JPH10502539A

JPH10502539A - Mutation analysis based on sequence of neoplastic tissue for diagnosis or prognosis of neoplasia

Info

Publication number: JPH10502539A
Application number: JP8504936A
Authority: JP
Inventors: ビューバーテル，マーガレツト; リンドストレーム，ペル; インガネス，マツツ
Original assignee: フアーマシア・バイオテツク・アー・ベー
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-06-29
Publication date: 1998-03-10

Abstract

(57)【要約】ヒトの腫瘍性組織、血液または他の体液サンプルの配列に基づく診断方法であって、該腫瘍新生から誘導されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの、癌関連タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を分析して突然変異の有無を調べ、該突然変異の存在、性質および位置の対応するタンパク質の生物学的機能に対する影響、ならびにそれによる腫瘍新生の特性に対する影響を分析し、それに基づいて腫瘍新生の進行を予示することを含む。 (57) [Summary] A diagnostic method based on the sequence of a human neoplastic tissue, blood or other bodily fluid sample, comprising the steps of: analyzing the DNA sequence of a gene encoding a cancer-associated protein in genomic DNA or cDNA derived from the neoplasia; Investigate the presence or absence of the mutation and analyze the effect of the mutation on the presence, nature and location of the corresponding protein on the biological function of the corresponding protein, and thereby on the properties of oncogenesis, and predict the progression of oncogenesis based thereon Including doing.

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍新生の診断または予後判定のための腫瘍性組織の配列に基づく突然変異分析発明の技術分野本発明は、癌の診断分野に関する。特に、本発明は、腫瘍新生（neoplasia）サンプルから得られる癌関連遺伝子における変化の検出およびその予後判定目的のための使用に関する。発明の背景乳癌は、女性に最も一般的な癌である。乳癌は遺伝する傾向があることが認められているが、多くの場合は、予測できない後天性の体細胞突然変異が原因である。今日、女性が乳癌であると診断されるとき、その成り行きの予示に関しては根源的に議論の余地がある。すなわち、女性の乳房に病変が発見されると、癌か否かの診断は、腫瘍およびその周辺の組織の形態学的変化に基づいて行われる。しかし、医師による治療の選択は、予後または成り行きによりかなり影響を受ける。予後の判定因子は、二つに分けることができる。すなわち、生物学的因子および時間的因子である。生物学的因子の測定としては、腫瘍の針生検による細胞学的検査が挙げられる。免疫組織化学染色は、ホルモン受容体の有無および量を調べるのに使用され、ＤＮＡ標識法は、細胞およびＤＮＡ合成におけるＤＮＡの量を定量する。時間的因子としては、腫瘍の大きさおよび腋窩の結節性状態があり、後者は、乳癌の管理における伝統的な予後評価因子である。癌を診断する場合、20〜30個のリンパ節を外科的に取り出し、癌細胞を含むリンパ節の数を数える。一定の数（例えば、５個）より多いリンパ節が認められると、患者に外科的な根治的治療および放射線／多化学療法またはその両方を行う。生物学的因子は、治療決定にますます使用されているが、リンパ節の状態は、依然、生物学的予後判定因子の予示能力を評価するための基準となっている。腋窩のリンパ節を含む乳癌患者は、予後が比較的悪いと考えられる。これは、一部には、腫瘍を調べる時間的段階に関係なく、腫瘍の攻撃性および／または転移性に影響を及ぼす他の生物学的因子による。しかし、最近の知見によると、リンパ節転移の存在および範囲は、腫瘍の攻撃性または転移性とほとんど関係なく、それは、もっぱら腫瘍が比較的進行していることを反映することを示唆している。病気の成り行きにより関係のある予後判定因子がない場合、ほとんどの医師は、臨床的または時間的因子とともに、40年以上にわたって使用されている因子である顕微鏡による腫瘍の形態学的段階に依然頼っている。従って、攻撃性および転移性における生物学的状態のより正確な指標が早期診断で利用できることが必要である。利用できれば、医師は、より早期に、より正確に、患者を治療するための処置をとるこができる。すなわち、転移性のある小さい腫瘍が、再発を待つのではなく、初期の診断からすでに根治的方法により治療され得る。さらに、転移性のある腫瘍がなく、再発の可能性も非常に小さいか無い患者は、より温和な方法で治療することができる。ここ２、３年の研究は、遺伝的突然変異と癌の発生および進行との間の相関関係を見い出すことに努力が払われている。これに関する興味ある遺伝子の種類は、腫瘍抑制遺伝子であり、これは、その機能喪失突然変異が腫瘍性である遺伝子として定義される。そのような遺伝子の野生型対立遺伝子は、腫瘍性を妨害または抑制するように機能すると考えられる。そのような遺伝子の例はｐ５３遺伝子であり、その染色体１７ｐに腫瘍抑制タンパク質ｐ５３がコードされている。ｐ５３遺伝子における突然変異は、ヒトの全ての癌の約半分に存在し得る。ｐ５３遺伝子における突然変異との相関関係が強いことが分かっている癌は、例えば、乳癌および結腸癌である。乳癌、結腸直腸癌または肺癌などのヒトの腫瘍新生または癌を、腫瘍性であると疑われるサンプル中の野生型ｐ５３遺伝子の減少を検出することにより診断する方法が、 EP-A-390323に開示されている。腫瘍抑制遺伝子を不完全にする突然変異の種類は、種々の腫瘍抑制遺伝子間で変わる。すなわち、例えば網膜芽腫において不完全である腫瘍抑制遺伝子は、通常、タンパク質の切断および不安定性を引き起こすナンセンス突然変異によって不活性化されるが、ｐ５３における突然変異の約７０％は、アミノ酸の同一性に変化を与えるミスセンス突然変異である。そのようなアミノ酸の変化は、立体配置を変え、従ってｐ５３の安定性を変え、ｐ５３の配列特異的ＤＮＡ結合および転写因子活性を間接的に変え得る。最近の研究から、ｐ５３はＤＮＡ修復機構の制御において重要な役割を果たし、修復が完了するまで細胞分割前のＤＮＡ複製を止めることが分かった。また、遺伝子には突然変異をより受けやすい多発箇所があるが、突然変異は、一般に、その多発領域内で無作為かつ自然にもたらされることも分かっている。乳癌に関する限り、生存とｐ５３突然変異との間には相関関係が認められている。すなわち、Thorlaciusら、Cancer Res．53（1993）1637-1641 は、ｐ５３突然変異がある乳癌の女性は、ｐ５３突然変異のない女性より死亡する危険性が３倍以上高いことを報告している。しかし、上記の生存との相関関係の他に、乳癌および他の腫瘍におけるｐ５３突然変異の分析による他の点での臨床パラメーターおよび予後との相関関係の確立はなされていない。発明の要旨本発明の目的は、病気の正確な予後判定を可能とし、それによって、医師が測定した腫瘍の生物学的状態に関して患者を分類するのを可能とし、その分類に応じて、特に早期診断において適切な治療を提供するために、攻撃性および転移性型の生物学的状態に関するｐ５３遺伝子などの癌関連遺伝子の可能な突然変異の検出に基づいて、ヒトの腫瘍性組織、血液または他の体液のより信頼できる診断方法を提供することである。本発明によれば、患者のヒト腫瘍新生サンプルを癌関連遺伝子の突然変異の位置および性質に関して測定することにより、患者の成り行きに対する検出された変化の重さを評価することができ、それに適する治療を施すことがてきる。特に関係あるのは、タンパク質の生物学的に機能するドメインをコードする遺伝子のそのような部分おける突然変異の位置および性質の検出である。従って、本発明は、組織、血液または他の体液サンプル（例えば、尿、唾液）におけるヒト腫瘍新生を診断する方法を提供し、該方法は、該腫瘍新生から誘導されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの、癌関連タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を分析して突然変異の有無を調べ、該突然変異の存在、性質および位置の対応するタンパク質の生物学的機能に対する影響、ならびにそれによる腫瘍新生の特性に対する影響を分析し、それに基づいて腫瘍新生の進行を予示することを含み、患者の適切な治療に対する指針を提供する。本発明で使用する「癌関連遺伝子」は、その突然変異が腫瘍新生または癌の進行と相関すると考えられる遺伝子を意味する。そのような遺伝子は、一般に、抑制タンパク質などのＤＮＡ複製サイクルに関与するタンパク質、増殖誘発タンパク質などのオンコゲンおよび調節タンパク質などのタンパク質をコードする。そのような遺伝子の例は、上記したｐ５３遺伝子の他に、タンパク質ＷＡＦＩ、ｅｒｂＢ− ２（HerII/Neu）、ｐ１６（ＭＴＳ I）、ＭＴＳ II、ＭＬＨ１＆２およびＲａｓをコードする遺伝子がある。検出される突然変異としては、点変異、欠失および挿入ならびに多形性が挙げられる。本発明はまた、ｐ５３ゲノムおよびｃＤＮＡの各々の増幅および配列分析のための特異的プライマーを提供する。図面の簡単な説明図１は、ｐ５３タンパク質の図式化図であり、進化保存領域ならびにトランス作用活性化(transactivation)ドメイン（Ａ）、ＤＮＡ結合ドメイン（Ｂ）およびオリゴマー化領域（Ｃ）の位置を示す。図２は、整列されたコード領域を有するｐ５３ｃＤＮＡならびに下記実施例１で使用された、増幅され配列分析した重複のある４個の断片の図式化図である。断片１〜４において、プライマーは「←」で示される。「Ｂ」はビオチニル化プライマーを示し、「Ｓ」はシークエンスプライマーを示す。図３は、図２と同様の図式化図であるが、断片およびプライマーが異なる。これらも下記実施例１で使用する。図４は、（ｉ）アジュバント治療を受けた、および（ii）該治療を受けなかった、ｐ５３突然変異のない結節陰性乳癌患者の手術後の再発のない生存を示すグラフ（「生存プロット」）である。図５は、ｐ５３突然変異のある結節陰性乳癌患者に対する図４と同様のグラフである。図６は、（ｉ）ｐ５３突然変異のある、および（ii）ｐ５３突然変異のない、結節陽性乳癌患者の手術後の再発のない生存を示す図４と同様のグラフである。図７は、（ｉ）局所放射線治療を受けた、および（ii）該治療を受けなかった、ｐ５３突然変異のない結節陰性乳癌患者の手術後の再発のない生存を示すグラフ（「生存プロット」）である。図８は、ｐ５３突然変異のある結節陰性乳癌患者についての図７と同様のグラフである。図９は、保存領域 II にｐ５３突然変異のある乳癌患者と保存領域の外側に突然変異のある乳癌患者との手術後の再発のない生存を示すグラフ（「生存プロット」）である。図１０は、保存領域 IIIにｐ５３突然変異のある乳癌患者と保存領域の外側に突然変異のある乳癌患者との図９と同様のグラフである。図１１は、保存領域 IV にｐ５３突然変異のある乳癌患者と保存領域の外側に突然変異のある乳癌患者との図９と同様のグラフである。図１２は、保存領域Ｖにｐ５３突然変異のある乳癌患者と保存領域の外側に突然変異のある乳癌患者との図９と同様のグラフである。図１３は、多くの乳癌患者のｐ５３のコード配列における突然変異の位置を示す棒グラフである。棒の高さは、各突然変異を有する患者の数を示す。図１４は、結節陰性患者に対する図１３と同様の棒グラフである。関連する場合の乳癌の再発（○）および死亡（○）もこのグラフに示す。図１５は、結節陽性患者に対する図１４と同様の棒グラフである。発明の詳細な説明ｐ５３タンパク質構造およびそこに検出される種々の突然変異は、とりわけ、Harris，C.，Science 262（1993）1980-1981に記載されている。そこに示されるように、ｐ５３は、トランス作用活性化ドメイン、オリゴマー化ドメインおよび５個の進化的な保存領域を有する。Yunje，C．ら、Science 26 5（1994）346-354は、ヒトｐ５３のコアドメインおよびＤＮＡ結合部位を含む複合体の結晶構造を記載している。正常または野生型ｐ５３遺伝子の完全なＤＮＡ配列は、例えば、Zakut-Houri，R．ら、EMBO J．4（1985）1251-1255，ジーンバンク登録 HUMP53C（ｃＤＮＡ配列）ならびに Mol．Biol．Cell．6（1986）1379- 1385および Mol．Cell．Biol．7（1987）961-963，EMBLデータべース登録 HSP53 G（ゲノムＤＮＡ配列）に見ることができる。本発明によれば、特に乳癌に関しては、（ｉ）ｐ５３ｃＤＮＡにおける突然変異の位置、（ii）そのタンパク質における進化的に保存されている機能性領域、および(iii)アミノ酸遷移の間に関係があることが分かった。また、一般に、ｐ５３遺伝子における突然変異は、初期に現れるホルモン受容体の状態またはリンパ節の関与などの他の生物学的因子に関係なく、乳癌患者の悪い予後を仲介することが分かった。例えば、ｐ５３タンパク質のＤＮＡ結合機能ドメイン内またはその近くの進化的な保存領域に位置するｐ５３遺伝子における突然変異は、特異的モチーフに対するより低親和結合または他の調節モチーフに対する非特異的結合を仲介し、従って、ＤＮＡ経路における他の遺伝子の発現に影響を及ぼす。同様に、ｐ５３タンパク質のトランス作用活性化部位に近い保存領域に位置するｐ５３突然変異は、いくつかの場合、転写停止シグナルを生じた。この結果、トランス作用活性化部位に欠ける切断タンパク質となる。これは、ＤＮＡのプルーフリーディングおよび修復が起こっている間細胞分割を阻止するタンパク質の役割を破壊するものである。腫瘍細胞は、それによって、無政府主義的となり、その結果、増殖の速い攻撃的腫瘍を生じる。すなわち、生物学的機能ドメインをコードするｐ５３遺伝子の少なくとも一部のＤＮＡ配列分析を行うことによって突然変異の分布を分析することにより、（ｉ）例えばＤＮＡ結合またはトランス作用活性化に影響を及ぼすような、患者に不利な突然変異、および（ii）患者にあまり害のない突然変異、すなわち、構造または機能にあまり影響を及ぼさないアミノ酸の変化の間を区別することが可能である。特に、一般に、乳癌患者は、突然変異の位置および性質ならびにその結果生じる患者の治療に対しての要件に関してサブグループに分類することができることが分かった。すなわち、一つの大きなグループ（調べた患者の約半分）は、ｐ５３突然変異のない結節陰性患者から成る。これらの患者に対しては、腫瘍の外科的除去後の今日のアジュバント照射または多化学療法／ホルモン治療は、何ら効果がないように思われる。言い換えると、アジュバント治療を受ける患者は、アジュバント治療を受けない患者より良好な予後を示さない。別のサブグループは、ｐ５３突然変異のある結節陰性患者から成る。これらの患者の予後は悪いが、適切なアジュバント治療を行えば、非常にうまく機能することが分かっている。特定の研究で、これらの患者は、局所放射線治療を行うと、生存がかなり改善されることが分かった。従って、このサブグループの乳癌患者の確認が本発明によって可能であることは、大いに価値がある。さらに別のサブグループは、ｐ５３突然変異のある結節陽性乳癌患者から成る。これらの患者は、今日のアジュバント治療を行っても予後は非常に悪いことが分かっている。従って、このサブグループには、例えば、自己骨髄移植などのより有効な治療が必要である。最後の別のサブグループは、ｐ５３突然変異のない結節陽性乳癌患者から成る。これらの患者は、ｐ５３突然変異のある結節陽性患者よりも予後が良好であることが分かっているが、今日のアジュバント治療は、これらの患者の生存率に対して何ら効果がないと思われる。なお、乳癌患者の上記分類および行うべき治療に対するその関連性分析は、ｐ５３突然変異の指標としてのｐ５３発現の免疫化学的検出に基づく免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法などの他の分析系では行うことができない。上述したように、ｐ５３遺伝子における突然変異の位置も、患者の予後判定には重要である。すなわち、保存領域 II およびＶ（図１参照）における突然変異は一般に重いが、保存領域III および IV における突然変異はあまり重くないと思われる。従って、医師は、悪性のサンプルにおけるｐ５３遺伝子のＤＮＡ配列を決定し、上記に従い腫瘍の攻撃性および転移性に関して突然変異を分類することにより、再発の発生率と相関する信頼できる予後判定因子が得られる。次いで、乳癌患者の治療において手術は小さく行うか、または根治的に行うか、また、放射線および／またはアジュバントによる多化学療法を伴うか否かの計画を、それに応じて行うことができる。例えば、上述したように、他の不安因子はないがｐ５３突然変異がある患者は、現在はより温和な治療形態が施されるだろうが、最初の診断からすでに根治的な治療が施され得る。同様に、例えばリンパ節を伴うが、決定的なｐ５３突然変異はない女性は、現在は根治的な治療が施されるだろうが、より温和な治療を受けることができる。このことは、もちろん、治療の費用および不必要な苦しみの両方に対して効果がある。ｐ５３における突然変異および乳癌に関して上記で述べたことは、もちろん、他の組織における腫瘍性変化、例えば肺癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌および結腸直腸癌ならびに白血病および悪性黒色腫などにも当てはまる。同様に、本発明の概念は、上述したｐ５３遺伝子以外の癌関連遺伝子にも当てはまる。サンプルの調製法、ＤＮＡ配列決定法およびデータの解釈は、自体公知であり、従って、特には本明細書に記載しない。遺伝子の突然変異を分析するための多重臨床サンプルの革新的な取扱法、特にｐ５３遺伝子に関する取扱法は、本発明の別の発明であり、次の工程：（ｉ）サンプルの調製；（ii）ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅；（iii）増幅産物の、好ましくは固相法による処理；（iv）自動配列分析器での検出；ならびに所望により、（ｖ）サンプルおよび処理工程を追跡・制御し、および／または得られる配列データの補助および／または解析のためのコンピューターソフトウェアの使用を含む。サンプル調製工程では、ゲノムＤＮＡを調製するか、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから調製する。ＤＮＡの増幅は、好ましくは、ＰＣＲによって行うが、もちろん、他の増幅法も考えられる。ＰＣＲの場合、プライマーの一つは、好ましくは、「分離用手段」、例えばビオチニル基を有する。増幅されたＤＮＡの固相処理においては、ＤＮＡ断片を固体支持体に、例えばビオチニル化ＤＮＡ断片をアビジンまたはストレプトアビジンが固定化された固体支持体に結合することにより捕獲する。ビオチニル化されていないＤＮＡ鎖を溶融した後、シークエンスプライマーを固定化ＤＮＡ断片にアニーリングし、４個のｄＮＴＰおよび各々のターミネーター（ｄｄＮＴＰなど）とのシークエンス反応を、固定化ＤＮＡ断片を鋳型として行う。これは、自体公知である。次いで、プライマー伸長産物を電気泳動により分離し、自動核酸配列分析器で検出する。好ましくは、特にｐ５３遺伝子に関しては、いくつかの重複する断片を増幅して配列分析を行う。固体支持体は、磁気ビーズなどのビーズ形態であってもよい。しかし、好ましい固相処理系は、本出願人による WO 94/00597および WO 94/11529に開示されており（それらの全文を参考文献として本明細書に組込まれる。）、多数の股のある装置、通常は櫛様の要素を含み、そのピンの先端または歯状突起が固定化表面を構成する。二つのレベル、すなわち（ｉ）処理および分析全般にわたる異なるサンプルの追跡ならびに異なる処理工程の制御、および（ii）得られた配列データの解析における少なくとも補助に対しては、コンピューターソフトウェアを使用することができる。次に、本発明を、下記実施例によって説明するが、本発明は下記実施例により限定されない。実施例１結節状態が確認された（結節陰性または結節陽性）第一群の乳癌患者 107人、および第二群の乳癌患者 292人の腫瘍サンプルを以下のように調製し、配列分析を行った。患者のサンプルからのｍＲＮＡの調製 300 μl のＲＮＡzole（商標）（フェノールおよびＧＴＣ、Cinna/Biotecx La b Inc.，Houston，Texas，U.S.A.）を 0.5ml管に入れ、氷上に置いた。５×２× ２ mm 片の凍結組織サンプルのを切り取り、その管にある抽出溶液中で小乳棒を使用してすりつぶした。次いで、500 μl のＲＮＡzole（商標）および80μl のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）を添加し、10秒間攪拌し、５分間氷上に放置した。10分間遠心分離した後、350μｌの上相を、350 μl のイソプロパノールを含む新しい管に移し、攪拌混合した。次いで、その管を氷上に30分置き、最大速度で20分間遠心分離した。得られたペレットを70％エタノールで２回洗浄し、簡単に脱水して、50μl のＤＥＰＣ−処理した水および25u(1μl)のＲＮＡguard（商標）（ヌクレアーゼ阻害剤、Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden）に溶解した。作った各組のＲＮＡ単離物に対して、陰性の対照（組織未添加）を同様に処理した。ｃＤＮＡの調製上記で得たＲＮＡサンプルを90℃で３分間変性し、氷上で冷却した。37.5μl の 2×ｃＤＮＡ混合物（90 mM のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ 8.3、138 mMのＫＣｌ、 18 mM のＭｇＣｌ₂、30 mM のＤＤＴ、3.6 mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰおよび 0.9 mM のｄＧＴＰ、0.152 Ｕ_A260ｐｄ（Ｎ）₆）、10μl のＭＭＵＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）（200 u）および2.5μl のＲＮＡguard （62.5 u ）を管の中で混合し、25μl の変性ＲＮＡサンプルを添加した。37℃で１時間インキュベートした後、ｃＤＮＡ反応物を 90 ℃で３分間加熱変性し、ｃＤＮＡサンプルを−20℃で保存した。作った各組のｃＤＮＡ反応物に対して、陰性の対照（ＲＮＡサンプルの代わりに 25 μl の水）を同様に処理した。ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅二つのサンプル群の各々の４種類のｃＤＮＡ断片（各々、図２および図３の断片１〜４）を、第一群の 107人の患者から得たｃＤＮＡに対してはこの記載の最後に挙げた配列で示すＰＣＲプライマーを使用し、第二群の 2 92人の患者から得たｃＤＮＡに対してもこの記載の最後に示すＰＣＲプライマーを使用して、別々の反応で増幅した。各反応は、以下のように、Perkin Elmer 9 600 ＰＣＲ装置（Perkin Elmer-Cetus，Emeryville，California，U.S.A.）で行った。 0.2 ml管で、５μl のＰＣＲ II 緩衝液（10x）（Perkin Elmer-Cetus，Emery ville，California，U.S.A．）、5 μl の５’−プライマー（1 pmol／μl）、5 μl の３’−プライマー（1 pmol／μl）、1.2 μl の 25 mM ＭｇＣｌ₂、28 μl の水および 0.8μl の AmpliTaq ポリメラーゼ（4 u）（Perk in Elmer-Cet us，Emeryville，California，U.S.A.）を混合した。5 μl のｃＤＮＡサンプルまたは 5μl の陰性対照サンプルを添加した（全ＰＣＲ反応物＝50μl）。サンプルを、94℃で15秒間、58℃で30秒間、72℃で45秒間のAUTOプロフィールにより、38サイクル行った。増幅反応は、72℃で5 分間のHOLDにより停止し、４℃→∞ のHOLDファイルに連結した。純度、品質、量のチェックは、5 μl のＰＣＲ反応物を、0.2μg の100塩基対Ladder（分子量マーカー、Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden）を参照物質として、１％アガロースゲルにかけることにより行った。ＤＮＡ配列分析上記で得られた４個のＤＮＡ断片の配列分析を、A.L.F.（商標）ＤＮＡ配列分析器（Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden）で行った。配列分析反応は、本出願人によるWO 94/11529 に記載の櫛様ポリスチレンマニホルズおよび対応するウェルプレートを使用して行った。各櫛は８個の歯状突起を有し、ウェルプレートは２種類あり、一方は、櫛の４個の歯状突起を受け入れるように設計されたウェルを有する型であり、これを以下、「４突起ウェル」と言い、第二の型は、各ウエルが櫛の１個の歯状突起を受け入れるように設計されており、これを以下、「１突起ウェル」と言う。次のｐ５３遺伝子の断片の配列分析を、図２および３に示すシークエンスプライマーを使用して行った。第一群の患者から誘導されるｃＤＮＡに対するプライマーセット１第二群の患者から誘導されるｃＤＮＡに対するプライマーセット２１．上記で得たＰＣＲ産物（40μl）を80μl のＢＷ緩衝液（１×ＴＥ、2 M ＮａＣｌ）を含む「４突起ウェル」に移した。気泡を立てないように、ピペッティングにより混合を行った。櫛のアビジン被覆した先端をウェルに挿入し、ビオチニル化したＰＣＲ産物の櫛への捕獲を改善するために数回浸した後、室温で少なくとも60分放置した。２．次いで、その櫛を、100 μl の 0.1 MＮａＯＨを含む別の「４突起ウェル」に移動させ、５分間インキュベートして未結合ＤＮＡ鎖を溶離した。次いで、その櫛を 100μl の 0.1 MＮａＯＨで１回、ＴＥ緩衝液で１回、最後に 100μl の超純水で１回洗浄した。３．新しい「４突起ウェル」に、104 μl の水、12μl の10 xアニーリング緩衝液（AutoRead（商標）シークエンスキット、Pharmacia Biotech AB，Uppsala，S weden ）、4 μl の1 pmol／μl のフルオレセイン−標識シークエンスプライマー（図２および３参照）を添加し、櫛をそのウェルに挿入した。アニーリング混合物を55℃に５分間加熱した後、室温で少なくとも10分間放置した。４．各ｄ／ｄｄＮＴＰに対して先に調製し、できるだけゆっくりＴ７酵素を添加しながら、氷上で保存した配列分析混合物（２μl の10 xアニーリング緩衝液、 1 μl の伸長緩衝液（AutoRead（商標）シークエンスキット、Pharmacia Biotec h AB，Uppsala，Sweden）、4μl のｄ／ｄｄＮＴＰ混合物、12μl の水、酵素希釈緩衝液（AutoRead（商標）シークエンスキット、Pharmacia Biotech AB，Uppsa la，Sweden ）で希釈した１μl（2 u）のＴ７ポリメラーゼ）のマスター混合物から、各々のシークエンス混合物の20μl を個々の「１突起ウェル」に分配した。その後直ちに、アニーリングされたプライマーを有する櫛をそれらのウェルに挿入し、37℃で５分間インキュベートし、次いで、氷上に置いた。５．予め 45 ℃に温めた A.L.F．（商標）ＤＮＡシークエンサーゲルの充填ウェルを洗浄し、各ウェルに15μl の停止溶液（AutoRead（商標）シークエンスキット、Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden）を充填した。上記「１突起ウェル」から櫛を取り出し、洗浄した充填ウエルに挿入し、10分間放置して、各々停止したプライマー伸長産物を切り離した。次いで、櫛を注意しながら取り出し、 A.L.F．（商標）ＤＮＡシークエンサーの電気泳動分離および検出プロセスを開始した。結果腫瘍サンプルを上述したように分析した 317の患者は、結果の評価に対するセットテスト規準を満たしており、それらのテストデータを、結節状態、アジュバント治療、再発のない生存月数および乳癌死などの患者の他のデータに関してさらに処理した。この評価で得られた結果を、一方では、（ｉ）突然変異のある、および無い、各々の結節陰性患者、ならびに（ii）突然変異のある、および無い、各々の結節陽性患者に対して、他方では、進化保存領域におけるｐ５３突然変異の影響と該領域の外側における突然変異の影響とに対して、下記に示す。また、ｐ５３突然変異の正確な位置および対応するアミノ酸変化を、（ｉ）結節陰性乳癌患者、および（ii）結節陽性乳癌患者の数に対して記載する。アジュバント治療の効果腫瘍を外科的に除去した後のアジュバント治療、すなわち、放射線および／または多化学療法（閉経前の患者）またはホルモン療法（閉経後の患者）の効果を調べた。結果を以下にまとめ、図４〜６に示す。局所放射線治療の効果に対する特定の研究も、結節陰性乳癌患者に対して行った。結果を図７および８に示す。結節陰性乳癌患者Ａ．ｐ５３突然変異がない患者図４に示すように、アジュバント治療を受けた患者が、アジュバント治療を受けなかった患者より良好であるようには見られなかったＢ．ｐ５３突然変異がある患者図５に示すように、アジュバント治療を受けなかった患者は予後が非常に悪かったが、該治療を受けた患者は、再発のない生存が長かった。結節陽性乳癌患者図６に示すように、全員アジュバント治療を受けたこれらの患者は、ｐ５３突然変異があるか否かにかかわらず、予後が悪かったが、ｐ５３突然変異のない患者の方が良好であった。従って、特にｐ５３突然変異のある結節陽性患者に対しては、より効力のある治療が必要である。結節陰性乳癌患者Ａ．ｐ５３突然変異がない患者図７に示すように、野生型ｐ５３を有する患者では、手術後に局所放射線治療を受けた患者とそうでない患者との間で、再発のない生存に相違はあまりなかった。Ｂ．ｐ５３突然変異がある患者再発のない生存は、手術後に局所放射線治療を受けた、ｐ５３突然変異のある結節陰性患者の場合、かなり良好であった。図８参照。保存領域におけるｐ５３突然変異進化保存領域（ｐ５３遺伝子における保存領域の位置に対しては、図１を参照されたい。）におけるｐ５３突然変異の影響と保存領域外における突然変異の影響とを調べた。結果を下記にまとめ、図９〜１２に示す。保存領域 II 図９に示すように、保存領域 II にｐ５３突然変異のある患者は、保存領域外に突然変異のある患者よりも予後がかなり悪かった。保存領域 III 図１０に示すように、保存領域 IIIに突然変異のある患者に対する再発のない生存率を保存領域外に突然変異のある患者と比較すると、あまり相違がない。保存領域 IV 図１１に示すように、保存領域 IV における突然変異は、保存領域外の突然変異よりも、患者に対してあまり重くない。保存領域Ｖ図１２に示すように、保存領域 II にｐ５３突然変異のある患者は、保存領域外に突然変異のある患者よりも予後がかなり悪かった。ｐ５３遺伝子における突然変異の位置図１３は、ある患者群の多数のサンプルに見られる突然変異のコドンの位置を示し、図１４は、結節陰性患者の多数のサンプルに見られる突然変異のコドンの位置を示し、図１５は、結節陽性患者の場合を示す。白丸（○）は、患者が再発したことを示し、黒丸（●）は、患者が乳癌で死亡したことを示す。図１４と１５を比較すると、結節陰性患者に対して重い突然変異の位置は、結節陽性患者に対して重い突然変異の位置と基本的に異なることが分かる。図１４および１５に示す突然変異に関連するアミノ酸の変化を下記表１および２に示す。上記で示したように、腫瘍状態に対する非常に価値のある情報は、腫瘍性サンプルのｐ５３遺伝子の少なくとも大部分の配列分析を行うことにより得ることができる。実施例２配列に基づく診断（ＳＢＤ）と免疫組織化学（ＩＨＣ）染色法との比較上記でテストした患者のサンプルの実質的に全部に対して、以下のように、免疫組織化学（ＩＨＣ）試験も行った。新しく切除した乳癌組織を、１時間、ホルマリンに固定し、60％エタノールで 30分脱水し、80％エタノールで１時間脱水し、95％エタノールで30分脱水し、99 ％エタノールで 3.5時間脱水し、キシレンで 2.5時間脱水し、パラフィンで３時間処理した。全工程を一夜、Tissue-Vek VIPで行った。最後に、組織サンプルを、より長い時間保存可能なパラフィンブロックに包埋すると、それから 3〜5 μ m の切片を切り取ることができた。次いで、それらの切片をキシレンで脱パラフィン化し、99％エタノール、95％エタノール、80％エタノール、最後に蒸留水で再水和した。ｐ５３タンパク質の染色を行う前に、下記のプロトコールを使用して、それらの切片をマイクロ波オーブンで前処理し、ｐ５３抗原を抗体に近づきやすくした。各々50 ml の10 mM クエン酸塩緩衝液（ｐＨ 6.0）を含む３個のビンを water bowelに置いた。液層が照射間にるように調整して、サンプルに 700 Wで３×５分照射した。最後に、ビンを蒸留水で冷却した。染色法は、Ventana ＥＳ自動免疫組織化学装置（Annex，Helsinki，Finland）で行った。簡単に述べると、顕微鏡のスライドを、1/100 の希釈度でｐ５３の野生型および突然変異形（cl 1801）に対するマウスモノクローナル抗体により処理した後、結合した抗体を、Ventana ＤＡＢ検出キットを使用して可視化した。これは、マウス免疫グロブリンに対するビオチン−標識化二次抗体、アビジン−標識化ホースラディッシュペルオキシダーゼ、Ｈ₂Ｏ₂、および最後に沈殿する酵素産物を生じるジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を順次適用することから成る。各工程の間に、サンプルの適切な洗浄を行った。次いで、切片を温かい生水で15分洗浄した。最後に、切片を各々、99％エタノール、95％エタノール、80％エタノール、および蒸留水で脱水し、最後にキシレンで透明にして、Pertex（Histolab）に固定した。ＩＨＣとＳＢＤとの比較全血サンプル材料に対しては、ＩＨＣおよびＳＢＤの各々により、下記の結果が得られた。ＩＨＣおよびＳＢＤの両方において陽性であった40人の患者のサンプルは、より広範囲の遺伝子の変化が生じた３個のサンプルを含む。すなわち、次の変化である。コドン変化２６７９ｂｐ欠失２４５３ｂｐ挿入１２６２１ｂｐ欠失上記の３つの変化は、全て、フレーム内突然変異である。ＩＨＣで陰性であり、ＳＢＤで陽性である18人の患者は、かなりの変化を示す１１個のサンプルを含む。すなわち、次の変化である。コドン変化２１３Ａｒｇ→停止２０４Ｇｌｕ→停止３４１Ａｒｇ→停止２６４３ｂｐ欠失１２０約２００ｂｐ欠失３１７Ｇｌｕ→停止１６５Ｇｌｕ→停止１０８１１ｂｐ欠失１２６２１ｂｐ欠失１０３１９ｂｐ欠失１７７９ｂｐ欠失サンプルを結節陽性患者および結節陰性患者に分けると、下記の結果が得られる。結節陰性ＩＨＣおよびＳＢＤの両方において陽性である22人の患者のサンプルのうち、２個のサンプルは大きい変化を示し、ＩＨＣで陰性であり、ＳＢＤで陽性である８個のサンプルでは、４個が大きい変化を示す。結節陽性ＩＨＣおよびＳＢＤの両方において陽性である15人の患者のサンプルのうち、１個のサンプルは大きい変化を示し、ＩＨＣで陰性であり、ＳＢＤで陽性である１０個のサンプルでは、７個が大きい変化を示す。上記結果から、ＩＨＣは、ｐ５３突然変異のある患者のかなりの数（テストサンプルの約３分の１）を、特に大きい遺伝子変化が関与する場合に、同定し損ねることが明らかである。これは、特に、手術後に適切なアジュバント治療を受けると予後が非常に良好である、先に述べたｐ５３突然変異のある結節陰性乳癌患者のサブグループに対して不利であると考えられる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION For diagnosis or prognosis of neoplasia Mutation analysis based on the sequence of neoplastic tissue TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to the field of cancer diagnosis. In particular, the present invention relates to neoplasia. Detection of changes in cancer-related genes obtained from samples and their prognostic purposes For use for.Background of the Invention Breast cancer is the most common cancer in women. Breast cancer is found to be inherited But are often due to unpredictable acquired somatic mutations. You. Today, when a woman is diagnosed with breast cancer, There is fundamental controversy. That is, if a lesion is found in a woman's breast, The diagnosis of failure is made based on the morphological changes of the tumor and the surrounding tissue. However, the choice of treatment by a physician is significantly influenced by the prognosis or outcome. You. Prognostic factors can be divided into two. That is, biological factors and And time factors. Biological factors can be measured by cytology using a needle biopsy of the tumor. Inspection. Immunohistochemical staining checks for the presence and amount of hormone receptors DNA labeling is used to measure the amount of DNA in cells and in DNA synthesis. Quantify. Temporal factors include tumor size and axillary nodular status, The latter are traditional prognostic factors in the management of breast cancer. When diagnosing cancer, 20-30 lymph nodes are surgically removed and the Count the number of emphasis clauses. More than a certain number of lymph nodes (for example, 5) And provide patients with radical surgical treatment and / or radiation / multi-chemotherapy . Biological factors are increasingly used in treatment decisions, but the condition of the lymph nodes It remains a criterion for evaluating the predictive ability of biological prognostic factors. Breast cancer patients with axillary lymph nodes may have a relatively poor prognosis. this is, In some cases, tumor aggressiveness and / or metastasis, regardless of the time Due to other biological factors that affect migration. However, recent findings indicate that The presence and extent of metastatic disease is largely independent of tumor aggressiveness or metastatic potential Suggests that it reflects exclusively that the tumor is relatively advanced You. If there is no prognostic factor relevant to the outcome of the disease, most doctors Factors that have been used for over 40 years, along with clinical or temporal factors It still relies on the morphological stage of the tumor under certain microscopes. Therefore, more accurate indicators of biological status in aggressive and metastatic are It must be available at all times. If available, doctors will be able to Indeed, steps can be taken to treat the patient. In other words, small metastatic The tumor has already been cured in a definitive way from the initial diagnosis, rather than waiting for recurrence. Can be treated. Furthermore, there are no metastatic tumors and the likelihood of recurrence is very small Absent patients can be treated in a more gentle manner. The last few years of research have shown a correlation between genetic mutations and cancer development and progression. Efforts are made to find a clerk. The types of genes of interest in this are , A tumor suppressor gene, which is a gene whose loss-of-function mutation is neoplastic Is defined as Wild-type alleles of such genes interfere with tumorigenicity or Is thought to function to suppress. An example of such a gene is the p53 gene And tumor suppression on chromosome 17p The anti-protein p53 is encoded. Mutations in the p53 gene May be present in about half of all cancers. Correlation with mutation in p53 gene Cancers that have been found to be involved are, for example, breast and colon cancers. Breast cancer, knot Suspect neoplastic or cancerous human tumors, such as colorectal or lung cancer A method of diagnosing by detecting a decrease in the wild-type p53 gene in a sample, It is disclosed in EP-A-390323. The type of mutation that renders a tumor suppressor gene incomplete depends on the variety of tumor suppressor genes. change. That is, for example, a tumor suppressor gene that is incomplete in retinoblastoma, Usually by nonsense mutations that cause protein cleavage and instability Although inactivated, about 70% of the mutations in p53 are due to amino acid identity. A missense mutation that gives a change. Such an amino acid change is Position, thus altering the stability of p53, the sequence-specific DNA binding of p53 and It can alter transcription factor activity indirectly. Recent studies indicate that p53 plays an important role in the regulation of DNA repair mechanisms. It was found that DNA replication before cell division was stopped until repair was completed. Also, More mutations in genes Although there are multiple sites that are susceptible to mutations, mutations are generally random within the region. It is also known to be brought naturally. As far as breast cancer is concerned, there is a correlation between survival and the p53 mutation You. That is, Thorlacius et al., Cancer Res. 53 (1993) 1637-1641 is p53 Women with breast cancer who have the mutation have a higher risk of dying than women who do not have the p53 mutation. Reports that it is more than twice as high. However, besides the above correlation with survival, p53 in breast cancer and other tumors Mutation analysis confirms correlation with other clinical parameters and prognosis There is no standing.Summary of the Invention The aim of the present invention is to enable an accurate prognosis of a disease, whereby the physician can determine Allows patients to be classified according to their defined tumor biological status, and Aggressive and metastatic to provide appropriate treatment, especially in early diagnosis Of possible mutations in cancer-related genes such as the p53 gene with respect to the biological status of More reliable diagnosis of human neoplastic tissue, blood or other body fluids based on detection Is to provide a way. In accordance with the present invention, a human neoplastic sample of a patient is By measuring the location and nature of the offspring mutation, The magnitude of the detected change can be assessed and appropriate treatment can be applied. It comes. Of particular relevance are the biologically functional domains of proteins. Detection of the location and nature of mutations in such parts of the gene to be loaded . Thus, the present invention is directed to tissue, blood or other body fluid samples (eg, urine, saliva) A method for diagnosing human neoplasia in Genomic DNA or cDNA of the gene encoding the cancer-associated protein The DNA sequence is analyzed for the presence of the mutation and the presence, nature and location of the mutation Of the corresponding protein on the biological function of the corresponding protein and thereby the tumor Analyze the effect on the characteristics of neoplasia and use it to predict the progression of neoplasia. And provide guidance for appropriate treatment of the patient. The “cancer-associated gene” used in the present invention is a mutation whose progress is in tumorigenesis or progression of cancer. A gene that is considered to be correlated with a row. Such genes are generally Proteins involved in the DNA replication cycle, such as Quality Encodes proteins such as oncogens and regulatory proteins. Such remains Examples of the gene include, in addition to the p53 gene described above, the proteins WAFI, erb B- 2 (HerII / Neu), p16 (MTS I), MTS II, MLH 1 & 2 and R There is a gene encoding as. Mutations detected include point mutations, deletions and insertions, and polymorphisms. Can be The present invention also provides for amplification and sequence analysis of each of the p53 genomic and cDNA. Specific primers are provided.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 is a schematic diagram of the p53 protein, showing the evolutionary conserved Transactivation domain (A), DNA binding domain (B) and And the position of the oligomerization region (C). FIG. 2 shows p53 cDNA having aligned coding regions and Example 1 below. FIG. 4 is a schematic diagram of four amplified and sequence analyzed overlapping fragments used in FIG. In fragments 1 to 4, primers are indicated by “←”. “B” is biotinylated Indicates a primer and "S" indicates a sequence primer. FIG. 3 is a schematic diagram similar to FIG. Ma is different. These are also used in Example 1 below. FIG. 4 shows (i) adjuvant treatment and (ii) no treatment A group showing no recurrence-free survival after surgery in node-negative breast cancer patients without the p53 mutation Rough (“survival plot”). FIG. 5 is a graph similar to FIG. 4 for a nodule negative breast cancer patient with a p53 mutation. It is. FIG. 6 shows that (i) with p53 mutation and (ii) without p53 mutation, FIG. 5 is a graph similar to FIG. 4 showing the survival of a nodule-positive breast cancer patient without recurrence after surgery. FIG. 7 shows that (i) received local radiation therapy and (ii) did not receive it , Graph showing recurrence-free survival after surgery in nodule-negative breast cancer patients without p53 mutation (“Survival plot”). FIG. 8 is a graph similar to FIG. 7 for a nodule negative breast cancer patient with a p53 mutation. It is. FIG. 9 shows breast cancer patients with a p53 mutation in conserved region II and those protruding outside the conserved region. Graph showing relapse-free survival after surgery with breast cancer patients with a mutation (see Survival G). FIG. 10 shows breast cancer patients with p53 mutations in conserved region III and outside the conserved region. FIG. 10 is a graph similar to FIG. 9 with a breast cancer patient having a mutation. Figure 11 shows breast cancer patients with p53 mutations in conserved region IV and outside the conserved region. FIG. 10 is a graph similar to FIG. 9 with a breast cancer patient having a mutation. FIG. 12 shows a breast cancer patient with a p53 mutation in conserved region V and a protrusion outside the conserved region. It is a graph similar to FIG. 9 with the breast cancer patient with a natural mutation. FIG. 13 shows the location of mutations in the p53 coding sequence of many breast cancer patients. It is a bar graph. The height of the bar indicates the number of patients with each mutation. FIG. 14 is a bar graph similar to FIG. 13 for a nodule negative patient. Related places The recurrence (○) and death (○) of the combined breast cancer are also shown in this graph. FIG. 15 is a bar graph similar to FIG. 14 for a nodule positive patient.Detailed description of the invention p53 protein structure and various mutations detected therein Differences are described, inter alia, in Harris, C., Science 262 (1993) 1980-1981. . As shown therein, p53 is a trans-activation domain, an oligomer Domain and five evolutionary conserved regions. Yunje, C.E. Et al., Science 26 5 (1994) 346-354 describes a complex containing the core domain and DNA binding site of human p53. The crystal structure of the coalescence is described. Complete DNA of normal or wild-type p53 gene Sequences are described, for example, in Zakut-Houri, R .; EMBO J. et al. 4 (1985) 1251-1255, Geneba Link registration HUMP53C (cDNA sequence) and Mol. Biol. Cell. 6 (1986) 1379- 1385 and Mol. Cell. Biol. 7 (1987) 961-963, EMBL database registration HSP53 G (genomic DNA sequence). According to the present invention, particularly with respect to breast cancer, (i) mutations in the p53 cDNA Different positions, (ii) functionally conserved functional regions in the protein, And (iii) a relationship was found between the amino acid transitions. Also, in general, mutations in the p53 gene Regardless of the condition of the body or other biological factors such as lymph node involvement, It was found to mediate a poor prognosis. For example, evolution within or near the DNA binding functional domain of the p53 protein Mutations in the p53 gene located in a specific conserved region Mediates lower affinity binding or non-specific binding to other regulatory motifs. Thus, it affects the expression of other genes in the DNA pathway. Similarly, the p53 protein is located in a conserved region near the transactivation site. P53 mutations in some cases resulted in transcription termination signals. As a result, It results in a truncated protein lacking the trans-activation site. This is a DNA pull -Proteins that block cell division while reading and repair are occurring It destroys the role. The tumor cells thereby become anarchist, The result is a fast growing aggressive tumor. That is, at least a part of the p53 gene encoding a biological functional domain By analyzing the distribution of mutations by performing DNA sequence analysis of i) for patients that affect, for example, DNA binding or transactivation Disadvantageous mutations and (ii) mutations that are less harmful to the patient, ie, the structure Or changes in amino acids that do not significantly affect function It is possible to distinguish between In particular, in general, breast cancer patients are subject to the location and nature of the mutation and the resulting Be categorized into subgroups with regard to the requirements for the treatment of patients I understood. That is, one large group (approximately half of the patients examined) Consisting of nodular negative patients with no. For these patients, after surgical removal of the tumor Today's adjuvant irradiation or multi-chemo / hormonal treatments have no effect Seems like. In other words, patients receiving adjuvant therapy Does not show a better prognosis than untreated patients. Another subgroup consists of nodule negative patients with p53 mutations. these Patients have a poor prognosis, but work very well with proper adjuvant treatment I know that. In certain studies, these patients were treated with local radiation therapy. , Found that survival was significantly improved. Therefore, this subgroup of breast cancer patients It is of great value that identification of the person is possible with the present invention. Yet another subgroup consists of nodule-positive breast cancer patients with p53 mutations . These patients are treated with adjuvant treatment today Has been found to have a very poor prognosis. Therefore, this subgroup Require more effective treatments, such as, for example, autologous bone marrow transplantation. The final separate subgroup consists of nodule-positive breast cancer patients without the p53 mutation . These patients have a better prognosis than nodule-positive patients with p53 mutations It is known that adjuvant treatment today has a negative impact on the survival of these patients. It seems that it has no effect. The above classification of breast cancer patients and its relevance analysis for the treatment to be performed are p Immunohistochemistry based on immunochemical detection of p53 expression as an indicator of 53 mutation It cannot be performed with other analysis systems such as the (IHC) staining method. As described above, the location of the mutation in the p53 gene can also be used to determine the prognosis of patients. Is important. That is, mutations in conserved regions II and V (see FIG. 1) Is generally heavy, but mutations in conserved regions III and IV are not Seem. Therefore, the physician determined the DNA sequence of the p53 gene in the malignant sample. By classifying the mutations with respect to tumor aggressiveness and metastaticity according to the above Correlate with the incidence of relapse Reliable prognostic factors are obtained. Then, in the treatment of breast cancer patients, surgery Small or curative, and radiation and / or adjuvant A plan of whether or not to involve multi-chemotherapy by the patient can be made accordingly. An example For example, as noted above, patients without any other anxiety factors but with a p53 mutation will now have At present, a milder form of treatment will be given, but radical cures have already been made since the initial diagnosis. Treatment may be provided. Similarly, for example, with lymph nodes, but a definitive p53 mutation Women who do not have curative treatment now, but receive milder treatment be able to. This, of course, means both the cost of treatment and unnecessary suffering. Effective for What has been said above regarding mutations in p53 and breast cancer, of course, Neoplastic changes in other tissues, such as lung, prostate, gastric, bladder and colon It also applies to rectal cancer and leukemia and malignant melanoma. Similarly, the present invention The concept also applies to cancer-related genes other than the p53 gene described above. Sample preparation, DNA sequencing and interpretation of data are known per se. Therefore, they are not specifically described herein. Multiple tools for analyzing gene mutations Innovative collection of heavy clinical samples The handling method, particularly the handling method for the p53 gene, is another invention of the present invention. : (I) sample preparation; (Ii) amplification of genomic DNA or cDNA; (Iii) treatment of the amplification product, preferably by a solid phase method; (Iv) detection on an automatic sequence analyzer; and, if desired, (V) Sequences that track and control samples and processing steps and / or obtain Use of computer software to assist and / or analyze data including. In the sample preparation process, prepare genomic DNA or convert cDNA from mRNA. Prepare. The amplification of the DNA is preferably carried out by PCR, but of course other amplification methods Is also conceivable. In the case of PCR, one of the primers is preferably , For example, having a biotinyl group. In the solid-phase treatment of the amplified DNA, the DNA fragment is placed on a solid support, for example. The biotinylated DNA fragment is immobilized on avidin or streptavidin. Binding to the body support Capture more. After melting the non-biotinylated DNA strand, The primers were annealed to the immobilized DNA fragment and the four dNTPs and each The sequencing reaction with a terminator (such as ddNTP) is performed using the immobilized DNA fragment Is used as a template. This is known per se. Next, the primer extension products are separated by electrophoresis, and analyzed by an automatic nucleic acid sequence analyzer. To detect. Preferably, especially for the p53 gene, several overlapping fragments are amplified. To perform sequence analysis. The solid support may be in the form of beads, such as magnetic beads. But preferred New solid state processing systems are disclosed in WO 94/00597 and WO 94/11529 by the applicant. (The entire text of which is incorporated herein by reference), and Device, usually a comb-like element, whose tips or teeth are fixed Is configured. Two levels, i.e., (i) different samples across processing and analysis For tracking and controlling different processing steps, and (ii) for analyzing the sequence data obtained Use computer software, at least for assistance in Can be. Next, the present invention will be described with reference to the following examples. Not limited. Example 1 107 patients with nodule status (nodule negative or nodule positive) in breast cancer, And 292 breast cancer patients from the second group were prepared and sequenced as follows: Was done.Preparation of mRNA from patient samples 300 μl of RNAzole ™ (phenol and GTC, Cinna / Biotecx La b Inc., Houston, Texas, U.S.A.) was placed in a 0.5 ml tube and placed on ice. 5x2x Cut out a 2 mm piece of frozen tissue sample and insert a small pestle in the extraction solution in the tube. Used and mashed. Then, 500 μl RNAzole ™ and 80 μl Add chloroform / isoamyl alcohol (24: 1), stir for 10 seconds, and 5 minutes Leave on ice. After centrifugation for 10 minutes, 350 μl of the upper phase is Transfer to a new tube containing lopanol and mix by stirring. Then place the tube on ice for 30 minutes And centrifuged at maximum speed for 20 minutes. The resulting pellet is washed with 70% ethanol 2 Washed briefly, dehydrated briefly, 50 μl DEPC-treated water and 25 u (1 μl) RNAguard (quote Mark) (nuclease inhibitor, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) did. A negative control (no tissue added) was similarly treated for each set of RNA isolates made did.Preparation of cDNA The RNA sample obtained above was denatured at 90 ° C. for 3 minutes and cooled on ice. 37.5μl 2 × cDNA mixture (90 mM Tris-HCl, pH 8.3, 138 mM KCl, 18 mM MgCl_Two, 30 mM DDT, 3.6 mM dATP, dCTP, dTTP , DITP and 0.9 mM dGTP, 0.152 U_A260pd (N)₆), 10 μl MMULV reverse transcriptase (RT) (200 u) and 2.5 μl RNAguard (62.5 u) ) Was mixed in a tube and 25 μl of denatured RNA sample was added. 1 hour at 37 ° C After incubation, the cDNA reaction was heat denatured at 90 ° C for 3 minutes, The samples were stored at -20 ° C. For each set of cDNA reactions made, a negative control (instead of RNA samples) Of water) was treated similarly.PCR amplification of cDNA Four types of cDNA fragments from each of the two sample groups (each figure 2 and fragments 1-4) of FIG. 3 were compared to cDNA from the first group of 107 patients. Using the PCR primers represented by the sequences listed at the end of this description, PCR primers shown at the end of this description for cDNA obtained from 92 patients Was used to amplify in separate reactions. Each reaction was performed as described below for Perkin Elmer 9 Run on a 600 PCR instrument (Perkin Elmer-Cetus, Emeryville, California, U.S.A.) Was. In a 0.2 ml tube, 5 μl of PCR II buffer (10 ×) (Perkin Elmer-Cetus, Emery ville, California, U.S.A. ), 5 μl of 5′-primer (1 pmol / μl), 5 μl μl 3′-primer (1 pmol / μl), 1.2 μl 25 mM MgCl_Two, 28 μl water and 0.8 μl AmpliTaq polymerase (4 u) (Perk in Elmer-Cet us, Emeryville, California, U.S.A.). 5 μl cDNA sample Alternatively, 5 μl of a negative control sample was added (total PCR reaction = 50 μl). Sun Pull with an AUTO profile of 94 ° C for 15 seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 45 seconds , 38 cycles. The amplification reaction was stopped by HOLD at 72 ° C for 5 minutes, and 4 ° C → ∞ Linked to a HOLD file. 5 μl PCR reaction for purity, quality and quantity checks With 0.2 μg of 100 salt See Grouper Ladder (molecular weight markers, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) As a control substance, it was carried out by running on a 1% agarose gel.DNA sequence analysis The sequence analysis of the four DNA fragments obtained above was performed using the A.L.F. The analysis was performed on an analyzer (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden). The sequence analysis reaction Applicant's comb-like polystyrene manifolds described in WO 94/11529 and corresponding This was performed using a well plate. Each comb has eight teeth and the well There are two types of seats, one designed to accept the four teeth of the comb This is a type having a well, which is hereinafter referred to as a “4-projection well”. Each well is designed to receive one tooth of the comb, which is , "One protrusion well". Sequence analysis of the following fragment of the p53 gene was performed using the sequence plasmid shown in FIGS. Performed using an immer. Against cDNA derived from the first group of patients Primer set 1 Against cDNA derived from a second group of patients Primer set 2 1. The PCR product (40 μl) obtained above was mixed with 80 μl of BW buffer (1 × TE, 2 M N aCl) was transferred to a "4-protrusion well". Pipette to avoid air bubbles Mixing was performed by ringing. Insert the avidin-coated tip of the comb into the wells and comb the biotinylated PCR product. Immersed several times to improve capture into water, then left at room temperature for at least 60 minutes. 2. The comb was then placed in another “4-protrusion well” containing 100 μl of 0.1 M NaOH. And incubated for 5 minutes to elute unbound DNA strands. Then, The comb once with 100 μl 0.1 M NaOH, once with TE buffer and finally with 100 μl It was washed once with ultrapure water. 3. 104 μl water, 12 μl 10x annealing buffer in a new “four well” Solution (AutoRead ™ sequencing kit, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, S weden), 4 μl 1 pmol / μl fluorescein-labeled sequence primer -(See FIGS. 2 and 3) was added and a comb was inserted into the well. Annealing blend The mixture was heated to 55 ° C. for 5 minutes and then left at room temperature for at least 10 minutes. 4. Prepare first for each d / ddNTP and add T7 enzyme as slowly as possible While storing the sequence analysis mixture on ice (2 μl of 10 × annealing buffer, 1 μl extension buffer (AutoRead ™ sequencing kit, Pharmacia Biotec h AB, Uppsala, Sweden), 4 μl d / ddNTP mixture, 12 μl water, enzyme dilution Buffer (AutoRead ™ sequencing kit, Pharmacia Biotech AB, Uppsa la, Sweden) diluted 1 μl (2 u) of T7 polymerase) master mix , 20 μl of each sequence mixture was dispensed into individual “1 protrusion wells” . Immediately thereafter, a comb with the annealed primer is added to those wells. Inserted and incubated at 37 ° C. for 5 minutes, then placed on ice. 5. A.L.F. preheated to 45 ° C. (TM) DNA Sequencer Gel Wash the wells and add 15 μl of Stop Solution (AutoRead ™ Sequence Kit) to each well. (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden). The above "1 protrusion Remove the comb from the `` R '', insert it into the washed filling well, leave it for 10 minutes, The stopped primer extension product was cut off. Then take out the comb carefully, A.L.F. Launches the Electrophoretic Separation and Detection Process of the DNA ™ Sequencer Started.result 317 patients whose tumor samples were analyzed as described above had a Test criteria are met and those tests are Statistical data include nodal status, adjuvant treatment, number of months without recurrence and breast cancer death Further processing was performed on other patient data such as. The result of this evaluation is On the one hand, (i) each nodule negative patient with and without mutation, and (Ii) for each nodule positive patient, with and without mutation, Effects of p53 mutations in evolutionary conserved regions and mutations outside of those regions The effects are shown below. Also, the exact location of the p53 mutation and the corresponding Amino acid changes in (i) nodule-negative breast cancer patients and (ii) nodule-positive breast cancer patients Described for numbers.Effects of adjuvant treatment Adjuvant treatment after surgical removal of the tumor, ie, radiation and / or Or the effects of multichemotherapy (premenopausal patients) or hormonal therapy (postmenopausal patients) Examined. The results are summarized below and are shown in FIGS. On the effects of local radiotherapy Certain studies were also performed on nodular negative breast cancer patients. The results are shown in FIGS. Nodule negative breast cancer patients A. Patients without p53 mutation As shown in FIG. 4, patients receiving adjuvant treatment receive adjuvant treatment. Did not appear to be better than those who did not B. Patients with p53 mutation As shown in FIG. 5, patients without adjuvant treatment have very poor prognosis However, patients who received the treatment had longer survival without recurrence. Nodule-positive breast cancer patients As shown in FIG. 6, these patients, all receiving adjuvant treatment, had p53 Patients with poor prognosis, regardless of mutation status, but without p53 mutation Person was better. Therefore, especially for nodule-positive patients with p53 mutations Therefore, more effective treatments are needed. Nodule negative breast cancer patients A. Patients without p53 mutation As shown in FIG. 7, in patients with wild-type p53, local radiotherapy after surgery There are few differences in relapse-free survival between patients who have received and those who have not Was. B. Patients with p53 mutation Recurrence-free survival is due to p53 mutation after local surgery after surgery In the case of nodule negative patients, it was quite good. See FIG. P53 mutations in conserved regions Evolutionary conserved region (see FIG. 1 for the location of the conserved region in the p53 gene) I want to be. Effect of p53 mutation on) and shadow of mutation outside the conserved region I checked with Hibiki. The results are summarized below and are shown in FIGS. Storage area II As shown in FIG. 9, patients with a p53 mutation in conserved region II The prognosis was significantly worse than in patients with a mutation. Storage area III As shown in FIG. 10, there is no recurrence for patients with mutations in conserved region III. There is not much difference when comparing survival to patients with mutations outside the conserved region. Storage area IV As shown in FIG. 11, mutations in conserved region IV Less heavily on the patient than out-of-region mutations. Storage area V As shown in FIG. 12, patients with a p53 mutation in conserved region II The prognosis was significantly worse than patients with external mutations. Location of mutation in p53 gene FIG. 13 shows the codon locations of the mutations found in multiple samples of a group of patients. FIG. 14 shows the mutation codons found in a number of samples of nodule negative patients. The position is shown, and FIG. 15 shows the case of a nodule positive patient. White circle (○) indicates that the patient has recurred The closed circle (•) indicates that the patient died of breast cancer. Figures 14 and 1 Comparing No. 5, the location of the heavy mutation for nodule-negative patients is On the other hand, it turns out that the position of the heavy mutation is fundamentally different. The amino acid changes associated with the mutations shown in FIGS. It is shown in FIG. As indicated above, very valuable information on tumor status is It can be obtained by performing at least most sequence analysis of the p53 gene of the pull. it can. Example 2 Comparison between sequence-based diagnosis (SBD) and immunohistochemistry (IHC) staining For substantially all of the patient samples tested above, Epidemiological histochemistry (IHC) tests were also performed. Freshly excised breast cancer tissue is fixed in formalin for 1 hour and then Dehydrate for 30 minutes, dehydrate for 1 hour with 80% ethanol, dehydrate for 30 minutes with 95% ethanol, 99 Dehydrate with 3.5% ethanol, 3.5 hours with xylene, 3 hours with paraffin For a while. All steps were performed overnight on a Tissue-Vek VIP. Finally, the tissue sample Embedded in a paraffin block that can be stored longer, then 3-5 μm m sections could be cut. The sections were then deparaffinized with xylene, 99% ethanol, 95% It was rehydrated with ethanol, 80% ethanol and finally with distilled water. Before performing staining of p53 protein, follow the protocol below. Pretreated the sections in a microwave oven to convert the p53 antigen into an antibody. It's easier to get closer. Dispense three bottles, each containing 50 ml of 10 mM citrate buffer (pH 6.0), into water put on bowel. Adjust the liquid layer so that it is between irradiations. Minutes. Finally, the bottle was cooled with distilled water. The staining method was Ventana ES automated immunohistochemistry (Annex, Helsinki, Finland) I went in. Briefly, microscope slides were prepared at 1/100 dilution at p53 field. Treated with mouse monoclonal antibodies against native and mutant forms (cl 1801) Reason After that, the bound antibodies were visualized using a Ventana DAB detection kit. this Are biotin-labeled secondary antibodies to mouse immunoglobulin, avidin-labeled Horseradish peroxidase, H_TwoO_TwoAnd final enzyme production Consisting of the sequential application of diaminobenzidine (DAB) to give the product. Each process During this time, the samples were properly washed. The sections were then washed with warm tap water for 15 minutes. Finally, cut sections in 99% ethanol , 95% ethanol, 80% ethanol, And dehydrated with distilled water, finally clarified with xylene and fixed on Pertex (Histolab) did.Comparison of IHC and SBD For whole blood sample material, the following results were obtained by IHC and SBD respectively. was gotten. A sample of 40 patients who were positive in both IHC and SBD, Includes three samples in which more extensive genetic changes have occurred. That is, with the next change is there. Codon change 267 9 bp deletion 245 3 bp insertion 126 21 bp deletion All three changes above are in-frame mutations. IHC negative , 18 patients positive for SBD contained 11 samples showing significant changes No. That is, the next change It is. Codon change 213 Arg → Stop 204 Glu → stop 341 Arg → Stop 264 3 bp deletion 120 About 200 bp deletion 317 Glu → stop 165 Glu → stop 108 11 bp deletion 126 21 bp deletion 103 19 bp deletion 177 9 bp deletion Dividing the sample into nodule-positive and nodule-negative patients gives the following results: You. Nodule negative Of a sample of 22 patients positive for both IHC and SBD, Two samples show large changes, negative for IHC and positive for SBD Of the eight samples, four show large changes. Nodule positive Of a sample of 15 patients positive for both IHC and SBD, One sample shows large changes, negative for IHC and positive for SBD Of the ten samples, seven show large changes. From the above results, IHC indicates that a significant number of patients with p53 mutations (test About one-third of the sample), especially when large genetic changes are involved. It is clear that This is especially true after surgery with appropriate adjuvant treatment. Nodule-negative breast cancer patients with p53 mutation Is considered disadvantageous to the subgroup of the elderly.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), JP, US

Claims

[Claims] 1. Diagnostic methods based on the sequence of human neoplastic tissue, blood or other body fluid samples Genomic DNA or cDNA derived from the neoplasia Analysis of the DNA sequence of the gene encoding the cancer-associated protein The presence, nature and location of the mutation in the corresponding protein Analyze the effect on function, and thereby its effect on the characteristics of tumorigenesis, Based on that, it predicts the progression of neoplasia and provides guidance for appropriate treatment of patients A method comprising: 2. Characterized in that the properties of tumorigenesis include biological aggression and / or metastasis The method of claim 1, wherein 3. The cancer-related protein is a protein involved in the DNA replication cycle The method according to claim 1, wherein: 4. Characterized in that the protein is an inhibitory protein or a growth-inducing protein 4. The method of claim 3, wherein the method comprises: 5. Encodes at least one biologically functional domain of a cancer-associated protein 5. A method according to claim 1, wherein a part of the gene to be analyzed is analyzed. The method described. 6. The biologically functional domain is a DNA binding domain and / or trans 6. The method according to claim 5, comprising an activation site. 7. 7. The method according to claim 5, wherein an evolutionary conserved region of the gene is analyzed. the method of. 8. The gene whose mutation is analyzed is the protein p53, WAFI, erb B -2 (HerII / Neu), p16 (MTS I), MTS II, MLM1 & 2 and R 7. The method according to claim 5, wherein the method is selected from as. 9. 9. The method according to claim 8, wherein the gene encodes a p53 protein. Method. 10. Tumor neoplasm is a breast, lung, prostate, stomach, colorectal, melanoma or leukemia tumor 10. The method of claim 9, wherein the method is newborn. 11. 11. The method according to claim 10, wherein the sample is derived from breast tumor neogenesis. Method. 12. The tumor was evaluated for (i) the presence or absence of the mutation and (ii) whether the patient was nodularly positive. 12. The method according to claim 11, wherein the information is classified into different sub-groups according to the method of. 13. P53 mutations in tumor samples from nodule negative patients Detection of presence or absence indicates need for adjuvant treatment after surgical removal of tumor 13. The method of claim 12, wherein the method comprises: 14． 14. The method according to claim 13, wherein the adjuvant treatment is local radiation treatment. The described method. 15. Next step: Preparation of genomic DNA or cDNA; at least cancer-related genes Amplification of some; treatment of cancer-related genes including sequence analysis reactions; automated nucleic acid sequence analyzer Detection of products from the sequence analysis reaction of the sample; optionally, (i) tracking and processing of the sample. And / or (ii) assisting the obtained sequence data and / or Specially including one or more uses of computer software to perform the analysis. 14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that: 16. Preparation of genomic DNA or cDNA; amplification of at least part of the gene; Processing of the amplified DNA, preferably by a solid-phase based method, to obtain a sequence analysis reaction product The sequence analysis by an automatic nucleic acid sequence analyzer for determining the DNA sequence of the p53 gene Analysis reaction product; and comparing the sequence with the corresponding wild-type p53 gene sequence. Computer software, including (i) sample tracking and processing steps Control and / or (ii) It should be used at least to assist in the analysis of the sequence data obtained. A method of detecting a mutation in a gene, which is a feature. 17． Detecting mutations in the gene encoding the p53 protein The method according to claim 15, characterized in that: 18. At least one selected from the amplification or sequencing primers shown in FIG. Amplification of p53 genomic or cDNA, characterized in that it comprises one primer And / or oligonucleotide primer sets for sequence analysis.