【発明の詳細な説明】
隔離剤
本発明は、一般的には溶解しない疎水性相を親水性相に分散させる際の疎水性
相における、該疎水性相に可溶化される、親水性分子の保持を補助する特定の化
合物の使用に関するものである。特に、本発明は、一般的には溶解しない疎水性
相における親水性高分子の保持を補助することを目的とする上記物質の使用に関
するものである。
製薬科学において、食品技術または化粧品工業において等、数多く用途につい
て、タンパク質及び同様の高分子を用いた研究は、それらの親水性及び高い極性
により脂質相と相互作用するまたは脂質相中に取り込まれることができる範囲が
制限されるため、問題を有する。多くの自然界の機構は、脂質のバリアー（例え
ば、皮膚、細胞膜）を利用しており、内部のコンパートメントへの親水性分子の
接近を阻害している；脂質媒介物中にタンパク質を分散することが可能になるこ
とによって、生物学的システムにこのような高分子を取り込むための新規なルー
トを開発でき、これにより、タンパク質を含む脂質媒質が、バリアーの疎水性成
分を排除せずに、これらの成分を組み込むことができる。
水性の媒質ではなく油相における親水性物質の分散液は、温度が介在する変性
、加水分解、光感受性等に関する安定性を増すという点でさらに長所を有する。
水溶液より広範な温度範囲にわたって流動性を維持し、またはより高い粘性を有
することにより物理的な損傷に対してより大きな保護が得られる油が選ばれる。
混合相のシステムにおいては、油中に疎水性物質が導入されることによって、油
内及び水相内双方における、他の物質との相互に有害な相互作用−例えば、酸化
−が制限できる。
高分子及び油双方を含む配合物の例はあり、その一例がＥＰ−Ａ−０３６６２
７７号に開示されている。上記公報に開示されている配合物は、疎水性相がカイ
ロミクロンまたはカイロミクロン形成脂質を含む、疎水性及び親水性相を有する
乳濁液である。しかしながら、高分子は疎水性相ではなく親水性相に溶解する。
ＥＰ−Ａ−０５２１９９４号は、レシチンと会合する生物学的に活性のある材
料またはインビボにおいてレシチンの前駆体として作用することができる化合物
からなる高分子の経口投与に適した組成物に関するものである。例示されたすべ
ての組成物は親水性及び親油性相からなる配合物である。再度繰り返すが、上記
従来の文献では、高分子は親油性相ではなく親水性相に溶解する。
上述した配合物は確かに高分子及び油を含んではいるが、すべての場合におい
て、高分子は初期には親油性相ではなく親水性相に溶解することは重要である。
真に油中に高分子を溶解した溶液を形成する試みは限られた範囲でしか成功して
いない。
オカハタ(Okahata)ら（ジェー ケム ソク ケム コミュン(J．Chem．Soc．
Chem．Commun.)、１９８８年、１３９２〜１３９４）には、疎水性溶剤中にタン
パク質を可溶化させる方法が開示される。しかしながら、上記方法によって製造
される両親媒性分子によって囲まれるタンパク質のアレイにおいて、著者らは、
両親媒性分子は水素結合によってまたは静電的相互作用を介して液状媒質中でタ
ンパク質と反応して固体の沈殿物を形成すると記載している。
ＵＫ特許出願番号９３２３５８８．５号には、親水性物質を一般的に溶解しな
い疎水性溶剤中に可溶化できる方法が開示されている。上記方法は、親水性物質
をある条件下で両親媒性物質(amphiphile)と混合すると、得られる組成物は油等
の親油性溶剤中に容易に溶解するという驚く
べき発見によるものである。
しかしながら、このような方法による産物の１つの可能性のある問題としては
、例えば、水等の、親水性相における単相の疎水性調製物の分散による、乳濁液
の製造におけるその使用に関するものがある。このような分散液では、少なくと
も場合によっては、可溶化される親水性物質が親水性相中に「漏れる」即ち可溶
化プロセスを逆行させる傾向にあるであろう。したがって、上記作用を抑制し、
このような疎水性相自体が後に親水性相中に分散される際でさえ親水性物質を疎
水性相中に保持させる必要が存在する。
驚くべきことに、化合物によっては疎水性相中に可溶化される親水性物質及び
乳濁液等の該疎水性相が後に分散される親水性相の間の直接的な相互作用の度合
いを減少できることが発見された。
したがって、第一の概念によると、本発明は、疎水性相中に可溶化される親水
性物質及び該疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する
物質の使用を提供するものである。
本発明において、「物質(agent)」ということばは、親水性物質が一般的には
溶解しない疎水性相自体を親水性中に分散させて、例えば、乳濁液を形成する際
に、該疎水性中に可溶化される親水性物質と該親水性相との間の直接的な相互作
用を抑制できる物質を意味する。
第二の概念によると、本発明は、一般的には溶解しない疎水性溶剤中に可溶化
される親水性物質および該親水性物質と単相の疎水性調製物が分散される親水性
相との間の直接的な相互作用を抑制する物質からなる単相の疎水性調製物を提供
するものである。
親水性物質は親水性相の個々の分子と接触できるが、大部分の親水性相とは接
触できないので、故に、親水性物質の親水性相中への漏れは抑制されると考えら
れる。
本発明において、「親水性物質(hydrophilic species)」ということばは、通
常、水性溶剤には可溶性であるが疎水性溶剤には不溶性である物質を意味するも
のである。好ましくは、以下の物質が挙げられる：
（ｉ）酸性脂質、例えば、コレステロールヘミスクシネート(cholesterol hem
isuccinate)（Ｃｈｅｍｓ）またはホスファチジン酸；または
（ｉｉ）例えば、カゼイン等の化合物などの疎水性相を通過できない乳化安定
剤。
第三の概念によると、本発明はまた、一般的には溶解しない疎水性溶剤中に可
溶化される親水性物質、及び乳濁液等の、該疎水性相が分散される親水性相の間
の直接的な相互作用を抑制するのに使用される物質を提供するものである。
好ましくは、明細書中に記載される物質は、ＵＫ特許出願番号９３２３５８８
．５号に記載される可溶化プロセスに使用される。したがって、さらなる概念に
よると、本発明は、以下よりなり：
（ｉ）液状媒質中で両親媒性物質と親水性物質との間で化学的な相互作用が生
じないように液状媒質中で親水性物質と両親媒性物質とを会合する(associate)
；
（ｉｉ）液状媒質を除去し、親水性のヘッドグループ(head group)が親水性物
質の方に向いた両親媒性分子のアレイ(array)を残す；および
（ｉｉｉ）親水性物質／両親媒性物質のアレイの周りに疎水性溶剤を供給する
、
親水性物質及び疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制す
る物質を一以上の上記段階で添加する、疎水性溶剤における、親水性物質からな
る単相の疎水性調製物の調製方法を提供するものである。
好ましくは、上記方法において、上記物質は段階（ｉ）において両親
媒性物質(amphiphile)と共に添加され、また、例えば、コレステロールヘミスク
シネート(cholesterol hemisuccinate)（Ｃｈｅｍｓ）またはホスファチジン酸
（ＰＡ）等の化合物などの疎水性相を通過できない乳化安定剤であることが好ま
しい。
本発明の明細書において、「化学的な相互作用」という言葉は、共有結合また
はイオン結合または水素結合等の相互作用に関するものであり、ファンデルワー
ルス力またはこのようなオーダーの大きさの他の相互作用を含むことを意図する
ものではない。
他の概念によると、本発明は、親水性物質及び親水性相の間の直接的な相互作
用を抑制する物質を親水性相に添加する段階からなる、親水性相における、疎水
性溶剤における親水性物質からなる、単相の疎水性調製物の分散方法を提供する
ものである。
上記方法において、上記物質は、例えば、カゼイン等の化合物などの疎水性相
を通過できない乳化安定剤であることが好ましい。
広範な様々な高分子が本発明の方法を用いて適当に可溶化できる。油溶液中に
疎水性高分子を可溶化させることは一般的にほとんど難しくないので、通常、高
分子化合物は親水性であるまたは少なくとも親水性領域を有するものである。適
当な高分子の例としては、タンパク質及び糖タンパク質、ＤＮＡやＲＮＡ等の、
オリゴ−及びポリ核酸(oligo- or polynucleic acid)、多糖及び場合によっては
、全細胞または細胞小器官またはウィルス（全部またはその一部）を含むこれら
のいずれかの超分子集合体(supermolecular assembly)が挙げられる。高分子、
特にシクロデキストリン等の多糖、と共にビタミン等の小分子を一緒に可溶化(c
o-solubilise)することも簡便である。ビタミンＢ12等の小分子をまた高分子と
化学的に共役させて、本組成物中に含ませてもよい。
特に、可溶化される高分子がタンパク質またはポリペプチドである際
には、該物質は酸性脂質であることが好ましい。
本発明の方法によって好ましく可溶化されるタンパク質の例としては、インス
リン、カルシトニン、ヘモグロビン、シトクロムＣ、西洋ワサビのペルオキシダ
ーゼ、アプロチニン、マッシュルームのチロシナーゼ、エリトロポエチン、ソマ
トトロピン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ガラニン(galanin)、ウロ
キナーゼ、因子ＩＸ、組織プラスミノーゲン活性化因子、スーパーオキシドジス
ムターゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、フェリチン、インターフェロン、因
子ＶＩＩＩ、メラニン及びこれらの断片（上記タンパク質はすべて適当な源由来
である）が挙げられる。他の使用できる高分子としては、ＦＩＴＣ−標識デキス
トラン(FITC-labelled dextran)及びトルラ属の酵母(Torulla yeast)からのＲＮ
Ａ抽出物がある。
高分子に加えて、本発明の方法はより小さい有機分子を可溶化するのにも使用
できる。小さな有機分子の例としては、グルコース、アスコルビン酸、カルボキ
シフルオレシン(carboxyfluorescin)及び抗癌剤等の数多くの薬剤が挙げられる
が、本方法は他の小さな有機分子、例えば、他のビタミン類または製薬上若しく
は生物学的に活性を有する物質、にも同様にして使用できることはいうまでもな
い。さらに、塩化カルシウムやリン酸ナトリウム等の分子もまた本発明の方法を
用いて可溶化できる。本発明は、非水溶液の使用によって分子が体内に入り変化
する、例えば、生物学的利用能を向上するようなルートが可能になるので、製薬
上及び生物学的に活性を有する物質に対して特に好ましい。
本発明の疎水性組成物に含まれる他の型の物質は、小さな無機分子等の無機材
料またはコロイド金属等のコロイド物質である。本発明の方法は、コロイド金、
パラジウム、白金若しくはロジウム等のコロイド金属の性質を、粒子が一般的な
環境下では凝集してしまう疎水性溶剤中でさ
え保持することが可能である。このことは有機溶剤中で行われる反応の触媒とし
て特に有用である。
本発明において使用される両親媒性物質は数多く存在し、リン脂質等の双性イ
オンの両親媒性物質は特に好ましいことが知られているものに含まれる。ホスフ
ァチジルコリンのヘッドグループを有するリン脂質は特に好ましく用いられ、こ
のようなリン脂質の例としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）それ自身、リゾ
−ホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、スフィンゴミエリン、ヘキサデシ
ルホスホコリン等のこれらの誘導体またはホスホリルコリンを含む両親媒性ポリ
マー及びフッ素化(fluoronated)リン脂質等のハロゲン化両親媒性物質が挙げら
れる。本願において、「ホスファチジルコリン（ＰＣ）」及び「レシチン」とい
う言葉は交互に使用される。適当な天然のレシチンは、例えば、卵、及び特に大
豆等の既知の源由来であってもよい。ほとんどの場合、使用される疎水性溶剤と
化学的に類似の両親媒性物質を選ぶことが好ましく、この件に関しては以下によ
り詳細に説明する。
本発明者らがリン脂質等の双性イオンの両親媒性物質が本方法において特に好
ましく使用されることを発見したという事実は、本発明とオカハタ(Okahata)ら
の方法の有意な差をさらに示すものである。さらに、従来の文献の著者等は、陰
イオンの及び双性イオンの脂質は著者等の方法に使用するには全く適当でないと
結論付けており、これらの脂質を用いると複合体の収率はゼロであったと述べて
いた。
使用される疎水性溶剤は、組成物が使用される目的、可溶化される物質の型及
び両親媒性物質によって異なる。適当な溶剤としては、鉱油、スクアラン及びス
クアレン等の非極性油、長鎖の脂肪酸（オレイン酸やリノレン酸等の不飽和脂肪
酸が好ましい）、アルコール類、特にオクタノール等の中鎖のアルコール類やフ
ィトール等の枝分れ長鎖アルコール
類、ネロールやゲラニオール等のイソプレノイド類、テルピネオール、グリセロ
ールモノオレエート（ＧＭＯ）等のモノグリセリド、酢酸エチル、酢酸アミルや
酢酸ボルニル等の他のエステル類、ジグリセリド及びトリグリセリド、特に中鎖
のトリグリセリド及びこれらの混合物、長鎖フルオロカーボン等のハロゲン化油
またはリピディオール(lipidiol)等のヨウ素化トリグリセリドなどの上記いずれ
かのハロゲン化類似体が挙げられる。
最適な結果は、通常、疎水性溶剤及び両親媒性物質を適当に使用する際に得ら
れる。例えば、オレイン酸等の溶剤には、ｌｙｓｏ−ＰＣがＰＣよりも好ましく
選ばれた両親媒性物質であり、疎水性溶剤がトリグリセリドである際には逆が好
ましい。
さらに、場合によっては、親水性物質／両親媒性物質のアレイに接触する前に
大量の両親媒性物質を疎水性溶剤に添加することが好ましいことが分かった。こ
のことは、疎水性溶剤に対する両親媒性物質の高い親和性により、両親媒性分子
が親水性物質周辺の位置から除かれないことを示すものである。
本発明の調製物は、肉眼では透明で、さらに、可視波長での濁度を測定するこ
とにより、及び場合によってはある一定の期間沈降を調べることにより検出でき
ることが非常に好ましい。
親水性のヘッドグループが親水性物質部分に面するアレイ中への両親媒性分子
の向きは多様に得られ、特に適当な方法の例は以下により詳細に記載する。
カービー(Kirby)ら（バイオテクノロジー(Biotechnology)、１９８４年１１月
、頁９７９〜９８４及びリポソーム テクノロジー(Liposome Technology)、Ｉ
巻、頁１９〜２７、グレゴリアディス著、シーアールシー プレス，インコーポ
レイテッド、ボカ レイトン、フロリダ、
ユーエスエー(Gregoriadis，Ed.，CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida，USA
)）によって記載された方法と同様の出発点を有する、第一の方法では、親水性
物質を親水性溶剤における両親媒性物質の分散液と混合することにより、両親媒
性分子は親水性のヘッドグループが親水性物質を含む親水性相に向かって外側に
面する集合体を形成する。次に、親水性溶剤を除去して、両親媒性分子の親水性
のヘッドグループが親水性物質に向かう乾燥組成物を残す。
オカハタ(Okahata)らによる方法においても、タンパク質溶液は水における両
親媒性物質の分散液と混合した。しかしながら、上記文献の著者等は、さらに疎
水性溶剤に可溶性となる沈殿物を得ることが必要であると信じていた。本発明の
多くの好ましい両親媒性物質はこのような沈殿物を形成しないので、オカハタ(O
kahata)らはこれらは使用できないと結論付けた。本発明の方法によると、沈殿
物は必要とせず、むしろ、目的とする生成物の収率が減少するので沈殿物を形成
させることは望ましくないと一般的に考えられている。
第一の方法によると、他の極性溶剤を使用してもよいが、親水性溶剤は水であ
ることが好ましい。
両親媒性物質の集合体によって取られる形態は、ミセル、単ラメラ小胞、好ま
しくは約２５ｎｍの直径を有すると通常考えられる小さい単ラメラ小胞、多重ラ
メラ小胞または管状構造物、例えば渦巻形のシリンダー、六角形相(hexagonal p
hase)、立方形相(cubic phase)またはミエリン型構造物(myelin type structure
)がある。使用される形態は使用する両親媒性物質によって異なり、例えば、ホ
スファチジルコリン（ＰＣ）等の両親媒性物質は小さい単ラメラ小胞を形成する
傾向にあるが、リゾ−ホスファチジルコリンはミセルを形成する。しかしながら
、これらのすべての構造物において、両親媒性分子の疎水性のテールは構造物
の中心に向かって内側に面しているが、親水性のヘッドグループは親水性物質が
分散する溶剤に向かって外側に面している。
両親媒性物質：親水性物質の重量比は、通常、１：１〜１００：１、好ましく
は２：１〜２０：１の範囲内であり、最も好ましくは、ＰＣで約８：１であり、
ｌｙｓｏ−ＰＣでは４：１である。
これらの割合は好ましい割合であるのみであり、特に、上限は最小限の可能な
量の両親媒性物質を用いることが好ましいという経済的な考慮によって設定され
ていることを指摘するべきである。より低い限度はより臨界的であり、２：１ま
たはそれより低い割合のみが親水性物質がかなり疎水性部分を有するまたは非常
に大きい場合に用いられると考えられる。
溶剤を速やかに除去すると良好に実施でき、既知の溶剤除去方法は凍結乾燥法
でありが、他の方法を用いてもよい。
場合によっては、特に、親水性物質が大きなタンパク質等の高分子化合物であ
る際には、親水性溶液中に塩を含ませることが有用である。しかしながら、大量
の無機塩の存在によって結晶が形成して、曇った溶液になりやすくなるため、塩
化ナトリウム等の無機塩ではなく有機塩が使用されるのが好ましい。酢酸アンモ
ニウムが、凍結乾燥によって容易に除去できるというさらなる長所を有するため
、このように目的には特に好ましい。
ヘッドグループが親水性物質部分方向に向いている両親媒性物質のアレイを含
む組成物の第二の調製方法は、共有の溶剤に親水性物質及び両親媒性物質を一緒
に可溶化し(co-solubilise)た後溶剤を除去することである。
本発明の方法の生成物は新規である。したがって、本発明のさらなる概念によ
ると、本発明の方法によって得られる疎水性溶剤における親水
性物質からなる単相の疎水性調製物を提供するものである。
親水性物質に加えて単相の疎水性調製物中に他の成分を含ませることも望まし
い。このことは、親水性物質が高分子である際に、しばしば特に好ましく、この
場合には、調製物は、例えば、胆汁酸塩、ビタミン類または高分子に結合する若
しくは高分子と会合する他の小分子を含んでいてもよい。
高分子／両親媒性物質のアレイによっては上記したカービー(Kirby)らによっ
て開示されているが、開示されているアレイはすべてリポソームの形成における
中間体であり、上述したように、このような型のものからなる非リポソームのま
たは疎水性の組成物には従来は何等興味がなかった。したがって、両親媒性物質
が小さい単ラメラ小胞を形成しないためリポソームを形成するとは考えられない
ものである本発明のアレイは新規である。
本発明の調製物の一つの長所としては、本質的に無水であるため加水分解に対
してより安定であることが挙げられる。また、タンパク質の場合では、本調製物
はタンパク質が開いて(unfold)変性するには水が存在しなければならないと考え
られるため、凍結融解に安定であり、高温でより大きな安定性を有する。このこ
とは、親水性物質の水性の調製物に比べると非常により長い寿命を有すると考え
られることを意味する。
本発明の溶液は非常に多能であり多くの用途がある。これらはまた、単独で使
用してよいが、水相と組み合わせて使用して乳濁液または同様の２相組成物を形
成することが好ましく、このことは本発明のさらなる概念を形成するものである
。
本発明の上記概念によると、親水性相および疎水性相からなる２相組成物であ
って、該疎水性相が上記方法によって得られる親油性溶剤における親水性物質の
調製物からなるものである２相組成物を提供するもの
である。
一般的には、このようなタイプの組成物では、疎水性相は親水性相中に分散し
ている。
２相組成物は、必要とされる目的によっては、一時的であるまたは安定である
乳濁液であってもよい。
乳濁液粒子の平均的な大きさは疎水性相および水相両方の性質によって異なる
。しかしながら、２μｍ程度の範囲内である。
水相における疎水性調製物の分散液は、混合によって、例えば、約１０〜６０
秒、一般的には約１５秒間等の短期間激しくボルテックスする(vortexing)、ま
たは例えばオービタルシェーカー(orbital shaker)を用いて数時間緩やかに混合
することによって、得られる。
他の概念によると、本発明は、可溶化される際の親水性物質及び親水性物質を
可溶化する疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物
質をあらかじめ添加した親水性相に疎水性相を分散させることからなる、疎水性
相の、乳濁液等の、分散液の調製方法を提供するものである。
本発明を以下の実施例を参照しながらさらに説明するが、下記実施例は本発明
を制限するものではないことはいうまでもない。実施例１
０．００１５Ｍホウ酸緩衝液を、１００ｍｌの蒸留水に６０ｍｇのテトラホウ
酸ナトリウムを溶解し、ｐＨ８．００に調整することにより調製した。５ｍｇの
ＢＡＰＮＡをＢ９ガラス製ネジキャップ付きバイアル瓶中に秤量し、３ｍｌのメ
タノールに溶解した。１０ｍｇのトリプシンを１５ｍｌプラスチック製の遠心管
(centrifuge)中に秤量し、そして１０ｍｌのホウ酸緩衝液をボルテックス(vorte
xing)しながら添加した。懸濁液を、ローラーミキサーで混合した後、未溶解物
を沈降させ(spin
down)、上清をデカンテーションした。
アプロチニンの希釈溶液（５０μｌ／ウェル）を０〜３０μｇ／ｍｌの濃度で
ミマイクロプレートの列に沿って分取した。
上記ＢＡＰＮＡ溶液を、１ｍｌ〜２０ｍｌの緩衝液を添加することによって２
０倍に希釈した後、１００μｌのＢＡＰＮＡ希釈標準溶液を各ウェルに導入し、
完全に混合した。このプレートを４０分間３７℃で振盪しながらインキューベー
トした後、４０５ｎｍでのプレートリーダーで読みとった。
ウェル中のアプロチニン濃度に対する基質変換による光学濃度をプロットした
後、アプロチニンがトリプシン活性を中和するにちょうど十分である濃度での変
曲点を観察する。この変曲点の位置は、テストサンプルのウェル中にさらに導入
されたアプロチニンの量にしたがって移動し、この濃度は標準品と比較すること
によって推測することができる。これにより、油から放出されて水相に移りやす
いアプロチニンの割合が示される。
アプロチニンを、実施例４のプロトコルと同様にして超音波処理された大豆の
ホスファチジルコリン分散液（１００ｍｇ／ｍｌ蒸留水）１００μｌ、及びアプ
ロチニン溶液（２０ｍｇ／ｍｌ蒸留水）２５μｌの混合物を凍結乾燥し、次いで
１００μｌのミグリオール８１８(Miglyol 818)を添加することによって、ミグ
リオール８１８(Miglyol 818)中に可溶化した。アプロチニンの濃度は、油中で
５ｍｇ／ｍｌであった。コントロール溶液は、アプロチニンを使用しなかった以
外は、上記と同様にして調製した。これらの油の水性分散液を、１０μｌの各油
を１ｍｌのホウ酸緩衝液と共に１０秒間ボルテックスすることによって調製した
。これらの第二の分散液におけるアプロチニンの最終濃度は０および５０μｇ／
ｍｌであった。これらの分散液を２倍に希釈し、上記方法に記載
されたのと同様にしてマイクロプレートのウェルに添加し、この際、０、５、１
０、１５及び２５μｇ／ｍｌの希釈溶液を用いた。基準化された光学濃度を下記
表、および添付するグラフに示す。１２．５μｇ／ｍｌのコントロールの標準物
質との比較により、少なくとも５０％のアプロチニンが水相中に油から放出され
ることが示される。
実施例２
アプロチニンを、リン脂質分散液にホスファチジルコリンに加えて１０重量％
のホスファチジン酸を含ませた用いた以外は、上記実施例に記載したのと同様に
してミグリオール８１８(Miglyol 818)中に可溶化した。分散液を適切に試験し
、２５μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌのコントロールの標準物質と比較した
。これらの標準との比較によって、わずかに２５％のアプロチニンが水相中に放
出されることが示される。
実施例３
アプロチニンを、リン脂質分散液にホスファチジルコリンに加えて１０重量％
のコレステロールヘミスクシネート（Ｃｈｅｍｓ）を含ませた以外は、上記実施
例に記載したのと同様にしてミグリオール８１８中に可溶化した。該分散液を適
切に試験し、そして、２５、１２．５および６．２５μｇ／ｍｌのコントロール
の標準物質と比較した。これらの標準物質との比較により、わずかに１２．５％
のアプロチニンが水相中へ放出されることが示される。
実施例４
１００ｍｇ／ｇの懸濁液を含む、大豆のホスファチジルコリン（ｓｏｙ ＰＣ
）の水性分散液を調製し、窒素で完全にフラッシュし(flush)、８ミクロンのピ
ーク間の幅で超音波処理した。各アリコートに、氷スラリー浴中で３０秒間冷却
することによって３０秒のパルスを挿入して、全４分間の超音波処理を施した。
次に、得られた小さい単ラメラ小胞(small unilamellar vesicle)（ＳＵＶ）の
乳白色の分散液を１５分間遠心してチタン粒子を除去した。
コロイド金ゾルを以下のようにして調製した。１５μｌの２５ｍＭ炭酸カリウ
ム、１５μｌの１％タンニン酸及び５０ｍｇのクエン酸三ナトリウムを蒸留水
で総重量２２．５ｇに調製し、１０ｍｌを２５ｍｌの共せんガラス製コニカルフ
ラスコ（Ａ）に移し、ウォーターバス中で６０℃に加熱した。２５ｍｇの塩化金
三水和物を蒸留水で２５０ｍｇに調製し、得られた溶液５０μｌを５０ｍｌの共
せんガラス製コニカルフラスコ（Ｂ）中の４０ｍｌの蒸留水に添加し、同様のウ
ォーターバス中で６０℃に加熱した。フラスコＡの内容物をフラスコＢのものと
混合し、７５分間加熱し続けると、濃い赤色のコロイド金ゾルが形成された。室
温まで冷却した後、１０ｍｌの一部を２ｍｇのウシ血清アルブミンと混合するこ
とにより安定化させた。
１ｍｌの安定化金ゾルを０．６ｍｌのＳＵＶと混合し、一晩凍結乾燥し、得ら
れた凍結乾燥物を３００ｍｇのミグリオール８１８と共にボルテックスする(vor
texing)ことにより分散させた。１時間以内に、透明な赤色のミグリオールにお
けるコロイド金の分散液が形成された。この分散液の３個の５０ｍｇのアリコー
トをガラス製の小バイアル瓶に加えた後、５００ｍｇの水、リン酸緩衝グルコー
ス溶液（１ｍＭリン酸ナトリウムを含む３００ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）及
びＳＵＶを別のバイアル瓶に添加した。この混合物を１０秒間ボルテックスする
ことにより乳化させた後、観察した。
１時間以内に、乳濁液のクリーミングが生じ始め、一晩放置後、これは実質的
な範囲にまで起こった。すべての場合で、下方の水相がピンク色に着色されたの
が観察されたことから、一部のコロイド金が油相から放出されたことが示された
。しかしながら、ＳＵＶの存在下で乳化された調製物では、上方の油乳濁液相で
は保色性の度合いが有意により高く、下方の水相での保色性の度合いはそれに比
例してより低かった。これより、リン脂質のＳＵＶ分散液の存在は、油相からの
コロイド金の損失を抑制する役割を果たすと考えられた。実施例５
１ｍｌのインスリンの１％溶液（溶解を促進するために２％酢酸を含む）を１
μＣｉのＩ125−標識インスリンと混合した後、さらに、実施例３と同様にして
調製されたコレステロールヘミスクシネート含有ＳＵＶ ３ｇと混合した。この
混合物を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を、オービタルシェーカー(orbital s
haker)で４時間混合して、ミグリオール８１８ ３ｇで分散させることにより、
油における放射線標識されたインスリンの透明な分散液を得た。２００ｍｇの分
散液の２個のアリコートを、それぞれ、８００ｍｇのリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）と混合し、それぞれ、１０秒及び３０秒間ボルテックスすることにより乳
化した。各々の得られたｏ／ｗ乳濁液をさらに９ｍｌのＰＢＳで希釈した後、８
０，０００ｇで４０分間遠心して、その成分画分に分類した。油相の表面層を注
意深く残存したＩ125−標識インスリンによるガンマ放射能の計測用のバイアル
瓶に移した。放出されたＩ125−標識インスリンを含む上清を別のバイアル瓶に
移し、既に形成されたペレットを残した。ペレット、典型的な割合の上清及び残
った油画分すべてについて、油画分の上清による混入に関して適当な修正を行い
ながら、放射能を計測した。
２種の乳濁液のうち、一方を３０秒間ボルテックスしたところ、４５．４％の
放射線標識が油相内に保持され、３．０％は遠心によるペレット（本質的にリポ
ソームであると考えられる）に関連するものであることが示され、さらに、１０
秒間ボルテックスされた乳濁液に関する相当する数字は、それぞれ、４３．３．
及び１．３％であった。これに対して、油分散液を調製するのに使用したＳＵＶ
がｓｏｙ ＰＣ／Ｃｈｅｍｓではなく純粋なｓｏｙ ＰＣから構成される別の２
実験では、標識物の油における保持率は３１％及び２８％であり、各場合におけ
るペレットで
は１％であった。これより、油におけるタンパク質の分散液を調製するのに使用
される両親媒システムにＣｈｅｍｓを含ませることにより、後者が乳化されて第
二のｗ／ｏ分散液を形成する際には油内のタンパク質の保持率が向上すると考え
られる。実施例６
下記に列挙される組成物を使用する以外は実施例３に記載されたのと同様にし
て、Ｉ125−標識インスリンを調製し、油相中に導入した。
調製物１の１個の１００ｍｇのアリコート及び調製物２の同様のアリコートを
１０ｍｌの遠心管に秤量した。各アリコートに、１ｍｌのＰＢＳを添加した。す
べてを１０秒間完全にボルテックスした後、後者を１０ｍｌのＰＢＳで希釈した
。次に、実施例２に記載されたのと同様にして、乳濁液を遠心し、各成分相に分
画した。
得られたペレットは、高い割合のリン脂質を含む油から構成されると考えられ
る。ホスファチジン酸を含む調製物では、ホスファチジルコリン単独を含む調製
物に比べて、かなりより少量の放射線標識されたインスリンが水性上清に放出さ
れる。実施例７
下記に列挙される組成物を使用する以外は実施例２に記載されたのと同様にし
て、Ｉ125−標識インスリンを調製し、油相中に導入した。
調製物１の１個の１００ｍｇのアリコートを１０ｍｌの遠心管に秤量し、０．
５％カゼイン溶液１ｍｌを添加し、１０秒間完全にボルテックスした。次に、試
験管の内容物を１０ｍｌの０．５％カゼイン溶液で希釈した。さらに、実施例２
に記載されたのと同様にして、乳濁液を遠心し、各成分相に分画した。
表に示されるように、かなりの割合の放射線標識されたインスリンが油相内に
保持される。実施例８
０．８ｍｌの２５ｍＭ塩化カルシウムを、実施例１と同様にして調製された０
．８ｍｌのｓｏｙ ＰＣ ＳＵＶと混合し、一晩凍結乾燥し、得られた凍結乾燥
物を０．５ｇのミグリオール８１８と混合した。一晩放置した後、完全に透明な
分散液が形成された。一部の分散液は、１５０ｍｇを約０．１７ｍｇのスダン４
色素と混合し、透明な濃い赤色の溶液を形成することによって着色させた。２ｍ
ｌの１％アルギン酸ナトリウムをガラス製の試験に移し、短時間ボルテックスす
ると同時に、パスツールピペットから上記着色した油分散液を添加した。得られ
た不透明な乳濁液を５００ｇで５分間遠心し、上方のピンク色の油分を多量に含
む相を下方にある透明な水相からデカンテーションし、光学顕微鏡で観察した。
すべての油は、凝結
物の兆候を示さない数多くの小さな離散した液滴として存在していることが分か
った。一部の油の液滴は、油の液滴から放出されるカルシウムイオンによるアル
ギン酸塩の界面複合体形成(interfacial complexation)によるものであると推測
される外壁に囲まれていると考えられた。１２日間放置しても、顕微鏡によって
もあるいは肉眼によっても、乳濁液の破壊(breakdown)の兆候は依然としてなか
った。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Isolating agent The present invention relates to the use of a specific compound in the hydrophobic phase to help retain hydrophilic molecules that are solubilized in the hydrophobic phase when the generally insoluble hydrophobic phase is dispersed in the hydrophilic phase. It is about. In particular, the present invention relates to the use of the above-mentioned substances for the purpose of assisting the retention of hydrophilic macromolecules in the generally insoluble hydrophobic phase. For many applications, such as in the pharmaceutical sciences, food technology or the cosmetics industry, studies with proteins and similar macromolecules may interact with or become incorporated into the lipid phase due to their hydrophilicity and high polarity. However, there is a problem because the range in which it can be performed is limited. Many natural mechanisms utilize lipid barriers (eg, skin, cell membranes) to block access of hydrophilic molecules to internal compartments; dispersing proteins in lipid mediators The possibilities allow the development of new routes for incorporating such macromolecules into biological systems, whereby lipid media containing proteins can be used without eliminating the hydrophobic components of the barrier. Ingredients can be incorporated. Dispersions of hydrophilic substances in the oil phase rather than the aqueous medium have the further advantage of increasing stability with respect to temperature-mediated denaturation, hydrolysis, photosensitivity and the like. Oils are selected that maintain fluidity over a broader temperature range than aqueous solutions or that have greater viscosity to provide greater protection against physical damage. In a mixed-phase system, the introduction of hydrophobic substances into the oil can limit mutually detrimental interactions with other substances, for example oxidation, both in the oil and in the aqueous phase. There are examples of formulations containing both polymers and oils, one example of which is disclosed in EP-A-0366677. The formulations disclosed in the above publications are emulsions having a hydrophobic and a hydrophilic phase, wherein the hydrophobic phase comprises chylomicrons or chylomicron forming lipids. However, the polymer dissolves in the hydrophilic phase rather than the hydrophobic phase. EP-A-0521994 relates to compositions suitable for oral administration of macromolecules consisting of biologically active materials which associate with lecithin or compounds which can act as precursors of lecithin in vivo. . All exemplified compositions are formulations comprising a hydrophilic and a lipophilic phase. Again, in the above-mentioned conventional literature, the polymer dissolves in the hydrophilic phase instead of the lipophilic phase. Although the formulations described above do include polymers and oils, it is important in all cases that the polymers initially dissolve in the hydrophilic phase rather than the lipophilic phase. Attempts to form solutions that truly dissolve polymers in oil have met with limited success. Okahata et al. (J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1988, 1392-1394) disclose a method for solubilizing proteins in a hydrophobic solvent. However, in an array of proteins surrounded by amphipathic molecules produced by the above method, the authors conclude that the amphipathic molecules react with the proteins in a liquid medium by hydrogen bonding or via electrostatic interactions. It states that a solid precipitate forms. UK Patent Application No. 93235888.5 discloses a method by which a hydrophilic substance can be solubilized in a hydrophobic solvent which generally does not dissolve. The above method is based on the surprising discovery that when a hydrophilic substance is mixed with an amphiphile under certain conditions, the resulting composition is readily soluble in lipophilic solvents such as oils. However, one possible problem with the products of such a process is related to its use in the production of emulsions, for example by dispersing a single-phase hydrophobic preparation in a hydrophilic phase, such as water. There is. In such dispersions, at least in some cases, the hydrophilic material to be solubilized will tend to "leak" into the hydrophilic phase or reverse the solubilization process. Therefore, there is a need to suppress the above effects and retain the hydrophilic substance in the hydrophobic phase even when such a hydrophobic phase itself is later dispersed in the hydrophilic phase. Surprisingly, some compounds reduce the degree of direct interaction between the hydrophilic phase solubilized in the hydrophobic phase and the hydrophilic phase into which the hydrophobic phase is later dispersed, such as an emulsion. It was discovered that it could be done. Therefore, according to the first concept, the present invention relates to a method for producing a hydrophilic substance that is solubilized in a hydrophobic phase and a substance that suppresses a direct interaction between the hydrophilic phase in which the hydrophobic phase is dispersed. Provide use. In the present invention, the term "agent" is used to disperse a hydrophobic phase in which a hydrophilic substance is generally not dissolved in a hydrophilic substance, for example, when forming an emulsion, the hydrophobic phase is dispersed. A substance capable of suppressing a direct interaction between a hydrophilic substance solubilized during sex and the hydrophilic phase. According to a second concept, the present invention relates to a hydrophilic substance solubilized in a generally insoluble hydrophobic solvent and a hydrophilic phase in which the hydrophilic substance and a single-phase hydrophobic preparation are dispersed. A single-phase hydrophobic preparation comprising a substance that inhibits direct interaction between It is believed that the hydrophilic substance can contact the individual molecules of the hydrophilic phase, but not most of the hydrophilic phase, and therefore the leakage of the hydrophilic substance into the hydrophilic phase is suppressed. In the present invention, the term "hydrophilic species" means a substance which is usually soluble in aqueous solvents but insoluble in hydrophobic solvents. Preferably, the following substances are mentioned: (i) acidic lipids, for example cholesterol hemisuccinate (Chems) or phosphatidic acid; or (ii) a hydrophobic phase such as, for example, a compound such as casein. An emulsion stabilizer that cannot pass. According to a third concept, the invention also relates to hydrophilic substances solubilized in generally insoluble hydrophobic solvents, and to hydrophilic phases in which the hydrophobic phase is dispersed, such as emulsions. It provides a substance that can be used to suppress direct interactions between them. Preferably, the materials described in the specification are from UK Patent Application No. 9323588. Used in the solubilization process described in No. 5. Thus, according to a further concept, the present invention consists of: (i) hydrophilicity in a liquid medium such that no chemical interaction occurs between the amphiphile and the hydrophilic substance in the liquid medium Associating the substance with the amphiphile; (ii) an array of amphipathic molecules with the liquid medium removed and a hydrophilic head group directed towards the hydrophilic substance And (iii) providing a hydrophobic solvent around the hydrophilic / amphiphile array, providing a direct interaction between the hydrophilic material and the hydrophilic phase in which the hydrophobic phase is dispersed. It is intended to provide a method for preparing a single-phase hydrophobic preparation of a hydrophilic substance in a hydrophobic solvent, wherein the substance to be inhibited is added in one or more of the above steps. Preferably, in the above method, the substance is added in step (i) together with an amphiphile and a compound such as, for example, cholesterol hemisuccinate (Chems) or phosphatidic acid (PA) It is preferably an emulsion stabilizer which cannot pass through a hydrophobic phase such as the above. In the specification of the present invention, the term "chemical interaction" relates to an interaction such as a covalent or ionic bond or a hydrogen bond, and may include van der Waals forces or other magnitudes of this order. It is not intended to include interactions. According to another concept, the present invention relates to a hydrophilic phase, a hydrophilic solvent, a hydrophobic solvent, comprising a step of adding to the hydrophilic phase a substance that inhibits a direct interaction between the hydrophilic substance and the hydrophilic phase. It is intended to provide a method for dispersing a single-phase hydrophobic preparation comprising an active substance. In the above method, it is preferable that the substance is an emulsion stabilizer which cannot pass through a hydrophobic phase, such as a compound such as casein. A wide variety of macromolecules can be appropriately solubilized using the method of the present invention. Generally, it is generally not very difficult to solubilize a hydrophobic polymer in an oil solution, so that the polymer compound is usually hydrophilic or has at least a hydrophilic region. Examples of suitable macromolecules include proteins and glycoproteins, oligo- or polynucleic acids such as DNA and RNA, polysaccharides and, optionally, whole cells or organelles or viruses (whole or whole). (A part thereof), or a supermolecular assembly of any of these. It is also convenient to co-solubilize macromolecules, especially polysaccharides such as cyclodextrin, and small molecules such as vitamins together. Vitamin B 12 And the like may also be chemically conjugated to the polymer and included in the composition. In particular, when the polymer to be solubilized is a protein or polypeptide, the substance is preferably an acidic lipid. Examples of proteins preferably solubilized by the method of the present invention include insulin, calcitonin, hemoglobin, cytochrome C, horseradish peroxidase, aprotinin, mushroom tyrosinase, erythropoietin, somatotropin, growth hormone, growth hormone releasing factor, galanin ( galanin), urokinase, factor IX, tissue plasminogen activator, superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ferritin, interferon, factor VIII, melanin and fragments thereof (all of the above proteins are from suitable sources). Can be Other polymers that can be used include FITC-labeled dextran and RNA extracts from Torulla yeast. In addition to macromolecules, the method of the present invention can also be used to solubilize smaller organic molecules. Examples of small organic molecules include many drugs, such as glucose, ascorbic acid, carboxyfluorescin, and anticancer drugs, but the method is useful for treating other small organic molecules, such as other vitamins or pharmaceutically. Alternatively, it goes without saying that the same can be used for a biologically active substance. In addition, molecules such as calcium chloride and sodium phosphate can also be solubilized using the methods of the present invention. The present invention relates to pharmaceutically and biologically active substances because the use of non-aqueous solutions allows routes for molecules to enter the body and change, e.g. to enhance bioavailability. Particularly preferred. Other types of materials included in the hydrophobic compositions of the present invention are inorganic materials such as small inorganic molecules or colloidal materials such as colloidal metals. The method of the present invention is capable of retaining the properties of colloidal metals such as colloidal gold, palladium, platinum or rhodium, even in hydrophobic solvents where the particles agglomerate under typical circumstances. This is particularly useful as a catalyst for reactions performed in organic solvents. There are many amphiphiles used in the present invention, and zwitterionic amphiphiles such as phospholipids are among those known to be particularly preferred. Phospholipids having a phosphatidylcholine head group are particularly preferably used. Examples of such phospholipids include phosphatidylcholine (PC) itself, lyso-phosphatidylcholine (lyso-PC), sphingomyelin, hexadecylphosphocholine and the like. And halogenated amphiphiles such as fluoronated phospholipids. In this application, the terms "phosphatidylcholine (PC)" and "lecithin" are used interchangeably. Suitable natural lecithins may be from known sources such as, for example, eggs, and especially soy. In most cases, it is preferable to choose an amphiphile that is chemically similar to the hydrophobic solvent used, and this is described in more detail below. The fact that we have found that zwitterionic amphiphiles, such as phospholipids, are particularly preferably used in the present method further increases the significant difference between the present invention and the method of Okahata et al. It is shown. In addition, the authors of the prior art have concluded that anionic and zwitterionic lipids were not at all suitable for use in their method, and that with these lipids the yield of the conjugate was reduced. Said it was zero. The hydrophobic solvent used will depend on the purpose for which the composition is used, the type of material solubilized and the amphiphile. Suitable solvents include mineral oils, non-polar oils such as squalane and squalene, long-chain fatty acids (preferably unsaturated fatty acids such as oleic acid and linolenic acid), alcohols, especially medium-chain alcohols such as octanol and phytol. Branched long-chain alcohols such as, isoprenoids such as nerol and geraniol, monoglycerides such as terpineol, glycerol monooleate (GMO), other esters such as ethyl acetate, amyl acetate and bornyl acetate, diglycerides and triglycerides, In particular, mention may be made of medium-chain triglycerides and mixtures thereof, halogenated oils such as long-chain fluorocarbons or halogenated analogues of any of the above, such as iodinated triglycerides such as lipidiol. Optimum results are usually obtained with appropriate use of hydrophobic solvents and amphiphiles. For example, for solvents such as oleic acid, lyso-PC is the preferred amphipathic substance over PC, and vice versa when the hydrophobic solvent is triglyceride. Further, it has been found that in some cases, it is preferable to add a large amount of amphiphile to the hydrophobic solvent before contacting the hydrophilic / amphiphile array. This indicates that the high affinity of the amphiphile for the hydrophobic solvent does not remove the amphiphilic molecule from the position around the hydrophilic material. It is highly preferred that the preparations according to the invention are transparent to the naked eye and, moreover, can be detected by measuring turbidity at visible wavelengths and, optionally, by examining sedimentation for a certain period of time. The orientation of the amphipathic molecules into the array, where the hydrophilic head group faces the hydrophilic moiety, can be varied and examples of particularly suitable methods are described in more detail below. Kirby et al. (Biotechnology, November 1984, pages 997-984 and Liposome Technology, Volume I, pages 19-27, by Gregoriadis, CLC Press, Inc., Boca Layton. The first method has a starting point similar to that described by Gregoriadis, Ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA). By mixing with the dispersion of the amphiphile, the amphiphilic molecules form an aggregate with the hydrophilic head group facing outward towards the hydrophilic phase containing the hydrophilic substance. Next, the hydrophilic solvent is removed, leaving a dry composition in which the hydrophilic head group of amphiphilic molecules is directed toward the hydrophilic substance. In the method of Okahata et al, the protein solution was also mixed with a dispersion of the amphiphile in water. However, the authors of the above document believed that it was necessary to obtain a precipitate which became more soluble in hydrophobic solvents. Okahata et al. Concluded that many of the preferred amphiphiles of the present invention do not form such precipitates, so they cannot be used. According to the process of the present invention, no precipitate is required, but rather, it is generally believed that it is undesirable to form a precipitate because the yield of the desired product is reduced. According to the first method, other polar solvents may be used, but the hydrophilic solvent is preferably water. The form taken by the assemblage of amphiphiles may be micelles, unilamellar vesicles, preferably small unilamellar vesicles, usually considered to have a diameter of about 25 nm, multilamellar vesicles or tubular structures such as spirals Cylinder, hexagonal phase, cubic phase or myelin type structure. The form used depends on the amphiphile used; for example, amphiphiles such as phosphatidylcholine (PC) tend to form small unilamellar vesicles, whereas lyso-phosphatidylcholine forms micelles. However, in all of these structures, the hydrophobic tail of the amphiphilic molecule faces inward toward the center of the structure, while the hydrophilic headgroup faces the solvent in which the hydrophilic material is dispersed. Facing outwards. The weight ratio of amphiphile: hydrophile is usually in the range 1: 1 to 100: 1, preferably 2: 1 to 20: 1, most preferably about 8: 1 for PC. , 4: 1 for lyso-PC. It should be pointed out that these proportions are only preferred proportions, in particular that the upper limit is set by economic considerations that it is preferred to use the smallest possible amount of amphiphile. The lower limit is more critical, and it is believed that only a 2: 1 or lower ratio is used when the hydrophilic material has a significant hydrophobic portion or is very large. It can be carried out well if the solvent is removed quickly, and the known solvent removal method is a freeze-drying method, but other methods may be used. In some cases, particularly when the hydrophilic substance is a polymer compound such as a large protein, it is useful to include a salt in the hydrophilic solution. However, it is preferable to use an organic salt instead of an inorganic salt such as sodium chloride since crystals are likely to be formed due to the presence of a large amount of the inorganic salt and a cloudy solution is easily formed. Ammonium acetate is particularly preferred for this purpose because it has the further advantage that it can be easily removed by lyophilization. A second method of preparing a composition comprising an array of amphiphiles in which the head group is oriented towards the hydrophilic moiety is to solubilize the hydrophilic and amphiphiles together in a shared solvent (co -solubilise) to remove the solvent. The products of the process of the invention are new. Thus, according to a further concept of the present invention, there is provided a single-phase hydrophobic preparation comprising a hydrophilic substance in a hydrophobic solvent obtained by the method of the present invention. It is also desirable to include other components in the single-phase hydrophobic preparation in addition to the hydrophilic substance. This is often particularly preferred when the hydrophilic substance is a macromolecule, in which case the preparation may be, for example, bile salts, vitamins or other polymers that bind or associate with the macromolecule. It may contain small molecules. Some polymer / amphiphile arrays are disclosed by Kirby et al., Supra, but all of the disclosed arrays are intermediates in the formation of liposomes, and as described above, Non-liposomal or hydrophobic compositions consisting of Thus, the arrays of the invention, which are not considered to form liposomes because the amphiphiles do not form small unilamellar vesicles, are novel. One advantage of the preparations according to the invention is that they are essentially anhydrous and therefore more stable to hydrolysis. Also, in the case of proteins, the preparations are stable to freeze-thaw and have greater stability at elevated temperatures, since it is believed that water must be present for protein to unfold and denature. This means that it is believed to have a much longer lifespan compared to aqueous preparations of hydrophilic substances. The solutions of the present invention are very versatile and have many uses. They may also be used alone, but are preferably used in combination with the aqueous phase to form an emulsion or similar two-phase composition, which forms a further concept of the present invention. is there. According to the above concept of the present invention, there is provided a two-phase composition comprising a hydrophilic phase and a hydrophobic phase, wherein the hydrophobic phase comprises a preparation of a hydrophilic substance in a lipophilic solvent obtained by the above method. It provides a two-phase composition. Generally, in such types of compositions, the hydrophobic phase is dispersed in the hydrophilic phase. The two-phase composition may be a temporary or stable emulsion, depending on the required purpose. The average size of the emulsion particles depends on the nature of both the hydrophobic and aqueous phases. However, it is in the range of about 2 μm. The dispersion of the hydrophobic preparation in the aqueous phase may be vigorously vortexed for a short period of time, such as, for example, for about 10-60 seconds, typically about 15 seconds, or by an orbital shaker, for example. It is obtained by gently mixing for several hours. According to another concept, the present invention relates to a substance which suppresses a direct interaction between a hydrophilic phase when solubilized and a hydrophilic phase in which a hydrophobic phase for solubilizing the hydrophilic substance is dispersed. An object of the present invention is to provide a method for preparing a dispersion of a hydrophobic phase, such as an emulsion, comprising dispersing a hydrophobic phase in a previously added hydrophilic phase. The present invention will be further described with reference to the following examples, which, needless to say, do not limit the present invention. Example 1 A 0.0015 M borate buffer was prepared by dissolving 60 mg of sodium tetraborate in 100 ml of distilled water and adjusting to pH 8.00. 5 mg of BAPNA was weighed into a B9 glass screw cap vial and dissolved in 3 ml of methanol. 10 mg of trypsin was weighed into a 15 ml plastic centrifuge and 10 ml of borate buffer was added with vortexing. After mixing the suspension with a roller mixer, the undissolved material was spun down and the supernatant was decanted. A diluted solution of aprotinin (50 μl / well) was aliquoted along the rows of the microplate at a concentration of 0-30 μg / ml. After diluting the BAPNA solution 20-fold by adding 1 ml to 20 ml of buffer, 100 μl of BAPNA diluted standard solution was introduced into each well and mixed thoroughly. The plate was incubated for 40 minutes with shaking at 37 ° C. before reading on a plate reader at 405 nm. After plotting the optical density due to substrate conversion against the aprotinin concentration in the wells, observe the inflection point at a concentration where aprotinin is just enough to neutralize trypsin activity. The location of this inflection point shifts according to the amount of aprotinin further introduced into the wells of the test sample, and this concentration can be inferred by comparison with a standard. This indicates the proportion of aprotinin released from the oil and easily transferred to the aqueous phase. Aprotinin was lyophilized from a mixture of 100 μl of a soybean phosphatidylcholine dispersion (100 mg / ml distilled water) sonicated as in Example 4 protocol and 25 μl of aprotinin solution (20 mg / ml distilled water), Solubilized in Miglyol 818 (Miglyol 818) by adding 100 μl of Miglyol 818. The concentration of aprotinin was 5 mg / ml in the oil. The control solution was prepared as described above, except that no aprotinin was used. Aqueous dispersions of these oils were prepared by vortexing 10 μl of each oil with 1 ml of borate buffer for 10 seconds. The final concentrations of aprotinin in these second dispersions were 0 and 50 μg / ml. These dispersions were diluted two-fold and added to the wells of a microplate as described in the above method, using 0, 5, 10, 15, and 25 μg / ml of the diluted solutions. Was. The normalized optical densities are shown in the following table and attached graphs. Comparison with the control standard of 12.5 μg / ml shows that at least 50% of aprotinin is released from the oil in the aqueous phase. Example 2 Aprotinin was solubilized in Miglyol 818 (Miglyol 818) as described in the above example, except that the phospholipid dispersion was used in addition to phosphatidylcholine and 10% by weight of phosphatidic acid. The dispersion was tested appropriately and compared to 25 μg / ml and 12.5 μg / ml control standards. Comparison with these standards shows that only 25% of aprotinin is released into the aqueous phase. Example 3 Aprotinin was solubilized in Miglyol 818 as described in the above example, except that the phospholipid dispersion contained 10% by weight of cholesterol hemisuccinate (Chems) in addition to phosphatidylcholine. The dispersion was tested appropriately and compared to control standards of 25, 12.5 and 6.25 μg / ml. Comparison with these standards shows that only 12.5% of aprotinin is released into the aqueous phase. Example 4 An aqueous dispersion of soy phosphatidylcholine (soy PC) containing a 100 mg / g suspension was prepared, flushed completely with nitrogen, and sonicated with a peak-to-peak width of 8 microns. Each aliquot was pulsed for 30 seconds by cooling in an ice slurry bath for 30 seconds and sonicated for a total of 4 minutes. The resulting milky white dispersion of small unilamellar vesicles (SUVs) was then centrifuged for 15 minutes to remove titanium particles. A colloidal gold sol was prepared as follows. 15 μl of 25 mM potassium carbonate, 15 μl of 1% tannic acid and 50 mg of trisodium citrate were prepared with distilled water to a total weight of 22.5 g, 10 ml was transferred to a 25 ml conical glass conical flask (A), and a water bath was prepared. Heated to 60 ° C. 25 mg of gold chloride trihydrate was adjusted to 250 mg with distilled water, 50 μl of the obtained solution was added to 40 ml of distilled water in a 50 ml conical glass flask (B), and the same water bath was used. Heated to 60 ° C. The contents of Flask A were mixed with those of Flask B and continued to heat for 75 minutes, forming a deep red colloidal gold sol. After cooling to room temperature, 10 ml aliquots were stabilized by mixing with 2 mg bovine serum albumin. 1 ml of stabilized gold sol was mixed with 0.6 ml of SUV, lyophilized overnight, and the resulting lyophilizate was dispersed by vortexing with 300 mg of Miglyol 818. Within one hour, a dispersion of colloidal gold in clear red miglyol was formed. After adding three 50 mg aliquots of this dispersion to a small glass vial, 500 mg of water, phosphate buffered glucose solution (300 mM glucose with 1 mM sodium phosphate, pH 7.4) and SUV were added to another. Added to vial. The mixture was emulsified by vortexing for 10 seconds and then observed. Within an hour, creaming of the emulsion began to occur, and after standing overnight, this had occurred to a substantial extent. In all cases, the lower aqueous phase was observed to be colored pink, indicating that some colloidal gold had been released from the oil phase. However, in preparations emulsified in the presence of SUVs, the degree of color retention is significantly higher in the upper oil emulsion phase and proportionally lower in the lower aqueous phase. Was. This suggests that the presence of the phospholipid SUV dispersion plays a role in suppressing the loss of colloidal gold from the oil phase. Example 5 1 ml of a 1% solution of insulin (containing 2% acetic acid to facilitate dissolution) was added to 1 μCi of I 125 -After mixing with labeled insulin, it was further mixed with 3 g of cholesterol hemisuccinate-containing SUV prepared as in Example 3. This mixture was lyophilized and the resulting lyophilizate was mixed on an orbital shaker for 4 hours and dispersed with 38.3 g of migliol 8183 to give a clear dispersion of radiolabeled insulin in oil I got Two aliquots of the 200 mg dispersion were each mixed with 800 mg of phosphate buffered saline (PBS) and emulsified by vortexing for 10 and 30 seconds, respectively. Each of the obtained o / w emulsions was further diluted with 9 ml of PBS, and then centrifuged at 80,000 g for 40 minutes to classify into component fractions. I carefully preserved the surface layer of the oil phase. 125 -Transferred to vial for measurement of gamma activity with labeled insulin. I released 125 -The supernatant containing the labeled insulin was transferred to another vial, leaving the pellet already formed. Radioactivity was measured for the pellet, a typical percentage of the supernatant, and all remaining oil fractions, with appropriate corrections for contamination by oil fraction supernatants. Vortexing one of the two emulsions for 30 seconds resulted in 45.4% of the radiolabel retained in the oil phase and 3.0% of the pellet by centrifugation (considered to be essentially liposomes). ), And the corresponding figures for emulsions vortexed for 10 seconds, respectively, are 43.3. And 1.3%. In contrast, in two other experiments where the SUV used to prepare the oil dispersion consisted of pure soy PC instead of soy PC / Chems, the retention of labeled in oil was 31% and 28%. And 1% for the pellets in each case. Thus, by including Chems in the amphipathic system used to prepare the dispersion of protein in oil, the latter is emulsified to form a second w / o dispersion when the latter is emulsified to form a second w / o dispersion. It is believed that the protein retention is improved. Example 6 In a similar manner to that described in Example 3, except that the compositions listed below were used, I 125 -Labeled insulin was prepared and introduced into the oil phase. One 100 mg aliquot of Preparation 1 and a similar aliquot of Preparation 2 were weighed into a 10 ml centrifuge tube. To each aliquot, 1 ml of PBS was added. After vortexing completely for 10 seconds, the latter was diluted with 10 ml of PBS. Next, the emulsion was centrifuged and fractionated into each component phase as described in Example 2. The resulting pellets are believed to be composed of an oil containing a high proportion of phospholipids. Preparations containing phosphatidic acid release significantly less radiolabeled insulin into the aqueous supernatant as compared to preparations containing phosphatidylcholine alone. Example 7 In a manner similar to that described in Example 2, except that the compositions listed below were used, I 125 -Labeled insulin was prepared and introduced into the oil phase. One 100 mg aliquot of Preparation 1 was weighed into a 10 ml centrifuge tube, and One ml of a 5% casein solution was added and vortexed completely for 10 seconds. Next, the contents of the test tube were diluted with 10 ml of a 0.5% casein solution. Further, the emulsion was centrifuged and fractionated into each component phase in the same manner as described in Example 2. As shown in the table, a significant proportion of the radiolabeled insulin is retained in the oil phase. Example 8 0.8 ml of 25 mM calcium chloride was prepared as in Example 1. It was mixed with 8 ml of soy PC SUV, lyophilized overnight, and the resulting lyophilizate was mixed with 0.5 g of miglyol 818. After standing overnight, a completely clear dispersion was formed. Some dispersions were colored by mixing 150 mg with about 0.17 mg of Sudan 4 dye to form a clear, deep red solution. 2 ml of 1% sodium alginate was transferred to a glass test and vortexed briefly while adding the above colored oil dispersion from a Pasteur pipette. The resulting opaque emulsion was centrifuged at 500 g for 5 minutes, the upper pink oily phase decanted from the lower clear aqueous phase and observed with an optical microscope. All oils were found to be present as a number of small discrete droplets showing no signs of condensation. Some oil droplets were thought to be surrounded by the outer wall, presumably due to interfacial complexation of alginate by calcium ions released from the oil droplets. After standing for 12 days, there was still no evidence of emulsion breakdown, either by microscope or by the naked eye.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項
【提出日】１９９７年１月１７日
【補正内容】
請求の範囲
１．疎水性相が親水性のヘッドグループが疎水性溶剤中に分散される親水性物質
の方を向いた両親媒性分子のアレイからなる、疎水性相中に可溶化される親水性
物質及び該疎水性相が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑制する物
質の使用。
２．該物質が疎水性相を通過できない乳化安定剤または酸性脂質である、請求の
範囲第１項に記載の使用。
３．該物質がコレステロールヘミスクシネート（Ｃｈｅｍｓ）、ホスファチジン
酸（ＰＡ）またはカゼインである、請求の範囲第２項に記載の使用。
４．親水性のヘッドグループが疎水性溶剤中に分散される親水性物質の方を向い
た両親媒性分子のアレイからなる単相の疎水性調製物において、該調製物が親水
性物質および疎水性調製物が分散される親水性相との間の直接的な相互作用を抑
制する物質からなることを特徴とする単相の疎水性調製物。
５．以下ＡまたはＢよりなる：
Ａ．ｉ）親水性物質を溶剤における両親媒性物質の溶液または分散液と混合す
る；
ｉｉ）溶剤を除去して両親媒性分子の親水性のヘッドグループが親水性物
質の方を向いた乾燥組成物を残す；及び
ｉｉｉ）親水性物質／両親媒性物質のアレイの周りに疎水性溶剤を供給す
る；または
Ｂ．ｉ）疎水性溶剤における両親媒性物質の溶液を親水性溶剤における親水性
物質の溶液で乳化して乳濁液を得る；及び
ｉｉ）該疎水性溶剤を除去する
疎水性溶剤における親水性物質からなる単相の疎水性調製物の調製方法において
、
親水性物質及び疎水性調製物が分散される親水性相の間の直接的な相互作用を抑
制する物質を一またはすべての上記段階で添加することを特徴とする調製方法。
６．該物質が酸性脂質である、請求の範囲第５項に記載の方法。
７．該物質がコレステロールヘミスクシネート（Ｃｈｅｍｓ）またはホスファチ
ジン酸（ＰＡ）である、請求の範囲第６項に記載の方法。
８．親水性相における、親水性のヘッドグループが疎水性溶剤中に分散される親
水性物質の方を向いた両親媒性分子のアレイからなる単相の疎水性調製物の分散
方法において、該方法がさらに親水性物質及び親水性相の間の直接的な相互作用
を抑制する物質を親水性相に添加する段階からなることを特徴とする分散方法。
９．該物質が疎水性相を通過できない乳化安定剤である、請求の範囲第８項に記
載の方法。
１０．該物質がカゼインである、請求の範囲第９項に記載の方法。
１１．該親水性物質がタンパク質、糖タンパク質、オリゴ−及びポリ核酸、多糖
およびこれらの超分子集合体からなる群から選ばれるものである、請求の範囲第
１項から第３項のいずれかに記載の使用、請求の範囲第４項に記載の調製物、ま
たは請求の範囲第５項から第１０項のいずれかに記載の方法。
１２．該親水性物質がインスリン、カルシトニン、ヘモグロビン、シトクロムＣ
、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アプロチニン、マッシュルームのチロシナー
ゼ、エリトロポエチン、ソマトトロピン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子
、ガラニン、ウロキナーゼ、因子ＩＸ、組織プラスミノーゲン活性化因子、スー
パーオキシドジスムターゼ、カタラ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、フェリチン、インターフェロン、因子ＶＩＩＩ、メラ
ニン、これらの断片、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＦＩＴＣ−標識デキストランまたはビタ
ミンＢ12である、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用、請求の
範囲第４項に記載の調製物、または請求の範囲第５項から第１０項のいずれかに
記載の方法。
１３．該両親媒性物質がリン脂質である、請求の範囲第１項から第１２項のいず
れかに記載の使用、調製物または方法。
１４．該リン脂質がホスファチジルコリンのヘッドグループを有する、請求の範
囲第１３項に記載の使用、調製物または方法。
１５．該リン脂質がホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾ−ホスファチジルコリ
ン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、スフィンゴミエリン、ヘキサデシルホスホコリン等の上
記いずれかの誘導体またはホスホリルコリンを含む両親媒性ポリマーである、請
求の範囲第１４項に記載の使用、調製物または方法。
１６．該疎水性溶剤が長鎖の脂肪酸、中鎖のアルコール、枝分れ長鎖アルコール
、モノグリセリド、ジグリセリド、中鎖のトリグリセリドまたは長鎖のトリグリ
セリドからなる、請求の範囲第４項から第１５項のいずれかに記載の調製物また
は方法。
１７．該リン脂質がＰＣからなりかつ該疎水性溶剤がトリグリセリドであるまた
は該リン脂質がｌｙｓｏ−ＰＣからなり該疎水性溶剤がオレイン酸である、請求
の範囲第１６項に記載の調製物または方法。
１８．方法Ａを使用し、かつ段階（ｉ）において、親水性物質を水における両親
媒製物質の分散液と混合する、請求の範囲第５項に記載の方法。
１９．両親媒性物質の集合体がミセル、単ラメラ小胞、多重ラメラ小胞または渦
巻形のシリンダー等の管状構造物、六角形相、立方形相またはミエリン型構造物
からなる、請求の範囲第１８項に記載の方法。
２０．水は凍結乾燥によって除去される、請求の範囲第１８項または第１９項に
記載の方法。
２１．方法Ｂを使用し、かつ親水性物質に対する両親媒性物質の重量比が約１：
１〜５０：１である、請求の範囲第５項に記載の方法。
２２．該乳濁液が油中水型乳濁液である、請求の範囲第２１項に記載の方法。
２３．該疎水性溶剤が低沸点の有機エーテルである、請求の範囲第２１項または
第２２項に記載の方法。
２４．請求の範囲第５項、第７項または第１１項から第２３項のいずれかに記載
の方法によって得られる疎水性溶剤における親水性物質の単相の疎水性調製物。
２５．疎水性相が請求の範囲第４項または第２４項に記載の調製物からなる、親
水性相及び疎水性相らなる２相組成物。
２６．該疎水性相が連続した親水性相中に分散される、請求の範囲第２５項に記
載の組成物。
２７．乳濁液である、請求の範囲第２５項または第２６項に記載の組成物。
２８．親水性物質の経口投与における請求の範囲第４項若しくは第１１項から第
１７項のいずれかに記載の調製物、請求の範囲第２４項に記載の調製物または請
求の範囲第２５項から第２８項のいずれかに記載の組成物の使用。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] January 17, 1997 [Content of Amendment] Claims 1. A hydrophilic substance solubilized in a hydrophobic phase, comprising an array of amphipathic molecules whose hydrophobic group is a hydrophilic head group directed toward the hydrophilic substance dispersed in a hydrophobic solvent; Use of substances that suppress direct interaction between the hydrophilic phases in which the sexual phases are dispersed. 2. The use according to claim 1, wherein the substance is an emulsion stabilizer or an acidic lipid that cannot pass through the hydrophobic phase. 3. 3. Use according to claim 2, wherein said substance is cholesterol hemisuccinate (Chems), phosphatidic acid (PA) or casein. 4. A monophasic hydrophobic preparation comprising an array of amphipathic molecules whose hydrophilic headgroup is oriented towards a hydrophilic substance dispersed in a hydrophobic solvent, the preparation comprising a hydrophilic substance and a hydrophobic preparation. A monophasic hydrophobic preparation, characterized in that it consists of a substance which inhibits a direct interaction with the hydrophilic phase in which the substance is dispersed. 5. The following consists of A or B: i) mixing the hydrophilic substance with a solution or dispersion of the amphiphile in a solvent; ii) removing the solvent and leaving the hydrophilic headgroup of the amphipathic molecules towards the hydrophilic substance And iii) supplying a hydrophobic solvent around the hydrophilic / amphiphile array; or i) emulsifying a solution of the amphiphile in a hydrophobic solvent with a solution of the hydrophilic material in a hydrophilic solvent to obtain an emulsion; and ii) removing the hydrophobic solvent from the hydrophilic material in the hydrophobic solvent. In a method for preparing a single-phase hydrophobic preparation, a substance which inhibits a direct interaction between the hydrophilic substance and the hydrophilic phase in which the hydrophobic preparation is dispersed is added in one or all of the above steps A preparation method characterized in that: 6. The method according to claim 5, wherein the substance is an acidic lipid. 7. 7. The method according to claim 6, wherein said substance is cholesterol hemisuccinate (Chems) or phosphatidic acid (PA). 8. A method for dispersing a single-phase hydrophobic preparation comprising an array of amphipathic molecules in a hydrophilic phase, wherein a hydrophilic headgroup is dispersed in a hydrophobic solvent toward a hydrophilic substance, wherein the method comprises: A dispersion method, further comprising a step of adding a substance that suppresses a direct interaction between the hydrophilic substance and the hydrophilic phase to the hydrophilic phase. 9. 9. The method according to claim 8, wherein said substance is an emulsion stabilizer which cannot pass through the hydrophobic phase. 10. 10. The method according to claim 9, wherein said substance is casein. 11. The hydrophilic substance according to any one of claims 1 to 3, wherein the hydrophilic substance is selected from the group consisting of proteins, glycoproteins, oligo- and polynucleic acids, polysaccharides, and supramolecular assemblies thereof. Use, a preparation according to claim 4 or a method according to any of claims 5 to 10. 12. The hydrophilic substance may be insulin, calcitonin, hemoglobin, cytochrome C, horseradish peroxidase, aprotinin, mushroom tyrosinase, erythropoietin, somatotropin, growth hormone, growth hormone releasing factor, galanin, urokinase, factor IX, tissue plasminogen activation factor, superoxide dismutase, catalase, peroxidase, ferritin, interferon, factor VIII, melanin, these fragments, DNA, RNA, a FITC- labeled dextran or vitamin B 12, any of claim 1, wherein the third term A use according to any of the preceding claims, a preparation according to claim 4 or a method according to any of claims 5 to 10. 13. 13. Use, preparation or method according to any of claims 1 to 12, wherein said amphiphile is a phospholipid. 14． 14. The use, preparation or method according to claim 13, wherein said phospholipid has a phosphatidylcholine head group. 15. 15. The method according to claim 14, wherein the phospholipid is an amphiphilic polymer containing any of the above derivatives such as phosphatidylcholine (PC), lyso-phosphatidylcholine (lyso-PC), sphingomyelin, hexadecylphosphocholine, or phosphorylcholine. The use, preparation or method as described. 16. 16. The method according to claim 4, wherein the hydrophobic solvent comprises a long-chain fatty acid, a medium-chain alcohol, a branched long-chain alcohol, a monoglyceride, a diglyceride, a medium-chain triglyceride or a long-chain triglyceride. A preparation or a method according to 17． 17. The preparation or method according to claim 16, wherein said phospholipid comprises PC and said hydrophobic solvent is triglyceride or said phospholipid comprises lyso-PC and said hydrophobic solvent is oleic acid. 18. 6. The method according to claim 5, wherein method A is used and in step (i) the hydrophilic substance is mixed with a dispersion of the amphiphile substance in water. 19. 19. The method according to claim 18, wherein the aggregate of the amphiphilic substance comprises a tubular structure such as a micelle, a unilamellar vesicle, a multilamellar vesicle or a spiral cylinder, a hexagonal phase, a cubic phase or a myelin-type structure. The described method. 20. 20. A method according to claim 18 or claim 19, wherein the water is removed by lyophilization. 21. A method according to claim 5, wherein method B is used and the weight ratio of amphiphile to hydrophilic substance is from about 1: 1 to 50: 1. 22. 22. The method according to claim 21, wherein said emulsion is a water-in-oil emulsion. 23. 23. The method according to claim 21 or claim 22, wherein said hydrophobic solvent is a low boiling organic ether. 24. 24. A single-phase hydrophobic preparation of a hydrophilic substance in a hydrophobic solvent obtained by a method according to any one of claims 5, 7 or 11 to 23. 25. A two-phase composition comprising a hydrophilic phase and a hydrophobic phase, wherein the hydrophobic phase comprises the preparation according to claim 4 or 24. 26. 26. The composition according to claim 25, wherein said hydrophobic phase is dispersed in a continuous hydrophilic phase. 27. 27. The composition according to claim 25 or 26, which is an emulsion. 28. The preparation according to any one of claims 4 or 11 to 17, the preparation according to claim 24, or the preparation according to claims 25 to 25 for oral administration of a hydrophilic substance. Use of a composition according to any of the items 28.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ
Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ
Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，
ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ
Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ
，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，
ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ
(72)発明者 カービー，クリストファー，ジョン
イギリス国，バークシャイアー アールジ
ー11 ２ワイエル，ウァーキングハム，オ
ックスフォード ロード 95────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M
C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG
, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN,
TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, U
G), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, B
Y, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES
, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG,
KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, L
V, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ
, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI,
SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, V
N
(72) Inventors Kirby, Christopher, John
Berkshire Arge, United Kingdom
-11 2 Weier, Workingham, Oh
Xford road 95