JPH10262695A - Electrochemical measurement of amadori compound - Google Patents
Electrochemical measurement of amadori compoundInfo
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- JPH10262695A JPH10262695A JP7734297A JP7734297A JPH10262695A JP H10262695 A JPH10262695 A JP H10262695A JP 7734297 A JP7734297 A JP 7734297A JP 7734297 A JP7734297 A JP 7734297A JP H10262695 A JPH10262695 A JP H10262695A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明が属する技術分野】本発明は、フルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼを用いるアマドリ化合物の電気化学的
な測定法に関し、さらに詳しくは、酵素反応における電
子の移動を伝達体を介して測定する方法に関する。The present invention relates to a method for electrochemically measuring an Amadori compound using fructosyl amino acid oxidase, and more particularly, to a method for measuring the transfer of electrons in an enzymatic reaction via a carrier.
【0002】[0002]
【従来の技術】アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチ
ド及びアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アル
ドースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基と
アルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマド
リ転移することにより生成される。アマドリ化合物の生
成速度は、タンパク質と還元糖の濃度、接触時間、温度
に依存しており、蛋白質と還元糖の量が多い程、両者の
接触時間が長い程、蛋白質の変性が起きない程度で温度
が高い程、糖化蛋白質の生成速度は早くなり、生成量は
多くなる。また生体中では、糖化される蛋白質の半減期
によってアマドリ化合物の濃度が異なる。従ってアマド
リ化合物の濃度を測定することにより、様々な情報を得
ることができる。例えば、血液中のヘモグロビンが糖化
されたフルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビ
ン、アルブミンが糖化された誘導体はグリコアルブミ
ン、血液中のタンパクが糖化された誘導体の還元能はフ
ルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の
一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は、
糖尿病の症状の診断及び症状の管理の重要な指標となり
得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用であ
る。また、食品中のアマドリ化合物を測定することによ
り、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることがで
き、品質管理に役立つと考えられる。このように、アマ
ドリ化合物の分析は医学及び食品を含む広範な分野で有
用である。2. Description of the Related Art When an Amadori compound contains a substance having an amino group such as protein, peptide and amino acid and a reducing sugar such as aldose, the amino group and the aldehyde group are non-enzymatically and irreversibly. And produced by Amadori rearrangement. The production rate of Amadori compounds depends on the concentration of protein and reducing sugar, the contact time, and the temperature.The larger the amount of protein and reducing sugar, the longer the contact time between the two, the less denaturation of the protein occurs. The higher the temperature, the faster the production rate of glycated protein and the greater the production amount. In the living body, the concentration of the Amadori compound varies depending on the half-life of the protein to be glycated. Therefore, various information can be obtained by measuring the concentration of the Amadori compound. For example, a fructosylamine derivative in which hemoglobin in blood is glycated is called glycohemoglobin, a derivative in which albumin is glycated is called glycoalbumin, and a reducing ability of a derivative in which blood protein is glycated is called fructosamine. These blood levels reflect the average blood glucose level over a period of time in the past,
The establishment of a measuring means is extremely clinically useful because it can be an important indicator for diagnosis and management of symptoms of diabetes. Further, by measuring the Amadori compound in the food, it is possible to know the preservation state and the period of the food after production, which is considered to be useful for quality control. Thus, the analysis of Amadori compounds is useful in a wide range of fields, including medicine and food.
【0003】試料中のアマドリ化合物は、例えば、アマ
ドリ化合物に酸化還元酵素を作用させ、酸素の消費量又
は生成物(例、過酸化水素)の産生量を測定することによ
り測定する方法が知られている(例えば、特公平5-3399
7号公報、特公平6-65300号公報、特開平2-195900号公
報、特開平3-155780号公報、特開平4-4874号公報、特開
平5-192193号公報、特開平6-46846号公報、 特開平7-289
253号公報、特開平8-154672号公報、 特開平8-336386号
公報)。さらに、糖尿病の診断のためのアマドリ化合物
の測定法も知られている(特開平2-195899号公報、特開
平2-195900号公報、特開平5-192193号公報(EP 0 526 15
0 A)、特開平6-46846号公報(EP 0 576 838 A)、 特開平7
-289253号公報、 特開平8-154672号公報、 特開平8-33638
6号公報)。A method of measuring the Amadori compound in a sample is known, for example, by reacting an Amadori compound with an oxidoreductase and measuring the amount of oxygen consumed or the amount of product (eg, hydrogen peroxide) produced. (For example, 5-3399
No. 7, JP-B-6-65300, JP-A-2-195900, JP-A-3-155780, JP-A-4-4874, JP-A-5-192193, JP-A-6-46846 Gazette, JP-A-7-289
253, JP-A-8-154672, JP-A-8-336386). Furthermore, a method for measuring an Amadori compound for diagnosing diabetes is also known (JP-A-2-195899, JP-A-2-195900, JP-A-5-192193 (EP 0 526 15
0 A), JP-A-6-46846 (EP 0 576 838 A), JP-A-7-46846
-289253 JP, JP-A 8-154672, JP-A 8-33638
No. 6).
【0004】上記の反応を触媒する酵素として、様々な
微生物由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼが提供
されており、本願出願人も、フサリウム属(Fusariu
m)、ギベレラ属(Gibberella)、ペニシリウム属(Pen
icillium)などに属する菌由来のFAODを得、これら
がアマドリ化合物の測定に有用であることを示した(特
開平7-289253号公報、 特開平8-154672号公報、 特開平8-
336386号公報。[0004] Fructosyl amino acid oxidases derived from various microorganisms have been provided as enzymes that catalyze the above reaction.
m ), Gibberella , Penicillium ( Pen
FAODs derived from bacteria belonging to icillium ) and the like were shown to be useful for the measurement of Amadori compounds (JP-A-7-289253, JP-A-8-154672, JP-A-8-154672).
No. 336386.
【0005】アマドリ化合物のFAODによる分解反応
は下記の一般式で表すことができる。 R1−CO−CH2−NH−R2 + O2 + H2O→
R1−CO−CHO + R2−NH2 + H2O2 (式中、R1はアルドース残基、R2はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す) FAODを用いるアマドリ化合物の測定では、酵素反応
の混合物における酸素の消費量又は生成物の量を測定す
ることにより行う。[0005] The decomposition reaction of an Amadori compound by FAOD can be represented by the following general formula. R 1 —CO—CH 2 —NH—R 2 + O 2 + H 2 O →
R 1 -CO-CHO + R 2 -NH 2 + H 2 O 2 (wherein R 1 represents an aldose residue and R 2 represents an amino acid, protein or peptide residue) In the measurement of an Amadori compound using FAOD, This is done by measuring the amount of oxygen consumed or the amount of product in the enzymatic reaction mixture.
【0006】[0006]
【発明が解決すべき課題】従来、アマドリ化合物の一般
的な測定法として、過酸化水素の生成量に基づく方法が
用いられるが、被検試料中にアスコルビン酸や尿酸など
の還元性物質が存在すると、それらが過酸化水素を消費
するために正確に測定することができない恐れがある。
また、過酸化水素の電気化学的測定法としては、作用電
極と参照電極間の間に一定電位(例えば+600mV程
度)を印加して、作用電極表面での酵素反応によって生
成される過酸化水素を酸化し、その際に流れる電流値を
測定する方法がある。しかし、この方法では、過酸化水
素を酸化するために必要な電位が、アスコルビン酸が酸
化される電位よりも高いことから、過酸化水素のみなら
ずアスコルビン酸も酸化されてしまうために正確な測定
値が得られない。Conventionally, as a general method for measuring Amadori compounds, a method based on the amount of hydrogen peroxide produced has been used, but reducing substances such as ascorbic acid and uric acid are present in the test sample. Then, they may not be able to measure accurately because they consume hydrogen peroxide.
As a method for electrochemically measuring hydrogen peroxide, a constant potential (for example, about +600 mV) is applied between a working electrode and a reference electrode, and hydrogen peroxide generated by an enzymatic reaction on the surface of the working electrode is measured. There is a method of measuring a current value flowing at the time of oxidation. However, in this method, since the potential required to oxidize hydrogen peroxide is higher than the potential at which ascorbic acid is oxidized, not only hydrogen peroxide but also ascorbic acid is oxidized, so accurate measurement is performed. No value is obtained.
【0007】また、測定溶液中の溶存酸素の影響も無視
できない問題である。即ち、生成する過酸化水素量を過
酸化水素電極によって測定する方法や、消費される酸素
量を酸素電極を用いて測定する方法のいずれも、溶存酸
素により正確に測定することができない恐れがある。例
えば、酸素電極を用いる場合の印加電圧は−400mV
以下であり、溶存酸素が電極上で還元される電位も−4
00mV付近以下であるために、溶存酸素は正誤差とし
て測定値に影響を及ぼすことになる。しかも、酸素消費
量を酸素電極を用いて測定する場合、酵素反応における
基質濃度に対応して多くの酸素が必要となるが、酸素供
給量が不十分であると酸欠状態となり正確な測定ができ
ないという問題もある。In addition, the influence of dissolved oxygen in the measurement solution is a problem that cannot be ignored. That is, neither the method of measuring the amount of generated hydrogen peroxide with a hydrogen peroxide electrode nor the method of measuring the amount of consumed oxygen with an oxygen electrode may not be able to accurately measure the amount of dissolved oxygen. . For example, when an oxygen electrode is used, the applied voltage is -400 mV.
And the potential at which dissolved oxygen is reduced on the electrode is also -4.
Since it is below about 00 mV, the dissolved oxygen will affect the measured value as a positive error. Moreover, when oxygen consumption is measured using an oxygen electrode, a large amount of oxygen is required in accordance with the substrate concentration in the enzymatic reaction. There is also the problem that it cannot be done.
【0008】従って、作用極と参照極間に印加させる電
位を、アスコルビン酸の酸化が起きない約+200mV
以下であって、酸素の分解が起きない−400mV以上
で過酸化水素の生成量を測定することが望ましいが、こ
の範囲における電位では感度が低く、実質上、アマドリ
化合物の測定には不適当である。しかも、過酸化水素電
極及び酸素電極のいずれを用いる場合は、電極材料とし
て白金や金等の貴金属を使用する必要があり、測定装置
のコストが高くなるために広範な臨床等への適用が困難
になるという問題点もある。このように、従来法は、ア
スコルビン酸や尿酸等の還元性物質、及び溶存酸素など
の種々の物質の影響を受け易いという問題点があった。
しかも、前者は、生体由来の試料(血清や尿)に多く含
有されており、後者は、全ての試料に幅広く存在するこ
とから、これら妨害物質の影響を受けずに正確に、効率
よく、しかも経済的にアマドリ化合物を測定する方法が
求められていた。Accordingly, the potential applied between the working electrode and the reference electrode is set to about +200 mV where oxidation of ascorbic acid does not occur.
It is desirable to measure the production amount of hydrogen peroxide at -400 mV or more where oxygen decomposition does not occur, but the sensitivity is low at a potential in this range, which is practically unsuitable for the measurement of Amadori compounds. is there. In addition, when using either a hydrogen peroxide electrode or an oxygen electrode, it is necessary to use a noble metal such as platinum or gold as an electrode material, and the cost of the measuring device is high, so that it is difficult to apply it to a wide range of clinical applications. There is also a problem that it becomes. As described above, the conventional method has a problem that it is easily affected by reducing substances such as ascorbic acid and uric acid and various substances such as dissolved oxygen.
Moreover, the former is contained in large amounts in biological samples (serum and urine), and the latter is widely present in all samples, so that it is accurately, efficiently, and not affected by these interfering substances. There has been a need for a method for economically measuring Amadori compounds.
【0009】[0009]
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中のアマ
ドリ化合物の測定法であって、アマドリ化合物とフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼとの酵素反応系に電子伝達
体を加え、該電子伝達体の電子移動を電気化学的に測定
することにより、試料中のアマドリ化合物を定量するこ
とを特徴とするアマドリ化合物の測定法を提供するもの
である。また、本発明は、試料中のアマドリ化合物の量
を、アマドリ化合物とフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼとの酵素反応における電子の移動に基づいて測定する
ための装置であって、該酵素反応の反応系に近接した作
用電極と、それら反応系と作用電極との間に介在する電
子伝達体と、該電子伝達体における電子移動を測定する
ための装置を提供するものである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention relates to a method for measuring an Amadori compound in a sample, comprising adding an electron carrier to an enzyme reaction system between the Amadori compound and fructosyl amino acid oxidase; It is an object of the present invention to provide a method for measuring an Amadori compound, which comprises quantifying an Amadori compound in a sample by electrochemically measuring the movement. Further, the present invention is an apparatus for measuring the amount of an Amadori compound in a sample based on the transfer of electrons in an enzymatic reaction between the Amadori compound and fructosyl amino acid oxidase, which is close to a reaction system of the enzyme reaction. The present invention provides a working electrode, an electron carrier interposed between the reaction system and the working electrode, and a device for measuring electron transfer in the electron carrier.
【0010】[0010]
【発明の実施の形態】本発明方法には、アマドリ化合物
を含有する任意の試料を用いることができ、例えば、血
液(全血、血漿又は血清)、尿等の生体由来の試料及び
醤油等の食品を挙げることができる。本発明方法によれ
ば、試料中のアスコルビン酸や尿酸等の還元性物質の影
響を回避してアマドリ化合物を測定することができるの
で、これらの物質を含有する可能性の高い生体由来の試
料の測定を正確に行うことが可能となる。本発明方法に
用いられるFAODとしては、アマドリ化合物に特異的
に作用する限り、任意のものを用いることができる。例
えば、フサリウム属(Fusarium)、ギベレラ属(Gibbere
lla)、ペニシリウム属(Penicillium)、アスペルギル
ス属(Aspergillus)などに属する菌をフルクトシルリ
ジン及び/又はフルクトシルNα−Z−リジンの存在下
で培養することにより誘導される酵素を挙げることがで
き、それらは、例えば、特開平7-289253号公報、 特開平
8-154672号公報、 特開平8-336386号公報等に開示された
方法で得ることができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In the method of the present invention, any sample containing an Amadori compound can be used. For example, a sample derived from a living body such as blood (whole blood, plasma or serum), urine and soy sauce can be used. Foods can be mentioned. According to the method of the present invention, the Amadori compound can be measured while avoiding the effects of reducing substances such as ascorbic acid and uric acid in the sample. Measurement can be performed accurately. As the FAOD used in the method of the present invention, any one can be used as long as it specifically acts on the Amadori compound. For example, the genus Fusarium (Fusarium), Gibberella genus (Gibbere
lla), Penicillium (Penicillium), there may be mentioned an enzyme derived by culturing bacteria belonging to such genera Aspergillus (Aspergillus) in the presence of fructosyl lysine and / or fructosyl N alpha -Z- lysine, They are disclosed, for example, in JP-A-7-289253,
It can be obtained by the methods disclosed in JP-A-8-154672 and JP-A-8-336386.
【0011】本発明方法には試料溶液をそのまま用いて
行うこともできるが、対象となるアマドリ化合物によっ
ては、FAODが反応しやすい状態に処理する。アマド
リ化合物を適当に断片化するには、プロテアーゼを用い
る方法(酵素法)、トリクロロ酢酸等の化学物質を用い
る方法(化学法)、及び熱等の物理的手法を用いる方法
(物理法)がある。酵素法には、当業者に既知である、
エンド型及びエキソ型のプロテアーゼを単独であるいは
組み合わせて用いることができる。エンド型のプロテア
ーゼは、タンパク質の内部から分解する酵素であり、例
えばトリプシン、α−キモトリプシン、スブチリシン、
プロティナーゼK、パパイン、カテプシンB、ペプシ
ン、サーモリシン、プロテアーゼXIV、プロテアーゼ
XVII、プロテアーゼXXI、リジルエンドペプチダー
ゼ、プロレザー、ブロメラインF等がある。一方、エキ
ソ型のプロテアーゼはペプチド鎖の端から順に分解する
酵素であり、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダ
ーゼ等が挙げられる。酵素処理の方法も既知であり、例
えば下記実施例に記載の方法で行うことができる。Although the method of the present invention can be carried out using a sample solution as it is, depending on the target Amadori compound, the treatment is carried out in such a state that the FAOD can easily react. In order to appropriately fragment the Amadori compound, there are a method using a protease (enzymatic method), a method using a chemical substance such as trichloroacetic acid (chemical method), and a method using a physical method such as heat (physical method). . Enzymatic methods are known to those skilled in the art,
Endo- and exo-type proteases can be used alone or in combination. Endo-type proteases are enzymes that degrade from the inside of proteins, such as trypsin, α-chymotrypsin, subtilisin,
Proteinase K, papain, cathepsin B, pepsin, thermolysin, protease XIV, protease XVII, protease XXI, lysyl endopeptidase, proleather, bromelain F and the like. On the other hand, exo-type proteases are enzymes that decompose sequentially from the end of the peptide chain, and include aminopeptidase, carboxypeptidase and the like. Enzyme treatment methods are also known and can be performed, for example, by the method described in the following Examples.
【0012】これらのエンド型、エキソ型のプロテアー
ゼは、その特性を利用し、測定対象となるアマドリ化合
物の糖化部位に応じて使い分けることが好ましい。例え
ば、糖化アルブミンは内部のリジン残基が糖化されてい
るため、エンド型のプロテアーゼで、ヘモグロビンA1
cは、β鎖N末端のバリン残基が糖化されているため、
エキソ型のプロテアーゼで、より効率良く処理すること
ができる。次いで、断片化処理したアマドリ化合物を含
有する試料にFAODを作用させ、該酸化酵素の活性中
心で発生する電子を、電子伝達体を介して作用電極に伝
達し、その電子の授受に基づく電流を測定することによ
り、該試料中のアマドリ化合物の量を測定する。It is preferable that these endo-type and exo-type proteases are used properly in accordance with the saccharification site of the Amadori compound to be measured, utilizing its properties. For example, glycated albumin is an endo-type protease, since the internal lysine residue is glycated, and hemoglobin A1
c is because the valine residue at the N-terminal of the β chain is saccharified,
It can be treated more efficiently with an exo-type protease. Next, FAOD is caused to act on the sample containing the fragmented Amadori compound, electrons generated in the active center of the oxidase are transmitted to the working electrode via an electron mediator, and a current based on the transfer of the electrons is transmitted. By measuring, the amount of the Amadori compound in the sample is measured.
【0013】本発明方法による電子伝達体(電子伝達
体)を用いるアマドリ化合物の測定をさらに詳しく説明
する。酸化酵素であるFAODとアマドリ化合物(基
質)とを酸素の存在下で反応させると、上記の式で示す
ように、グルコソンや過酸化水素等が生成されるが、こ
の時酵素の活性中心で電子が放出される。この酵素反応
の反応系に酸化型電子伝達体が存在すると、酵素活性の
中心から反応時に放出される電子を該電子伝達体が受け
取り、還元型電子伝達体となって作用電極に電子を供給
し、自身は酸化型電子伝達体となる。これに伴い、電極
では電子の数(基質の濃度)に依存して電流が生じる。
従って、予め既知濃度の標準物質を用い、該物質の濃度
と電流との関係を示す検量式を作成しておけば、未知試
料を用いた場合の電流測定値をその検量式に当てはめて
該未知試料中のアマドリ化合物の濃度を決定することが
できる。The measurement of an Amadori compound using an electron carrier (electron carrier) according to the method of the present invention will be described in more detail. When FAOD, which is an oxidase, is reacted with an Amadori compound (substrate) in the presence of oxygen, glucosone and hydrogen peroxide are generated as shown in the above formula. Is released. When an oxidized electron carrier is present in the reaction system of this enzymatic reaction, the electron carrier receives electrons emitted during the reaction from the center of the enzyme activity, and supplies electrons to the working electrode as a reduced electron carrier. Itself becomes an oxidized electron carrier. Accordingly, an electric current is generated in the electrode depending on the number of electrons (substrate concentration).
Therefore, by using a standard substance having a known concentration in advance and preparing a calibration equation showing the relationship between the concentration of the substance and the current, the measured current value when an unknown sample is used is applied to the calibration equation to obtain the unknown. The concentration of the Amadori compound in the sample can be determined.
【0014】電子伝達体は、種類により固有の酸化還元
電位が存在することから、用いる電子伝達体によって
は、作用電極に印加される電位が低くても、測定が可能
である。従って、上記のアスコルビン酸の酸化や溶存酸
素分解等の影響を回避しうる低電位で、正確に測定する
ことができる。また、電子伝達体の選択により、従来の
過酸化水素電極を用いて過酸化水素の発生を電流値とし
て検出する方法に比較してはるかに高感度の測定が可能
となる。Since the electron carrier has a specific oxidation-reduction potential depending on the type, it is possible to measure even if the potential applied to the working electrode is low depending on the electron carrier used. Therefore, accurate measurement can be performed at a low potential that can avoid the above-described effects of oxidation of ascorbic acid, decomposition of dissolved oxygen, and the like. In addition, the selection of the electron carrier makes it possible to perform measurement with much higher sensitivity than the conventional method of detecting the generation of hydrogen peroxide as a current value using a hydrogen peroxide electrode.
【0015】本発明方法に用いることができる電子伝達
体としては、フェリシアン化カリウム、メタロセン及び
メタロセン誘導体、オクタシアノタングステンイオン、
ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体、フェロセン及
びフェロセン誘導体、キノン及びキノン誘導体、ヘキサ
シアノ鉄酸塩等を用いることができるが、フェリシアン
化カリウム、フェロセン、ニッケロセンが好ましい。こ
れらを単独で、又は組み合わせて用いる。ニッケロセン
誘導体とは、ニッケロセン((C5H5)Ni)の誘導体
をも含み、例えば1,1'−ジカルボキシレートニッケロ
セン、モノカルボキシレートニッケロセン、ジメチルア
ミノメチルニッケロセン、ヒドロキシメチルニッケロセ
ン等が例示できる。また、ニッケロセン又はその誘導体
は、単独で又は他の電子伝達体との種々の混合物として
使用することもできる。The electron carrier that can be used in the method of the present invention includes potassium ferricyanide, metallocene and metallocene derivatives, octacyanotungsten ion,
Nicotinamide derivatives, flavin derivatives, ferrocene and ferrocene derivatives, quinones and quinone derivatives, hexacyanoferrates, and the like can be used, but potassium ferricyanide, ferrocene, and nickelocene are preferred. These may be used alone or in combination. The nickelocene derivatives, nickelocene also include derivatives of ((C 5 H 5) Ni ), for example, 1,1'-dicarboxylate nickel Russia Sen, monocarboxylate nickel Russia Sen, dimethylaminomethyl nickel Russia Sen, hydroxymethyl nickel b Sen etc. Can be exemplified. Nickelocene or its derivatives can also be used alone or in various mixtures with other electron carriers.
【0016】以下に、本発明に用いる作用電極の形態に
ついて説明する。電極の材料は、低電位で使用可能な電
極なら特に限定されないが、入手容易であるカーボン電
極材料が好ましい。ただし、必要に応じて金や白金等の
貴金属を用いてもよい。カーボン電極材料の場合には、
カーボンまたはカーボンと他の材料の組み合わせ、例え
ば組成物を用いることができる。電導性が高い上に、他
の粉末や粒状材料と混合して組み合わせ安くて成形が容
易であるという利点を有することから、カーボン粒状物
や微粒状物が好ましい。カーボン粒子の平均粒子径は約
5〜20μmが好ましく、約10μmであることがより
好ましい。Hereinafter, the form of the working electrode used in the present invention will be described. The material of the electrode is not particularly limited as long as it is an electrode that can be used at a low potential, but a readily available carbon electrode material is preferable. However, a noble metal such as gold or platinum may be used if necessary. In the case of carbon electrode material,
Carbon or a combination of carbon and other materials, such as a composition, can be used. Carbon granules and fine granules are preferred because they have the advantage of being highly conductive, being inexpensive to mix with other powders and granular materials, and being easy to mold. The average particle diameter of the carbon particles is preferably about 5 to 20 μm, and more preferably about 10 μm.
【0017】カーボン電極は、カーボン粒状物(粉末)
と電子伝達体を混合し、パラフィン、ヌジョール、ワッ
クス、エポキシ樹脂、シリコンゴム等のペースト化剤の
存在下でペースト状に成形し、ガラス管の先端に充填
し、例えば、銀棒を該カーボン混合物の層に接触するま
で差し込むことで形成する。カーボン粒子と電子伝達体
との混合比は、9:1〜5:5の範囲であり、8:2〜
6:4が好ましい。The carbon electrode is made of carbon particles (powder).
And an electron carrier, and are formed into a paste in the presence of a pasting agent such as paraffin, nujol, wax, epoxy resin, silicone rubber, and the like, and filled at the tip of a glass tube. It is formed by inserting until it comes into contact with the layer of. The mixing ratio between the carbon particles and the electron carrier ranges from 9: 1 to 5: 5, and 8: 2 to 5: 5.
6: 4 is preferred.
【0018】ペースト状カーボン混合物に白金粒子、特
に微粒子状の白金を含有させると、カーボン単独の場合
よりも大きい応答電流を得ることができ、より低い電極
間の印加電位で応答電流のピーク値を得ることができる
ので好ましい。カーボン電極に含有させる白金粒状物の
大きさは、平均直径0.3〜2.5μm程度であることが
好ましく、カーボン粒子より小さいことが特に好まし
い。カーボン粒子と白金粒子の混合比は100:1〜8
5:15の範囲が好ましい。When the paste-like carbon mixture contains platinum particles, particularly fine-particle platinum, a higher response current can be obtained than in the case of using carbon alone, and the peak value of the response current can be reduced at a lower applied potential between the electrodes. It is preferable because it can be obtained. The size of the platinum particles contained in the carbon electrode is preferably about 0.3 to 2.5 μm in average diameter, and particularly preferably smaller than carbon particles. The mixing ratio of carbon particles and platinum particles is 100: 1 to 8
A range of 5:15 is preferred.
【0019】FAODは、測定を液相で行う場合には、
測定溶液に混合しても良い。しかし、上記のごとく製造
したカーボン電極の表面に積層し、脱落しないよう半透
膜や限外ろ過膜のような多孔質膜等で覆うことにより、
電極と一体化してもよい。このように形成されたFAO
D−カーボン電極では、酵素反応の反応系と電極とが近
接しているので、酵素反応に伴う電子の移動を正確に検
出することができ、好都合である。しかも、FAOD−
カーボン電極は、予め作成しておき、必要に応じて反復
して用いることができるので、測定を簡便かつ迅速に行
うことができるるばかりか、資源の有効利用にも役立
つ。FAOD−カーボン電極を、液相での測定に用いる
場合は、その表面を多孔質膜等で覆うことが必要である
が、電極のFAOD層に直接、上方から試料を滴下し
て、電極表面で酵素反応を行うこともでき、その場合に
は、多孔質膜等で覆う必要はない。When the measurement is performed in the liquid phase, FAOD
It may be mixed with the measurement solution. However, by laminating on the surface of the carbon electrode manufactured as described above, by covering with a porous membrane such as a semipermeable membrane or ultrafiltration membrane so as not to fall off,
It may be integrated with the electrode. FAO formed in this way
In the D-carbon electrode, since the reaction system of the enzyme reaction and the electrode are close to each other, it is possible to accurately detect the transfer of electrons accompanying the enzyme reaction, which is convenient. Moreover, FAOD-
Since the carbon electrode can be prepared in advance and used repeatedly as necessary, not only can the measurement be performed simply and quickly, but also the resources can be effectively used. When the FAOD-carbon electrode is used for measurement in the liquid phase, it is necessary to cover the surface with a porous film or the like, but the sample is dropped directly from above onto the FAOD layer of the electrode, and the An enzymatic reaction can also be performed, in which case it is not necessary to cover with a porous membrane or the like.
【0020】さらに、上記のように構成されたFAOD
−カーボン電極と接触させずに、プロテアーゼ、アスコ
ルビンオキシダーゼ、ウリカーゼを固定化した多孔質膜
により、該FAOD−積層カーボン電極を被覆させても
よい。この時多孔質膜の孔径は、アマドリ化合物のプロ
テアーゼ等によって断片化した生成物が通過できる大き
さであることが必要である。このように構成された作用
電極を用いることにより、アスコルビン酸、尿酸等の還
元性物質を高濃度に含有する生体成分等の試料の場合で
も、それら還元性物質による電子伝達体の還元に起因す
る正の誤差が生じる恐れがなく、正確な測定値を得るこ
とができる。上記のごとく、FAOD及びその他の必要
な酵素をカーボン作用電極に固定化すれば、測定毎に酵
素を添加する必要がないので、迅速かつ効率的に測定を
行うことができる。しかもそのような電極は反復使用が
可能であり、経済的である。Further, the FAOD constructed as described above
-Without contact with the carbon electrode, the FAOD-laminated carbon electrode may be coated with a porous membrane on which protease, ascorbin oxidase, and uricase are immobilized. At this time, it is necessary that the pore size of the porous membrane is large enough to allow a product fragmented by the protease of the Amadori compound or the like to pass through. By using the working electrode configured in this way, even in the case of a sample such as a biological component containing a high concentration of a reducing substance such as ascorbic acid or uric acid, the sample is caused by reduction of the electron carrier by the reducing substance. There is no possibility that a positive error occurs, and an accurate measurement value can be obtained. As described above, if FAOD and other necessary enzymes are immobilized on the carbon working electrode, it is not necessary to add the enzymes every measurement, so that the measurement can be performed quickly and efficiently. Moreover, such electrodes can be used repeatedly and are economical.
【0021】作用電極と参照電極の間に印加する電位
は、用いる電子伝達体により異なるが、通常、−400
〜+300mV、好ましくは−300〜+200mVで
ある。電子伝達体がニッケロセンまたはニッケロセン誘
導体である場合、参照電極と作用電極間の電位は約−3
00mV〜+100mVの範囲が好ましく、約−100
mVに印加させた場合に、効率よく電子が伝達される。
本発明方法によれば、アスコルビン酸の酸化が殆ど起こ
らない電位であって、かつ酸素が分解する電位(約−4
00mV)よりも高い電位で測定することができるの
で、試料中のアスコルビン酸や溶存酸素の影響を受けず
に正確に測定することができる。従って、本発明方法
は、これらの物質を含有する可能性が高い生体成分中の
アマドリ化合物の測定に適する。The potential applied between the working electrode and the reference electrode varies depending on the electron mediator used, but is usually -400.
To +300 mV, preferably -300 to +200 mV. When the electron carrier is nickelocene or a nickelocene derivative, the potential between the reference electrode and the working electrode is about -3.
A range of 00 mV to +100 mV is preferred, and about -100
When applied to mV, electrons are efficiently transmitted.
According to the method of the present invention, a potential at which oxidation of ascorbic acid hardly occurs and a potential at which oxygen is decomposed (about -4)
Since the measurement can be performed at a potential higher than 00 mV), the measurement can be accurately performed without being affected by ascorbic acid or dissolved oxygen in the sample. Therefore, the method of the present invention is suitable for measuring an Amadori compound in a biological component having a high possibility of containing these substances.
【0022】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。実施例1 糖化アルブミン濃度の測定 (1)アマドリ化合物測定装置 第1図は、アマドリ化合物測定装置の1例を示し、図
中、1は容器、2は被検物質を含む測定溶液、3は撹拌
子、4は作用電極、5は参照電極(Ag/AgCl)、6は対極
(Pt)である。作用電極4は例えば、第2図のようにして
作成することができる。カーボン粉末(平均粒子径10
μm)200mg、フェリシアン化カリウム200mg及び
パラフィン250μlを混合してペースト状にし、得ら
れたペースト状のカーボン混合物8をガラス管(内径5
mm)7の先端に詰める。次いで、カーボン混合物層8
に、銀棒9を差し込み、フサリウム・オキシスポルムS-
1F4(Fusarium oxysporum S-1F4;FERM BP-5010)由来
のFAOD(特開平7-289253号公報、70ユニット/m
g)を積層し、FAOD層10を多孔質膜11で覆い、
Oリング12で止めることにより作成される。Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. Example 1 Measurement of Saccharified Albumin Concentration (1) Amadori Compound Measuring Apparatus FIG. 1 shows an example of an Amadori compound measuring apparatus, in which 1 is a container, 2 is a measuring solution containing a test substance, and 3 is stirring. Child, 4 working electrode, 5 reference electrode (Ag / AgCl), 6 counter electrode
(Pt). The working electrode 4 can be prepared, for example, as shown in FIG. Carbon powder (average particle size 10
μm) 200 mg, potassium ferricyanide 200 mg and paraffin 250 μl were mixed to form a paste, and the resulting paste-like carbon mixture 8 was placed in a glass tube (with an inner diameter of 5 μm).
mm). Next, the carbon mixture layer 8
, Insert a silver stick 9 into the Fusarium Oxysporum S-
FAOD derived from 1F4 ( Fusarium oxysporum S-1F4; FERM BP-5010) (Japanese Patent Laid-Open No. 7-289253, 70 units / m)
g), and the FAOD layer 10 is covered with a porous membrane 11;
It is created by stopping at the O-ring 12.
【0023】(2)糖化アルブミン濃度の測定 糖化ヒト血清アルブミン(SIGMA)を0.9%塩化
ナトリウム水溶液で溶解させ、0〜10mg/mlの範囲で
濃度の異なる糖化ヒト血清アルブミン溶液を調製した。
このヒト血清アルブミン溶液200μlと12.5mg/ml
プロテアーゼXIV200μlを混合し、37℃で30分間
インキュベートした。その後、100℃で5分間、加熱
してプロテアーゼ反応を停止し、基質とした。容器1内
に0.1M トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)5μlを入
れ、作用電極4、参照電極5及び対極6を浸漬させた。
撹拌子3で撹拌しながら、上記のプロテアーゼ処理液
(基質)を加え、30℃、200mV定電位の条件で電
流値を測定した。この方法で得られる糖化アルブミン濃
度と電流値との関係を第3図に示す。図中の縦軸は、電
子伝達体を介して検出された、酵素反応に伴う電子の移
動に対応する電流値、縦軸は糖化アルブミンの濃度を表
す。図は、糖化アルブミンの濃度と電流値が相関関係に
あることを示している。(2) Measurement of Glycated Albumin Concentration Glycated human serum albumin (SIGMA) was dissolved in a 0.9% aqueous sodium chloride solution to prepare glycated human serum albumin solutions having different concentrations in the range of 0 to 10 mg / ml.
200 μl of this human serum albumin solution and 12.5 mg / ml
200 μl of protease XIV was mixed and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the protease reaction was stopped by heating at 100 ° C. for 5 minutes to obtain a substrate. 5 μl of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) was placed in the container 1, and the working electrode 4, the reference electrode 5 and the counter electrode 6 were immersed.
The above-mentioned protease-treated solution (substrate) was added while stirring with the stirrer 3, and the current value was measured at 30 ° C. and 200 mV constant potential. FIG. 3 shows the relationship between the saccharified albumin concentration obtained by this method and the current value. The vertical axis in the figure represents the current value corresponding to the transfer of electrons accompanying the enzyme reaction detected via the electron mediator, and the vertical axis represents the concentration of saccharified albumin. The figure shows that the concentration of glycated albumin and the current value are correlated.
【0024】[0024]
【発明の効果】本発明方法によれば、アスコルビン酸や
溶存酸素の影響を受けずに正確にしかも簡便にアマドリ
化合物を測定することができる。従って、本発明方法
は、これらの物質を含有する可能性が高い生体成分中の
アマドリ化合物の日常的な測定をより容易にし、糖尿病
の症状の管理や診断に貢献するものである。According to the method of the present invention, an Amadori compound can be accurately and simply measured without being affected by ascorbic acid or dissolved oxygen. Therefore, the method of the present invention makes it easier to routinely measure an Amadori compound in a biological component likely to contain these substances, and contributes to the management and diagnosis of diabetes symptoms.
【図1】 アマドリ化合物測定装置の説明図である。FIG. 1 is an explanatory view of an Amadori compound measuring device.
【図2】 1つの実施態様の作用電極の作成方法を示す
説明図である。FIG. 2 is an explanatory view showing a method for producing a working electrode according to one embodiment.
【図3】 糖化ヒトアルブミン濃度と電流との関係を示
すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the relationship between glycated human albumin concentration and current.
【図4】 他の実施態様の作用電極の作成方法を示す説
明図である。FIG. 4 is an explanatory view showing a method for producing a working electrode according to another embodiment.
1 容器 2 測定溶液 3 撹拌子 4 作用電極 5 参照電極 6 対極 7 ガラス管 8 カーボン混合物 9 銀棒 10 FAOD層 11 多孔質膜 12 Oリング 13 多孔質膜 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Container 2 Measurement solution 3 Stirrer 4 Working electrode 5 Reference electrode 6 Counter electrode 7 Glass tube 8 Carbon mixture 9 Silver rod 10 FAOD layer 11 Porous film 12 O-ring 13 Porous film
Claims (12)
て、アマドリ化合物とフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼとの酵素反応系に電子伝達体を加え、該電子伝達体の
電子移動を電気化学的に測定することにより、該試料中
のアマドリ化合物を定量することを特徴とするアマドリ
化合物の測定法。1. A method for measuring an Amadori compound in a sample, comprising adding an electron carrier to an enzyme reaction system between the Amadori compound and fructosyl amino acid oxidase, and electrochemically measuring the electron transfer of the electron carrier. A method for measuring an Amadori compound, wherein the Amadori compound in the sample is quantified.
子伝達体及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼから成
る電極を用いることを特徴とする請求項1に記載の測定
法。2. The method according to claim 1, wherein an electrode comprising a carbon electrode material, an electron carrier and fructosyl amino acid oxidase is used as a working electrode.
することを特徴とする請求項2に記載の測定法。3. The method according to claim 2, wherein the carbon electrode material also contains platinum particulates.
フェロセン及びニッケロセンから選択される1又はそれ
以上のものである請求項1〜3のいずれかに記載の測定
法。4. The method according to claim 1, wherein the electron carrier is potassium ferricyanide,
The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the method is one or more selected from ferrocene and nickelocene.
300mVの電位を印加することを特徴とする請求項1
〜4のいずれかに記載の測定法。5. A voltage between −400 and + between a working electrode and a reference electrode.
2. The method according to claim 1, wherein a potential of 300 mV is applied.
5. The measuring method according to any one of items 1 to 4.
が−300〜+200mVである請求項5に記載の測定
法。6. The method according to claim 5, wherein the potential applied between the working electrode and the reference electrode is from −300 to +200 mV.
オキシダーゼ及びウリカーゼをも反応系に含ませること
を特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の測定法。7. The method according to claim 1, wherein a protease, ascorbate oxidase, and uricase are further included in the reaction system.
リ化合物とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの酵素
反応における電子の移動に基づいて測定するための装置
であって、該酵素反応の反応系に近接した作用電極と、
それら反応系と作用電極との間に介在する電子伝達体
と、該電子伝達体における電子移動を測定するための装
置。8. An apparatus for measuring the amount of an Amadori compound in a sample based on the transfer of electrons in an enzymatic reaction between the Amadori compound and fructosyl amino acid oxidase, wherein the apparatus is located close to a reaction system of the enzyme reaction. A working electrode;
An electron carrier interposed between the reaction system and the working electrode, and an apparatus for measuring electron transfer in the electron carrier.
達体及びフルクトシルアミノ酸オキシダーゼから成るも
のである請求項8記載の装置。9. The device according to claim 8, wherein the working electrode comprises a carbon electrode material, an electron carrier and fructosyl amino acid oxidase.
有する請求項9記載の装置。10. The apparatus according to claim 9, wherein the carbon electrode material also contains platinum particulates.
ム、フェロセン及びニッケロセンから選択される1又は
それ以上のものである請求項8記載の装置。11. The device according to claim 8, wherein the electron carrier is one or more selected from potassium ferricyanide, ferrocene and nickelocene.
スコルビン酸オキシダーゼ及びウリカーゼを固定化した
多孔性の膜が、該電極に接触することなく配されている
請求項8記載の装置。12. The apparatus according to claim 8, wherein a porous membrane on which a protease, ascorbate oxidase, and uricase are immobilized is provided near the working electrode without contacting the electrode.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7734297A JPH10262695A (en) | 1997-03-28 | 1997-03-28 | Electrochemical measurement of amadori compound |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP7734297A JPH10262695A (en) | 1997-03-28 | 1997-03-28 | Electrochemical measurement of amadori compound |
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JP (1) | JPH10262695A (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7250269B2 (en) * | 2001-01-31 | 2007-07-31 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Composition for assaying glycoprotein |
EP2639586A1 (en) | 2012-03-15 | 2013-09-18 | ARKRAY, Inc. | Measurement method using enzymes |
-
1997
- 1997-03-28 JP JP7734297A patent/JPH10262695A/en active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7250269B2 (en) * | 2001-01-31 | 2007-07-31 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Composition for assaying glycoprotein |
EP2639586A1 (en) | 2012-03-15 | 2013-09-18 | ARKRAY, Inc. | Measurement method using enzymes |
US8802366B2 (en) | 2012-03-15 | 2014-08-12 | Arkray, Inc. | Measurement method using enzyme |
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