JPH10505760A - 骨代謝マーカーをモニターする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 骨破壊マーカーを含む体液サンプルを持続的に採集し、さらに、骨代謝マーカーについて体液の成分を分析することによって骨代謝マーカーをモニターする方法。

Description

【発明の詳細な説明】 骨代謝マーカーをモニターする方法 技術分野 本発明は骨代謝マーカーを検出する方法に関する。より具体的には、本発明は 、骨代謝マーカーの存在について汗を採集し分析する方法に関する。 関連技術の説明 骨代謝疾患についてその有無、治療経過または症状をモニターするために用い られる従来の方法は、血液または尿サンプル中に見出される骨代謝マーカーの測 定を必要とする。このような方法の例は、米国特許第５２８３１９７号（Robins ）、米国特許第４９７３６６６号（Eyre）、および米国特許第５１４０１０３号 （Eyre）に示されている。これらのマーカーで最も普遍的に測定されるものには 、カルシウム、ヒドロキシプロリン、アルカリフォスファターゼ、プロコラーゲ ンＩ型およびその切断生成物、並びに骨コラーゲンペプチド（架橋アミノ酸を含 む）が含まれる。この架橋アミノ酸には、ピリジノリン、ヒドロキシリシルピリ ジノリン、リシルピリジノリン、ｎ−テロペプチド、および前者の分子を含むペ プチドが含まれる。 これらの分子は、骨吸収に続いて生成されることが分かっている特定のコラー ゲン分解生成物である。したがって、これらの架橋アミノ酸（骨代謝マーカー） の測定は、骨代謝疾患の指標を提供し、さらに種々の症状で見出される骨密度の 低下を減少させるための医療処置の経過をモニターする上で役立つ。 生物学的に興味深い他の多くの分子のように、架橋アミノ酸の産生は日周期性 サイクルで時間の経過にしたがって変化し^1,2,3、さらにその濃度はまた毎日変 化する⁴。個々の健常人のこれらコラーゲン分解生成物濃度の正常な生物学的変 動は、長期に及ぶ代謝による高レベルの骨破壊を特徴とする症状をもつと診断さ れた個々の患者で得られるこれら分子のレベルとほぼ等しい。そのような疾患に は、例えば骨粗鬆症^5,6、上皮小体機能亢進症^7,8、ページェット病^5,8、類リュ ーマチ性関節炎⁹、多発性ミエローマ¹⁰、腫瘍付随性高カルシウム血症¹¹、およ び骨関節炎^10,12が含まれる。上記に引用したロビンス（Robins）およびアイア ー（Eyre）の米国特許は、尿および血液サンプルを分析し、骨破壊の指標レベル を分析する方法を開示する。しかしながら、ただ１度の血液および尿サンプルの 採集は時間的にただ１点のみを表し、これらのマーカーに固有の濃度における正 常な日周期性および日々の変動のために、骨代謝マーカーのレベル変動があった としても全く発見することができないであろう。さらに、典型的にはこれら従来 の方法は、技術者（例えば血液サンプルを採取する者）による技術提供を必要と し、また場合によっては被験者が検査所、病院もしくは医院に赴き分析のための サンプルを提出する必要があるかもしれない。有意義な診断を可能にする十分な 検査結果を得るために、被験者が経時的な一連の分析用サンプルを提出しなけれ ばならないというようなことは煩わしいことであろう。すなわち、従来の方法で 得られる結果は時間的にただ１点のみを表示するので、偽陽性または偽陰性結果 を得る可能性を低くするためには、被験者は多数の血液もしくは尿サンプルを提 出しなければならないからである。この問題は不便な点の１つであるというだけ でなく、被験者にとって大きな負担となり、さらに誤診の可能性をはらむ。 従来の分析方法に付随する問題を克服するために、日周期性変動および日々の 変動による生物学的変動を排除する採集様式を導入することが必要である。これ は、骨破壊マーカー産生における生物学的変動の影響を減少させるために、持続 的で中断されず、そのために時間の経過を包括するという利点を有するより一層 有意義なサンプルの採集が可能な手段を提供することによって達成される。さら に、この方法はまた、偽陽性または偽陰性検査結果を減少させることによって検 査の診断能力を高めるであろう。 本発明は、従来の方法に付随する負担と不便さの幾つかを排除するだけでなく 、正確さの改善および長い間のある種の問題（例えば生物学的変動）を排除する ことによる性能の改善、それによって骨破壊マーカーの測定を一層有意義にさせ 、さらに骨吸収疾患の診断および治療におけるその重要性を大いに高めるという また別の利益をもたらす。本出願人は、生理的な骨破壊の指標となる骨代謝マー カー（コラーゲン分解生成物）が検出可能なレベルで汗に含まれることを見出し た。さらに、出願人は、ある時間中の汗のサンプルを採集することによって、よ り正 確で呼応する骨吸収評価を提供する定量可能な結果が得られることを見出した。 本発明は、発汗または汗の採集に皮膚パッチの使用を開示するが、これは架橋 アミノ酸の日周期性変動および日々の変動を最小にする分析のためのサンプルを 採集する。数日間に亙って採集された汗は、時間経過にしたがって総合すること によって生物学的変動の根源を最小にしたサンプル中に蓄積され、骨破壊マーカ ーの測定を一層有意義な値にし、それによって疾患の診断および治療におけるそ の重要性を高める。皮膚パッチの使用はまた、診療所、医院または家庭で実施で きる標本採集手段を提供し、したがて骨代謝疾患の治療方法の有効性をモニター するために適切で、したがって骨疾患の開始または進行のスクリーニングに用い ることができる。 発明の要旨 本発明にしたがって、骨代謝マーカーを含む体液サンプルを持続的に採集し、 当該骨代謝マーカーについて当該体液の組成物を分析することによって、骨代謝 マーカーをモニターする方法が提供される。 図面の簡単な説明 本発明のその他の利点は、添付の図面と合わせて下記の詳細な説明を参考にす ることによって容易に理解されよう。当該図面は下記のとおりである。 図１は、皮膚パッチに付着したピリジノリンの抽出回収を示すグラフである。 ここで、ピリジノリンは免疫アッセーで２０、５０および８０％結合と概算され る濃度で各パッチに配置された（ｎ＝２）。 図２は、ピリジノリン回収における日光の影響を示す棒グラフである。ピリジ ノリンは、１００（斜線棒）または５００ｆｍｏｌ／ｍＬ（白色棒）で２組のパ ッチに添加された。データは予想回収から算出される。 図３は、汗のサンプル中のピリジノリン測定に対するサンプルろ過の影響を示 すグラフである。志願者に１日から７日間張り付けた皮膚パッチを抽出し、抽出 物を回転ろ過し（横軸）またはろ過しないで、ピリジノリンを分析した。４回の 別々の実験から得られた結果をまとめた；ｎ＝２２サンプル、 回帰直線ｙ＝−０.０１４＋１.０２ｘ；ｒ＝０.９８。 図４は、身体の異なる部位の汗のピリジノリンの回収を示す棒グラフである。 パッチは各人の躯幹（斜線棒）および四肢に同時に３日から５日間貼付し、各測 定は２組で実施した。 図５は、年令の関数におけるピリジノリンの分泌の関係を示すグラフである。 パッチは２５人の被験者（女：丸、男：四角）に貼付された。 図６は、時間の関数としてピリジンの濃度の関係を示すグラフである。ピリジ リンは種々の時間貼付された皮膚パッチに採集された。パッチは背中に貼付され 、ピリジノリンについて抽出分析された。 図７は、時間の関数におけるクレアチニンの濃度の関係を示すグラフである。 皮膚パッチは６人の被験者に同時に１−７日間貼付され、続いて抽出され、各抽 出物についてクレアチニンを測定した。 図８は、時間の関数における汗に集められた尿素の濃度の関係を示すグラフで ある。皮膚パッチは６人の被験者に同時に１−７日間貼付され、続いて抽出され 、各抽出物について尿素を測定した。 図９は、時間の関数における汗に集められたカリウムの濃度の関係を示すグラ フである。皮膚パッチは６人の被験者に同時に１−７日間貼付され、続いて抽出 され、各抽出物についてイオン選択電極を用いてカリウムを測定した。 本発明および利点の詳細な説明 本発明は、ある時間の間持続的に採集した体液サンプル中の骨代謝マーカーを モニターする方法を提供する。換言すれば、本発明は、骨破壊もしくは骨吸収を 伴う疾患を示唆する、または正常な骨代謝（すなわち正常な骨の成長および死） レベルを示すマーカーを含む汗のサンプルを採集するために、体液（例えば汗） をある時間に亙って採集する方法を開示する。続いて採集した汗のサンプルを分 析し、骨代謝のこれらのマーカーの存在を決定し、それによって可能性のある疾 患または症状を確定することができる。 体液の持続的採集とは、ある与えられた時間の間中断されずに体液を採集する ことを意味する。言い換えれば、体液サンプルは、サンプル採集で一切の間隙ま たは中断なしにある時間に亙って採集される。これは、サンプルが採集された時 点のみに対応する典型的な血液もしくは尿サンプルとは異なる。持続的で中断さ れない体液の採集は、ある時間の間対応するサンプル分析を可能にし、したがっ て日周期性変動および他の時間経過中の変動を減少、排除または制御することが できる。 １週間に及ぶ分析のための汗の持続的で中断されない採集は、新規であり、さ らに１週間に及ぶ尿の全サンプルを採集するよりも煩雑さは幾分少ない。汗の持 続的で中断されない採集は、被験者の一切の関与なしに実施され、したがって被 験者のコンプライアンスは大いに強化される。言い換えれば、被験者が実施しな ければならないことの全ては、採集装置を貼付するか、またはサンプリング期間 の開始時に採集装置を貼付してもらい、当該採集装置を処方された採集期間の間 使用することである。装置の貼付後、該被験者は、普通に活動すること以外何も 要求されない。全尿サンプルを採集したり、または連続的な血液サンプリングと 異なり、被験者は、当該装置の貼付のために採集期間の開始時に、さらに取り外 しおよび装置に採集されたサンプルの分析のために採集期間の終了時にかかりつ けの医師を訪れることを要求されるだけである。また別には、被験者はかれら自 身で該装置を貼付および／または取り外すことができる。したがって、このよう な被験者の最低限の関与によって、サンプルの採集およびその分析について被験 者のコンプライアンスは大いに高められる。 発汗とは、汗腺の分泌活動による汗の機能的分泌と定義される。汗は汗腺によ って分泌される液体で、主として水および塩化ナトリウムを含む。しかしながら 、汗は、微量ではあるが検出可能な量で存在する他の化合物もしくは分析物、例 えば尿素、アルブミンおよび骨代謝マーカーもまた含む。 一般には、汗のサンプルを採集するために汗採集装置が被験者に貼付される。 この汗採集装置は、汗または発汗の採集に適した何れの装置でもよく、この装置 はまた、該装置内に配置された吸収性パッド内に捕捉され、または付着した非揮 発性物質のみを残し、水分（すなわち水）が該採集装置から蒸発することができ るようにデザインされる。すなわち、汗または発汗速度をより正確に維持するた めに、該採集装置は、汗の水分を通常のように蒸発させることを可能にしなけれ ばならない。汗の正常な蒸発またはその周辺環境による皮膚のガス交換に変化を 与えるいずれの採集装置も、該採集装置の貼付によって創り出された人工的環境 に対する異常なもしくは誘導せられた皮膚の生理的反応のために、不正確なデー タを誘導または生じる可能性があるだろう。 典型的な汗の採集装置は、吸収性パッド（例えば木綿のガーゼ、合成パッド、 他の浸透性材料、毛細管）または皮膚パッチ装置を含むことができるが、後者は 、例えば米国特許第４９５７１０８号、５０７６２７３号および５２０３３２７ 号（いずれもSchoendorferら、さらにいずれもSudor Partner Inc.，に譲渡）に 記載されたようなものである（この文献は全て参照によって本明細書に含まれる ）。これらの特許に開示された汗採集装置は全て経皮的な汗採集装置であり、皮 膚を介して滲出した体熱（能動的）および大気による蒸発（受動的）の影響下に 水分画の主要部分を能動的および受動的に排除することによって、パッチ内に採 集され濃縮されるべき体液中の１つまたは２つ以上の皮膚を介して滲出する分析 物の採集が可能である。前述のまた別の方法では、これら汗採集装置は、液体の 正常な蒸発および周辺大気による皮膚のガス交換を可能にしつつ汗の中に存在す る分析物の回収を可能にする。 シェーンドーフ（Schoendorfer）らの参考文献に開示された装置の各々は経皮 的な汗採集パッチについて言及するが、これは、採集された汗のサンプル中に存 在する分析物の採集のための吸収性パッドを含む。このパッドは、粘着物（例え は粘着テープまたは当業者に既知の他の手段）の手段によって被験者に付着され る。汗のサンプル中に存在する分析物は該吸収性パッドに沈積し、汗の水性およ び揮発性成分は蒸発と周辺環境による正常なガス交換によってそれぞれ排除され る。 汗採集パッチは皮膚の準備された領域に貼付され、予め処方された期間被験者 に適用される。 パッチを十分な期間貼付した後、このパッチを被験者から取り外し、分析のた めに調製する。吸収性パッドを粘着性背当てから分離し、吸収性パッドを真空デ シケーターに入れ均質な脱水を確保して分析に備える。続いて、分析物（すなわ ち骨代謝マーカー）は適切な抽出緩衝液で吸収性パッドから抽出され、下記に述 べる方法によって骨代謝マーカーを含む分析物はパッド領域から取り除かれる。 骨代謝マーカーは、正常または異常な骨の成長および／または死の間に生じる か、または放出される一切の生成物を含むと解される。骨代謝のこれらのマーカ ーは、病的状態と同様に正常な健常状態を決定するために用いられる。骨代謝マ ーカーは、架橋アミノ酸（例えばピリジノリン、ヒドロキシリシルピリジノリン 、リジルピリジノリン、置換ピリジノリン、ｎ−テロペプチド、プロコラーゲン Ｉ型およびその切断生成物並びにオステオカルシン）を含む一群の中のいずれで もよい。本発明の方法で用いる好ましいマーカーはピリジノリンおよびｎ−テロ ペプチドであるが、その理由は、それらが骨吸収を示すことが分かっている化合 物であり、さらにそれらは骨吸収疾患を明らかにする検出可能量で汗の中に存在 するからである。 骨代謝マーカー（すなわちピリジノリン）を吸収性パッドから抽出した後、骨 代謝マーカーを含む抽出物を酵素免疫アッセー（ＥＩＡ）または当技術分野で周 知の他のいずれかの方法によって分析する。この後者の方法は、骨破壊マーカー の濃度を定量的に決定するために、さらに骨代謝マーカーの存在を定量的に決定 するために、所望のマーカーの存在を定量的および定性的に検出できる方法であ る。 与えられた汗のサンプル中に存在する骨破壊マーカーの濃度をより正確に決定 するために、汗の容量は、同時に採集した汗の中の参照マーカー濃度を被験者の 汗のサンプルとともに定量的に分析することによって標準化される。この参照マ ーカーは、比較的一定でさらに既知の速度で経皮的に分泌される何れの分析物で もよい。そのような参照分析物は、典型的にはクレアチニン、尿素、カリウムま たは一定の速度で分泌される他の一切の分析物を含む。特定の参照マーカーの濃 度を定量的に測定することによって、ある採集期間に経皮的に分泌された汗の容 積を決定することができる。この期間中に分泌される汗のおおよその容積を知る ことによって、採集された汗の正確な見積もりが提供され、それによって当該サ ンプル中に存在する骨破壊マーカー濃度の正確な計算が可能になる。したがって 、骨破壊マーカーの濃度についての（ある期間中の総合された）定量値が得られ るが、これは日周期性変動および日々の変動を含まない。この方法は、持続的で 中断されないある期間中のサンプルの採集を提供し、これは例えば血液または尿 分析のような“一時点”サンプリングに付随する不明確さおよび変動性を排除す る。 実施例 材料および方法 ¹ 試薬 燐酸ナトリウム、チメロサール、トリトンＸ−１００、トウィーン２０並びに クレアチニンおよび尿素測定用アッセーキットは、シグマケミカル社（Sigma Ch emical Co.，セントルイス、ミズーリ）のものである。サンプルの浸透圧は、蒸 気圧浸透圧計（Wescor model 5500，Logan UT）を用いて測定した。汗のサンプルの採集 皮膚パッチを貼付する皮膚領域を滅菌アルコールプレップパッド（Profession al Disposables，Inc.，オレンジバーグ、ニューヨーク）で〜３０秒拭い、パッ チを貼付する前にさらに皮膚を完全に乾燥させた（〜２分）。皮膚パッチの粘着 性パッドに触れないように常に注意をはらった。皺にならないように皮膚を微か に伸ばしてパッチを貼付した。各パッチを準備した領域に配置し、中央から周辺 に向けて平坦にした。皮膚パッチ貼付時間を記録した。パッチは典型的には２４ 時間間隔（±１／２時間）で取り外した。パッドを粘着性背当てから外し、プラ スチックバッグに４°Ｃで保存した。 （¹：略語：ＥＢ、抽出緩衝液（１０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ7.4）、０.０２％チメ ロサール、0.1％トリトンＸ−１００）；ＰＹＤ、ピリジノリン）抽出 皮膚パッチ（Sudormed，Inc.，サンタアナ、カリフォルニア）を一晩デシケー ターで乾燥させ、均質な脱水を確保した。このパッチを３ｍＬの注射筒（Becton Dickinson Company，ラザフォード、ニュージャージ）に1.0ｍｌ（1.0−2.5ｍ ｌ）の抽出緩衝液（ＥＢ；１０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ7.4）、０.０２％チメロサ ール、０．１％トリトンＸ−１００）とともに入れた。この注射筒を暗所で平板 回転攪拌器上で１８０ｒｐm、３時間室温で攪拌し、抽出物を分析のため放出さ せた。パッチ抽出物を0.1μｍのワットマン（Clifton，ニュージャージ）スピン フィルターを通して２０００×ｇで１０分遠心ろ過した。抽出物は４°Ｃで暗所 で保存した。皮膚パッチからの回収 ピリジノリンとクレアチニンを含む溶液１００μＬ分を２組の皮膚パッチに加 えた。このパッチを一晩真空デシケータで乾燥させ、続いて1.0ｍＬのＥＢで抽 出した。サンプルをピリジノリンについてはＥＩＡで、クレアチニンについては アルカリ性ピクラートを用いて分析した。分析方法 汗の中のピリジノリンは、血清中のピリジノリンを測定するためにデザインさ れた酵素免疫アッセーキットを改変して求めた（Special Edition Collagen Cro sslink^TMKit; Metra Biosystems，Inc．マウンテンビュー、カリフォルニア）。 このキットの標準ピリジノリンおよびコントロールを抽出緩衝液で５００倍に希 釈した。被覆したマイクロリットルウェルで１００μＬ（５０−２００μＬ）の 標準物質、コントロールまたはサンプルを、５０μＬの一次抗体と４°Ｃで一晩 反応させた。ウェルを洗浄した後、１５０μＬの二次抗体−酵素共役物を添加し た。室温で１時間保温した後、ウェルを洗浄して１５０μＬの基質（ｐ−ニトロ フェノール）溶液を添加した。１時間保温した後、４０５ｎｍでの吸収をプレー ト読み取り装置（Titertek Multiskan Plus，ICN Biomedicals，コスタメサ、カ リフォルニア）で求めた。クレアチニン クレアチニンは、ジャフ（Jaffe）反応（アルカリ性ピクラート；Metra Biosy stems，マウンテンビュー、カリフォルニア）を用いる通常の臨床検査を少し変 更して測定した。標準クレアチニンは、１０、１００および１０００倍に希釈し 、汗のサンプルに見出される低レベルの分析物を含ませた。マイクロリットルウ ェルに５０μＬの標準物質またはサンプルおよび１００μＬのアルカリ性ピクラ ートを入れ、タイターテック（Titertek）プレート読み取り装置で４９２ｎｍで の吸収を測定した。尿素 尿素窒素アッセーキット（シグマ）を用いて汗のサンプル中の尿素とアンモニ アの両方を、尿素をアンモニアと二酸化炭素に加水分解して測定した。サンプル をウレアーゼと反応させ、続いて次亜塩素酸塩とフェノールとを反応（この反応 はニトロプルシドナトリウムの存在下で青色の発色団インドフェノールを形成す る）させることによって、尿素およびアンモニアの全濃度（Ｔ）を測定した。イ ンドフェノールは６００ｎｍの吸収で定量した。アンモニア（Ａ）は同じ反応系 でウレアーゼを省略することによって測定した。尿素加水分解前のサンプル中の 尿素の量は、アンモニアおよび尿素の両方について見出された総量からアンモニ アの値を差し引いて算出した（Ｕ＝Ｔ−Ａ）。カリウム 汗の中のカリウムは、イオン特異的電極（Cole Parmer Instrument Company， ナイルズ、イリノイ）の手段によって求めた。この電極は、カリウム標準物質の 1.0ｇ／Ｌ希釈（Cole Parmer）に対して目盛りを付した。 結果 未貼付皮膚パッチに付着させたピリジノリンの回収 パッチ抽出物中のピリジノリンの回収は、パッチをＥＢで抽出したときほぼ定 量的であった（図１）。トリトンＸ−１００の代わりに0.1％トウェーン２０を 用い、さらに緩衝液を省略した場合にもまた同様な結果が得られた。緩衝液の安 定化作用およびトリトンＸ−１００の免疫アッセーに対する非緩衝性（データは 提示せず）ゆえに、基準方法として我々はＥＢを選んだ。 アッセー妨害の原因 低レベルまたは高レベルのピリジノリンもしくは参照マーカーが、サンプルの 不安定性、汚染または他のアッセー妨害のために人為的に測定される可能性があ る。極めて有力なエラーの原因には以下が含まれる：ａ）紫外線によるピリジノ リンの光分解；ｂ）分析物レベルのに対する皮膚酵素または細菌の作用；および ｃ）剥がれた表皮の測定に対する影響。光分解の排除 ピリジノリンをパッチに付着させ、これに続いて直射日光に２１時間曝した（ 図２）。アルミホイルで日覆いをかけたパッチは分析物の顕著な消失は生じなか った。非被覆パッチのピリジノリンの殆どは失われ、薄い布で覆われたパッチは ピリジノリンを完全には保護しなかった。したがって、汗の中のピリジノリンを 測定するためには、皮膚パッチは、ピリジノリンの光分解を防ぐために紫外光 に対して不透明な材料層を含ませる必要がある。細菌作用の影響 皮膚パッチに蓄積される化合物は、微生物の増殖に有利な条件に曝される。細胞の残骸の影響 ピリジノリンは種々の組織のコラーゲンで見出されるが、皮膚には認められな かった。皮膚にはコラーゲンが存在しない可能性があるが、一方、パッチに採集 される細胞の残骸は非特異的にピリジノリンアッセーを妨害する可能性がある。 そのようなアッセー妨害の有無について調べるために、皮膚パッチを志願者に貼 付し、このパッチを抽出し、抽出物の適量をワットマンニトロセルローススピン フィルター（0.1μｍ）でろ過し、ピリジノリンについてアッセーした。ろ過お よび非ろ過サンプルを比較した結果（図３）は、抽出物中の蛋白および細胞の残 骸による顕著なアッセー妨害は存在しないであろうということを示唆した。算出 値の平均は、非ろ過サンプルについては測定値の１０３％である。汗のサンプル中のピリジノリンの測定 ピリジノリンレベルは身体の位置に依る。躯幹（腹部および背中下部）および 四肢（上腕および大腿）に貼付した皮膚パッチに採集された汗のピリジノリンレ ベル。検査した被験者の全員で、ピリジノリン量は、四肢に貼付したパッチより 躯幹に貼付したパッチで多かった（図４）。年令によるピリジノリンレベル 種々の被験者（２才から５０才）から採集した汗でピリジノリンレベルを測定 した。全ての事例で、皮膚パッチを背中の下部に貼付した。ピリジノリン量は幼 い子供で高く、成人では女性がとりわけ高かった（図５）。パッチ接触時間によるピリジノリンレベル より長時間貼付された皮膚パッチはより多くのピリジノリン量を蓄積する（図 ６）。すべての事例で、皮膚パッチは背中の下部に貼付された。ピリジノリンの 蓄積速度は多くの事例で同様であった。参照マーカーの測定 ３つの候補化合物、クレアチニン、尿素およびカリウムが、汗の中でのその高 い濃度と種々の発汗速度における比較的一定の濃度のゆえに選択された。これら の分析物のいずれも汗の容積マーカーとして十分ではなく、検査の必要がある他 の物が存在する可能性はあるが、それは十分なデータが集められた後で初めて明 らかになるであろう。これらの分析物に加えて、汗の容積の指標としてパッチ抽 出物の比重の有用性が調べられるであろう。汗の中のクレアチニン 汗の中のクレアチニンは、パッチ貼付時間の増加に合わせて急速に増加するこ とはなかった。（図７）。汗の中の尿素 尿素量は、検査した全ての個々人でほぼ同じ速度で増加し、パッチを５日以上 貼付したとき平坦になった（図８）汗の中のカリウム 尿素のように、数人の被験者の汗のカリウムレベルはパッチの貼付時間ととも に増加し、パッチを５日以上貼付したときカリウムの蓄積は降下した（図９）。 本発明は例示として説明され、使用した用語は制限のためではなくむしろ種類 を明示することを意図していることは理解されよう。 明らかに、上記の教示を基に本発明には多くの修飾および変更が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルードニック エレン アメリカ合衆国 イリノイ州 60015 デ ィアフィールド ウッドランド レーン 1316

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．骨代謝マーカーを含む体液サンプルを持続的に採集し、さらに当該骨代謝マ ーカーについて当該体液の成分を分析することによって骨代謝マーカーをモニタ ーする方法。 ２．当該採集工程がさらに以下のように規定される、当該体液が汗または発汗で ある請求の範囲第１項に記載の方法： 骨破壊を表示する成分を含む汗のサンプルを被験者から採集し、さらに 骨代謝マーカーについて汗の成分を分析する。 ３．採集された汗のサンプルの容積を標準化する工程をさらに含む請求の範囲第 ２項に記載の方法。 ４．当該標準化工程が、被験者から採集した汗の中の参照マーカーの濃度を定量 的に分析することをさらに含む請求の範囲第３項に記載の方法。 ５．参照マーカーが、クレアチニン、尿素、カリウム、またはその濃度が種々の 発汗速度で比較的一定である化合物と定義される他の適切なマーカーから成る群 から選ばれる請求の範囲第４項に記載の方法。 ６．骨代謝のマーカーが、ピリジノリン、ヒドロキシリシルピリジノリン、リシ ルピリジノリン、置換ピリジノリン、ｎ−テロペプチド、プロコラーゲンＩ型お よびその切断生成物並びにオステオカルシンから成る群から選ばれる請求の範囲 第１項に記載の方法。 ７．汗を採集する当該工程が、被験者に汗採集手段を適用することをさらに含む 請求の範囲第２項に記載の方法。 ８．当該汗採集手段が、皮膚パッチ、吸収性パッド、または毛細管から成る群か ら選ばれる請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．当該分析工程が、採集液から骨代謝マーカーを抽出することをさらに含む請 求の範囲第１項に記載の方法。 10．当該分析工程が、骨代謝マーカーの濃度を定性的および定量的に決定する工 程をさらに含む請求の範囲第９項に記載の方法。 11．当該定性的および定量的に骨代謝マーカーの濃度を決定する工程が、酵素免 疫アッセー技術を用いることをさらに含む請求の範囲第１０項に記載の方法。 12．被験者から汗のサンプルを採集する汗採集装置を用いる方法であって、当該 汗のサンプルが骨破壊を表示する成分を含み、さらに骨代謝マーカーについて当 該汗の成分を分析する、前記汗採集装置を用いる方法。