JPH1033161A - 変異型転写調節因子を有する酵母 - Google Patents
変異型転写調節因子を有する酵母Info
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- JPH1033161A JPH1033161A JP8194595A JP19459596A JPH1033161A JP H1033161 A JPH1033161 A JP H1033161A JP 8194595 A JP8194595 A JP 8194595A JP 19459596 A JP19459596 A JP 19459596A JP H1033161 A JPH1033161 A JP H1033161A
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- JP
- Japan
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- met4
- yeast
- gene
- glutathione
- amino acid
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本願発明は、変異型転写調節因子を利用した
グルタチオン高生産性酵母、および当該酵母を用いたグ
ルタチオンの製造方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本願発明の酵母は、転写活性を強化する
ように変異させたＭＥＴ４遺伝子を利用し、グルタチオ
ン等の含硫化合物を高濃度に蓄積するように酵母を変異
させることによって作製される。前記変異型ＭＥＴ４遺
伝子の導入によって、菌体内のグルタチオン含有量がコ
ントロールの１.７倍程度に増加する。
グルタチオン高生産性酵母、および当該酵母を用いたグ
ルタチオンの製造方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本願発明の酵母は、転写活性を強化する
ように変異させたＭＥＴ４遺伝子を利用し、グルタチオ
ン等の含硫化合物を高濃度に蓄積するように酵母を変異
させることによって作製される。前記変異型ＭＥＴ４遺
伝子の導入によって、菌体内のグルタチオン含有量がコ
ントロールの１.７倍程度に増加する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は高活性を有する変異
型転写調節因子の導入によりグルタチオン含有量が増加
した酵母に関する。また、本発明は当該酵母を用いたグ
ルタチオンの製造方法に関する。
型転写調節因子の導入によりグルタチオン含有量が増加
した酵母に関する。また、本発明は当該酵母を用いたグ
ルタチオンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】グルタチオンは生体内の酸化還元系に関
与し、諸酵素の活性化や解毒作用などの生理活性を示す
トリペプチドとして、医薬上重要な物質である。グルタ
チオンは天然に広く存在するが、特にサッカロミセス・
セレビジエー（Saccharomycescerevisiae）などの酵母
菌体からのグルタチオンの抽出、精製が一般的な工業的
製造法のひとつとなっている（特公昭42-17757号および
特公昭44-239号各公報参照）。
与し、諸酵素の活性化や解毒作用などの生理活性を示す
トリペプチドとして、医薬上重要な物質である。グルタ
チオンは天然に広く存在するが、特にサッカロミセス・
セレビジエー（Saccharomycescerevisiae）などの酵母
菌体からのグルタチオンの抽出、精製が一般的な工業的
製造法のひとつとなっている（特公昭42-17757号および
特公昭44-239号各公報参照）。
【０００３】酵母を用いるグルタチオンの製造法では、
酵母菌体中のグルタチオン前駆体の含量が増加するにつ
れ、その生産性が大きく低下し、生産量が制約されると
いう問題がある。
酵母菌体中のグルタチオン前駆体の含量が増加するにつ
れ、その生産性が大きく低下し、生産量が制約されると
いう問題がある。
【０００４】そのため、菌体中にグルタチオンを大量に
生成、蓄積させるための種々の技術が開発されてきた。
例えばメタノール、ギ酸などC1化合物を添加する方法
（特開昭52-156994）や培地中に乳酸を添加する方法
（特開昭60-244284）等が知られている。また、グルタ
チオン生成に関係するアミノ酸を添加することによるグ
ルタチオン製造法（特公昭47-26314、特開昭53-94089、
特公昭54-997、特開昭48-44487、特開昭51-36357）等が
ある。また現在では酵母（特にサッカロミセス・セレビ
ジエー）の代謝系とそれを司る各酵素をコードする遺伝
子が数多く明らかにされているので、グルタチオン合成
に係る遺伝子の操作によってグルタチオン含有率の高い
酵母菌株を作成する試みも行われている。例えばＣＹＳ
４（ＮＨＳ５）遺伝子の強化により、グルタチオンの生
成量が増加することや（特公平7-24586）、γ-グルタミ
ルシステイン合成酵素遺伝子を導入したグルタチオン高
生産酵母（特公平7-53102）が報告されている。
生成、蓄積させるための種々の技術が開発されてきた。
例えばメタノール、ギ酸などC1化合物を添加する方法
（特開昭52-156994）や培地中に乳酸を添加する方法
（特開昭60-244284）等が知られている。また、グルタ
チオン生成に関係するアミノ酸を添加することによるグ
ルタチオン製造法（特公昭47-26314、特開昭53-94089、
特公昭54-997、特開昭48-44487、特開昭51-36357）等が
ある。また現在では酵母（特にサッカロミセス・セレビ
ジエー）の代謝系とそれを司る各酵素をコードする遺伝
子が数多く明らかにされているので、グルタチオン合成
に係る遺伝子の操作によってグルタチオン含有率の高い
酵母菌株を作成する試みも行われている。例えばＣＹＳ
４（ＮＨＳ５）遺伝子の強化により、グルタチオンの生
成量が増加することや（特公平7-24586）、γ-グルタミ
ルシステイン合成酵素遺伝子を導入したグルタチオン高
生産酵母（特公平7-53102）が報告されている。
【０００５】しかしながら、酵母菌体中のグルタチオン
前駆体含量の増加による生産性の低下の問題を解決する
手段は未だ知られていない。
前駆体含量の増加による生産性の低下の問題を解決する
手段は未だ知られていない。
【０００６】一方、最近の研究によれば、酵母菌体中の
グルタチオン含量の増加による生産性の低下は次のよう
に説明できることがわかってきた。グルタチオンなどの
含硫化合物の前駆体となる含硫アミノ酸（メチオニン、
システイン）は酵母の有する２０以上のメチオニン合成
遺伝子（ＭＥＴ遺伝子）群によって菌体外の硫酸イオン
から複数の過程を経て合成される。ところが、これらＭ
ＥＴ遺伝子の多くは、培地中や菌体内のメチオニンやそ
の誘導体によって、転写レベルでの抑制を受けるので、
酵母中にグルタチオン前駆体が蓄積されたり、グルタチ
オン前駆体としての含硫アミノ酸等を培地へ必要以上に
添加すること（例えば、菌体外メチオニン濃度を約0.2
mM以上にすること）は、むしろ酵母の持つ含硫化合物合
成能を低下させる方向に働くのである。そして、このよ
うなＭＥＴ遺伝子群の抑制は、ＭＥＴ遺伝子群のうちの
「ＭＥＴ４」と呼ばれる遺伝子の産物である、転写活性
因子を介して行われていることも報告されている（Moun
tain, H.A. et al., Mol.Microbiol., 7, 215, 199
3）。
グルタチオン含量の増加による生産性の低下は次のよう
に説明できることがわかってきた。グルタチオンなどの
含硫化合物の前駆体となる含硫アミノ酸（メチオニン、
システイン）は酵母の有する２０以上のメチオニン合成
遺伝子（ＭＥＴ遺伝子）群によって菌体外の硫酸イオン
から複数の過程を経て合成される。ところが、これらＭ
ＥＴ遺伝子の多くは、培地中や菌体内のメチオニンやそ
の誘導体によって、転写レベルでの抑制を受けるので、
酵母中にグルタチオン前駆体が蓄積されたり、グルタチ
オン前駆体としての含硫アミノ酸等を培地へ必要以上に
添加すること（例えば、菌体外メチオニン濃度を約0.2
mM以上にすること）は、むしろ酵母の持つ含硫化合物合
成能を低下させる方向に働くのである。そして、このよ
うなＭＥＴ遺伝子群の抑制は、ＭＥＴ遺伝子群のうちの
「ＭＥＴ４」と呼ばれる遺伝子の産物である、転写活性
因子を介して行われていることも報告されている（Moun
tain, H.A. et al., Mol.Microbiol., 7, 215, 199
3）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
の手法を用いて、菌体内外の含硫アミノ酸濃度が増加し
てもグルタチオンの生産性が低下しない酵母および該酵
母を用いるグルタチオンの製造方法を提供するものであ
る。
の手法を用いて、菌体内外の含硫アミノ酸濃度が増加し
てもグルタチオンの生産性が低下しない酵母および該酵
母を用いるグルタチオンの製造方法を提供するものであ
る。
【０００８】即ち、本発明者らは、上記のとおりＭＥＴ
遺伝子群のほとんどの遺伝子は、菌体外にある程度以上
の濃度の含硫アミノ酸等が存在するとその発現が転写レ
ベルで抑制される事実に着目した。さらに、ＭＥＴ遺伝
子群の転写調節は転写活性因子のひとつであるＭＥＴ４
遺伝子産物によって担われていることに着目した。その
結果、ＭＥＴ４遺伝子を改変することによってＭＥＴ遺
伝子群への抑制を解除し、培地組成に非依存的なＭＥＴ
遺伝子群の恒常的な活性化を保てば、グルタチオンなど
の含硫化合物生成増加への効果が大きいと考えた。
遺伝子群のほとんどの遺伝子は、菌体外にある程度以上
の濃度の含硫アミノ酸等が存在するとその発現が転写レ
ベルで抑制される事実に着目した。さらに、ＭＥＴ遺伝
子群の転写調節は転写活性因子のひとつであるＭＥＴ４
遺伝子産物によって担われていることに着目した。その
結果、ＭＥＴ４遺伝子を改変することによってＭＥＴ遺
伝子群への抑制を解除し、培地組成に非依存的なＭＥＴ
遺伝子群の恒常的な活性化を保てば、グルタチオンなど
の含硫化合物生成増加への効果が大きいと考えた。
【０００９】本発明は、このような条件を満たす変異型
ＭＥＴ４遺伝子をスクリーニングし、これを酵母サッカ
ロミセス・セレビジエーに導入し、培養条件に左右され
ないグルタチオン高生産性の菌株を作製することを目的
とするものである。
ＭＥＴ４遺伝子をスクリーニングし、これを酵母サッカ
ロミセス・セレビジエーに導入し、培養条件に左右され
ないグルタチオン高生産性の菌株を作製することを目的
とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の酵母は、変異型
ＭＥＴ４遺伝子を有することにより、天然型ＭＥＴ４遺
伝子を有する酵母と比較して、菌体内外の含硫アミノ酸
濃度が増加してもグルタチオン等の含硫化合物の生産性
が全くまたは僅かしか低下せず、そのような含硫化合物
を安定かつ恒常的に生成する酵母である。
ＭＥＴ４遺伝子を有することにより、天然型ＭＥＴ４遺
伝子を有する酵母と比較して、菌体内外の含硫アミノ酸
濃度が増加してもグルタチオン等の含硫化合物の生産性
が全くまたは僅かしか低下せず、そのような含硫化合物
を安定かつ恒常的に生成する酵母である。
【００１１】酵母、典型的にはサッカロミセス・セレビ
ジエーは、菌体外の硫酸イオンを取り込み、これを還元
し、炭素骨格を付加して、生命活動に必要なメチオニン
やシステインなどの含硫アミノ酸を合成する。この一連
の反応には２０以上のＭＥＴ遺伝子がコードする種々の
酵素が関与する。多くのＭＥＴ遺伝子（例えばＭＥＴ
２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ２５な
ど）はＭＥＴ４遺伝子の産物である転写調節因子の制御
を受け、メチオニン存在下での培養ではその発現が抑制
される。
ジエーは、菌体外の硫酸イオンを取り込み、これを還元
し、炭素骨格を付加して、生命活動に必要なメチオニン
やシステインなどの含硫アミノ酸を合成する。この一連
の反応には２０以上のＭＥＴ遺伝子がコードする種々の
酵素が関与する。多くのＭＥＴ遺伝子（例えばＭＥＴ
２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ２５な
ど）はＭＥＴ４遺伝子の産物である転写調節因子の制御
を受け、メチオニン存在下での培養ではその発現が抑制
される。
【００１２】本発明の酵母を製造するには、ＭＥＴ４遺
伝子から発現される転写調節因子が、ＭＥＴ遺伝子群の
他の遺伝子が抑制されることを妨げるため、変異型ＭＥ
Ｔ４遺伝子を導入する。ＭＥＴ４遺伝子を変異させ、酵
母に導入することは、常法にしたがって行うことができ
る。即ち、酵母サッカロミセス・セレビジエーのＭＥＴ
４遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列
が報告されている（Thomas, D. et al., Mol. Cell. Bi
ol., 12, 1719, 1992）（配列は配列番号：５）。この
情報をもとにプライマーを調製し、ＭＥＴ４遺伝子を複
製連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅、単離することが
できる。例えば、容易に入手できるサッカロミセス・セ
レビジエーＸ２１８０−１Ａ株由来の染色体ＤＮＡから
ＭＥＴ４遺伝子をＰＣＲ法によって増幅・単離し、これ
をプラスミドＤＮＡ上にクローニングした後、変異を施
すことができる。
伝子から発現される転写調節因子が、ＭＥＴ遺伝子群の
他の遺伝子が抑制されることを妨げるため、変異型ＭＥ
Ｔ４遺伝子を導入する。ＭＥＴ４遺伝子を変異させ、酵
母に導入することは、常法にしたがって行うことができ
る。即ち、酵母サッカロミセス・セレビジエーのＭＥＴ
４遺伝子は既にクローニングされており、その塩基配列
が報告されている（Thomas, D. et al., Mol. Cell. Bi
ol., 12, 1719, 1992）（配列は配列番号：５）。この
情報をもとにプライマーを調製し、ＭＥＴ４遺伝子を複
製連鎖反応（ＰＣＲ）法によって増幅、単離することが
できる。例えば、容易に入手できるサッカロミセス・セ
レビジエーＸ２１８０−１Ａ株由来の染色体ＤＮＡから
ＭＥＴ４遺伝子をＰＣＲ法によって増幅・単離し、これ
をプラスミドＤＮＡ上にクローニングした後、変異を施
すことができる。
【００１３】ＭＥＴ４遺伝子に施す変異は、ＭＥＴ４遺
伝子産物のＭＥＴ遺伝子群の他の遺伝子を制御する機能
のみを失わせ、または弱める変異であって、当該遺伝子
産物のその他の機能に実質的に影響を与えないものであ
れば、どのような変異であってもよい。そのような変異
には、例えばＭＥＴ４遺伝子の塩基配列に付加、削除、
変更を施したものが含まれる。また、ＭＥＴ４遺伝子の
特定の塩基を修飾したものであってもよい。
伝子産物のＭＥＴ遺伝子群の他の遺伝子を制御する機能
のみを失わせ、または弱める変異であって、当該遺伝子
産物のその他の機能に実質的に影響を与えないものであ
れば、どのような変異であってもよい。そのような変異
には、例えばＭＥＴ４遺伝子の塩基配列に付加、削除、
変更を施したものが含まれる。また、ＭＥＴ４遺伝子の
特定の塩基を修飾したものであってもよい。
【００１４】このような変異はあらゆる公知の方法を用
いて行うことができる。例えば、ランダムな配列を有す
るオリゴヌクレオチドを用いてクンケルの方法（Kunke
l, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488, 1985）で
ＭＥＴ４構造遺伝子に対して部位特異的な変異を施すこ
とができる。また、消化酵素、ＤＮＡリガーゼ等を使用
して、ＭＥＴ４遺伝子の一部を削除した変異体、または
ＭＥＴ４遺伝子内に別の塩基配列を挿入してもよい。
いて行うことができる。例えば、ランダムな配列を有す
るオリゴヌクレオチドを用いてクンケルの方法（Kunke
l, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488, 1985）で
ＭＥＴ４構造遺伝子に対して部位特異的な変異を施すこ
とができる。また、消化酵素、ＤＮＡリガーゼ等を使用
して、ＭＥＴ４遺伝子の一部を削除した変異体、または
ＭＥＴ４遺伝子内に別の塩基配列を挿入してもよい。
【００１５】得られる変異ＭＥＴ４遺伝子のプールを、
適当な酵母用ベクターにつないで、所望の酵母菌株に導
入する。好ましくは、適当な変異ＭＥＴ４遺伝子が導入
された変異体のスクリーニングの指標として、ＭＥＴ２
５遺伝子の下流にレポーター遺伝子を導入する。例え
ば、導入先の酵母のＭＥＴ２５遺伝子プロモーターの下
流に酸性ホスファターゼ遺伝子を結合する。この場合、
酸性ホスファターゼの活性を測定することにより（Toh-
e, A. and Oshima, Y., J. Bacteriol., 120, 608, 197
4）、培地中のメチオニン濃度非依存的に高転写活性を
示すＭＥＴ４遺伝子産物を検索し、その遺伝子を単離す
ることができる。こうして得られる変異ＭＥＴ４遺伝子
のＤＮＡ塩基配列を確認するためには、サンガーの方法
（Sanger,F., Science, 214, 1205, 1981）で配列を解
析し、データベース（EMBL GenBank検索番号z12126）に
示された天然型ＭＥＴ４の配列と比べればよい。
適当な酵母用ベクターにつないで、所望の酵母菌株に導
入する。好ましくは、適当な変異ＭＥＴ４遺伝子が導入
された変異体のスクリーニングの指標として、ＭＥＴ２
５遺伝子の下流にレポーター遺伝子を導入する。例え
ば、導入先の酵母のＭＥＴ２５遺伝子プロモーターの下
流に酸性ホスファターゼ遺伝子を結合する。この場合、
酸性ホスファターゼの活性を測定することにより（Toh-
e, A. and Oshima, Y., J. Bacteriol., 120, 608, 197
4）、培地中のメチオニン濃度非依存的に高転写活性を
示すＭＥＴ４遺伝子産物を検索し、その遺伝子を単離す
ることができる。こうして得られる変異ＭＥＴ４遺伝子
のＤＮＡ塩基配列を確認するためには、サンガーの方法
（Sanger,F., Science, 214, 1205, 1981）で配列を解
析し、データベース（EMBL GenBank検索番号z12126）に
示された天然型ＭＥＴ４の配列と比べればよい。
【００１６】本発明の好ましいＭＥＴ４変異体は、ラン
ダム変異法により得られた天然のＭＥＴ４遺伝子配列と
１塩基だけ異なる、２種類の変異体である（１６９２Ｃ
及び１５１６Ｃ）。１６９２Ｃは、ＭＥＴ４遺伝子の１
６９２位の塩基ＴがＣに変異した結果、ＭＥＴ４遺伝子
産物の２１５位のアミノ酸残基がＳｅｒからＰｒｏに置
換している（アミノ酸残基の番号は、配列番号５の１０
５０番目から始まるＡＴＧを１位として数えた）。１５
１６Ｃは、１５１６位の塩基ＴがＣに変異した結果、１
５６位のアミノ酸残基がＰｈｅからＳｅｒに置換してい
る。図１に本発明の２種の変異ＭＥＴ４遺伝子の構造を
模式的に示してある。変異ＭＥＴ４遺伝子を有する酵母
のｍＲＮＡを解析すると、コントロール（親株）と比べ
ＭＥＴ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ
２５などの遺伝子のｍＲＮＡ量が上昇し、なおかつ培地
中の高濃度メチオニンによる発現抑制が行われにくくな
っていた。また、変異ＭＥＴ４遺伝子を持つこれらの菌
株では、乾燥菌体の元素分析の結果から、菌体内に含ま
れる硫黄成分が増加していることが明らかとなった。グ
ルタチオンは含硫アミノ酸をその構成成分として含む
が、これらの菌株ではグルタチオンの含量もコントロー
ルの親株に比して増加していた。１５６位および２１５
位のアミノ酸残基における変異が菌体におけるグルタチ
オン含量の増加に影響する事実から、両方の部位におい
て同時に変異があっても同様の効果が得られると考えら
れ、そのような変異体も本発明の好ましいＭＥＴ４変異
体である。
ダム変異法により得られた天然のＭＥＴ４遺伝子配列と
１塩基だけ異なる、２種類の変異体である（１６９２Ｃ
及び１５１６Ｃ）。１６９２Ｃは、ＭＥＴ４遺伝子の１
６９２位の塩基ＴがＣに変異した結果、ＭＥＴ４遺伝子
産物の２１５位のアミノ酸残基がＳｅｒからＰｒｏに置
換している（アミノ酸残基の番号は、配列番号５の１０
５０番目から始まるＡＴＧを１位として数えた）。１５
１６Ｃは、１５１６位の塩基ＴがＣに変異した結果、１
５６位のアミノ酸残基がＰｈｅからＳｅｒに置換してい
る。図１に本発明の２種の変異ＭＥＴ４遺伝子の構造を
模式的に示してある。変異ＭＥＴ４遺伝子を有する酵母
のｍＲＮＡを解析すると、コントロール（親株）と比べ
ＭＥＴ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ１４、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ
２５などの遺伝子のｍＲＮＡ量が上昇し、なおかつ培地
中の高濃度メチオニンによる発現抑制が行われにくくな
っていた。また、変異ＭＥＴ４遺伝子を持つこれらの菌
株では、乾燥菌体の元素分析の結果から、菌体内に含ま
れる硫黄成分が増加していることが明らかとなった。グ
ルタチオンは含硫アミノ酸をその構成成分として含む
が、これらの菌株ではグルタチオンの含量もコントロー
ルの親株に比して増加していた。１５６位および２１５
位のアミノ酸残基における変異が菌体におけるグルタチ
オン含量の増加に影響する事実から、両方の部位におい
て同時に変異があっても同様の効果が得られると考えら
れ、そのような変異体も本発明の好ましいＭＥＴ４変異
体である。
【００１７】酵母に変異ＭＥＴ４遺伝子を導入する際の
ベクターとしては、原則として任意の公知の酵母用ベク
ターが使用可能である。例えば、後記実施例で用いられ
る単コピー型のＹＣｐ５０が都合よく使用できるが、そ
の他にもＹＥｐ１３等の多コピー型やＹＩｐ２８等の染
色体ＤＮＡ組み込み型も利用可能である（Rose, M.D.,
Winston, F. and Hieter, P.(1990):Methods in Yeast
Genetics:A Laboratory Course Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
ベクターとしては、原則として任意の公知の酵母用ベク
ターが使用可能である。例えば、後記実施例で用いられ
る単コピー型のＹＣｐ５０が都合よく使用できるが、そ
の他にもＹＥｐ１３等の多コピー型やＹＩｐ２８等の染
色体ＤＮＡ組み込み型も利用可能である（Rose, M.D.,
Winston, F. and Hieter, P.(1990):Methods in Yeast
Genetics:A Laboratory Course Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
【００１８】変異ＭＥＴ４遺伝子を導入する宿主として
は、適当な栄養要求性マーカーを持つ酵母、例えばサッ
カロミセス・セレビジエーが利用できる。その他にも醸
造用酵母等、例えばサッカロミセス・セレビジエー、IF
O1951、IFO1952、IFO1953、IFO1954等を宿主にすること
も可能であるが、この場合は変異ＭＥＴ４遺伝子導入に
用いるベクターがｐＹＥＧ（特開平7-303475）等のよう
に適当な薬剤耐性遺伝子を有していることが必要であ
る。
は、適当な栄養要求性マーカーを持つ酵母、例えばサッ
カロミセス・セレビジエーが利用できる。その他にも醸
造用酵母等、例えばサッカロミセス・セレビジエー、IF
O1951、IFO1952、IFO1953、IFO1954等を宿主にすること
も可能であるが、この場合は変異ＭＥＴ４遺伝子導入に
用いるベクターがｐＹＥＧ（特開平7-303475）等のよう
に適当な薬剤耐性遺伝子を有していることが必要であ
る。
【００１９】
【実施例】以下に本発明を実施例によってさらに詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
【００２０】実施例１ ＭＥＴ４遺伝子の単離とランダ
ム変異 文献の情報（Thomas, D. et al., Mol. Cell. Biol., 1
2, 1719, 1992）をもとに酵母サッカロミセス・セレビ
ジエーのＭＥＴ４遺伝子をＰＣＲによって増幅、単離し
た。その際、研究用酵母Ｘ２１８０−１Ａ株（Rose, M.
D., Winston, F. and Hieter, P.(1990):Methods in Ye
ast Genetics:A Laboratory Course Manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
Y）から染色体ＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲの鋳型と
した。
ム変異 文献の情報（Thomas, D. et al., Mol. Cell. Biol., 1
2, 1719, 1992）をもとに酵母サッカロミセス・セレビ
ジエーのＭＥＴ４遺伝子をＰＣＲによって増幅、単離し
た。その際、研究用酵母Ｘ２１８０−１Ａ株（Rose, M.
D., Winston, F. and Hieter, P.(1990):Methods in Ye
ast Genetics:A Laboratory Course Manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N
Y）から染色体ＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲの鋳型と
した。
【００２１】ＭＥＴ４のオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）を増幅するためのＰＣＲ用のプライマーとし
て5'-TACAGCACGGAATTCATAAATCTCT-3' （配列番号：1）
および5'-GAGGATCCATTTCGAGCGGCTTGCA-3' （配列番号：
2）の合成ＤＮＡを用いた。これらはそれぞれ、配列番
号5に示すＭＥＴ４遺伝子の1083〜1107番目の塩基およ
び3442〜3460番目の塩基に対応する。得られた約２.４
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１１８（宝
酒造社製）へ挿入して、プラスミドｐＵＣ−ＭＥＴ４を
得た。
（ＯＲＦ）を増幅するためのＰＣＲ用のプライマーとし
て5'-TACAGCACGGAATTCATAAATCTCT-3' （配列番号：1）
および5'-GAGGATCCATTTCGAGCGGCTTGCA-3' （配列番号：
2）の合成ＤＮＡを用いた。これらはそれぞれ、配列番
号5に示すＭＥＴ４遺伝子の1083〜1107番目の塩基およ
び3442〜3460番目の塩基に対応する。得られた約２.４
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１１８（宝
酒造社製）へ挿入して、プラスミドｐＵＣ−ＭＥＴ４を
得た。
【００２２】ｐＵＣ−ＭＥＴ４からヘルパーファージな
どを用いて一本鎖DNAを調製し（Vieira, J. and Messin
g, J., Methods in Enzymology, 153, 3, 1987）、これ
を部位特異的変異操作時の鋳型として用いた。ランダム
変異を誘起するためのプライマーとしてはランダムな配
列を有する６塩基のオリゴヌクレオチド（宝酒造社製）
を使用した。部位特異的変異は宝酒造社製のキットMuta
n-Kを使用し、取扱い説明書に従って操作した。変異操
作を終了したDNAを二本鎖プラスミドDNAの形で回収し、
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化後、約２.４ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製した。
どを用いて一本鎖DNAを調製し（Vieira, J. and Messin
g, J., Methods in Enzymology, 153, 3, 1987）、これ
を部位特異的変異操作時の鋳型として用いた。ランダム
変異を誘起するためのプライマーとしてはランダムな配
列を有する６塩基のオリゴヌクレオチド（宝酒造社製）
を使用した。部位特異的変異は宝酒造社製のキットMuta
n-Kを使用し、取扱い説明書に従って操作した。変異操
作を終了したDNAを二本鎖プラスミドDNAの形で回収し、
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化後、約２.４ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製した。
【００２３】ＭＥＴ４遺伝子のプロモーター領域は5'-C
ACATACATGCATGCCACATACATGC-3'（配列番号：3）及び5'-
AGAGATTTATGAATTCCGTGCTGTAT-3'（配列番号：4）の合成
ＤＮＡをプライマー、研究用酵母X2180-1A株から抽出し
た染色体DNAを鋳型とするＰＣＲによって調製した。配
列番号3および4のプライマーは、それぞれ、配列番号5
の347〜371番目の塩基および1083〜1107番目の塩基に対
応する。得られた約７４０ｂｐのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ
断片は一旦ｐＵＣ１８ベクター（宝酒造社製）にクロー
ニングして塩基配列を確認した後に、再度約７４０ｂｐ
のＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片として調製した。これをラ
ンダム変異後のＭＥＴ４遺伝子の約２.４ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とともにシャトルベクターＹＣｐ
５０のＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩ部位にクローニングしてプ
ラスミドＤＮＡを調製し、スクリーニング用の変異ＭＥ
Ｔ４遺伝子プールとした。
ACATACATGCATGCCACATACATGC-3'（配列番号：3）及び5'-
AGAGATTTATGAATTCCGTGCTGTAT-3'（配列番号：4）の合成
ＤＮＡをプライマー、研究用酵母X2180-1A株から抽出し
た染色体DNAを鋳型とするＰＣＲによって調製した。配
列番号3および4のプライマーは、それぞれ、配列番号5
の347〜371番目の塩基および1083〜1107番目の塩基に対
応する。得られた約７４０ｂｐのＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ
断片は一旦ｐＵＣ１８ベクター（宝酒造社製）にクロー
ニングして塩基配列を確認した後に、再度約７４０ｂｐ
のＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩ断片として調製した。これをラ
ンダム変異後のＭＥＴ４遺伝子の約２.４ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ−ＢａｍＨＩ断片とともにシャトルベクターＹＣｐ
５０のＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩ部位にクローニングしてプ
ラスミドＤＮＡを調製し、スクリーニング用の変異ＭＥ
Ｔ４遺伝子プールとした。
【００２４】このＭＥＴ４プールを用いて酵母FDM441株
（MATa ura3 trp1 his1 pho3 pho5leu2::ＭＥＴ25p-PHO
5::LEU2 met4::TRP1）を酢酸リチウム法（Rose, M.D.,
Winston, F. and Hieter, P.(1990):Methods in Yeast
Genetics:A Laboratory Course Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）に
よって形質転換した。宿主に用いた株は染色体上のＰＨ
Ｏ３及びＰＨＯ５遺伝子が破壊してあるので内在性の酸
性ホスファターゼの活性を持たない。
（MATa ura3 trp1 his1 pho3 pho5leu2::ＭＥＴ25p-PHO
5::LEU2 met4::TRP1）を酢酸リチウム法（Rose, M.D.,
Winston, F. and Hieter, P.(1990):Methods in Yeast
Genetics:A Laboratory Course Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）に
よって形質転換した。宿主に用いた株は染色体上のＰＨ
Ｏ３及びＰＨＯ５遺伝子が破壊してあるので内在性の酸
性ホスファターゼの活性を持たない。
【００２５】一方でＭＥＴ25遺伝子の下流にＰＨＯ５遺
伝子がつないであるので、ＭＥＴ２５プロモーターから
転写されるmRNAを酸性ホスファターゼの活性によってモ
ニターできるシステムとなっている（Toh-e, A. and Os
hima, Y., J. Bacteriol., 120, 608, 1974）。変異Ｍ
ＥＴ４遺伝子のプールを導入した酵母を５ｍＭのメチオ
ニンとヒスチジン、２％寒天を添加したバークホルダー
合成培地のプレート上にまき、３０℃で３日間保持し
た。コロニーの出現後、プレート上に０.５ｍｇ／ｍｌ
1-ナフチルリン酸二ナトリウム、５ｍｇ／ｍｌ Fast bl
ue salt B （Merck）、0.05 M酢酸バッファー、1％寒天
からなる液を重層し、各コロニーの持つ酸性ホスファタ
ーゼの活性を染色によって判定した。
伝子がつないであるので、ＭＥＴ２５プロモーターから
転写されるmRNAを酸性ホスファターゼの活性によってモ
ニターできるシステムとなっている（Toh-e, A. and Os
hima, Y., J. Bacteriol., 120, 608, 1974）。変異Ｍ
ＥＴ４遺伝子のプールを導入した酵母を５ｍＭのメチオ
ニンとヒスチジン、２％寒天を添加したバークホルダー
合成培地のプレート上にまき、３０℃で３日間保持し
た。コロニーの出現後、プレート上に０.５ｍｇ／ｍｌ
1-ナフチルリン酸二ナトリウム、５ｍｇ／ｍｌ Fast bl
ue salt B （Merck）、0.05 M酢酸バッファー、1％寒天
からなる液を重層し、各コロニーの持つ酸性ホスファタ
ーゼの活性を染色によって判定した。
【００２６】天然型のＭＥＴ４遺伝子を持つ株では５ｍ
ＭのメチオニンによってＭＥＴ２５の発現が抑制される
が、５ｍＭのメチオニンを含むプレート上でも十分なＭ
ＥＴ２５プロモーターからのｍＲＮＡの発現を示すよう
なクローンを選択し、そこから回収した変異ＭＥＴ４遺
伝子を解析した結果、２種の異なる位置にＤＮＡ塩基置
換を有する変異ＭＥＴ４遺伝子（1692C及び1516C）が得
られた（図１）。１６９２Ｃは、ＭＥＴ４遺伝子の１６
９２位の塩基ＴがＣに変異した結果、ＭＥＴ４遺伝子産
物の２１５位のアミノ酸残基がＳｅｒからＰｒｏに置換
していた。１５１６Ｃは、１５１６位の塩基ＴがＣに変
異した結果、１５６位のアミノ酸残基がＰｈｅからＳｅ
ｒに置換していた。
ＭのメチオニンによってＭＥＴ２５の発現が抑制される
が、５ｍＭのメチオニンを含むプレート上でも十分なＭ
ＥＴ２５プロモーターからのｍＲＮＡの発現を示すよう
なクローンを選択し、そこから回収した変異ＭＥＴ４遺
伝子を解析した結果、２種の異なる位置にＤＮＡ塩基置
換を有する変異ＭＥＴ４遺伝子（1692C及び1516C）が得
られた（図１）。１６９２Ｃは、ＭＥＴ４遺伝子の１６
９２位の塩基ＴがＣに変異した結果、ＭＥＴ４遺伝子産
物の２１５位のアミノ酸残基がＳｅｒからＰｒｏに置換
していた。１５１６Ｃは、１５１６位の塩基ＴがＣに変
異した結果、１５６位のアミノ酸残基がＰｈｅからＳｅ
ｒに置換していた。
【００２７】実施例２ 変異ＭＥＴ４遺伝子を有する株
における各種ＭＥＴ遺伝子のｍＲＮＡ発現量 酵母サッカロミセス・セレビジエーFDM441株（MATa ura
3 trp1 his1 pho3 pho5 leu2::MET25p-PHO5::LEU2 met
4::TRP1）を天然型ＭＥＴ４遺伝子を有するＹＣｐ型プ
ラスミドDNA（ｐＹＣＭ４、図２）、及び変異ＭＥＴ４
遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（pYC-1692C及びpYC-151
6C、図２）を用いて、酢酸リチウム法によって形質転換
した。得られた形質転換株を２％グルコースを含むYeas
t NitrogenBase (Difco)、又は、２％グルコース及び５
ｍＭメチオニン含むYeast Nitrogen Baseで30℃、17時
間培養した。酵母菌体を集菌、洗浄し、０.２ｍＭのＬ
ＥＴＳバッファー（０.１ＭＬｉＣｌ、１％(w/v)ＳＤ
Ｓ、０.２ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、０.０１Ｍ
ＥＤＴＡ）に懸濁し、０.４ｇのグラスビーズを加え
て、激しく撹拌し、菌体を破砕した。
における各種ＭＥＴ遺伝子のｍＲＮＡ発現量 酵母サッカロミセス・セレビジエーFDM441株（MATa ura
3 trp1 his1 pho3 pho5 leu2::MET25p-PHO5::LEU2 met
4::TRP1）を天然型ＭＥＴ４遺伝子を有するＹＣｐ型プ
ラスミドDNA（ｐＹＣＭ４、図２）、及び変異ＭＥＴ４
遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（pYC-1692C及びpYC-151
6C、図２）を用いて、酢酸リチウム法によって形質転換
した。得られた形質転換株を２％グルコースを含むYeas
t NitrogenBase (Difco)、又は、２％グルコース及び５
ｍＭメチオニン含むYeast Nitrogen Baseで30℃、17時
間培養した。酵母菌体を集菌、洗浄し、０.２ｍＭのＬ
ＥＴＳバッファー（０.１ＭＬｉＣｌ、１％(w/v)ＳＤ
Ｓ、０.２ＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、０.０１Ｍ
ＥＤＴＡ）に懸濁し、０.４ｇのグラスビーズを加え
て、激しく撹拌し、菌体を破砕した。
【００２８】得られた菌体破砕液を10,000 x g、10分間
遠心して上清を得、フェノール処理を３回施した後に、
エタノールを加え、−２０℃で全RNAを沈殿させた。遠
心後、沈殿を７０％エタノールでリンスし乾固させて、
蒸留水に溶解し全ＲＮＡ液とした。得られた全RNA４０
μgを常法（Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniati
s, T. (1989):Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY）どおりホ
ルムアルデヒドゲル電気泳動で展開後、ニトロセルロー
ス膜に写し、32Ｐ-ラベルしたＤＮＡフラグメントをプ
ローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った。
プローブに用いた遺伝子は、ＭＥＴ２、ＭＥＴ３、ＭＥ
Ｔ１４、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ２５、及びコントロール用
のＡＣＴ１である。
遠心して上清を得、フェノール処理を３回施した後に、
エタノールを加え、−２０℃で全RNAを沈殿させた。遠
心後、沈殿を７０％エタノールでリンスし乾固させて、
蒸留水に溶解し全ＲＮＡ液とした。得られた全RNA４０
μgを常法（Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniati
s, T. (1989):Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY）どおりホ
ルムアルデヒドゲル電気泳動で展開後、ニトロセルロー
ス膜に写し、32Ｐ-ラベルしたＤＮＡフラグメントをプ
ローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行った。
プローブに用いた遺伝子は、ＭＥＴ２、ＭＥＴ３、ＭＥ
Ｔ１４、ＭＥＴ１６、ＭＥＴ２５、及びコントロール用
のＡＣＴ１である。
【００２９】発現量の強さはイメージングプレート（富
士写真フィルム社製、BAS2000）を用いて測定した。内
部コントロールのACT1遺伝子の値で標準化し、メチオニ
ン非存在下での天然型ＭＥＴ４遺伝子を有する株の値を
１００％とした結果を表1に示す。
士写真フィルム社製、BAS2000）を用いて測定した。内
部コントロールのACT1遺伝子の値で標準化し、メチオニ
ン非存在下での天然型ＭＥＴ４遺伝子を有する株の値を
１００％とした結果を表1に示す。
【００３０】
【表１】 表１ ＭＥＴ遺伝子 ｍＲＮＡ発現量（％） --------------------------------------------------------------------- ＭＥＴ４の型 天然型 １６９２Ｃ １５１６Ｃ --------------------------------------------------------------------- メチオニン − ＋ − ＋ − ＋ --------------------------------------------------------------------- ＭＥＴ２ １００ ５２ １１０ ８０ １３４ １１１ ＭＥＴ３ １００ ４０ １３３ ６６ １４２ ６５ ＭＥＴ１４ １００ １２ ２５０ １０５ ２８０ １１６ ＭＥＴ１６ １００ ３１ ２６０ ９１ ３０３ ９６ ＭＥＴ２５ １００ ４４ １１５ ７８ １２２ ９９ ---------------------------------------------------------------------
【００３１】天然型ＭＥＴ４遺伝子を有するコントロー
ル（FDM441+pYCM4）に比して、変異型ＭＥＴ４（1692C
又は1516C）を有する株では、メチオニン非存在下での
各ＭＥＴ遺伝子の発現量が増加している。また、天然型
ＭＥＴ４遺伝子を有するコントロールに於いては、培地
中のメチオニンによって各ＭＥＴ遺伝子のｍＲＮＡ発現
が抑制されているのに対し、変異型ＭＥＴ４を有する株
では、ＭＥＴ２５及びＭＥＴ１４遺伝子などの培地中の
メチオニンによる発現抑制がかかりにくくなっている。
ル（FDM441+pYCM4）に比して、変異型ＭＥＴ４（1692C
又は1516C）を有する株では、メチオニン非存在下での
各ＭＥＴ遺伝子の発現量が増加している。また、天然型
ＭＥＴ４遺伝子を有するコントロールに於いては、培地
中のメチオニンによって各ＭＥＴ遺伝子のｍＲＮＡ発現
が抑制されているのに対し、変異型ＭＥＴ４を有する株
では、ＭＥＴ２５及びＭＥＴ１４遺伝子などの培地中の
メチオニンによる発現抑制がかかりにくくなっている。
【００３２】実施例３ 変異ＭＥＴ４遺伝子を有する株
の硫黄元素含量率測定 酵母サッカロミセス・セレビジエーＦＤＭ４４１株（MA
Ta ura3 trp1 his1 pho3 pho5 leu2::MET25p-PHO5::LEU
2 met4::TPR1）の天然型ＭＥＴ４を含むｐＹＣＭ４、及
び変異ＭＥＴ４を含むpYC-1692C又はpYC-1516Cによる形
質転換株をＹＰＤ培地（Rose, M.D., Winston, F. and
Hieter, P.(1990):Methods in YeastGenetics:A Labora
tory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY）で３０℃、１７時間
培養した。酵母菌体を集菌した後蒸留水で洗浄し、凍結
乾燥して微量元素測定装置用のサンプルとした。得られ
たサンプルを２ｍｇ量りとり、微量元素測定装置に供
し、菌体中の硫黄化合物をすべて酸化燃焼によってＳＯ
2に変換して、赤外吸収強度によって硫黄元素を定量し
た。微量元素測定装置による測定条件を表２に示す。
の硫黄元素含量率測定 酵母サッカロミセス・セレビジエーＦＤＭ４４１株（MA
Ta ura3 trp1 his1 pho3 pho5 leu2::MET25p-PHO5::LEU
2 met4::TPR1）の天然型ＭＥＴ４を含むｐＹＣＭ４、及
び変異ＭＥＴ４を含むpYC-1692C又はpYC-1516Cによる形
質転換株をＹＰＤ培地（Rose, M.D., Winston, F. and
Hieter, P.(1990):Methods in YeastGenetics:A Labora
tory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY）で３０℃、１７時間
培養した。酵母菌体を集菌した後蒸留水で洗浄し、凍結
乾燥して微量元素測定装置用のサンプルとした。得られ
たサンプルを２ｍｇ量りとり、微量元素測定装置に供
し、菌体中の硫黄化合物をすべて酸化燃焼によってＳＯ
2に変換して、赤外吸収強度によって硫黄元素を定量し
た。微量元素測定装置による測定条件を表２に示す。
【００３３】
【表２】 表２ 微量元素測定装置の条件 --------------------------------------------------------------------- 装置 LECO社 CHNS-932型 微量元素測定装置 還元燃焼温度 ７５０℃ 酸化燃焼温度 ９５０℃ キャリアガス（Ｈｅ）流量 ３０ ｍＬ／分 Ｏ2 供給量 １０ ｍＬ 測定時間 ３ 分 ---------------------------------------------------------------------
【００３４】微量元素測定の結果、得られた変異型及び
天然型ＭＥＴ４を有する形質転換株の硫黄元素含有率を
下表に示す。
天然型ＭＥＴ４を有する形質転換株の硫黄元素含有率を
下表に示す。
【００３５】
【表３】 表３ 微量元素測定の結果 -------------------------------------------------------------- 菌株 硫黄元素含有率 （％） -------------------------------------------------------------- ＦＤＭ４４１＋ｐＹＣＭ４（コントロール） ０．１８ ＦＤＭ４４１＋ｐＹＣ−１６９２Ｃ ０．２４ ＦＤＭ４４１＋ｐＹＣ−１５１６Ｃ ０．２７ --------------------------------------------------------------
【００３６】変異型ＭＥＴ４遺伝子の導入によって、菌
体内の硫黄元素含有量が天然型ＭＥＴ４のコントロール
の１.５倍程度に増加することが判明した。
体内の硫黄元素含有量が天然型ＭＥＴ４のコントロール
の１.５倍程度に増加することが判明した。
【００３７】実施例４ 変異ＭＥＴ４遺伝子を有する株
におけるグルタチオン生成能 酵母サッカロミセス・セレビジエーＦＤＭ４４１株の天
然型ＭＥＴ４を含むｐＹＣＭ４、及び変異ＭＥＴ４を含
むｐＹＣ−１６９２Ｃ又はｐＹＣ−１５１６Ｃによる形
質転換株を５ｍｌのＹＰＤ培地で３０℃、３０時間培養
した。遠心分離で菌体を集め、蒸留水で洗浄後１ｍｌの
蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１００℃、5分間加熱
した後、遠心分離にて上清を得た。上清中に抽出された
グルタチオンを比色定量（Tietze, F., Anal. Bioche
m., 27, 502, 1969）に供した。
におけるグルタチオン生成能 酵母サッカロミセス・セレビジエーＦＤＭ４４１株の天
然型ＭＥＴ４を含むｐＹＣＭ４、及び変異ＭＥＴ４を含
むｐＹＣ−１６９２Ｃ又はｐＹＣ−１５１６Ｃによる形
質転換株を５ｍｌのＹＰＤ培地で３０℃、３０時間培養
した。遠心分離で菌体を集め、蒸留水で洗浄後１ｍｌの
蒸留水に懸濁した。この懸濁液を１００℃、5分間加熱
した後、遠心分離にて上清を得た。上清中に抽出された
グルタチオンを比色定量（Tietze, F., Anal. Bioche
m., 27, 502, 1969）に供した。
【００３８】０.７ｍＭのＥＤＴＡを含む０.３６Ｍ、ｐ
Ｈ７.０のリン酸バッファー２.５ｍｌに、５,５'-ジチ
オビス-（2-ニトロ安息香酸）４ｍｇ／ｍｌ溶液１００
μl、ＮＡＤＰＨ４ｍｇ／ｍｌ溶液５０μl、グルタチオ
ンリダクターゼ０.５ユニットを加え、光路長１ｃｍの
ガラス製キュベットへ入れ、２５℃に加温した。そのキ
ュベットへ適宜希釈したグルタチオンを含むサンプルを
１０μl添加して反応を開始した。日立自記分光光度計3
20型を用いて412 nmの吸光度を連続的に1分間記録し
た。同様にして、濃度既知のグルタチオン標準溶液をサ
ンプルとして反応させ、吸光度の増加から検量線を作
り、サンプルの増加曲線の勾配からサンプル中に含まれ
るグルタチオンを算出した。得られた変異型及び天然型
ＭＥＴ４を有する形質転換株の菌体内グルタチオン含有
率を下表に示す。
Ｈ７.０のリン酸バッファー２.５ｍｌに、５,５'-ジチ
オビス-（2-ニトロ安息香酸）４ｍｇ／ｍｌ溶液１００
μl、ＮＡＤＰＨ４ｍｇ／ｍｌ溶液５０μl、グルタチオ
ンリダクターゼ０.５ユニットを加え、光路長１ｃｍの
ガラス製キュベットへ入れ、２５℃に加温した。そのキ
ュベットへ適宜希釈したグルタチオンを含むサンプルを
１０μl添加して反応を開始した。日立自記分光光度計3
20型を用いて412 nmの吸光度を連続的に1分間記録し
た。同様にして、濃度既知のグルタチオン標準溶液をサ
ンプルとして反応させ、吸光度の増加から検量線を作
り、サンプルの増加曲線の勾配からサンプル中に含まれ
るグルタチオンを算出した。得られた変異型及び天然型
ＭＥＴ４を有する形質転換株の菌体内グルタチオン含有
率を下表に示す。
【００３９】
【表４】 表４ 菌体重量あたりのグルタチオン重量％ （ＨＰＬＣの結果） 菌株 グルタチオン ＦＤＭ４４１＋ｐＹＣＭ４ １．３ ＦＤＭ４４１＋ｐＹＣ−１６９２Ｃ ２．０ ＦＤＭ４４１＋ｐＹＣ−１５１６Ｃ ２．３
【００４０】以上の結果から本発明は、酵母サッカロミ
セス・セレビジエーの菌体内グルタチオン含有率を増加
させるのに有効であることが確認された。
セス・セレビジエーの菌体内グルタチオン含有率を増加
させるのに有効であることが確認された。
【００４１】
【発明の効果】本発明に於いては、酵母で働く複数のメ
チオニン合成系遺伝子群を同時に、メチオニン等の培地
成分による抑制を受けることなく恒常的に活性化できる
ので、結果として菌体内に含硫化合物を多く蓄積する酵
母を作成でき、これを用いることにより、グルタチオン
の生産性を高めることが可能である。
チオニン合成系遺伝子群を同時に、メチオニン等の培地
成分による抑制を受けることなく恒常的に活性化できる
ので、結果として菌体内に含硫化合物を多く蓄積する酵
母を作成でき、これを用いることにより、グルタチオン
の生産性を高めることが可能である。
【００４２】
【００４３】配列番号：1 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： TACAGCACGG AATTCATAAA TCTCT 25
【００４４】配列番号：2 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： GAGGATCCAT TTCGAGCGGC TTGCA 25
【００４５】配列番号：3 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： CACATACATG CATGCCACAT ACATGC 26
【００４６】配列番号：4 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列： AGAGATTTAT GAATTCCGTG CTGTAT 26
【００４７】配列番号：5 配列の長さ：3479 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：酵母(Saccharomyces cerevisiae), strain S28
8C 配列の特徴 MET4遺伝子 配列： TGGAGGAATA ACTCTTGAGG CTCTGGAGGC CGCATGCTCA GCAAGAGCAA TAATACTCTC 60 TTTAACCATG ATTGTTCCTT GTCTTTTTGT AAGGAAAAAG TCTACAGTAA ACTTCTAGTG 120 TGAGAATCCT TTTTTTTCTT CAAAAAATAC CCTTTGAAAG AACTGAGTCA CTTACACGTA 180 AGTTTCTTTT TACTGGTCAA GTTGAAAAAT AACCAATAAA TGATTATGGA AAGAACGTTG 240 AAAGAGGAGA GAGGCTGACC CAAGAGGAGA AAACATCGAA CCTACGCGAC TCCATAGCGC 300 ACATCTCCCA TGCGCCCGTG CTTATATATA TATAAATATA CATACACACA TACATGCACG 360 CACATACATG CACGCGCATG ACAGTGACTG GCCGTTACTG TACAATTTTT TCAGCCAAGT 420 ATGACACACA TTCAACTCAG CTTTTCTGAG GCCTTCTTTC TTTTCCTGCG CGTCGGTAGA 480 GCGATGACTA ACCTACTACT GTCTCAGAGC CGGTCCCGCT CCGGTAGCAA TCCTGGGGCT 540 GGTCATAACA GCCGAGTGGA AGTGTCAAAG CGGAGAACAG AAGCATAAGC TCAATCGCTG 600 GACATACGGA TGCTTATATA CGTCTTATTG TCGTTGAAAA ATATCGAATT TTTTACTTCA 660 TTTATCGAGG CTTCTTCGAG CACTTTTCCG CTATGGCTTT TTCCCCGTTT CCTTTTAATC 720 ACGTGCGCGG GTAGCACCCG GCACACAGCT GGTGTCTCGT CGCACATGCT ATTGTGTGTC 780 ATCGGGCCAC ACAAGCATAT TGCTTGAATT TTCTTTCATC GTTCAACTTA AATCCACCCA 840 ATCTAGATGT AGCCGTAGCA TGTAATAACG TATATCCTTG TTTACATGCA TCTGTGCCAG 900 GTGAAACGGT CTGTTTGAAC GCACATCATT TCATATATTA GTCAACTCCT GAAGGTCTTC 960 TTGCCTGTCC GTCAACTGTT TAGACAGACT CTCGTCAATA AAGCGCACTT CTGATAAGCA 1020 CTTTTATTCC TTTTTTTCCA CTGTGAACGA TGAAGCAGGA GCAGTCCCAC GAAGGCGACT 1080 CATACAGCAC GGAATTCATA AATCTCTTTG GCAAAGATAC CGCAACACAC CCTAGCAGCA 1140 ACAACGGTGC TAATAATAAT GGCATGGGGA GCACGAACTC GTTGGACCAG TTTGTGGCAA 1200 CAGCCTCATC GTCATCTTCT CTGGTGACCA GCAGCGAGAA TAGGCGCCCC CTAATAGGTG 1260 ACGTTACCAA TAGGGGCAAC ACTAACCTAT ATGACCACGC TGTCACGCCA GAAATACTCT 1320 TAGAACAGTT GGCCTACGTG GATAACTTCA TACCATCTCT GGATAACGAG TTCTCTAATG 1380 TGGATTGGAA TGTGAATACC ACCCATAATA ATGCAAACAA TAATGGCGCG GACACTTTCA 1440 GCAGCATAAA TGCAAATCCT TTTGACTTGG ATGAACAACT AGCCATTGAG TTGAGTGCGT 1500 TTGCCGACGA TTCTTTCATC TTCCCAGACG AGGATAAGCC GAGCAATAAC AATAACAACA 1560 GCAATAATGG TAATGACGAC CATAGCAACC ACGACGTATT GCATGAGGAC CCTTCTACCA 1620 ATAATAGACA AAGAAATCCT CACTTCTTGA CTCAAAGAAG GAATACTTTC CTAACTTCCC 1680 AATACGACCA ATCAAAGTCT CGATTTTCGT CCAAAAACAA AAGAAATGGC AATAACGGCG 1740 AAACAAACAA CTTTGGCGAC AATATGCAAA ATAACCATCC TTTTGAGCCA AACTTTATGG 1800 GAAGCCCTTC TCAGTTTCCC GCTGACGCAA CTAATATGAC ATCAATCGAC CATGGCGGCT 1860 TCACAAATGT TGACATTACA TCAACTGAGA ACAATACTAC CGGTGACAAT GGAGTGGATG 1920 CGCTATCAAA TCTACTACAT AGGACAACAC ACACACCGAA CCGCTCCTCC CCCCTAAGCA 1980 ATGTCACTTC TGCTCAAAAT TCCTCTTCAC AACAACGAAA ACATTCGGAA AGCAAAGTCG 2040 ATAGTAACAG CGATAATAAC AGCTCCAACA AAGCCCCCAA TATAACTGTT CCTGACTATT 2100 CAATTATACC AACCTCTGTT TTAGTAACTC TATTACCGAG GGTCAACGTG CCCAACGGCG 2160 CATATAACTC GTTGATCAGC GCGGGATTTG ACAATGATCA AATAGATGCT ATAGCCGCAA 2220 TAATGGCGTA TCATCATCAA AAAAAGATTA GGGAAAATAA CAGTAATAAT AATAAAAACA 2280 TCAACACCAA TGACAGTCAA GAGGCACCCA TTCTAAAAAA CATCAACGAA CTTTTAAGTG 2340 TCTTAATACC ACCCTCTCCG GCTGAAACTC GTGGGCCAAC TACCTTATCA ACGTCGCCTT 2400 CGTTCAATGA GCACGGTGTA GTAGCAGAGG CTTCTTTTCT AAGCTCCATT TTGGAACTGG 2460 GCATAAAGCA TCCAAAAAGT AATAATATTC ACAATCAACG ACAACCTTCA CGAAACGATC 2520 ATAAAATATC AAGAGAGAGT GACGGTAACA ATGGAAACGA TAATGTCCAT CATAATAACG 2580 CTGTTATTAA GTCAAGTACG ACGCGTGGAG ACGAAATTGC CAAGATACGA TCCGAGCCAA 2640 CTTTAAATGC AAGTTCTTCT GATCACAAGG AAAATAGTTT AAAAAGATCA CACTCCGGAG 2700 ATTTGAAAAA TAAAAAAGTA CCCGTCGACC GCAAGTATTC TGATAATGAA GACGATGAAT 2760 ATGACGATGC AGATTTACAC GGCTTTGAAA AGAAGCAACT GATCAAGAAA GAGTTAGGGG 2820 ACGACGATGA AGATTTATTG ATACAGTCGA AAAAATCTCA TCAAAAAAAA AAACTAAAGG 2880 AAAAGGAGTT AGAATCATCG ATACATGAAC TGACCGAAAT TGCAGCATCC TTACAAAAAC 2940 GGATACATAC GTTAGAAACG GAAAACAAGC TTTTAAAGAA TTTAGTTCTG AGTAGCGGTG 3000 AAACGGAAGG AATAAAAAAA GCTGAAAGCT TAAAGAAGCA AATTTTTGAG AAGGTTCAGA 3060 AAGAATAAAA TAACAGACTA TACAGTTTAA TTATATATAT ATATATATAT ACGTGCATTT 3120 TTCTTAAAGA AATATAACTT TTTTCTTGTA CTGCCTGCAA TCTCTATTCT TCATTCATCA 3180 CACATCTATT CAAACGCGTT AAAATTTTTT TGTTAGCCTA TAAGTAAAAC GCGTCGCGTG 3240 TATCCAATTT TACTGAATTA AATTCTTTAC TCATTGGATG ATATATATCT TCTTGGTCTA 3300 GACAACGAAC ACATACCAAT TCAGACTCAC GAGAAAAAAA ACTGTCTTCA CTCTGCTATT 3360 AGAAACCAAA TAGTATCAAG GCATAAAATA AACAGTGGAA AATGTCTTCT AAAAGTGAAA 3420 AATTAGAAAA ATTGAGAAAG CTGCAAGCCG CTCGAAATGG TACATCCATC GATGATTAC 3479
8C 配列の特徴 MET4遺伝子 配列： TGGAGGAATA ACTCTTGAGG CTCTGGAGGC CGCATGCTCA GCAAGAGCAA TAATACTCTC 60 TTTAACCATG ATTGTTCCTT GTCTTTTTGT AAGGAAAAAG TCTACAGTAA ACTTCTAGTG 120 TGAGAATCCT TTTTTTTCTT CAAAAAATAC CCTTTGAAAG AACTGAGTCA CTTACACGTA 180 AGTTTCTTTT TACTGGTCAA GTTGAAAAAT AACCAATAAA TGATTATGGA AAGAACGTTG 240 AAAGAGGAGA GAGGCTGACC CAAGAGGAGA AAACATCGAA CCTACGCGAC TCCATAGCGC 300 ACATCTCCCA TGCGCCCGTG CTTATATATA TATAAATATA CATACACACA TACATGCACG 360 CACATACATG CACGCGCATG ACAGTGACTG GCCGTTACTG TACAATTTTT TCAGCCAAGT 420 ATGACACACA TTCAACTCAG CTTTTCTGAG GCCTTCTTTC TTTTCCTGCG CGTCGGTAGA 480 GCGATGACTA ACCTACTACT GTCTCAGAGC CGGTCCCGCT CCGGTAGCAA TCCTGGGGCT 540 GGTCATAACA GCCGAGTGGA AGTGTCAAAG CGGAGAACAG AAGCATAAGC TCAATCGCTG 600 GACATACGGA TGCTTATATA CGTCTTATTG TCGTTGAAAA ATATCGAATT TTTTACTTCA 660 TTTATCGAGG CTTCTTCGAG CACTTTTCCG CTATGGCTTT TTCCCCGTTT CCTTTTAATC 720 ACGTGCGCGG GTAGCACCCG GCACACAGCT GGTGTCTCGT CGCACATGCT ATTGTGTGTC 780 ATCGGGCCAC ACAAGCATAT TGCTTGAATT TTCTTTCATC GTTCAACTTA AATCCACCCA 840 ATCTAGATGT AGCCGTAGCA TGTAATAACG TATATCCTTG TTTACATGCA TCTGTGCCAG 900 GTGAAACGGT CTGTTTGAAC GCACATCATT TCATATATTA GTCAACTCCT GAAGGTCTTC 960 TTGCCTGTCC GTCAACTGTT TAGACAGACT CTCGTCAATA AAGCGCACTT CTGATAAGCA 1020 CTTTTATTCC TTTTTTTCCA CTGTGAACGA TGAAGCAGGA GCAGTCCCAC GAAGGCGACT 1080 CATACAGCAC GGAATTCATA AATCTCTTTG GCAAAGATAC CGCAACACAC CCTAGCAGCA 1140 ACAACGGTGC TAATAATAAT GGCATGGGGA GCACGAACTC GTTGGACCAG TTTGTGGCAA 1200 CAGCCTCATC GTCATCTTCT CTGGTGACCA GCAGCGAGAA TAGGCGCCCC CTAATAGGTG 1260 ACGTTACCAA TAGGGGCAAC ACTAACCTAT ATGACCACGC TGTCACGCCA GAAATACTCT 1320 TAGAACAGTT GGCCTACGTG GATAACTTCA TACCATCTCT GGATAACGAG TTCTCTAATG 1380 TGGATTGGAA TGTGAATACC ACCCATAATA ATGCAAACAA TAATGGCGCG GACACTTTCA 1440 GCAGCATAAA TGCAAATCCT TTTGACTTGG ATGAACAACT AGCCATTGAG TTGAGTGCGT 1500 TTGCCGACGA TTCTTTCATC TTCCCAGACG AGGATAAGCC GAGCAATAAC AATAACAACA 1560 GCAATAATGG TAATGACGAC CATAGCAACC ACGACGTATT GCATGAGGAC CCTTCTACCA 1620 ATAATAGACA AAGAAATCCT CACTTCTTGA CTCAAAGAAG GAATACTTTC CTAACTTCCC 1680 AATACGACCA ATCAAAGTCT CGATTTTCGT CCAAAAACAA AAGAAATGGC AATAACGGCG 1740 AAACAAACAA CTTTGGCGAC AATATGCAAA ATAACCATCC TTTTGAGCCA AACTTTATGG 1800 GAAGCCCTTC TCAGTTTCCC GCTGACGCAA CTAATATGAC ATCAATCGAC CATGGCGGCT 1860 TCACAAATGT TGACATTACA TCAACTGAGA ACAATACTAC CGGTGACAAT GGAGTGGATG 1920 CGCTATCAAA TCTACTACAT AGGACAACAC ACACACCGAA CCGCTCCTCC CCCCTAAGCA 1980 ATGTCACTTC TGCTCAAAAT TCCTCTTCAC AACAACGAAA ACATTCGGAA AGCAAAGTCG 2040 ATAGTAACAG CGATAATAAC AGCTCCAACA AAGCCCCCAA TATAACTGTT CCTGACTATT 2100 CAATTATACC AACCTCTGTT TTAGTAACTC TATTACCGAG GGTCAACGTG CCCAACGGCG 2160 CATATAACTC GTTGATCAGC GCGGGATTTG ACAATGATCA AATAGATGCT ATAGCCGCAA 2220 TAATGGCGTA TCATCATCAA AAAAAGATTA GGGAAAATAA CAGTAATAAT AATAAAAACA 2280 TCAACACCAA TGACAGTCAA GAGGCACCCA TTCTAAAAAA CATCAACGAA CTTTTAAGTG 2340 TCTTAATACC ACCCTCTCCG GCTGAAACTC GTGGGCCAAC TACCTTATCA ACGTCGCCTT 2400 CGTTCAATGA GCACGGTGTA GTAGCAGAGG CTTCTTTTCT AAGCTCCATT TTGGAACTGG 2460 GCATAAAGCA TCCAAAAAGT AATAATATTC ACAATCAACG ACAACCTTCA CGAAACGATC 2520 ATAAAATATC AAGAGAGAGT GACGGTAACA ATGGAAACGA TAATGTCCAT CATAATAACG 2580 CTGTTATTAA GTCAAGTACG ACGCGTGGAG ACGAAATTGC CAAGATACGA TCCGAGCCAA 2640 CTTTAAATGC AAGTTCTTCT GATCACAAGG AAAATAGTTT AAAAAGATCA CACTCCGGAG 2700 ATTTGAAAAA TAAAAAAGTA CCCGTCGACC GCAAGTATTC TGATAATGAA GACGATGAAT 2760 ATGACGATGC AGATTTACAC GGCTTTGAAA AGAAGCAACT GATCAAGAAA GAGTTAGGGG 2820 ACGACGATGA AGATTTATTG ATACAGTCGA AAAAATCTCA TCAAAAAAAA AAACTAAAGG 2880 AAAAGGAGTT AGAATCATCG ATACATGAAC TGACCGAAAT TGCAGCATCC TTACAAAAAC 2940 GGATACATAC GTTAGAAACG GAAAACAAGC TTTTAAAGAA TTTAGTTCTG AGTAGCGGTG 3000 AAACGGAAGG AATAAAAAAA GCTGAAAGCT TAAAGAAGCA AATTTTTGAG AAGGTTCAGA 3060 AAGAATAAAA TAACAGACTA TACAGTTTAA TTATATATAT ATATATATAT ACGTGCATTT 3120 TTCTTAAAGA AATATAACTT TTTTCTTGTA CTGCCTGCAA TCTCTATTCT TCATTCATCA 3180 CACATCTATT CAAACGCGTT AAAATTTTTT TGTTAGCCTA TAAGTAAAAC GCGTCGCGTG 3240 TATCCAATTT TACTGAATTA AATTCTTTAC TCATTGGATG ATATATATCT TCTTGGTCTA 3300 GACAACGAAC ACATACCAAT TCAGACTCAC GAGAAAAAAA ACTGTCTTCA CTCTGCTATT 3360 AGAAACCAAA TAGTATCAAG GCATAAAATA AACAGTGGAA AATGTCTTCT AAAAGTGAAA 3420 AATTAGAAAA ATTGAGAAAG CTGCAAGCCG CTCGAAATGG TACATCCATC GATGATTAC 3479
【図１】図１は、本発明で単離した高活性型変異ＭＥＴ
４遺伝子を、文献（Thomas, D.et al., Mol. Cell. Bio
l., 12, 1719, 1992）を基にして示した模式図であり、
星印が部位特異的変異の手法によって変異を受けた1692
番目及び1516番目の塩基で、1692Cの変異によって215位
のアミノ酸がSerからProに、1516Cの変異によって156位
のPheがSerに置換されている。
４遺伝子を、文献（Thomas, D.et al., Mol. Cell. Bio
l., 12, 1719, 1992）を基にして示した模式図であり、
星印が部位特異的変異の手法によって変異を受けた1692
番目及び1516番目の塩基で、1692Cの変異によって215位
のアミノ酸がSerからProに、1516Cの変異によって156位
のPheがSerに置換されている。
【図２】図２は、天然型ＭＥＴ４遺伝子を有するプラス
ミドDNA（pYCM4）、及び本発明で単離した高転写活性型
ＭＥＴ４の遺伝子（1692C及び1516C）を宿主の酵母サッ
カロミセス・セレビジエーに導入する際に用いたプラス
ミドDNA（pYC-1692C及びpYC-1516C）であり、「URA3」
はウラシル要求性回復遺伝子、「CEN4及びARS1」はプラ
スミドの酵母菌体内での自己複製に必要な配列、「or
i」はプラスミドの大腸菌内での自己複製に必要な配
列、そして「Ampr」はアンピシリン耐性遺伝子をそれぞ
れ意味する。
ミドDNA（pYCM4）、及び本発明で単離した高転写活性型
ＭＥＴ４の遺伝子（1692C及び1516C）を宿主の酵母サッ
カロミセス・セレビジエーに導入する際に用いたプラス
ミドDNA（pYC-1692C及びpYC-1516C）であり、「URA3」
はウラシル要求性回復遺伝子、「CEN4及びARS1」はプラ
スミドの酵母菌体内での自己複製に必要な配列、「or
i」はプラスミドの大腸菌内での自己複製に必要な配
列、そして「Ampr」はアンピシリン耐性遺伝子をそれぞ
れ意味する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (3)
- 【請求項１】 変異型転写調節因子として、ＭＥＴ４の
２１５番目のアミノ酸残基および１５６番目のアミノ酸
残基の少なくとも一方が別のアミノ酸残基に変異してい
る、変異型ＭＥＴ４遺伝子を有する酵母。 - 【請求項２】 ＭＥＴ４の２１５番目のアミノ酸残基が
Ｐｒｏに、または、１５６番目のアミノ酸残基がＳｅｒ
に変異している、請求項１に記載の酵母。 - 【請求項３】 請求項１または２記載の酵母を培養し、
当該培養物からグルタチオンを採取することを特徴とす
るグルタチオンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8194595A JPH1033161A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 変異型転写調節因子を有する酵母 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8194595A JPH1033161A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 変異型転写調節因子を有する酵母 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1033161A true JPH1033161A (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=16327164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8194595A Pending JPH1033161A (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | 変異型転写調節因子を有する酵母 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1033161A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7410790B2 (en) | 2002-12-13 | 2008-08-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing γ-glutamylcysteine |
| WO2010116833A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel yeast having increased content of sulfur-containing compound, screening method thereof, and culturing method thereof |
-
1996
- 1996-07-24 JP JP8194595A patent/JPH1033161A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7410790B2 (en) | 2002-12-13 | 2008-08-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing γ-glutamylcysteine |
| WO2010116833A1 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Ajinomoto Co., Inc. | Novel yeast having increased content of sulfur-containing compound, screening method thereof, and culturing method thereof |
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