【発明の詳細な説明】
唾液の分析方法
本発明は、唾液の処理方法に関するものである。特に、本発明はヘリコバクタ
ー ピロリ(H．pylori)に対する抗原の存在に関する診断試験に使用される唾液
の処理方法に関するものである。
唾液は、口腔内の様々な腺由来の分泌物の複雑な混合物である。多くの構成成
分の中には、様々な酵素、免疫グロブリン及びムチンが細胞破壊片や細菌叢の宿
主と共にある。特に、ムチンは唾液の粘弾性に応答し、保護及び抗細菌特性を有
する潤滑剤として作用する。これらの糖タンパク質の粘弾性は合成中に得られる
タンパク質及び炭水化物組成物に依存するが、唾液の他の成分との相互作用の程
度によっても影響を受ける。例えば、脂質は、唾液の粘弾性にかなり貢献する。
免疫グロブリンを含む唾液は、様々な病気の診断に使用することができる。特
に、病原体によって産生される抗原に特異的なＩｇＧの検出は感染または最近の
保菌者(recent contact)を示す。このような感染の一例としては、ヘリコバクタ
ー ピロリ(H．pylori)によって引き起こされるものがある。ヘリコバクター
ピロリ（H.pylori）の感染の診断は、顕微鏡、微生物の培養若しくは胃粘膜の生
検におけるウレアーゼの検出、尿素呼気試験によってまたはＥＬＩＳＡによって
検出される血清中の特異的抗体の存在によってなされる。ヘリコバクター ピロ
リ(H．pylori)は、胃粘膜に感染し、胃の分泌物の粘液中に検出されるＩｇＡ抗
体反応を誘発すると考えられる。
しかしながら、粘液分泌物中で見付かった主なヘリコバクター ピロリ(H．py
lori)に特異的な抗体はＩｇＧクラスであり、ＩｇＡではないことが発見された
。ＡＵ−Ａ−９０６７６７６号には、哺乳動物におけるヘリコバクター ピロリ
(H．pylori)微生物による感染の検出手段となる、ヘリコバクター ピロリ(H．p
ylori)
抗原に特異的な粘液分泌物のＩｇＧの検出方法が記載される。相当する文献とし
ては、ウィット(Witt)ら、フロンティアーズ イン ムコサル イムノロジー(F
rontiers in Mucosal Immunology)、１巻、頁６９３〜６９６（１９９１年）が
ある。
ヘリコバクター ピロリ(H．pylori) （カンピロバクター ピロリ(Campylob
acter pylori)）陽性患者の唾液中のＩｇＧ抗体の存在は、アメリカン ガスト
ロエンテロロジカル アソシエーション(American Gastroenterological Associ
ation)の年次総会の会報でいくらか注意を引いた。１９８９年の会報でこのよう
な抗体の存在がチン(Czinn)らによって開示された後、ラーセン(Larsen)らが、
１９９１年５月の会報で唾液中のＩｇＧレベルは抗生物質による治療期間中の治
療の応答の実用的な非侵襲性のマーカーであると結論付けた。１９９２年４月の
会報では、ランデス(Landes)らは、先の観察結果を確認し、ヘリコバクター ピ
ロリ(Helicobacter pylori)に対する唾液のＩｇＧの測定は、特に他の試験が実
用的でない広範なまたは小児の集団において、ヘリコバクター ピロリ(H．pylo
ri)陽性患者を検出するための簡単な非侵襲性の試験であることを観察した。
ＷＯ−Ａ−９３２２６８２号は、ヘリコバクター ピロリ(H．pylori)に関す
る簡便で信頼性の高いインビトロ試験法を開示する。この試験は、試験される哺
乳動物の粘液分泌物中のＩｇＧ抗体と反応する抗原調製物を利用するものである
。
しかしながら、このような診断方法における唾液の使用もまた問題を伴う。こ
れらの診断方法は、唾液サンプルを膜若しくはパッドに結合した抗原、または他
の同様の材料と接触させるものであることが多い。したがって、このような装置
では唾液の流動性(flow-through)が試験の必須要素である。また、実用的な流動
時間が正確で有意義な結果を得るのに必須である。しかしながら、唾液の複雑な
性質、特に微粒子及びムチンの存在のため、個々の唾液サンプルの流動性は、患
者内及び患者間でかなり変動する。
唾液中に存在する微粒子は、表面に簡単に沈着することにより膜に結合し、流
れ時間(flow time)を減少させる。ムチンは、粘弾性を有するため、ゲル様マト
リッ
クスを膜上に沈着させ、これにより液体の流れが抑制されるであろう。唾液の流
動時間は抗原へのＩｇＧの正確な結合に対する必要性と均衡がとれていなければ
ならず、これは、流動時間は早すぎてはならず、また、試験が実用的であるため
の必要性、即ち、流動時間は遅すぎてもいけないことを意味する。抗原が結合す
る膜またはパッドの表面への微粒子やムチンの結合により、流動時間がかなり抑
制されてしまう。
膜へのムチン及び微粒子の沈着に関連する他の問題は、シグナルの発達に関す
るものである。シグナルの発達の一つの好ましい方法は、沈着物によってトラッ
プされるＩｇＧ−コロイド金複合体を利用するものである。この方法では、偽陽
性結果が生じるため、最悪の場合には、複合体が自由に通過できず、全膜が複合
体と結合してしまう。
理論的には、ムチンを除去することは可能である。しかしながら、必要な試薬
及び固相媒質では、このような方法は商業的に使用できない。したがって、他の
より経済的な方法が沈着を抑制するのに、即ち、流動時間を向上させるのに必要
である。
現在、唾液は、唾液を綿パッド上に収集した後、緩衝液中に抽出し、多孔性の
プラスチックフィルターで濾過するオムニサル（商標）(OmnisalR)として既知の
システムを用いて処理できる。しかしながら、このようにして製造される液体は
依然として流れ特性が良くない。
驚くべきことに、唾液サンプルの性質、例えば、粘弾性、を変化させることに
よって、流動時間が向上でき、これによりより正確で感受性の高い試験が得られ
ることが発見された。これは、例えば、唾液中に存在するムチンを除去する必要
がなく、その性質を変えるのみである。
したがって、本発明は、唾液サンプルの性質を変化させる段階からなる、唾液
の流れ特性の向上方法を提供するものである。特に、本発明は唾液の粘弾性を変
えることに関する。
本発明の好ましい実施態様では、唾液の性質を、上記効果を達成する瀘過媒質
に
唾液を通すことによって変化させる。好ましい瀘過媒質としては、木炭、ＤＥＡ
Ｅ−セファロース及びセライト（商標）(CeliteR)等の珪藻土が挙げられ、珪藻
土が特に好ましい。瀘過媒質は微粒子を除去する。高分子量の凝集物や脂質を除
去する、機械的な剪断応力はムチンのポリマー構造を破壊することにより、流れ
特性を向上させる。
存在するムチンは、上記方法によっては除去されないが、そのポリマー構造が
変化することにより流れ特性が向上する。
本発明の第二の実施態様によると、唾液サンプルの性質は、界面活性剤の添加
及び唾液サンプルのイオン強度および／またはｐＨを調節することにより操作で
きる。これは、唾液サンプルを適当な緩衝溶液中に通過させることにより達成で
きる。当然、唾液の性質がこのようにして調製される際には、粒状物質を除去す
る別の瀘過段階を含むことも有用である。
したがって、本発明の特に好ましい実施態様によると、唾液サンプルを、唾液
の性質を変える瀘過媒質に通すだけでなく、適当な緩衝溶液に通過させることに
よってそのｐＨおよび／またはイオン強度を調節し、界面活性剤を添加する。
本発明の方法は、唾液中に見付かる特異的な抗体に関する迅速な診断試験に特
に使用できる。したがって、さらなる概念によると、本発明は、唾液の性質、例
えば、粘弾性を変えることにより流れ特性を改善する段階からなる唾液のサンプ
ルにおける抗体の検出方法を提供するものである。本明細書中に記載されている
とおり、上記は瀘過および／または緩衝液による操作によって達成できる。
好ましくは、試験は、ヘリコバクター ピロリ(H．pylori)に特異的な抗体、
通常、ＩｇＧの検出を目的とするものである。
このような診断方法は、一般的に、抗原が結合する膜またはパッドからなる診
断キットを用いて行われる。したがって、さらなる概念によると、本発明は、唾
液サンプルの性質、例えば、粘弾性を変化させる手段からなり、上記手段が瀘過
材料および／または緩衝溶液の形態で提供され、上記形態のいずれかまたは双方
が試験領
域に使用される前に唾液サンプルの流れ特性を変化できる、唾液のサンプルにお
ける抗体の検出用キットを提供するものである。
本発明を、下記実施例を参照しながら説明するが、下記実施例により本発明が
制限されるものではない。
実施例は以下の図面を参照する：
図１は、セライト（商標）(Cel1teR)による瀘過段階を含むまたは含まない場
合の唾液の流れ時間を示すものである；
図２は、セライト（商標）(CeliteR)による瀘過段階を含むまたは含まない場
合のＩｇＧ−金複合体の流れ時間を示すものである。実施例
唾液サンプルは、オムニサル（商標）(OmnisalR)（サリヴァ ダイアグノステ
ィック システムズ インコーポレイテッド(Saliva Diagnostic Systems，Inc.
)、１１７１９ エヌイー ９５ス ストリート、バンクーバー、ダブリューエ
ー９８６８２(11719 NE 95th Street，Vancouver,WA 98682)、アメリカ）の唾液
収集及び処理システムを用いて多くのヒトから集めた。しかしながら、唾液を下
記緩衝液中に抽出した：０．５％（ｖ／ｖ）ツィーン６０、１２５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ アジ化ナトリウム及び０．１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡを含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液、ｐＨ７．０〜８．０。
唾液をオムニサル（商標）(OmnisalR)のフィルターでまたはセライト（商標）
（CeliteR）で濾過することにより緩衝液中に抽出した。次に、このようにして
得られた溶液１ｍｌを、抗原がスポットされた膜を含むヘリサル（商標）(Helis
alR)ラピッドテストカード(rapid test card)上に置き、流動時間を記録した。
また、唾液後、１ｍｌのＩｇＧ−金複合体を加え、流動時間を記録した。結果を
下記に示す。結果
ディスカッション
図１及び２は上記データをグラフで示すものである。下記点が明らかである：
ｉ）唾液サンプル自体及びＩｇＧ−金複合体の流れ時間は双方とも処理段階の
結果、減少する；
ｉｉ）加えて、双方の場合における流れ時間はサンプル間で非常に変動が少ない
。
また、上記したように処理されたサンプルは、ＩｇＧ−金のトラップにより背
景の色がかなり抑制され、偽陽性の数が非常に減少する。The present invention relates to a method for treating saliva. In particular, the present invention relates to a method for treating saliva used in a diagnostic test for the presence of an antigen against Helicobacter pylori. Saliva is a complex mixture of secretions from various glands in the oral cavity. Among many components, various enzymes, immunoglobulins and mucins, along with cell debris and bacterial flora hosts. In particular, mucin responds to the viscoelastic properties of saliva and acts as a lubricant with protective and antibacterial properties. The viscoelastic properties of these glycoproteins depend on the protein and carbohydrate composition obtained during synthesis, but are also affected by the degree of interaction with other components of saliva. For example, lipids contribute significantly to the viscoelastic properties of saliva. Saliva containing immunoglobulins can be used for diagnosis of various diseases. In particular, detection of IgG specific for the antigen produced by the pathogen is indicative of infection or recent contact. One example of such an infection is that caused by H. pylori. Diagnosis of Helicobacter pylori infection is made by detection of urease in microscopy, microbial cultures or biopsy of gastric mucosa, by the urea breath test or by the presence of specific antibodies in serum detected by ELISA. . Helicobacter pylori is thought to infect the gastric mucosa and trigger an IgA antibody response that is detected in the mucus of gastric secretions. However, it was discovered that the major Helicobacter pylori-specific antibody found in mucus secretions was of the IgG class and not IgA. AU-A-9066766 discloses a method for detecting IgG of mucus secretion specific to Helicobacter pylori antigen, which is a means for detecting infection by H. pylori microorganisms in mammals. be written. The corresponding literature is Witt et al., Frontiers in Mucosal Immunology, Vol. 1, pp. 693-696 (1991). The presence of IgG antibodies in saliva of H. pylori (Campylob acter pylori) -positive patients has drawn some attention in the annual report of the American Gastroenterological Association. Was. After the presence of such antibodies was disclosed by Czinn et al. In the 1989 bulletin, Larsen et al. Reported in a May 1991 bulletin that IgG levels in saliva during treatment with antibiotics. We conclude that it is a practical non-invasive marker of treatment response. In a newsletter of April 1992, Landes et al. Confirmed previous observations that the measurement of salivary IgG against Helicobacter pylori has been particularly extensive or pediatric for which other tests are impractical. In a population, we observed that it was a simple non-invasive test to detect H. pylori positive patients. WO-A-9322682 discloses a simple and reliable in vitro test method for Helicobacter pylori. This test utilizes an antigen preparation that reacts with IgG antibodies in mucus secretions of the mammal being tested. However, the use of saliva in such diagnostic methods is also problematic. These diagnostic methods often involve contacting a saliva sample with an antigen bound to a membrane or pad, or other similar material. Therefore, in such a device, the flow-through of saliva is an essential element of the test. Practical flow times are also essential for obtaining accurate and meaningful results. However, due to the complex nature of saliva, especially the presence of microparticles and mucin, the fluidity of individual saliva samples varies considerably within and between patients. Microparticles present in saliva bind to the membrane by easily depositing on the surface and reduce flow time. Because mucin is viscoelastic, it will cause a gel-like matrix to deposit on the membrane, which will restrict the flow of liquid. The flow time of saliva must be balanced with the need for accurate binding of IgG to the antigen, which is necessary for the flow time not to be too fast and for the test to be practical. Sex, meaning that the flow time must not be too slow. The binding time of the microparticles or mucin to the surface of the membrane or pad to which the antigen binds significantly reduces flow time. Another problem associated with the deposition of mucins and microparticles on membranes relates to signal development. One preferred method of signal development utilizes an IgG-colloidal gold complex that is trapped by deposits. In this method, false positive results occur, and in the worst case, the complex cannot pass freely and the whole membrane binds to the complex. In theory, it is possible to remove mucin. However, with the necessary reagents and solid media, such methods are not commercially available. Therefore, other more economical methods are needed to control the deposition, i.e. to improve the flow time. Currently, saliva, saliva was collected on a cotton pad, and extracted in buffer can be processed using known systems as Omunisaru filtration through porous plastic filter (TM) (Omnisal R). However, the liquids produced in this way still have poor flow properties. Surprisingly, it has been discovered that by altering the properties of the saliva sample, eg, viscoelasticity, the flow time can be improved, thereby providing a more accurate and sensitive test. This does not require, for example, the removal of mucin present in saliva, but only changes its properties. Accordingly, the present invention provides a method for improving the flow characteristics of saliva, comprising the step of changing the properties of a saliva sample. In particular, the invention relates to altering the viscoelasticity of saliva. In a preferred embodiment of the present invention, the properties of saliva are altered by passing saliva through a filtration medium that achieves the above effects. Preferred filtration media, charcoal, include diatomaceous earth, such as DEA E- sepharose and Celite (TM) (Celite R), diatomaceous earth is particularly preferred. The filtration medium removes particulates. Mechanical shear stress, which removes high molecular weight aggregates and lipids, improves flow properties by breaking the mucin polymer structure. The mucin present is not removed by the above method, but the flow properties are improved by changing its polymer structure. According to a second embodiment of the present invention, the properties of the saliva sample can be manipulated by adding a surfactant and adjusting the ionic strength and / or pH of the saliva sample. This can be achieved by passing the saliva sample through a suitable buffer solution. Of course, when the saliva properties are prepared in this manner, it is also useful to include a separate filtration step to remove particulate matter. Thus, according to a particularly preferred embodiment of the present invention, the pH and / or ionic strength of the saliva sample is adjusted not only by passing it through a filtration medium that modifies saliva properties, but also by passing it through a suitable buffer solution, Add surfactant. The method of the invention can be used particularly for rapid diagnostic tests for specific antibodies found in saliva. Thus, according to a further concept, the present invention provides a method for detecting antibodies in a sample of saliva comprising the step of improving the flow properties by altering the properties of saliva, eg, viscoelasticity. As described herein, this can be accomplished by filtration and / or buffer manipulation. Preferably, the test is for the detection of antibodies specific for Helicobacter pylori, usually IgG. Such a diagnostic method is generally performed using a diagnostic kit comprising a membrane or a pad to which an antigen binds. Thus, according to a further concept, the invention comprises a means for altering the properties, eg, viscoelasticity, of a saliva sample, wherein said means is provided in the form of a filtration material and / or a buffer solution, wherein An object of the present invention is to provide a kit for detecting antibodies in a sample of saliva, which can change the flow characteristics of the sample of saliva before both are used in the test area. The present invention will be described with reference to the following examples, but the present invention is not limited by the following examples. Examples with reference to the following drawings: FIG 1 shows a Celite (TM) (Cel1te R) saliva flow time when or without filtration step according to; Figure 2 is a Celite (trade mark ) (shows a Celite R) flow time of IgG- gold complex when or without filtration step with. EXAMPLE Saliva samples Omunisaru (TM) (Omnisal R) (Sariva Diagnostic Systems Incorporated (Saliva Diagnostic Systems, Inc.) , 11719 Enui 95 scan Street, Vancouver, W. chromatography er 98682 (11719 NE 95th Street, Vancouver , WA 98682), USA) from a number of humans using a saliva collection and processing system. However, saliva was extracted in the following buffer: 20 mM phosphate buffer containing 0.5% (v / v) Tween 60, 125 mM NaCl, 10 mM sodium azide and 0.1% (w / w) BSA. PH 7.0-8.0. Saliva was extracted in a buffer by filtration through a Omunisaru (trademark) filter or Celite (Omnisal R) (TM) (Celite R). Then, a solution 1ml obtained in this way, the antigen is placed on Herisaru comprising a membrane spotted (TM) (Helis al R) Rapid test card (rapid test card), was recorded flow time. After saliva, 1 ml of the IgG-gold complex was added and the flow time was recorded. The results are shown below. result Discussion Figures 1 and 2 graphically illustrate the above data. The following points are clear: i) The flow time of the saliva sample itself and the IgG-gold complex both decrease as a result of the processing step; ii) In addition, the flow time in both cases is very variable between samples Less is. Also, the samples treated as described above have a considerable reduction in background color due to the IgG-gold trap and greatly reduce the number of false positives.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ
Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ
Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，
ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ
Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ
，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，
ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ
(72)発明者 スミス，クリストファー，ジョン
イギリス国，クルウィド エルエル17 ０
ティイー，ルアルト，トレマイアーチオン
レイン，イスフライン （番地なし)────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M
C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG
, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN,
TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, U
G), AL, AM, AT, AU, BB, BG, BR, B
Y, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES
, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG,
KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, L
V, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ
, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI,
SK, TJ, TM, TT, UA, UG, US, UZ, V
N
(72) Inventors Smith, Christopher, John
Cluwid El El 170, United Kingdom
Tee, Rualto, Tremey Archon
Rain, Isfrain (No address)