JPH10507906A

JPH10507906A - Genetically engineered pig cells

Info

Publication number: JPH10507906A
Application number: JP8508145A
Authority: JP
Inventors: エイチ．サクス，デイビッド; サイクス，メガン; ベーチャー，マンフレッド
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション; バイオトランスプラントインコーポレイテッド
Priority date: 1994-08-19
Filing date: 1995-08-10
Publication date: 1998-08-04
Also published as: AU711183B2; EP0773993A1; AU3243595A; CA2196311A1; WO1996006165A1; EP0773993A4

Abstract

(57)【要約】寛容を誘導するための遺伝子工学処理した細胞。 (57) [Summary] Genetically engineered cells to induce tolerance.

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子工学処理したブタ細胞発明の背景この発明は、器官移植の分野に関係する。同種異系の器官移植における技術的進歩及び非特異的免疫抑制剤の利用可能性は、器官移植の分野に一大変革を起こした。しかしながら、この進歩は、適当なサイズと適合性の必須の器官の不足を生じた。同種異系移植器官の不足は、異種移植における増大した興味を生じた。チンパンジーからヒトへの移植が長期の生命維持機能を提供し得ることは、２５年以上前に示された。しかしながら、非ヒト霊長類の器官源としての利用は、適用可能性が限られている。多くの霊長動物種は、数が少なくて保護されており、もっと多いもの例えばヒヒは、しばしば、成人におけるそれらの器官の使用を可能にする大きさにまで成長しない。更に、幾つかの文化においては、器官源としての霊長類の利用は、民族学的に許容されない。これらの困難の幾つかは、有蹄類の器官特にブタの器官の利用により解決することができるであろう。ブタは、家畜化されており、繁殖が容易であり、同腹子が多く、そして非常に大きいヒトにおけるそれらの器官の使用を可能にする大きさまで急速に成長する。更に、ブタとヒトは、多くの解剖学的及び生理学的類似性を有している。しかしながら、ブタの器官のヒトへの移植は、移植器官の活発な拒絶を生じる。発明の要約一般に、この発明は、遺伝子工学処理したブタ細胞例えば培養ブタ細胞例えばレトロウイルスでトランスフォームした培養ブタ細胞、又は移植片を支持する蛋白質例えば霊長類の例えばヒトの造血ペプチドをコードするトランスジーン；又は移植片拮抗性の遺伝子産物の発現若しくは作用を阻止するトランスジーンの一方又は両方を含むトランスジェニックブタから誘導した細胞を特徴とする。移植片拮抗性の遺伝子産物の発現又は作用を阻止するトランスジーンの例には、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現若しくは作用を直接若しくは間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ例えばレシピエント由来の蛋白質に対するドナーにコードされるレセプターの発現を阻止する（それにより、レシピエント由来蛋白質の作用を阻止する）アンチセンスＲＮＡをコードするトランスジーン；ドナー移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、ドナーのゲノムに例えば相同組換えにより挿入された場合に誤発現される内因性遺伝子を生じるか又は突然変異により｛例えばドナー移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の内因性ゲノムコピーへの突然変異（例えば、欠失）の導入により｝不活性化された内因性遺伝子を生じるトランスジーン（例えば、トランスジーンの挿入は、移植片拮抗性であるレシピエント由来の蛋白質に対するドナー由来のレセプターについてのノックアウトを生じる）；ドナー若しくはレシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質のインヒビター例えば競争的インヒビター若しくはプロテアーゼその他の移植片拮抗性蛋白質の活性を特異的に阻止する分子をコードするトランスジーン；及び移植片拮抗性の遺伝子産物例えば宿主サイトカインに対するドナー細胞レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするトランスジーンが含まれる。好適具体例において、移植片支持蛋白質をコードするトランスジーンは、レシピエントＭＨＣ遺伝子例えば霊長類の例えば非ヒト霊長類又はヒトのＭＨＣ遺伝子である。好適具体例において、トランスジーンは、ドナーＭＨＣ遺伝子産物（この産物は移植片拮抗性である）の発現又は作用を阻止するものである。好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ細胞は造血幹細胞であり、移植片支持蛋白質をコードするトランスジーンはレシピエントＭＨＣ遺伝子例えば霊長類の例えば非ヒト霊長類又はヒトのＭＨＣ遺伝子である。好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ細胞は造血幹細胞であり、トランスジーンは、ドナーＭＨＣ遺伝子産物（この遺伝子産物は移植片拮抗性である）の発現又は作用を阻止するものである。好適具体例において、移植片支持蛋白質をコードするトランスジーン及び／又は、移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を阻止するトランスジーンは、ＭＨＣ遺伝子；ブタＭＨＣ遺伝子；レシピエントＭＨＣ遺伝子；非霊長類ＭＨＣ遺伝子；非ヒトＭＨＣ遺伝子以外のものである。好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ細胞は造血幹細胞であり、移植片支持蛋白質をコードするトランスジーン及び／又は移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を阻止するトランスジーンは、ＭＨＣ遺伝子；ブタＭＨＣ遺伝子；レシピエントＭＨＣ遺伝子；非霊長類ＭＨＣ；又は非ヒトＭＨＣ遺伝子以外のものである。好適具体例において、トランスジーンは、移植片支持蛋白質例えばヒト成長因子又はサイトカインのレセプター例えば造血の調節に関与する成長因子又はサイトカインのレセプターをコードする。成長因子又はサイトカインのレセプターの例には、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、Ｅｐｏ及びウテロフェリンに対するレセプターが含まれる。好適具体例において、トランスジーンは、移植片支持蛋白質例えばヒト接着分子例えば造血細胞の植付け及び／又は維持に関与する接着分子をコードする。ヒト接着分子の例には、ＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８及びＣＤ３４が含まれる。更に別の好適具体例においてはトランスジーンは、レシピエント又はドナーの蛋白質例えば、レシピエントに対してドナー細胞により開始された免疫応答を、直接又は間接に（例えば、第２のサイトカインの活性レベルの刺激又は阻止により）阻止するサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＴＧＦ −βをコードする。更に他の好適具体例において、トランスジーンは、キメラ分子例えばキメラリンホカイン例えばＰＩＸＹ１２３をコードする。更に他の好適具体例において、トランスジーンは、移植片支持蛋白質例えば、ドナー組織に対してレシピエント細胞により開始された免疫応答を直接又は間接に（例えば、第２のサイトカインの活性レベルの刺激又は阻止により）阻止するレシピエント又はドナーのサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ− ２又はＴＧＦ−βをコードする。更に他の好適具体例において、トランスジーンは、例えば遺伝子産物の発現を減じることにより移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を阻止する。例えば、トランスジーンは、ドナー移植片拮抗性蛋白質例えばドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主のサイトカインに対するドナーのレセプターをコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、ドナーゲノム中に例えば相同組換えによって挿入された場合に内因性遺伝子を生じるものである｛該内因性遺伝子は、誤発現され又は突然変異により（例えば、ドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主のサイトカインに対するドナーのレセプターをコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異例えば、欠失の導入により）不活性化されている｝。トランスジーンは、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質例えばドナーにコードされたＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３又は宿主サイトカインに対するドナーのレセプターの発現を阻止するアンチセンスＲＮＡの発現又は作用を直接又は間接に阻止するアンチセンスＲＮＡをコードするものであってよい。トランスジーンは、移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主のサイトカインに対するレセプター又はドナーＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするものであってよい。更に他の好適具体例において、トランスジーンは、ヒトペプチド例えば造血ペプチドをコードする核酸であって、ブタプロモーター例えばブタ造血遺伝子プロモーター；ウイルス性プロモーター又は発生的に調節されたプロモーターを含めて天然のプロモーターに操作可能に結合された核酸を含む。更に別の好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ細胞は、ブタ造血幹細胞例えば臍帯血造血幹細胞、骨髄造血幹細胞又は胎児若しくは新生児の肝臓若しくは脾臓の造血幹細胞であり；分化した血液細胞例えば骨髄性細胞例えば巨核球、単球、顆粒球、若しくは好酸球から誘導され；赤血球系細胞例えば赤血球例えばリンパ球様細胞（例えば、Ｂリンパ球及びＴリンパ球）であり；多能性造血幹細胞例えば造血前駆体例えばバースト形成単位赤血球系細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位赤血球系細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位巨核球（ＣＦＵ−Ｍｅｇ）、コロニー形成単位−顆粒球−単球（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位好酸球（ＣＦＵ−Ｅｏ）又はコロニー形成単位顆粒球−顆粒球−赤血球− 巨核球−単球（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）から誘導され；造血幹細胞又は他の血液細胞以外のブタ細胞であり；ブタ胸腺細胞例えばブタ胸腺間質細胞であり；骨髄間質細胞であり；ブタ肝臓細胞であり；ブタ腎臓細胞であり；ブタ上皮細胞；ブタ造血前駆体細胞であり；ブタ筋肉細胞例えば心筋であり；又は樹状細胞又はその前駆体である。更に他の好適具体例において、トランスジェニック細胞は、培養細胞例えば初代培養例えば造血幹細胞の初代培養細胞から誘導され；トランスジェニック動物から単離され又は誘導される。更に別の好適具体例において、トランスジェニックブタ細胞は、トランスジーンについてヘミ接合であり；トランスジェニックブタ細胞は、トランスジーンについてヘテロ接合であり；トランスジェニックブタ細胞は、トランスジーンについてホモ接合であり（ヘテロ接合のトランスジェニックブタを交配させて、トランスジーンについてホモ接合である子孫を生成することができる）；トランスジェニックブタ細胞は、２つ以上のトランスジーンを含む。他の面において、この発明は、ブタプロモーター例えばブタ造血遺伝子プロモーター又は、異種の誘導可能な若しくは発生的に調節されるプロモーター（移植片支持蛋白質例えば霊長類若しくはヒトの移植片支持蛋白質例えば霊長類例えばヒトの造血ペプチドをコードする核酸；又はコードする核酸に操作可能に結合されたもの）を含むトランスジーン又は移植片拮抗性である遺伝子産物の発現若しくは作用を阻止するトランスジーンを特徴とする。移植片拮抗性である遺伝子産物の発現若しくは作用を阻止するトランスジーンの例には、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現若しくは作用を直接若しくは間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ例えばドナーにコードされるレシピエント由来蛋白質に対するレセプターの発現を阻止する（それにより、レシピエント由来蛋白質の作用を阻止する）アンチセンスＲＮＡをコードするトランスジーン；ドナー若しくはレシビエント由来の移植片拮抗性蛋白質のインヒビター例えば競争的インヒビター又は、移植片拮抗性蛋白質の活性を特異的に阻止するプロテアーゼその他の分子をコードするトランスジーン；及び移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主のサイトカインに対するドナー細胞レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするトランスジーンが含まれる。好適具体例において、移植片支持蛋白質をコードするトランスジーンは、レシピエントＭＨＣ遺伝子例えば霊長類例えば非ヒト霊長類又はヒトのＭＨＣ遺伝子である。好適具体例において、トランスジーンは、ドナーＭＨＣ遺伝子産物（これは、移植片拮抗性である）の発現又は作用を阻止するものである。好適具体例において、移植片支持蛋白質をコードする核酸及び／又は移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を阻止する核酸は、ＭＨＣ遺伝子；ブタＭＨＣ遺伝子；レシピエントＭＨＣ遺伝子；非霊長類ＭＨＣ遺伝子；又は非ヒトＭＨＣ遺伝子以外である。好適具体例において、核酸は、移植片支持蛋白質例えばヒト成長因子又はサイトカインレセプター例えば造血の調節に関与する成長因子又はサイトカインレセプターをコードする。成長因子又はサイトカインレセプターの例には、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、Ｅｐｏ及びウテロフェリンに対するレセプターが含まれる。他の好適具体例において、核酸は、移植片支持蛋白質例えばヒトの接着分子例えば造血細胞の植付け及び／又は維持に関与する接着分子をコードする。ヒトの接着分子の例には、ＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ −１、ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８及びＣＤ３４が含まれる。更に他の好適具体例において、核酸は、レシピエント又はドナーの蛋白質例えば、ドナー細胞により開始されるレシピエントに対する免疫応答を（例えば、第２のサイトカインの活性レベルの刺激又は阻止によって）直接又は間接に阻止するサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＴＧＦ−βをコードする。更に別の好適具体例において、核酸は、移植片支持蛋白質例えば、レシピエント細胞により開始されるドナー組織に対する免疫応答を（例えば、第２のサイトカインの活性レベルの刺激又は阻止によって）直接又は間接に阻止するレシピエント又はドナーのサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＴＧＦ−βをコードする。トランスジーンは、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現又は作用を直接又は間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ例えば、ドナーにコードされるＢ− ７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターの発現を阻止するアンチセンスＲＮＡをコードするものであってよい。トランスジーンは、移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主サイトカインに対するドナー細胞レセプター又はドナーＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター又はＬＦＡ−３レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするものであってよい。更に他の好適具体例において、トランスジーンは、キメラ分子例えばキメラリンホカイン例えばＰＩＸＹ１２３をコードする。好適具体例において、トランスジーンは、更に、転写調節配列例えば組織特異的プロモーター例えば、組換えヒト遺伝子配列に操作可能に結合された造血系特異的プロモーターを含む。他の面において、この発明は、移植片拮抗性である遺伝子産物の作用を、例えばその遺伝子産物の発現を減じることにより阻止するトランスジーンを特徴とする。例えば、このトランスジーンは、ドナーの移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、ドナーゲノム中に例えば相同組換えにより挿入された場合に内因性遺伝子を生じるトランスジーンである｛該内因性遺伝子は、誤発現され又は、例えばドナーの移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異（例えば、欠失）の導入によって、突然変異により不活性化されている｝（例えば、トランスジーンの挿入は、移植片拮抗性蛋白質であるレシピエント由来蛋白質に対するドナー由来レセプターについてノックアウトを生じる）。好適具体例において、トランスジーンは、ドナーＭＨＣ遺伝子産物（この遺伝子産物は、移植片拮抗性である）の発現又は作用を阻止するものである。好適具体例において、移植片拮抗性である遺伝子産物の作用を阻止するトランスジーンは、ＭＨＣ遺伝子；ブタＭＨＣ遺伝子；レシピエントＭＨＣ遺伝子；非霊長類ＭＨＣ遺伝子；又は非ヒトＭＨＣ遺伝子以外である。更に別の好適具体例において、トランスジーンは、移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を、例えばその遺伝子産物の発現を減じることにより阻止する。例えば、このトランスジーンは、ドナー移植片拮抗性蛋白質例えばドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターをコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、ドナーのゲノム中に例えば相同組換えにより挿入された場合に内因性遺伝子を生じるものである｛該内因性遺伝子は、誤発現され又は、例えば、ドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターをコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異（例えば、欠失）の導入により不活性化されている｝。他の面において、この発明は、移植片支持蛋白質例えば霊長類の例えばヒトの蛋白質（好ましくは、造血ペプチド）をコードするトランスジーン；又は移植片拮抗性である遺伝子産物の発現若しくは作用を阻止するトランスジーンの一方又は両方を含む細胞を有するトランスジェニックブタを特徴とする。移植片拮抗性である遺伝子産物の発現若しくは作用を阻止するトランスジーンの例には、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現若しくは作用を直接若しくは間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ、例えばレシピエント由来蛋白質に対するドナーにコードされるレセプターの発現を阻止する（それにより、レシピエント由来蛋白質の作用を阻止する）アンチセンスＲＮＡをコードするトランスジーン；ドナーの移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、ドナーゲノム中に例えば相同組換えによって挿入された場合に内因性遺伝子を生じるトランスジーン｛該内因性遺伝子は、誤発現され又は、例えばドナーの移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異（例えば、欠失）の導入により突然変異により不活性化されている｝（例えば、トランスジーンの挿入は、移植片拮抗性蛋白質であるレシピエント由来蛋白質に対するドナー由来レセプターについてのノックアウトを生じる）；ドナー若しくはレシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質のインヒビター例えば競争インヒビター又はプロテアーゼその他の移植片拮抗性蛋白質の活性を特異的に阻止する分子をコードするトランスジーン；及び移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主サイトカインに対するドナー細胞レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするトランスジーンが含まれる。好適具体例において、移植片支持蛋白質をコードするトランスジーンは、レシピエントのＭＨＣ遺伝子例えば霊長類の例えば非ヒト霊長類又はヒトのＭＨＣ遺伝子である。好適具体例において、トランスジーンは、ドナーＭＨＣ遺伝子産物（その遺伝子産物は、移植片拮抗性である）の発現又は作用を阻止するものである。好適具体例において、移植片支持蛋白質をコードするトランスジーン及び／又は移植片拮抗性である遺伝子産物の発現若しくは作用を阻止するトランスジーンは、ＭＨＣ遺伝子；ブタＭＨＣ遺伝子；レシピエントＭＨＣ遺伝子；非霊長類ＭＨＣ遺伝子；又は非ヒトＭＨＣ遺伝子以外である。好適具体例において、トランスジーンは、移植片支持蛋白質例えばヒト成長因子又はサイトカインレセプター例えば造血の調節に関与する成長因子又はサイトカインレセプターをコードする。成長因子又はサイトカインのレセプターの例には、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、Ｅｐｏ及びウテロフェリンに対するレセプターが含まれる。他の好適具体例において、トランスジーンは、移植片支持蛋白質例えばヒトの接着分子例えば造血細胞の植付け及び／又は維持に関与する接着分子をコードする。ヒトの接着分子の例には、ＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８及びＣＤ３４が含まれる。更に他の好適具体例において、トランスジーンは、レシピエント又はドナーの蛋白質例えば、ドナー細胞により開始されるレシピエントに対する免疫応答を（例えば、第２のサイトカインの活性レベルを刺激し又は阻止することにより）直接若しくは間接に阻止するサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＩＧＦ−βをコードする。更に別の好適具体例において、トランスジーンは、移植片支持蛋白質例えば、レシピエント細胞により開始されるドナー組織に対する免疫応答を（例えば、第２のサイトカインの活性レベルを刺激し又は阻止することにより）直接又は間接に阻止するレシピエント又はドナーのサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＴＧＦ−βをコードする。更に別の好適具体例において、トランスジーンは、キメラ分子例えばキメラリンホカイン例えばＰＩＸＹ１２３をコードする。更に別の好適具体例において、トランスジーンは、移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を、例えばその遺伝子産物の発現を減少させることにより阻止する。例えば、トランスジーンは、ドナーの移植片拮抗性蛋白質例えばドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターをコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであり且つドナーゲノム中に例えば相同組換えによって挿入された場合に内因性遺伝子を生じるものであり、該内因性遺伝子は、誤発現され又は、例えば、ドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターをコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異（例えば、欠失）の導入により、突然変異によって不活性化されている。トランスジーンは、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現又は作用を直接又は間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ例えばドナーにコードされるＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターの発現を阻止するアンチセンスＲＮＡをコードするものであってよい。トランスジーンは、移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主サイトカインに対するドナー細胞レセプター又はドナーＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするものであってよい。更に別の好適具体例において、トランスジーンは、移植片支持蛋白質例えば霊長類の又はヒトの移植片支持蛋白質例えば霊長類若しくはヒト造血ペプチドをコードする核酸又は、移植片拮抗性である遺伝子産物例えば移植片拮抗性蛋白質であるレシピエント蛋白質に対するドナーレセプターである遺伝子産物の作用を阻止するトランスジーン（ブタプロモーター例えばブタ造血遺伝子プロモーター；ウイルスプロモーター；誘導可能なプロモーター；又は発生的に調節されるプロモーターと共に自然に生じるもの以外のプロモーターに操作可能に結合されたもの）を含む。更に別の好適具体例において、トランスジェニックブタ細胞は、トランスジーンについてヘミ接合であり；トランスジェニックブタ細胞は、トランスジーンについてヘミ接合であり；トランスジェニックブタは、トランスジーンについてヘテロ接合であり；トランスジェニックブタは、トランスジーンについてホモ接合であり（ヘテロ接合のトランスジェニックブタを交配させて、トランスジーンについてホモ接合である子孫を生成することができる）；トランスジェニックブタは、２つ以上のトランスジーンを含む。この発明のトランスジェニックブタ（又はブタ細胞）は、ヒト患者への異種間移植のための「ヒト化」造血細胞の源として用いることができる。この発明のトランスジェニックブタ細胞を用いて、ヒト成長因子、サイトカイン又は造血系の調節に関与する他の分子のアゴニスト又はアンタゴニストを測定し及び／又は同定することもできる。例えばレトロウイルスによりトランスフォームされた培養細胞又はトランスジェニック動物から誘導したこの発明のトランスジェニックブタ細胞を用いて、ドナーブタからの移植片に対するレシピエント動物における免疫寛容を誘導することができる。例えば、この発明の細胞を、１９９３年９月２３日出願の米国特許出願第１２６，１２２号に記載された寛容を誘導する方法と組合せることができる。この発明は、ドナー細胞及び分子とレシピエントの細胞との間の望ましい相互作用を増す（例えば、レシピエント環境におけるドナー幹細胞の植付け又は機能を促進する）ように処理したブタドナー細胞の移植を提供する｛一般に、幹細胞を植付けてドナー移植片細胞に対する寛容を誘導（或は、ドナー移植片細胞の受容を促進）する｝。この発明は又、ドナー細胞及び分子とレシピエントの細胞（これらは、例えば、ドナー移植片細胞の拒絶を促進し又はドナー移植片細胞の機能を阻止する）との間の望ましくない相互作用を最小化するように処理したドナー細胞の移植をも提供する。この発明は、幹細胞及び移植片細胞の何れか又は両方をそのように処理する移植方法を提供する。ドナー幹細胞とレシピエントとの間の所望の相互作用を増大させる処理された変化は、幾つかの場合において、移植片の細胞において望ましくないであろう。同様に、ドナー移植片細胞とレシピエントとの間の望ましくない相互作用を減じる処理された変化は、幾つかの場合に、ドナー幹細胞において望ましくないであろう。従って、この発明は、ドナー幹細胞とドナー移植片が異なる方法を含み、該方法において、一方は、他方にない処理された変化を有する。例えば、幾つかの適用において、ドナー幹細胞は、移植片細胞に存在しないトランスジーンを有し、ドナー移植片細胞は、ドナー幹細胞に存在しないトランスジーンを有する。従って、他の面において、この発明は、レシピエント哺乳動物例えば霊長類例えばヒトにおけるドナー動物例えばミニブタからの移植片細胞に対する寛容を誘導する（或は、レシピエント哺乳動物による移植片細胞の受容を促進する）方法であって、下記を含む該方法を特徴とする：レシピエントにドナーの造血幹細胞を導入し、そしてそのレシピエントにドナーの移植片細胞を導入する、但し、次の条件の少なくとも１つを満たす：（１）ドナー幹細胞を遺伝子工学処理して、ドナー幹細胞とレシピエントの細胞又は分子との間の望ましい相互作用を促進する；（２）ドナー幹細胞を遺伝子工学処理して、レシピエントの細胞又は分子とドナー幹細胞との間の望ましくない相互作用を阻止する；（３）ドナー移植片細胞を遺伝子工学処理して、ドナー移植片（及び／又は幹）細胞とレシピエントの細胞又は分子との間の望ましい相互作用を促進する；（４）ドナー移植片細胞を遺伝子工学処理して、レシピエントの細胞又は分子とドナー移植片（及び／又は幹）細胞との間の望ましくない相互作用を阻止する。好適具体例において、もし（１）又は（２）における遺伝子工学による変化がＭＨＣ遺伝子の挿入例えばブタＭＨＣ、ドナーＭＨＣ遺伝子、レシピエントＭＨＣ遺伝子、非霊長類ＭＨＣ遺伝子又は非ヒトＭＨＣ遺伝子の挿入であるならば、ＭＨＣ遺伝子の挿入以外によって遺伝的に変えられたドナー細胞又は造血幹細胞以外の遺伝的に変えられた細胞の一方又は両方をもレシピエント中に導入する。好適具体例において、もしＭＨＣ遺伝子例えばブタＭＨＣ、ドナーＭＨＣ遺伝子、レシピエントＭＨＣ遺伝子、非霊長類ＭＨＣ遺伝子、又は非ヒトＭＨＣ遺伝子であるトランスジーンを有する細胞をレシピエントに投与するならば、ＭＨＣ遺伝子例えばブタＭＨＣ、ドナーＭＨＣ遺伝子、又はレシピエントＭＨＣ遺伝子、非霊長類ＭＨＣ遺伝子、又は非ヒトＭＨＣ遺伝子以外のトランスジーンを有する第２の細胞も又、そのレシピエントに投与される。好適具体例において、遺伝子工学処理したとは、トランスジーンを含むことをいい；ドナー幹細胞は、遺伝子工学処理された変化例えばドナー移植片細胞にはないトランスジーンを有し；ドナー移植片細胞は、遺伝子工学による変化例えばドナー幹細胞にないトランスジーンを有し；ドナー幹細胞は、第１の遺伝子工学による変化例えば幹細胞とレシピエントの分子又は細胞との間の相互作用を増大させる第１のトランスジーンを有し、そしてドナー移植片細胞は第２の遺伝子工学による変化例えばドナー移植片細胞とレシピエントの分子又は細胞との間の相互作用を減じる第２のトランスジーンを有する。好適具体例において、ドナー幹細胞は、移植片支持蛋白質例えば造血ペプチドをコードするトランスジーンを含み、ドナー移植片細胞はドナー幹細胞のトランスジーンを含まない。他の好適具体例において、ドナー移植片細胞は、移植片拮抗性である遺伝子産物例えば移植片拮抗性であるレシピエント蛋白質に対するレセプターである遺伝子産物の作用を阻止するトランスジーンを含み、ドナー幹細胞はそのトランスジーンを含まない。更に他の好適具体例において、ドナー幹細胞は、移植片支持蛋白質例えばヒト成長因子又はサイトカインのレセプター例えば造血の調節に関与する成長因子又はサイトカインのレセプターをコードするトランスジーンを含む。成長因子又はサイトカインのレセプターの例には、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ −３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、Ｅｐｏ及びウテロフェリンのレセプターが含まれる。更に他の好適具体例において、ドナー幹細胞は、移植片支持蛋白質例えばヒトの接着分子例えば造血細胞の植付け及び／又は維持に関与する接着分子をコードするトランスジーンを含む。ヒト接着分子の例には、ＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８及びＣＤ３４が含まれる。更に別の好適具体例において、ドナー幹細胞、ドナー移植片細胞、又はこれらの両方は、レシピエント若しくはドナーの蛋白質、ドナー細胞により開始されるレシピエントに対する免疫応答を（例えば、第２のサイトカインの活性レベルの刺激又は阻止により）直接又は間接にを阻止するサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＴＧＦ−βをコードするトランスジーンを含む。更に別の好適具体例において、ドナー幹細胞、ドナー移植片細胞、又はこれらの両方は、移植片支持蛋白質例えば、レシピエント細胞により開始されるドナー組織に対する免疫応答を（例えば、第２のサイトカインの活性レベルの刺激又は阻止により）直接又は間接に阻止するレシピエント若しくはドナーのサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−２又はＴＧＦ−βをコードするトランスジーンを含む。更に別の好適具体例において、ドナー幹細胞、ドナー移植片細胞、又はこれらの両方は、移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を阻止するトランスジーンを含む。移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を阻止するトランスジーンの例には、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現若しくは作用を直接若しくは間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ例えばレシピエント由来蛋白質に対するドナーにコードされるレセプターの発現を阻止する（それにより、そのレシピエント由来蛋白質の発現を阻止する）アンチセンスＲＮＡをコードするトランスジーン；ドナーの移植片支持蛋白質をコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、例えば相同組換えによりドナーゲノム中に挿入された場合に内因性遺伝子を生じるトランスジーン｛該内因性遺伝子は、誤発現され又は、例えば、ドナーの移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異（例えば、欠失）の導入により、突然変異によって不活性化されている｝（例えば、トランスジーンの挿入は、移植片拮抗性蛋白質であるレシピエント由来蛋白質に対するドナー由来レセプターについてのノックアウトを生じる）；ドナー若しくはレシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質のインヒビター例えば競争的インヒビター若しくはプロテアーゼその他の移植片拮抗性蛋白質の活性を特異的に阻止する分子をコードするトランスジーン；並びに移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主サイトカインに対するドナー細胞レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするトランスジーンが含まれる。更に他の好適具体例において、トランスジーンは、移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を、例えばその遺伝子産物の発現を減じることにより阻止する。例えば、トランスジーンは、ドナーの移植片拮抗性蛋白質例えばドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターをコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、ドナーゲノム中に例えば相同組換えによって挿入された場合に内因性遺伝子を生じるものである｛該内因性遺伝子は、誤発現され又は、例えば、ドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターをコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異（例えば、欠失）の導入によって、突然変異により不活性化されている｝。トランスジーンは、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現又は作用を直接又は間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ例えばドナーにコードされるＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターの発現を阻止するアンチセンスＲＮＡをコードするものであってよい。トランスジーンは、移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主サイトカインに対するドナー細胞レセプター又はドナーのＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするものであってよい。更に別の好適具体例において、ドナー幹細胞、ドナー移植片、又はこれらの両方は、キメラ分子例えばキメラリンホカイン例えばＰＩＸＹ１２３をコードするトランスジーンを含む。更に別の好適具体例において、ドナー哺乳動物及びレシピエント哺乳動物は、異なる種であり、例えば、それらは、不一致の霊長類例えばヒトレシピエント及び非ヒトドナーであり；レシピエントは霊長類例えばヒトであり；ドナーはブタ例えばミニブタである。更に別の好適具体例において、ドナー哺乳動物及びレシピエント哺乳動物は、同じ種であり、例えば、両者は、霊長類例えばヒトであり；レシピエント及びドナーは同じ種であり、ドナー幹細胞は例えば培養ドナー幹細胞のレトロウイルストランスフォーメーションにより導入されたトランスジーンを含み、ドナー移植片の細胞はトランスジーンを含まない。更に別の好適具体例において、幹細胞のドナー及び移植片のドナーは、両者ともミニブタであり、幹細胞ドナーは、移植片支持蛋白質を発現するように遺伝子工学処理した系統に由来し；移植片ドナーは、移植片の受容又は機能に拮抗性である蛋白質についての減少した発現を有するように遺伝子工学処理した系統であり；移植片ドナー及び幹細胞ドナーは、同系繁殖体であり；移植片ドナー及び幹細胞ドナーはＭＨＣ同一である。更に別の好適具体例において、トランスジーンは、ブタプロモーター例えばブタ造血遺伝子プロモーター；ウイルスプロモーター；又は誘導可能な若しくは発生的に調節されたプロモーターを含めて天然のもの以外のプロモーターに操作可能に結合された核酸を含む。更に別の好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ幹細胞は、培養細胞例えば初代培養例えば造血幹細胞の初代培養から単離され又は誘導され；トランスジェニック動物から単離され又は誘導され；臍帯血から単離され又は誘導され；移植片細胞が得られる個々の動物から得られ；移植片細胞が得られる個々の動物と同系である個々の動物から得られ；移植片細胞が得られる個々の動物とＭＨＣマッチし好ましくは同一である個々の動物から得られ；臍帯血、骨髄造血幹細胞又は胎児若しくは新生児肝若しくは脾臓細胞造血幹細胞である。好適具体例において、ドナー移植片細胞は、造血幹細胞又は他の血液細胞以外のものであり；ドナー移植片細胞は、ブタ胸腺細胞例えばブタ胸腺間質細胞であり；ドナー移植片細胞は、骨髄間質細胞であり；ドナー移植片細胞は、ドナー移植片細胞は、ブタ肝臓細胞であり；ドナー移植片細胞は、ブタ腎臓細胞であり；ドナー移植片細胞は、ブタ上皮細胞であり；ドナー移植片細胞は、ブタ筋肉細胞例えば心臓細胞であり；ドナー移植片細胞は、ブタニューロン細胞であり；移植片細胞は、器官例えば腎臓、肝臓又は心臓を含み；ドナー移植片細胞は、樹状細胞又はそれらの前駆体を含む。他の好適具体例には、レシピエントに、ドナー種特異的な間質組織好ましくは造血間質組織例えば胎児肝又は胸腺を導入するステップが含まれる。好適具体例において、間質組織を、造血幹細胞と同時に又は該細胞より前に導入する。好適具体例においては、間質組織を、遺伝子工学処理して、間質細胞とレシピエントの細胞又は分子との間の所望の相互作用を促進し；遺伝子工学処理して、レシピエントの細胞又は分子と間質細胞との間の望ましくない相互作用を阻止する。他の好適具体例には、移植片細胞の移植前又は移植と同時にトランスジェニック幹細胞をレシピエントに投与するもの；造血幹細胞がレシピエント中のある部位に向かうもの；幹細胞を静脈注射によって投与するものが含まれる。他の好適具体例には、レシピエント哺乳動物のナチュラルキラー細胞を、例えばそのレシピエント哺乳動物にそのレシピエントのナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体を導入することにより不活性化すること；そのレシピエント哺乳動物のＴ細胞を、例えばそのレシピエントにそのレシピエントのＴ細胞に結合し得る抗体を導入することにより不活性化すること（好ましくは、幹細胞の投与前）が含まれる。他の好適具体例には、例えば、約１００〜４００ラドの低線量全身照射でレシピエントを照射すること、骨髄抑制剤をレシピエントに投与してレシピエントの骨髄を涸渇させ又は部分的に涸渇させることの１つ以上によって造血空間を造るステップが含まれ；この方法は、造血空間を造るステップを含み且つそのステップをトランスジェニック細胞をレシピエントに導入する前に実施する。他の好適具体例には、レシピエント哺乳動物を約７００ラドの胸腺照射を用いて照射すること；抗Ｔ細胞抗体の１投与量好ましくは２投与量以上を投与すること；又はレシピエントに１９９４年３月２９日出願の米国特許出願第０８／２２０，３７１号に記載のように短期間免疫抑制剤を投与することの１つ以上によって（好ましくは、造血幹細胞移植前に）胸腺Ｔ細胞を不活性化することが含まれる。他の好適具体例には、レシピエント哺乳動物の血液中の天然の抗体を、例えばブタから得た器官（例えば、肝臓又は腎臓）を血液潅流するか又は天然抗体を不活性化させ若しくは涸渇させる薬物例えばデオキシスパガリン（ＤＳＧ）を投与することによって涸渇させるかさもなければ不活性化させるステップが含まれ；この方法は、レシピエントの血液中の天然抗体を涸渇させるかさもなければ不活性化させるステップを含み且つそのステップを造血幹細胞の移植前に実施する。例えばレトロウイルスでトランスフォームした培養細胞又はトランスジェニック動物から誘導したこの発明のトランスジェニックブタ細胞を、異種個体環境におけるブタ造血細胞の植付けを命ずる任意の方法において用いることができる。例えば、この発明の細胞を、次の方法と組み合わせることができる：シクロスポリン若しくは類似の薬剤を短期間投与することにより移植片の寛容を誘導し或は受容を促進する方法、例えば１９９４年３月２９日に出願された米国特許出願第０８／２２０，３７１号に記載された方法；異種個体胸腺移植片の移植を用いて寛容を誘導する方法、例えば１９９３年１２月７日に出願された米国特許第０８／１６３，９１２号に記載された方法；寛容促進若しくはＧＶＨＤ阻止サイトカインの活性レベルを増大させ又は寛容阻止若しくはＧＶＨＤ促進サイトカインの活性レベルを減少させる方法、例えば１９９３年８月３０日に出願された米国特許出願第０８／１１４，０７２号に記載された方法；臍帯血液細胞を用いて寛容を誘導する方法、例えば１９９３年１１月１０日に出願された米国特許第０８／１５０，７３９号に記載された方法；１９９３年９月２３日に出願された米国特許出願第０８／１２６，１２２号の方法；及び１９９４年２月１４日に出願されたSykes 及びSachs のＰＣＴ／ＵＳ９４／０１６１６に開示された寛容を誘導する方法。他の面において、この発明は、ドナーブタ造血幹細胞により異種レシピエント例えば霊長類例えばヒトの骨髄の植付け及び又は再増殖を促進し、それにより、その異種レシピエント中に混合キメリズムを誘導する方法を特徴とする。この方法は、ドナー幹細胞とレシピエントの細胞若しくは分子との間の望ましい相互作用を促進するように遺伝子工学処理された又はレシピエントとドナー幹細胞との間の望ましくない相互作用を阻止するように遺伝子工学処理されたブタ細胞（造血幹細胞であってもよく、そうでなくてもよい）を供給し；そして遺伝子工学処理したブタ細胞をレシピエントに移植することを含み、但し、遺伝子工学処理した細胞がブタ造血幹細胞でないならば、ブタ造血幹細胞もそのレシピエントに移植する。好適具体例において、この遺伝子工学による改変は、ＭＨＣ遺伝子例えばブタＭＨＣ遺伝子、ドナーＭＨＣ遺伝子、レシピエントＭＨＣ遺伝子、非霊長類ＭＨＣ遺伝子又は非ヒトＭＨＣ遺伝子の挿入以外のものである。好適具体例において、遺伝子工学処理したとは、トランスジーンを含むことをいう。他の好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ細胞は、移植片支持蛋白質例えばヒト成長因子又はサイトカインレセプター例えば造血の調節に関与する成長因子又はサイトカインレセプターをコードするトランスジーンを含む。成長因子又はサイトカインレセプターの例には、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、Ｅｐｏ及びウテロフェリンに対するレセプターが含まれる。更に別の好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ細胞は、移植片支持蛋白質例えばヒトの接着分子例えば造血細胞の植付け及び／又は維持に関与する接着分子をコードするトランスジーンを含む。ヒトの接着分子の例には、ＶＬＡ− ４、ｃ−ｋｉｔ、ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８及びＣＤ３４が含まれる。更に別の好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ細胞は、移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を阻止するトランスジーンを含む。移植片拮抗性である遺伝子産物の発現又は作用を阻止するトランスジーンの例には、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現又は作用を直接又は間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ例えばレシピエント由来の蛋白質に対するドナーにコードされるレセプターの発現を阻止する（それにより、レシピエント由来の蛋白質の作用を阻止する）アンチセンスＲＮＡをコードするトランスジーン；ドナー移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、例えば相同組換えによってドナーゲノム中に挿入された場合に内因性遺伝子を生じるトランスジーン｛該内因性遺伝子は、誤発現され又は、ドナー移植片拮抗性蛋白質をコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異（例えば、欠失）の導入によって、突然変異により不活性化されている｝（例えば、トランスジーンの挿入は、移植片拮抗性であるレシピエント由来の蛋白質に対するドナー由来のレセプターについてのノックアウトを生じる）；ドナー若しくはレシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質のインヒビター例えば競争的インヒビター又はプロテアーゼその他の移植片拮抗性蛋白質の活性を特異的に阻止する分子をコードするトランスジーン；及び移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主サイトカインに対するドナー細胞レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするトランスジーンが含まれる。更に他の好適具体例において、遺伝子工学処理したブタ細胞は、移植片拮抗性である遺伝子産物の作用を、例えばその発現を減じることにより阻止するトランスジーンを含む。例えば、トランスジーンは、ドナー移植片拮抗性蛋白質例えばドナー細胞のＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターをコードする遺伝子の突然変異により不活性化されたコピーであって、例えば相同組換えによりドナーゲノム中に挿入された場合に内因性遺伝子を生じるものである｛該内因性遺伝子は、誤発現され又は、ドナーのＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプターも若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターをコードする遺伝子の内因性ゲノムコピー中への突然変異（例えば、欠失）の導入によって、突然変異により不活性化されている｝。トランスジーンは、レシピエント由来の移植片拮抗性蛋白質の発現又は作用を直接又は間接に阻止するアンチセンスＲＮＡ例えばドナーにコードされるＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターの発現を阻止するアンチセンスＲＮＡをコードするものであってよい。トランスジーンは、移植片拮抗性である遺伝子産物例えば宿主サイトカインに対するドナー細胞レセプター又はドナーＢ−７レセプター、ＣＤ２７レセプター若しくはＬＦＡ−３レセプターにおける優性の負の突然変異をコードするものであってよい。更に別の好適具体例において、遺伝子工学処理されたブタ細胞は、レシピエント又はドナー蛋白質、レシピエントに対してドナー細胞により開始される免疫応答を（例えば、第２のサイトカインの活性レベルの刺激又は阻止によって）直接又は間接に阻止するサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ−４又はＴＧＦ−βをコードするトランスジーンを含む。更に別の好適具体例において、遺伝子工学処理されたブタ細胞は、移植片支持蛋白質例えばドナー組織に対してレシピエント細胞により間始される免疫応答を（例えば、第２のサイトカインの活性レベルの刺激又は阻止により）直接又は間接に阻止するレシピエント又はドナーのサイトカイン例えばＩＬ−１０、ＩＬ −４又はＴＧＦ−βをコードするトランスジーンを含む。更に別の好適具体例において、遺伝子工学処理されたブタ細胞は、キメラ分子例えばキメラリンホカイン例えばＰＩＸＹ１２３をコードするトランスジーンを含む。更に他の好適具体例において、遺伝子工学処理されたブタ細胞は、培養細胞例えば初代培養例えば造血幹細胞の初代培養から単離若しくは誘導され；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、トランスジェニック動物から単離若しくは誘導され；もし遺伝子工学処理されたブタ細胞が幹細胞でないならば、遺伝子工学処理されたブタ細胞及びやはり投与される幹細胞は、同じ動物から、（この発明の改変を除いて）同系である動物から若しくはＭＨＣマッチし且つ好ましくはＭＨＣ同一である動物から得られ；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、臍帯血細胞、骨髄造血幹細胞又は胎児若しくは新生児肝若しくは脾臓細胞造血幹細胞である。好適具体例において、遺伝子工学処理されたブタ細胞は、造血幹細胞若しくは他の血液細胞以外のものであり；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、胸腺細胞例えばブタ胸腺間質細胞であり；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、骨髄間質細胞であり；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、ブタ肝細胞であり；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、ブタ腎臓細胞であり；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、ブタ上皮細胞であり；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、ブタ筋肉細胞例えば心臓細胞であり；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、ブタニューロン細胞であり；遺伝子工学処理されたブタ細胞は、ブタ樹状細胞又はそれらの前駆体である。他の好適具体例には、（好ましくは、幹細胞を投与する前に）レシピエント哺乳動物のナチュラルキラー細胞を、例えばそのレシピエント哺乳動物にそのレシピエントのナチュラルキラー細胞に結合し得る抗体を導入することによって不活性化すること；レシピエント哺乳動物のＴ細胞を、例えばそのレシピエントにそのレシピエントのＴ細胞に結合し得る抗体を導入することにより不活性化することが含まれる。他の好適具体例には、例えば、約１００〜４００ラドの低線量の全身照射でレシピエントを照射すること、骨髄抑制剤をレシピエントに投与すること又は抗クラスＩ抗体をレシピエントに投与することの１つ以上によりそのレシピエントの骨髄を涸渇又は部分的に涸渇させることによって造血空間を造るステップが含まれ；この方法は、造血空間を造るステップを含み且つそのステップはトランスジェニック細胞をレシピエント中に導入する前に実施する。他の好適具体例には、（好ましくは、造血幹細胞移植前に）レシピエント哺乳動物を例えば約７００ラドの胸腺照射で照射し；抗Ｔ細胞抗体の１投与量好ましくは２投与量以上を投与し；又は１９９４年３月２９日に出願された米国特許出願第０８／２２０，３７１号に記載された免疫抑制剤を短期間レシピエントに投与することの１つ以上によって胸腺Ｔ細胞を不活性化することが含まれる。他の好適具体例には、例えばブタから得た器官例えば肝臓若しくは腎臓を血液潅流すること又は天然抗体を不活性化し若しくは涸渇させる薬剤例えばデオキシスパガリン（ＤＳＧ）を投与することにより、レシピエント哺乳動物の血液中の天然抗体を涸渇させ或は不活性化させるステップが含まれ；この方法は、レシピエントの血液中の天然抗体を涸渇させ或は不活性化するステップを含み且つそのステップは造血幹細胞移植の前に行なう。好適具体例において、この方法は、ドナーから得られた移植片（造血幹細胞と異なる器官例えば肝臓又は腎臓から得られたもの）をレシピエントに導入するステップを含む。一般に、この発明の遺伝子工学処理したブタ細胞は、当業者に公知の方法例えばブタ細胞のレトロウイルストランスダクションにより作成することができる。この発明のトランスジェニックブタの製造方法は、標準的トランスジェニック技術を用いる。これらの方法には、例えば接合体若しくは生物のレトロウイルスを含むウイルスによる感染；組織のウイルス感染及びその後のその組織の動物への再導入；及び動物の胚性幹細胞への組換え核酸の導入及びその後のその胚性幹細胞の適当な操作によるトランスジェニック動物の生成が含まれる。特に、この発明は、生殖細胞及び体細胞が、造血ペプチドをコードするＤＮＡ配列及びそのＤＮＡ配列に操作可能に結合された組織特異的プロモーターを含むトランスジーンを含むトランスジェニックブタを特徴とし、その組織特異的プロモーターは、そのブタの骨髄細胞におけるその造血ペプチドの発現を達成し、このトランスジーンは、その動物又はその先祖の胎児細胞に導入する。この発明の更に別の面は、薬剤例えば治療剤例えば造血系疾患の治療において有用な薬剤を、この発明のトランスジェニックブタに対するその薬剤の効果を評価することによって同定し又は試験する方法を特徴とする。説明のための具体例において、薬剤をトランスジェニックブタに投与して、造血組織の状態（代謝面若しくは遺伝子発現の面）を評価し且つ対照標準（例えば、対照用トランスジェニック動物）のそれと比較する。本方法を用いて、例えば、ヒトの造血系成長因子のアゴニスト又はアンタゴニストのイン・ビボでの効力を測定することができる。同様の実験を、培養細胞を用いて行なうことができる。異種ドナーの造血幹細胞は、異種レシピエント中に植付けられた場合に、移植されたドナー器官に対するドナー特異的寛容の状態を誘導することができることが示されている。低レベルの造血系キメリズムでさえも、この寛容状態を誘導するのに十分であり得る。しかしながら、キメリズムの喪失（これは、しばしば、生じる）が、寛容の付随的喪失と関連する。この発明の動物、細胞、トランスジーン及び方法を用いて、キメリズムの形成及び維持を促進することができる。この発明のトランスジーン、トランスジェニック細胞、トランスジェニック動物及び方法は又、薬物試験プロトコール例えばヒトレセプター又は接着分子と相互作用する薬剤を同定するプロトコール例えばヒトの成長因子又は接着分子のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する薬剤を同定するプロトコールにおいても有用である。この発明のトランスジーン、トランスジェニック細胞、トランスジェニック動物及び方法は又、ヒトのレセプター又は接着分子とブタリガンドとの間の相互作用の種特異性を測定するためにも有用である。この発明の他の特徴及び利点は、下記の詳細な説明及び請求の範囲より明らかとなろう。発明の詳細な説明最初に、図面を簡単に説明する。図面図１は、ＧＳ４．５レトロウイルス構築物のダイヤグラムである。図２は、ＧＳ４．５プロウイルスゲノム及び予想される転写物のダイヤグラムである。図３ａ及び３ｂは、トランスダクションした細胞のフローサイトメトリープロフィルの表示である。図４は、トランスダクションアッセイのダイヤグラムである。Ｉ．異種骨髄の再増殖この発明の具体例は、遺伝子工学処理したブタ細胞例えば、組換えペプチド例えばヒトペプチドを発現する遺伝子工学処理した造血幹細胞に関係する。これらのペプチドは、異種宿主に移植されたブタ細胞の生存、植付け、増殖又は機能のいずれかを促進する。典型的具体例においては、ヒトの造血組織例えば骨髄で見出されるようなヒト造血環境の存在下で、幹細胞の生存、植付け、増殖若しくは機能、又は幹細胞の分化した細胞型への発生が促進される。これらの処理した細胞は、例えばヒト成長因子レセプター例えば造血の制御に関与するヒト成長因子を発現することができる。ヒト成長因子レセプターの例には、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−ＩＬＩＬ−２、Ｅｐｏ及びウテロフェリンに対するレセプターが含まれる。他の典型的具体例において、これらの処理した細胞は、造血細胞の植付け及び／又は維持に関与するヒト接着分子を発現する。かかる分子の例には、ＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ− １、ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−ＬＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８及びＣＤ３４が含まれる。不一致の骨髄移植の競争的再増殖は、異種個体の造血細胞が、特に、非骨髄消耗的養生法の一部として移植された場合に、異種宿主の再構成に対して競争的不利益であり得ることを示した。即ち、宿主の幹細胞を利用できる場合には、それらの宿主細胞は、一般に、宿主の再構成において競争的有利さを有する。この競争的有利さは、植付けられた異種個体造血幹細胞による再構成を阻止する主要な因子であり得る。幾つかの因子は、移植された異種個体の幹細胞を超える自己の骨髄により享受される競争的利益の原因であり得る。この利益は、部分的に、異種個体の細胞が成長因子と宿主の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分とを十分に組み合わせることができないことから由来するようである。細胞外マトリックス成分及び成長因子の両者は、造血の調節並びに造血幹細胞及び分化した造血細胞の両者の維持において重要な役割を演じ、それ故に、異種個体の細胞の生存に重要である。幹細胞の維持は、例えば、成長因子結合並びに植付けのための周囲の細胞例えば間質細胞との近距離相互作用を必要とする。しかしながら、ＥＣＭ相互作用及び造血細胞による成長因子結合は、少なくとも部分的に、種依存性であり得て、異種個体セッティングにおいて、移植された骨髄は、自己骨髄と比較して、少なくとも有糸分裂促進性刺激又は植付けにおいて、競争的不利益にある。例えば、接着分子相互作用（ＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８又はＣＤ３４により媒介されるもの等）の種特異性は、造血において重要であると考えられる。かかる接着分子の宿主種からのリガンドとの相互作用の失敗は、異種個体幹細胞によるホーミング及び再構成に対する主要な障害であり得る。同様に、幾つかの成長因子例えば造血成長因子は、それらのレセプター相互作用における変化する程度の種特異性を示すことが知られている。例えば、Ｇ−ＣＳＦは、有意の（絶対的ではないが）種特異性を示す。例えば、ＩＬ−３は、非常に顕著な種特性を有する。下記に一層詳述する説明のための具体例において、ヒトｃ−ｋｉｔレセプター（以後、「ｃ−ｋｉｔ」という）、ＳＣＦのリガンドを、ブタ幹細胞中に処理する。ヒトのｃ−ｋｉｔを有する幹細胞は、間質細胞に結合したヒトＳＣＦと効果的に相互作用することができ且つヒトＳＣＦは、この組換えブタ幹細胞に対する成長因子として作用することができるので、ヒト骨髄により享受される植付けられたブタ幹細胞に対する競争的有利さの幾らかは、失われるであろう。従って、ｃ−ｋｉｔヒト化されたブタ細胞の使用は、ブタ幹細胞によるヒト患者の改善された再構成を促進することができる。類似のアプローチを、ヒト造血成長因子レセプター例えばＩＬ−３レセプター及びＧＭ−ＣＳＦレセプターについて並びに造血に関与するヒト接着分子について用いることができ、それにより、ブタ細胞は、ヒトリガンドと効果的に相互作用する。従って、この発明の１つの面において、主題の「ヒト化」ブタ細胞を、異種移植プロトコールにおいて用いることができる。造血細胞を調節するヒト因子に対して応答する改善された能力（野生型ブタ細胞と比較して）のために、これらのヒト化細胞を用いて、ブタ造血幹細胞の植付け及び／又は生存を改善し、それにより、ヒト患者における寛容を促進することができる。本発明の好適具体例には、例えば、本発明の組換え核酸分子を含み且つ発現する少なくとも１つの細胞を有するトランスジェニック哺乳動物を生成することにより、異種移植片組織の源として用いる場合に、ヒト造血ペプチドを発現するブタ細胞を与えることにより、対応野生型細胞と比較して成長の選択的有利さをトランスジェニック細胞に与える方法が含まれる。この組換え核酸分子を含むトランスジェニック哺乳動物を、その組換え核酸分子中に存在する造血モジュレーター遺伝子に関して、その細胞内で発現されるのに十分な期間維持し、それにより、他の種に移植された場合におけるそのトランスジェニック細胞に対する選択的有利さ（対応する野生型細胞と比較して）を与える。他の面において、これらの組換えブタ細胞、特にかかる細胞を有するトランスジェニックブタは、組換えヒト造血因子の効力をアッセイするために有用である。ここで用いる場合、移植片支持蛋白質は、次の特性の１つ以上を有する蛋白質をいう：ブタ細胞中で発現された場合に、異種ドナーにおけるその細胞の受容を延長し或は促進し；ブタ細胞中で発現された場合に、異種ドナーにおける他のブタ細胞の受容を延長し或は促進し；ブタ細胞中で発現された場合に、異種ドナーにおけるそのブタ細胞の機能を増大させ或は促進し；ブタ細胞中で発現された場合に、異種ドナーにおける他のブタ細胞の機能を増大させ或は促進する。移植片支持蛋白質は、それが作用する細胞の移植又は組織の異種宿主における移植の前に又はその後に或はその両方において発現することができる。移植片支持蛋白質は、それが作用した細胞又は組織が異種レシピエントに移植される前又はその後に、或はその両方においてブタ細胞又は組織に対してその作用を発揮することができる。例えば、移植片支持蛋白質を培養細胞中で発現させ、次いで、移植片支持蛋白質を発現している培養細胞を（単独で又は他のブタ組織と共に）ドナーに移植することができ；移植片支持蛋白質をトランスジェニックブタにおいて発現させ、そのトランスジェニックブタからの移植片支持蛋白質を発現している細胞を（単独で又は他のブタ組織と共に）ドナーに移植することができる。｛作用した細胞又は組織は、移植片支持蛋白質が直接又は（他の細胞に対する作用を介して）間接に影響を有する細胞又は組織であり；作用した細胞又は組織は、移植片支持蛋白質を発現する細胞又は組織であってよく、或は移植片支持蛋白質を発現しない細胞例えば移植片支持蛋白質発現細胞と共に移植された細胞又は組織であってよい。｝移植片支持蛋白質の例には、レシピエントＨＬＡ分子；レシピエント成長因子レセプター；レシピエント接着分子；及び移植片に対する機能に関係するレシピエント又はドナーの蛋白質が含まれる。移植片支持蛋白質には、造血蛋白質が含まれる。ここで用いる場合、移植片拮抗性蛋白質は、移植片組織又はレシピエントによるその発現が、ドナー組織又はレシピエントに対する免疫応答を促進する蛋白質であるか、或は、幹細胞の機能に対して拮抗性であるか、或は、レシピエントによるドナー幹細胞又は移植片の受容に対して拮抗性である蛋白質である。移植片拮抗性蛋白質の例は、ドナー細胞に対する免疫応答を媒介する宿主蛋白質に対するドナー細胞表面レセプター、例えば、ドナー細胞のＢ７、ＣＤ２７若しくはＬＦＡ−３レセプター又は宿主サイトカインに対するドナーレセプターである。ここで用いる場合、用語「トランスジーン」は、（例えば、１つ以上の造血ペプチドをコードする）核酸配列を意味し、それは、それが導入されるトランスジェニック動物又は細胞に対して部分的に又は完全に異質的であり、即ち外来性であり、或は、それが導入されるトランスジェニックブタ又は細胞の内因性遺伝子と相同性であるが、その動物のゲノム中に、それが挿入される細胞のゲノムを変化させるような仕方で挿入されるようにデザインされ又は挿入される（例えば、それは、天然の遺伝子における位置と異なる位置に挿入され又はその挿入はノックアウトを生じる）。トランスジーンは、１つ以上の転写調節配列及び選択した核酸の最適な発現に必要であり得る任意の他の核酸例えばイントロンを含むことができる（すべては、選択した核酸に操作可能に結合され、又、エンハンサー配列を含むことができる）。ここで用いる場合、用語「トランスジェニック細胞」は、トランスジーンを含む細胞をいう。ここで用いる場合、「トランスジェニック動物」は、その動物の細胞緒の１つ以上、好ましくはすべてがトランスジーンを含む任意の動物である。トランスジーンは、その細胞の前駆体への送達用遺伝子操作例えばマイクロインジェクション又は組換えウイルスでの感染による導入よって直接又は間接的に細胞に導入される。この用語遺伝子操作は、古典的な交雑育種又はイン・ビトロ受精を含ず、組換えＤＮＡ分子の導入を指している。この分子は、染色体中にインテグレートされ得るか、又は、それは染色体外で複製するＤＮＡであってよい。ここに記載のトランスジェニック動物において、トランスジーンは、細胞に、組換えペプチド（例えば、組換え造血ペプチド例えば造血の調節に関与するヒト成長因子又はサイトカインレセプター例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、Ｅｐｏ若しくはウテロフェリン、又は造血細胞の植付け及び／又は維持に関与するヒト接着分子例えばＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８若しくはＣＤ３４に対するレセプター）の発現を引き起こす（野生型の非トランスジェニック動物においてはかかる造血ペプチドを発現しない細胞において）。１つ以上のヒト造血ペプチドをコードする１つ以上のトランスジーンを含むトランスジェニックブタは、この発明の範囲内にある。例えば、２つ又は３つのトランスジーンを含む二重又は三重トランスジェニック動物を生成することができる。ここで用いる場合、用語「生殖細胞系列トランスジェニック動物」は、トランスジーンの遺伝情報が生殖細胞系列に存在し、それにより、その情報を子孫に伝える能力を付与されたトランスジェニック動物をいう。もしかかる子孫が実際にその情報の幾らか又はすべてを有するならば、それらもトランスジェニック動物である。用語「造血遺伝子」は、ここで用いる場合、その遺伝子産物好ましくはヒトの遺伝子産物が、ブタ造血細胞により発現されたときに、競争的に霊長類例えばヒト宿主を再構成するブタ造血幹細胞の能力を増大させ得る任意の遺伝子を意味する。例えば、ヒト遺伝子産物は、ヒト患者における組換えブタ細胞の増殖能力を増大させることができ；細胞外マトリックス成分に結合するブタ細胞の能力を増大させることができ；又はブタ骨髄細胞の機能活性を増大させることができる。好適具体例において、ヒト造血遺伝子は、細胞表面蛋白質；ヒト造血成長因子レセプター例えばＧ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ −１１、ＩＬ−２、Ｅｐｏ；若しくはウテロフェリン、又は造血細胞の植付け及び／又は維持に関与するヒト接着分子例えばＶＬＡ−４、ｃ−ｋｉｔ、ＬＦＡ− １、ＣＤ１１ａ、Ｍａｃ−１、ＣＲ３、ＣＤ１１ｂ、ｐ１５０、ｐ９５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ａ、ＬＰＡＭ−１、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４４、ＣＤ３８若しくはＣＤ３４に対するレセプターをコードする。ヒト造血遺伝子の遺伝子産物は、ここでは、「ヒト造血蛋白質又はペプチド（用語蛋白質、ペプチド及びポリペプチドは、この意味において、交換可能に用いる）」として言及し且つヒト造血成長因子レセプター及びヒト造血接着分子を含む。用語「増殖因子」又は「造血成長因子」は、例えば組換えブタ細胞の増殖を刺激し、ＥＣＭ成分への結合を促進し及び／又は細胞の機能活性を増大させることのできる生物学的に活性な分子を記述するために用いる。用語「サイトカイン」は、成長因子と交換可能に用いる。造血成長因子の例には、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−２、Ｅｐｏ及びウテロフェリンが含まれる。「成長因子レセプター」は、細胞により、典型的には、細胞外表面にて発現される蛋白質であって、その細胞による成長因子の結合を促進し及び単独若しくは他の細胞蛋白質と共に、成長因子の結合に対する細胞内での生物学的応答を誘導する蛋白質である。造血遺伝子には、ハイブリッド蛋白質例えばヒト及びブタ成分の両方をコードするペプチド例えばヒト細胞外ドメイン及びブタ細胞内若しくは膜貫通ドメインを有するハイブリッドレセプターをコードするものが含まれる。造血蛋白質は、造血遺伝子によりコードされる蛋白質である。ここで用いる場合、用語「操作可能に結合した」は、選択したＤＮＡ例えば造血ペプチドをコードするＤＮＡが転写調節配列例えば組織特異的プロモーターの近くにあって、その調節配列が選択したＤＮＡの発現を調節することを可能にすることを意味する。用語「遺伝的にプログラムされた」は、ここで用いる場合、細胞のＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白質含有物を永久に変えることを意味する。典型的には、この遺伝的プログラミングは、造血ペプチドをコードする組換え核酸分子をブタ細胞に導入することにより達成する。ここで用いる場合、用語「組換えブタ細胞」は、組換えベクター又は他のトランスファー核酸に対するレシピエントとして用いられ、トランスフェクト又はトランスフォームされた元の細胞の子孫を含む、ブタ好ましくはミニブタから誘導された細胞をいう。好適具体例において、組換えブタ細胞は、ブタ造血幹細胞例えばブタ骨髄造血細胞から誘導され、組換えヒトペプチドを発現するように遺伝的にプログラムされた。組換えブタ細胞には、トランスジーン又は他の核酸ベクターが宿主細胞ゲノム中に取り込まれた細胞並びに宿主細胞ゲノムからの自律性を維持している発現ベクターを有する細胞が含まれる。ここで用いる場合、用語「トランスフェクション」は、核酸例えば発現ベクターのレシピエント細胞中への核酸媒介の遺伝子トランスファーによる導入を意味する。「トランスフォーメーション」は、ここで用いる場合、外因性ＤＮＡ又はＲＮＡの細胞による取り込みの結果として細胞の遺伝子型が変化する過程をいい、例えば、トランスフォームされたブタ細胞はヒト細胞表面ペプチドを発現する。ここで用いる場合、用語「ベクター」は、それが結合された他の核酸を輸送することのできる核酸分子をいう。好適ベクターの１つの型は、エピソーム即ち染色体外で複製し得る核酸である。好適ベクターは、自律的な複製及び／又はそれらが結合された核酸の発現が可能なものである。ここでは、操作可能に結合された遺伝子の発現を指令することのできるベクターを、「発現ベクター」として言及する。「転写調節配列」は、開始シグナル、エンハンサー及びプロモーター等のそれらが操作可能に結合された蛋白質コーディング配列の転写を誘導し又は制御するＤＮＡ配列に言及するために明細書中で用いられる包括的用語である。好適具体例において、組換え造血遺伝子の転写は、ヒトにおける組換え遺伝子の発現を天然において制御するか又はブタ細胞における対応遺伝子の発現を天然において制御するプロモーター配列（又は他の転写調節配列）の制御下にある。更に一層好適な具体例において、転写調節配列は、組換え蛋白質の造血特異的発現を引き起こす。上記の具体例には逆らわないが、組換え遺伝子は、組換え蛋白質の転写を天然において制御する配列と異なる転写調節配列の制御下にあってよいことも又、理解されよう。組換え遺伝子の転写は、例えば、合成プロモーター配列の制御下にあってよい。好ましくは、組換え遺伝子の転写を制御するプロモーター配列は、骨髄細胞特に造血細胞において活性である（即ち、遺伝子発現を促進することができる）。組換え遺伝子の転写を制御するプロモーターは、ウイルス起源のものであってよく；例は、ときに、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ＳＶ４０、ブタ水泡病ウイルス（ＳＶＤＶ）及びサイトメガロから誘導されるプロモーターである。ここで用いる場合、用語「組織特異的プロモーター」は、プロモーターとして働く即ち、そのプロモーターに操作可能に結合された選択したＤＮＡ配列の発現を制御するＤＮＡ配列であって且つ特異的細胞例えば造血細胞において選択したＤＮＡ配列の発現を達成するＤＮＡ配列を意味する。この組織特異的プロモーターは、もし専ら造血細胞においてでないならば、優性に発現を指示する。ヒトの造血遺伝子の発現を指示するために特に有用なプロモーター配列には、天然において組換えヒト遺伝子と結合されたプロモーター配列；相同ブタ遺伝子（即ち、組換えヒト遺伝子に対応する遺伝子）と天然に結合したプロモーター配列；主として造血細胞例えばリンパ系細胞、赤血球系細胞若しくは骨髄性細胞において活性であるプロモーター；Brinster等(1983)Nature 306:332-336及びStorb 等(198 4)Nature 310:238-231により記載された免疫グロブリンプロモーター；Ruscon等 (1985)Nature 314:330-334及びGrosscheld等(1984)Cell 38:647-658 により記載された免疫グロブリンプロモーター；Townes等(1985)Mol.Cell.Biol.5:1977-198 3 及びMagram等(1989)Mol.Cell.Biol 9:4581-4584 により記載されたグロビンプロモーターが含まれる。他の造血プロモーターは、ここに記載されており又は当業者には明白であろうし、リンパ系遺伝子例えばＣＤＬＣＤ２、ＣＤ３−γ、ＣＤ３−δ、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−ζ、ＣＤ３−η、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ７２、ＣＤ７６、ｐ５６^lck、ＩＬ−３Ｒβ鎖、Ｊ１１ｄ（熱安定性抗原）、ｆｙｎ、ＮＫ１、ＮＫ２、Ｆｃ、ＲＩγ鎖、ＩＬ−２Ｒβ−鎖、αＴＣＡＲ、βＴＣＡＲ、γＴＣＡＲ、δＴＣＡＲ、ＦｃＹＲＩＩＩ、ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２、Ｉｇ−β（Ｂ２９）又はＩｇＭ−ａ（ＭＢ−１）及び免疫グロブリンイソ型Ｉｇμ、Ｉｇδ、Ｉｇγ、Ｉｇα、Ｉｇε；Ｉｇｋ及びＩｇλに関連した遺伝子から誘導された調節配列が含まれる。更に、かかるプロモーターは又、発現に必要な更なるＤＮＡ配列例えばイントロン及びエンハンサー配列をも含むことができる。この用語は又、選択したＤＮＡの主としてーの組織における発現を調節するが他の組織でも発現を生じるいわゆる「漏れ易い」プロモーターをもカバーする。他の調節要素例えば遺伝子座制御領域例えばＤＮアーゼＩ過敏性部位を含むことができる。「細胞特異的発現」とは、転写調節要素が特定の細胞型例えば骨髄細胞において組換え蛋白質の発現を指示することを意図する。それ故、用語「造血特異的発現」は、実質的に造血細胞に限定された組換え蛋白質の発現をいう。「移植片」は、ここで用いる場合、身体の部分、器官、組織又は細胞をいう。移植片は、器官例えば肝臓、腎臓、心臓又は肺；身体の部分例えば骨又は骨格マトリックス；組織例えば皮膚、腸、内分泌腺；又は種々の型の先祖幹細胞からなってよい。用語「組織」は、ここで用いる場合、移植し得る任意の生物学的材料を意味し、器官（特に、生きた内蔵例えば心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓及び甲状腺）、角膜、皮膚、血管及び他の結合組織、血液細胞及び造血細胞、ランゲルハンス島、脳細胞及び内分泌腺その他の器官及び体液からの細胞を含む細胞を包含する（これらのすべては、移植の候補であり得る）。「不一致の種の組合せ」は、ここで用いる場合、一方から他方へ移植片を移植したときに超急性拒絶が起きる２つの種をいう。主題の発明において、ドナーはブタ起源であり、レシピエントはヒトである。「造血幹細胞」は、ここで用いる場合、細胞例えば骨髄細胞、胎児若しくは新生児肝若しくは脾臓細胞、又は成熟骨髄及び／又はリンパ系細胞に発生し得る請帯血細胞をいう。「先祖細胞」は、ここで用いる場合、分化した子孫を生じさせる細胞をいう。幹細胞と対照的に、先祖細胞は、常に自己再生してはおらず、分化ポテンシャルにおいて比較的限定されている。ここで用いる場合、用語「造血細胞」は、巨核球、単球、顆粒球及び好酸球を含む骨髄細胞系統から誘導された細胞；赤血球系統から誘導された細胞例えば赤血球細胞；リンパ細胞系統の細胞例えばＢリンパ球及びＴリンパ球を含む分化した血液細胞を包含する。一般に理解されているように、上記の細胞系統の各々は、一連の分化ステップを経て、徐々に系列の制限された先祖細胞になる「多能性の造血幹細胞」（ここでは、「造血幹細胞」又は「コロニー形成幹細胞」ともいう）から成熟する。従って、用語造血細胞は又、これらの分化した細胞が発生する種々の造血前駆体細胞例えばＢＦＵ−Ｅ（バースト形成単位−エリスロイド）、ＣＦＵ−Ｅ（コロニー形成単位−エリスロイド）、ＣＦＵ−Ｍｅｇ（コロニー形成単位−巨核球）、ＣＦＵ−ＧＭ（コロニー形成単位−顆粒球−単球）、ＣＦＵ−Ｅｏ（コロニー形成単位−好酸球）及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成単位−顆粒球−赤血球−巨核球−単球）をも包含する。「間質組織」は、ここで用いる場合、機能的要素又は実質組織と区別される器官の支持組織又はマトリックスをいう。「寛容」は、ここで用いる場合、それがなければ、例えば非自己ＭＨＣ抗原抗原のレシピエントへの導入に対する応答において生じる移植片レシピエントの免疫応答の阻止をいう。寛容は、体液性、細胞性又は体液性と細胞性の応答の両者を含むことができる。寛容は、ここで用いる場合、抗原に対する完全な免疫寛容をいうだけでなく、部分的免疫寛容、即ち、この発明の方法を用いなかったならば見られたであろうものより程度の強い抗原に対する寛容をもいう。「ＭＨＣ抗原」は、ここで用いる場合、１つ以上のＭＨＣ遺伝子の蛋白質産物をいい；この用語は、レシピエント生物における免疫応答を引き起こすことのできるＭＨＣ遺伝子産物の断片又はアナログを含む。ＭＨＣ抗原の例には、ヒトのＭＨＣ遺伝子即ちＨＬＡ遺伝子の産物（及びその断片又はアナログ）が含まれる。ブタ例えばミニブタ中のＭＨＣ抗原には、ＳＬＡ遺伝子例えばＤＲＢ遺伝子の産物（及びその断片及びアナログ）が含まれる。「ミニブタ」は、ここで用いる場合、完全に又は部分的に同系交配した動物をいう。ここに記載のように、トランスジェニックドナー組織は、細胞培養からであってもトランスジェニックブタからであってもよい。トランスジェニックブタは、少なくとも移植する組織において組換えヒト遺伝子を発現する（又は、発現可能である）べきである。本発明の実施においては、別途指示しない限り、当業者の範囲内の技術を用いる。かかる技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版、Sambrook,Fritsch 及びManiatis編（Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989）；DNA Cloning,第Ｉ及びII巻（D.N.Glover編、1985）；Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編、1984）；Mullis等米国特許出願第４，６８３，１９５号; Nucleic Acid Hybridization（B.D.Hames 及び S.J.Higgins 編1984）；Transcription And Translation（B.D.Hames 及びS.J.H iggins 編1984）；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1 987); Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press,1986）；B.Perbal,A Practi cal Guide To Molecular Cloning(1984);論文、Methods In Enzymology（Academ ic Press，Inc.，ニューヨーク）；Gene Transfer Vectos For Mammalian Cells(J.H.Miller及びM.P.Calos 編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology,第154 及び155 巻（Wu等編）、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（Mayer 及びWalker 編、Academic Press,Lond on，1987）；Handbook Of Experimental Immunology 第Ｉ−IV巻（D.M.Weir及び C.C.Blackwell 編、1986）；Manipulating the Mouse Embryo（Cold Spring Har bor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，ニューヨーク、1986）を参照されたい。本発明の実施又は試験において、ここに記載したものに類似した又は同等の方法及び材料を用いることはできるが、好ましい方法及び材料は、下記の通りである。ここで言及したすべての刊行物を参考として援用する。更に、これらの材料、方法及び実施例は、単に説明のためのものであり、制限することを意図してはいない。II ．組換えヒト遺伝子本発明のブタ細胞中へのヒト造血遺伝子の導入は、組換えヒト遺伝子をその細胞又はその細胞の前駆体中にトランスフェクトすることを必要とする。理解されるであろうが、導入の様式及びその結果生じるブタ細胞の所望のインテグレーション表現型（即ち、ベクターが細胞のゲノム中にインテグレートされるか自律性のままでいるか）は、主題の組換えブタ細胞の生成に用いられる発現ベクターの選択に影響し得る。一般に、ヒト造血遺伝子を含む発現ベクターは、適当な転写調節配列例えば組織特異的プロモーターを、造血蛋白質をコードする核酸例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡと操作可能に結合することにより構築することができる。更に、組織特異的プロモーターは、各々が異なるヒト造血蛋白質をコードするか又はヒト造血蛋白質とある種の別の外来蛋白質例えば他の細胞表面抗原をコードする１つより多くのｃＤＮＡに結合することができる。用いる特異的プロモーターによっては、プロモーター−ｃＤＮＡ構築物を、イントロンスプライス部位及び／又はポリアデニル化シグナルを含むように改変することは望ましいことであろう。５’及び３’側の発現調節配列及び組換えＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ由来）に加えて、この発明のトランスジーンは又、トランスジーンの転写されるが翻訳されない５’領域を中断する「組換えインタービーニング配列」をも含むことができる。かかるインタービーニング配列（ＩＶＳ）は、当業者に公知である。ここで用いるかかる配列は、「相同組換えインタービーニング配列」である（このＩＶＳ中の５’及び３’ＲＮＡスプライスシグナルは、内因性遺伝子又は異質遺伝子からのＩＶＳ中に通常見出されるものである）。しかしながら、組換えインタービーニング配列には、「ハイブリッドインタービーニング配列」も含まれ得る。かかるハイブリッドインタービーニング配列は、異なる起源に由来するインタービーニング配列からの５’ＲＮＡスプライスシグナル及び３’ＲＮＡスプライスシグナルを含む。この発明の幾つかの面において、かかるハイブリッドＩＶＳは、少なくとも１つの「許容的ＲＮＡスプライス配列」を含む。ここで用いる場合、許容的ＲＮＡスプライスシグナルは、細胞分化中に再配置を受ける生殖系列ＤＮＡ断片のレパトアに含まれるイントロンからのＲＮＡスプライスシグナル配列（好ましくは、３’ＲＮＡスプライスシグナル）である。かかる遺伝子レパトアの例には、免疫グロブリン及びＴ細胞抗原レパトアを含む免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリー並びに主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子その他のレパトアが含まれる。特に好適な許容的スプライス配列は、免疫グロブリンレパトア（好ましくは、ＩｇＧクラス）から得られるものであり、一層好ましくは、Ｉｇ重鎖及び軽鎖（最も好ましくは、重鎖）のＪ−Ｃセグメント再配置と関連する３’スプライスシグナル配列である。許容的ＲＮＡスプライスシグナルを含むハイブリッドインタービーニング配列は、組換えＤＮＡがｃＤＮＡ配列に対応するときに、好適に用いられる。上記に基づいて、好適トランスジーンは、比較的多数の５’及び３’発現調節配列を含み得ることは、明らかである。更に、組換えＤＮＡは、好ましくは、ゲノムクローンから誘導する（１０〜１００キロベース長であってよい）。ＤＮＡをクローン化し、操作する現在の技術に基づいて、トランスジーンの構築及びマイクロインジェクションは、実際上、約１００ｋｂより大きくない長さを有する線状化ＤＮＡに限られている。しかしながら、この発明のトランスジーン、特に約５０ｋｂより長いものは、所望のトランスジーンの２つ以上の重複断片を胎児の標的細胞に導入することによって容易に生成することができる。導入されると、これらの重複断片は、相同組換えを受け、それは、標的細胞のゲノム中に完全に再構成されたトランスジーンのインテグレーションを生じる。一般に、かかる重複するトランスジーン断片は、重複する領域において１００％相同性を有することが好ましい。しかしながら、低い配列相同性は、効率的な相同組換えが起きるならば、許容され得る。相同配列部分の間に非相同性が存在するならば、非相同性が相同配列部分中に広がらずに不連続の領域内にあるのが好ましい。１００％相同性の僅か１４塩基対であっても哺乳動物細胞における相同組換えに十分である（Rubnitz 等(1984)Mol.Cell.Biol.4:2253-2258）が、もっと長い相同配列部分が好適である（例えば、各相同配列部分について、５００ｂｐ、一層好ましいのは、１，０００ｂｐ、準最適は、２，０００ｂｐ、最適は、２，０００ｂｐより長いものである）。この発明の組換え核酸の操作にＹＡＣ及びＭＡＣを用いることも又、望ましいであろう。更なる具体例において、組換え造血蛋白質は、ヒト造血遺伝子によりコードされる部分及びブタ造血遺伝子によりコードされる部分を有するキメラペプチドであってよい。好適具体例において、このキメラ蛋白質は、ヒト起源の細胞外ドメイン及びブタ起源の細胞内ドメイン（及び膜貫通ドメイン）を含む。かかるキメラ蛋白質は、ヒト分子の細胞内ドメインが、ブタ細胞の細胞内シグナル変換蛋白質と組み合わせたときに、ブタの対応物より効率的でないような状況において有用であり得る。融合遺伝子を作成する技術は、周知である。本質的には、慣用技術によって、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の連結を行なう（該技術は、ライゲーション用の鈍端化した又は食い違った末端、適当な末端を準備するための制限酵素消化、粘着末端の充填（適宜）、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素によるライゲーションを用いる）。或は、アニールしてキメラ遺伝子配列を生成することのできる２つの連続した遺伝子断片間（例えば、ヒト遺伝子とブタ遺伝子間）の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いる遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行なうことができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel 等編、John Wil ey & Sons:1992参照）。１９８０年代中期以来、多くの造血成長因子レセプターがヒト起源からクローン化され、本発明で使用する標準的分子生物学的技術によって容易に利用することができる（総説としては、Foxwell 等(1992)Clin Exp Immunol 90:161-169 を参照されたい）。多くの場合に、それらのクローン化された遺伝子と天然において結合している転写調節配列も又、同定され、よく特性決定されている。更に、本願の開示に照らして、他の適当な遺伝子をヒト起源より得ることができ、ブタの転写調節配列を得てそのヒト遺伝子と共に用いることができるということは、当業者には明らかであろう。この発明の１つの面においては、組換えブタ細胞を誘導して、ヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子、又はそれが属する密接に関連したチロシンキナーゼレセプターファミリーの他のメンバー例えばコロニー刺激因子Ｉレセプター（ｃ−ｆｍｓ）、血小板由来成長因子レセプター（ＰＤＧＦ−Ｒａ及びＰＤＧＦ−ＲＢ）、又は胎児肝キナーゼ（ＦＬＫ−１又はＦＬＫ−２）を発現させる（総説としては、Andre 等(1 992)Oncogene 7:685-691を参照されたい）。ヒトｃ−ｋｉｔ（Ogawa 等(1994)Ex p Hematol 22:45-51; Vardenbark等(1992)Oncogene 7:1259-1266; Yarden等(198 7)EMBO J 6:3341-3351; Blume-Jensen等(1991)EMBO J 10:4121-4128）、ヒトｃ −ｆｍｓ（Bourette等(1993)Blood 81:2511-2520; Dibbs 等(1990)GrowthFactor s 2:301-311; Sherr(1988)Leukemia 2:1325-1425）、ヒトＰＤＧＦ−Ｒα及びヒトＰＤＧＦ−Ｒｂ（Matsui等(1989)DNAS 86:8314-8318）、及びヒトＦＬＫ−１及びヒトＦＬＫ−２（米国特許第５，２７０，４５８号；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１０１３６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００３４９号；米国特許第５，２８３，３５４号）の各々のｃＤＮＡクローン及び幾つかの場合にはゲノムクローンが単離されており、下記のようにそれらを用いて、主題のブタ細胞を誘導するのに必要なトランスジーンを含む発現ベクターを生成することができる。更に、核レセプターについてのプロモーター配列及び他の転写調節配列が特性決定されており（ Yasuda等(1993)Biochem Biophys Res Commun 191:893-901;Yamamoto等(1993)Jpn J Cancer Res 84:1136-1144）、それらを、この組換え造血遺伝子構築物において用いることができる。或は、対応するブタ遺伝子（ゲノム）と隣接する調節配列を、標準的技術によってクローン化し、組換えブタ細胞におけるヒト遺伝子の発現を調節するために用いることができる。この発明の他の面において、組換えブタ細胞を処理して、ヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）レセプターを発現させる。ヒトＧＭ −ＣＳＦレセプターは、クローン化されており（Sasaki等(1993)J Biol Chem 26 8:13697-13702; Sakamaki等(1992)EMBO J 11:3541-3549; Hayashida等(1992)Nip pon Rinsho 50:1867-1871; Metcalfe等(1990)PNAS 87:4670-4674;Gearing 等(19 89)EMBO J 8:3667-3676; Lock等(1994)PNAS 91:252-256 及びKitamura等(1991)P NAS 88:5082-5086）、２つのポリペプチド鎖「ａ鎖」及び「β鎖」からなることが見出されていて、この後者は、他の成長因子レセプター複合体例えばＩＬ−３レセプター及びＩＬ−５レセプターにより利用される。これら２つの鎖の各々は、同じ発現ベクターからでも、同じ細胞内の別々の発現ベクターからでも発現させることができる。第１のトランスジーンを発現するトランスジェニックブタを、第２のトランスジーンを発現するトランスジェニックブタと交配させて両方を発現するトランスジェニック動物を提供することができる。（この技術の変法を用いて、第３及びそれ以降の遺伝子を追加することができる。）従って、１つのトランスジーン即ちα若しくはβ鎖の他の一方のみを発現するトランスジェニックブタを、適当なトランスジェニック兄弟と交配させて両鎖についてキメラである子孫を産出することができる。或は、α鎖がブタβ鎖と活性なレセプター複合体を形成し得るならば、α鎖だけが発現されればよい。α 鎖は、レセプター複合体に結合特異性の殆どを与え、それ故、β鎖よりもＧＭ− ＣＳＦの種特異的結合に影響を与えることはありそうである。類似の様式で、ヒトＩＬ−３レセプターを、α及びβ鎖サブユニットの各々に対するクローン化遺伝子を用いて、ブタ造血細胞中に構成することができる（Sa kamaki等(1992)EMBO J 11:3541-3549;及びKitamura等(1991)611661165-1174）（適当な発現ベクターを誘導するため）。従って、ヒト造血遺伝子のクローニングに由来するヌクレオチド配列（そのヒト蛋白質の全部又は選択部分をコードする）を用いて、ブタ細胞中でヒト蛋白質の組換え型を生成することができる。ポリヌクレオチド配列を遺伝子構築物例えば発現ベクター中にライゲートすること及び、ブタ細胞中にトランスフォーム又はトランスフェクトすることは、標準的技術によって行なうことができる。上記の組換え核酸構築物を、増幅のために任意の適当なプラスミッド、バクテリオファージ又はウイルスベクターに挿入することができ、それにより、当業者に公知の方法、例えばMolecular Cloning A Laboatory Manual,第二版、Samboro ok、Fritsch及びManiatis編（Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989）に記載された方法を用いて増殖させることができる。好適具体例においては、真核細胞に適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合性のものを用いる。真核細胞発現ベクターは、当分野で周知であり、幾つかの市販品を利用することができる。好適なブタ発現ベクターは、（細菌中でのベクターの増殖を促進するための）原核生物の配列及び、ブタ細胞中で機能性である１つ以上の真核生物転写単位の両方を含む。典型的には、かかるベクターは、所望の組換えＤＮＡ分子の挿入のために便利な制限部位を提供する。ｐｃＤＮＡＩ、ｐＳＶ２、ｐＳＶＫ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＰＶＶ−１／ＰＭＬ２ｄ及びｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、Ｎｏ．３１２５５）由来のベクターは、ブタ細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物用発現ベクターである。これらのベクターの幾つかは、細菌性プラスミッド例えばｐＢＲ３２２からの配列により改変して、原核及び真核細胞の両方における複製及び薬剤耐性選択を容易にされる。或は、ウイルス例えば、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）又はエプスタイン−バールウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来及びｐ２０５）の誘導体を、ブタ細胞における蛋白質の発現に用いることができる。プラスミッドの調製及び宿主細胞のトランスフォーメーションに用いられる種々の方法は、当分野では周知である。本発明において有用である他の適当な発現系並びに一般的組換え手順については、Molecu lar Cloning A Laboratory Manuarl，第二版、Sambrook，Fritsch 及びManiatis 編（Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989）を参照されたい。組換え核酸分子が宿主ゲノム中に取込まれるべきトランスジーンとしてブタ卵母細胞中に導入される状況においては、例えば、その組換え核酸分子を１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて切断することによって、構築物を線状化し、好ましくは、過剰のベクター配列を除去して、最小限、所望の転写調節配列及びヒト造血遺伝子を含む線状化核酸分子を生成することができる。好ましくは、核酸分子（例えば、トランスジーン）は、約５，０００塩基対〜約１００，０００塩基対長である。特定のヒト造血蛋白質の適切さ（例えば、ヒト蛋白質がそのブタ対応物より適当であるかどうか）を、下記のアッセイの１つを用いて測定することができ、次いで、そのｃＤＮＡを標準的技術によって測定することができる。例えば、この発明によって、プロモーターをヒトのｃ−ｋｉｔをコードするｃＤＮＡと結合して、ブタ細胞におけるヒトｃ−ｋｉｔの発現のためのベクターを造る。このプロモーター−造血蛋白質トランスジーンの発現は、例えば、適当な組織培養細胞におけるヒトｃ−ｋｉｔの発現の直接検出によって確認することができる。更に、トランスジェニックブタ細胞のイン・ビボでの改善された生存力を潜在的に与えるヒト遺伝子の能力を、ヒトとブタ細胞の内因性蛋白質の相対的な生物学的活性を比較することによって、イン・ビトロで予想することができる。改善された生存力は、ヒト成長因子に応答して半固体培地中で生長する組換え細胞の能力に相関するはずである。幾つかのトランスジェニックブタは、トランスジーンの多数のコピーを有し、ゲノムの種々の部位に取込まれたトランスジーンのコピーを有する。ゲノムへのトランスジーンの取込みの部位は、トランスジーンの発現に強く影響し得て、それ故、あるものは、別々のトランスジーン制限酵素断片長多型パターンを有するトランスジーン発現と相関し得る。更に、上記のように、２匹のトランスジェニックブタ（それぞれ、異なる造血蛋白質又はある造血蛋白質と他の外来抗原例えばヒトＭＨＣペプチドを同じ又は異なる組織細胞にて発現する）を交配させて、両トランスジーン産物を発現する動物を生成することができる。同じ効果を、２つの別々のトランスジーンを同じ胚細胞に導入することによって達成することができる。ある特定のヒト造血蛋白質がこの発明の方法における使用に適しているかどうかを測定するのに有用な典型的イン・ビトロアッセイには、（１）リガンド例えばＥＣＭ成分の成長因子の、組換えブタ細胞の細胞表面上のヒト造血蛋白質の細胞外ドメインへの結合を測定するアッセイ；及び（２）ヒト細胞表面蛋白質とアゴニスト的リガンドとの相互作用によって活性化されるシグナル変換経路の活性化について試験するアッセイが含まれる。第１のクラスのアッセイは、例えば、異種移植されたブタ骨髄の生存力を改善し得る潜在的ヒト造血蛋白質を、ヒトのリガンド（例えば、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ）の組換えブタ細胞に対する結合定数を天然のブタ細胞に対して比較することによって同定するのに有用である。第２のクラスのアッセイは、ヒト造血蛋白質のどれが本発明において使用するのに適しているかを、それらのブタ細胞中で機能する能力に基づいて測定するのに好適である。III ．遺伝子工学処理したブタ細胞この発明のトランスジェニックブタ細胞は、当業者に公知の任意の方法によって生成することができる。トランスジーンを、細胞例えば幹細胞例えば培養幹細胞に、それらの細胞の植付け又は維持を促進するのに十分なレベル及び期間にわたってこれらの遺伝子の発現を可能にする任意の方法によって導入することができる。これらの方法には、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子銃ボンバードメント及びウイルスベクター例えばレトロウイルスによるトランスダクションが含まれる。トランスジェニックブタ細胞も又、トランスジェニック動物から誘導することができる。トランスジーンのレトロウイルスイントロダクション組換えレトロウイルスは、好適な送達システムである。それらは、過去数年にわたって、遺伝子トランスファーのためのビヒクルとして広く発展した（例えば、Eglitis 等、1988、Adv.Exp.Med.Biol.241:19 参照）。最も簡単なレトロウイルスベクター構築物は、ウイルスの構造遺伝子が単一の遺伝子で置き換えられているものであり、該遺伝子は、次いで、ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）に含まれる調節要素の制御下で転写される。モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）を含む単一遺伝子ベクター主鎖の変形物が用いられてきた。種々の遺伝子例えば選択可能マーカーの遺伝子及び関心ある第２の遺伝子の内部プロモーターの制御下の多数の挿入を可能にするレトロウイルスベクターを、この型の主鎖から誘導することができる（例えば、Gilboa,1988,Adv.Exp.Med.Biol.241:29参照）。蛋白質産物の発現のためのベクターの構築の要素は、当業者には、公知である。レトロウイルスベクターからの最も効率的な発現は、転写制御用に「強い」プロモーター例えばＳＶ４０プロモーター又はＬＴＲプロモーターを用いたときに認められる（Chang 等、1989、Int.J.Cell Cloning 7:264に総説あり）。これらのプロモーターは、構成的であり且つ一般に組織特異的発現を与えない。他の適当なプロモーターは、上述の通りである。効率的なパッケージング細胞株の利用は、生成された組換えビリオンの感染性の効率及びスペクトルの両方を増大させることができる（Miller,1990,Human Ge ne Therapy 1:5参照）。マウスレトロウイルスベクターは、遺伝子を効率的にマウス胎児（例えば、Wagner等、1985、EMBO J.4:663; Griedley等、1987 Trends Genet.3:162 参照）及び造血幹細胞（例えば、Lemischka 等、1986、Cell 45:91 7- 927; Dick 等、1986、Trends in Genetics 2:165-170参照）にトランスファーするのに有用であった。以前に可能であったより遥かに高いウイルス力価の達成を可能にする最近のレトロウイルス技術の改良には、環境栄養性パッケージング細胞株と両栄養性パッケージング細胞株との間での連続的トランスファー（いわゆる「ピンポン」法）（例えばKozak 等1990、J.Virol.64:3500-3508; Bodine 等、1989、Prog.Clin.B iol.Res.319:589-600参照）による増幅が含まれる。トランスダクション効率は、高レベルの選択可能遺伝子を発現する骨髄細胞を豊富にするレシピエントへの導入前に感染させた骨髄の予備選択によって増大させることができる（例えば、Dick等、1985、Cell 42:71-79; Keller 等、1985、 Nature 318:149-154参照）。更に、ウイルス力価を増大させるための最近の技術は、効率的なトランスダクションを達成するためにウイルス産生細胞株との直接的インキュベーションではなくウイルス含有上清の利用を可能にした（例えば、 Bodine等、1989、Prog.Clin.Biol.Res.319:589-600参照）。宿主ゲノム中へのレトロウイルスのインテグレーションには細胞性ＤＮＡの複製が必要なので、活発に周期を巡っている標的幹細胞の頻度を例えばイン・ビトロでの成長因子での処理によって標的細胞の分裂を誘導することにより増大させること（例えば、Lemi schka 等、1986、Cell 45:917-927参照）（ＩＬ−３とＩＬ−６の組合せは、最も効果的であるようである。例えばBodine等、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.86:88 97-8901参照）、又はレシピエントを骨髄採取前に５−フルオロウラシル（例えば、Mori等、1984、Jpn.J.Clin.Oncol.14 補遺1:457-463参照）にさらすことは望ましいであろう（例えば、Lemischka 等、1986、Cell 45:917-927; Chang等、 1989,Int.J.Cell Cloning 7:264-280参照）。レトロウイルストランスフォーメーションにおいてサイトカイン又は他の成長因子を含むことは、標的細胞の一層効率的なトランスフォーメーションへと導き得る。実施例１レトロウイルスによりトランスフォームされた細胞の生成及びレトロウイルス媒介の遺伝子トランスファーによるマウス骨髄造血細胞におけるブタトランスジーンの維持された発現発現可能な遺伝子を導入するためのレトロウイルス遺伝子トランスファーアプローチの効力を、薬剤耐性マーカー（ネオマイシン）及びブタのクラスIIＤＲＢｃＤＮＡを発現するように処理した二重コピーのレトロウイルスベクターを用いて示した。この例はブタクラスIIＤＲＢ遺伝子を用いるが、当業者は、ここに記載の他の遺伝子例えばヒトｃｋｉｔ遺伝子をその代わりにすることができることを認めるであろう。これらのベクターを含む感染性粒子を、環境栄養性及び両栄養性のパッケージング細胞株の両方を用いて、１×１０⁶ Ｇ４１８耐性コロニー形成単位／ｍｌを超える力価にて生成した。ＤＲＡ感染させ続いてウイルス含有上清を用いてトランスダクションしたマウス繊維芽細胞のフローサイトメトリー分析は、トランスファーされた配列がＤＲ表面発現を生成するのに十分であることを示した。マウス骨髄と高力価生成株との同時培養は、Ｇ４１８選択下でのコロニー形成の頻度により測定して、顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）の４０％のトランスダクションへと導く。ほぼ５週間の長期骨髄培養の後に、ウイルスにさらした骨髄は、依然、Ｇ４１８耐性ＣＦＵ−ＧＭを、２５％の頻度で含んだ。更に、事実上すべてのトランスダクションされ、選択されたコロニーは、ＤＲＢ特異的転写物を含んだ。これらの結果は、非常に原始的な骨髄発生前駆体細胞の有意の割合をＤＲＢ組換えベクターでトランスダクションすることができること及びベクター配列がこれらの細胞の分化した子孫において発現されることを示している。これらの実験を、以下に詳述する。レトロウイルス構築物の詳細を、図１に示す。２つの型のレトロウイルス構築物ＧＳ４．４及びＧＳ４．５を調製した。図１のダイヤグラムは、ＧＳ４．５レトロウイルス構築物を描いている。図１中の矢印は、転写の向きを示している。ＧＳ４．５において、ＤＲＢｃＤＮＡ転写の向きは、ウイルス転写と同じである。ＧＳ４．４において（示してない）、ＴＫプロモーター及びＤＲＢｃＤＮＡは、Ｎ２Ａの３’ＬＴＲ中に、ウイルス転写に関する転写の逆向きで挿入され、サルウイルス４０の３’ＲＮＡプロセッシングシグナルを加えた。ｐＢＳｔは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター配列（Stratagene）をいう。チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターは、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子からの２１５塩基対（ｂｐ）のＰｖｕＩＩ−ＰｓｔＩ断片に含まれた（McKnight,1980 Nucleic Acids Res.8:5949-5964）。サルウイルス４０の３’ＲＮＡプロセッシングシグナルは、ｐＢＬＣＡＴ３プラスミッド（Luckow等(1987)Nucleic Acids Res.15:5490-54 97）からの１４２ｂｐのＨｐａＩ〜ＳｍａＩ断片中に含まれた（図１参照）。プロモーター、クラスIIｃＤＮＡ及びベクター配列の接合点の配列分析は、これらの構築物の要素が適当にライゲートされたことを確認した。これらのレトロウイルス構築物を、両栄養性パッケージング細胞株ＰＡ３１７にトランスフェクトし、トランスフェクタントをＧ４１８含有培地にて選択した。それぞれＧＳ４．４及びＧＳ４．５組換えプラスミッドでトランスフェクトした２４及び３６クローンのすべてを、培養上清のＰＥＧ沈殿及びウイルスＲＮＡのスロットブロット分析により試験した。これらの内の、それぞれ、８及び１２クローンが、ＤＲＢについて陽性であることが見出された（但し、ＤＲＢシグナルは、ＧＳ４．４由来のクローンについて一貫して弱かった）。ＧＳ４．５細胞からのゲノム及びスプライスされた転写物の、ＰＥＧ沈殿した粒子のドットブロット分析による分析は、ＧＳ４．５によりトランスフェクトされた種々のクローンにおけるウイルス性転写物間の不均一性を示した。一の実験において、２つのクローンがＤＲＢ⁺／Ｎｅｏ⁺ウイルスＲＮＡを含み、２つがＤＲＢ⁺ Ｎｅｏ^- ＲＮＡを含み、２つがＤＲＢ^-／Ｎｅｏ⁺ ＲＮＡを含み、１つはクラスII又はＮｅｏシグナルを示さなかった。ＤＲＢ陽性クローンからの上清のＧ４１８耐性（Ｇ４１８^r）力価の測定は、ＧＳ４．５トランスフェクトしたクローン（１０³〜１０⁴ ＣＦＵ／ｍｌ）により生じた平均力価は、ＧＳ４．４トランスフェクトしたクローン（１０²〜１０³ ＣＦＵ／ｍｌ）のそれより有意に高いことを確認した。それ故、更なるトランスダクション実験を、最良のクローン（ＧＳ４．５Ｃ４と命名）を用いて行なった（これは、初期Ｇ４１８^r力価３×１０⁴ ＣＦＵ／ｍｌを生じた）。プラスミッドの調製、クローニング手順、ＤＮＡ配列決定、ＲＮＡの調製、ノーザンブロット及びＲＮＡスロットブロットを、標準的方法、Sambrook等、1989 、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第二版（Cold Spring Harbor Lab. ，Cold Spring Harbor）により実施した。ブロットの最終洗浄を、０．１×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝０．１８ＭＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４／１ｍＭＥＤＴＡ）にて、６０℃で、３０分間行なった。パッケージング細胞株ＰＡ３１７（Miller等、1986、Mol.Cell.Biol.6:2895-2 902）、ＧＰ＋Ｅ−８６（Markowitz 等、1988、J.Virol 62:1120-1124）、ｐｓｉＣＲＩＰ（Danos 等、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464）、及びそれらの誘導体を、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Whittaker Bioproducts）、抗生物質ペニシリン（５単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ）を補った１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（CELLect Silver; Flow Laboratories ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM; GIBCO）中に３７℃で維持した。Ｃ４クローンのウイルス力価の改良。最近のデータは、高いレトロウイルス力価を含む上清が骨髄細胞をトランスダクションするための最良の候補であることを示した（Bodine等、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3738-3742）ので、Ｃ４産生クローンの力価を、「ピンポン」増幅（Bestwick等、1988、Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85:5404-5408）によって増大させた。殆ど集密的なＣ４培養からの上清を用いて、ＧＰ＋Ｅ−８６環境栄養性パッケージング細胞及びＧ４１８選択を適用した。４８クローンを単離し、ウイルス粒子の産生についてＰＥＧ沈殿によりスクリーニングした。これらのクローンの内の１８からの上清が、ウイルスＲＮＡのドットブロット分析によりＤＲＢ陽性であり、０．５〜３．５×１０⁴ ＣＦＵ／ｍｌのＧ４１８^r力価を有した。次いで、１つの陽性クローンを、両栄養性ハイグロマイシン耐性パッケージング株ｐｓｉＣＲＩＰを用いるビンポン技術により増幅した。４８のハイグロマイシン耐性クローンからの上清をＤＲＢ陽性ウイルスＲＮＡの存在についてＰＥＧ沈殿により試験し、それらのＧ４１８^r 力価を測定した。これらのクローンのすべては、ＤＲＢプローブを用いるドットブロット分析により陽性であり、１×１０⁵〜１×１０⁷ ＣＦＵ／ｍｌの力価を生じた。最高の力価を生じた両栄養性クローンＧＳ４．５Ａ４を、ヘルパーウイルスの存在について、Ｓ＋Ｌアッセイにより試験した。複製成分ヘルパーウイルスは検出されなかった。ウイルス力価の増幅を、ピンポン技術により達成した。ｐｓｉＣＲＩＰパッケージング細胞は、ある型のベクターを用いる場合には、ＰＡ３１７よりヘルパーウイルスを生成する傾向が少ないという証拠がある（Miller,1990,Hum.Gene The rapy 1:5-14）ので、ＤＲＢ組換えビリオンを、ｐｓｉＣＲＩＰ／ＧＰ−Ｅ−８６産生細胞の組合せを用いて調製した。検出可能な両栄養性ヘルパーウイルスを伴わずに１×１０⁷ ＣＦＵ／ｍｌを超える力価の値を得た（これは、このストラテジーが、イン・ビボ実験に適した安全なウイルス粒子を生成することを確実にする）。それぞれ異なるパッケージング細胞株から誘導したＧＳ４．５産生クローンＣ４、Ａ９及びＡ４のノーザンブロット分析は、保存されたハイブリダイゼーションパターンを示した。完全長のウイルスゲノム、スプライシングを受けたＮｅｏ転写物及びＤＲＢ転写単位に対応するＲＮＡ種が、更なるＲＮＡ種と共に認められた。これらの実験で認められた高分子サイズの種は、ＴＫプロモーターから開始して他の長い末端反復（ＬＴＲ）にて終了するリードスルー転写物を構成し得る。不規則なＤＲＢ転写物を提供したトランスフェクションにより得られた多くのビリオン産生クローンと対照的に、トランスダクションにより得られたものは、安定なＤＲＢハイブリダイゼーションパターンを示した（これは、増幅手順中に組換え事象が起きなかったことを示唆している）。レトロウイルス力価を、下記のようにして測定した。複製欠損レトロウイルス粒子を、組換え構築物で最初にトランスフェクトしたパッケージング細胞株から、標準的リン酸カルシウム沈殿法（Wigler等、1978、Cell 14:725-733）を用いて生成した。レトロウイルス生成を、Bodine等、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3738-3742に記載されたように、薬剤耐性力価（Ｇ４１８耐性コロニー形成単位／ｍｌ、ＣＦＵ／ｍｌ）によって評価した。ｐｓｉＣＲＩＰ株を除いて、Ｇ４１８（GIBCO）選択を、５００μｇ／ｍｌの活性成分にて、１０〜１２日間行なった。ハイグロマイシンＢ選択を、ｐｓｉＣＲＩＰ由来のパッケージングクローンに対して、活性薬物を５０μｇ／ｍｌで含む培地にて、１０日間にわたって適用した。複製コンピテントなヘルパーウイルス力価を、ＰＧ４ネコ細胞にて、Ｓ⁺Ｌ^-法（Bassen等、1971、Nature 229:564-566）によってアッセイした。ウイルス粒子のＰＥＧ沈殿を、下記のように行なった。１ｍｌの培養上清に含まれるビリオンを、０．５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて、４℃で、３０分間沈殿させた。遠心分離後、ペレットを、ＲＮアーゼインヒビター（バナジルリボヌクレアーゼ複合体、BRL）の混合物を用いて処理し、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿させた。次いで、ペレットを、１５．７％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドに再懸濁し、連続希釈物をニトロセルロース膜上にドットした。パッケージング細胞クローン中のＤＲＢ転写の分析を、下記のように行なった。異なる産生クローン中の導入されたＤＲＢｃＤＮＡの正確な転写について試験するために、これらのクローンから単離したＲＮＡを含むノーザンブロットをＤＲＢ及びＮｅｏプローブとハイブリダイズさせた。図２は、プロウイルスゲノムの構造及びウイルス性ＬＴＲ又はＴＫプロモーターから開始される転写物の予想されるサイズを描いたものである。ＰＡ３１７（クローンＣ４）、ＧＰ＋Ｅ−８６（クローンＡ９）及びｐｓｉＣＲＩＰ（クローンＡ４）細胞から誘導した３つのＧＳ４．５含有クローンの各々は、ＤＲＢ陽性の転写物を示した。Hantzopoul os等、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3519-3523 に報告されたように、スプライシングを受けてないゲノムＲＮＡ（バンドａ）及びスプライシングを受けたＮｅｏ転写物（バンドｂ）が認められた。更に、ＤＲＢプローブとユニークにハイブリダイズし得る転写物が検出され、それは、ＤＲＢｃＤＮＡ転写単位について予想されるサイズ（１７００塩基、バンドｃ）に対応した。トランスダクションされた繊維芽細胞におけるＳＬＡ−ＤＲ抗原の表面発現を、下記のように検出した。マウス繊維芽細胞におけるＳＬＡ−ＤＲ抗原の表面発現を試験するためのイン・ビトロアッセイを開発した。図３に示したフローサイトメトリー（ＦＣＭ）プロフィルは、３×１０⁴のＧ４１８^r力価（クローンＣ４）が、トランスダクションされたＤＲＡトランスフェクタントの細胞表面上のＤＲ抗原の発現を促進するのに十分であることを示した。図３において、実線はＤＲ細胞表面発現（抗ＤＲ抗体結合）（ＧＳ４．５Ｃ４（Ｂ）及びＧＳ４．５Ａ４（Ｃ）を用いてそれぞれトランスダクションした３日後の細胞のバルクポピュレーションの２２％及び７５％）を示し；破線は抗マウスクラスＩ抗体結合（陽性対照）を示し；点線は抗ブタＣＤ８抗体結合（陰性対照）を示す。トランスダクションされた細胞のバルクポピュレーションの２２％は、ＤＲ陽性であり、サブクローンは、５か月より長期間クラスII発現を維持した。力価の増加（クローンＡ４）は、トランスダクションされた細胞の数の増加（トランスダクションされたポピュレーションの７５％はＤＲ陽性であった）及びＤＲシグナルの明るさと相関した。クラスIIトランスダクションアッセイを、図４のダイヤグラムのように行なった。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、プラスミッド発現ベクター（Okayama 等、1982、Mol. Cell.Biol.2:161-170）に挿入されたＳＬＡ−ＤＲＡ^d ｃＤＮＡでトランスフェクトした。高レベルのＤＲＡｍＲＮＡを発現する安定なＤＲＡトランスフェクタント（クローン１１／１２．２Ｆ）の約３×１０⁴細胞を、次いで、１ｍｌのＤＲＡ含有レトロウイルス上清で一晩トランスダクションした。細胞を、続いて、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質を補った新鮮なＤＭＥＭにて、更に２日間培養し、ＤＲ抗原の表面発現について、ＦＣＭ分析により試験した。ここに記載のクラスIIトランスダクションアッセイは、レトロウイルス構築物の発現及び機能的力価の両方を試験するための迅速且つ簡単な方法を提供する。ＤＲＡでトランスフェクトした細胞を用いることにより、２つの別々のベクター（Yang等、1987、Mol.Cell Biol.1:3923-3928; Korman 等、1987、Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 84:2150-2154）によるトランスダクションの後の長たらしい二重選択が回避される。ＤＲヘテロ二量体の細胞表面発現が、トランスダクションの３日後にＦＣＭ分析により示され、これは、トランスファーされた配列が有意のレベルのＤＲβ鎖を生成するのに十分であることを示した。一層重要なことには、この試験は、独立して調節される薬剤耐性マーカーの発現ではなく関心ある遺伝子の発現に基づいて、「機能的」力価の測定を与える。ＳＬＡ−ＤＲＢプローブは、ＤＲβ鎖の完全なコード配列（Gustafsson等、 1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9798-9802）を含むＥｃｏＲＩｃＤＮＡ断片であった。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）プローブは、Ｎ２Ａレトロウイルスプラスミッド（Hantzopoulos等、1989、Proc.Natl.Acad .Sci.USA 86:3519-3523）のＢｃ１Ｉ−ＸｈｏＩ断片であった。マウス骨髄先祖細胞中にトランスダクションしたブタＤＲＢｃＤＮＡの発現骨髄性クローン原性前駆体がトランスダクションされた効率を、骨髄細胞をＧＳ４．５由来のビリオンにさらした後に、ＣＦＵ−ＧＭについて、選択的量のＧ４１８の存在時及び不在時にアッセイすることによって測定した。２つの実験について、薬剤の存在時及び不在時に形成されたコロニー数の比較は、骨髄性先祖細胞の初期ポピュレーションの約４０％がトランスダクションされたことを示した。Ｇ４１８^r ＣＦＵ−ＧＭの頻度を、トランスダクションした骨髄試料を長期培養条件下で３３日間拡張させた後に、再び測定した。３３日後に培養中に存在した先祖の２５％は、依然として、Ｇ４１８選択下でコロニーを生じた。ＣＦＵ −ＧＭから生じた細胞のコロニーを、ＤＲＢ特異的転写物の存在について、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、次いで、ＰＣＲ増幅を、本明細書及びShafer等、1991、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9670に記載のように行なうことによりにより試験した。３６０ｂｐのＤＲＢ特異的生成物が、新鮮なトランスダクションした骨髄由来の６つのＧ４１８選択されたコロニーの内の５つにおいて検出されたが、３３日後に培養中に存在したトランスダクションされた先祖から同様に誘導した６つのコロニーはすべて陽性であった。試料の幾つかにおいて認められた１００ｂｐの更なるバンドは、おそらく、非特異的プライミング事象の細胞生理的性質を反映している。ＤＲＢ特異的転写物は又、薬剤耐性コロニーのバルクポピュレーション及び産生細胞においても検出されたが、対照例えばトランスダクションされていないコロニーのバルクポピュレーション、キャリアーＲＮＡを与えるために用いられる繊維芽細胞、及び上記のように処理された（逆転写酵素を除く）トランスダクションされたコロニーのバルクポピュレーションにおいては検出されなかった。これらの後者のデータは、ＰＣＲシグナルがｃＤＮＡの合成に依存しており、ウイルス性メッセージではなくプロウイルスが増幅された断片の原因である可能性を排除することを示している。ウイルスデザインの改変、ウイルス力価の増加、前駆体細胞を刺激する成長因子の利用及びトランスダクション前の幹細胞の選択を含む最近の改良は、造血コンパートメントにおけるトランスダクションされた遺伝子の長期発現を改善することが示された（Bodine等、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:3738-3742;Bodi ne等、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8897-8901; Wilson 等、1990、Proc.N atl.Acad.Sci.USA 87:439-443; Kang 等、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:98 03-9807; Bender等、1989、Mol.Cell.Biol.9:1426-1434）。ここに記載した実験は、造血細胞中にトランスファーされた主要組織適合性複合体クラスII遺伝子の発現の達成におけるレトロウイルス遺伝子トランスファー技術の適用可能性を示している。発生的に原始的な造血細胞がトランスダクションされる効率を測定するために、Ｇ４１８^r ＣＦＵ−ＧＭの頻度を、３３日間長期培養に維持した感染骨髄細胞を拡張した後に評価した。外因性ＤＲＢｃＤＮＡの発現も又、感染の直後又は長期培養期間の後に存在したトランスダクションしたＣＦＵ−ＧＭ由来の細胞においてモニターした。個々に試験したコロニーの事実上すべてがＤＲＢ特異的転写物について陽性であり、これは、ＤＲＢ組換えベクターがマウス造血細胞における発現に適していることを示唆している。骨髄細胞を、６〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／１０マウスの大腿骨より得て、Il dstad 等、1984、Nature 307:168-170に記載されたように調製した。顆粒球／マクロファージコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）についてのメチルセルロースコロニーアッセイ（Eaves 等、1979、Blood 52:1196-1210）を、記載されたように、５％（ｖ／ｖ）マウスインターロイキン３培養補足物（Collaborative Resear ch）を用いて行なった。長期デクスター型骨髄培養を、６０ｍｍ培養皿にて、２ ×１０⁷の有核細胞を用いて開始した（Eaves 等、1987、CRC Crit.Rev.Oncol.He matol.7:125-138）。骨髄細胞を、本質的に、Bodine等、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8897-8 901に記載されたようにしてトランスダクションした。簡単には、骨髄を、５− フルオロウラシル（１５０ｍｇ／ｋｇ）で２日間処理した６〜１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／１０ドナーについて採取した。１×１０⁶細胞／ｍｌを、２日間、７．５％インターロイキン３培養補足物及び組換えインターロイキン６（２００単位／ｍｌ；メリーランド、Bethesda在、国立衛生研究所のJ.Juleから贈呈された）を加えた長期デクスター型骨髄培養培地中でインキュベートすることにより、予備刺激を行なった。骨髄細胞を、ほぼ集密的なウイルス産生細胞、ポリブレン（８ｍｇ／ｍｌ）及び上記のサイトカインを含む１０ｃｍプレート当り５×１０⁶細胞を加えることにより４８時間トランスダクションした。ＣＦＵ由来コロニー中のＤＲＢ特異的転写物の検出を、下記のように行なった。個々のＣＦＵコロニーに対応する細胞及び全プレート上に存在するコロニー（バルク）に対応する細胞を、最初に、メチルセルロース培養から、リン酸緩衝塩溶液での希釈及び遠心分離により抽出した。これらの細胞を、次いで、１×１０⁶ のＮＩＨ３Ｔ３細胞（キャリアーＲＮＡを与える）と合わせ、全ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート／ＣｓＣｌ法を用いて抽出した。第１鎖ｃＤＮＡを、２０μｇの全ＲＮＡから、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＲｅｄＭｏｄｕｌｅキットを用いて調製した。次いで、ｃＤＮＡを、ＳＬＡＤＲＢ特異的オリゴヌクレオチド０４（5'-CCACAGGCCTGATCCCTAATGG）（SEQ ID NO:１）及び１７（5'-AGCATA GCAGGAGCCTTCTCATG）（SEQ ID NO:２）の存在下で、勧められたようにＣｅｔｕｓＧｅｎｅＡｍｐキット（Perkin-Elmer/Cetus）を用いて、５０サイクルのＰＣＲ増幅にかけた。反応生成物を、３％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル（FMC）上での電気泳動後に、エチジウムブロミドで染色することにより可視化した。ＦＣＭ分析を、抗ＤＲモノクローナル抗体４０Ｄ（Pierres 等、1980、Eur.J. Immunol.10:950-957）、抗Ｈ−２^dアロ抗血清又は抗ブタＣＤ８モノクローナル抗体７６−２−１１（Pescovitz 等、1984、J.Exp.Med.160:1495-1505）を用いて染色し、それからフルオレセインイソチオシアネート標識したヤギ抗マウス抗体（Boehringer Mannheim）を用いて染色した細胞について、ＦＡＣ−ＳｃａｎI I蛍光活性化セルソーター（Becton Dickenson）を用いて行なった。IV ．トランスジェニックブタの作製この発明の他の面により、ヒト患者におけるブタ造血細胞の改善された生存及び／又は植付けを促進する１つ以上の組換えヒト蛋白質を発現する移植可能なブタ細胞例えば造血幹細胞例えばブタ骨髄細胞又は他の組織を提供する。特に、本発明は、ヒト造血遺伝子を発現する組換えブタ細胞を含む。好適具体例において、ヒトの造血遺伝子は、ヒト遺伝子に近接して位置され且つブタ細胞におけるヒト遺伝子の発現を調節する組織特異的プロモーター例えば造血特異的プロモーターを含む組換え核酸分子の一部である。組換えヒト造血遺伝子を含む組織を、組換え核酸分子を組織例えば骨髄細胞に、公知のトランスフォーメーション技術を用いて導入することによって調製することができる。これらのトランスフォーメーション技術には、マーカー遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を有するレトロウイルスによるトランスフェクション及び感染が含まれる。例えば、Current Protocols in Molecular Biology ，Ausubel 等編、John Wiley and Sons，ニューヨーク (1987)及びFriedmann(1989)Science 244:1275-1281を参照されたい。本発明の組換え核酸分子を含む組織を、次いで、再構成技術（例えば、Dick等(1985)Cell 42:71参照）を用いて、動物中に再導入することができる。本発明は又、骨髄細胞において、ブタ骨髄細胞のヒト宿主を再構成する能力を改良する組換えヒト造血蛋白質を発現するブタ好ましくはミニブタをも含む。上記の組換え構築物を用いて、トランスジェニックブタを、当分野で公知の任意の方法（マイクロインジェクション、胚性幹（ＥＳ）細胞操作、エレクトロポレーション、細胞銃、トランスフェクション、トランスダクション、レトロウイルス感染等が含まれるが、これらに限定されない）によって生成することができる。本発明のトランスジェニックブタを、トランスジーンをブタの生殖細胞系統特に骨髄細胞例えば造血細胞のゲノム中に導入することによって生成することができる。種々の発生ステージの胎児標的細胞を用いて、ヒトトランスジーン構築物を導入することができる。当分野で一般的に理解されているように、胎児標的細胞の発生のステージに依って、トランスジーンを導入するために種々の方法を用いる。遺伝子移入によりブタを改変するための１つの技術は、組換え核酸分子を受精卵の雄性前核に、その組換え核酸分子の１つ以上のコピーが発生する動物の細胞中に保持されるようにマイクロインジェクションすることである。関心ある組換え核酸分子は、細菌中での複製に用いられる配列の大部分を除いた線状形態で単離する。線状化及び余分なベクター配列の除去は、トランスジェニック哺乳動物の生成における一層高い効率を生じる。例えば、Brinster等(1985)PNAS 82: 4438-4442 を参照されたい。一般に、接合体は、マイクロインジェクションのための最適の標的である。ブタにおいて、雄性前核は、標準的マイクロインジェクション技術によるＤＮＡ溶液の再現可能な注入を可能にするサイズに達する。更に、遺伝子移入の標的としての接合体の利用は、殆どの場合に、注入されたＤＮＡが最初の卵割の前に宿主ゲノム中に取り込まれるという主要な利点を有する。通常、注入された卵から発生する動物の４０％までが、それらの組織中に、少なくとも１コピーの組換え核酸分子を含む。これらのトランスジェニック動物は、一般に、その遺伝子をその生殖細胞系統から次の世代へ伝える。遺伝子移入により操作された胚の子孫を、組織切片のサザーンブロット分析により、その構築物の存在について試験することができる。典型的には、尾の小部分をこの目的のために利用する。組換え核酸分子のトランスジェニック胚のゲノム中への安定なインテグレーションは、その組換え核酸分子を有する永久的なトランスジェニック哺乳動物系統を樹立することを可能にする。本発明の組換え核酸分子を含む動物を生成するための別法には、受精卵、胚由来幹細胞、強い胚性癌腫（Ｅｃ）細胞又は初期卵割胚の、その組換え核酸分子を含むウイルス性発現ベクターでの感染が含まれる。例えば、Palmiter等(1986)An n.Rev.Genet.20:465-499を参照されたい。レトロウイルス感染を用いて、トランスジーンをブタに導入することもできる。その発生中の胚を、イン・ビトロで、胚盤胞ステージまで培養することができる。この期間中、卵割球を、レトロウイルス感染について標的とすることができる（Jaenich(1976)PNAS 73:1260-1264）。卵割球の効率的な感染を、透明帯を取り除く酵素処理によって得ることができる（Hogan 等(1986)Manipulating the M ouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor,ニューヨーク中）。トランスジーンを導入するために用いられるウイルスベクター系は、典型的には、トランスジーンを有する複製欠損レトロウイルスである（Jahner等(1985)PNAS 82:6927-6931; Vander Putten 等(1985)PNAS 82:6148-61 52）。トランスフェクションは、卵割球をウイルス産生細胞の単層上で培養することにより得ることができる（Vander Putten，前出；Stewart 等(1987)EMBO J. 6:383-388）。或は、感染を、もっと遅いステージで行なうことができる。ウイルス又はウイルス産生細胞を卵割腔に注入することができる（Jahner等(1982)Na ture 298:623-628）。これらの創出動物（founder）の殆どは、取り込みが典型的にはトランスジェニックブタを形成した細胞のサブセットにおいてのみ生じるので、トランスジーンについてモザイクとなる。更に、この創出動物は、トランスジーンの種々のレトロウイルス挿入物を、ゲノムの種々の位置に含むことができ、それらは、一般に、子孫において分離する。更に、効率は低いが、妊娠中期の胎児の子宮内レトロウイルス感染によって、トランスジーンを生殖細胞系統に導入することも可能である（Jahner等(1982)前出）。トランスジェニックブタの構築において有用であり得る第３のアプローチは、トランスジーンの胚性幹細胞（ＥＳ）中への導入をターゲットするであろう。ＥＳ細胞は、イン・ビトロで培養された予備移植胚から得られ、胚と融合される（ Evans 等(1981)Nature 292:154-156; Bradley 等(1984)Nature 309:255-258; Go ssler 等(1986)PNAS 83:9065-9069;及びRobertson 等(1986)Nature 322:445-448 ）。トランスジーンは、ＤＮＡトランスフェクション又はレトロウイルス媒介のトランスダクションによって、効率的に、ＥＳ細胞中に導入することができよう。かかるトランスフォームしたＥＳ細胞を、その後、ブタからの胚盤胞と合わせることができよう。これらのＥＳ細胞をその後に用いて、胚にコロニー形成して、生成するキメラブタの生殖細胞系統に寄与することができよう。総説としては、Jaenisch(1988)Science 240:1468-1474 を参照されたい。受精卵母細胞ステージにおける組換え遺伝子の導入は、その遺伝子配列が、トランスジェニック「創出」ブタのすべての生殖細胞及び体細胞中に存在することを確実にする。ここで用いる場合、創出動物（略号「Ｆ」）は、組換え遺伝子が１細胞胚ステージにおいて導入されたブタを意味する。トランスジェニック創出動物の生殖細胞中における組換え遺伝子配列の存在は、更に、その創出動物の子孫の約半分がそれらのすべての生殖細胞及び体細胞中に活性化された組換え遺伝子配列を有することを意味する。もっと遅い胚ステージにおける組換え遺伝子配列の導入は、創出動物の幾つかの体細胞におけるその遺伝子の不在を生じ得るが、その遺伝子を受け継いだかかる動物の子孫は、それらの生殖細胞及び体細胞のすべてに、活性化された組換え遺伝子を有するであろう。ブタ卵母細胞のマイクロインジェクション好適具体例において、本発明のトランスジェニックブタを、下記により生成する：ｉ）組換え核酸分子を受精したブタ卵にマイクロインジェクションして、遺伝子を改変したブタ卵を生成し；ｉｉ）遺伝子を改変したブタ卵を宿主雌ブタに移植し；ｉｉｉ）その宿主雌を、該ブタ胎児の妊娠期間の実質的部分に等しい期間にわたって維持し；ｉｖ）この遺伝子を改変した哺乳動物卵から発生した、ヒト造血遺伝子を発現する少なくとも１つの細胞を有するトランスジェニックブタを得る。一般に、トランスジェニック動物作製におけるマイクロインジェクションプロトコールの利用は、典型的には、次の主要な４つのフェーズに分けられる：（ａ）それらの動物の用意；（ｂ）１若しくは２細胞胚の回収及びイン・ビトロでの維持；（ｃ）それらの胚のマイクロインジェクション及び（ｄ）胚のレシピエント雌への再移植。トランスジェニック家畜特にブタの作製に用いる方法は、原理的に、トランスジェニックマウスを作製するために用いるものと変わらない。例えば、一般的にトランスジェニックマウスに関するGordon等(1983)Methods in E nzymology 101:411 及びGordon等(1980)PNAS 77:7380を、Hammer等(1985)Nature 315:680，Hammer等(1986)J Anim S ci 63:269-278，Wall 等(1985)Biol Reprod .32:645-651，Pursel等(1989)Science 244:1281-1288，Vize 等(1988)J Cell Sc ience 90:295-300，Muller 等(1992)Gene 121:263-270及びVelander等(1992)PNA S 89:12003-12007（これらの各々は、トランスジェニックブタを生成するための技術を教示する）と比較されたい。ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０３４３２号及びＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２６４６号並びにこれらにおいて引用されている参考文献も参照されたい。準備フェーズの１ステップには、少なくともドナー雌の発情サイクルを同期化させること及び交配の前にそれらのドナー雌に過剰排卵を誘導することが含まれる。過剰排卵には、典型的には、発情サイクルの適当なステージに薬剤を投与して濾胞の発達を刺激し、次いで、薬剤で処理して発情を同期化し、排卵を開始することが含まれる。下記の実施例に記載のように、典型的には、妊娠雌ウマ血清を、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を真似るために、黄体形成ホルモン（ＬＨ）を真似るヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）と共に用いる。ブタにおける過剰排卵の効率的誘導は、周知のように、それらの雌の年齢及び体重、並びにゴナドトロピン投与の量及びタイミングを含む幾つかの変数に依存する。例えば、ブタの過剰排卵を記載しているWall等(1985)Biol.Reprod.32:645を参照されたい。過剰排卵は、多数の健康な胚が交配後に利用できる見込を増大させ、更に、実務者が実験のタイミングを制御することを可能にする。交配後、過剰排卵した雌からの１若しくは２細胞の受精卵を、マイクロインジェクション用に採取する。ブタから卵を集めるのに有用な様々なプロトコールが公知である。例えば、１つのアプローチにおいて、受精した過剰排卵した雌の卵管を外科的に取り出し、緩衝溶液／培養培地中で単離し、受精卵をそれらの単離した卵管組織からしぼり出す。Gordon等(1980)PNAS 77:7380; 及びGordon等(198 3)Methods in Enzymology 101:411 参照。或は、これらの卵管にカニューレを挿入して、受精卵を麻酔した動物から、緩衝溶液／培養培地を流すことにより外科的に集め、それにより、その動物を犠牲にする必要性を排除することができる。 Hammer等(1985)Nature 315:600参照。過剰排卵した雌の交配後の胚の採取のタイミングは、受精過程の長さ及び前核の十分な拡大に要する時間に依存し得る。この一時的な待ち時間は、例えば、大型品種のブタについては、最長で４８時間に及び得る。マイクロインジェクションに適した受精卵例えば前核を含む１細胞卵又は２細胞胚を、解剖顕微鏡下で容易に同定することができる。これらの単離したブタ胚のマイクロインジェクションに必要な装置及び試薬は、マウスについて使用されるものと類似している。例えば、胚をマイクロインジェクションするための装置及び試薬を記載しているGordon等(1983)Methods in Enzymology 101:411; 及びGordon等(1980)PNAS 77:7380を参照されたい。簡単には、受精卵を、卵ホルダー（１ｍｍのガラス管から作る）を用いて位置決めする（該ホルダーは、マイクロマニピュレーターに取り付けられており、それは、更に、適宜微分干渉コントラスト部分を備えた解剖顕微鏡と統合されている）。前核の可視化が、光学的に密な細胞質物質のために困難である場合（そういうことはブタ胚では普通のことである）、それらの胚の遠心分離を胚の生存力を危険にさらすことなく行なうことができる。Wall等(1985)Biol.Reprod.32:645。遠心分離は、通常、この方法において必要である。本発明の組換え核酸分子は、その組換え核酸分子を少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼを用いて線状化することにより、典型的には、線状化形態で与えられる（目的は、任意の原核生物の配列並びに不必要な隣接配列の除去である）。更に、組織特異的プロモーター及びヒト造血遺伝子を含む組換え核酸遺伝子を、ベクター配列から、１種以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて単離することができる。組換え核酸分子を操作し、線状化する技術は、周知であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual第二版、Maniatis 等編、Cold Spring Harbor，ニューヨーク(1989)に記載された技術が含まれる。線状化した組換え核酸分子を、周知の技術を用いて、ブタ卵中にマイクロインジェクションして、遺伝子の改変された哺乳動物卵を生成することができる。典型的には、線状化核酸分子を、Gordon等(1980)PNAS 77:7380-7384 により記載されたように、直接、受精卵の前核にマイクロインジェクションする。これは、生きている胚の有意の集団における組換え核酸分子の安定な染色体インテグレーションへと導く。例えば、Brinster等(1985)PNAS 82:4438-4442 及びHammer等(198 5)Nature 315:600-603を参照されたい。注入に用いる極微針（卵ホルダー等）も又、ガラス管を引いて作ることができる。極微針の先端を、毛管作用により、プラスミッド懸濁液で満たすことができる。次いで、顕微鏡による可視化により、極微針を、卵ホルダーによって保持された細胞の前核に挿入し、プラスミッド懸濁液をその前核に注入する。もし注入が成功すれば、前核は、一般に、顕著に膨潤する。次いで、極微針を引き抜き、マイクロインジェクションを生き抜いた細胞（例えば、溶解しないもの）を、続いて、宿主雌における移植用に用いる。この遺伝子を改変した哺乳動物胚を、次いで、レシピエントの卵管若しくは子宮角に移す。マイクロインジェクションされた胚を移植ピペット中に集め、そのピペットを外科的に露出させたレシピエントの卵管に挿入してマイクロインジェクションされた卵をピペットから卵管中に排出する。移植ピペットを引き抜いた後に、すべての外科的切開を閉じ、胚は養育母親にて妊娠を継続させる。例えば、Gordon等(1983)Methods in Enzymology 101:411; Gordon 等(1980)PNAS 77:73 90; Hammer等(1985)Nature 315:600; 及びWall等(1985)Biol.Reprod.32:645を参照されたい。移植された遺伝子を改変された哺乳動物卵を含む宿主雌哺乳動物を、本発明の組換え核酸分子を発現する少なくとも１つの細胞例えば骨髄細胞例えば造血細胞を有するその遺伝子を改変された哺乳動物卵から発生したトランスジェニック哺乳動物を誕生させるのに十分な期間維持する。２〜４週齢（生後）にて、尾切片をこれらの仔ブタから採取して、プロテイナーゼＫで消化する。これらの試料からのＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出し、次いで、種々の制限酵素で消化する。これらのＤＮＡ消化物を、トリス− ホウ酸ゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース上にブロットして、ランダムヘキサマーの伸長により標識した関心ある組換えｃＤＮＡのコード領域の少なくとも一部からなるプローブとハイブリダイズさせる。高緊縮条件下で、このプローブは内因性ブタ遺伝子とハイブリダイズしないはずであり、トランスジェニックブタの同定を可能にするであろう。この発明の好適な特定の具体例により、トランスジェニックブタを、実施例１に示した方法によって生成することができる。実施例２ヒトのｃ−ｋｉｔ（ヒトＳＣＦのレセプター）を発現するトランスジェニックブタの作製経口で活性のプロゲストゲン（アリルトレボロン、ＡＴ：１５ｍｇ／動物／日）を、性的に成熟した未経産雌ブタ（＞７月齢）に、１２〜１４日間食べさせることにより、発情を同期化する。ＡＴ給餌の最終日に、すべての未経産雌ブタに、プロスタグランディンＦ_2a（Ｌｕｔａｌｙｓｅ：１０ｍｇ／注射）を、０８００又は１６００にて、筋肉注射（ＩＭ）する。ＡＴ消費の最終日の２４時間後に、すべてのドナー未経産雌ブタに、妊娠雌ウマ血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ：１５００ＩＵ）の単一ＩＭ注射をする。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ：７５０ＩＵ）を、ＰＭＳＧ後８０時間にて、すべてのドナーに投与する。ＡＴ消費を停止した後に、ドナー及びレシピエントの未経産雌ブタを、１日２回、成熟雄ブタを用いて、発情の徴候をチェックする。ＨＣＧ投与後３６時間以内に発情を示したドナーを、人工及び自然の受精（それぞれ）を用いて、発情の開始後１２及び２４時間にて交配させる。ＨＣＧの投与の５９及び６６時間後に、１細胞及び２細胞卵を、次の手順を用いて交配したドナーから外科的に回収する。体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇのアセプロマジン及び１．３ｍｇのケタミンを末梢の耳の静脈から投与することにより全身麻酔を誘導する。麻酔に続いて、生殖管を、腹中開腹によって体外に出す。吸出用ガラスカニューレ（Ｏ．Ｄ．５ｍｍ、長さ８ｃｍ）を、卵管口に挿入し、単一シルク（２−０）縫合を用いて漏斗状部に固定する。２０ｇ針を卵管の内腔（子宮卵管接合点の２ｃｍ前）に挿入することにより、逆行様式で、卵をフラッシュする。０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補った無菌のダルベッコのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を卵管中に注入し、ガラスカニューレの方にフラッシュする。この培地を、無菌の１７×１００ｍｍポリスチレン管中に集める。フラッシュ物を１０×６０ｍｍのペトリ皿に移して低倍率（５０×）にて探す。すべての１細胞及び２細胞卵を、１．５％ＢＳＡを補ったブリンスター改変卵培養３培地（ＢＭＯＣ−３）にて２回洗い、油下の５０ｍｌのＢＭＯＣ−３液滴に移す。卵を、９０％Ｎ₂、５％Ｏ₂、５％ＣＯ₂大気下で、マイクロインジェクションを行なうまで３８℃に保存する。１細胞及び２細胞卵を、１．５％ＢＳＡを補った１ｍｌのＨＥＰＥＳ培地を含むエッペンドルフ管に入れ（１５卵／管）、１細胞卵中の前核及び２細胞卵中の核を可視化するために、１４０００×ｇで６分間遠心分離する。次いで、卵を、陥凹スライド上の油下の５〜１０ｍｌのＨＥＰＥＳ培地の液滴に移す。マイクロインジェクションを、Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学装置及び２つのＬｅｉｔｚマイクロマニピュレーターを備えたＬａｂｏｒｌｕｘ顕微鏡を用いて行なう。操作可能にプロモーターに結合されたヒトのｃ−ｋｉｔ遺伝子を含むＤＮＡ構築物の１０〜１７００コピー（トリス−ＥＤＴＡ緩衝液１ｍｌ中のｌｎｇ）を、１細胞卵中の１つの前核又は２細胞卵中の両方の核に注入する。マイクロインジェクションした卵は、油下のＢＭＯＣ−３培地の液滴に戻し、それらの適当なレシピエントへのトランスファー前には、９０％Ｎ₂、５％ＣＯ₂ 、５％Ｏ₂大気下で、３８℃に維持する。卵は、回収の１０時間以内にトランスファーする。ドナーと同じ日に又は２４時間遅れて発情を示したレシピエントのみを、胚トランスファーに用いる。レシピエントを、上記のように麻酔する。一方の卵管を体外に出した後に、少なくとも３０個の注入された１細胞及び／又は２細胞卵及び４〜６個の対照用卵を、次の方法にてトランスファーする。２１ｇｘ３／４バタフライ注入セットからの管をｌｃｃシリンジに接続する。卵及び１〜２ｍｌのＢＭＯＣ−３培地をこの管中に吸引する。次いで、この管を、卵管口を通して、先端が卵管の下１／３又は峡部に達するまで送り込む。続いて、これらの卵を、この管をゆっくり引き出す際に排出する。この生殖管の露出させた部分を、無菌の１０％グリセロール／０．９％塩溶液に浸して、体腔に戻す。白線を含む結合組織、脂肪及び皮膚を、３つの別々の層として縫合する。中断されないハルステッドスティッチを用いて、白線を閉じる。脂肪及び皮膚は、それぞれ、単一の連続的スティッチ及びマットレススティッチを用いて閉じる。次いで、局所的抗菌剤（フラゾリドン）を、切開領域に投与する。レシピエントを４つのグループにておりに入れ、１．８ｋｇの標準的な１６％粗蛋白質トウモロコシ大豆食糧を与える。１８日目に開始して（０日目＝発情の開始）、すべてのレシピエントを、毎日、成熟雄ブタを用いて、発情の徴候をチェックする。３５日目に、超音波を用いて、妊娠の検出を行なう。妊娠１０７日目に、レシピエントを、分娩室へ移す。分娩時に付き添うことを確実にするために、プロスタグランディンＦ_2a（１０ｍｇ／注射）を妊娠１１２日目の０８００及び１４００時間に投与することにより分娩を誘導する。レシピエントは、ＰＧＦ_2a投与後約３４時間以内に分娩するはずである。Ｖ．ヒト成長因子を試験するためのトランスジェニックブタの利用この発明の動物をモデルとして用いて、ヒト成長因子のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する薬剤について試験することができる。試験すべき薬剤をこの発明の動物に投与してトランスジェニック造血細胞の増殖をモニターすることができる。VI ．異種移植におけるトランスジェニックブタ造血幹細胞の利用下記の手順を、移植されたブタ器官（異種移植片）が拒絶前に異種宿主において生存する時間を長くするようにデザインした。この器官は、任意の器官例えば肝臓、例えば腎臓、例えば心臓であってよい。主なストラテジーは、器官潅流による天然抗体の排除、寛容を誘導するトランスジェニックブタ細胞の移植及び、適宜、ドナー間質組織の移植である。移植のためのレシピエントの用意には、これらのステップの何れか又はすべてが含まれる。好ましくは、それらを、下記の順序で行なう。第１に、ウマ抗ヒト胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の調製物を、レシピエントに静脈注射する。この抗体調製物は、成熟Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を排除する。もし排除されなければ、成熟Ｔ細胞は、骨髄移植物及び、感作後に、移植片自体の両方の拒絶を促進するであろう。同様に重要なことには、ＡＴＧ調製物は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をも排除する。ＮＫ細胞は、おそらく、移植された器官に何の効果も有しないが、新たに導入された骨髄を直ちに拒絶するであろう。任意の哺乳動物宿主から得た抗ヒトＡＴＧ例えばブタで生成したＡＴＧを用いることもできる（但し、ブタＡＴＧ調製物は、ウマ由来ＡＴＧより遥かに低力価である）。抗ＮＫモノクローナル抗体は一般にすべての宿主ＮＫ細胞に対して溶解性ではないが、ＡＴＧにおけるポリクローナル混合物はすべての宿主ＮＫ細胞を溶解させることができるので、ＡＴＧは、抗ＮＫモノクローナル抗体より優れている。宿主Ｔ細胞が移植後再生する時期における宿主胸腺中のドナー抗原の存在は、宿主Ｔ細胞を寛容化するのに決定的に重要である。もしドナー造血幹細胞が宿主胸腺において樹立され得ず、宿主Ｔ細胞が再生する前に寛容を誘導できなければ、この骨髄消耗的でない養生法中、抗レシピエントＴ細胞抗体の反復投与が必要であり得る。宿主Ｔ細胞の連続的涸渇は、数週間にわたって必要であり得る。或は、例えば、もしこのアプローチが不成功で、寛容が（ドナー皮膚移植片の受容、特異的細胞のイン・ビトロでの応答性低下及び体液性寛容により測定して）これらの動物において誘導されないならば、宿主の胸腺摘出術を含むようにアプローチを改変することができる。胸腺摘出したレシピエントにおいて、宿主Ｔ細胞は、宿主胸腺において分化する機会を持たず、ドナー胸腺中で分化しなければならない。もしこれが不可能であるならば、その動物は、免疫適格について、ドナー胸腺において発生するドナーのＴ細胞に依存しなければならない。免疫適格は、非ドナー型の同種異型ドナー皮膚移植片を拒絶する能力及び病原体含有環境で生存する能力によって測定することができる。貧血を回避するために、レシピエントに脾臓摘出術を施すことも又、必要若しくは望ましいであろう。第２に、造血空間を造るために、レシピエントに低線量照射を施す。１００〜４００ラドの全身照射の準致死的線量及び７００ラドの局所的胸腺照射が、この目的に効果的であることが見出されている。第３に、天然抗体を、レシピエントの血液から、ブタ肝臓の血液潅流によって吸収する。予め形成された天然抗体（ｎＡＢ）は、移植片拒絶の主要な作用因子である。天然抗体は、異種内皮細胞に結合し、主としてＩｇＭクラスである。これらの抗体は、異種ドナーの抗原に以前にさらされる必要がない。これらの天然抗体を生成するＢ細胞は、Ｔ細胞非依存性の傾向があり、発生中にこれらの抗体にさらされることにより自己抗原に対して、通常、寛容である。新たに発生するＢ細胞が寛容化される機構は、未知である。肝臓は、腎臓より一層効果的な天然抗体の吸収材である。非骨髄消耗的手順における第４のステップは、ドナー間質組織（好ましくは、胎児肝、胸腺及び／又は胎児脾臓から得たもの）をレシピエントに移植する（好ましくは、腎臓カプセルにて）。異種バリヤーを超える幹細胞植付け及び造血は、ドナー種からの造血間質環境を与えることにより促進される。間質マトリックスは、造血細胞とそれらの間質環境との相互作用に必要な種特異的因子例えば造血成長因子、接着分子及びそれらのリガンドを供給する。胸腺は、Ｔ細胞成熟の主要な部位である。各器官は、宿主に移植された各未分化幹細胞の分化を支持し得る器官特異的な間質マトリックスを含む。成体の胸腺を用いることはできるが、妊娠の十分初期に得られる胎児組織が、ＧＶＨＤを引き起こし得る成熟Ｔ細胞を含まないので好適である。胎児組織は又、移植した場合に、成体組織よりよく生存する傾向がある。ＧＶＨＤに対する更なる用心として、胸腺間質組織を、移植前に照射することができる（例えば、１０００ラドで照射）。移植の別法又は補助として、胎児肝細胞を、液体懸濁液にて投与することができる。（トランスジェニック「ヒト化」ブタ細胞（宿主幹細胞と一層効果的に競争して宿主を再増殖することができる）の利用は、このステップの必要性を排除することができる。）第５に、トランスジェニックブタ骨髄幹細胞（ＢＭＣ）例えばヒトｃ−ｋｉｔ遺伝子を発現するように処理されたブタＢＭＣを、レシピエントに注入する。ドナーＢＭＣは、レシピエントの適当な部位に向かい、残りの宿主細胞と隣接して成長して増殖し、キメラリンパ造血ポピュレーションを形成する。この過程において、新たに形成されるＢ細胞（及びそれらが生成する抗体）は、ドナー抗原にさらされ、それにより、その移植物は、自己として認識されることになる。ドナーに対する寛容は又、造血幹細胞例えばＢＭＣ植付けが達成された動物においてＴ細胞レベルでも認められる。器官移植片を、骨髄キメリズムを誘導した数カ月後にかかる動物中に置くと、ドナーに対する天然抗体は消失しており、移植片は免疫系の体液性及び細胞性の力の両方により受け入れられるはずである。このアプローチは、造血細胞例えばＢＭＴ例えば胎児肝懸濁液の移植の後、器官移植が十分に長く行なえるようにし、器官移植の時点で正常の健康及び免疫適格が回復されるという更なる利点を有する。これらの手順の何れも移植された器官の生存を助けるが、最良の結果は、すべてのステップを組み合わせて用いた場合に達成される。移植のドナーと寛容を誘導する造血細胞若しくは潅流される肝臓を与える個体は、同一個体であるべきであり、或は、できるだけ近い関係であるべきである。例えば、高度に交配したドナーコロニーから移植組織を得るのは好ましいことである。他の具体例ここで論じているように、混合キメリズムの発生を促進するために、移植片レシピエントを照射にさらすことはしばしば望ましい。照射線量を分けることにより即ち照射を２以上の曝露又は持続期間にて加えることによって、一層少ない照射毒性にて混合キメリズムを誘導することができる。異種移植片のレシピエント例えば霊長類の例えばヒトレシピエントの照射を必要とするこの発明の任意の方法において、その照射は、単一曝露にて加えることもできるし、２以上の曝露又は持続期間に分けることもできる。分けた線量の合計は、好ましくは、単一照射で与えた場合に混合キメリズムを生じる照射線量に等しい（例えば、ラド又はＧｙにて）。これらの分割した線量は、好ましくは、ほぼ等しい。例えば、７００ラドの単一線量は、３５０ラドの２つの分割した線量と又は１００ラドの７つの分割した線量と置き換えることができる。照射線量の高度分割も又、この発明の方法において用いることができる。これらの分割線量は、同じ日に加えてもよいし、１、２、３、４、５日以上の間隔を開けて加えてもよい。全身照射、胸腺照射又はこれらの両方を、分割することができる。ここで論じているように、血液潅流例えばドナー器官を用いる血液潅流を用いて宿主の天然抗体を涸渇させることができる。天然抗体を涸渇させ或は不活性化させる他の方法を、ここに記載の方法の任意のものと共に用いることができる。例えば、天然抗体を涸渇させ又は不活性化させる薬物例えばデオキシスパガリン（ＤＳＧ）（Bristol）又は抗ＩｇＭ抗体を、同種移植片又は異種移植片のレシピエントに投与することができる。この発明の方法において、ＤＳＧ（若しくは類似の薬物）、抗ＩｇＭ抗体及び血液潅流の１つ以上を用いて、レシピエントの天然抗体を涸渇させ或は不活性化させることができる。濃度６ｍｇ／ｋｇ／日のＤＳＧの静脈投与が、ブタにおけるカニクイザル腎臓移植物に対する天然抗体の機能の抑制に有用であることが見出されている。ここに記載の方法の幾つかは、致死的照射を用いて、造血空間を造り、それにより、異種の遺伝子工学処理した幹細胞の投与に対するレシピエントの用意をする。ここに記載の方法の何れにおいても（特に、霊長類における方法又は臨床における方法において）、かかる細胞の投与のための造血空間を、非致死的手段により例えば準致死的線量（投与量）の照射、骨髄涸渇剤又は抗体を投与することにより造ることは望ましい。準致死的レベルの骨髄涸渇の利用は、レシピエントにおける混合キメリズムの生成を与える。混合キメリズムは、一般に、レシピエント骨髄の全体的又は致死的消耗及びそれに続く投与した幹細胞によるレシピエントの完全な再構成に好適である。他の具体例は、後述の請求の範囲内にある。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Genetically engineered pig cellsBackground of the Invention The invention relates to the field of organ transplantation. Technological advances in allogeneic organ transplantation and availability of nonspecific immunosuppressants Has revolutionized the field of organ transplantation. However, this advance Lack of essential organs of size and compatibility resulted. Lack of allograft organs has resulted in increased interest in xenografts. Chimp It has been more than 25 years that NJ to human transplants can provide long-term life support Shown before. However, its use as a non-human primate organ source is applicable Sex is limited. Many primate species are small and protected, and more Many, such as baboons, often allow the use of those organs in adults. Does not grow to a size Furthermore, in some cultures, spirit as an organ source Utilization of the long class is not ethnically acceptable. Some of these difficulties are solved by utilizing ungulate organs, especially pig organs Will be able to. Pigs are domesticated, easy to breed, and litters Large and allow the use of those organs in very large humans It grows very fast. In addition, pigs and humans have many anatomical and physiological similarities. It has nature. However, transplantation of porcine organs into humans is not Rejection.Summary of the Invention In general, The present invention Genetically engineered porcine cells such as cultured porcine cells Cultured swine cells transformed with retrovirus, Or a protein that supports the graft Transgenes encoding white matter, eg, primate, eg, human hematopoietic peptides; or Is a transgene that blocks the expression or action of a graft antagonistic gene product. Or cells derived from transgenic pigs containing either or both. Transplant Examples of transgenes that block the expression or action of an antagonistic gene product include: Resi Directly or indirectly inhibits the expression or action of graft antagonistic protein from Pient. Antisense RNA to stop, e.g., Block the expression of the receptor that is loaded Recipient-derived protein A transgene encoding an antisense RNA; Donor transfer In a copy inactivated by a mutation in the gene encoding the plant antagonist protein So, Mis-expressed when inserted into the donor genome, for example by homologous recombination Cause an endogenous gene or cause a mutation, eg, a donor graft antagonistic protein Mutation of the gene encoding quality to an endogenous genomic copy (eg, Deletion) Transgenes that produce an inactivated endogenous gene upon insertion (eg, Tiger The insertion of the transgene Defects against recipient-derived proteins that are graft-antagonistic Knockout for the receptor from the donor); Donor or resi Inhibitors of graft antagonistic protein from Pient, such as competitive inhibitors Or molecules that specifically block the activity of proteases or other graft antagonistic proteins A transgene encoding And graft antagonistic gene products such as host sites Encodes a dominant negative mutation in the donor cell receptor for Cain Includes transgene. In a preferred embodiment, The transgene encoding the graft support protein is Resi Pient MHC genes, eg, primates, eg, non-human primates or human MHC genes I am a child. In a preferred embodiment, Transgene Donor MHC gene product (this product Is an antagonist of the graft). In a preferred embodiment, The genetically engineered pig cells are hematopoietic stem cells, Transplant The transgene encoding the cantilever support protein is a recipient MHC gene such as A long, eg non-human, primate or human MHC gene. In a preferred embodiment, The genetically engineered pig cells are hematopoietic stem cells, Tiger Susgene, Donor MHC gene product (this gene product is graft antagonistic ) Is inhibited. In a preferred embodiment, A transgene encoding a graft support protein and / or Is A transgene that blocks the expression or action of a gene product that is graft antagonistic , MHC gene; Porcine MHC gene; A recipient MHC gene; Non-primate MH C gene; It is other than the non-human MHC gene. In a preferred embodiment, The genetically engineered pig cells are hematopoietic stem cells, Transplant Transgene and / or Graft Antagonistic Gene Encoding a Graft Supporting Protein A transgene that blocks product expression or action MHC gene; Pig MHC remains Kid; A recipient MHC gene; Non-primate MHC; Or non-human MHC gene or less Outside. In a preferred embodiment, Transgene Graft support proteins such as human growth factors Receptor for cytokines or cytokines, such as growth factors or cytokines involved in the regulation of hematopoiesis Encodes a receptor for tokine. Growth factor or cytokine receptor Examples include: G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11 , IL-2, Includes receptors for Epo and Uteroferrin. In a preferred embodiment, Transgene Graft support proteins such as human adhesion They encode adhesion molecules involved in the implantation and / or maintenance of offspring, such as hematopoietic cells. Hi Examples of adhesion molecules include VLA-4, c-kit, CD11a, Mac-1, CD 3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD49a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 and CD34 are included. In yet another preferred embodiment, the transgene comprises: Recipient or donor For example, a protein Immune response initiated by donor cells to the recipient , Directly or indirectly (for example, For stimulating or blocking the activity level of the second cytokine More) blocking cytokines such as IL-10, IL-4, IL-2 or TGF Code -β. In yet another preferred embodiment, Transgene Chimera molecules such as chimeras Enhokine is encoded, for example, PIXY123. In yet another preferred embodiment, Transgene Graft support protein Direct or indirect immune response initiated by recipient cells to donor tissue (For example, (By stimulating or blocking the level of activity of the second cytokine) A recipient or donor cytokine such as IL-10; IL-4, IL- 2 or TGF-β. In yet another preferred embodiment, Transgene For example, the expression of a gene product The reduction prevents the expression or action of a gene product that is graft antagonistic. An example For example, Transgene Donor graft antagonistic proteins such as B-7 in donor cells Receptor, CD27 receptor or LFA-3 receptor or host Inactivated by mutation in gene encoding donor receptor for tocaine A sexualized copy, Inserted into the donor genome, for example, by homologous recombination. When an endogenous gene is generated, the endogenous gene is Mis-expressed or Is due to a mutation (for example, B-7 receptor on donor cells, CD27 receptor Donor or receptor for LFA-3 or LFA-3 receptor or host cytokine Mutation into the endogenous genomic copy of the gene encoding Deletion Inactivated (by introduction). Transgene Graft antagonistic protein from the recipient, e.g. Loaded B-7 receptor, CD27 receptor or LFA-3 or host Antisense RNA that blocks expression of donor receptors for cytokines Encoding an antisense RNA that directly or indirectly blocks the expression or action of It may be. Transgene Gene products that are graft-antagonistic, such as host cytokines A receptor or donor B-7 receptor for CD27 receptor or Encoding a dominant negative mutation in the LFA-3 receptor. No. In yet another preferred embodiment, Transgene Human peptides such as hematopoiesis A nucleic acid encoding a peptide, Swine promoter, such as swine hematopoietic gene pro motor; Including viral or developmentally regulated promoters And a nucleic acid operably linked to a natural promoter. In yet another preferred embodiment, Pig cells that have been genetically engineered Pig hematopoietic stem Vesicles such as cord blood hematopoietic stem cells, Bone marrow hematopoietic stem cells or fetal or neonatal liver Are hematopoietic stem cells of the spleen; Differentiated blood cells such as myeloid cells such as megakaryocytes , Monocytes, Granulocytes, Or derived from eosinophils; Erythroid cells such as red blood cells For example, lymphoid cells (for example, B lymphocytes and T lymphocytes); Pluripotent hematopoiesis Stem cells such as hematopoietic progenitors such as burst forming units erythroid cells (BFU-E), Colony forming units erythroid cells (CFU-E), Colony forming unit megakaryocyte (CF U-Meg), Colony forming units-granulocytes-monocytes (CFU-GM), Colony shape Adult eosinophils (CFU-Eo) or colony forming units granulocytes-granulocytes-erythrocytes- Derived from megakaryocyte-monocyte (CFU-GEMM); Hematopoietic stem cells or other blood cells Other porcine cells; Porcine thymic cells such as porcine thymic stromal cells; Bone marrow stroma Cells; Porcine liver cells; Porcine kidney cells; Porcine epithelial cells; Pig making Blood precursor cells; Porcine muscle cells such as myocardium; Or dendritic cells or before It is a carnival. In yet another preferred embodiment, Transgenic cells Cultured cells Subcultured, eg, derived from primary cultures of hematopoietic stem cells; Transgenic animals Isolated or derived from In yet another preferred embodiment, Transgenic pig cells Transgy Hemi-junction for Transgenic pig cells Transgene About heterozygotes; Transgenic pig cells Transgene And homozygous (by crossing heterozygous transgenic pigs, Tiger Progeny that can be homozygous for the transgene); Transge Enzymatic pig cells Includes two or more transgenes. In other respects, The present invention Pig promoters such as the pig hematopoietic gene promoter Data or Heterologous inducible or developmentally regulated promoter (transplant Graft support proteins such as primates or human graft support proteins such as primates A nucleic acid encoding a human hematopoietic peptide; Or operably linked to the encoding nucleic acid. Expression of a transgene or a gene product that is graft antagonistic It is characterized by a transgene that blocks its action. Gene production that is graft-antagonistic Examples of transgenes that block the expression or action of a product include: From the recipient An antiserum that directly or indirectly blocks the expression or action of a graft antagonistic protein For RNAs such as recipient-encoded proteins encoded by the donor Block the expression of the Block the action of recipient protein Transgene encoding antisense RNA; Donor or reciever Inhibitors of graft-antagonistic protein derived from the drug, such as competitive inhibitors or Protease or other molecules that specifically block the activity of the graft antagonist protein Transgene And gene products that are graft antagonistic, such as host sites Encodes a dominant negative mutation in the donor cell receptor for Cain Includes transgene. In a preferred embodiment, The transgene encoding the graft support protein is Resi Pient MHC genes, eg, primates, eg, non-human primate or human MHC genes It is. In a preferred embodiment, Transgene Donor MHC gene product (this is (Which is graft antagonistic). In a preferred embodiment, Nucleic acids encoding graft support proteins and / or graft antagonists A nucleic acid that blocks expression or action of a gene product that is resistant is MHC gene; Pig M HC gene; A recipient MHC gene; Non-primate MHC genes; Or non-human M Other than the HC gene. In a preferred embodiment, Nucleic acids are Graft support proteins such as human growth factor or cytochrome Tokine receptors such as growth factors or cytokine receptors involved in the regulation of hematopoiesis Code the puter. Examples of growth factor or cytokine receptors include: G-CS F, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, IL-2, Ep o and uteroferrin receptors. In another preferred embodiment, Nucleic acids are Graft-supporting proteins such as human adhesion molecules For example, it encodes an adhesion molecule involved in the implantation and / or maintenance of hematopoietic cells. Human Examples of adhesion molecules include VLA-4, c-kit, LFA-1, CD11a, Mac -1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD49a, LP AM-1, CD49d, CD44, CD38 and CD34 are included. In yet another preferred embodiment, Nucleic acids are Recipient or donor protein illustration If The immune response to the recipient initiated by the donor cells (eg, No. Directly or indirectly (by stimulating or blocking the level of activity of the two cytokines) Cytokines such as IL-10, IL-4, Encodes IL-2 or TGF-β I do. In yet another preferred embodiment, Nucleic acids are Graft support protein Recipe En Mediated immune response against donor tissue (eg, Second site Recipients that block directly or indirectly (by stimulating or blocking the level of activity of Cain) A cytokine of a patient or donor, such as IL-10; IL-4, IL-2 or TG Encodes F-β. Transgene Expression or action of the graft antagonistic protein from the recipient Antisense RNA that blocks directly or indirectly, for example, B- encoded by the donor 7 receptors, CD27 receptor or LFA-3 receptor or host Antisense RNA blocking the expression of donor receptor for tokine May be used. Transgene For gene products that are graft-antagonistic, such as host cytokines A donor cell receptor or donor B-7 receptor for CD27 receptor Or encodes a dominant negative mutation in the LFA-3 receptor. May be. In yet another preferred embodiment, Transgene Chimera molecules such as chimeras Enhokine is encoded, for example, PIXY123. In a preferred embodiment, Transgene Furthermore, Transcriptional regulatory sequences, eg tissue specific For example, a promoter Hematopoietic system operably linked to a recombinant human gene sequence Includes heterologous promoter. In other respects, The present invention The effects of gene products that are graft antagonistic example Characterized by a transgene that blocks by reducing expression of its gene product You. For example, This transgene Encodes a donor graft antagonistic protein A copy inactivated by mutation of the gene, Like in the donor genome Is a transgene that produces an endogenous gene when inserted by homologous recombination. The endogenous gene is Misexpressed or For example, a donor graft antagonist protein Mutations into the endogenous genomic copy of the encoding gene (eg, Deletion) By Is inactivated by mutation (eg, Transgene insertion Enter Donor-derived proteins against recipient-derived proteins that are graft-antagonistic proteins Knocks out the scepter). In a preferred embodiment, Transgene Donor MHC gene product (this genetic Child products are (Which is graft antagonistic). In a preferred embodiment, Tranes that block the effects of gene products that are graft antagonistic Jean, MHC gene; Porcine MHC gene; A recipient MHC gene; Non A primate MHC gene; Or it is other than a non-human MHC gene. In yet another preferred embodiment, Transgene Genes that are graft antagonistic Expression or action of the product, For example, by reducing expression of the gene product You. For example, This transgene Donor graft antagonistic proteins such as donor cells Vesicular B-7 receptor, CD27 receptor or LFA-3 receptor or Mutations in the gene encoding the donor receptor for the host cytokine Inactivated copy, In the donor's genome, for example by homologous recombination When inserted, it produces an endogenous gene. The endogenous gene is Misexpression Or For example, B-7 receptor on donor cells, CD27 receptor Encodes a donor receptor for the LFA-3 receptor or host cytokine. Mutations into the endogenous genomic copy of the gene (eg, Deletion) Has been deactivated. In other respects, The present invention Graft support protein, eg, primate, eg, human Protein (preferably, A transgene encoding a hematopoietic peptide); Or graft A transgene that blocks the expression or action of a gene product that is antagonistic or Characterize transgenic pigs with cells containing both. Graft antagonism Examples of transgenes that block the expression or action of a gene product that is Resi Directly or indirectly inhibits the expression or action of graft antagonistic protein from Pient. Antisense RNA to stop, For example, donors for proteins from the recipient Block the expression of the receptor that is loaded Recipient-derived protein A transgene encoding an antisense RNA; Donor's A copy inactivated by mutation of the gene encoding the graft antagonistic protein And Endogenous when inserted into the donor genome, for example by homologous recombination A transgene that produces the gene; the endogenous gene is Misexpressed or For example, Sudden into the Endogenous Genomic Copy of the Gene Encoding the Gnar Antagonist Antagonist Protein Mutations (for example, Has been inactivated by mutation through the introduction of a deletion If Transgene insertion Recipient-derived protein that is a graft antagonistic protein Knock-out of donor-derived receptors for quality); Donor young Or an inhibitor of a graft antagonistic protein from the recipient, such as a competitive inhibitor Specifically inhibits the activity of bitter or protease or other graft antagonistic proteins A transgene encoding a molecule; And gene products that are graft antagonistic, such as A dominant negative mutation in the donor cell receptor for the major cytokine Includes transgenes to load. In a preferred embodiment, The transgene encoding the graft support protein is Resi Pient MHC genes, eg, primates, eg, non-human primates or human MHC genes It is a messenger. In a preferred embodiment, Transgene Donor MHC gene product Child products are (Which is graft antagonistic). In a preferred embodiment, A transgene encoding a graft support protein and / or Is a transgene that blocks the expression or action of a gene product that is graft antagonistic Is MHC gene; Porcine MHC gene; A recipient MHC gene; Non-primate M HC gene; Or it is other than a non-human MHC gene. In a preferred embodiment, Transgene Graft support proteins such as human growth factors Offspring or cytokine receptors such as growth factors or sites involved in the regulation of hematopoiesis Encodes a cytokine receptor. Examples of growth factor or cytokine receptors Is G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, I L-2, Includes receptors for Epo and Uteroferrin. In another preferred embodiment, Transgene Graft support proteins, such as human Encoding an adhesion molecule, eg, an adhesion molecule involved in the implantation and / or maintenance of hematopoietic cells. You. Examples of human adhesion molecules include VLA-4, c-kit, LFA-1, CD11 a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD4 9a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 and CD34 included You. In yet another preferred embodiment, Transgene Of the recipient or donor Protein Immune response to recipient initiated by donor cells ( For example, By stimulating or blocking the level of activity of the second cytokine) Cytokines that block directly or indirectly, such as IL-10, IL-4, IL-2 Or encodes IGF-β. In yet another preferred embodiment, Transgene Graft support protein An immune response to donor tissue initiated by the recipient cells (eg, No. Direct or indirect (by stimulating or blocking the level of activity of the two cytokines) A recipient or donor cytokine such as IL-10, IL-4 , Encodes IL-2 or TGF-β. In yet another preferred embodiment, Transgene Chimera molecules such as chimeras Enhokine is encoded, for example, PIXY123. In yet another preferred embodiment, Transgene Genes that are graft antagonistic Expression or action of the product, For example, by reducing the expression of the gene product. Stop. For example, Transgene Donor graft antagonistic protein, eg, donor B-7 receptor on cells, CD27 receptor or LFA-3 receptor or Is a mutation in the gene encoding the donor receptor for host cytokines A more inactivated copy and in the donor genome, for example, by homologous recombination. Which result in an endogenous gene when inserted The endogenous gene is Misrepresentation Manifested or For example, B-7 receptor on donor cells, CD27 receptor young Or a donor receptor for LFA-3 receptor or host cytokine. Mutation into the endogenous genomic copy of the gene to be encoded (eg, Deletion) Than, Inactivated by mutation. Transgene Expression or action of the graft antagonistic protein from the recipient Antisense RNA that blocks directly or indirectly, eg, B-7 encoded by the donor Receptor, CD27 receptor or LFA-3 receptor or host site Encodes antisense RNA that blocks donor receptor expression for Cain It may be. Transgene For gene products that are graft-antagonistic, such as host cytokines A donor cell receptor or donor B-7 receptor for CD27 receptor Or encodes a dominant negative mutation in the LFA-3 receptor May be. In yet another preferred embodiment, Transgene Graft-supporting proteins such as spirits Coding long or human graft support proteins such as primate or human hematopoietic peptides Nucleic acid to be loaded, or A gene product that is graft antagonistic, such as a graft antagonistic protein Inhibits the action of a donor receptor gene product on a recipient protein Transgene to be shut off (porcine promoter, eg, porcine hematopoietic gene promoter; Viral promoter; An inducible promoter; Or professionally regulated Operably linked to a promoter other than those naturally occurring with the motor A). In yet another preferred embodiment, Transgenic pig cells Transgy Hemi-junction for Transgenic pig cells Transgene About hemizygosity; Transgenic pigs About Transgene Terrorism; Transgenic pigs Homozygous about transgene (Heterozygous transgenic pigs are crossed, Transgene Progeny that can be homozygous for Transgenic pig Is Includes two or more transgenes. The transgenic pig (or pig cell) of the present invention comprises: Xenogeneic to human patients It can be used as a source of "humanized" hematopoietic cells for transplantation. The present invention Using transgenic pig cells, Human growth factor, Cytokine or hematopoietic Measuring agonists or antagonists of other molecules involved in regulation and / or Can also be set. For example, cultured cells or transgenes transformed by a retrovirus Using the transgenic pig cells of the present invention derived from transgenic animals, Do Inducing Immune Tolerance in Recipient Animals to Transplants from Nurse Pigs Can be. For example, The cells of this invention U.S. Patent filed on Sep. 23, 1993 Application No. 126, Can be combined with the method for inducing tolerance described in No. 122 You. The present invention Desirable interaction between donor cells and molecules and recipient cells Increase the effect (for example, Implantation or function of donor stem cells in a recipient environment To provide a transplant of porcine donor cells that have been treated as described above. Stem cells To induce tolerance to donor graft cells (or Receiving donor graft cells 容. The invention also provides Donor cells and molecules and recipient cells ( They are, For example, Promotes rejection of donor graft cells Donors treated to minimize unwanted interactions between -It also provides for cell transplantation. The present invention Stem cells and / or graft cells And provide a porting method that treats them as such. Between donor stem cells and the recipient The processed changes that increase the desired interaction between In some cases, Transfer It would not be desirable in the cells of the explant. Similarly, Donor graft cells and recipes The processed changes that reduce unwanted interactions with the ent In some cases To It would not be desirable in donor stem cells. Therefore, The present invention donor Stem cells and donor grafts include different methods, In the method, One is On the other hand Have processed changes. For example, In some applications, Donor stem cells Having a transgene that is not present in the graft cells, Donor graft cells Donor stem Has a transgene that is not present in the cell. Therefore, In other respects, The present invention Recipient mammal eg primate example For example, to induce tolerance to graft cells from human donor animals such as minipigs in humans Lead (or Method for Enhancing Graft Cell Acceptance by Recipient Mammals) And Features of the method include: Introducing donor hematopoietic stem cells into the recipient, And Introducing the donor graft cells into the recipient, However, Meet at least one of the following conditions: (1) Genetic engineering of donor stem cells And Desirable interaction between donor stem cells and recipient cells or molecules Promotes; (2) Genetically engineering the donor stem cells, The cells of the recipient Blocks unwanted interactions between molecules and donor stem cells; (3) Donor The transplant cells are genetically engineered, Donor graft (and / or stem) cells and recipes Promote the desired interaction with the cell or molecule of the ent; (4) Donor transplant One cell is genetically engineered, The recipient cells or molecules and the donor graft (and And / or stem) cells. In a preferred embodiment, If the genetic engineering change in (1) or (2) Insertion of MHC gene, such as porcine MHC, Donor MHC gene, Recipient MH C gene, If the insertion is a non-primate MHC gene or a non-human MHC gene, Donor cells or hematopoietic stem cells genetically altered by other than insertion of the MHC gene One or both of the other genetically altered cells are also introduced into the recipient. In a preferred embodiment, If the MHC gene, such as porcine MHC, Donor MHC inheritance Child, Recipient MHC gene, Non-primate MHC genes, Or non-human MHC inheritance If cells having a transgene that is a child are administered to the recipient, MHC Genes such as porcine MHC, Donor MHC gene, Or recipient MHC gene , Non-primate MHC genes, Or has a transgene other than the non-human MHC gene The second cell is also Administered to the recipient. In a preferred embodiment, Genetically engineered Including transgene Good; Donor stem cells Genetically engineered changes, such as for donor graft cells Has no transgene; Donor graft cells Changes due to genetic engineering Having a transgene not found in the donor stem cells; Donor stem cells The first genetic engineering Changes, e.g., increase the interaction between stem cells and recipient molecules or cells Having a first transgene to cause And the donor graft cells are Changes between the donor graft cells and the recipient molecules or cells. Has a second transgene that reduces interaction. In a preferred embodiment, Donor stem cells Graft support proteins such as hematopoietic peptides Including a transgene that encodes Donor graft cells are used as donor stem cell Does not include Gene. In another preferred embodiment, Donor graft cells Gene production that is graft-antagonistic Genes that are receptors for a recipient protein, such as a graft antagonist Including a transgene that blocks the action of progeny products, Donor stem cells are Not included. In yet another preferred embodiment, Donor stem cells Graft support protein, eg human Receptors for growth factors or cytokines, such as growth factors or Include transgenes that encode cytokine receptors. Growth factor or Examples of cytokine receptors include G-CSF, SCF, GM-CSF, IL -3, IL-6, IL-11, IL-2, Receptors for Epo and Uteroferrin Is included. In yet another preferred embodiment, Donor stem cells Graft support protein, eg human Encoding adhesion molecules involved in the implantation and / or maintenance of hematopoietic cells Including transgenes. Examples of human adhesion molecules include VLA-4, c-kit, LFA-1, CD11a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95 , CD11c, CD49a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 and And CD34. In yet another preferred embodiment, Donor stem cells, Donor graft cells, Or these Both are Recipient or donor protein, Initiated by donor cells The immune response to the recipient (eg, Of the activity level of the second cytokine Cytokines that block either directly or indirectly (by stimulation or blocking), such as IL-10 , IL-4, Includes transgenes encoding IL-2 or TGF-β. In yet another preferred embodiment, Donor stem cells, Donor graft cells, Or these Both are Graft support protein Donor initiated by recipient cells An immune response to a tissue (eg, Stimulation of the activity level of the second cytokine or Direct or indirect blocking of the recipient or donor cytochemistry For example, IL-10, IL-4, Trans encoding IL-2 or TGF-β Including Gene. In yet another preferred embodiment, Donor stem cells, Donor graft cells, Or these Both are Transgenes that block the expression or action of gene products that are graft antagonistic Including Trans blocking expression or action of a gene product that is graft antagonistic Gene's example: Expression or action of the graft antagonistic protein from the recipient Antisense RNA that blocks directly or indirectly, such as a protein from the recipient Block expression of the donor-encoded receptor for That Encoding an antisense RNA (which blocks the expression of the protein from the recipient) Lance Gene; By mutation of the gene encoding the donor graft support protein An inactivated copy, Inserted into the donor genome, for example by homologous recombination A transgene that, when performed, results in an endogenous gene. Misexpression Or For example, Endogenous gene encoding the gene encoding donor graft antagonistic protein Mutation into nom copy (eg, Deletion), Mutation Activated (for example, Transgene insertion With graft antagonistic protein Knock a donor-derived receptor for a recipient-derived protein Produces an out) Of graft antagonistic protein from a donor or recipient Inhibitors, such as competitive inhibitors or proteases or other graft antagonists A transgene encoding a molecule that specifically blocks the activity of the protein; And transplant Donor cell receptors for gene products that are hemi-antagonistic, such as host cytokines And transgenes encoding dominant negative mutations in In yet another preferred embodiment, Transgene Genes that are graft antagonistic Expression or action of the product, For example, by reducing expression of the gene product You. For example, Transgene Donor graft antagonist protein, eg, donor cells B-7 receptor, CD27 receptor or LFA-3 receptor or accommodation By mutation of the gene encoding the donor receptor for the main cytokine An inactivated copy, Inserted into the donor genome, for example by homologous recombination When introduced, it produces an endogenous gene. The endogenous gene is Misexpression Or For example, B-7 receptor on donor cells, CD27 receptor or Gene encoding donor receptor for LFA-3 or host cytokine Mutation into the endogenous genomic copy of The deletion) Sudden change It has been inactivated by an error. Transgene Expression or action of the graft antagonistic protein from the recipient Antisense RNA that blocks directly or indirectly, eg, B-7 encoded by the donor Receptor, CD27 receptor or LFA-3 receptor or host site Encodes antisense RNA that blocks donor receptor expression for Cain It may be. Transgene For gene products that are graft-antagonistic, such as host cytokines A donor cell receptor or a donor B-7 receptor, CD27 receptor Encoding a dominant negative mutation in the LFA-3 or LFA-3 receptor It may be. In yet another preferred embodiment, Donor stem cells, Donor graft, Or both of these Person, Encodes a chimeric molecule such as a chimeric lymphokine such as PIXY123 Including transgene. In yet another preferred embodiment, The donor mammal and the recipient mammal are: Different species, For example, They are, Unmatched primates, such as human recipients and And non-human donors; The recipient is a primate, for example a human; Donor is a pig An example is a miniature pig. In yet another preferred embodiment, The donor mammal and the recipient mammal are: Of the same species, For example, Both are A primate, for example a human; Recipient and de Gnar is of the same species, Donor stem cells are, for example, retroviruses of cultured donor stem cells. Including the transgene introduced by the transformation, Donor transplant One cell does not contain a transgene. In yet another preferred embodiment, Stem cell donors and transplant donors With both Is also a mini pig, Stem cell donors Genes to express graft support proteins From an engineered strain; Graft donors Antagonistic to graft acceptance or function Strains that have been genetically engineered to have reduced expression for a protein R; The graft donor and the stem cell donor Are inbreds; Graft donor and stem The cell donor is the same MHC. In yet another preferred embodiment, Transgene Pig promoters Hematopoietic gene promoter; Viral promoter; Or inducible or departure Operable on non-natural promoters, including bioregulated promoters And nucleic acids that are operably linked. In yet another preferred embodiment, The genetically engineered porcine stem cells Examples of cultured cells Isolated or derived from a primary culture, eg, a primary culture of hematopoietic stem cells; Trance Isolated or derived from a transgenic animal; Isolated or derived from cord blood; Graft cells are obtained from the individual animal from which they are obtained; Individual animals from which graft cells are obtained Obtained from an individual animal syngeneic with Individual animals and MHC from which graft cells are obtained Obtained from individual animals that are matched and preferably identical; Cord blood, Bone marrow hematopoietic stem cells Or a fetal or neonatal liver or spleen cell hematopoietic stem cell. In a preferred embodiment, Donor graft cells Other than hematopoietic stem cells or other blood cells Of; Donor graft cells Porcine thymic cells, such as porcine thymic stromal cells R; Donor graft cells Bone marrow stromal cells; Donor graft cells Donor transfer The explant cells Porcine liver cells; Donor graft cells Porcine kidney cells; Donor graft cells Porcine epithelial cells; Donor graft cells Pig muscle cells For example, heart cells; Donor graft cells Porcine neuron cells; Transplant One cell is Organs such as kidneys, Including the liver or heart; Donor graft cells Dendritic Vesicles or their precursors. Other preferred embodiments include: To the recipient Donor species-specific stromal tissue, preferably Introducing hematopoietic stromal tissue, such as fetal liver or thymus. Preferred examples At Stromal tissue, It is introduced at the same time as or before the hematopoietic stem cells. Suitable In a specific example, Stromal tissue, Genetic engineering, Stromal cells and recipients Promotes a desired interaction between the cell or molecule of the protein; Genetic engineering, recipe Prevents unwanted interactions between cells or molecules of the ent and stromal cells. Other preferred embodiments include: Transgenic before or simultaneously with graft cell transplantation Administering stem cells to the recipient; Hematopoietic stem cells in the recipient Towards the rank; Stem cells are administered by intravenous injection. Other preferred embodiments include: Natural killer cells of the recipient mammal, example Binds to the recipient mammal's natural killer cells Inactivating by introducing a potential antibody; The recipient mammal T cells For example, the recipient may bind to the recipient's T cells Inactivating by introducing an antibody (preferably, Before administration of stem cells) included. Other preferred embodiments include: For example, A low dose whole body irradiation of about 100 to 400 rads Irradiating the pient, Administration of myelosuppressive drugs to the recipient Create a hematopoietic space by one or more of depleting or partially depleting bone marrow Steps included; This method Including and creating a hematopoietic space. The transfer is performed before the transgenic cells are introduced into the recipient. Other preferred embodiments include: Using a recipient mammal with about 700 rads of thymic irradiation Irradiating; One dose, preferably two or more doses of the anti-T cell antibody may be administered. When; Or US Patent Application No. 08/22, filed March 29, 1994 with the recipient. 0, By administering one or more short-term immunosuppressive drugs as described in US Pat. (Preferably Inactivating thymic T cells (prior to hematopoietic stem cell transplantation) You. Other preferred embodiments include: Natural antibodies in the blood of the recipient mammal, For example Organs obtained from pigs (for example, Blood perfusion of the liver or kidneys or Administration of an activating or depleting drug such as deoxyspagarin (DSG) Depleting or otherwise inactivating by performing This method Depletes or otherwise inactivates natural antibodies in the recipient's blood Including the step of sexualizing and performing the step prior to hematopoietic stem cell transplantation. For example, cultured cells or transgenic cells transformed with a retrovirus Transgenic pig cells of the invention derived from For heterogeneous environments Can be used in any method that directs the inoculation of porcine hematopoietic cells in the cell. For example, The cells of this invention Can be combined with the following methods: Cyclospo Short-term administration of phosphorus or similar agents induces graft tolerance or How to promote acceptance, For example, U.S. patent application Ser. 08/220, 371; Using transplantation of xenogeneic thymus graft How to induce tolerance, For example, U.S. Patent No. 08 filed December 7, 1993 / 163, No. 912; Tolerance-promoting or GVHD-blocking cytokine Increases the level of activity of the cytokine or inhibits the tolerance or enhances GVHD How to reduce the level of activity, For example, U.S. patent application filed on August 30, 1993 No. 08/114, No. 072; Tolerance using umbilical cord blood cells How to guide the For example, U.S. Patent No. 08 / filed November 10, 1993 150, No. 739; US Patent Application filed on September 23, 1993 Application No. 08/126, No. 122 method; And filed on February 14, 1994 Induces tolerance as disclosed in PCT / US94 / 01616 of Sykes and Sachs Way. In other respects, The present invention Heterologous recipients with donor porcine hematopoietic stem cells Promote the transplantation and / or regrowth of, for example, primates, e.g. human bone marrow, Thereby, It is characterized by a method of inducing mixed chimerism in the heterogeneous recipient. This one The law is Desired interaction between donor stem cells and recipient cells or molecules Between the recipient and donor stem cells that have been genetically engineered to facilitate Porcine cells that have been genetically engineered to block unwanted interactions between May be blood stem cells, May not be)); And genetic engineering office Transplanting the treated porcine cells into a recipient, However, Genetic engineering If the cells are not porcine hematopoietic stem cells, Pig hematopoietic stem cells are also transferred to the recipient. To plant. In a preferred embodiment, This genetic engineering modification MHC gene such as pig MHC gene, Donor MHC gene, Recipient MHC gene, Non-primate MH Other than insertion of the C gene or non-human MHC gene. In a preferred embodiment, Genetically engineered Including transgene Say. In another preferred embodiment, Pig cells that have been genetically engineered Graft support protein For example, human growth factors or cytokine receptors such as those involved in the regulation of hematopoiesis Includes transgenes encoding long factor or cytokine receptors. Growth factor Examples of offspring or cytokine receptors include: G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, IL-2, For Epo and Uteroferrin Receptors. In yet another preferred embodiment, Pig cells that have been genetically engineered Graft support protein White matter, eg, human adhesion molecules, eg, contacts involved in the implantation and / or maintenance of hematopoietic cells. Includes a transgene encoding the landing molecule Examples of human adhesion molecules include VLA- 4, c-kit, LFA-1, CD11a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD49a, LPAM-1, CD49d, CD 44, CD38 and CD34 are included. In yet another preferred embodiment, Pig cells that have been genetically engineered Graft antagonism And transgenes that block the expression or action of a gene product that is Graft antagonist Examples of transgenes that block the expression or action of a sex gene product include: recipe An antagonist that directly or indirectly blocks the expression or action of a graft antagonistic protein from an ent. Chisense RNA, eg, encoded by a donor for a protein from the recipient Block the expression of the receptor (so that The effect of the protein from the recipient A transgene encoding an antisense RNA; Donor graft antagonism A copy inactivated by a mutation in the gene encoding the sex protein, For example, an endogenous gene may be generated when inserted into the donor genome by homologous recombination. Transgene: the endogenous gene is Misexpressed or Donor graft antagonism Mutations into the endogenous genomic copy of the gene encoding the protein (eg, Deletion ), Is inactivated by mutation (eg, Transge Insertion of the Donor-based for recipient-derived proteins that are graft-antagonistic Knockout for the original receptor); Donor or Recipe Inhibitors of graft antagonistic proteins derived from the same, such as competitive inhibitors or pro- Encodes a molecule that specifically blocks the activity of the proteases or other graft antagonistic proteins Transgene; And gene products that are graft antagonistic, such as host cytokines Encoding a dominant negative mutation in the donor cell receptor for Contains Gene. In yet another preferred embodiment, Pig cells that have been genetically engineered Graft antagonism The effect of the gene product For example, a transcript that blocks by reducing its expression Including Gene. For example, Transgene Donor graft antagonistic protein e.g. B-7 receptor on donor cells, CD27 receptor or LFA-3 receptor Of the gene encoding the donor receptor for the host or host cytokine A copy inactivated by the mutation, For example, by donor homogenization by homologous recombination The endogenous gene when inserted into a gene. Misexpressed or Donor B-7 receptor, CD27 receptor or L Encodes a FA-3 receptor or a donor receptor for a host cytokine Mutation into the endogenous genomic copy of the gene (eg, Deletion) , Inactivated by mutation. Transgene Expression or action of the graft antagonistic protein from the recipient Antisense RNA that blocks directly or indirectly, eg, B-7 encoded by the donor Receptor, CD27 receptor or LFA-3 receptor or host site Encodes antisense RNA that blocks donor receptor expression for Cain It may be. Transgene For gene products that are graft-antagonistic, such as host cytokines A donor cell receptor or donor B-7 receptor for CD27 receptor Or encodes a dominant negative mutation in the LFA-3 receptor May be. In yet another preferred embodiment, The genetically engineered pig cells Recipe En Or donor protein, Immune response initiated by donor cells to the recipient Answer (for example, Directly (by stimulating or blocking the activity level of the second cytokine) Or indirectly blocking cytokines such as IL-10, IL-4 or TGF-β Includes transgene to code. In yet another preferred embodiment, The genetically engineered pig cells Graft support Proteins, such as immune responses initiated by recipient cells against donor tissue (For example, Directly or by stimulating or blocking the level of activity of the second cytokine) Indirectly blocking recipient or donor cytokines such as IL-10; IL -4 or a transgene encoding TGF-β. In yet another preferred embodiment, The genetically engineered pig cells Chimeric molecule For example, a transgene encoding a chimeric lymphokine such as PIXY123 Including. In yet another preferred embodiment, The genetically engineered pig cells Examples of cultured cells Isolated or derived, for example, from a primary culture, eg, a primary culture of hematopoietic stem cells; Genetic engineering The treated swine cells are Isolated or derived from a transgenic animal; If the engineered pig cells are not stem cells, Genetically engineered Porcine cells and also administered stem cells, From the same animal, (Modification of this invention Except) from animals that are syngeneic or MHC matched and preferably MHC identical Obtained from an animal that is The genetically engineered pig cells Cord blood cells, Bone marrow Hematopoietic stem cells or fetal or neonatal liver or spleen cells. In a preferred embodiment, The genetically engineered pig cells Hematopoietic stem cells or Other than other blood cells; The genetically engineered pig cells Thymocyte example Eg porcine thymic stromal cells; The genetically engineered pig cells Bone marrow stromal cells Is; The genetically engineered pig cells Porcine hepatocytes; Genetic engineering processing Porcine cells Porcine kidney cells; The genetically engineered pig cells B Epithelial cells; The genetically engineered pig cells Porcine muscle cells eg heart Cells; The genetically engineered pig cells Porcine neuron cells; Remains Genetically engineered pig cells Pig dendritic cells or their precursors. Other preferred embodiments include: (Preferably, (Before administering stem cells) Natural killer cells of dairy animals For example, the recipient mammal Inactivated by introducing antibodies that can bind to Pient's natural killer cells Sexualizing; T cells of the recipient mammal are For example, the recipient Inactivated by introducing an antibody capable of binding to T cells of the recipient. And are included. Other preferred embodiments include: For example, A low dose of about 100-400 rads Irradiating the Scipient, Administration of myelosuppressive drugs to recipients One or more of administering a ras I antibody to a recipient Creating a hematopoietic space by depleting or partially depleting the bone marrow Re; This method Including the step of creating a hematopoietic space and the step Performed before introduction of the transgenic cells into the recipient. Other preferred embodiments include: (Preferably, Before hematopoietic stem cell transplantation) Recipient feeding Irradiating the animal with, for example, about 700 rads of thymic irradiation; 1 dose of anti-T cell antibody preferred Or two or more doses; Or a US patent filed March 29, 1994 Request 08/220, 371 to the recipient for a short period of time. Inactivating thymic T cells by one or more of providing. Other preferred embodiments include: For example, organs obtained from pigs such as liver or kidney Agents that perfuse or inactivate or deplete natural antibodies such as deoxy By administering spagarin (DSG), In the blood of the recipient mammal Depleting or inactivating the native antibody; This method recipe Depleting or inactivating natural antibodies in the blood of the ent and comprising The steps are performed before hematopoietic stem cell transplantation. In a preferred embodiment, This method Graft from donor (hematopoietic stem cells and A different organ (eg, obtained from the liver or kidney) into the recipient Including Tep. In general, The genetically engineered pig cells of the present invention Methods known to those skilled in the art For example, it can be produced by retroviral transduction of pig cells. The method for producing a transgenic pig of the present invention comprises: Standard transgenic techniques Use techniques. These methods include: For example, zygote or biological retrovirus Infection by viruses, including: Viral infection of a tissue and subsequent transmission of that tissue to an animal Reintroduction; And introduction of recombinant nucleic acids into embryonic stem cells of animals and Transgenic animals by appropriate manipulation of the vesicles. Especially, This departure Ming is Germ cells and somatic cells, DNA sequence encoding hematopoietic peptide and its D Transgene containing a tissue-specific promoter operably linked to an NA sequence Featuring transgenic pigs containing The tissue-specific promoter So Achieving expression of the hematopoietic peptide in bone marrow cells of pigs, This transgy Is It is introduced into fetal cells of the animal or its ancestor. Yet another aspect of the invention is that Drugs, eg, therapeutic agents, eg, in the treatment of hematopoietic disorders Useful drugs, The effect of the drug on the transgenic pig of this invention was evaluated. It features a method of identifying or testing by evaluating. Specific examples for explanation At Administering the drug to the transgenic pig, Hematopoietic tissue status (metabolic side) Or aspects of gene expression) and controls (eg, Control transge Nick animal). Using this method, For example, Human hematopoietic growth factors In vivo efficacy of offspring agonists or antagonists can be measured You. A similar experiment, It can be performed using cultured cells. Hematopoietic stem cells from a heterologous donor When planted in a heterogeneous recipient, Transplant Be able to induce a state of donor-specific tolerance to isolated donor organs It is shown. Even low-level hematopoietic chimerism, Induces this tolerance state May be sufficient. However, Loss of chimerism (this is often, Occurs) but Associated with a concomitant loss of tolerance. The animal of the present invention, cell, Transge Using the methods and methods The formation and maintenance of chimerism can be promoted. This The transgene of the invention, Transgenic cells, Transgenic animals and The method is also Drug testing protocols such as interaction with human receptors or adhesion molecules Protocols for identifying drugs to be used, such as human growth factors or adhesion molecules Protocol to identify drugs that act as Useful. The transgene of the present invention, Transgenic cells, Transge Genetic animals and methods also Between human receptor or adhesion molecule and porcine ligand It is also useful to determine the species specificity of the interaction between them. Other features and advantages of the invention include: It will be apparent from the following detailed description and the appended claims. Let's be.Detailed description of the invention First, the drawings will be briefly described.Drawing FIG. 1 is a diagram of the GS4.5 retroviral construct. FIG. 2 is a diagram of the GS4.5 provirus genome and predicted transcripts. It is. Figures 3a and 3b show flow cytometry profiles of transduced cells. It is a display of Phil. FIG. 4 is a diagram of a transduction assay.I. Regrowth of xenogeneic bone marrow Embodiments of this invention include genetically engineered porcine cells, such as recombinant peptide examples. For example, it involves genetically engineered hematopoietic stem cells that express human peptides. these Peptides are useful for the survival, inoculation, growth or function of porcine cells transplanted into a heterologous host. Promote one. In a typical embodiment, the human hematopoietic tissue, e.g. In the presence of a hematopoietic environment, the survival, inoculation, proliferation or function of stem cells, or the Development into differentiated cell types is promoted. These treated cells are, for example, human It can express long factor receptors, such as human growth factors involved in the regulation of hematopoiesis. Wear. Examples of human growth factor receptors include G-CSF, SCF, GM-CSF, Against IL-3, IL-6, IL-IL IL-2, Epo and Uteroferrin Receptors. In another exemplary embodiment, these treated cells Express human adhesion molecules involved in hematopoietic cell implantation and / or maintenance. Heel Examples of such molecules include VLA-4, c-kit, LFA-1, CD11a, and Mac- 1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD49a, LPA M-LCD49d, CD44, CD38 and CD34 are included. Competitive repopulation of mismatched bone marrow transplants is a consequence of hematopoietic cells of xenogeneic individuals, When transplanted as part of a conservative regimen, there is no competitive advantage for reconstitution of a heterologous host. Showed that it could be a benefit. That is, if host stem cells are available, These host cells generally have a competitive advantage in reconstituting the host. This competition The competitive advantage is a major factor in preventing reconstitution by implanted xenogeneic hematopoietic stem cells. Can be a factor. Several factors are responsible for the ability of the transplanted It may be the source of the competitive benefits enjoyed by bone marrow. This benefit is partially Species cells have sufficient growth factors and host extracellular matrix (ECM) components It seems to come from the inability to combine. Both extracellular matrix components and growth factors regulate hematopoiesis and hematopoietic stem cells And plays an important role in the maintenance of both differentiated hematopoietic cells and It is important for the survival of an individual's cells. Stem cell maintenance can be, for example, growth factor binding and Requires short-range interaction with surrounding cells, such as stromal cells, for implantation. I However, ECM interactions and growth factor binding by hematopoietic cells are at least partially In some cases, transplanted bone marrow can be species-dependent and Compared to autologous bone marrow, at least in mitogenic stimulation or implantation At competitive disadvantage. For example, adhesion molecule interactions (VLA-4, c-kit, L FA-1, CD11a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD49a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 or Species specificity, such as those mediated by CD34, are considered important in hematopoiesis. available. Failure of such adhesion molecules to interact with ligands from the host species is It can be a major obstacle to homing and reconstitution by individual stem cells. Likewise Some growth factors, such as hematopoietic growth factors, are involved in their receptor interactions. It is known to exhibit varying degrees of species specificity. For example, G-CSF is Shows significant (but not absolute) species specificity. For example, IL-3 is It has very remarkable species characteristics. In an illustrative embodiment, which is described in more detail below, the human c-kit receptor (Hereinafter referred to as “c-kit”), the ligand of SCF is treated in porcine stem cells. You. Stem cells with human c-kit are effective with human SCF bound to stromal cells And human SCF is capable of interacting with this recombinant porcine stem cell. An implant that is enjoyed by human bone marrow because it can act as a growth factor Some of the competitive advantages over reduced porcine stem cells will be lost. Therefore, Use of c-kit humanized porcine cells improves human patients with porcine stem cells Facilitated reconstruction. A similar approach is to use human hematopoietic growth factor For sceptors such as IL-3 receptor and GM-CSF receptor; Can be used for human adhesion molecules involved in hematopoiesis; Interacts effectively with human ligands. Therefore, one aspect of the present invention is Thus, the subject "humanized" porcine cells can be used in xenograft protocols. it can. Improved ability to respond to human factors that regulate hematopoietic cells (wild-type Using these humanized cells for porcine hematopoietic stem cells Implantation and / or survival of plants, thereby promoting tolerance in human patients Can be Preferred embodiments of the present invention include, for example, recombinant nucleic acid molecules of the invention. A transgenic mammal having at least one cell comprising and expressing Produces a human hematopoietic peptide when used as a source of xenograft tissue. By providing porcine cells that express the cells, select for growth compared to the corresponding wild-type cells. Included are methods for conferring an alternative advantage on transgenic cells. This recombinant nucleic acid The transgenic mammal containing the molecule is constructed using the structure present in the recombinant nucleic acid molecule. Maintain the blood modulator gene long enough to be expressed in its cells And thereby the transgenic cells when transplanted into another species Provides a selective advantage (compared to the corresponding wild-type cells). On the other side And these recombinant porcine cells, especially transgenic cells having such cells. Is useful for assaying the efficacy of recombinant human hematopoietic factors. As used herein, a graft support protein is a protein having one or more of the following properties: Refers to the acceptance of that cell in a xenogeneic donor when expressed in a porcine cell Prolongs or promotes; when expressed in porcine cells, other Prolongs or enhances the acceptance of human cells; heterologous donors when expressed in porcine cells Enhances or enhances the function of the porcine cell in the cell; In so doing, it increases or promotes the function of other porcine cells in the xenogeneic donor. Graft The supporting protein may be used for transplantation of the cells on which it acts or for transplantation of the tissue in a heterologous host. Or later or both. Graft support protein Before or after the cells or tissues on which it has acted are transplanted into the xenogeneic recipient Or its effect on porcine cells or tissues in both. it can. For example, the graft support protein is expressed in cultured cells, and then the graft support Cultured cells expressing the carrier protein (alone or with other porcine tissues) Can be transplanted; expresses graft support protein in transgenic pigs Cells expressing the graft support protein from the transgenic pig Can be transplanted into donors (alone or with other porcine tissues). ｛Act Cells or tissues can be directly or (through action on other cells) C) cells or tissues that have an indirect effect; Can be a cell or tissue that expresses a support protein, or expresses a graft support protein Cells that are not transplanted, such as cells or tissues that have been transplanted with May be.例 Examples of graft support proteins include recipient HLA molecules; Growth factor receptor; recipient adhesion molecule; and function for grafts Recipient or donor proteins. Hematopoiesis for graft support proteins Contains proteins. As used herein, a graft antagonistic protein may be used by graft tissue or the recipient. A protein whose expression promotes an immune response to a donor tissue or recipient Or is antagonistic to the function of stem cells, or Is a protein that is antagonistic to donor stem cell or graft acceptance by Graft Examples of antagonistic proteins are those against host proteins that mediate an immune response to donor cells. Donor cell surface receptors, such as B7, CD27 or L It is a donor receptor for FA-3 receptor or host cytokine. As used herein, the term “transgene” refers to (eg, one or more hematopoietic markers). Means a nucleic acid sequence (encoding a peptide), which is the transgene into which it is introduced. Partially or completely heterogeneous to the transgenic animal or cell, ie, exogenous. Or the endogenous gene of the transgenic pig or cell into which it is introduced Is homologous to the animal but alters the genome of the cell into which it is inserted. Designed or inserted in such a way that It may be inserted at a position different from that in the native gene or the insertion may be Results in a workout). The transgene comprises one or more transcription regulatory sequences and a selected Including any other nucleic acids that may be necessary for optimal expression of the nucleic acids, such as introns (All are operably linked to the selected nucleic acid, and Column). As used herein, the term “transgenic cell” includes transgenes. Cell. As used herein, a “transgenic animal” is one of the cells of the animal As described above, preferably all animals are any animals containing a transgene. Transge A gene is engineered for delivery to the precursor of the cell, such as microinjection. Introduced directly or indirectly into cells by infection with a recombinant or recombinant virus. It is. The term genetic manipulation does not include classical cross breeding or in vitro fertilization, Refers to the introduction of a recombinant DNA molecule. This molecule integrates into the chromosome Or it may be extrachromosomally replicating DNA. Listed here In transgenic animals, the transgene is transformed into cells by recombinant peptidic (Eg, a recombinant hematopoietic peptide such as a human growth factor involved in the regulation of hematopoiesis or Cytokine receptors such as G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3 , IL-6, IL-11, IL-2, Epo or Uteroferrin, or hematopoiesis Human adhesion molecules involved in cell implantation and / or maintenance, eg, VLA-4, ck it, LFA-1, CD11a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD49a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD 38 or the receptor for CD34) (wild-type non- In transgenic animals, cells that do not express such hematopoietic peptides In the cell). One or more transgenes encoding one or more human hematopoietic peptides Transgenic pigs that contain the gene are within the scope of this invention. For example, two Or generating a double or triple transgenic animal containing three transgenes. Can be As used herein, the term "germline transgenic animal" refers to a transgenic animal. The genetic information of the gene is present in the germline, and is therefore transmitted to offspring. Refers to a transgenic animal that has been given the ability to If such descendants actually If they have some or all of that information, they are also transgenic animals. It is. The term "hematopoietic gene" as used herein refers to its gene product, preferably human. When the gene product is expressed by porcine hematopoietic cells, it competes with primates, e.g. Any gene that can increase the ability of porcine hematopoietic stem cells to reconstitute the host You. For example, human gene products can enhance the growth potential of recombinant porcine cells in human patients. Increase the ability of porcine cells to bind extracellular matrix components Or increase the functional activity of porcine bone marrow cells. In a preferred embodiment, the human hematopoietic gene is a cell surface protein; Scepters such as G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL -11, IL-2, Epo; or uteroferrin, or hematopoietic cell transplantation and And / or human adhesion molecules involved in maintenance, such as VLA-4, c-kit, LFA- 1, CD11a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD1 1c, CD49a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 or C Encodes a receptor for D34. The human hematopoietic gene product can be found here In the "human hematopoietic protein or peptide (the term protein, peptide and polypeptide) Are used interchangeably in this sense) and are referred to as human hematopoietic growth factors. Child receptors and human hematopoietic adhesion molecules. The term "growth factor" or "hematopoietic growth factor" "Pups" can, for example, stimulate the growth of recombinant porcine cells, promote binding to ECM components and Describe biologically active molecules that can increase the functional activity of cells Used to The term "cytokine" is used interchangeably with growth factor. Construction Examples of blood growth factors include G-CSF, SCF, GM-CSF, Includes IL-3, IL-6, IL-11, IL-2, Epo and Uteroferrin It is. “Growth factor receptors” are produced by cells, typically on the extracellular surface. A protein that promotes the binding of growth factors by its cells and Together with other cellular proteins to enhance the biological response in the cell to growth factor binding. Induced protein. Hematopoietic genes include hybrid proteins such as human and Peptides encoding both components, such as the human extracellular domain and the porcine intracellular domain. Or those encoding a hybrid receptor with a transmembrane domain It is. Hematopoietic proteins are proteins encoded by hematopoietic genes. As used herein, the term "operably linked" refers to a selected DNA, e.g. The DNA encoding the blood peptide is a transcription regulatory sequence, such as a tissue-specific promoter. Nearby, allowing the regulatory sequence to regulate the expression of the selected DNA. Means that The term "genetically programmed" as used herein refers to the DNA, R, Permanently changing NA or protein content. Typically, this genetic Programming introduces recombinant nucleic acid molecules encoding hematopoietic peptides into porcine cells Achieved by doing As used herein, the term “recombinant porcine cell” refers to a recombinant vector or other tiger. Transfected or used as a recipient for transfer nucleic acids. Derived from a pig, preferably a mini-pig, containing the transformed progeny of the original cell Cell In a preferred embodiment, the recombinant porcine cell is a porcine hematopoietic stem cell example. For example, derived from porcine bone marrow hematopoietic cells and inherited to express a recombinant human peptide Programmed. Recombinant porcine cells contain a transgene or other nucleic acid vector. Cells that have been integrated into the host cell genome and autonomy from the host cell genome And a cell having an expression vector maintaining the expression vector. As used herein, the term "transfection" refers to a nucleic acid, such as an expression vector. Transfection into recipient cells by nucleic acid-mediated gene transfer I do. “Transformation” as used herein refers to exogenous DNA or The process by which a cell's genotype changes as a result of RNA uptake by the cell For example, transformed porcine cells express human cell surface peptides You. As used herein, the term "vector" transports another nucleic acid to which it has been linked. Refers to nucleic acid molecules that can be One type of preferred vector is an episome or stain. It is a nucleic acid that can replicate outside the chromosome. Preferred vectors are capable of autonomous replication and / or replication. Can express a nucleic acid to which they are bound. Here it is operably coupled A vector that can direct the expression of a gene that has been expressed is referred to as an “expression vector”. Reach. "Transcriptional regulatory sequences" are those such as initiation signals, enhancers and promoters. Induce or regulate the transcription of an operably linked protein coding sequence A generic term used herein to refer to a DNA sequence. Preferred concrete In some examples, transcription of the recombinant hematopoietic gene is responsible for the expression of the recombinant gene in humans. Control the expression of the corresponding gene in porcine cells. Under the control of a promoter sequence (or other transcription regulatory sequence) that it controls. Even better In a preferred embodiment, the transcriptional regulatory sequence causes a hematopoietic-specific expression of the recombinant protein. Rub Although not contrary to the above specific examples, the recombinant gene regulates the transcription of the recombinant protein. It may also be under the control of transcriptional regulatory sequences that are different from the sequences that are naturally controlled. Will be understood. Transcription of the recombinant gene can be performed, for example, by controlling a synthetic promoter sequence. May be below. Preferably, a promoter sequence that controls transcription of the recombinant gene Is active in bone marrow cells, especially hematopoietic cells (ie, Can be). Promoters that regulate the transcription of recombinant genes are of viral origin Examples are sometimes bovine herpes virus (BHV), Moloney Mouse leukemia virus (MLV), SV40, swine vesicle virus (SVDV) And a promoter derived from cytomegalo. As used herein, the term “tissue specific promoter” refers to a promoter Works, ie, expresses a selected DNA sequence operably linked to its promoter DNA sequence that regulates and is selected in specific cells such as hematopoietic cells A DNA sequence that achieves expression of the DNA sequence. This tissue-specific promoter -Indicates dominant expression if not exclusively in hematopoietic cells. Human Promoter sequences that are particularly useful for directing hematopoietic gene expression include those naturally occurring. A promoter sequence linked to the recombinant human gene; a homologous porcine gene (ie, A promoter sequence naturally linked to a gene corresponding to a recombinant human gene); Activated in hematopoietic cells such as lymphoid cells, erythroid cells or myeloid cells (1983) Nature 306: 332-336 and Storb et al. (198 4) Immunoglobulin promoter described by Nature 310: 238-231; Ruscon et al. (1985) Nature 314: 330-334 and Grosscheld et al. (1984) Cell 38: 647-658 (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1977-198. 3 and Magram et al. (1989) Mol. Cell. Biol 9: 4581-4584. Motor is included. Other hematopoietic promoters are described here or here. It will be apparent to those skilled in the art that lymphoid genes such as CDLCD2, CD3-γ, C D3-δ, CD3-ε, CD3-ζ, CD3-η, CD4, CD5, CD7, C D8, CD19, CD20, CD38, CD40, CD45, CD72, CD7 6, p56^lck, IL-3Rβ chain, J11d (thermostable antigen), fyn, NK1 , NK2, Fc, RIγ chain, IL-2Rβ-chain, αTCAR, βTCAR, γT CAR, δTCAR, FcYRIII, RAG-1, RAG-2, Ig-β (B 29) or IgM-a (MB-1) and immunoglobulin isoforms Igμ, Igδ, Igγ, Igα, Igε; a control derived from genes related to Igk and Igλ. Includes a knot array. Moreover, such promoters may also provide additional DNA necessary for expression. Sequences such as intron and enhancer sequences may also be included. This term is It also regulates the expression of the selected DNA primarily in the primary tissue, but also in other tissues. It also covers so-called "leaky" promoters that cause expression. Other adjustment elements For example, it may include a locus control region, such as a DNase I hypersensitive site. “Cell-specific expression” refers to the activity of a transcriptional regulatory element on a particular cell type, such as bone marrow cells. To direct the expression of the recombinant protein. Therefore, the term "hematopoietic specific development "Current" refers to the expression of a recombinant protein substantially restricted to hematopoietic cells. "Graft" as used herein refers to a body part, organ, tissue or cell. Grafts can be organs such as liver, kidney, heart or lung; parts of the body such as bone or skeletal A tissue; for example, skin, intestine, endocrine glands; or various types of ancestral stem cells. May be. The term "tissue" as used herein means any biological material that can be implanted. , Organs (especially living organs such as heart, lung, liver, kidney, pancreas and thyroid), horns Membranes, skin, blood vessels and other connective tissues, blood cells and hematopoietic cells, islets of Langerhans, Includes cells, including brain cells and cells from endocrine glands and other organs and fluids. All of them can be candidates for transplantation). "Discrepant species combination", as used herein, refers to transplanting a graft from one to the other These are two species that cause hyperacute rejection. In the subject invention, the donor It is of porcine origin and the recipient is human. "Hematopoietic stem cells" as used herein refers to cells such as bone marrow cells, fetal or neonatal cells. Progenitors that may develop in live liver or spleen cells or mature bone marrow and / or lymphoid cells Refers to cord blood cells. “Progenitor cells” as used herein refers to cells that give rise to differentiated progeny. In contrast to stem cells, ancestral cells do not always renew themselves and have a differentiation potential Is relatively limited. As used herein, the term "hematopoietic cells" refers to megakaryocytes, monocytes, granulocytes and eosinophils. Cells derived from a bone marrow cell line, including; cells derived from an erythroid lineage, eg, red Blood cells; differentiated cells, including cells of the lymphoid cell lineage such as B lymphocytes and T lymphocytes Blood cells. As is generally understood, each of the above cell lines Through a series of differentiation steps, gradually becoming a lineage-restricted progenitor cell "pluripotency Hematopoietic stem cells ”(herein, also referred to as“ hematopoietic stem cells ”or“ colony forming stem cells ”). U) to mature. Thus, the term hematopoietic cells also gives rise to these differentiated cells. Hematopoietic progenitor cells such as BFU-E (burst forming unit-erythroid) , CFU-E (colony forming unit-erythroid), CFU-Meg (colony CFU-GM (colony forming unit-granulocyte-monocyte), CF U-Eo (colony forming unit-eosinophil) and CFU-GEMM (colony forming unit) Position-granulocytes-erythrocytes-megakaryocytes-monocytes). "Stromal tissue", as used herein, is a device that is distinguished from functional elements or parenchymal tissue. A government support organization or matrix. "Tolerance", as used herein, refers to the absence of a non-self MHC antigen Immunity of graft recipients resulting in response to introduction into the original recipient Refers to the prevention of epidemics. Tolerance is humoral, cellular or both humoral and cellular responses Can be included. Tolerance, as used herein, is a complete tolerance of the antigen. As well as partial tolerance, that is, if the method of the present invention was not used It also refers to a greater degree of tolerance to antigens than would have been seen. “MHC antigen” as used herein refers to the protein product of one or more MHC genes Refers to the term that causes an immune response in the recipient organism. Fragments or analogs of the MHC gene product. Examples of MHC antigens include human Includes products of the MHC gene or HLA gene (and fragments or analogs thereof) . MHC antigens in pigs, such as minipigs, include SLA genes, such as the DRB gene. Products (and fragments and analogs thereof). "Minipig", as used herein, refers to a fully or partially inbred animal. Say. As described herein, transgenic donor tissue was obtained from cell culture. Or from transgenic pigs. Transgenic pigs Express (or express) the recombinant human gene in at least the tissue to be transplanted Should be). In the practice of the present invention, unless otherwise indicated, techniques within the skill of the art are used. You. Such techniques are explained fully in the literature. For example, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd edition, edited by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (edited by D.N. Glover) Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, 1984); Mullis et al. Patent Application No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J.Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B.D.Hames and S.J.H) iggins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney, Alan R.Liss, Inc., 1) 987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practi cal Guide To Molecular Cloning (1984); Dissertation, Methods In Enzymology (Academ ic Press, Inc., New York); Gene Transfer Vectos For Mammalian Cells (edited by J.H.Miller and M.P.Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Edited by Mayer and Walker, Academic Press, Lond on, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volume I-IV (D.M.Weir and C.C.Blackwell ed., 1986); Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Har bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1986). In the practice or testing of the present invention, one similar or equivalent to the one described herein Although methods and materials can be used, preferred methods and materials are as follows. You. All publications mentioned herein are incorporated by reference. In addition, these materials , Methods and examples are illustrative only and are not intended to be limiting. Not in.II . Recombinant human gene Introduction of the human hematopoietic gene into the porcine cells of the present invention can Requires transfection into the vesicle or precursor of the cell. Understood The mode of transfer and the desired integration of the resulting porcine cells. Phenotype (ie, whether the vector is integrated into the cell's genome Remains) of the expression vector used to generate the subject recombinant porcine cells. Can influence choice. Generally, an expression vector containing a human hematopoietic gene is Regulatory sequences, such as tissue-specific promoters, nucleic acids encoding hematopoietic proteins, such as can be constructed by operably linking to cDNA or genomic DNA You. In addition, tissue-specific promoters each encode a different human hematopoietic protein. Or a human hematopoietic protein and certain other foreign proteins, such as other cell surface antigens. Can bind to more than one cDNA to be loaded. Specific promo used Depending on the promoter, the promoter-cDNA construct may be Modification to include a position and / or polyadenylation signal Will. 5 'and 3' expression control sequences and recombinant DNA (genomic DNA or cDNA) In addition to the origin), the transgenes of the invention may also be transcribed Also contains a "recombinant inter-been sequence" that interrupts the 5 'untranslated region be able to. Such inter-being sequences (IVS) are known to those skilled in the art. You. Such a sequence as used herein is a “homologous recombination inter-been sequence” (The 5 'and 3' RNA splice signals in this IVS are either endogenous genes or (Usually found in IVS from foreign genes). However, recombination The inter-beenning sequence also includes the `` hybrid inter-beening sequence. '' Can be rare. Such hybrid interbeaning sequences can be derived from different sources. RNA splice signal and 3 'RNA from inter-been sequence Includes splice signal. In some aspects of the invention, such a hybrid De-IVS contains at least one "permissive RNA splice sequence". here When used, permissive RNA splice signals undergo rearrangement during cell differentiation RNA splicing from introns contained in germline DNA fragment repertoire Signal sequence (preferably, 3 'RNA splice signal). Such heredity Examples of offspring repertoire include immunoglobulins, including immunoglobulins and T cell antigen repertoires Phosphorus supergene family and major histocompatibility complex (MHC) genes Other repertoires are included. Particularly suitable permissive splice sequences are immunoglobulin Derived from a nonrepertoire (preferably of the IgG class), and more preferably Alternatively, the JC segment rearrangement of Ig heavy and light chains (most preferably heavy chains) Related 3 'splice signal sequence. Permissive RNA splice signal The hybrid inter-beenning sequence containing It is preferably used when corresponding. Based on the above, preferred transgenes have relatively large numbers of 5 'and 3' Obviously, sequences can be included. Further, the recombinant DNA is preferably Derived from nome clones (can be 10-100 kilobases long). DNA Based on current technology for cloning and manipulating Icroinjection has a length that is practically no greater than about 100 kb Limited to linearized DNA. However, the transgenes of the invention, especially Those longer than about 50 kb can be used to transfer two or more overlapping fragments of the desired transgene to the fetus. Can be easily produced by introducing into a target cell. When introduced , These overlapping fragments undergo homologous recombination, which is completely integrated into the genome of the target cell. This results in integration of the reconstituted transgene. Generally take Overlapping transgene fragments have 100% homology in the overlapping region Is preferred. However, low sequence homology results in efficient homologous recombination. If acceptable, it is acceptable. If there is non-homology between the homologous sequence parts, Preferably, the homology is in a discontinuous region without spreading in the homologous sequence portion. 100 As little as 14 base pairs of% homology are sufficient for homologous recombination in mammalian cells. (Rubnitz et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 2253-2258), but longer homologous sequences Portions are preferred (eg, 500 bp, more preferred for each homologous sequence portion). It is 1,000bp, suboptimal is 2,000bp, optimal is 2,000bp Longer). Using YACs and MACs to manipulate the recombinant nucleic acids of this invention It would also be desirable. In a further embodiment, the recombinant hematopoietic protein is encoded by a human hematopoietic gene. And a chimeric peptide having a portion encoded by the porcine hematopoietic gene. May be. In a preferred embodiment, the chimeric protein is an extracellular domain of human origin. Includes intracellular domains (and transmembrane domains) of in and porcine origin. Such texture La protein is an intracellular signal transduction protein of porcine cells Useful in situations where, when combined with quality, are less efficient than pig counterparts Can be for Techniques for making fusion genes are well known. Essentially, by conventional technology, Ligation of various DNA fragments encoding different polypeptide sequences is performed (see Prepare blunt or staggered ends for ligation, appropriate ends Restriction digestion, filling of sticky ends (as appropriate), to avoid unwanted ligation Alkaline phosphatase treatment and enzyme ligation). Alternatively, two consecutive fragments that can be annealed to produce a chimeric gene sequence Generate complementary overhangs between gene fragments (eg, between human and porcine genes). PCR amplification of a gene fragment using an anchor primer (For example, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., John Wil ey & Sons: 1992). Since the mid-1980s, many hematopoietic growth factor receptors have been cloned from human sources. And can be easily utilized by standard molecular biology techniques used in the present invention. (For a review, see Foxwell et al. (1992)Clin Exp Immunol 90: 161-169 Please see). In many cases, their cloned genes and natural odors The associated transcriptional regulatory sequences have also been identified and well characterized. Furthermore, In the light of the present disclosure, other suitable genes can be obtained from human sources, That the transcriptional regulatory sequence can be obtained and used with its human gene. It will be clear to those skilled in the art. In one aspect of the invention, recombinant porcine cells are derived from human c-kit. Gene or closely related tyrosine kinase receptor family to which it belongs -Other members such as colony stimulating factor I receptor (c-fms), platelets Derived growth factor receptors (PDGF-Ra and PDGF-RB) or fetal liver liver (FK-1 or FLK-2) (for a review, see Andre et al. (1. 992) Oncogene 7: 685-691). Human c-kit (Ogawa et al. (1994) Ex p Hematol 22: 45-51; Vardenbark et al. (1992) Oncogene 7: 1259-1266; Yarden et al. (198 7) EMBO J 6: 3341-3351; Blume-Jensen et al. (1991) EMBO J 10: 4121-4128), human c -Fms (Bourette et al. (1993)Blood 81: 2511-2520; Dibbs et al. (1990)GrowthFactor s 2: 301-311; Sherr (1988) Leukemia 2: 1325-1425), human PDGF-Rα and human PDGF-Rb (Matsui et al. (1989)DNAS 86: 8314-8318), and human FLK-1 And human FLK-2 (U.S. Pat. No. 5,270,458; PCT Publication WO93 / 10136; PCT Publication WO 93/00349; U.S. Patent No. 5,283,3. No. 54) and genomic clones in some cases And use them to induce the subject porcine cells as described below. An expression vector can be generated that contains a suitable transgene. In addition, nuclear receptors The promoter sequence and other transcriptional regulatory sequences for the promoter have been characterized ( Yasuda et al. (1993)Biochem Biophys Res Commun 191: 893-901; Yamamoto et al. (1993)Jpn J Cancer Res 84: 1136-1144), and disclose them in this recombinant hematopoietic gene construct. Can be used. Alternatively, the regulatory sequence adjacent to the corresponding porcine gene (genome) The rows were cloned by standard techniques and the human genes It can be used to regulate expression. In another aspect of the invention, recombinant porcine cells are treated to produce human granulocyte-macro Express phage colony stimulating factor (GM-CSF) receptor. Human GM -The CSF receptor has been cloned (Sasaki et al. (1993)J Biol Chem 26 8: 13697-13702; Sakamaki et al. (1992)EMBO J 11: 3541-3549; Hayashida et al. (1992)Nip pon Rinsho 50: 1867-1871; Metcalfe et al. (1990)PNAS 87: 4670-4674; Gearing et al. (19 89) EMBO J 8: 3667-3676; Lock et al. (1994)PNAS 91: 252-256 and Kitamura et al. (1991)P NAS 88: 5082-5086) consisting of two polypeptide chains “a-chain” and “β-chain” Which has been found to be compatible with other growth factor receptor complexes, such as IL-3. Utilized by the receptor and the IL-5 receptor. Each of these two chains Expression from the same expression vector or from separate expression vectors in the same cell. Can be made. Tiger expressing the first transgene The transgenic pig is transformed into a transgenic pig expressing the second transgene. To provide a transgenic animal expressing both. . (A third and subsequent genes can be added using a modification of this technique. You. ) Thus expressing only one transgene, the other one of the α or β chains Crossed transgenic pigs with appropriate transgenic siblings Progeny can be produced that are chimeric for strands. Or, if the α chain is a pig β chain Only the α-chain need be expressed if an active receptor complex can be formed. α The chains confer most of the binding specificity on the receptor complex and are therefore more GM- It is likely to affect species-specific binding of CSF. In a similar manner, human IL-3 receptor is added to each of the α and β chain subunits. Can be constructed in porcine hematopoietic cells using the cloned gene (Sa kamaki et al. (1992)EMBO J 11: 3541-3549; and Kitamura et al. (1991) 611661165-1174) ( To derive a suitable expression vector). Therefore, the nucleotide sequence derived from the cloning of the human hematopoietic gene (the human Encoding all or a selected portion of the protein) in human cells in porcine cells. Can be produced. Polynucleotide sequence compared to genetic construct Ligated into an expression vector and transformed or Transfection can be performed by standard techniques. The recombinant nucleic acid construct described above can be used for amplification in any suitable plasmid, Lyophage or viral vector, which allows those skilled in the art For example, Molecular Cloning A Laboatory Manual, 2nd edition, Samboro Edited by ok, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) It can be grown using the methods described. In a preferred embodiment, the eukaryote Use a cell-compatible expression vector, preferably one compatible with vertebrate cells . Eukaryotic cell expression vectors are well known in the art and several commercially available Can be. Suitable porcine expression vectors are those that promote the growth of the vector in bacteria. Prokaryotic sequences) and one or more eukaryotes that are functional in porcine cells Includes both transcription units. Typically, such vectors contain the desired recombinant DNA content. Provides convenient restriction sites for insertion of offspring. pcDNAI, pSV 2, pSVK, pMSG, pSVL, pPVV-1 / PML2d and pTDT1 (ATCC, No. 31255) is derived from porcine cell transfectants. This is a mammalian expression vector suitable for the application. Some of these vectors are Modified by sequences from bacterial plasmids such as pBR322 to produce prokaryotic and true It facilitates replication and selection of drug resistance in both nuclear cells. Or a virus example For example, bovine papilloma virus (BPV-1) or Epstein-Barr virus (PHEBo, pREP-derived and p205) derivatives It can be used for white matter expression. Plasmid preparation and host cell trans The various methods used for formation are well-known in the art. In the present invention For other suitable expression systems and general recombination procedures useful in lar Cloning A Laboratory Manuarl, 2nd edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989). Pig egg as a transgene in which the recombinant nucleic acid molecule is to be integrated into the host genome In situations where they are introduced into a mother cell, for example, one or more of the recombinant nucleic acid molecules Linearize the construct by cleavage with a restriction endonuclease of Preferably, excess vector sequences are removed to minimize the desired transcriptional regulatory sequences and Linearized nucleic acid molecules containing human hematopoietic genes can be generated. Preferably, the nucleus Acid molecules (e.g., a transgene) can range from about 5,000 base pairs to about 100,000. Base pair length. The suitability of a particular human hematopoietic protein (for example, if the human protein is more suitable than its porcine counterpart) Or not) can be measured using one of the assays described below. Alternatively, the cDNA can be measured by standard techniques. For example, this According to the invention, the promoter is linked to the cDNA encoding human c-kit. To create a vector for expression of human c-kit in pig cells. This professional Expression of the motor-hematopoietic protein transgene can be expressed, for example, in appropriate tissue culture cells. Can be confirmed by direct detection of the expression of human c-kit. Furthermore, Potentially provides improved viability of transgenic pig cells in vivo The ability of human genes to determine the relative biological activity of endogenous proteins in human and porcine cells Can be predicted in vitro by comparing Improved raw Potency is compatible with the ability of recombinant cells to grow in semi-solid media in response to human growth factors. Should be concerned. Some transgenic pigs have multiple copies of the transgene, It has copies of the transgene integrated at various sites in the genome. To the genome The site of transgene uptake can strongly influence transgene expression, Therefore, some have distinct transgene restriction fragment length polymorphism patterns Can correlate with transgene expression. In addition, as described above, two transgenic animals Porcine pigs, each with a different hematopoietic protein or a hematopoietic protein and another foreign antigen That express human MHC peptides in the same or different tissue cells) Animals expressing both transgene products can be generated. The same effect, 2 Can be achieved by introducing two separate transgenes into the same embryo cell it can. Whether a particular human hematopoietic protein is suitable for use in the method of the invention Typical in vitro assays that are useful for determining the presence of (1) ligands For example, the growth factors of the ECM component, human hematopoietic proteins on the cell surface of recombinant pig cells An assay for measuring binding to the extracellular domain; and (2) Activity of signal transduction pathway activated by interaction with gonist ligand Includes assays that test for activation. A first class of assays is, for example, A potential human hematopoietic protein that could improve the viability of xenografted porcine bone marrow was Ligands (eg, SCF, IL-3, GM-CSF) on recombinant porcine cells Useful for identifying binding constants by comparing them to native porcine cells. is there. The second class of assays is that any of the human hematopoietic proteins may be used in the present invention. Are suitable to be performed based on their ability to function in porcine cells. It is suitable forIII . Genetically engineered pig cells The transgenic pig cells of the present invention can be prepared by any method known to those of skill in the art. Can be generated. The transgene is transferred to cells such as stem cells such as cultured stem cells. The cells are at a level and for a period sufficient to facilitate the implantation or maintenance of those cells. They can then be introduced by any method that allows expression of these genes. Wear. These methods include, for example, transfection, electroporation, Bombardment and viral vectors such as retroviruses. Transductions are included. Transgenic pig cells are also transgenic It can be derived from a transgenic animal. Transgene Retrovirus Introduction Recombinant retroviruses are a preferred delivery system. They have been It has been widely developed as a vehicle for gene transfer (for example, Eglitis et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241: 19). The easiest retro ui Lus vector constructs consist of a viral structural gene replaced by a single gene. The gene is then contained in the long terminal repeat (LTR) of the virus. It is transcribed under the control of a regulatory element. Moloney mouse leukemia virus (MoM ULV) -containing single gene vector backbone variants have been used. Various heredity Offspring, eg the gene for the selectable marker and the internal promoter of the second gene of interest A retroviral vector that allows for multiple insertions under the control of (See, for example, Gilboa, 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241: 29). See). Elements of the construction of vectors for expression of protein products are known to those skilled in the art. . The most efficient expression from retroviral vectors is a “strong” step for controlling transcription. When using a promoter such as the SV40 promoter or the LTR promoter (Chang et al., 1989, reviewed in Int. J. Cell Cloning 7: 264). these Promoters are constitutive and generally do not confer tissue-specific expression. Other suitable Suitable promoters are as described above. Efficient use of the packaging cell line will increase the infectivity of the resulting recombinant virions (Miller, 1990, Human Geometry) ne Therapy 1: 5). Mouse retrovirus vectors efficiently map genes. Male fetus (eg, Wagner et al., 1985, EMBO J. 4: 663; Griedley et al., 1987 Trends Genet. 3: 162) and hematopoietic stem cells (see, eg, Lemischka et al., 1986, Cell 45:91). 7- 927; see Dick et al., 1986, Trends in Genetics 2: 165-170). It was useful for Recent studies that allow achieving much higher virus titers than previously possible Improvements in torovirus technology include ecotropic packaging cell lines and amphotropic packaging. Continuous transfer to and from caging cell lines (so-called "ping-pong" method) (E.g. Kozak et al. 1990, J. Virol. 64: 3500-3508; Bodine et al., 1989, Prog. Clin. B iol. Res. 319: 589-600). Transduction efficiency is required for bone marrow cells expressing high levels of selectable genes. Augmented by preselection of infected bone marrow prior to introduction into enriched recipients (Eg, Dick et al., 1985, Cell 42: 71-79; Keller et al., 1985, Nature 318: 149-154). Furthermore, recent techniques for increasing virus titers Directly with virus-producing cell lines to achieve efficient transduction Enabled the use of virus-containing supernatants rather than incubation (e.g., Bodine et al., 1989, Prog. Clin. Biol. Res. 319: 589-600). Into the host genome Torovirus integration requires replication of cellular DNA, The frequency of target stem cells cycling through the cell for example in vitro with growth factors Increase by inducing the division of target cells (eg, Lemi See schka et al., 1986, Cell 45: 917-927) (the combination of IL-3 and IL-6 is Also seem to be effective. For example, Bodine et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:88. 97-8901) or 5-fluorouracil (eg, For example, exposure to Mori et al., 1984, Jpn.J.Clin.Oncol.14 Addendum 1: 457-463) Would be desirable (eg, Lemischka et al., 1986, Cell 45: 917-927; Chang et al., 1989, Int. J. Cell Cloning 7: 264-280). Cytokines or other growth in retroviral transformation Inclusion of factors leads to more efficient transformation of target cells obtain.Example 1 Generation of cells transformed by retrovirus and retroviral medium Transfer in mouse bone marrow hematopoietic cells by mediated gene transfer Maintenance of expression Retroviral gene transfer app for introducing expressible genes Roach potency was determined by drug resistance marker (neomycin) and porcine class II DRB Using a double-copy retroviral vector that has been treated to express cDNA Shown. This example uses the porcine class II DRB gene, but those skilled in the art Other genes listed, such as the human c kit gene, could be used instead. Would admit. Infectious particles containing these vectors are packaged in an environmentally and amphotropic package. 1 × 10 using both⁶ G418 resistant colony forming units / ml Produced at higher titers. DRA infection followed by virus-based supernatant Flow cytometric analysis of transduced mouse fibroblasts It was shown that the sequence sequenced was sufficient to generate DR surface expression. Mau Co-culture of bone marrow and high titer-producing strains has a high frequency of colony formation under G418 selection. Granulocyte / macrophage colony forming unit (CFU-GM) Leads to 40% transduction. After approximately 5 weeks of long-term bone marrow culture, Bone marrow exposed to Lus still contains G418 resistant CFU-GM at a frequency of 25%. I do. Furthermore, virtually all transduced and selected colonies are DRB-specific transcripts were included. These results indicate that very primitive myeloid progenitors Significant percentage of cells can be transduced with the DRB recombinant vector And that the vector sequence is expressed in differentiated progeny of these cells Is shown. These experiments are detailed below. Details of the retroviral construct are shown in FIG. Two types of retrovirus construction The products GS4.4 and GS4.5 were prepared. The diagram in FIG. Draws a torovirus construct. The arrow in FIG. 1 indicates the direction of transfer. In GS4.5, the direction of DRB cDNA transcription is the same as viral transcription. You. In GS4.4 (not shown), TK promoter and DRB cDNA Is inserted into the 3 'LTR of N2A in the reverse orientation of transcription for viral transcription, A 3 'RNA processing signal for simian virus 40 was added. pBSt is Refers to the Bluescript vector sequence (Stratagene). Thymidine kinase ( The TK) promoter is a 215 base pair (TK) from the herpes simplex virus TK gene. bp) PvuII-PstI fragment (McKnight, 1980 Nucleic Acids Res. 8: 5949-5964). The 3 'RNA processing signal of simian virus 40 is , PBLCAT3 plasmid (Luckow et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 5490-54) 97) was included in the 142 bp HpaI to SmaI fragment (see FIG. 1). Step Sequence analysis of the junctions of the promoter, class II cDNA and vector sequences Elements of the construct were ligated properly. These retroviral constructs were converted to the amphotropic packaging cell line PA317 And the transfectants were selected in a G418-containing medium. . Transfected with GS4.4 and GS4.5 recombinant plasmids respectively All 24 and 36 clones were subjected to PEG precipitation of the culture supernatant and viral RNA. Were tested by slot blot analysis. Of these, 8 and 12 respectively The clone was found to be positive for DRB (but not for DRBSigna). Was consistently weaker for clones from GS4.4). GS4.5 cells Dot-blot of PEG-precipitated particles of genomic and spliced transcripts from Analysis by blot analysis shows that various clones transfected with GS4.5 Heterogeneity among the viral transcripts in the protein was demonstrated. In one experiment, two The clone is DRB⁺/ Neo⁺Contains viral RNA, two are DRB⁺ Neo^- R NA and two DRB^-/ Neo⁺ RNA, one of which is class II or Ne o showed no signal. G418 resistance of the supernatant from the DRB positive clone (G 418^r) Titer determination was performed on GS4.5 transfected clones (10^Three~ 1 0^Four (CFU / ml), the average titer generated was GS4.4 transfected. Clone (10^Two-10^Three (CFU / ml). . Therefore, further transduction experiments were performed with the best clone (GS4.5C4 (Named as "G418").^rtiter 3 × 10^Four CFU / ml). Plasmid preparation, cloning procedures, DNA sequencing, RNA preparation, Southern blots and RNA slot blots were prepared according to standard methods, Sambrook et al., 1989. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition (Cold Spring Harbor Lab. , Cold Spring Harbor). The final wash of the blot was performed with 0.1 × SS PE (1 × SSPE = 0.18 M NaCl / 10 mM sodium phosphate, p H7.4 / 1 mM EDTA) at 60 ° C. for 30 minutes. Packaging cell line PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2). 902), GP + E-86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol 62: 1120-1124), ps iCRIP (Danos et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464), and These derivatives are combined with 0.1 mM non-essential amino acids (Whittaker Bioproducts), Antibiotics penicillin (5 units / ml) and streptomycin (5 μg / ml) (V / v) fetal calf serum (CELLect Silver; Flow Laboratories) ) Was maintained at 37 ° C. in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; GIBCO). Improvement of virus titer of C4 clone. Recent data show high retroviruses That the supernatant containing the titer is the best candidate for transducing bone marrow cells. (Bodine et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738-3742). The titer of C4 producing clones was determined by "ping-pong" amplification (Bestwick et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5404-5408). From almost confluent C4 culture Of G + E-86 ecotropic packaging cells and G418 selection Choice applied. Forty-eight clones were isolated and PEG precipitated for virus particle production Screened. Supernatants from 18 of these clones were DRB-positive by dot blot analysis of RNA, 0.5-3.5 × 10^Four G418 at CFU / ml^rHad a titer. One positive clone was then Vinpon using vegetative hygromycin resistant packaging strain psiCRIP Amplified by technology. Supernatants from 48 hygromycin resistant clones were DRB The presence of positive viral RNA was tested by PEG precipitation and their G418^r The titer was measured. All of these clones were docked using DRB probes. Positive by blot analysis, 1 × 10^Five~ 1 × 10⁷ CFU / A titer of ml was produced. The amphotropic clone GS4.5A4 that produced the highest titer was The presence of helper virus was tested by the S + L assay. To replicate components Ruper virus was not detected. Amplification of the virus titer was achieved by the ping-pong technique. psiCRIP package Aging cells are more helper than PA317 when certain types of vectors are used. There is evidence that they are less prone to virus production (Miller, 1990, Hum. Gene The rapy 1: 5-14), the DRB recombinant virions were transformed with psiCRIP / GP-E-8. Prepared using a combination of 6 producer cells. Detectable amphotropic helper virus 1 × 10 without accompanying⁷ Titer values in excess of CFU / ml were obtained (this is Ensures that Teggie produces safe virus particles suitable for in vivo experiments Do). GS4.5 producing clone C derived from different packaging cell lines 4, A9 and A4 Northern blot analysis showed conserved hybridization. Pattern was shown. Full-length viral genome, spliced Neo Transcripts and RNA species corresponding to the DRB transcription unit were found along with additional RNA species. Was. High molecular size species found in these experiments were opened from the TK promoter. Construct a read-through transcript that begins and ends with another long terminal repeat (LTR) You. Many obtained by transfection providing irregular DRB transcripts In contrast to virion-producing clones of Showed a stable DRB hybridization pattern (this was during the amplification procedure). Suggest that no recombination event occurred.) Retrovirus titers were measured as described below. Replication defective retrovirus Particles from packaging cell line originally transfected with recombinant construct Using the standard calcium phosphate precipitation method (Wigler et al., 1978, Cell 14: 725-733) Generated. Retrovirus generation was determined by Bodine et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738-3742, drug resistance titers (G418 resistant colony forming Position / ml, CFU / ml). G4 except for psiCRIP strain 18 (GIBCO) selection with 500 μg / ml active ingredient for 10-12 days Was. Hygromycin B selection was performed using psiCRIP-derived packaging For 10 days in a medium containing 50 μg / ml of active drug. Applied. Replication competent helper virus titer in PG4 cat cells , S⁺L^-Assayed by the method (Bassen et al., 1971, Nature 229: 564-566). PEG precipitation of virus particles was performed as follows. Included in 1 ml culture supernatant 0.5 ml of 30% (w / v) polyethylene glycol (P Using EG), the mixture was precipitated at 4 ° C. for 30 minutes. After centrifugation, the pellet is Using a mixture of ase inhibitors (vanadyl ribonuclease complex, BRL) Phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. Next The pellet was then resuspended in 15.7% (v / v) formaldehyde and The exudates were doted on nitrocellulose membrane. Analysis of DRB transcripts in packaging cell clones was performed as follows. . Test for accurate transcription of introduced DRB cDNA in different production clones To do this, Northern blots containing RNA isolated from these clones were Hybridized with RB and Neo probes. Figure 2 shows the provirus genome Structure and prediction of transcripts initiated from viral LTR or TK promoter It is the size that is drawn. PA317 (clone C4), GP + E-8 6 (clone A9) and three derived from psiCRIP (clone A4) cells GS4.5-containing clones showed a DRB-positive transcript. Hantzopoul os, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3519-3523. Unlicensed genomic RNA (band a) and spliced Neo transcript (band b) was observed. Furthermore, it is uniquely unique to DRB probes. A transcript that can be hybridized was detected, indicating that the DRB cDNA transcription unit Corresponding to the expected size (1700 bases, band c). Surface expression of SLA-DR antigen in transduced fibroblasts Was detected as follows. Surface development of SLA-DR antigen in mouse fibroblasts An in vitro assay has been developed to test the present. Flow cyto shown in FIG. The tomometry (FCM) profile is 3 × 10^FourG418^rTiter (Clone C4 ) On the cell surface of the transduced DRA transfectant Is sufficient to promote the expression of the DR antigen. In FIG. 3, a solid line Indicates DR cell surface expression (anti-DR antibody binding) (GS4.5C4 (B) and GS4.5 3 days after transduction using A4 (C) Dashed lines indicate anti-mouse class I antibody binding (22% and 75% of the Positive control); dotted line indicates anti-pig CD8 antibody binding (negative control). Trance 22% of the bulk population of reduced cells is DR positive, The subclones maintained class II expression for more than 5 months. Increase in titer (black A4) shows an increase in the number of transduced cells (transduction 75% of the population used were DR positive) and the brightness of the DR signal And correlated. The class II transduction assay was performed as shown in the diagram of FIG. Was. NIH3T3 cells were transformed with a plasmid expression vector (Okayama et al., 1982, Mol. Cell.Biol.2: 161-170) inserted into SLA-DRA^d Transfer with cDNA Cut. Stable DRA transfector expressing high levels of DRA mRNA About 3 × 10 of the clone (clone 11 / 12.2F)^FourCells are then washed with 1 ml of D Transduction overnight with RA-containing retroviral supernatant. Cells, followed by Culture in fresh DMEM supplemented with 10% fetal calf serum and antibiotics for another 2 days Then, the surface expression of the DR antigen was tested by FCM analysis. The class II transduction assay described here is for retroviral constructs. Provides a quick and simple method for testing both expression and functional titer of E. coli. By using cells transfected with DRA, two separate vectors (Yang et al., 1987, Mol. Cell Biol. 1: 3923-3928; Korman et al., 1987, Proc. Natl. Ac. ad.Sci.USA 84: 2150-2154), a lengthy double selection after transduction Selection is avoided. Cell surface expression of the DR heterodimer indicates that 3 FCM analysis after day indicated that the transferred sequence had significant levels. It was sufficient to generate a bell DRβ chain. More importantly, This test is based on genetic control of interest rather than expression of independently regulated drug resistance markers. A measure of “functional” titer is given based on offspring expression. The SLA-DRB probe has the complete coding sequence of the DRβ chain (Gustafsson et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9798-9802). Met. Neomycin phosphotransferase gene (Neo) probe , N2A retrovirus plasmid (Hantzopoulos et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3519-3523). Expression of porcine DRB cDNA transduced into mouse bone marrow progenitor cells The efficiency with which the myeloid clonogenic precursor was transduced After exposure to virions from S4.5, selective amounts of G for CFU-GM Measured by assaying in the presence and absence of 418. Two experiments The comparison of the number of colonies formed in the presence and absence of the drug Indicating that about 40% of the initial population of cells was transduced Was. G418^r The frequency of CFU-GM was determined using transduced bone marrow samples After 33 days of expansion under culture conditions, measurements were taken again. Present in culture after 33 days 25% of those ancestors still gave rise to colonies under G418 selection. CFU -Colonies of cells arising from GM were checked for the presence of DRB-specific transcripts by RN A is converted to cDNA, and then PCR amplification is performed as described herein and in Shafer et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9670. Was. A 360 bp DRB-specific product was obtained from fresh transduced bone marrow Detected in 5 of the next 6 G418 selected colonies, 33 Six similarly derived from transduced ancestors present in culture after day All colonies were positive. 100 bp found in some of the samples Additional bands probably counteract the cell physiology of non-specific priming events. I am reflecting. DRB-specific transcripts also demonstrate bulk populations of drug-resistant colonies. And production cells, but control, e.g., transduction Not populated colonies to give carrier RNA Fibroblasts used and tigers treated as described above (excluding reverse transcriptase) Not detected in bulk populations of induced colonies won. These latter data indicate that the PCR signal is Fragments that are amplified by the provirus rather than the viral message To eliminate the possibility of the cause. Altered viral design, increased viral titer, growth factors that stimulate precursor cells Recent improvements, including the use of offspring and the selection of stem cells prior to transduction, have Improves long-term expression of transduced genes in compartments (Bodine et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3738-3742; Bodi Ne et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8897-8901; Wilson et al., 1990, Proc. N. atl.Acad.Sci.USA 87: 439-443; Kang et al., 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:98. 03-9807; Bender et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9: 1426-1434). Experiments described here Is the major histocompatibility complex class II gene transferred into hematopoietic cells. Demonstrates the applicability of retroviral gene transfer technology in achieving expression doing. Measuring the efficiency of transduction of developmentally primitive hematopoietic cells G418^r Infection in which the frequency of CFU-GM was maintained in a long-term culture for 33 days Bone marrow cells were evaluated after expansion. Expression of the exogenous DRB cDNA is also From transduced CFU-GM that was present after a long or long culture period Monitored in cells. Virtually all of the individually tested colonies have DRB characteristics. Positive for heterologous transcripts, indicating that the DRB recombinant vector Suggests that it is suitable for expression in cells. Bone marrow cells were obtained from femurs of 6-12 week old female C57BL / 10 mice and Prepared as described in dstad et al., 1984, Nature 307: 168-170. Granulocyte / ma Methylcellulose cells for clophage colony forming units (CFU-GM) Ronnie assay (Eaves et al., 1979, Blood 52: 1196-1210) as described. 5% (v / v) mouse interleukin 3 culture supplement (Collaborative Resear ch). Long-term Dexter-type bone marrow culture was performed in a 60 mm culture dish for 2 hours. × 10⁷(Eaves et al., 1987, CRC Crit. Rev. Oncol. He. matol.7: 125-138). Bone marrow cells were purified essentially from Bodine et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8897-8. Transduction as described in 901. Briefly, the bone marrow 6-12 week old females treated with fluorouracil (150 mg / kg) for 2 days Collected for C57BL / 10 donors. 1 × 10⁶Cells / ml for 2 days 7.5% interleukin 3 culture supplement and recombinant interleukin 6 (200 Units / ml; donated by J. Jule of the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) Pre-incubation in added long-term Dexter bone marrow culture medium Stimulation was performed. Bone marrow cells are transformed into a nearly confluent virus-producing cell, polybrene (8 mg / ml) and 5 × 10 5 per 10 cm plate containing the above cytokines⁶Fine Transduction was performed for 48 hours by adding cells. Detection of DRB-specific transcripts in CFU-derived colonies was performed as follows. . Cells corresponding to individual CFU colonies and colonies present on all plates ( The cells corresponding to (bulk) were first removed from the methylcellulose culture, in phosphate buffered saline. Extracted by dilution with solution and centrifugation. These cells were then 1x10⁶ NIH3T3 cells (giving carrier RNA) and total RNA Extracted using the Niidine isothiocyanate / CsCl method. First-strand cDNA: Invitrogen Red Module Kit from 20 μg of total RNA Was prepared using The cDNA is then converted to SLA DRB-specific oligonucleotides. Pide 04 (5'-CCACAGGCCTGATCCCTAATGG) (SEQ ID NO: 1) and 17 (5'-AGCATA GCAGGAGCCTTCTCATG) (SEQ ID NO: 2) in the presence of Cetu as recommended. s 50 cycles of P using GeneAmp kit (Perkin-Elmer / Cetus) It was subjected to CR amplification. The reaction product was subjected to 3% NuSieve agarose gel (FMC) After electrophoresis above, they were visualized by staining with ethidium bromide. FCM analysis was performed using the anti-DR monoclonal antibody 40D (Pierres et al., 1980, Eur. Immunol. 10: 950-957), anti-H-2^dAllo-antiserum or anti-porcine CD8 monoclonal Using antibody 76-2-11 (Pescovitz et al., 1984, J. Exp. Med. 160: 1495-1505). Goat anti-mouse anti-fluorescein isothiocyanate labeled For cells stained using the body (Boehringer Mannheim), FAC-ScanI was used. This was performed using a fluorescence activated cell sorter (Becton Dickenson).IV . Production of transgenic pig According to another aspect of the invention, improved survival and survival of porcine hematopoietic cells in human patients. Implantable plants expressing one or more recombinant human proteins that promote planting and / or engraftment The cells are provided, such as hematopoietic stem cells such as porcine bone marrow cells or other tissues. In particular, the invention includes recombinant porcine cells that express the human hematopoietic gene. Preferred concrete In an example, the human hematopoietic gene is located in close proximity to the human gene and porcine cells Tissue-specific promoters that regulate human gene expression in E. coli, such as hematopoietic Part of a recombinant nucleic acid molecule containing a promoter. Contains recombinant human hematopoietic genes Tissues can be transformed with recombinant nucleic acid molecules into tissues, e.g., bone marrow cells, by known transformation techniques. It can be prepared by introduction using an alternative technique. These tran The transformation techniques include reticulations with marker genes or drug resistance genes. Includes transfection and infection with a rovirus. For example,Current Protocols in Molecular Biology , Ausubel et al., John Wiley and Sons, New York (1987) and Friedmann (1989) Science 244: 1275-1281. Of the present invention The tissue containing the recombinant nucleic acid molecule is then subjected to a reconstitution technique (eg, Dick et al. (1985) Cell 42:71) can be reintroduced into animals. The present invention also relates to bone marrow cells. Recombinant human construct to improve the ability of porcine bone marrow cells to reconstitute a human host in cells Pigs expressing blood proteins are also included, preferably mini-pigs. Use the above recombinant construct And transgenic pigs can be prepared by any method known in the art (microinjection). Injection, embryonic stem (ES) cell manipulation, electroporation, cell gun, tiger Infection, transduction, retroviral infection, etc. (Not limited to these). The transgenic pigs of the present invention can be used to Into the bone marrow cells such as hematopoietic cells. Wear. Human Transgene Constructs Using Fetal Target Cells of Different Developmental Stages Can be introduced. As is generally understood in the art, fetal targeting Different methods are used to introduce the transgene, depending on the stage of vesicle development. I have. One technique for modifying pigs by gene transfer is to use recombinant nucleic acid molecules. In animals in which one or more copies of the recombinant nucleic acid molecule occur in the male pronucleus of a fertilized egg Microinjection so that it is retained in cells. Interested Recombinant nucleic acid molecules have a linear form, excluding most of the sequences used for replication in bacteria. To isolate. Linearization and removal of excess vector sequences can be achieved by transgenic mammals. This results in higher efficiency in animal production. For example, Brinster et al. (1985) PNAS 82: See 4438-4442. Generally, conjugates are only microinjected. The best target for In pigs, the male pronucleus is standard microinjected To a size that allows for reproducible injection of DNA solutions by means of the mitigation technique. Change In addition, the use of conjugates as targets for introgression is almost always A has the major advantage that A is integrated into the host genome before the first cleavage. Usually, up to 40% of animals that develop from injected eggs have low levels in their tissues. It contains at least one copy of the recombinant nucleic acid molecule. These transgenic animals Generally, the gene is passed from the germline to the next generation. By gene transfer The progeny of the engineered embryos were analyzed for their constructs by Southern blot analysis of tissue sections. Can be tested for the presence of Typically, a small portion of the tail is used for this purpose. Use for Stable integration of the recombinant nucleic acid molecule into the genome of the transgenic embryo Integration is a permanent transgenic with the recombinant nucleic acid molecule Allows establishment of mammalian strains. Alternative methods for producing animals containing the recombinant nucleic acid molecules of the invention include fertilized eggs, embryos, The recombinant nucleic acid molecule of stem cells, strong embryonal carcinoma (Ec) cells or early cleavage embryos Infection with a viral expression vector containing the virus. For example, Palmiter et al. (1986) An See n.Rev.Genet.20: 465-499. Transgenes can also be introduced into pigs using retroviral infection . The developing embryo can be cultured in vitro to the blastocyst stage. You. During this period, blastomeres can be targeted for retroviral infection. (Jaenich (1976) PNAS 73: 1260-1264). Efficient infection of blastomeres by removing the zona pellucida (Hogan et al. (1986) Manipulating the M ouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York During). The viral vector system used to introduce the transgene is: Typically, a replication defective retrovirus with a transgene (Jahner et al. (1985) PNAS 82: 6927-6931; Vander Putten et al. (1985) PNAS 82: 6148-61 52). Transfection involves culturing blastomeres on a monolayer of virus-producing cells (Vander Putten, supra; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6: 383-388). Alternatively, the infection can be performed at a later stage. Wooly Rus or virus producing cells can be injected into the blastocoel (Jahner et al. (1982) Na ture 298: 623-628). Most of these founders are typically uptake Occurs only in a subset of cells that formed transgenic pigs So it is a mosaic of the transgene. In addition, the animal created Different retroviral inserts of the gene can be included at different locations in the genome. And they generally segregate in progeny. Furthermore, although less efficient, Transgenes become germ-line by in utero retroviral infection of unborn child It can also be introduced (Jahner et al. (1982) supra). A third approach that may be useful in the construction of transgenic pigs is It will target the introduction of the transgene into embryonic stem cells (ES). E S cells are obtained from a pretransplanted embryo cultured in vitro and fused with the embryo ( Evans et al. (1981) Nature 292: 154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309: 255-258; Go ssler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322: 445-448. ). Transgenes can be transfected by DNA or retrovirus-mediated. Transduction could be efficiently introduced into ES cells . Such transformed ES cells are then combined with blastocysts from pigs Could be. These ES cells can then be used to colonize embryos Could contribute to the germline of the resulting chimeric pig. As a review See Jaenisch (1988) Science 240: 1468-1474. Introducing a recombinant gene at the fertilized oocyte stage requires that the gene sequence Present in all germ and somatic cells of transgenic “creating” pigs To ensure. As used herein, the creation animal (abbreviation "F") is a recombinant gene Pigs introduced at the one-cell embryo stage. Transgenic creation The presence of the recombinant gene sequence in the germ cells of the animal further indicates that Recombinant inheritance in which about half of the grandchildren are activated in all their germ cells and somatic cells Means having a child array. Recombinant gene placement at a later embryo stage The introduction of the sequence can result in the absence of that gene in some somatic cells of the creation animal. , The offspring of such animals that have inherited the gene, All will have the recombinant gene activated. Microinjection of porcine oocytes In a preferred embodiment, the transgenic pigs of the invention are produced as follows. RU: i) Microinjection of the recombinant nucleic acid molecule into fertilized pig eggs Producing a genetically modified pig egg; ii) transplanting the genetically modified porcine egg into a host sow; iii) allowing the host female to live for a period equal to a substantial portion of the gestational age of the fetal pig; Maintain; iv) Expression of a human hematopoietic gene generated from a mammalian egg in which this gene has been modified A transgenic pig having at least one cell is obtained. Generally, microinjection proces in transgenic animal production The use of protocol is typically divided into four main phases: (a ) Preparation of those animals; (b) recovery of one or two cell embryos and in vitro Maintenance; (c) microinjection of those embryos and (d) embryo recipe Re-transplantation into a female. The principle used for the production of transgenic livestock, especially pigs, is the principle The same as that used for producing transgenic mice. An example For example, in general, Gordon et al. (1983) Methods in E for transgenic mice nzymology 101: 411 and Gordon et al. (1980) PNAS 77: 7380; Hammer et al. (1985) Nature 315: 680, Hammer et al. (1986) J Anim S ci 63: 269-278, Wall et al. (1985) Biol Reprod .32: 645-651, Pursel et al. (1989) Science 244: 1281-1288, Vize et al. (1988) J Cell Sc ience 90: 295-300, Muller et al. (1992) Gene 121: 263-270 and Velander et al. (1992) PNA S 89: 12003-12007 (each of these were used to produce transgenic pigs) Teach the technique). PCT Publication WO90 / 03432 and PC T publication WO 92/22646 and references therein. See also the referenced references. One step in the preparation phase is to synchronize at least the estrous cycle of the donor female And inducing superovulation in their donor females prior to mating. You. For superovulation, the drug is typically administered at the appropriate stage of the estrous cycle. To stimulate follicular development and then treated with drugs to synchronize estrus and initiate ovulation Is included. Typically, as described in the Examples below, pregnant mare serum Luteinizing hormone (LH) to mimic follicle stimulating hormone (FSH) For use with mimic human chorionic gonadotropin (hCG). Excess elimination in pigs Efficient induction of eggs, as is well known, depends on the age and weight of their females, and gonadoto. It depends on several variables, including the amount and timing of lopine administration. For example, pig See Wall et al. (1985) Biol. Reprod. 32: 645 describing superovulation. excess Ovulation increases the likelihood that a large number of healthy embryos will be available after mating, It allows you to control the timing of experiments. After mating, fertilized eggs of one or two cells from superovulated females were Collect for injection. A variety of protocols useful for collecting eggs from pigs It is known. For example, in one approach, fertilized superovulated female eggs Tubes are surgically removed and isolated in buffer / culture medium and fertilized eggs are isolated for their Squeeze out of the fallopian tube tissue. (1980) PNAS 77: 7380; and Gordon et al. (198 3) See Methods in Enzymology 101: 411. Alternatively, cannulate these fallopian tubes Surgery by flushing buffered / culture medium from animals that have received and anesthetized fertilized eggs Collection, thereby eliminating the need to sacrifice the animal. See Hammer et al. (1985) Nature 315: 600. Thailand for collecting embryos after mating superovulated females Mining can depend on the length of the fertilization process and the time required for full expansion of the pronucleus. This The temporary waiting time can be, for example, up to 48 hours for large breed pigs. And get. Fertilized eggs suitable for microinjection, such as one-cell eggs containing pronuclei Alternatively, two-cell embryos can be easily identified under a dissecting microscope. The equipment and reagents required for microinjection of these isolated pig embryos are , Similar to those used for mice. For example, embryos can be Gordon et al. (1983) Methods in Enzymology 101: 411; and Gordon et al. (1980) PNAS 77: 7380. simply Locates fertilized eggs using an egg holder (made from a 1 mm glass tube) (The holder is attached to a micromanipulator, which And optionally with a dissecting microscope with a differential interference contrast section). Before Where nuclear visualization is difficult due to optically dense cytoplasmic material (such as Is common in porcine embryos), and centrifugation of those embryos can endanger embryo viability It can be done without exposure. Wall et al. (1985) Biol. Reprod. 32: 645. Centrifugation Separation is usually required in this method. The recombinant nucleic acid molecules of the present invention Linearizing the recombinant nucleic acid molecule with at least one restriction endonuclease; And is typically provided in a linearized form (the purpose is to provide any prokaryotic Row as well as unnecessary adjacent sequences). Further, a tissue-specific promoter and Recombinant nucleic acid genes, including human hematopoietic genes, can It can be isolated using endonuclease. Manipulate the recombinant nucleic acid molecule, Techniques for linearizing are well known,Molecular Cloning: A Laboratory Manualsecond Edition, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, New York (1989). I will. The linearized recombinant nucleic acid molecule is microinjected into porcine eggs using well-known techniques. By injection, a genetically modified mammalian egg can be produced. Scripture Formally, linearized nucleic acid molecules were described by Gordon et al. (1980) PNAS 77: 7380-7384. Microinjection directly into the pronucleus of the fertilized egg as described. This is raw Stable chromosomal integration of recombinant nucleic acid molecules in a significant population of growing embryos Guide to For example, Brinster et al. (1985) PNAS 82: 4438-4442 and Hammer et al. (198 5) See Nature 315: 600-603. Micro needle (eg egg holder) used for injection It can also be made by drawing a glass tube. Touch the tip of the microneedle by capillary action. Can be filled with lath mid suspension. Then, by microscopic visualization, Insert the microneedle into the pronucleus of the cells held by the egg holder and place The suspension is injected into the pronucleus. If the injection is successful, the pronucleus is generally markedly swollen. Moisten. Next, the microneedle is pulled out, and the fine needle that survived microinjection Vesicles (eg, those that do not lyse) are subsequently used for transplantation in host females. You. The genetically modified mammalian embryo is then transferred to the oviduct or offspring of the recipient. Move to Miyanomiya. The microinjected embryos are collected in a transfer pipette and the Insert the pipette into the surgically exposed oviduct of the recipient and insert the microinjector. The aspirated egg is discharged from the pipette into the fallopian tube. Pulled out the transplant pipette Later, all surgical incisions are closed and the embryo is allowed to continue pregnancy in a foster mother. For example (1983) Methods in Enzymology 101: 411; Gordon et al. (1980) PNAS 77:73. 90; Hammer et al. (1985) Nature 315: 600; and Wall et al. (1985) Biol. Reprod. 32: 645. I want to be illuminated. A host female mammal comprising a transplanted genetically modified mammalian egg, At least one cell expressing a recombinant nucleic acid molecule, eg, a bone marrow cell, eg, a hematopoietic cell Transgenic baby generated from a mammalian egg whose gene has been modified Maintain for a period sufficient to produce the dairy animal. At 2-4 weeks of age (postnatal), tail sections were collected from these piglets and Digest with Kose K. DNA from these samples was subjected to phenol-chloroform extraction. And then digested with various restriction enzymes. These DNA digests are converted to Tris- After electrophoresis on a boric acid gel, blotting on nitrocellulose At least the coding region of the recombinant cDNA of interest labeled by summer extension Hybridize with a partial probe. Under high stringency conditions, this probe Should not hybridize to the endogenous porcine gene, Data will be identified. According to a preferred specific embodiment of the present invention, a transgenic pig is prepared according to Example 1 Can be generated by the method shown in FIG.Example 2 Transgenic cells expressing human c-kit (receptor for human SCF) Production Orally active progestogen (allyltrebolone, AT: 15 mg / animal / ) To sexually mature heifers (> 7 months old) for 12-14 days By doing so, the estrus is synchronized. On the last day of AT feeding, all heifers And Prostaglandin F_2a(Lutallyse: 10 mg / injection) At 00 or 1600, an intramuscular injection (IM) is performed. 24 hours after the last day of AT consumption First, pregnant donor horse serum gonadotropin (PMSG) was given to all donor heifers. : 1500 IU) for a single IM injection. Human chorionic gonadotropin (HCG: 750 IU) is administered to all donors 80 hours after PMSG. After cessation of AT consumption, donor and recipient heifers were recruited 2 days / day. The adult boars are checked twice for signs of estrus. 36 hours or more after HCG administration The donors that showed estrus in the estrus using artificial and natural fertilization (respectively) Mating is performed 12 and 24 hours after initiation. One and two cell eggs were obtained 59 and 66 hours after HCG administration using the following procedure. And surgically recovered from mated donors. 0.5 mg acetokg / kg body weight By administering promazine and 1.3 mg of ketamine via the peripheral ear vein Induce general anesthesia. Following anesthesia, the genital tract is removed from the body by abdominal laparotomy. Insert a glass cannula for suction (OD 5 mm, length 8 cm) into the fallopian tube, Secure to the funnel using a single silk (2-0) suture. 20g needle into the fallopian tube lumen (2 cm before the utero-tubal junction) to flush the eggs in a retrograde fashion. Shuffle. Sterile Dulbecco supplemented with 0.4% bovine serum albumin (BSA) Inject phosphate buffered saline (PBS) into the fallopian tube and flush toward the glass cannula. Shuffle. The medium is collected in sterile 17 × 100 mm polystyrene tubes. H The rush is transferred to a 10 × 60 mm Petri dish and searched at low magnification (50 ×). You All 1-cell and 2-cell eggs were cultured in modified Brinstar eggs supplemented with 1.5% BSA Wash twice with 3 medium (BMOC-3) and transfer to 50 ml BMOC-3 droplets under oil You. Eggs 90% N_Two, 5% O_Two, 5% CO_TwoUnder air, microinjection Store at 38 ° C until washing is performed. One- and two-cell eggs were mixed with 1 ml of HEPES medium supplemented with 1.5% BSA. Put into an Eppendorf tube (15 eggs / tube), the pronucleus in a 1-cell egg and the Centrifuge at 14000 × g for 6 minutes to visualize nuclei. Then, the eggs Transfer to 5-10 ml drops of HEPES medium under oil on recessed slides. micro Injection was performed with a Nomarski optics and two Leitz micros This is performed using a Laborlux microscope equipped with a manipulator. Operable DNA constructs containing the human c-kit gene linked to the promoter 1700 copies (1 ng in 1 ml of Tris-EDTA buffer) were added to one cell egg. Inject into one pronucleus or both nuclei in a two-cell egg. The microinjected eggs are returned to droplets of BMOC-3 medium under oil, Before transfer to their appropriate recipients, 90% N_Two, 5% CO_Two , 5% O_TwoMaintain at 38 ° C. under air. Eggs should be trans-transformed within 10 hours of collection. To fur. Only recipients that show estrus on the same day as the donor or 24 hours later are Used for transfer. The recipient is anesthetized as described above. One of the fallopian tubes After exiting the body, at least 30 injected one-cell and / or two-cell eggs And 4 to 6 control eggs are transferred in the following manner. 21gx3 / 4 ba Connect the tubing from the turf infusion set to the lcc syringe. Egg and 1-2 ml Aspirate BMOC-3 medium into this tube. The tube is then passed through the fallopian tube Feed until the tip reaches the lower third or gorge of the fallopian tube. Then, these eggs, Discharge when slowly pulling out this tube. The exposed portion of the genital tract is replaced with a sterile 10% glycerol / 0.9% salt solution. And return to the body cavity. Connect connective tissue, fat and skin, including the white line, in three separate layers And suture. Use uninterrupted Halstead stitch to close white lines . Fat and skin are separated by a single continuous stitch and mattress stitch, respectively. Close using a switch. Next, a topical antibacterial agent (furazolidone) is administered to the incision area I do. Recipients are caged in four groups, 1.8 kg standard 16% Provides crude protein corn soy food. Start on day 18 (Day 0 = estrus Start), all recipients are checked daily for signs of estrus using adult boars. Check. On day 35, pregnancy is detected using ultrasound. 107 days of pregnancy In eyes, transfer the recipient to the delivery room. To ensure that you are present at birth And Prostaglandin F_2a(10 mg / injection) on day 112 of pregnancy And at 1400 hours to induce labor. The recipient is PG F_2aIt should deliver within about 34 hours after administration.V. Using transgenic pigs to test human growth factor Using the animal of the present invention as a model, a human growth factor agonist or Drugs that act as gonists can be tested. Which drug to test It can be administered to animals of the invention to monitor the growth of transgenic hematopoietic cells. Can be.VI . Use of transgenic porcine hematopoietic stem cells in xenotransplantation The following procedure is used to ensure that the transplanted porcine organ (xenograft) is To survive longer. This organ can be any organ, for example It may be a liver, for example a kidney, for example a heart. The main strategy is organ perfusion Elimination of natural antibodies, transplantation of transgenic pig cells to induce tolerance, and Where appropriate, transplantation of donor stromal tissue. Preparing recipients for transplantation Any or all of these steps are included. Preferably, they are Perform in order. First, a preparation of equine anti-human thymocyte globulin (ATG) was prepared by the recipient. Intravenously. This antibody preparation excludes mature T cells and natural killer cells. Remove. If not eliminated, mature T cells can be transferred after bone marrow transplantation and sensitization. It will promote both rejection of the plant itself. Equally important, ATG preparation The thing also eliminates natural killer (NK) cells. NK cells are probably Has no effect on planted organs, but immediately rejects newly introduced bone marrow Will. Anti-human ATG from any mammalian host, eg, AT produced in pigs G can also be used (however, the porcine ATG preparation is much more Low titer). Anti-NK monoclonal antibodies are generally used in all host NK cells. The polyclonal mixture in ATG is not soluble ATG is an anti-NK monoclonal that can lyse host NK cells. Better than antibodies. The presence of donor antigens in the host thymus at the time when host T cells regenerate after transplantation, Critical for tolerizing host T cells. If donor hematopoietic stem cells are the host If it cannot be established in the thymus and cannot induce tolerance before the host T cells regenerate Requires multiple doses of anti-recipient T cell antibodies during this non-myeloablative regimen Can be Continuous depletion of host T cells may be necessary over several weeks. Some For example, if this approach was unsuccessful and tolerance was low (donor skin graft acceptance) , As measured by decreased in vitro responsiveness of specific cells and humoral tolerance) If not induced in these animals, appointment to include thymectomy of the host Can be modified. In thymectomized recipients, host T cells Have no opportunity to differentiate in the host thymus and must differentiate in the donor thymus. No. If this is not possible, the animal will be -It must depend on donor T cells that develop in the thymus. Immune eligibility Ability to reject non-donor allogeneic donor skin grafts and in pathogen-containing environments It can be measured by the ability to survive. Splenectomy of the recipient may also be necessary to avoid anemia. Would be desirable. Second, the recipient is irradiated with a low dose to create a hematopoietic space. 100 ~ A sublethal dose of 400 rad total body irradiation and 700 rad local thymic irradiation It has been found to be effective for the purpose. Third, natural antibodies are obtained from the blood of the recipient by perfusion of pig liver. Absorb. Pre-formed natural antibodies (nAB) are key agents in graft rejection It is. Natural antibodies bind to heterologous endothelial cells and are primarily of the IgM class. This These antibodies need not have previously been exposed to antigens of a heterologous donor. These natural B cells that produce antibodies tend to be T-cell independent and during development these antibodies Are usually tolerant to self-antigens by exposure to Newly generated The mechanism by which B cells are tolerized is unknown. Liver is naturally more effective than kidney Absorbent for antibodies. The fourth step in a non-myeloablative procedure involves donor stromal tissue (preferably, Fetal liver, thymus and / or fetal spleen) are transplanted into the recipient (preferably Preferably in a kidney capsule). Stem cell transplantation and hematopoiesis across heterogeneous barriers Is facilitated by providing a hematopoietic stromal environment from the donor species. Interstitial matrix Are species-specific factors necessary for the interaction of hematopoietic cells with their interstitial environment, such as Supplies blood growth factors, adhesion molecules and their ligands. The thymus is a major site of T cell maturation. Each organ is isolated from each untransplanted It contains an organ-specific stromal matrix that can support the differentiation of mesenchymal cells. Adult thymus Can be used, but fetal tissue obtained sufficiently early in pregnancy can trigger GVHD. It is preferred because it does not contain any mature T cells that may arise. The fetal tissue is also In general, they tend to survive better than adult tissues. Be more cautious about GVHD Thus, thymic stromal tissue can be irradiated prior to transplantation (eg, at 1000 rads). Irradiation). As an alternative or adjunct to transplantation, fetal hepatocytes may be administered in a liquid suspension. Can be. (Transgenic "humanized" porcine cells (host stem cells and more effective The ability to compete and repopulate the host) is the need for this step. Can be eliminated. ) Fifth, transgenic porcine bone marrow stem cells (BMC) such as human c-kit Porcine BMC that has been treated to express the gene is injected into the recipient. Do The donor BMC is directed to the appropriate site in the recipient and adjacent to the rest of the host cells. Grows and proliferates, forming a chimeric lymphohematopoietic population. During this process Newly formed B cells (and the antibodies they produce) Exposed, so that the implant will be recognized as self. Donna Tolerance is also observed in animals in which hematopoietic stem cells, such as BMC, have been implanted. It is also found at the T cell level. Several months after organ transplantation induced bone marrow chimerism Later, when placed in such an animal, the natural antibody to the donor has been lost and the graft is It should be accepted by both the humoral and cellular forces of the immune system. This The approach involves transplantation of hematopoietic cells, eg, BMT, eg, fetal liver suspension, followed by organ transplantation. Allow for long enough to restore normal health and immunocompetence at the time of organ transplant Has the further advantage of being While any of these procedures will help the transplanted organ survive, the best results have been This is achieved when all the steps are used in combination. Transplant donor and tolerant hematopoietic cells or individuals giving perfused liver Should be the same individual, or should be as close as possible. For example, it is preferable to obtain transplanted tissues from highly mated donor colonies. is there.Other examples As discussed here, to promote the development of mixed chimerism, the graft It is often desirable to expose the recipient to irradiation. By dividing the irradiation dose That is, by applying irradiation for more than one exposure or duration, Mixed chimerism can be induced by radiotoxicity. Xenograft recipient Any person of the invention requiring irradiation of eg a primate eg a human recipient In the method, the irradiation can be applied in a single exposure, two or more exposures or Can be divided into durations. The sum of the divided doses is preferably a single irradiation Equal to the dose that produces mixed chimerism when given by (eg, rad or G y). These divided doses are preferably approximately equal. For example, 700 A single dose of rad is divided into two divided doses of 350 rads or 7 Can be replaced with fractionated dose. Altitude division of irradiation dose is also Can be used in the method. These fractional doses may be added on the same day Alternatively, they may be added at intervals of 1, 2, 3, 4, 5 days or more. Whole body irradiation, thymus illumination The projections or both can be split. As discussed herein, blood perfusion, for example, using blood perfusion with a donor organ, may be used. To deplete the host's natural antibodies. Depletes or inactivates natural antibodies Other methods of effecting can be used with any of the methods described herein. For example, drugs that deplete or inactivate natural antibodies such as deoxyspagarin (DSG) (Bristol) or anti-IgM antibody was applied to allograft or xenograft It can be administered to a pient. In the method of the present invention, DSG (or Similar drugs), anti-IgM antibodies and one or more of Natural antibodies can be depleted or inactivated. Concentration 6mg / kg / day Intravenous administration of DSG could increase the ability of natural antibodies to cynomolgus monkey kidney transplants in pigs It has been found to be useful in inhibiting function. Some of the methods described here use lethal irradiation to create a hematopoietic space, Prepare recipients for administration of heterologous genetically engineered stem cells. You. In any of the methods described herein (especially in primates or clinically) Hematopoietic space for the administration of such cells in a non-lethal manner. For example, sub-lethal irradiation (dose), administration of bone marrow depleting agents or antibodies It is desirable to build by. The use of sublethal levels of bone marrow depletion is Gives the generation of mixed chimerism in Mixed chimerism is generally Total or fatal exhaustion of bone marrow and subsequent recipients with administered stem cells It is suitable for complete reconstruction of the component. Other embodiments are within the following claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者サクス，デイビッドエイチ. アメリカ合衆国 02166 マサチューセッツ，ニュートン，ステューディオーロード 77 (72)発明者サイクス，メガンアメリカ合衆国 02129−4230 マサチューセッツ，ボストン，エイスストリート 197 ナンバー301 (72)発明者ベーチャー，マンフレッドアメリカ合衆国 01890 マサチューセッツ，ウィンチェスター，ポンドストリート 195──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI C12R 1:91) (72) Inventor Saks, David H. United States 02166 Massachusetts, Newton, Studio Road 77 (72) Invention Sykes, Megan United States 02129-4230 Massachusetts, Boston, Ace Street 197 Number 301 (72) Inventor Becher, Manfred USA 01890 Massachusetts, Winchester, Pond Street 195

Claims

[Claims] 1. A transgene encoding a graft-supporting protein or inheritance that is graft-antagonistic Genetically engineered to contain one or both of the transgenes Pig cells (provided that the transgene and / or Transgenes that block the effects of gene products that are graft antagonistic are non-primate M Other than the HC gene). 2. The transgene encoding the graft supporting protein is a human growth factor or The engineered gene of claim 1, which encodes a receptor for a cytokine. Pig cells. 3. G-CSF, SCF, G M-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, IL-2, Epo and Uterov 3. The genetically engineered probe of claim 2, wherein the genetically engineered probe is selected from the group of Cell. 4. The transgene encoding the graft-supporting protein is used for transplantation of hematopoietic cells. Genetic engineering according to claim 1, which encodes an adhesion molecule involved in and / or maintenance. Treated pig cells. 5. The human adhesion molecule is VLA-4, c-kit, LFA-1, CD11a. , Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD49 a, selected from the group of LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 and CD34 The genetically engineered porcine cell according to claim 4. 6. The transgene encoding the graft-supporting protein is administered to the recipient. Recipient or donor protein to block the immune response initiated by the donor cell The genetically engineered porcine cell of claim 1, which encodes white matter. 7. Said protein is selected from the group of IL-10, IL-4 or TGF-β; A genetically engineered porcine cell according to claim 6. 8. The transgene encoding the graft-supporting protein may be Recipient or donor protein that blocks the immune response initiated by the recipient The genetically engineered porcine cell of claim 1, which encodes white matter. 9. Said protein is selected from the group of IL-10, IL-4 or TGF-β; A genetically engineered porcine cell according to claim 8. 10. A transgene that blocks the action of the gene product is derived from the recipient Antisense RNA that blocks the expression or action of graft antagonistic proteins Transgenes; mutations in the gene encoding the donor graft antagonistic protein Differently inactivated copies that are endogenous when inserted into the donor genome A transgene that produces a gene (the endogenous gene is the endogenous genome of the gene Inactivated by mutation due to the introduction of a deletion in the copy); Or a tiger encoding an inhibitor of a graft antagonistic protein from the recipient A dominant negative mutation in a gene product that is graft-antagonistic; 2. The genetically engineered pig cell of claim 1, which is a transgene that encodes. Vesicles. 11. The integration of the transgene is responsible for the B-7 receptor of the donor cells. Knockout for puter, CD27 receptor or LFA-3 receptor The genetically engineered porcine cell of claim 10, which produces 12. Isolating said pig cells from cultured cells or transgenic animals; or 2. The genetically engineered porcine cell of claim 1, which is to be induced. 13. A nucleic acid encoding a graft support protein; or a gene product that is graft antagonistic Porcine promoter operably linked to a nucleic acid encoding a product that blocks the action of porcine (A transgene encoding a graft-supporting protein) And / or a transgene that blocks the effect of a gene product that is graft antagonistic Non-primate MHC genes). 14． The nucleic acid encoding the graft supporting protein is a human growth factor or a cytokine. 14. The transgene of claim 13, which encodes an in receptor. 15. The growth factor or cytokine receptor may be G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11 IL-2, Epo and Utero 15. The transgene of claim 14, wherein the transgene is selected from the group of receptors for ferrin. 16. The nucleic acid encoding the graft support protein may be used for hematopoietic cell inoculation and / or 14. The transgene of claim 13, which encodes an adhesion molecule involved in or maintenance. . 17． The human adhesion molecule is VLA-4, c-kit, LFA-1, CD11. a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD4 17. The method of claim 16, wherein the member is selected from the group of 9a, CD44, CD38 and CD34. Transgene. 18. The nucleic acid encoding the graft support protein is donated to the recipient. -Recipient or donor proteins that block the immune response initiated by the cells 14. The transgene of claim 13, wherein the transgene is loaded. 19. Said protein is selected from the group of IL-10, IL-4 or TGF-β The transgene of claim 18. 20. The nucleic acid encoding the graft-supporting protein is used as a recipe for donor cells. Co-administer a recipient or donor protein that blocks the immune response initiated by the recipient. 14. The transgene of claim 13, wherein the transgene is loaded. 21. Selecting said protein from IL-10, IL-4 or TGF-β; 21. The transgene according to claim 20. 22. A porcine transgene that blocks the effects of gene products that are graft antagonistic (but not However, this transgene is not a non-primate MHC gene). 23. The transgene is used to express a recipient-derived graft antagonistic protein. Or a transgene encoding an antisense RNA that blocks action; -Copy inactivated by mutation of the gene encoding the graft antagonistic protein That result in an endogenous gene when inserted into the donor genome (The endogenous gene is derived by introducing a deletion into the endogenous genomic copy of the gene. Transfer from the donor or recipient). A transgene encoding an inhibitor of a graft antagonistic protein; or a graft antagonist In transgenes encoding dominant negative mutations in gene products that are sexual 23. The transgene of claim 22, wherein 24. The integration of the transgene is responsible for the B-7 receptor of the donor cells. Knockout for puter, CD27 receptor or LFA-3 receptor 24. The transgene of claim 23, which produces 25. A transgene encoding a graft-supporting protein or a gene that is graft-antagonistic A cell having cells containing one or both of the transgenes that block the action of the gene product. Lancegenic pig. 26. The transgene encoding the graft support protein may be a human growth factor or 26. The transgenic gene of claim 25, which encodes a receptor for a cytokine. Cook pig. 27. The growth factor or cytokine receptor may be G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, IL-2, Epo and Utero 27. The transgenic pig of claim 26, wherein the pig is selected from the group of ferrin. 28. The transgene encoding the graft-supporting protein is used for transplantation of hematopoietic cells. 26. The transgenic cell of claim 25, which encodes an adhesion molecule involved in spreading and / or maintenance. Sgenic pig. 29. Said human adhesion molecule is VLA-1, c-kit, LFA-1, CD11. a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD4 9a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 and CD34. 29. The transgenic pig of claim 28, wherein said pig is selected. 30. The transgene encoding the graft-supporting protein is delivered to the recipient. A recipient or donor that blocks an immune response initiated by the donor cells 26. The transgenic pig of claim 25, which encodes a protein. 31. Selecting said protein from IL-10, IL-4 or TGF-β; 30. The transgenic pig according to claim 30. 32. The transgene encoding the graft-supporting protein binds to the donor cells. Recipient or donor to block the immune response initiated by the recipient 26. The transgenic pig of claim 25, which encodes a protein. 33. Said protein is selected from the group of IL-10, IL-4 or TGF-β A transgenic pig according to claim 32. 34. Said transgene acts as a recipient-derived graft antagonistic protein Transgene encoding an antisense RNA that blocks DNA; donor graft antagonism Copy that has been inactivated by mutation of a gene encoding a sex protein A transgene that, when inserted into the genome, produces an endogenous gene A gene is mutated by introducing a deletion into the endogenous genomic copy of the gene. Is more inactivated); a graft antagonistic protein from a donor or recipient Transgenes encoding white matter inhibitors; or inheritance that is graft antagonistic A transgene encoding a dominant negative mutation in the offspring product. 25. The transgenic pig according to 25. 35. The integration of the transgene is responsible for the B-7 receptor of the donor cells. Knockout for puter, CD27 receptor or LFA-3 receptor 35. The transgenic pig of claim 34, which produces 36. In the recipient mammal, the transplanted cells from the donor mammal A method of inducing tolerance, comprising: Introducing the donor hematopoietic stem cells into the recipient, and Introduce donor graft cells into recipient (Provided that at least one of the following conditions is satisfied: (1) These donor stem cells are: Desirable interaction between those donor stem cells and recipient cells or molecules (2) these donor stems Cells initiate unwanted interactions between the recipient and these donor stem cells. Genetically engineered to block; (3) these donor graft cells The vesicles are composed of their graft (and / or stem) cells and recipient cells or molecules. Has been genetically engineered to promote the desired interaction between (4) These donor graft cells were transferred to the recipient and these donor grafts ( And / or stem engineering to prevent unwanted interactions with cells In addition, the change due to genetic engineering of (1) or (2) If it is HC gene insertion, change the gene by other than MHC gene insertion One or both of the donor cells and / or cells in which genes other than hematopoietic stem cells have been altered. One to the recipient). 37. The donor stem cells may contain a transgene encoding a graft support protein. 37. The method of claim 36, comprising. 38. Donor graft cells block the action of gene products that are graft antagonistic 37. The method of claim 36, comprising a transgene. 39. The transgene encodes a human growth factor or cytokine receptor 38. The method of claim 37, wherein 40. The growth factor or cytokine receptor may be G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, IL-2, Epo and Utero 40. The method of claim 39, wherein the method is selected from the group of ferrin. 41. The transgene may be a contactor involved in the transplantation and / or maintenance of hematopoietic cells. 38. The method of claim 37, wherein the method encodes a landing molecule. 42. The human adhesion molecule is VLA-4, c-kit, LFA-1, CD11. a, Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD4 9a, LPAM-1, CD49d, CD44, CD38 and CD34. 42. The method of claim 41, wherein 43. The transgene is initiated by donor cells relative to the recipient. 4. Encoding a recipient or donor protein that blocks the resulting immune response. 7. The method according to 6. 44. Said protein is selected from the group of IL-10, IL-4 or TGF-β 44. The method of claim 43. 45. The transgene is initiated by the recipient against the donor cells. 4. Encoding a recipient or donor protein that blocks the resulting immune response. 7. The method according to 6. 46. Said protein is selected from the group of IL-10, IL-4 or TGF-β 46. The method of claim 45. 47. The transgene is used to express a recipient-derived graft antagonistic protein. Or a transgene encoding an antisense RNA that blocks action; -Copy inactivated by mutation of the gene encoding the graft antagonistic protein That result in an endogenous gene when inserted into the donor genome (The endogenous gene is derived by introducing a deletion into the endogenous genomic copy of the gene. Transfer from the donor or recipient). A transgene encoding an inhibitor of a graft antagonistic protein; or a graft antagonist In transgenes encoding dominant negative mutations in gene products that are sexual 39. The method of claim 38, wherein the method comprises: 48. The integration of the transgene is responsible for the B-7 receptor of the donor cells. Knockout for puter, CD27 receptor or LFA-3 receptor 48. The method of claim 47, wherein 49. 49. The recipient of claim 48, wherein the recipient is a human and the donor is a minipig. the method of. 50. Transplantation and / or repopulation of bone marrow of a heterologous recipient with donor pig hematopoietic stem cells Promotes proliferation, thereby inducing mixed chimerism in the heterologous recipient A method comprising: a donor stem cell and a recipient cell or molecule. Genetically engineered to promote the desired interaction between Genetic engineering to prevent undesired interactions between Prepared porcine cells (which may or may not be hematopoietic stem cells) Transplant the genetically engineered swine cells into a genetically engineered pig cell. If the hematopoietic cells are not porcine hematopoietic stem cells, transfer the porcine hematopoietic stem cells to the recipient as well. Planting, and this genetic engineering modification is other than MHC gene insertion) . 51. The genetically engineered porcine cells are used to encode graft supporting proteins. 51. The method of claim 50, comprising a transgene. 52. The genetically engineered porcine cells are used to generate gene products that are graft-antagonistic. 51. The method of claim 50, comprising a transgene that blocks action. 53. The transgene encodes a human growth factor or cytokine receptor 52. The method of claim 51, wherein 54. The growth factor or cytokine receptor may be G-CSF, SCF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11, IL-2, Epo and Utero 54. The method of claim 53, wherein the method is selected from the group of receptors for ferrin. 55. The transgene may be a contactor involved in the transplantation and / or maintenance of hematopoietic cells. 52. The method of claim 51, which encodes a landing molecule. 56. The human adhesion molecule described above was used for VLA-4, c-kit, LFA-LCD11a. , Mac-1, CR3, CD11b, p150, p95, CD11c, CD49 56. The method of claim 55, wherein the member is selected from the group of: a, CD44, CD38 and CD34. Law. 57. The transgene is initiated by donor cells relative to the recipient. 6. Encoding a recipient or donor protein that blocks the resulting immune response. 2. The method according to 1. 58. Said protein is selected from the group of IL-10, IL-4 or TGF-β 58. The method of claim 57. 59. The transgene is initiated by a recipient against donor cells. 6. Encoding a recipient or donor protein that blocks the resulting immune response. 2. The method according to 1. 60. Said protein is selected from the group of IL-10, IL-4 or TGF-β 60. The method of claim 59. 61. The transgene is used to express a recipient-derived graft antagonistic protein. Or a transgene encoding an antisense RNA that blocks action; -Copy inactivated by mutation of the gene encoding the graft antagonistic protein That result in an endogenous gene when inserted into the donor genome (The endogenous gene is derived by introducing a deletion into the endogenous genomic copy of the gene. Transplantation from donor or recipient A transgene encoding an inhibitor of a antagonistic protein; or graft antagonistic A transgene encoding a dominant negative mutation in the gene product 53. The method of claim 52, wherein 62. The integration of the transgene is responsible for the B-7 receptor of the donor cells. Knockout for puter, CD27 receptor or LFA-3 receptor 62. The method of claim 61, wherein 63. 52. The recipient of claim 51, wherein the recipient is a human and the donor is a minipig. the method of. 64. Therapeutic agents can be evaluated by evaluating their effect on transgenic pig cells. A method of identifying or testing, wherein the agent is administered to transgenic pigs. Assessing the state of the hematopoietic tissue of the animal, and comparing the state to that of a control animal. The above method, comprising comparing with: