JPH10502254A

JPH10502254A - 真菌抽出方法及びキット

Info

Publication number: JPH10502254A
Application number: JP8503900A
Authority: JP
Inventors: バートレット，ウィリアム，シー．; メルビー，ジェームズ，エム．
Original assignee: ストラテジックダイアゴナスティクスインダストリーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-07-01
Filing date: 1995-06-27
Publication date: 1998-03-03
Also published as: WO1996001325A1; AU2950395A; US5558996A; TW309591B

Abstract

(57)【要約】植物から真菌を抽出する方法及びキット。抽出液を植物から得られた組織と混合し、その混合物を、好ましくは振とうすることによって攪拌して、植物から検出可能な量の真菌を抽出する。抽出液は希酸及び洗浄剤を含有する溶液である。抽出は次に真菌を分解することなく中和することができ、イムノアッセイによって分析し、病原性真菌の存在を検出することができる。この方法は、イネ植物について、ピリクラリア・オリゼ（Pyricularia oryzae）の検出に特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】真菌抽出方法及びキット発明の背景本発明は、化学及び微生物学分野に関し、特に植物からの真菌の化学的抽出(e xtraction)に関する。農作物や観葉植物では、真菌類等の寄生物がたびたび溶菌斑を形成する。特に米作物は、真菌のピリクラリア・オリゼ（Pyricularia oryzae）（イネいもち病、またピリクラリア・グリセア（Pyricularia grisea）として知られている）による感染の影響を非常に受けやすい。植物における菌類の感染は一つの地域から別の地域へと急速に広がり、処置しないと作物全体が死滅する。非常に多くの抗菌処理が用いられているが、最高の効果を上げ、作物を守るためには、感染の直後に処理を開始しなければならない。農業従事者にとっては、感染後数日または数週間以内に真菌による病気を検出、同定することが難しい場合が多く、真菌を定着させ根絶を難しくし、その結果、処置の効果が現れる前に作物の全てまたは大部分が死滅する。従って、真菌の感染を迅速に検出することが効果的な処置及び最終的な作物の生存に不可欠である。セプトリア（Septoria）または「穀草眼状斑点病」として知られている小麦の真菌感染を検出するため、緩衝液の存在下で小麦をすりつぶし小麦上で生育していた全ての真菌をとり、得られる緩衝液中の真菌の存在をイムノアッセイによって検査する方法が現在用いられている。この方法の主な短所は、すりつぶす工程が重労働で時間がかかり、高価で特殊な機械類や装置が必要であり、緩衝液（すりつぶした後の）はイムノアッセイに干渉し得るクロロフィルを含んでいることである。農業従事者は、感染した直後、効果的な処理を行う為に十分速やかに菌の感染が検出できないことを心配して、真菌微生物の存在を確認する試験を実施せずに感染を予防するための抗菌処理を頻繁に行っている。従って、多大な費用を要する殺菌剤が、単に病原性真菌の感染が疑われただけで自由に投与されている。この潜在的に有毒な化学物質の不当な投与によって、消費者及び環境は脅威にさらされ、生産コストは大きく上昇する。従って、本発明の目的は、植物の真菌感染を検出する迅速で感度の高い方法を提供することである。さらに本発明は、植物の真菌感染を検出するためのキットを提供することを目的とする。さらにまた、本発明は、植物組織から得られる真菌を抽出する、簡単かつ迅速で、コスト効率の良い方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、植物から真菌を抽出するための抽出液を提供する。発明の概要植物から真菌(fungus)を抽出する方法及びキットを提供する。この方法に従って、抽出液を植物から得られた組織と混合し、その混合物を好ましくは振とうすることによって攪拌して、植物から検出可能な量の真菌を抽出する。抽出液は希酸(dilute acid)及び洗浄剤(detergent)を含有する溶液である。この溶液は、抽出物中のクロロフィルによる緑色の量を減らし、それによりイムノアッセイに干渉する抽出物中の緑色色素の量を最小限にする。加えて、抽出液は容易に中和され、検出可能な量未満に真菌を分解することはない。次に抽出液を中和し、イムノアッセイによって分析し、病原性真菌の存在を検出することができる。植物サンプルから真菌を抽出するために提供されるキットは、希酸及び洗浄剤を含有し、両剤はキット中では混合した単一の抽出液であってもよい。キットには、さらに、植物を、抽出液及び抽出された真菌を検出する試薬と反応させるための反応容器が含まれていてもよい。抽出方法及びキットは、植物に対する真菌感染を検出するイムノアッセイと組み合わせて使用するのが好ましい。この方法は、イネ植物について、ピリクラリア・オリゼ（Pyricularia oryzae ）の検出に特に有用である。図面の簡単な説明図１は、イネいもち病菌の接種後の経過時間に対する反射単位を示すグラフである。反射単位は、イネいもち病菌の存在量に逆比例する。白抜きの正方形の記号は、本明細書で述べる方法に従って、希酸及び界面活性剤とともに振とうすることによってイネの葉から真菌を抽出した場合の反射を表す。黒塗りの正方形の記号は、中性緩衝液の存在下で乳鉢と乳棒で葉をすりつぶした場合を表す。発明の詳細な説明植物真菌抽出方法及びキットについて説明する。植物組織は、希酸及び洗浄剤を含有する抽出液と混合し、その混合物は、植物組織から十分な量の菌を抽出するのに十分な時間攪拌する。攪拌の方法としては振とうが好ましい。真菌を含有する抽出物は、植物組織から分離し、研究、医薬的または診断目的のため、または植物に適用された抗菌剤の有効性を測定するために用いることができる。この抽出方法は、植物真菌感染を検出するためのイムノアッセイ等の検出方法と組み合わせることが好ましい。真菌の検出のためのイムノアッセイは商業的に利用可能である。定性的または定量的なイムノアッセイが可能である。この方法及びキットは、真菌感染の診断の分野で特に有用である。処置は診断に続いて即時に処方され、また、アッセイは処置の成功を観察するために何回でも繰り返すことが可能である。この方法は、検出可能な量の菌が植物組織上に定着する限り、感染の開始の直後に、真菌の生長を検出するために使用することができる。感染の検出能力に影響を与える因子には、胞子の濃度、植物の罹病性の程度、及び気象条件がある。乾燥した天候では生長する菌は少ない。通常の条件下では、多くの場合この方法を感染の４日後には真菌の生長を検出するために使用することが可能であり、従って処置を早急に開始することができる。この抽出方法は、草、高木、低木、花及び観賞植物などの、しかしこれらに限定されない植物上で生長する真菌を抽出するのに有用であり、特にイネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ及びバナナなどの草で生長する真菌を抽出するのに有用である。記載の方法によって、あらゆる種類の真菌が抽出できるはずである。加えて、植物のバクテリアやウイルスなどの他の病原性生物もこの方法で抽出できる。例えば、この方法は以下の菌の抽出に特に有用である。小麦のさび病菌、ストロブまつコブ病菌、コブ病菌、及びトウモロコシ、オート麦、大麦、タマネギ及び小麦の黒穂病菌を含む担子菌類；ブドウ及び他の宿主のべと病菌、根腐れ病菌、及びジャガイモ及びトマトの葉枯れ病菌を含む藻菌類；並びに、穀類、果物及び他の作物のウドンコビョウ菌、オランダニレ病菌、穀類の麦角病菌、モモ及びプラムの灰星病菌、バラの黒斑病、リンゴの黒星病を含む子嚢菌類。加えて、この抽出方法は以下の菌の抽出に有用である。イネ植物から得られる、イネいもち病菌（Pyricularia oryzae,Pyricularia grisea）、褐斑病菌（Cochliobolus mizabe anus）、イネやけ菌病（Rhynchosporium oryzae）、葉鞘べと病菌（Rhizoctonia solani）、細菌性葉枯れ病／条斑病菌（Xanthomonas campestris）、及びイネ・ツングロ(tungro)ウイルス（グリーンリーフホッパー(Green Leaf Hopper)がベクターである）；小麦植物から得られる、ウドンコビョウ菌（Erysiphe gram inis）、さび病菌（Puccinia spp.）、ムギ黒穂病菌（Tilletia spp.）、黒穂病菌（Ustilago spp.）、セプトリア斑点病(septoria leaf spot)菌（Septoria spp.）、及び立ち枯れ病菌（Gaeumannomyces graminis）；大麦植物から得られる、さび病菌、ウドンコビョウ菌、黒穂病菌、葉枯れ病菌（Rhynchosporium s ecalis）、網斑病菌（Pyrenophora teres）、すそ腐れ病及び耳べと病菌（Fusar ium spp.）；トウモロコシから得られる、さび病菌、黒穂病菌、茎腐れ病菌（Fu sarium spp.）、べと病菌（Peronosclerospora spp.）、葉枯れ病菌（Helminth osporium spp.）、及び耳腐れ病菌（Gibberella sp.,Fusarium sp.）；並びに、ブドウ植物から得られる、ブドウ貯蔵腐れ菌（Aspergillus niger）、ブドウウドンコビョウ菌（Uncinula necator）、及び灰色かび菌（Botrytis cin erea）。真菌を抽出する植物組織は葉が好ましいが、花、茎、種、果実、野菜の食用部分(vegetable)、根、または樹皮でもよい。検出可能な量の真菌を得るために抽出を受ける原料の量は植物組織の大きさによる。例えば、通常の大きさのイネの葉（幅１／４インチ以下）の場合、次のイムノアッセイによる検出のためには、約３０インチの原料が抽出操作に用いられる。イネの葉が幅広い場合（幅１／４〜３／４インチ）は、抽出及び次のイムノアッセイによる検出のためには、１５インチの原料で十分であろう。抽出液抽出液は希酸及び洗浄剤を含有する。真菌を分解しない希酸は全て使用することができる。例えば、希酸として、塩酸、硫酸、酢酸、硝酸及び有機酸を使用することができるが、これらに限定されない。希酸として最も好ましいのは、２０ｍＭの塩酸である。この溶液は抽出物中のクロロフィルによる緑色を低減し、それによってイムノアッセイに干渉する抽出物中の緑色色素の量を最小限にする。希酸は、好ましくは、水で希釈し、濃度は約１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内である。これより高濃度では、中性のｐＨで実施されるイムノアッセイの前に、酸を中和する能力が逆の影響を受けて、結果が悪くなる。洗浄剤は、植物組織の表面から真菌を洗い落とすのを助ける。洗浄剤としては、イオン性でも非イオン性でもよく、アルコキシル化した直鎖状アルコール、ラウリル硫酸塩、ポリオキシエチレンエステル（界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ^TM、界面活性剤ＭＹＲＪ^TM、及び界面活性剤Ｂｒｉｊ^TM等）、ポリオキシエチレンソルビタン（界面活性剤Ｔｗｅｅｎ^TM等）、ソルビタン（界面活性剤Ｓｐａｎ^TM等）、及びポリグリコールエーテル界面活性剤（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^TM等）、オーリン社（Olin Corporation、米国コネチカット州、スタンフォード）またはシグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company、米国ミズーリ州、セントルイス）両社のすべての製品が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の使用可能な生物学的洗浄剤は、当業者にとって公知である。ここで述べる抽出液中で使用可能な生物学的洗浄剤の代表的なリストは、シグマカタログ（シグマ社、米国ミズーリ州、セントルイス）の１６４５〜１６５２頁に掲載されており、引用により本明細書に含める。好ましい洗浄剤はアルコキシル化した直鎖状アルコールである。最も好ましい洗浄剤は、アルコキシル化した直鎖状アルコールのＰｏｌｙ−ＴｅｒｇｅｎｔＳＬＦ−１８^TMであり、本品はオーリン社（米国コネチカット州、スタンフォード）から販売されている低起泡性界面活性剤である。ＳＬＦ−４５やＳＬＦ−６２など、炭素鎖の長さが異なるＰｏｌｙ−ＴｅｒｇｅｎｔＳＬＦ^TM界面活性剤も有用である。洗浄剤の濃度は、約０．０１〜１％の範囲が好ましく、約０．１％が最も好ましい。好ましい希釈剤は水である。抽出液は事前に混合して植物組織に加えるのが好ましい。希酸及び洗浄剤は別々に植物組織に加えることができることは、当業者には理解されるであろう。約２ｍｌの抽出液を、葉等の組織の幅によって１５〜３０インチの植物組織毎に加える。攪拌真菌の抽出は、植物組織と洗浄液の混合物を検出可能な量の真菌を抽出するのに十分な時間攪拌することによって行われる。攪拌は、混合物をプラスチックボトル等の容器中で振とうすることによるのが好ましい。容器は、植物組織及び抽出液の容積に攪拌を妨げない十分な余裕を加えた十分な大きさが必要である。振とうに替わる攪拌方法としては、菌を分解しないものであれば、これに限定されず、かき回し、渦(vortexing)、超音波処理または振動などがある。好ましくは、植物組織及び抽出液の混合物は、手による、穏やな程度から力強い程度の振とうである。攪拌は便宜的な時間行い、いかなる長さでもよい。好ましい攪拌時間は３０分以下である。最適な攪拌時間は約３分である。攪拌は、あらゆる環境温度（約６５〜１００°Ｆ）で行うことができる。最も好ましい温度は洗浄剤がわずかに溶け残る環境温度である。界面活性剤Ｐｏｌｙ −ＴｅｒｇｅｎｔＳＬＦ−１８^TMの好ましい温度は１５℃以上である。イムノアッセイ真菌を検出するイムノアッセイによって抽出物を分析する前に、真菌を含有する抽出物をイムノアッセイに干渉し得る植物組織のすべての大きな断片から分離するため、抽出物を濾過するべきである。好ましい濾過材は、直径約１μｍの細孔を有するポリエチレンフィルターである。最適な濾過材は、ポアレックス・テクノロジー社（Porex Technologies、米国ジョージア州、フェアバーン）から販売されているフィルターチップなどのフィルターチップであり、これは抽出操作を行う容器の開口部に取り付けることができる。濾過した抽出物は、最大感度を得るため、イムノアッセイによって分析する前に、中和すべき、すなわちｐＨを約６〜８に戻すべきである。中和は、Ｈｅｐｅｓ^TM緩衝液またはＴｒｉｚｍａ^TM緩衝液などのｐＨが中性の緩衝液を十分量加えることによって行うのが好ましい。ｐＨが中性の緩衝液は、シグマ・ケミカル社（米国ミズーリ州、セントルイス）などの化学会社から購入することができ、また当業者によく知られた方法に従って塩類から調製することができる。検出のため、中和した抽出物は検出する真菌に特異的な抗体と反応させ、抗原抗体複合体を当業者によく知られた方法に従って検出する。検出する真菌に特異的な抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれも使用することができる。抗体の産生は、代表的には、フロイントの完全アジュバント等のアジュバント中で乳化した抗原を、免疫を生じる量用いて、２，３週間の間隔をおいて数週間投与して動物に免疫し（好ましくはフロイントの完全アジュバントによる最初の免疫化の後、フロイントの不完全アジュバンドによる、２週間から１ヶ月間隔の免疫化）、次に、血清から抗体を分離し、または脾臓細胞を骨髄腫細胞に融合させて培地中で抗体を発現するハイブリドーマを作成することによって行われる。試験採血は、好ましくは２回目と３回目の免疫化の間の１４日間に行い、その後１ヶ月の間隔をおいて生産的採血を行う。例えば、検出する真菌に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれも、Ｘｉａ，Ｊ．Ｑ．らの「イネいもち病の病原菌であるピリクラリア・グリセア（Pyricularia grisea）に特異的なモノクローナル抗体の開発」、Myc ol．Res．96：867−873（1992）に記載されているように調製することができる。本文献は引用により本明細書に含める。本検出方法の好ましい具体例は、Ｘｉａらの方法の改良法であり、ピリクラリア・グリセア（P．grisea）菌の胞子形成菌糸を破砕し、遠心分離して得られる可溶性分画を用いて、または、ピリクラリア・グリセア（P．grisea）菌の菌糸体を液体窒素で凍結させ、乳鉢と乳棒で破砕し、リン酸緩衝生理食塩水中に懸濁し、超音波処理することによって、抗原を調製する。抗体は、検出を容易にするために固相に固定することができる。固相としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたはあらゆる固相プラスチック材料を、試験管、ビーズ、微細粒子、浸漬棒(d ip-stick)等の形状にして使用できることは、当業者に理解されるであろう。また固相は、ガラスビーズ、ガラス試験管及びガラスで作られる他のあらゆる適当な形状のものでもよい。好ましい固相はラテックスビーズである。好ましい検出方法としては、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体等の第二抗体を用いた直接的または間接的酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウス抗体等の第二抗体を用いる直接的または間接的免疫蛍光検定法が挙げられる。最も好ましいイムノアッセイ検出法は、検出可能な色を生じる基質に反応性がある酵素を含有する、検出する真菌に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を用いる方法である。この反応は停止液を加えることによって停止し、この停止液は、結果を分光光度計、反射率計で読みとるかまたはカラーチャートと比較するまでの数時間の間、色調を保存する保存料を含有していてもよい。真菌抽出及び検出キット真菌抽出キットは希酸及び洗浄剤を含有し、これらは混合してキット中で単一の抽出液であってもよい。このキットには、さらに、植物と抽出液とをその中で反応させる反応容器、対照サンプル、濾過器具、抗菌抗体被覆固相、検出可能抗菌抗体結合物、中和試薬及び抽出された真菌の検出試薬、並びに、その中でサンプルと試薬を保温し、反応体を洗浄してもよい容器が含まれてもよい。反応容器は好ましくは、プラスチックボトル等の不活性なボトルであって、検出可能な量の真菌を抽出するのに十分な量の抽出液が入るものがよい。濾過器具は、抽出物から検出に干渉する可能性のある植物組織の断片を除くために用いられる。好ましい濾過器具は、細孔の大きさが約０．２μｍ〜２μｍ、最も好ましくは１μｍの市販のフィルターチップ（ポレックス・テクノロジー社、米国ジョージア州、フェアバーン）がよく、これは反応容器の開口部に取り付けることができる。またキットには検出する菌の抗原の対照サンプルが含まれていてもよく、それによって野外で色調の比較を直接的に行うことができる。対照サンプルは凍結乾燥品であってもよく、真菌抗原の再構成のために再懸濁緩衝液を含んでもよい。好ましい再構成緩衝液は抽出液である。好ましい抗体は、上述したように当業者によく知られた方法に従って調製したポリクローナル抗体であり、検出する真菌の抗原に特異的である。モノクローナル抗体もまた使用することができる。キットは二種の抗菌抗体調製物を装えるべきである。第一の抗体調製物は、ラテックスビーズなどの固相上に被覆された抗体が好ましく、第二の抗体調製物は、酵素結合抗体が好ましい。検出試薬とのインキュベーションの間、植物組織及び対照サンプルを便宜的に保持するために、キットに複数のバイアルが含まれていてもよい。これらバイアルの中に、中和緩衝液中の凍結乾燥免疫試薬が入っているのが好ましい。バイアルとしては透明な容器が好ましい。カップ組立品がキットに含まれていてもよく、これは未反応の免疫試薬から反応物を分離するためのものである。カップ組立品は好ましくは、比色の変化を観察するための、隣接した２つの小室を有する。キットに含まれていてもよい試薬としては、イムノアッセイの前に抽出物を中和するための中和緩衝液、未反応の免疫試薬から反応物を分離するための洗浄緩衝液、酵素結合抗体の酵素と反応する基質または基質緩衝液、及び反応の色調を保存する保存料を含有する停止液が挙げられる。中和緩衝液は、ｐＨが６〜９の間の緩衝液であり、例えば０．５ＭＥＤＴＡ、ＩｇＧ０．２％、ＢＳＡ０．０５％及びアジ化ナトリウム０．０５％を含有するＨｅｐｅｓ^TM緩衝液であり、また、洗浄緩衝液は中性の緩衝液であり、例えば洗浄剤ＳＬＦ−１８^TM０．１％及びアジ化ナトリウム０．０５％を含有する１０ｍＭトリスｐＨ８．０である。好ましい基質緩衝液は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸等の基質とマグネシウムイオンとを２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液中に含有するものである（ＢＣＩＰ、シグマ・ケミカル社、米国ミズーリ州、セントルイス）。停止液は緩衝液及び保存料を含有するものが好ましく、例えば１５ｍＭのアジ化ナトリウムを含有する３６ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。キットには、さらに、野外で菌の感染の診断をするため、植物組織サンプルと対照サンプルを迅速に比較するためのカラーカードが含まれていてもよい。菌の抽出方法及びキットについては、下記の非限定的実施例によりさらに理解されるだろう。実施例１イネいもち病菌のすりつぶしと抽出の比較希酸及び界面活性剤を含有する抽出液を使用して、イネの葉からイネいもち病菌を抽出した。この抽出操作と、中性緩衝液を用いてすりつぶすことによるイネの葉の抽出とを比較した。健康なイネの葉に、ピリクラリア・グリセア（Pyricularia grisea）の胞子を接種し、接種の直後及び接種後１，２，３，４，５及び６日後に抽出のために葉を採取した。胞子の接種を行わないイネの葉を陰性コントロールとして使用した。イネの葉のサンプルは、採取した後、抽出するまで凍結保存した。イネの葉は、０．０１ＭＨＣｌ及び０．１％の界面活性剤Ｐｏｌｙ−ＴｅｒｇｅｎｔＳＬＦ−１８^TM（オーリン社、米国コネチカット州、スタンフォード）を含有する抽出液と、プラスチックボトル中で混合し、室温で３分間手で振とうした。抽出液に対するイネの葉の割合は１００ｍｇ／ｍｌであった。抽出物は、中和緩衝液（１５０ｍＭＨｅｐｅｓ^TM、ｐＨ８．３、０．５ＭＥＤＴＡ、０．２％ＩｇＧ、０．０５％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウム）の存在下で免疫試薬に加え、５分間インキュベートした。なお、濾過材を有するカップ組立品を用いた。これら免疫試薬は、５０μｌの抗体被覆ラテックス及び７．５μｌの抗体−アルカリフォスフェート結合物であり、これらは５４２．５μｌの濾過した抽出物とともにインキュベートした。抽出物は、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、０．１％洗浄剤ＳＬＦ−１８^TM、及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む洗浄緩衝液４００μｌで洗浄した。マグネシウムイオンを含む２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液中の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ、シグマ・ケミカル社、米国ミズーリ州、セントルイス）２００ μｌを抽出物に加え、室温で１０分間インキュベートした。反応によって検出可能な色調の変化が生じ、その変化を反射率計で測定した。結果を図１の白抜きの正方形で表し、この結果は菌の感染が接種４日後と早く検出できることを示す。すりつぶした場合の実験としては、イネの葉０．２ｇを、５０ｍＭＨｅｐｅｓ^TM、０．１％ＳＬＦ−１８、０．０５ＭＥＤＴＡ、０．２％ウサギＩｇＧ、０．０５％アジ化ナトリウム、及び０．０５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ８．３の緩衝液２ｍｌと混合した。次にイネの葉を乳鉢と乳棒を用いて破砕し、２４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．８μｍシリンジフィルター（ゲルマン・サイエンス社、米国ミシガン州、アンアーバー）で濾過し、上述した免疫試薬と混合した（中和緩衝液は使用しなかった）。結果を図１の黒塗りの正方形で表す。不規則な曲線から、すりつぶす方法は振とうする方法と比べて干渉または変位が多く、葉が菌に汚染されているかどうかを決定するのが難しくなっていることが示される。これら２種の抽出方法の比較から、希酸及び界面活性剤を用いた抽出法が、中性緩衝液を用いたすりつぶし抽出法より優位であることが示される。植物菌抽出方法及びキットの改良及び変更は、これまでの説明から当業者にとって明らかである。そのような改良及び変更は、添付した請求の範囲内に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年６月１４日【補正内容】・・・、緩衝液（すりつぶした後の）はイムノアッセイに干渉し得るクロロフィルを含んでいることである。Ｂｒａｍｂｌの米国特許第４，６５０，７５４号明細書には、穀物及び他のカビに感染しやすいバルク食物について、カビによる汚染の広がりを定量的に検査する方法が記載されている。Ｂｒａｍｂｌの方法に従って、カビの胞子は、溶媒と混合することによって、穀物及び食物から選択的に抽出される。次に溶液を洗浄剤で洗浄し、抽出した胞子を無菌の溶液中に懸濁し、必要に応じて希釈する。一定量を栄養生長培地に移し、コロニーを生長させる。次に胞子のコロニーをカウントし、希釈因子を乗じ、サンプル中の菌の胞子数を計算する。大日本製薬株式会社の欧州特許出願公開第１３５，３７８号には、微生物の定量的測定のための薬剤及び方法が記載されている。この薬剤は、測定する微生物と同種の菌株から調製した第一抗体、第一抗体に十分に結合するが、抗体と結合していた他の菌株を放出させたり置換することがない菌株の不溶化した細胞成分、及び標識した第二抗体を含有する。この方法によれば、予め量を測定した第一抗体を過剰に試験サンプルに加え、抗原抗体反応を行う。次に未反応の第一抗体と反応させるため細胞成分を加え、沈澱した抗原抗体複合体を分離し、標識した第二抗体を加え、混合物を洗浄し、複合物中の標識した第二抗体の量を測定する。Ｘｉａらの抄録Chem．Abstracts，118：9、1993、AN78951には、ピリクラリア・グリセア（Pyricularia grisea）に対するモノクローナル抗体の産生が記載されている。北川らの抄録Chem．Abstracts，108：19、1988、AN164630には、ピリクラリア・オリゼ（Pyricularia oryzae）の１０の菌株についての競合的酵素イムノアッセイが記載されている。農業従事者は、感染した直後、効果的な処理を行う為に十分速やかに菌の感染が検出できないことを心配して、真菌微生物の存在を確認する試験を実施せずに感染を予防するための抗菌処理を頻繁に行っている。従って、多大な費用を要する殺菌剤が、単に病原性真菌の感染が疑われただけで自由に投与されている。この潜在的に有毒な化学物質の不当な投与によって、消費者及び環境は脅威にさらされ、生産コストは大きく上昇する。従って、本発明の目的は、植物の真菌感染を検出する迅速で感度の高い方法を提供することである。さらに本発明は、植物の真菌感染を検出するためのキットを提供することを目的とする。さらにまた、本発明は、植物組織から得られる真菌を抽出する、簡単かつ迅速で、コスト効率の良い方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、植物から真菌を抽出するための抽出液を提供する。発明の概要植物から真菌(fungus)を抽出する方法及びキットを提供する。この方法に従って、抽出液を植物から得られた組織と混合し、その混合物を好ましくは振とうすることによって攪拌して、植物から検出可能な量の真菌を抽出する。抽出液は希酸(dilute acid)及び洗浄剤(detergent)を含有する溶液である。・・・・・・；トウモロコシから得られる、さび病菌、黒穂病菌、茎腐れ病菌（Fusari um spp.）、べと病菌（Peronosclerospora spp.）、葉枯れ病菌（Helmint hosporium spp.）、及び耳腐れ病菌（Gibberella sp.，Fusarium sp.）；並びに、ブドウ植物から得られる、ブドウ貯蔵腐れ菌（Aspergillus niger）、ブドウウドンコビョウ菌（Uncinula necator）、及び灰色かび菌（Botrytis cine rea）。真菌を抽出する植物組織は葉が好ましいが、花、茎、種、果実、野菜の食用部分(vegetable)、根、または樹皮でもよい。検出可能な量の真菌を得るために抽出を受ける原料の量は植物組織の大きさによる。例えば、通常の大きさのイネの葉（幅０．６３５ｃｍ（１／４インチ）以下）の場合、次のイムノアッセイによる検出のためには、約７６．２ｃｍ（３０インチ）の原料が抽出操作に用いられる。イネの葉が幅広い場合（幅０．６３５ｃｍ〜１．９０５ｃｍ（１／４〜３／４インチ））は、抽出及び次のイムノアッセイによる検出のためには、３８．１ｃｍ（１５インチ）の原料で十分であろう。抽出液抽出液は希酸及び洗浄剤を含有する。真菌を分解しない希酸は全て使用することができる。例えば、希酸として、塩酸、硫酸、酢酸、硝酸及び有機酸を使用することができるが、これらに限定されない。希酸として最も好ましいのは、２０ｍＭの塩酸である。この溶液は抽出物中のクロロフィルによる緑色を低減し、それによってイムノアッセイに干渉する抽出物中の緑色色素の量を最小限にする。希酸は、好ましくは、水で希釈し、濃度は約１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲内である。これより高濃度では、中性のｐＨで実施されるイムノアッセイの前に、酸を中和する能力が逆の影響を受けて、結果が悪くなる。洗浄剤は、植物組織の表面から真菌を洗い落とすのを助ける。洗浄剤としては、イオン性でも非イオン性でもよく、アルコキシル化した直鎖状アルコール、ラウリル硫酸塩、ポリオキシエチレンエステル（界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ^TM、界面活性剤ＭＹＲＪ^TM、及び界面活性剤Ｂｒｉｊ^TM等）、ポリオキシエチレンソルビタン（界面活性剤Ｔｗｅｅｎ^TM等）、ソルビタン（界面活性剤Ｓｐａｎ^TM等）、及びポリグリコールエーテル界面活性剤（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^TM等）、オーリン社（ Olin Corporation、米国コネチカット州、スタンフォード）またはシグマ・ケミカル社（Sigma Chemical Company、米国ミズーリ州、セントルイス）両社のすべての製品が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の使用可能な生物学的洗浄剤は、当業者にとって公知である。ここで述べる抽出液中で使用可能な生物学的洗浄剤の代表的なリストは、シグマカタログ（シグマ社、米国ミズーリ州、セントルイス）の１６４５〜１６５２頁に掲載されている。好ましい洗浄剤はアルコキシル化した直鎖状アルコールである。最も好ましい洗浄剤は、アルコキシル化した直鎖状アルコールのＰｏｌｙ−ＴｅｒｇｅｎｔＳＬＦ−１８^TMであり、本品はオーリン社（米国コネチカット州、スタンフォード）から販売されている低起泡性界面活性剤である。ＳＬＦ−４５やＳＬＦ−６２など、炭素鎖の長さが異なるＰｏｌｙ−ＴｅｒｇｅｎｔＳＬＦ^TM界面活性剤も有用である。洗浄剤の濃度は、約０．０１〜１％の範囲が好ましく、約０．１％が最も好ましい。好ましい希釈剤は水である。抽出液は事前に混合して植物組織に加えるのが好ましい。希酸及び洗浄剤は別々に植物組織に加えることができることは、当業者には理解されるであろう。約２ｍｌの抽出液を、葉等の組織の幅によって３８．１ｃｍ〜７６．２ｃｍ（１５〜３０インチ）の植物組織毎に加える。攪拌真菌の抽出は、植物組織と洗浄液の混合物を検出可能な量の真菌を抽出するのに十分な時間攪拌することによって行われる。攪拌は、混合物をプラスチックボトル等の容器中で振とうすることによるのが好ましい。容器は、植物組織及び抽出液の容積に攪拌を妨げない十分な余裕を加えた十分な大きさが必要である。振とうに替わる攪拌方法としては、菌を分解しないものであれば、これに限定されず、かき回し、渦(vortexing)、超音波処理または振動などがある。好ましくは、植物組織及び抽出液の混合物は、手による、穏やな程度から力強い程度の振とうである。攪拌は便宜的な時間行い、いかなる長さでもよい。好ましい攪拌時間は３０分以下である。最適な攪拌時間は約３分である。攪拌は、あらゆる環境温度（約１８℃〜３８℃（６５〜１００°Ｆ））で行うことができる。最も好ましい温度は洗浄剤がわずかに溶け残る環境温度である。界面活性剤Ｐｏｌｙ−ＴｅｒｇｅｎｔＳＬＦ−１８^TMの好ましい温度は１５℃ 以上である。イムノアッセイ真菌を検出するイムノアッセイによって抽出物を分析する前に、真菌を含有する抽出物をイムノアッセイに干渉し得る植物組織のすべての大きな断片から分離するため、抽出物を濾過するべきである。・・・・・・、好ましくは２回目と３回目の免疫化の間の１４日間に行い、その後１ヶ月の間隔をおいて生産的採血を行う。例えば、検出する真菌に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれも、Ｘｉａ，Ｊ．Ｑ．らの「イネいもち病の病原菌であるピリクラリア・グリセア（Pyricularia grisea）に特異的なモノクローナル抗体の開発」、Myc ol．Res．96：867−873（1992）に記載されているように調製することができる。本検出方法の好ましい具体例は、Ｘｉａらの方法の改良法であり、ピリクラリア・グリセア（P．grisea）菌の胞子形成菌糸を破砕し、遠心分離して得られる可溶性分画を用いて、または、ピリクラリア・グリセア（P．grisea）菌の菌糸体を液体窒素で凍結させ、乳鉢と乳棒で破砕し、リン酸緩衝生理食塩水中に懸濁し、超音波処理することによって、抗原を調製する。抗体は、検出を容易にするために固相に固定することができる。固相としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたはあらゆる固相プラスチック材料を、試験管、ビーズ、微細粒子、浸漬棒 (dip-stick)等の形状にして使用できることは、当業者に理解されるであろう。また固相は、ガラスビーズ、ガラス試験管及びガラスで作られる他のあらゆる適当な形状のものでもよい。好ましい固相はラテックスビーズである。好ましい検出方法としては、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体等の第二抗体を用いた直接的または間接的酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗マウス抗体等の第二抗体を用いる直接的または間接的免疫蛍光検定法が挙げられる。・・・、すりつぶす方法は振とうする方法と比べて干渉または変位が多く、葉が菌に汚染されているかどうかを決定するのが難しくなっていることが示される。これら２種の抽出方法の比較から、希酸及び界面活性剤を用いた抽出法が、中性緩衝液を用いたすりつぶし抽出法より優位であることが示される。請求の範囲１．ａ）希酸及び洗浄剤を含む抽出液を植物から得られる組織と混合し、ｂ）その混合物を攪拌することを含み、前記抽出液は植物から真菌を抽出し、また、前記抽出液は容易に中和されるとともに検出可能な量未満に真菌を分解しないことを特徴とする、植物から真菌を抽出する方法。２．（削除）３．前記抽出液が抽出物中のクロロフィルによる緑色の量を低減する請求の範囲第１項に記載の方法。４．前記酸が約１ｍＭ〜５０ｍＭのモル濃度である請求の範囲第１項に記載の方法。５．前記酸が、塩酸、硫酸、酢酸、硝酸及び有機酸からなる群より選択される請求の範囲第１項に記載の方法。６．前記洗浄剤が約０．０１〜１％の濃度である請求の範囲第１項に記載の方法。７．前記洗浄剤がアルコキシル化された直鎖アルコールである請求の範囲第１項に記載の方法。８．前記混合物が３０分未満、手で振とうされる請求の範囲第１項に記載の方法。９．前記植物が、草、高木、低木、花及び観賞植物からなる群より選択される請求の範囲第１項に記載の方法。１０．前記植物が、イネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ及びバナナからなる群より選択される請求の範囲第１項に記載の方法。１１．前記植物がイネであり、前記菌がピリクラリア・オリゼ（Pyricularia oryzae）である、請求の範囲第１項に記載の方法。１２．ａ）希酸液、及びｂ）アルコキシル化された直鎖アルコールから本質的に成る、植物からの真菌抽出用キット。１３．前記の希酸及び洗浄剤が単一の抽出液として混合されている請求の範囲第１２項に記載のキット。１４．さらに前記植物を前記抽出液と反応させるための反応容器を含む請求の範囲第１２項に記載のキット。１５．前記酸が約１ｍＭ〜５０ｍＭのモル濃度である請求の範囲第１２項に記載のキット。１６．前記酸が、塩酸、硫酸、硝酸及び有機酸からなる群より選択される請求の範囲第１２項に記載のキット。１７．前記洗浄剤が約０．０１〜１％の濃度である請求の範囲第１２項に記載のキット。１８．（削除）１９．ａ）希酸及び洗浄剤を含む抽出液を植物から得られる組織と混合し、ｂ）その混合物を攪拌し、ｃ）抽出液から植物組織を分離し、ｄ）その抽出液を中和し、及びｅ）イムノアッセイにより抽出液中の真菌の有無を検出することを含む、植物上の真菌感染を検出する方法。２０．希酸液及びアルコキシル化された直鎖アルコールから本質的に成る、植物からの病原性微生物抽出用の抽出液。２１．前記酸が、塩酸、硫酸、硝酸及び有機酸からなる群より選択される請求の範囲第１９項に記載の方法。２２．前記洗浄剤がアルコキシル化された直鎖アルコールである請求の範囲第１９項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者メルビー，ジェームズ，エム. アメリカ合衆国，19711 デラウェア，ニューアーク，スタンフォードドライブ 322番地

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）希酸及び洗浄剤を含む抽出液を植物から得られる組織と混合し、ｂ）その混合物を攪拌することを含み、前記抽出液は植物から真菌を抽出することを特徴とする、植物から真菌を抽出する方法。２．前記抽出液が容易に中和されるとともに真菌を検出可能な量未満に分解しない請求の範囲第１項に記載の方法。３．前記抽出液が抽出物中のクロロフィルによる緑色の量を低減する請求の範囲第１項に記載の方法。４．前記酸が約１ｍＭ〜５０ｍＭのモル濃度である請求の範囲第１項に記載の方法。５．前記酸が、塩酸、硫酸、酢酸、硝酸及び有機酸からなる群より選択される請求の範囲第１項に記載の方法。６．前記洗浄剤が約０．０１〜１％の濃度である請求の範囲第１項に記載の方法。７．前記洗浄剤がアルコキシル化された直鎖アルコールである請求の範囲第１項に記載の方法。８．前記混合物が３０分未満、手で振とうされる請求の範囲第１項に記載の方法。９．前記植物が、草、高木、低木、花及び観賞植物からなる群より選択される請求の範囲第１項に記載の方法。１０．前記植物が、イネ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ及びバナナからなる群より選択される草である請求の範囲第１項に記載の方法。１１．前記植物がイネであり、前記菌がピリクラリア・オリゼ（Pyricularia oryzae）である、請求の範囲第１項に記載の方法。１２．ａ）希酸、及びｂ）洗浄剤を含む、植物からの真菌抽出用キット。１３．前記の希酸及び洗浄剤が単一の抽出液として混合されている請求の範囲第１２項に記載のキット。１４．さらに前記植物を前記抽出液と反応させるための反応容器を含む請求の範囲第１２項に記載のキット。１５．前記酸が約１ｍＭ〜５０ｍＭのモル濃度である請求の範囲第１２項に記載のキット。１６．前記酸が、塩酸、硫酸、酢酸、硝酸及び有機酸からなる群より選択される請求の範囲第１２項に記載のキット。１７．前記洗浄剤が約０．０１〜１％の濃度である請求の範囲第１２項に記載のキット。１８．洗浄剤がアルコキシル化された直鎖アルコールである請求の範囲第１２項に記載のキット。１９．ａ）希酸及び洗浄剤を含む抽出液を植物から得られる組織と混合し、ｂ）その混合物を攪拌し、ｃ）抽出液から植物組織を分離し、ｄ）その抽出液を中和し、及びｅ）イムノアッセイにより抽出液中の真菌の有無を検出することを含む、植物上の真菌感染を検出する方法。２０．希酸及び洗浄剤を含む、植物からの病原性微生物抽出用の抽出液。