-ray crystal structure. The deletion / insertion found in the proband DT of family 004 results in a translational frameshift, resulting in the synthesis of a 190 amino acid residue polypeptide. Only the first 96 residues of this polypeptide correlate with the FXIIIa subunit protein sequence. Interestingly, the nucleotide sequence TCGTCC is also present at positions 354 to 369 of the mature FXIIIa mRNA, and the conversion of GG to TCGTCC is not an error in DNA replication in this particular family, especially since it is transmitted through paternity. It is noted that it may have been caused by Of all the sequence changes caused by the FXIIIa subunit deficiency identified to date, four out of the seven families studied (20, 22 and this study) show mutations at the splice site (3/8 mutation Equivalent). A G → T mutation at the exon 3 donor splice site was identified in two families (001 and 004). This mutation can then prove to be a common sequence change. Probands in three families (001, 002, and 005) were also found to be homozygous for the mutation caused by the deficiency. This suggests that these sequence changes may be more common than those found in complex heterozygotes of patients in families 003 and 004. Overall, the FXIIIa subunit deficiency appears to be genetically heterogeneous. Six normal polymorphisms have been described at the amino acid level (17-19), which give rise to four different alleles. In this study, probands PG, PC, and DT in families 001, 022, and 004, respectively, ^★ Proband SO with family 005 has the IB allele ^★ Probands DS and LS of family 003 with 1A allele, ^★ 1A / ^★ It was found to have the 1B allele (as defined by Suzuki (7)). No further polymorphisms have been identified at the amino acid level in this study. In summary, eight mutations were identified in six patients from five unrelated families. Four of these sequence changes are predicted to produce truncated polypeptides. The translation ability of FXIIIa mRNA containing the two silent mutations is not expected to be affected by codon usage factors. The effect of Asp60Lys and Arg408Gln changes on the structure-function relationship can be best analyzed by expression of these mutant alleles in mammalian cells and examination of the produced protein. In addition, the present inventors have also identified specific polymorphisms or mutations in the factor XIIIa gene that correlate with either an increased tendency to clot or recurrent miscarriage. By using the methods described herein, mutations in the factor XIII gene could be identified. Based on this, we were able to compile a table of mutations that cause factor XIII deficiency in a homozygous or compound heterozygous state. It is expected that a causative mutation for factor XIII deficiency will be found in individuals suffering from factor XIII deficiency. Similarly, a causative mutation for such a condition is found in an individual suffering from a clot-derived disease condition, and / or any cause for factor XIII deficiency in an individual suffering from such a condition. It is expected to be found to lack the mutation. As noted above, it is not known that factor XIII will cause complications or have any detrimental effects, so in certain predictable situations, populations likely to experience reduced factor XIII levels It may be desirable to administer Factor XIII to all individuals at In contrast, anticoagulants can have detrimental effects and their administration must be carefully considered. The inventors therefore propose that the information contained in this patent application is another step in its careful consideration process. Because the level of factor XIII activity in a given individual can be genetically predicted, and thus the likely consequences (harmful or not) of administering an anticoagulant to the individual. is there. Accordingly, the inventive concepts described in this patent application have broad consequences.

Claims

[Claims] 1. A method for diagnosing the level of factor XIII activity in a particular individual, comprising: Process: a) collecting at least one cell from a specific individual; b) Determining the genetic sequence structure of both alleles of the factor XIII gene derived from the individual Process, c) comparing the determined sequence structure with the known sequence structure of the factor XIII gene , d) identifying any differences; e) determining the difference as either a decrease in factor XIII activity or an increase in factor XIII activity Comparing with the differences that are both known to separate, f) the step of concluding as follows: i) at least one difference is identified, said difference typically leading to a reduction in factor XIII activity In instances where segregation occurs with low levels, the individual is usually expected to have reduced factor XIII levels. Diagnosing a symptom of factor XIII deficiency under the condition ii) at least one difference is identified, said difference typically increasing the factor XIII activity In instances where the individual segregates with large, the individual is likely to suffer from a clot-derived pathological condition. The process of diagnosing iii) Differences associated with increased factor XIII activity identified and reduced factor X In instances where a difference associated with factor III activity is identified, the relative superiority of each of the differences Diagnosing said individual according to the momentum; A method comprising: 2. The comparison in e) is a step of comparing the difference with the information provided in Table 4. The method of claim 1, comprising: 3. The comparison in e) is a step of comparing the difference with the information provided in Table 3. The method of claim 1, comprising: 4. The step of e) comparing the difference with the information in Tables 3 and 4; The method of claim 1, comprising: 5. Bleeding; and / or haemorrhage; and / or A method for preventing miscarriage, in which a reduction in factor XIII levels is normally expected Regular factor XIII in individuals diagnosed as likely to have symptoms of factor XIII deficiency below Providing a daughter injection. 6. The portion of the female wherein the individual has a factor XIII activity level below the population average 6. The method of claim 5, comprising a woman that is part of a population. 7. Bleeding in women who have not been previously diagnosed with factor XIII deficiency; And / or haemorrhage; and / or medication to prevent miscarriage Use of factor XIII in the production of 8. Bleeding in men who have not previously been diagnosed with factor XIII deficiency; XIII in the manufacture of a medicament for the prevention of and / or haemorrhage; Use of factors. 9. The medicament prevents the disease in an environment with reduced factor XIII levels 9. Use according to claim 7 or claim 8 for use. 10. Birth, comprising administering factor XIII to all pregnant women Pre-curing method. 11. Individuals genetically diagnosed with factor XIII activity above the average level A method for preventing a pathological condition derived from clots, comprising administering an anticoagulant to the individual. A method comprising the step of administering. 12. Individuals genetically diagnosed with factor XIII activity above the average level In the manufacture of pharmaceuticals to prevent morbidity from clots Use of agents. 13. A method for diagnosing the level of factor XIII activity in a particular individual, comprising: Process of: a) collecting at least one cell from a specific individual; b) Changes associated with increased factor XIII activity and / or decreased factor XIII activity At least one region complementary to at least one region of the factor XIII gene The primer is an allele of at least one or both of the factor XIII genes of the individual; Determine whether the individual binds to the offspring and, in this manner, alleles of the factor XIII gene of the individual. Whether the gene has any differences compared to the known sequence structure of the factor XIII gene Identifying whether; and c) The steps that conclude as follows: i) at least one difference is identified, said difference typically leading to a reduction in factor XIII activity In instances where segregation occurs with low levels, the individual is usually expected to have reduced factor XIII levels. Diagnosing a symptom of factor XIII deficiency under the condition ii) at least one difference is identified, said difference typically increasing the factor XIII activity In an example that separates with large, the individual is likely to suffer from a clot-derived pathological condition. Diagnosing it; and iii) Differences associated with increased factor XIII activity identified and reduced factor X In instances where a difference associated with factor III activity is identified, the relative superiority of each of the differences Diagnosing the individual according to the momentum; A method comprising: 14． The method of b), wherein the method of step b) includes preparing cDNA related to the gene. 14. The method according to claim 1 or 13. 15. 15. The method of claim 14, wherein the method of step b) further comprises amplifying the cDNA. The described method. 16. The method according to claim 15, wherein the amplification is performed using a PCR method. 17． The cDNA of the factor XIII "a" gene covers the entire coding region with A, B, C and And into four overlapping segments, called D and each segment Or the oligonucleotides substantially similar to the oligonucleotides shown in FIG. Have an alteration, addition, or deletion that does not affect the functional activity of the gonucleotide 2. The method of claim 1, wherein the probe is probed by amplification with an oligonucleotide. 14. The method according to 13.