KR101925715B1 - Use of ARD1 as a Liver cancer diagnostic marker - Google Patents

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Abstract

간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)은 단계적으로 진행되는바, 만성 간질환에서 발생되는 이형성 결절, 특히 고분화 이형성 결절은 전암병변으로서 다단계 간암발생 과정의 조기 변화로 볼 수 있다. 이와 같은 이형성 결절 단계를 거쳐 점차 악성도가 증가하여 전이도가 높으며 분화도가 좋지 않은 간암으로 발전하게 되므로, 최근 간암을 조기에 진단하기 위하여 노력이 집중되고 있다.
이에, 본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있도록 간암 단계 진단 및 간암 진단 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따라 ARD1 발현 수준을 분석하면 간암을 조기에 진단하여 대응하고, 간암의 진행 단계를 파악하는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.Hepatocellular carcinoma (HCC) progresses gradually, and dysplastic nodules that develop in chronic liver disease, especially hyperdifferentiated dysplastic nodules, are precancerous lesions and can be seen as early changes in the development of multilevel hepatocellular carcinoma. Because the malignant progresses gradually through the dysplastic nodule stage, it develops into hepatocellular carcinoma with a high degree of metastasis and a poor degree of differentiation. Recently, efforts have been focused on early diagnosis of liver cancer.
Accordingly, the present invention relates to a liver cancer diagnosis step and a liver cancer diagnosis kit so that the liver cancer can be diagnosed and predicted effectively at an early stage. The analysis of the level of ARD1 expression according to the present invention enables early diagnosis and response of liver cancer, It is expected that it will be useful for understanding.

Description

간암 예후측정 또는 진단용 마커로서의 ARD1의 용도 {Use of ARD1 as a Liver cancer diagnostic marker}Use of ARD1 as a Marker for Liver Cancer Prognosis Measurement or Diagnosis {Use of ARD1 as a Liver cancer diagnostic marker}

본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있도록 간암 진행 단계 진단 및 간암 진단 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명자들은 정상인과 비교하여 간암 환자에게서 ARD1 발현 수준이 높다는 사실을 확인하였는바, 본 발명에 따라 ARD1 발현 수준을 분석하면 간암을 조기에 진단하고, 간암의 진행 단계를 파악할 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a liver cancer progression stage diagnosis kit and a liver cancer diagnosis kit so that the liver cancer can be effectively diagnosed and predicted in an early stage. More specifically, the present inventors have confirmed that ARD1 expression level is high in liver cancer patients compared with normal persons, By analyzing the level of ARD1 expression according to the invention, it is expected that early diagnosis of liver cancer and the progress of liver cancer can be grasped.

간암 또는 간세포암 (hepatocellular carcinoma; HCC)은 세계에서 5번째로 흔한 암이며, 국내에서는 2013년 통계청 자료에 의하면 암에 의한 사망의 22.6%가 간암으로, 암 사망 원인 4위에 해당된다. 간세포암종에 관한 가장 바람직한 치료법은 수술이지만, 종양의 절제할 수 없는 크기 및 수, 간기능 저하, 다양한 간내 또는 원격 전이 등의 요인이 간세포암종 환자의 수술 가능 여부 및 수술 이후 재발에 주요한 제한 요소로 작용하고 있다. 이와 관련된 암의 다양한 증식 및 전이 관련 단백질들이 연구되고 분리되어져 있다. Liver cancer or hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common cancer in the world. In Korea, according to the National Statistical Office (NSO) data, 22.6% of cancer deaths are liver cancer. The most favorable treatment for hepatocellular carcinoma is surgery, but the unresectable size and number of tumors, hepatic dysfunction and various intrahepatic or distant metastases are the main limiting factors for the operability of patients with hepatocellular carcinoma and postoperative recurrence . Various proliferative and metastatic proteins associated with cancer have been studied and isolated.

특히 간세포암은 간염바이러스나 알코올, 간경화와 같은 위험인자를 가지고 있는 환자에게서 호발하는 것으로 알려져 있고 조기진단 마커를 이용하여 고위험군에 대한 선별적 감시 검사 (surveillance)를 시행할 대상이 명확하다. 실제로, 6개월 간격으로 시행하는 조기진단은 간암 환자의 생존율 증대 (사망률 37% 감소)하는 것으로 나타났다.In particular, hepatocellular carcinoma is known to occur in patients with risk factors such as hepatitis virus, alcohol, and cirrhosis, and it is clear that a surveillance surveillance test for high-risk patients should be performed using early diagnosis markers. Indeed, early diagnosis at 6-month intervals was associated with an increased survival rate (a 37% reduction in mortality) in patients with liver cancer.

정상인에서 간암을 조기에 정확하게 발견해 낼 수 있는 바이오마커 검사는 아직까지 개발되지 못했으며, 고위험군에서 비침습적인 조기 간암 진단을 위하여 사용하고 있는 검사 방법이 혈청 알파태아단백 (α-fetoprotein; AFP) 검사이다. AFP는 개발 당시 민감도와 특이도를 모두 양호한 수준으로 달성할 수 있는 기준값이 20ng/mL로 제시되었으나, 이 경우 민감도가 60%에 지나지 않으며 현재 국제 학회의 간암 진단 가이드라인에 따라 200ng/mL를 기준으로 간암을 진단할 경우 특이도는 상승하지만 민감도가 22%에 불과하다. 기존의 연구 결과, AFP는 전체적으로 약 66%의 민감도와 82%의 특이도를 갖는 것으로 알려져 있어 모든 간암 환자를 진단하는 데에 제한이 있다.A biomarker test for early detection of liver cancer in normal individuals has not yet been developed. The test method used for the diagnosis of non-invasive early liver cancer in high-risk patients is serum α-fetoprotein (AFP) to be. AFP was 20 ng / mL, which is the standard for achieving both sensitivity and specificity at the time of development. However, sensitivity is only 60% in this case, and 200 ng / mL The specificity of liver cancer is elevated, but the sensitivity is only 22%. Previous studies have shown that AFP has a sensitivity of about 66% overall and a specificity of 82%, which limits the diagnosis of all liver cancer patients.

그 외 진단 기준으로 확립되어 있지는 않으나 간암 진단에 도움이 되는 혈청 마커로는 Descarboxyprothrombin (DCP), Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II (PIVKA-II), 글리코실화 AFP 대 총 AFP (L3 fraction)분포, α-fucosidase, glypican 3, HSP-70 등이 있다. 그러나 각각은 예후 인자로서 의미를 가지는 것이 대부분이고, 단독으로 사용하였을 때 정확도가 낮아 아직 선별 검사로 사용되지 못하고 있으며, 단일 혈청학적 마커로 간암을 조기 진단하는 것은 이미 한계에 다다른 것으로 판단된다. 아울러 실제 수술이나 고주파 열치료술과 같은 근치적 치료가 가능한 단계에서 진단되는 환자들은 전체 간암 환자의 30% 정도에 국한된다(미국 공개특허공보 제2010/0304372호 참조).Serum markers useful for the diagnosis of liver cancer include Descarboxyprothrombin (DCP), Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II (PIVKA-II), Glycosylated AFP versus Total AFP (L3 fraction) distribution, -fucosidase, glypican 3, and HSP-70. However, most of them have significance as a prognostic factor, and when used alone, they are not used as screening tests due to their low accuracy. Early diagnosis of liver cancer by single serologic markers is already different from the limit. In addition, patients diagnosed at the stage of curative treatment such as actual surgery or radiofrequency thermal therapy are limited to about 30% of all patients with liver cancer (see US Patent Application Publication No. 2010/0304372).

Arrest-defective 1 protein (ARD1)은 다양한 암에서 발현이 증가되어 있음이 보고되었으며, 암세포 증식 및 암 혈관 신생에 관여됨이 알려져 있다. 그러나 ARD1이 간세포암종 환자에서 암의 악성화, 침윤, 재발 및 생존에 어떠한 역할을 수행하는지에 관한 구체적인 보고는 전무한 실정이다.Arrest-defective 1 protein (ARD1) has been reported to be expressed in various cancers and is known to be involved in cancer cell proliferation and cancer angiogenesis. However, there are no specific reports on how ARD1 plays a role in cancer malignancy, invasion, recurrence and survival in patients with HCC.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 간세포암종 환자의 종양 조직 및 종양 주변 조직을 분석하고, 정상인과 비교하여 간암환자에게서 ARD1 발현 수준이 높다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.DISCLOSURE Technical Problem The present invention has been made in order to solve the above problems in the prior art, and the present inventors analyzed tumor tissue and tumor surrounding tissues of hepatocellular carcinoma patients and found that the level of ARD1 expression was high in liver cancer patients Thereby completing the present invention.

이에, 본 발명의 목적은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물 및 간암 진행 단계 진단용 키트를 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for diagnosing progress of the liver cancer stage and a kit for the progress of the liver cancer stage, which comprises a substance for measuring the level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or the level of ARD1 protein.

본 발명의 다른 목적은 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함한 간암 예후예측용 키트 및 간암의 예후측정을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for predicting the prognosis of liver cancer including the step of measuring the expression level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) protein in hepatocellular carcinoma tissues and tissues surrounding liver cancer isolated from an individual, Method.

본 발명의 또 다른 목적은 피검체 유래의 혈액 샘플에서 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공방법 및 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide an information providing method for liver cancer diagnosis, comprising the step of measuring an expression level of mRNA of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or a protein encoded by the gene in a blood sample derived from a subject And a kit for the diagnosis of liver cancer.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기 목적을 달성하기 위하여, ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물 및 이를 포함하는 간암 진행 단계 진단용 키트를 제공한다. In order to accomplish the above object, there is provided a composition for diagnosing liver cancer progression and a kit for the diagnosis of liver cancer progression, which comprises a substance for measuring the level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or the level of ARD1 protein.

본 발명의 일 구현예로, 상기 ARD1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the ARD1 gene may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 ARD1 유전자의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the substance for measuring the level of the ARD1 gene may be a primer or a probe capable of amplifying the ARD1 gene.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the substance that measures the level of the ARD1 protein may be an antibody that specifically recognizes the ARD1 protein.

또한, 본 발명은 a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암의 예후가 더 나쁠 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 간암 예후예측용 키트를 제공한다.Also, the present invention provides a method for detecting an ARD1 (Arrest-defective 1 protein) protein, comprising the steps of: a) measuring the expression level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) b) comparing the expression level of the ARD1 protein in the liver cancer tissue and the expression level of the ARD1 protein in the liver cancer tissue in the step a); And c) comparing the expression level of ARD1 protein in step b) above, the larger the expression level of ARD1 protein in liver cancer tissue is, the worse the prognosis of liver cancer is, as compared with the amount of ARD1 protein expression in liver cancer tissue The present invention also provides a kit for predicting the prognosis of liver cancer.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 ARD1 단백질의 발현량을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the substance that measures the expression level of the ARD1 protein may be an antibody that specifically recognizes the ARD1 protein.

또한, 본 발명은 a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암의 예후가 더 나쁠 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예후측정을 위한 정보제공방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for detecting an ARD1 (Arrest-defective 1 protein) protein, comprising the steps of: a) measuring the expression level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) b) comparing the expression level of the ARD1 protein in the liver cancer tissue and the expression level of the ARD1 protein in the liver cancer tissue in the step a); And c) comparing the expression level of ARD1 protein in step b) above, the larger the expression level of ARD1 protein in liver cancer tissue is, the worse the prognosis of liver cancer is, as compared with the amount of ARD1 protein expression in liver cancer tissue A method for providing information for prognosis of liver cancer.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질의 발현량을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In another embodiment of the present invention, the method for measuring the expression level of the protein may be Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), and Protein Chip (FACS) were used for immunoassay, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, protein chip), but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNaseprotection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법일 수 있다.In another embodiment of the present invention, the method of measuring the gene expression level may be selected from the group consisting of RT-PCR, Competitive RT-PCR, Realtime RT-PCR ), RNase protection assay (RPA; RNaseprotection assay), Northern blotting, and DNA chip.

또한, 본 발명은 피검체 유래의 혈액 샘플에서 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method for providing information for diagnosis of liver cancer, comprising the step of measuring the expression level of mRNA of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or protein encoded by the gene in a blood sample derived from a subject do.

또한, 본 발명은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는데 사용되는, 간암 진단용 키트로서, 상기 간암 진단을 위하여 피검체 유래의 혈액 샘플을 이용하는 것을 특징으로 하는, 간암 진단용 키트를 제공한다.Also, the present invention provides a kit for the diagnosis of liver cancer, which is used for measuring the expression level of mRNA of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or protein encoded by the gene, wherein the blood sample derived from the subject is used for diagnosis of liver cancer And a liver cancer diagnosis kit.

간세포암종(hepatocellular carcinoma, HCC)은 단계적으로 진행되는바, 만성 간질환에서 발생되는 이형성 결절, 특히 고분화 이형성 결절은 전암병변으로서 다단계 간암발생 과정의 조기 변화로 볼 수 있다. 이와 같은 이형성 결절 단계를 거쳐 점차 악성도가 증가하여 전이도가 높으며 분화도가 좋지 않은 간암으로 발전하게 되므로, 최근 간암을 조기에 진단하기 위하여 노력이 집중되고 있다.Hepatocellular carcinoma (HCC) progresses gradually, and dysplastic nodules that develop in chronic liver disease, especially hyperdifferentiated dysplastic nodules, are precancerous lesions and can be seen as early changes in the development of multilevel hepatocellular carcinoma. Because the malignant progresses gradually through the dysplastic nodule stage, it develops into hepatocellular carcinoma with a high degree of metastasis and a poor degree of differentiation. Recently, efforts have been focused on early diagnosis of liver cancer.

이에, 본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있도록 간암 진행 단계 진단 및 간암 진단 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 따라 ARD1 발현 수준을 분석하면 간암을 조기에 진단하여 대응하고, 간암의 진행 단계를 파악하는데 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.Accordingly, the present invention relates to a liver cancer progression stage diagnosis kit and a liver cancer diagnosis kit so that the liver cancer can be diagnosed and predicted effectively in an early stage. When the level of ARD1 expression is analyzed according to the present invention, the liver cancer is diagnosed early, It is expected that it will be useful for understanding.

도 1은 간암 환자의 간암 조직 (T) 및 간암 주변 조직 (NT)에서의 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 발현을 나타내는 도이다.
도 2는 간암 환자의 간암 조직 (T) 및 간암 주변 조직 (NT)에서의 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 발현량을 정량화하여 나타내는 도이다.
도 3은 ARD1 발현 레벨과 간암 수술 후 재발률 및 생존율 사이의 관련성을 분석하기 위하여, 실험 대상자인 환자들 총 698명의 clinical characteristics을 나타내는 도이고, 도 4는 상기 실험 대상자인 환자들의 tumor characteristics을 나타내는 도이다.
도 5는 상기 실험 대상자들 698명의 간세포암종 조직에 면역화학염색을 시행하여 ARD1 발현 정도에 따라 실험 대상자들을 네 개의 그룹으로 나타낸 도이고, 도 6은 이와 같이 간세포암종 조직에서 살펴 본 ARD1의 발현 레벨을 도식화 하여 나타낸 도이다.
도 7은 면역화학염색 한 조직에서 미세혈관 침윤 (microvascular invasion; MVI)이 존재하는 경우, ARD1 발현이 높은 경향을 보임을 나타낸 도이다.
도 8은 분화도가 좋지 않은 간암에서 ARD1 과발현 정도가 높은 경향을 보임을 나타낸 도이다.
도 9는 근치적 간절제술을 시행 받았던 536명의 간세포암종 환자들을 대상으로 간세포암종 조직에서 ARD1의 발현이 높은 그룹에서 수술 후 재발률 (cumulative recurrence rate)이 높은 경향을 보임을 나타낸 도이고, 도 10은 상기 간세포암종 환자들을 대상으로 간세포암종 조직에서 ARD1의 발현이 높은 그룹에서 간암 수술 후 생존율 (survival rate)이 낮은 경향을 보임을 나타내는 도이다.
도 11은 간암의 전단계인 이형성 결절 (displastic nodule; DN)에서의 ARD1 레벨을 간 정상 조직 및 간암 조직과 비교하기 위하여, 실험 대상자들의 clinical characteristics을 나타내는 도이다.
도 12는 정상조직 (Normal)에서 이형성 결절 (DN), 그리고 간암 (hepatocellular carcinoma; HCC)으로 병세가 진행될수록 ARD1의 발현량이 증가함을 확인한 도이다.
도 13은 이형성 결절 환자 (DN)와 간암 환자 (HCC)의 ARD1 발현 정도를 비교하였을 때, 간암 환자의 ARD1 과발현 정도가 이형성 결절 환자에 비하여 더 높다는 사실을 확인한 도이다.
도 14는 이형성 결절의 분화도 (grade)에 따라 ARD1의 발현 정도를 관찰하였을 때, 고분화 이형성 결절 (High-grade DN)에서 ARD1의 발현 비율이 유의하게 높음을 확인한 도이다.
도 15는 quantitative RT-PCR을 통하여 혈액 샘플에서 ARD1 mRNA의 레벨을 확인한 결과, 대조군에 비하여 간암 환자에게서 상기 ARD1 mRNA의 레벨이 전반적으로 높음을 나타내는 도이다.FIG. 1 shows the expression of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) in liver cancer tissue (T) and liver cancer surrounding tissue (NT) in patients with liver cancer.
FIG. 2 is a graph showing quantitative expression of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) expression in liver cancer tissue (T) and liver cancer surrounding tissues (NT) in patients with liver cancer.
FIG. 3 is a graph showing the clinical characteristics of a total of 698 patients to be tested in order to analyze the relationship between the ARD1 expression level and the recurrence rate and survival rate after liver cancer surgery, and FIG. 4 is a graph showing the tumor characteristics to be.
FIG. 5 is a graph showing the results of immunochemical staining of 698 hepatocellular carcinoma tissues of the subjects, showing four groups of subjects according to the degree of ARD1 expression, and FIG. 6 shows the expression levels of ARD1 in hepatocellular carcinoma tissues Fig.
Figure 7 shows that ARD1 expression tends to be high in the presence of microvascular invasion (MVI) in immunochemically stained tissues.
FIG. 8 shows that the degree of overexpression of ARD1 is high in liver cancer of poor differentiation degree.
FIG. 9 is a graph showing a tendency that a cumulative recurrence rate tends to be higher in a group with high expression of ARD1 in hepatocellular carcinoma tissues in 536 HCC patients who had undergone curative hepatic resection, and FIG. 10 This shows that the survival rate of hepatocellular carcinoma patients tends to be low after hepatocarcinoma surgery in a group with high expression of ARD1 in hepatocellular carcinoma tissue.
11 is a graph showing the clinical characteristics of the subjects in order to compare the level of ARD1 in the displaced nodule (DN), which precedes the liver cancer, to liver normal tissues and liver cancer tissues.
FIG. 12 shows that the expression level of ARD1 increases as disease progresses to dysplasia nodule (DN) and hepatocellular carcinoma (HCC) in normal tissue (Normal).
FIG. 13 shows that the level of ARD1 overexpression in patients with dysplastic nodule (DN) and hepatocellular carcinoma (HCC) is higher than that with dysplastic nodule in liver cancer patients.
FIG. 14 is a graph showing that the expression ratio of ARD1 in the high-grade DN was significantly higher when the degree of expression of ARD1 was observed according to the grade of dysplastic nodule.
FIG. 15 is a graph showing the level of ARD1 mRNA level in hepatocellular carcinoma patients as compared with the control group, as a result of confirming the levels of ARD1 mRNA in blood samples through quantitative RT-PCR.

본 발명자들은 간세포암종 환자의 종양 조직 및 종양 주변 조직을 분석하고, 정상인과 비교하여 간암환자에게서 ARD1 발현 수준이 높다는 사실을 확인함으로써, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors have analyzed tumor tissue and tumor surrounding tissues in patients with hepatocellular carcinoma and confirmed that the level of ARD1 expression is high in liver cancer patients as compared with normal individuals, thereby completing the present invention.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물을 제공함에 특징이 있다.The present invention is characterized by providing a composition for diagnosing liver cancer progression, which comprises a substance that measures the level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or the level of ARD1 protein.

본 발명자들은, ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자가 종양 주변 조직에 비해 종양 조직에서 높게 발현되는 점 및 정상인과 비교하여 간암환자에게서 ARD1 발현 수준이 높다는 사실을 확인할 수 있었으며, 상기 ARD1 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다.The inventors of the present invention confirmed that ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene is highly expressed in tumor tissue as compared with tumor surrounding tissue and that ARD1 expression level is high in liver cancer patients compared with normal human. The sequence is shown in SEQ ID NO: 1.

본 발명의 일 실시예에서는, 16명의 간암환자들로부터 간 조직 샘플을 얻어 간 종양 조직에서 특이적으로 ARD1의 발현이 증가한다는 것을 확인하였다(실시예 1 참조).In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the expression of ARD1 was specifically increased in tumor tissues obtained from liver tissue samples from 16 liver cancer patients (see Example 1).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 면역화학염색 방법을 통하여 ARD1의 발현 레벨을 확인하였다(실시예 2 참조).In another embodiment of the present invention, the level of expression of ARD1 was determined by immunochemical staining (see Example 2).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 간암 수술 후의 ARD1 발현 레벨을 확인하여 ARD1과 간암의 재발률 및 간암 환자의 생존율 사이의 관련성을 분석하였다(실시예 3 참조).In another embodiment of the present invention, the level of ARD1 expression after liver cancer surgery was determined to analyze the association between ARD1 and the recurrence rate of liver cancer and the survival rate of patients with liver cancer (see Example 3).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 간암의 진행 단계에 따라 ARD1의 발현 레벨이 증가한다는 것을 확인하였으며(실시예 4 참조), 또한, quantitative RT-PCR을 통하여 혈액 샘플에서 ARD1 mRNA 레벨을 확인한 결과, 간암 환자의 ARD1 발현 레벨이 높다는 사실을 확인하였다(실시예 5 참조). In another embodiment of the present invention, it has been confirmed that the level of ARD1 expression increases with the progression of liver cancer (see Example 4), and furthermore, ARD1 mRNA levels in blood samples were confirmed by quantitative RT-PCR, It was confirmed that the levels of ARD1 expression in liver cancer patients were high (see Example 5).

따라서 본 발명에 따른 ARD1 유전자의 발현 레벨 측정을 통하여 간암을 조기에 진단할 수 있으며, 혈액 샘플을 사용하는 간암 진단 키트를 개발하는 등 간암의 진단이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.Therefore, the expression level of the ARD1 gene according to the present invention can be used to diagnose liver cancer early, and a liver cancer diagnosis kit using a blood sample can be developed and used for various purposes and purposes requiring diagnosis of liver cancer.

이에, 본 발명은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 진행 단계 진단용 조성물 및 이를 포함하는 간암 진행 단계 진단용 키트를 제공한다. Accordingly, the present invention provides a composition for diagnosing liver cancer progression and a kit for the diagnosis of liver cancer progression, which comprises a substance for measuring an ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene level or an ARD1 protein level.

또한, 본 발명은 a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암의 예후가 더 나쁠 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 간암 예후예측용 키트를 제공한다.Also, the present invention provides a method for detecting an ARD1 (Arrest-defective 1 protein) protein, comprising the steps of: a) measuring the expression level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) b) comparing the expression level of the ARD1 protein in the liver cancer tissue and the expression level of the ARD1 protein in the liver cancer tissue in the step a); And c) comparing the expression level of ARD1 protein in step b) above, the larger the expression level of ARD1 protein in liver cancer tissue is, the worse the prognosis of liver cancer is, as compared with the amount of ARD1 protein expression in liver cancer tissue The present invention also provides a kit for predicting the prognosis of liver cancer.

또한, 본 발명은 a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 단백질의 발현량을 측정하는 단계; b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암의 예후가 더 나쁠 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예후측정을 위한 정보제공방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for detecting an ARD1 (Arrest-defective 1 protein) protein, comprising the steps of: a) measuring the expression level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) b) comparing the expression level of the ARD1 protein in the liver cancer tissue and the expression level of the ARD1 protein in the liver cancer tissue in the step a); And c) comparing the expression level of ARD1 protein in step b) above, the larger the expression level of ARD1 protein in liver cancer tissue is, the worse the prognosis of liver cancer is, as compared with the amount of ARD1 protein expression in liver cancer tissue A method for providing information for prognosis of liver cancer.

본 발명에서, "진단"이란 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 진행 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.In the present invention, " diagnosis " means confirming a pathological condition. For the purpose of the present invention, the diagnosis is to confirm the progress of liver cancer by confirming the presence or absence of expression of a liver cancer diagnostic marker. Diagnosis of liver cancer involves determining the presence or absence of development of liver cancer, development and alleviation of liver cancer by checking the presence or absence and expression level of the liver cancer diagnostic marker.

본 발명에서, "예후측정"이란 간암으로 진단 후 치료를 받고 회복 여부를 판별하는 것을 포함하는 것이다.In the present invention, " prognostic measurement " includes diagnosis of hepatocellular carcinoma and determination of recovery.

또한, "진단용 마커 (diagnosis marker)"란 간암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암 세포에서 발현량이 증가하는 ARD1 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 ARD1 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.The term " diagnosis marker " means a substance capable of distinguishing hepatocellular carcinoma cells from normal cells. The term " diagnosis marker " means a polypeptide or nucleic acid (for example, mRNA or the like) , Lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like. The marker for liver cancer diagnosis provided by the present invention may be an ARD1 gene or a protein having an increased expression level in liver cancer cells as compared with normal cells, and preferably the ARD1 gene has a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1.

본 발명에서 상기 ARD1 유전자의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 상기 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.In the present invention, the substance measuring the level of the ARD1 gene may be a primer or a probe capable of amplifying the ARD1 gene, and the substance measuring the level of the ARD1 protein may be an antibody specifically recognizing the ARD1 protein.

본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.The term " primer " in the present invention means a short nucleic acid sequence capable of forming a base pair with a complementary template with a short free 3-terminal hydroxyl group and functioning as a starting point for template strand copying. The primer can initiate DNA synthesis in the presence of reagents and four different nucleoside triphosphates for polymerization reactions (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) at appropriate buffer solutions and temperatures.

본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지 (Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.The term " probe " in the present invention means a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few nucleotides or hundreds of nucleotides that can specifically bind to mRNA and is labeled so that presence or absence of a specific mRNA Can be confirmed. The probe can be produced in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.In the present invention, " antibody " means a specific protein molecule directed against an antigenic site. For purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a marker protein and includes both polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and recombinant antibodies.

본 발명의 유전자는 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다.Since the nucleic acid sequence of the present invention is registered in the gene bank, a person skilled in the art can design an antisense oligonucleotide, a primer pair or a probe which specifically amplifies a specific region of these genes based on the above sequence.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.The antisense oligonucleotides, primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, capping, substitution with one or more of the natural nucleotide analogs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methylphosphonate, phosphotriester, Amidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).

또한, 본 발명은 피검체 유래의 혈액 샘플에서 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method for providing information for diagnosis of liver cancer, comprising the step of measuring the expression level of mRNA of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or protein encoded by the gene in a blood sample derived from a subject do.

또한, 본 발명은 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는데 사용되는, 간암 진단용 키트로서, 상기 간암 진단을 위하여 피검체 유래의 혈액 샘플을 이용하는 것을 특징으로 하는, 간암 진단용 키트를 제공한다.Also, the present invention provides a kit for the diagnosis of liver cancer, which is used for measuring the expression level of mRNA of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or protein encoded by the gene, wherein the blood sample derived from the subject is used for diagnosis of liver cancer And a liver cancer diagnosis kit.

본 발명의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 포함한다. 이때, 인간 대상체는 간암이 발병했을 것으로 의심되는 사람, 간염, 간경화 환자, 또는 의심되지 않는 사람으로 간암 진단 여부가 필요한 사람을 포함한다. The methods of the present invention include mammals, particularly humans. At this time, the human subject includes a person who is suspected of having liver cancer, a hepatitis, a liver cirrhosis patient, or a person who is not suspected and needs to be diagnosed with liver cancer.

본 발명에서 "생물학적 시료"는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 생물학적 시료에서 존재하는 ARD1 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 증가된 경우, 간암이 진행된 것으로 판정할 수 있다.In the present invention, the "biological sample" may be, but not limited to, tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva and urine. In addition, when the expression level or protein amount of the ARD1 gene present in the biological sample is increased as compared with the control group, it can be judged that the liver cancer has progressed.

본 발명에서 "유전자 발현량 측정"이란 간암의 진행 여부를 확인하기 위하여 간 조직 세포에서 상기 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, " measurement of gene expression level " is a process of confirming the presence or absence of mRNA and the expression level of the gene in liver tissue cells in order to confirm the progress of liver cancer, and measuring the amount of mRNA. For example, RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, and RNase protection assay (RPA). RNase protection assay, Northern blotting, DNA chip, and the like.

본 발명에서 유전자의 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다. 본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.The agent for measuring the level of a gene in the present invention is preferably an antisense oligonucleotide, a primer pair or a probe. In the present invention, " antisense " means that the antisense oligomer is hybridized with the target sequence in the RNA by Watson-Crick base pairing to form the sequence of the nucleotide base, typically within the target sequence, And an oligomer having a backbone between subunits. Oligomers may have an exact sequence complement or approximate complementarity to the target sequence. This antisense oligomer can alter the processing of mRNA that blocks or inhibits translation of mRNA and produces splice variants of mRNA.

본 발명에서 "단백질 발현량 측정"이란 간암의 진행 여부를 확인하기 위하여 간 조직 세포에서 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.In the present invention, " measurement of protein expression level " is a process of confirming the presence and expression level of the protein expressed from the gene of the present invention in liver tissue cells in order to confirm the progress of liver cancer, and measuring the amount of protein. Examples of the assay methods include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis But are not limited to, tissue immuno staining, immunoprecipitation assays, complement fixation assays, fluorescence activated cell sorters (FACS), protein chips, and the like. The agent for measuring the protein expression level in the present invention is preferably an antibody.

본 발명에서 "검출"이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.In the present invention, the term " detection " includes quantitative and / or qualitative analysis, including detection of presence and absence and detection of the expression level, and such methods are well known in the art and are well known to those skilled in the art You will be able to choose a method.

본 발명에서 "이형성 결절"이란, 1994년 world congress of gastroenterology에서 working international party의 토의를 거쳐 제정한 것으로서, 이형성 결절 (dysplastic nodule; DN)은 현재로서는 양성인지 악성인지 확실히 결정하기 어려우나 앞으로 간세포 암종이 발생될 가능성이 높다는 생물학적 특성에 중점을 둔 명칭이다. 이형성 결절은 이형성을 동반한 장경 1mm 이상의 간의 결절성 병변으로 확실한 악성의 조직학적 소견은 없으며 대부분 간경변증에서 발생한다. 육안 소견상 이형성 결절은 대부분 주위 간조직과 색, 성상 등이 틀리며 절단면이 불룩하게 나오는 특징을 보이며, 이형성 병소 (dysplastic foci)는 장경 1mm 이하의 간세포 군집으로 이형성은 관찰되나 확실한 악성의 조직학적 소견은 없는 것을 지칭하는데, 장경 1mm 이상은 이형성 결절로, 그 이하는 이형성 병소로 정의함으로써 이형성 결절을 진단 시 병변의 크기는 중요성이 줄어들었다.In the present invention, "dysplastic nodule" was established in 1994 through discussion of working international party in world congress of gastroenterology. Dysplastic nodule (DN) is currently difficult to determine positively or malignantly, but hepatocellular carcinoma It is a name with an emphasis on biological characteristics that are likely to occur. The dysplastic nodule is a nodular lesion of the liver with a dysplasia of greater than 1 mm in diameter. There is no definite malignant histologic finding, and it usually occurs in cirrhosis. The dysplastic nodule is characterized by a heterogeneous appearance of the surrounding liver, color, and features. The dysplastic foci is a hepatocellular mass with a diameter of less than 1 mm. However, histologic findings The lesion size is less important in diagnosing dysplastic nodules when more than 1 mm in diameter is defined as a dysplastic nodule, and less than 1 mm in dysplastic lesion.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 간암 조직 및 간암 주변 조직에서의 ARD1 발현 레벨 확인Example 1. Confirmation of ARD1 expression level in liver cancer tissue and liver cancer tissue

1-1. 시료의 준비 (조직 샘플)1-1. Preparation of sample (tissue sample)

16명의 환자들로부터 간 조직 샘플을 얻었다. 본 실시예에서 사용된 상기 조직 샘플들은 서울아산병원 임상연구심의위원회의 승인을 받은 것이며, 헬싱키 선언의 요구에 부합되도록 사전에 참가자들로부터 동의를 받았다. 각 환자의 특성치는 하기 표 1에 나타내었다.Liver tissue samples were obtained from 16 patients. The tissue samples used in this example were approved by the Asan Medical Center clinical research review committee and were agreed in advance by the participants to meet the requirements of the Helsinki Declaration. The characteristics of each patient are shown in Table 1 below.

항목Item 특성치Characteristic value 연령 (년, 평균±SD)Age (years, mean ± SD) 59 ± 11.559 ± 11.5 성별 (M:F)Sex (M: F) 12 : 412: 4 간경변 유/무Liver cirrhosis 7/87/8 원인 (HBV/HCV/NBNC)Causes (HBV / HCV / NBNC) 12/1/312/1/3 HCC 크기 (cm, rnage)HCC size (cm, rnage) 1.4 ~ 11.81.4 to 11.8

*간암 환자 (총 16명) 특성치* Patients with liver cancer (16 patients)

1-2. 간암 조직에서의 ARD1 발현 증가 확인1-2. Increased expression of ARD1 in liver cancer tissue

ARD1 (Arrest-defective 1 protein)의 발현을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-1에서와 같이 간암 환자 간암 조직 및 간암 주변 조직을 채취하여 하기와 같이 실험하였다.In order to confirm the expression of ARD1 (Arrest-defective 1 protein), hepatocellular carcinoma tissues and tissues surrounding hepatocellular carcinoma were collected as described in Example 1-1.

분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직을 세포 용해 버퍼 (lysis buffer)에서 균일화하여 단백질을 추출하고 BCA assay로 정량하였다. 각 샘플당 40 μg의 단백질을 95 ℃에서 5 분간 가열하여 변성 (denaturation) 시킨 후, SDS-PAGE 전기영동법으로 분리하였다. 이를 니트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane)에 옮긴 후 ARD1 항체를 1:3000의 비율로 희석하여 4 ℃에서 16 시간, HRP 태그 된 2차 항체를 상온에서 1 시간 반응시키고, 형광이미지 분석기 (LAS-4000)로 HRP 활성을 측정하였다. Image J 프로그램을 이용하여 촬영된 ARD1 밴드의 덴시토메트리 (densitometry)를 측정하여 ARD1의 발현량을 정량화 하였으며, 같은 방법으로 빈쿨린 (vinculin)을 정량하여 표준화하였다.The isolated hepatocarcinoma tissues and surrounding liver tissues were homogenized in lysis buffer and proteins were extracted and quantitated by BCA assay. 40 μg of protein per each sample was heated at 95 ° C for 5 minutes to denaturation, and then separated by SDS-PAGE electrophoresis. After transferring the antibody to a nitrocellulose membrane, the ARD1 antibody was diluted at a ratio of 1: 3000, reacted at 4 ° C for 16 hours, reacted with HRP-labeled secondary antibody for 1 hour at room temperature, and analyzed with a fluorescence image analyzer (LAS- HRP activity was measured. The expression level of ARD1 was quantitated by measuring the densitometry of the ARD1 band photographed using the Image J program, and vinculin was quantified and standardized in the same manner.

그 결과, 도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 간암 주변 조직에 비해 간암 조직에서 ARD1의 발현이 증가하며, ARD1의 발현 증가폭이 클수록 간세포암종의 미세혈관성 침입 (microvascular invasion)이 증가하는 경향을 확인하였다.As a result, as shown in Figs. 1 and 2, the expression of ARD1 was increased in liver cancer tissues compared with the tissues surrounding liver cancer, and the microvascular invasion of hepatocellular carcinoma tended to increase with an increase in expression of ARD1 .

실시예 2. 면역화학염색 방법을 통한 ARD1 발현 레벨 확인Example 2. Identification of ARD1 expression level by immunochemical staining method

면역화학염색(immunohistochemical staining)을 이용해 ARD1의 발현 레벨을 확인하기 위하여, 실험 대상자들의 tissue microarray block 조직에서 OptiView DAB IHC Detection Kit (Ventana Medical System)를 이용하여 Bench Mark XT automatic immunostaining device (Ventana Medical System, Tucson, AZ)에서 제조업체의 지침에 따라 ARD1 항체 (Ab155687, abcam, CAMBRIDGE, UK)의 면역화학염색을 시행하였다. 각 조직의 절편 (4 ㎛)을 실레인 처리된 유리 슬라이드 상에 붙인 후, 실온에서 10분간, 65°C 인큐베이터에서 20분간 건조시켰다. 그 후, CC1 buffer를 32분간 처리한 다음, ARD1 항체를 이용하여 조직표본염색장치 (autoimmunostainer)에서 16분간 염색시켰다. To determine the level of expression of ARD1 using immunohistochemical staining, we used the OptiView DAB IHC Detection Kit (Ventana Medical System) in the tissue microarray block tissue of the subjects, using a Bench Mark XT automatic immunostaining device (Ventana Medical System, (Ab155687, abcam, CAMBRIDGE, UK) were immunochemically stained according to manufacturer's instructions. Sections of each tissue (4 占 퐉) were stuck onto a silane-treated glass slide and then dried for 10 minutes at room temperature and 20 minutes in a 65 ° C incubator. Subsequently, the CC1 buffer was treated for 32 minutes and stained for 16 minutes in an autoimmunostainer using ARD1 antibody.

상기와 같이 면역화학염색을 시행한 후, ARD1 면역염색의 강도는 전체 세포 중 면역 염색 양성을 보이는 세포의 비율로 결정하였는데, 모든 세포가 전혀 염색되지 않는 경우는 none; 일부의 세포가 양성 소견을 보이지만, 그 비율이 1/3을 넘지 않는 경우는 1+(+); 전체의 1/3에서 2/3사의 비율을 보이는 경우를 2+ (++); 2/3이상 세포가 면역 화학 염색에서 양성 소견을 보이는 경우를 3+(+++)로 정의하였다. After immunochemical staining, the intensity of ARD1 immunostaining was determined as the ratio of cells showing immunostaining in all cells. None of the cells were stained at all; Some cells show positive findings, but when the ratio does not exceed 1/3, 1 + (+); 2 + (++) indicates the ratio of 1/3 to 2/3 of the total; 3 + (+++) was defined as 2/3 or more cells with positive immunohistochemical staining.

실시예 3. ARD1 발현 레벨과 간암 수술 후 재발률 및 생존율 사이의 관련성 분석Example 3. Analysis of Relation Between ARD1 Expression Level and Recurrence Rate and Survival Rate after Liver Cancer Surgery

3-1. 간암 환자들의 ARD1 발현 레벨 확인3-1. Identification of ARD1 expression levels in patients with liver cancer

조직학적으로 간세포암종으로 확진된 698명의 환자들을 대상으로 ARD1 발현 레벨을 확인하였는데, 이중 162명은 간이식을 받았으며 536명은 근치적 간절제술을 받았다. 도 3 및 도 4는 실험 대상자인 환자들 총 698명의 clinical characteristics과 tumor characteristics을 각각 나타낸 것이다. 간세포암종의 특성과 ARD1 면역화학염색 발현정도 사이의 연관성에 대해 평가하기 위하여, 상기 실험 대상자들의 간세포암종 조직을 이용해 실시예 2에 기재된 방법으로 모든 간세포암종 tissue microarray block 조직에서 ARD1 항체 (Ab155687, abcam, CAMBRIDGE, UK)의 면역화학염색을 시행하였다. The level of ARD1 expression was confirmed in 698 patients with histologically proven HCC, of whom 162 had undergone liver transplantation and 536 underwent radical liver resection. Figures 3 and 4 show clinical characteristics and tumor characteristics of a total of 698 patients, respectively. To evaluate the relationship between the characteristics of hepatocellular carcinoma and the degree of expression of ARD1 immunochemistry, ARD1 antibody (Ab155687, abcam) was used in all hepatocellular carcinoma tissue microarray block tissues by the method described in Example 2 using hepatocellular carcinoma tissues of the above subjects , CAMBRIDGE, UK) were immunochemically stained.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 환자별 간세포암종 조직에서의 ARD1 발현 정도가 상이하였으며, ARD1 발현 정도에 따라 실험대상자들을 네 개의 그룹으로 나눌 수 있었다(-, nothing; +, <1/3; ++, 1/3 ~ 2/3; +++, >2/3). 도 6은 상기와 같이 간세포암종 조직에서 살펴 본 ARD1의 발현 레벨을 도식화하여 나타낸 것이다.As a result, as shown in FIG. 5, the degree of ARD1 expression in the hepatocellular carcinoma tissues was different, and the subjects were divided into four groups according to the degree of ARD1 expression (-, nothing; +, <1/3 ; ++, 1/3 to 2/3; +++, > 2/3). FIG. 6 is a graphical representation of the expression level of ARD1 in hepatocellular carcinoma tissue as described above.

3-2. 간암 수술 후 ARD1 발현 레벨 확인 3-2. Identification of ARD1 expression level after liver cancer surgery

ARD1 발현 정도와 간암 환자들의 수술 후 간암의 재발 여부 및 생존율 사이의 관련성을 분석하기 위하여, 실험 대상자들을 상대로 간암 수술 후 ARD1 발현 레벨을 확인하였다. In order to analyze the relationship between the degree of ARD1 expression and the recurrence rate and survival rate of patients with hepatocellular carcinoma after the surgery, the levels of ARD1 expression after liver cancer surgery were checked against the subjects.

그 결과, 실시예 2에 기재된 방법에 따라 면역화학염색 한 조직에서 미세혈관 침윤 (microvascular invasion; MVI) 존재 여부에 따른 ARD1 발현 정도를 비교하였을 때, 미세혈관 침윤이 존재하는 경우, ARD1 발현이 높은 경향을 보였다(도 7 참조). 또한, 면역화학염색을 시행한 간암조직에서 ARD1 발현 정도와 간암 분화도와의 관계를 비교하였을 때, 분화도가 좋지 않은 간암에서 ARD1 과발현 정도가 높은 경향을 보였다(도 8 참조). As a result, when the degree of ARD1 expression was compared according to the presence of microvascular invasion (MVI) in the immunochemically stained tissue according to the method described in Example 2, in the presence of microvascular invasion, ARD1 expression was high (See Fig. 7). Furthermore, when the relationship between the degree of ARD1 expression and the degree of liver cancer differentiation was compared in the immunohistochemical liver cancer tissues, the degree of ARD1 overexpression was high in the liver cancer with poor differentiation (see FIG. 8).

한편, 실험 대상자 중 간이식을 받았던 경우를 제외하고, 근치적 간절제술을 시행 받았던 536명의 간세포암종 환자들만을 대상으로 간세포암종 조직에서의 ARD1 발현정도와 수술 후 재발률을 분석한 결과, 간세포암종 조직에서 ARD1의 발현이 높은 그룹에서 수술 후 재발률(cumulative recurrence rate)이 높은 경향을 확인하였으며(도 9 참조), 또한, ARD1의 발현이 높은 그룹에서 간암 수술 후 생존율(survival rate)이 낮은 경향을 확인하였다(도 10 참조).In contrast, only 536 patients with hepatocellular carcinoma who had undergone curative hepatic resection, except for liver transplant recipients, analyzed the degree of ARD1 expression and the postoperative recurrence rate in hepatocellular carcinoma tissues, (FIG. 9), and the survival rate after liver cancer surgery was low in the high expression group of ARD1 (FIG. 9) (See FIG. 10).

상기 결과들을 종합하면, 회복도가 좋지 않은 간암 환자들에게서 ARD1의 발현량이 높다는 것을 관찰할 수 있으므로, 이는 ARD1의 발현정도와 간암의 분화도, 재발률, 및 생존율과의 관련성이 있음을 시사한다. These results suggest that the expression level of ARD1 is high in patients with poor recovery of liver cancer, suggesting that there is a relationship between the degree of ARD1 expression and the degree of differentiation, recurrence rate, and survival rate of liver cancer.

실시예 4. 간암의 진행 단계에 따른 ARD1 발현 레벨 확인Example 4. Confirmation of ARD1 expression level according to progress of liver cancer

간암의 전단계인 이형성 결절 (displastic nodule; DN)에서의 ARD1 레벨을 간 정상 조직 (Normal liver) 및 간암 조직 (hepatocellular carcinoma; HCC)과 비교하기 위하여, 조직학적으로 확진된 이형성 결절 환자 51명 [저분화 이형성 결절 (Low-grade DN) 20명 (39%); 고분화 이형성 결절 (High-grade DN) 31명 (61%)] 의 ARD1 발현 정도를 평가하였으며, 이와 함께 226명의 간세포암종 환자들 및 4명의 정상인의 간조직에서의 ARD1 발현정도를 비교 분석하였다. 도 11은 상기 실험 대상자들의 clinical characteristics을 나타내는 도이다.In order to compare the level of ARD1 in the displaced nodule (DN), which precedes the liver cancer, with normal liver and hepatocellular carcinoma (HCC), 51 patients with histologically confirmed dysplastic nodule 20 (39%) of low-grade DN; (High-grade DN) (31% (61%)). In addition, the level of ARD1 expression in liver tissue of 226 patients with hepatocellular carcinoma and 4 healthy controls was analyzed. 11 is a graph showing clinical characteristics of the subjects.

간암은 저분화 이형성 결절 (Low-grade displastic nodule)에서 고분화 이형성 결절 (High-grade displastic nodule)을 거쳐 간암으로 여러 단계에 걸쳐서 진행되는데, 상기 과정에서 종양 세포는 분화된 세포에서 점차 더 미분화되는 탈분화(dedifferentiation)가 단계적으로 서서히 일어나고, 이에 따라 악성도는 점차 증가하여, 미세혈관 침윤(microvascular invasion)이 존재하여 전이도가 높으며 분화도가 좋지 않은 간암으로 발전하게 된다. Liver cancer progresses from low-grade dysplastic nodule to high-grade dysplastic nodule to liver cancer in which the tumor cells become more undifferentiated in differentiated cells Dedifferentiation gradually develops gradually, and malignancy gradually increases, resulting in microvascular invasion, which leads to high metastatic and poorly differentiated liver cancer.

이에 상기 실시예 2의 방법에 따라, 면역화학염색을 시행하여 간암의 진행 단계에 따른 ARD1의 발현 레벨을 분석한 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 정상조직 (Normal)에서 이형성 결절 (DN), 그리고 간암 (HCC)으로 간암이 진행될수록 ARD1의 발현량이 증가함을 확인하였다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 이형성 결절 환자와 간암 환자의 ARD1 발현 정도를 비교하였을 때, 간암 환자의 ARD1 과발현 정도가 이형성 결절 환자에 비하여 더 높다는 사실을 관찰할 수 있었다.As a result of analyzing the level of expression of ARD1 according to the progression stage of liver cancer by immunochemical staining according to the method of Example 2, as shown in Fig. 12, it was found that in normal tissues (Normal), dysplastic nodules (DN) And it was confirmed that the expression level of ARD1 increased as liver cancer progressed to liver cancer (HCC). In addition, as shown in FIG. 13, when ARD1 expression level of patients with dysplastic nodule and liver cancer was compared, it was observed that the level of ARD1 overexpression in liver cancer patients was higher than that of dysplastic nodule patients.

아울러, 도 14에 나타낸 바와 같이, 이형성 결절의 분화도 (grade)에 따른 ARD1의 발현 정도를 관찰하였을 때, 고분화 이형성 결절 (High-grade DN)에서 ARD1의 발현 비율이 유의하게 높다는 사실을 확인할 수 있었다.In addition, as shown in FIG. 14, when the degree of expression of ARD1 according to the grade of dysplastic nodule was observed, it was confirmed that the expression ratio of ARD1 in the high-grade DN was significantly higher there was.

상기 결과들을 종합하면, 간 정상조직에서 이형성 결절, 그리고 간암조직으로 점차 병세가 진행돼 간암이 악성화 되어 갈수록 ARD1의 발현량이 높다는 사실을 관찰할 수 있는바, 이는 ARD1 발현 레벨을 측정하여 이형성 결절의 분화 정도를 판정하고, 간암을 이형성 결절 단계에서 조기에 진단하는 등, ARD1을 간암 진행 단계 진단의 용도로 이용할 수 있음을 시사한다. These results indicate that the level of expression of ARD1 is higher as liver cancer progresses gradually from the liver normal tissue to the dysplastic nodule and liver cancer tissue, And it is suggested that ARD1 can be used for the diagnosis of liver cancer progression stage by determining the degree of differentiation and early diagnosis of liver cancer in the dysplastic nodule stage.

실시예 5. 혈액 샘플에서의 ARD1 발현 레벨 확인Example 5. Identification of ARD1 expression levels in blood samples

상기 실시예 2의 방법에 따른 면역화학염색 방법뿐만이 아니라, 혈액 샘플을 통해서도 ARD1 발현 레벨을 관찰하여 간암을 진단할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.In order to confirm not only the immunochemical staining method according to the method of Example 2 but also the blood level, the level of ARD1 expression was observed to diagnose liver cancer, the following experiment was conducted.

먼저, 혈액 시료를 2500 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 3개의 층 [hematocrit (아래층), buffy coat (중간층), plasma (상층)]으로 분리하였다. 그 다음 상층 혈장을 제거한 후, buffy coat를 조심스럽게 분리하여 1.5ml 튜브에 옮겼다. 분리한 buffy coat를 RBC lysis buffer에 현탁 시켜, 섞여 있는 적혈구를 용해시킨 후, 다시 2500 rpm에서 5분간 원심분리 하여 RBC lysis buffer를 제거하고, 세포 펠렛 (pellet)을 얻었다. 이 pellet을 TRIzol reagent로 용해하여 RNA를 분리한 후, 2ug의 RNA를 MMLV reverse transcriptase (Promega)로 역전사하여, cDNA를 얻어내었다. 그 후, StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems)를 사용하여, quantitative real-time PCR을 수행해 mRNA 상대량 (Relative quantity)을 측정하였다. mRNA 상대량은 GAPDH로 표준화하였다.First, the blood samples were centrifuged at 2500 rpm for 5 minutes and separated into three layers (hematocrit (lower layer), buffy coat (middle layer), plasma (upper layer)). After removing the upper plasma, the buffy coat was carefully removed and transferred to a 1.5 ml tube. The separated buffy coat was suspended in RBC lysis buffer, and the mixed red blood cells were dissolved. Then, RBC lysis buffer was removed by centrifugation at 2500 rpm for 5 minutes to obtain a cell pellet. The pellet was dissolved in TRIzol reagent to separate RNA, and 2 ug of RNA was reverse-transcribed with MMLV reverse transcriptase (Promega) to obtain cDNA. Subsequently, quantitative real-time PCR was performed using a StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) to measure the relative quantity of mRNA. Large amounts of mRNA were normalized to GAPDH.

이와 같이 혈액 샘플에서 quantitative RT-PCR을 통하여 ARD1 mRNA 레벨을 확인한 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 간암 환자에서 ARD1 mRNA 레벨이 전반적으로 높음을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, 간암 진단 키트를 개발하는데 혈액에서 검출한 ARD1 발현 레벨을 이용할 수 있을 것으로 기대된다.As shown in FIG. 15, the ARD1 mRNA level was quantitatively analyzed by quantitative RT-PCR in the blood sample. As a result, it was confirmed that the ARD1 mRNA level was generally higher in liver cancer patients than in the control group. From the above results, it is expected that the level of ARD1 expression detected in blood can be utilized to develop a liver cancer diagnostic kit.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R & DB FOUNDATION THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Use of ARD1 as a Liver cancer diagnostic marker <130> MP17-118 <150> KR 1020160116510 <151> 2016-09-09 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1136 <212> DNA <213> Arrest-defective 1 protein <400> 1 gaccggctcc gcgcattggc ccgccccgtg cgctggcctg tcccgcgcat tggccaagcg 60 gccgggagga cgggcccggc ggccgtgcac ttccggccgg tggccggccc ggcgcgcacc 120 gccccttccg ccgtcgccca gcgagcccag ctccggtccc agccccggcc gtcccggcgt 180 cgcttcggag cgcggcggca gctgactgcg ccttcacgat ccgctgggac ccgcgagccc 240 cgccgccgtt atgaacatcc gcaatgcgag gccagaggac ctaatgaaca tgcagcactg 300 caacctcctc tgcctgcccg agaactacca gatgaaatac tacttctacc atggcctttc 360 ctggccccag ctctcttaca ttgctgagga cgagaatggg aagattgtgg ggtatgtcct 420 ggccaaaatg gaagaggacc cagatgatgt gccccatgga catatcacct cattggctgt 480 gaagcgttcc caccggcgcc tcggtctggc tcagaaactg atggaccagg cctctcgagc 540 catgatagag aacttcaatg ccaaatatgt ctccctgcat gtcaggaaga gtaaccgggc 600 cgccctgcac ctctattcca acaccctcaa ctttcagatc agtgaagtgg agcccaaata 660 ctatgcagat ggggaggacg cctatgccat gaagcgggac ctcactcaga tggccgacga 720 gctgaggcgg cacctggagc tgaaagagaa gggcaggcac gtggtgctgg gtgccatcga 780 gaacaaggtg gagagcaaag gcaattcacc tccgagctca ggagaggcct gtcgcgagga 840 gaagggcctg gctgccgagg atagtggtgg ggacagcaag gacctcagcg aggtcagcga 900 gaccacagag agcacagatg tcaaggacag ctcagaggcc tccgactcag cctcctagag 960 cctgccccat cccctcctca ccccacgagc tttcacaata aattcgctcc gtggcactgg 1020 ggaactttgt gtgtgagcgc gcgcacattt agagggtgtg tttctccagg tcctctggtg 1080 gggatgtgag ccttggcctt ttgacccaga gcatcctgaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1136 <110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R & D FOUNDATION          THE ASAN FOUNDATION          University of Ulsan Foundation for Industry Cooperation <120> Use of ARD1 as a Liver cancer diagnostic marker <130> MP17-118 <150> KR 1020160116510 <151> 2016-09-09 <160> 1 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1136 <212> DNA <213> Arrest-defective 1 protein     <400> 1 gaccggctcc gcgcattggc ccgccccgtg cgctggcctg tcccgcgcat tggccaagcg 60 gccgggagga cgggcccggc ggccgtgcac ttccggccgg tggccggccc ggcgcgcacc 120 gccccttccg ccgtcgccca gcgagcccag ctccggtccc agccccggcc gtcccggcgt 180 cgcttcggag cgcggcggca gctgactgcg ccttcacgat ccgctgggac ccgcgagccc 240 cgccgccgtt atgaacatcc gcaatgcgag gccagaggac ctaatgaaca tgcagcactg 300 caacctcctc tgcctgcccg agaactacca gatgaaatac tacttctacc atggcctttc 360 ctggccccag ctctcttaca ttgctgagga cgagaatggg aagattgtgg ggtatgtcct 420 ggccaaaatg gaagaggacc cagatgatgt gccccatgga catatcacct cattggctgt 480 gaagcgttcc caccggcgcc tcggtctggc tcagaaactg atggaccagg cctctcgagc 540 catgatagag aacttcaatg ccaaatatgt ctccctgcat gtcaggaaga gtaaccgggc 600 cgccctgcac ctctattcca acaccctcaa ctttcagatc agtgaagtgg agcccaaata 660 ctatgcagat ggggaggacg cctatgccat gaagcgggac ctcactcaga tggccgacga 720 gctgaggcgg cacctggagc tgaaagagaa gggcaggcac gtggtgctgg gtgccatcga 780 gaacaaggtg gagagcaaag gcaattcacc tccgagctca ggagaggcct gtcgcgagga 840 gaagggcctg gctgccgagg atagtggtgg ggacagcaag gacctcagcg aggtcagcga 900 gaccacagag agcacagatg tcaaggacag ctcagaggcc tccgactcag cctcctagag 960 cctgccccat cccctcctca ccccacgagc tttcacaata aattcgctcc gtggcactgg 1020 gt; gggatgtgag ccttggcctt ttgacccaga gcatcctgaa aaaaaaaaaaaaaaaa 1136

Claims (11)

ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 수준 또는 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 수술 후의 예후예측용 조성물로서,
상기 예후예측은 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 수준이 증가될 때 높은 재발률 또는 낮은 생존율을 예측하는 것을 특징으로 하는, 간암 수술 후의 예후예측용 조성물.
A composition for predicting the prognosis after liver cancer surgery, comprising a substance that measures the level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or the level of ARD1 protein,
Wherein the prognosis prediction predicts a high recurrence rate or a low survival rate when the level of ARD1 gene or ARD1 protein is increased.
제1항에 있어서,
상기 ARD1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 간암 수술 후의 예후예측용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the ARD1 gene has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
삭제delete 제1항에 있어서,
상기 ARD1 유전자의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 간암 수술 후의 예후예측용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the substance for measuring the level of the ARD1 gene is a primer or a probe capable of amplifying the ARD1 gene.
제1항에 있어서,
상기 ARD1 단백질의 수준을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, 간암 수술 후의 예후예측용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the substance for measuring the level of the ARD1 protein is an antibody that specifically recognizes the ARD1 protein.
ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 수술 후의 예후예측용 키트로서,
상기 간암 수술 후의 예후예측은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 간암수술 후의 예후예측용 키트:
a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록 간암 수술 후의 높은 재발률 또는 낮은 생존율을 예측하는 단계.
ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or ARD1 A kit for predicting the prognosis after liver cancer surgery, the kit comprising a substance for measuring an expression amount of a protein,
Wherein the prediction of the prognosis after the liver cancer surgery comprises the following steps:
a) measuring the expression level of ARD1 gene or ARD1 protein in liver cancer tissue and liver cancer tissue isolated from an individual;
b) comparing the expression level of the ARD1 gene or the ARD1 protein in the liver cancer tissue in the step a) and the expression level of the ARD1 gene or the ARD1 protein in the liver cancer tissue; And
c) As the expression level of ARD1 gene or ARD1 protein in liver cancer tissue is larger than that of ARD1 gene or ARD1 protein in liver cancer tissue, Predicting a higher recurrence rate or a lower survival rate step.
제6항에 있어서,
상기 ARD1 단백질의 발현량을 측정하는 물질은 ARD1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, 간암 수술 후의 예후예측용 키트.
The method according to claim 6,
Wherein the substance for measuring the expression level of the ARD1 protein is an antibody that specifically recognizes the ARD1 protein.
a) 개체로부터 분리한 간암 조직 및 간암 주변 조직에 대하여 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 간암 조직에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량과 간암 주변 조직에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질 발현량의 비교로부터, 간암 주변 조직에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량과 비교하여 간암 조직에서의 ARD1 유전자 또는 ARD1 단백질의 발현량이 크면 클수록, 간암 수술 후의 높은 재발률 또는 낮은 생존율을 예측하는 단계를 포함하는, 간암 수술 후의 예후예측을 위한 정보제공방법.
a) measuring the expression level of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or ARD1 protein on liver cancer tissue and liver cancer tissue isolated from the individual;
b) comparing the expression level of the ARD1 gene or the ARD1 protein in the liver cancer tissue in the step a) and the expression level of the ARD1 gene or the ARD1 protein in the liver cancer tissue; And
c) The higher the expression level of ARD1 gene or ARD1 protein in liver cancer tissue as compared with the expression amount of ARD1 gene or ARD1 protein in the tissue surrounding liver cancer from the comparison of the amount of expression of ARD1 gene or ARD1 protein in step b) And predicting a high recurrence rate or a low survival rate after the operation.
제8항에 있어서,
상기 단백질의 발현량을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 간암 수술 후의 예후예측을 위한 정보제공방법.
9. The method of claim 8,
Methods for measuring the expression level of the protein include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, (1) selected from the group consisting of immunoprecipitation assays, complement fixation assays, fluorescence activated cell sorters (FACS), and protein chips. Wherein the method comprises the following steps:
a) 피검체 유래의 혈액 샘플에서 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 ARD1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량이 정상인의 발현량과 비교하여 피검체에서의 발현량이 크면 클수록, 간암 수술 후의 높은 재발률 또는 낮은 생존율을 예측하는 단계를 포함하는, 간암 수술 후의 예후예측을 위한 정보제공방법.
a) measuring an expression level of mRNA of an ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or a protein encoded by the gene in a blood sample derived from a subject; And
b) a step of predicting a high recurrence rate or a low survival rate after liver cancer surgery as the amount of expression of mRNA of the ARD1 gene or the protein encoded by the gene in the step a) is greater than that of a normal human, A method for providing information for predicting prognosis after liver cancer surgery.
ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 물질을 포함하는, 간암 수술 후의 예후예측용 키트로서,
상기 간암 수술 후의 예후예측은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 간암 수술 후의 예후예측용 키트:
a) 피검체 유래의 혈액 샘플에서 ARD1 (Arrest-defective 1 protein) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서의 ARD1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현량이 정상인의 발현량과 비교하여 피검체에서의 발현량이 크면 클수록, 간암 수술 후의 높은 재발률 또는 낮은 생존율을 예측하는 단계.A kit for predicting prognosis after liver cancer surgery, comprising a substance for measuring an expression level of mRNA of ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or a protein encoded by the gene,
Wherein the prediction of the prognosis after the liver cancer surgery comprises the following steps:
a) measuring an expression level of mRNA of an ARD1 (Arrest-defective 1 protein) gene or a protein encoded by the gene in a blood sample derived from a subject; And
b) predicting a high recurrence rate or a low survival rate after liver cancer surgery as the amount of expression of mRNA of the ARD1 gene or the protein encoded by the gene in the step a) is larger than that of a normal human.
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