JPH10237097A - 一酸化窒素合成酵素の選択的阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ｉＮＯＳ過剰産生に起因する疾病の治療又は
予防に有用なｉＮＯＳ阻害薬を提供する。 【解決手段】 化１で表されるジペプチド型化合物又は
その生理的に許容される塩。 【化１】 （Ｒは水素原子、直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ ア
ルキル基、Ｃ₃ 〜Ｃ₆ シクロアルキル基、直鎖状若しく
は分岐状のヒドロキシＣ₁ 〜Ｃ₂ アルキル基、ベンジル
基などを意味し、Ｒ¹ は化２で表される基を意味し、 【化２】 ここで、Ｒ^a は硫黄原子またはＮ−ＮＯ₂ 基を意味し、
Ｒ^b は直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキル基、
Ｃ₃ 〜Ｃ₆ シクロアルキル基又は直鎖状若しくは分岐状
のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキルチオ基を意味し、＊印で指示され
る炭素での配置はＬ型，Ｄ型又はＤＬ型である。）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一酸化窒素合成酵素
の選択的阻害薬として有用なジペプチド型化合物および
その医薬としての使用に関する。

【０００２】

【技術背景】1980年にFurchgott らにより、血管弛緩・
血小板凝集抑制作用を有する内皮由来弛緩因子（エンド
セリン由来弛緩因子：ＥＤＲＦ）の存在が初めて明らか
にされ、続いて、Moncada らによりその本態がＬ−アル
ギニン由来の一酸化窒素（Nitric Oxide: 以下ＮＯと略
称する）であることが示された1980年後半以降、生体内
のＮＯが神経系や循環器系で生理的に重要な役割を担っ
ており、一方で過剰なＮＯ産生は種々の炎症（慢性関節
リウマチ，潰瘍性大腸炎など）、自己免疫疾患、糖尿病
などの要因になっていることが種々報告され、生体内の
ＮＯ研究は急速に進展した。ＮＯは一酸化窒素合成酵素
（Nitric Oxide Synthase:以下ＮＯＳと略称する）によ
りＬ−アルギニンを基質として産生される。ＮＯＳには
恒常型ＮＯＳ（constitutive NOS: ｃＮＯＳと略称す
る）と誘導型ＮＯＳ（induced NOS:ｉＮＯＳと略称す
る）の２種のイソ酵素(isozyme) があり、それぞれ異な
る器官で異なる作用を担っている。ｃＮＯＳには血管内
皮細胞により産生される血管内皮型ＮＯＳと、神経組織
から分泌される神経型ＮＯＳの２種類があり、細胞内に
恒常的に存在し、生理的変化による酵素量の変化はほと
んど見られない。それに対して、ｉＮＯＳはマクロファ
ージ、好中球、血管内皮細胞、平滑筋細胞、血小板など
から産生されるが、通常細胞内で認められず、各種サイ
トカインやエンドトキシンの成分であるリポポリサッカ
ライド（ＬＰＳ）による刺激を受けて大量に数時間から
数日に亘って分泌される誘導酵素である。

【０００３】ＮＯＳはＬ−アルギニン（Ｌ−Ａｒｇ）を
Ｌ−シトルリンに変換する過程でＮＯを産生するが、過
剰なＮＯはｉＮＯＳにより誘導産生されることが明らか
にされている。産生ＮＯは外敵を攻撃する生体防御であ
るが、その過剰産生は細胞毒になり自己組織をも破壊
し、自己免疫疾患をもたらす。重症感染では、エンドト
キシンにより起こる多臓器不全と低血圧ショックを起こ
す。従って、ＮＯＳ阻害薬は低血圧ショック、組織障害
などの治療薬として期待されている。

【０００４】

【発明の開示】本発明の目的はｉＮＯＳ過剰産生に起因
する疾病の治療又は予防に有用なｉＮＯＳ阻害薬を提供
することにある。上述のようにＮＯＳにはｃＮＯＳとｉ
ＮＯＳの２種のイソ酵素があり、ｉＮＯＳ阻害薬を開発
するにはｉＮＯＳに対し選択的に高い阻害活性が求めら
れる。本発明者らはｃＮＯＳとｉＮＯＳの両者には基質
の認識に差があると予想し、既存の阻害剤であるＬ−Ａ
ｒｇ構造類似体のＣ末部分を化学修飾して選択性を向上
させた高活性阻害薬を見いだした。

【０００５】本発明は医薬、特に、ｉＮＯＳ過剰産生に
起因する疾病の治療又は予防に有用なｉＮＯＳ阻害薬と
してのジペプジド型化合物およびその医薬としての使用
に関する。更に詳しくは、下記一般式(I) で表されるジ
ペプチド型化合物又はその生理的に許容される塩および
その医薬としての使用に関する。

【０００６】

【化３】

【０００７】（Ｒは水素原子、直鎖状若しくは分岐状の
Ｃ₁ 〜Ｃ₅ アルキル基、Ｃ₃ 〜Ｃ₆ シクロアルキル基、
直鎖状若しくは分岐状のヒドロキシＣ₁ 〜Ｃ₂ アルキル
基、メルカプトメチル基、メチルメルカプトエチル基、
ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基又はヘテロアリ
ールメチル基を意味し、Ｒ¹ は下記式(II)又は(III)

【０００８】

【化４】

【０００９】で表される基を意味し、ここで、Ｒ^a は硫
黄原子又はＮ−ＮＯ₂ 基を意味し、Ｒ^b は直鎖状若しく
は分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキル基、Ｃ₃ 〜Ｃ₆ シクロア
ルキル基又は直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキ
ルチオ基を意味し、＊印で指示される炭素での配置はＬ
型，Ｄ型又はＤＬ型である。）

【００１０】

【発明の具体的説明】本発明の化合物は上記一般式(I)
で示されるが、好ましい化合物は一般式(I)において＊
印で指示される炭素での配置がＬ型であり、Ｒ¹ がＲ^a
においてＮ−ＮＯ₂ であるか、又はＲ^b において直鎖状
若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキルチオ基であるジペ
プチド型化合物又はその生理的に許容される塩であり、
さらに好ましくは下記化合物又はその生理的に許容され
る塩が挙げられる。

【００１１】Ｓ−メチル−Ｌ−イソチオシトルリニル−
Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−メチル−Ｌ−イソチオシト
ルリニル−Ｌ−ロイシンおよびＬ−Ｎ−ニトロアルギニ
ル−Ｌ−フェニルアラニン

【００１２】一般式(I) で表される本発明の化合物は生
理的に許容される酸と塩を形成していてもよく、酸とし
ては、例えば、塩酸，臭化水素酸，ヨウ化水素酸，硫
酸，リン酸等の無機酸、酢酸，トリフルオロ酢酸，シュ
ウ酸，マレイン酸，フマル酸，マロン酸，乳酸，リンゴ
酸，クエン酸，酒石酸，安息香酸，メタンスルホン酸，
トシル酸等の有機酸が挙げられる。また、一般式(I) で
表される本発明の化合物は生理的に許容される塩基と塩
を形成していてもよく、塩基としては、アルカリ金属,
アルカリ土類金属, 有機塩基等が挙げられる。好ましく
は生理的に許容される酸との塩である。

【００１３】本明細書中でヘテロアリールメチル基の
「ヘテロアリール」とは窒素原子，酸素原子及び硫黄原
子から選択される１〜２個のヘテロ原子を含んでなる５
員環若しくは６員環のヘテロアリール又はインドールを
意味する。

【００１４】一般式(I) で表される本発明の化合物又は
その生理的に許容される塩は水和物及び／又は溶媒和物
として存在することもある。従って、このような形のも
のも当然本発明の化合物に包含される。本発明の化合物
には、複数の不斉炭素原子を有するものが含まれ、それ
らは異なる立体異性体として存在しうる。従って、これ
らの立体異性体もまた本発明の化合物に包含される。ま
た、一般式(I) において＊印で指示される炭素での配置
にはＤ型、Ｌ型およびＤＬ型があるが、これらすべて本
発明の化合物に包含される。

【００１５】次に、本発明の化合物の製造法について以
下に説明する。

【００１６】（製造法１）一般式(I) で表される本発明
の化合物において、Ｒ¹ におけるＲ^b が直鎖状若しくは
分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキル基、Ｃ₃ 〜Ｃ₆ シクロアル
キル基又は直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキル
チオ基である化合物は下記反応式（化５）に示される方
法により製造することができる。

【００１７】

【化５】

【００１８】（反応式中、Ｒ^a は硫黄原子を意味し、Ｒ
^b は直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキル基、Ｃ
₃ 〜Ｃ₆ シクロアルキル基又は直鎖状若しくは分岐状の
Ｃ₁ 〜Ｃ₅ アルキルチオ基を意味し、Ｒ’はカルボキシ
ル基の保護基を意味し、Ｒ”はアミノ基の保護基を意味
し、Ｒは前掲に同じ。）

【００１９】Ｒ^b が直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅
アルキルチオ基である本発明の化合物(3) は、化合物
(1) に文献記載の方法に準じて、反応に関与しない適当
な溶媒中チオホスゲンを反応させ、さらにアンモニアガ
スで処理することにより化合物(2) とし、次いで対応す
るハロゲン化アルキルでＳ−アルキル化した後、酸処理
又は加水素分解で脱保護することにより得ることができ
る。カルボキシル基の保護基としてはペプチド化学で通
常用いられるtert−ブチル基、ベンジル基などが挙げら
れる。アミノ基の保護基としてはペプチド化学で通常用
いられるtert−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシ
カルボニル基などが挙げられる。

【００２０】また、Ｒ^b が直鎖状若しくは分岐状のＣ₁
〜Ｃ₅ アルキル基又はＣ₃ 〜Ｃ₆ シクロアルキル基であ
る本発明の化合物(3) は化合物(1) に文献記載の方法に
準じて、反応に関与しない適当な溶媒中対応するカルボ
ン酸イミノエステルと反応させ、次いで酸処理又は加水
素分解で脱保護することにより得ることができる。

【００２１】（製造法２）一般式(I) で表される本発明
の化合物において、Ｒ¹ におけるＲ^a が硫黄原子である
化合物は下記反応式（化６）に示される方法により製造
することができる。

【００２２】

【化６】

【００２３】（反応式中、Ｒ^a は硫黄原子を意味し、Ｒ
は前掲に同じ。）

【００２４】製造法１で合成される化合物(2) を文献記
載の方法に準じて、酸処理することにより本発明の化合
物(4) を得ることができる。

【００２５】（製造法３）また、一般式(I) で表される
本発明の化合物において、Ｒ^a が硫黄原子またはＮ−Ｎ
Ｏ₂ 基である化合物は下記反応式（化７）に示される方
法により製造することができる。

【００２６】

【化７】

【００２７】（反応式中、Ｒ^a は硫黄原子またはＮ−Ｎ
Ｏ₂ 基を意味し、Ｒ’はカルボキシル基の保護基を意味
し、Ｒ”はアミノ基の保護基を意味し、Ｒは前掲に同
じ。）

【００２８】Ｒ^a が硫黄原子またはＮ−ＮＯ₂ 基である
本発明の化合物(8) は、化合物(5)と化合物(6) を縮合
剤の存在下に縮合させ化合物(7) とし、次いで酸処理又
は加水素分解で脱保護することにより得ることができ
る。縮合剤としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣＩ・ＨＣｌ），
Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールなどが挙げられ
る。カルボキシル基の保護基としてはペプチド化学で通
常用いられるtert−ブチル基、ベンジル基などが挙げら
れる。アミノ基の保護基としてはペプチド化学で通常用
いられるtert−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシ
カルボニル基などが挙げられる。

【００２９】上記製造法１〜３により製造される一般式
(I) で表される本発明の化合物はクロマトグラフィー，
イオン交換樹脂，再結晶，再沈澱等のペプチド化学で用
いられる通常の操作法により単離・精製される。

【００３０】また、一般式(I) で表される本発明の化合
物は、原料化合物の選定，反応・処理条件等により、遊
離塩基または酸付加塩の形で得られる。酸付加塩は常
法、例えば、炭酸アルカリ，水酸化アルカリのような塩
基で処理することにより、遊離塩基に変えることができ
る。また、遊離塩基は常法に従って各種の酸と処理する
ことにより酸付加塩に導くことができる。

【００３１】

【発明の効果】一般式(I) で表される本発明の化合物は
ｉＮＯＳを選択的に高活性で阻害するので、一般式(I)
で表される本発明の化合物又はその生理的に許容される
塩は低血圧ショック、種々の炎症（リウマチ性炎症、慢
性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎など）、ストレス性胃潰
瘍、自己免疫疾患、臓器移植後の組織障害、急性冠微小
血管塞栓、ショック性血管塞栓、虚血性脳障害、動脈硬
化、インシュリン依存性糖尿病などｉＮＯＳ過剰産生に
起因する疾病の治療又は予防に使用することができる。

【００３２】

【本発明化合物の医薬としての使用方法】本発明の化合
物をｉＮＯＳ阻害薬として使用する場合、剤型としては
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ
剤、懸濁剤などとして経口投与され、又、注射剤、点滴
剤、坐剤、ゲル剤、外用剤などとして非経口投与あるい
は直腸内投与される。これらの製剤は常法に従って調製
される。なお、液体製剤にあっては、用時、水又は他の
適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また
錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーテイ ングしてもよい。
注射剤の場合には、主薬を注射用水に溶解させて調製さ
れるが、必要に応じてｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤、
安定化剤、可溶化剤などを添加してもよく、常法により
皮下、筋肉内、静脈内、脳室内用注射剤とすることがで
きる。投与量としては、投与方法、患者の症状・年齢、
処置形式（予防又は治療）等により異なるが、通常成人
１日あたり０．１mg〜１０００mg、好ましくは２mg〜５
００mgを１日１〜数回に分けて経口投与される。または
１回に１００μg 〜１００mgを１日１〜数回に分けて非
経口に投与され、好ましくは静脈内または脳室内に投与
される。

【００３３】本発明の化合物を、医薬品として許容され
る通常の製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与
される場合、製剤用担体としては、賦形剤，結合剤，崩
壊剤, 滑沢剤, 抗酸化剤，コーティング剤，界面活性
剤, 流動性促進剤, 矯味矯臭剤, 着色剤, 可塑剤，香料
など製剤分野において常用される担体を用い、かつ本発
明の化合物と反応しない担体が適宜選択され使用され
る。

【００３４】これらの製剤は、本発明の化合物を０．０
１％以上、好ましくは０．０５〜７０％の割合で含有す
ることができる。これらの製剤はまた、治療上有効な他
の成分を含有してもよい。

【００３５】

【実施例】以下に本発明の代表的化合物について試験例
（薬理試験方法）およびその結果を示し、本発明の化合
物の作用の特徴について説明する。また、実施例を挙げ
て、本発明の化合物について具体的に説明する。記載の
簡略化のために、以下において次の略号を使用すること
もある。

【００３６】Ｐｈｅ：フェニルアラニン； Ｏｒｎ：オ
ルニチン； Ｌｅｕ：ロイシン；Ａｒｇ：アルギニン；
ＭＩＴ：Ｓ−メチルイソチオシトルリニル基；ＴＣｉ
ｔ：チオシトルリニル基； ＮＩＯ：Ｎε−イミノエチ
ルオルニチニル基； ＮＮＡ：Ｎ^G −ニトロアルギニ
ン； ＢＯＣ又はＢｏｃ：tert−ブトキシカルボニル
基； Ｚ：ベンジルオキシカルボニル基； ｔＢｕ：te
rt−ブチル基；ＤＭＳＯ−ｄ₆ ：重水素化ジメチルスル
ホキシド； ＴＭＳ：テトラメチルシラン； ＷＳＣＩ
・ＨＣｌ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩。

【００３７】試験例 ＮＯＳ阻害活性（トリチウムラベ
ル法による測定）

【００３８】50mM Hepes・塩酸緩衝液(pH 7.4)，被検物
質, 17nM [³H]-L-アルギニン, 1mMNADPH, 1mMエチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)，1mM ジチオトレイトール(DTT),
6μｇ/ml ６Ｓテトラヒドロビオプテリン（以下ｎＭＯ
Ｓのみ), 1.25mM 塩化カルシウム, 10μｇ/ml カルモジ
ュリンを含む）125 μｎＭＯＳ（ケイマン60870,ラット
脳）またはｉＮＯＳ（ケイマン60862,マウスマクロファ
ージ）を50mM Hepes・塩酸緩衝液(pH 7.4, 10%グリセロ
ール, 100 μM DTT （ｎＭＯＳのみ）を含む）で１０倍
に希釈して25μl 添加した。２２℃で５分間インキュベ
ートし、20mMHepes ・塩酸緩衝液(pH 5.5, 5mM EDTA を
含む）を2mL 加えて反応を停止した。反応液を陽イオン
交換樹脂カラム(ISOLUTE PRS, H-FORM, 500mG, 3ml) に
通し4mlの水で生成した[³H]- シトルリンを流出させ、
液体シンチレーションカクテルを加えて放射活性(S) を
測定した。尚、被検物質を含まない場合の放射活性(C)
および酵素を加えない場合の放射活性(B) も測定し、阻
害率を下記式（数１）により算出した。これより、被検
物質の50% 阻害に必要な濃度(IC₅₀)を求めた。その結果
を表１に示す。

【００３９】

【数１】阻害率（％）＝１００×［１−（Ｓ−Ｂ）／
（Ｃ−Ｂ）］

【００４０】

【表１】 ^*1 実施例１の化合物を意味する（以下同じ）。

【００４１】表１から明らかのように、これら被検化合
物はいずれもｉＮＯＳを選択的に阻害する。

【００４２】実施例１ Ｓ−メチル−Ｌ−イソチオシト
ルリニル−Ｌ−フェニルアラニン・二塩酸塩 (L-MIT-L-
Phe ・2HCl) （化８）の製造：

【００４３】

【化８】

【００４４】1) Ｎε−Ｚ−Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニ
チニル−Ｌ−フェニルアラニンtert−ブチルエステル
(Nε-Z-Nα-BOC-L-Orn-L-Phe-OtBu)の合成：

【００４５】文献(G.C.Wallaceら, J. Med. Chem., 199
1,34, 1746) 記載の方法に従って合成した Nε-Z-Nα-B
OC-L- オルニチン(Nε-Z-Nα-BOC-L-Orn-OH) 3.697g (1
0mmol)とH-L-Phe-OtBu 2.434g (11mmol)をジクロロメタ
ン35mlに溶解し、氷冷した。WSCI・ HCl 2.300g (12mmo
l)を加え、室温に戻して１晩攪拌した。反応液を1%クエ
ン酸水溶液、4%炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水
で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を
留去し、得られた黄色アモルファスの粉末をシリカゲル
カラムグラフィー（溶出液: ジクロロメタン−10% 酢酸
エチル, Rf値=0.2）に付し、精製した。得られた結晶を
ｎ−ヘキサン−酢酸エチルから再結晶し、 Nε-Z-Nα-B
OC-L-Orn-L-Phe-OtBu 4.557g (79%)を無色結晶として得
た。融点１０２℃．

【００４６】¹H-NMR 300MHz (in CDCl₃-TMS): δ7.34
(m, 5H, Z-phenyl), 7.3-7.1(m, 5H,Phe-Phenyl), 6.69
(d broad, 0.6H, J=7.3, amide-NH), 5.05(d, 2H, J=
4.1,Z-CH₂), 4.92 (m, 0.7H, amide-NH), 4.70(q, 1H,
J=7.7, Phe- α-H), 4.21 (m, 1H, Orn-α-H), 3.35
(m, 1H, Orn-δ-H), 3.15 (m, 1H, Orn-δ-H), 3.06 (d
d, 2H, Jββ=6.2, Jαβ=1.8, Phe-β-H), 1.8-1.5
(m, 4H, Orn- β, γ-H),1.43 (s, 9H, t-butyl), 1.38
(s, 9H, t-butyl).

【００４７】2) Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニチニル−Ｌ
−フェニルアラニンtert−ブチルエステル (Nε-H-Nα
-BOC-L-Orn-L-Phe-OtBu)の合成：

【００４８】Nε-Z-Nα-BOC-L-Orn-L-Phe-OtBu 1.709g
(3mmol)をメタノール10mlに溶解し、アルゴンで脱気置
換したのち、触媒のパラジウム−炭素(Pd-C)182mg を添
加し、水素置換した。水素雰囲気下に室温で３時間攪拌
し、理論量の水素を添加させた。反応後、Pd-Cを濾去
し、濾液を濃縮し、淡黄色アモルファスの Nε-H-Nα-B
OC-L-Orn-L-Phe-OtBu 1.130g (86%)を得た。

【００４９】¹H-NMR 300MHz (in CDCl₃-TMS): δ7.3-7.
1(m, 5H, phenyl), 5.44 (d broad,0.7H, J=6.3, amide
-NH), 4.74(q, 1H, J=7.9, Phe-α-H), 4.15 (m, 1H, O
rn-α-H), 3.08 (d, 2H, J=6.4, Orn- δ-H), 2.71 (m,
2H, Phe-β-H), 1.9-1.5 (m, 4H, Orn- β, γ-H), 1.
44 (s, 9H, t-butyl), 1.40(s, 9H, t-butyl).

【００５０】3) Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌ−チオシトルリニル
−Ｌ−フェニルアラニンtert−ブチルエステル (Nα-B
OC-L-TCit-L-Phe-OtBu) の合成：

【００５１】Nε-H-Nα-BOC-L-Orn-L-Phe-OtBu 1.130g
(2.6mmol), チオホスゲン 0.40ml(3.4mmol), 炭酸カル
シウム 680mg, クロロホルム12mlおよび水12mlの混合物
を１晩激しく攪拌した。翌日不溶物を濾去し、有機層を
分液抽出し、水層をジクロロメタンで洗って洗液を合わ
せた。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を留去し
た。残渣をメタノール24mlに溶解して氷冷し、アンモニ
アガスを15-20 分間通気した後４時間攪拌した。溶媒を
留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（溶出液: 酢酸エチル：n-ヘキサン＝4 :1 ; Rf=0.3 ）
に付し、精製して、 Nα-BOC-L-TCit-L-Phe-OtBu 1.108
g (83%) を淡黄色アモルファスとして得た。

【００５２】¹H-NMR 300MHz (in CDCl₃-TMS): δ7.3-7.
1 (m, 5H, phenyl), 6.56 (s broad, 0.5H, -NH), 6.26
(s broad, 0.8H, -NH), 5.45 (d broad, 1H, J=7.3, a
mide-NH), 4.67 (q, 1H, J=6.8, Phe-α-CH), 4.15 (m,
1H, TCit-α-CH), 3.54 (m,1H, TCit-δ-CH₂), 3.07
(dd, 1H, Jββ=6.4, Jαβ=3.6, Phe-β-CH₂), 2.38
(s broad, 1H, NH₂), 1.9-1.5 (m, 4H, TCit- β, γ-C
H₂), 1.42 (s, 9H, t-butyl), 1.39 (s, 9H, t-butyl).

【００５３】¹³C-NMR 300MHz (in CDCl₃-TMS):δ171.8,
156.7(C=S), 137.0, 130.3, 129.3, 127.9, 83.5, 81.
1, 61.3, 54.9, 38.8, 29.2, 28.8, 21.9, 15.1.

【００５４】4) L-MIT-L-Phe ・2HClの合成：

【００５５】N α-BOC-L-TCit-L-Phe-OtBu 594mg (1.20
mmol) をアセトニトリル3ml に溶解し、ヨードメタン1.
1ml (12mmol)を加えて室温で１時間攪拌した後、溶媒を
留去した。残渣にトリフルオロ酢酸 (TFA) 3ml, 水0.1m
l,フェノール211mg,チオアニソール0.1ml,エタンジチオ
ール0.05mlを加え、１時間攪拌した。反応液を50℃に加
熱してアルゴン気流下にTFA をある程度蒸発させた後、
大量のエーテルを加えてガム状の沈殿物をとり、上清を
捨てた（この操作を２、３回繰り返した）。沈殿物を水
に溶解し、陰イオン交換樹脂（AMBERLITE IRA-400, Cl-
form）に通した。溶媒を減圧下に留去し、得られた固体
をメタノール−エーテルから結晶化させ、L-MIT-L-Phe
・ 2HCl 281mg (55%) を得た。本品は強吸湿性。融点は
アモルファスの粉末のため測定できなかった。旋光度:
［α］_D = +15.5 °(24 ℃in EtOH). FAB MS: M ⁺ +1=
353.

【００５６】¹H-NMR 300MHz (in DMSO-d₆): δ9.03 (s
broad, 1H, -NH), 7.3-7.2 (m, 5H,phenyl), 4.42 (q,
1H, J=4.0, Phe-α-CH), 3.85 (t, 1H, J=6.2, TCit-
α-CH), 3.09 (dd, 1H, Jββ=14.1, Jαβ=4.0, Phe-
β-CH₂), 2.95 (dd, 1H, Jββ=13.5, Jαβ=8.2, Phe-
β-CH₂), 2.63 (s, 3H, SCH₃), 1.70 (m, 2H, TCit-β,
γ-CH₂), 1.64 (m, 2H, TCit- β, γ-CH₂).

【００５７】対応する原料化合物を用いて、実施例１と
同様に反応／処理して、実施例２，３の化合物を得る。

【００５８】実施例２ Ｓ−メチル−Ｌ−イソチオシト
ルリニル−Ｄ−フェニルアラニン・二塩酸塩 (L-MIT-D-
Phe ・2HCl) （化９）：アモルファスの粉末。

【００５９】

【化９】

【００６０】¹H-NMR 300MHz (in DMSO-d₆): δ9.22 (d,
0.5H, J=8.4, -NH), 9.02 (d, 0.5H, J=9.2, -NH), 8.
29 (s, broad, 2H, -NH₂), 7.3-7.2 (m, 5H, phenyl),
4.55(m, 1H, Phe- α-H), 3.84 (m, 1H, MIT-α-H), 3.
2 (m, 2H, MIT- δ-H), 2.65 (s, 3H, SCH₃), 1.54 (m,
1H, Phe-β-H), 1.37 (m, 2H, MIT-β, γ-H), 1.22
(m, 2H, MIT-β, γ-H). FAB MS: M ⁺ +1=353.

【００６１】実施例３ Ｓ−メチル−Ｌ−イソチオシト
ルリニル−Ｌ−ロイシン・二塩酸塩(L-MIT-L-Leu・ 2HC
l)（化１０） : アモルファスの粉末。

【００６２】

【化１０】

【００６３】¹H-NMR 300MHz (in D₂O): δ4.20 (t, 1H,
J=7.5, Leu-α-H), 3.91 (t, 1H,J=6.3, MIT- α-H),
3.28 (t, 2H, J=6.9, MIT- δ-H), 2.44 (s, 3H, SC
H₃), 1.81 (m, 2H, Leu-β-H), 1.7-1.5 (m, 4H, MIT-
β, γ-H), 1.52 (d, 1H, J=4.6, Leu- δ-H), 0.77 (d
d, 6H, J=10.2, 6.1, Leu-CH₃ ×2).

【００６４】実施例４ Ｌ−チオシトルリニル−Ｌ−フ
ェニルアラニン・トリフルオロ酢酸塩 (L-TCit-L-Phe・
CF₃CO₂H) （化１１）の製造：

【００６５】

【化１１】

【００６６】N α-BOC-L-TCit-L-Phe-OtBu をTFA に溶
解し、室温下１時間攪拌する。TFAを留去し、残渣にエ
ーテルを加えて結晶化させ、濾取する。メタノール−エ
ーテルから再結晶し、L-TCit-L-Phe・ CF₃CO₂Hを得る。
融点１２７−１２９℃

【００６７】¹H-NMR 300MHz (in DMSO-d₆): δ8.59 (s,
broad, 1H, -NH), 7.28 (s, broad, 1H, -NH), 7.3-7.
2 (m, 5H, phenyl), 7.01 (s, broad, 1H, -NH), 4.44
(m,1H, Phe-α-H), 3.41 (m, 1H, TCit- α-H), 2.94
(m, 1H, Phe-β-H), 1.67 (m, 2H, TCit- β, γ-H),
1.49 (m, 2H, TCit- β, γ-H). 旋光度: ［α］_D =+3
2.8 °(24 ℃ in EtOH).

【００６８】対応する原料化合物を用いて、実施例４と
同様に反応／処理して、実施例５の化合物を得る。

【００６９】実施例５ Ｌ−チオシトルリニル−Ｄ−フ
ェニルアラニン・トリフルオロ酢酸塩 (L-TCit-D-Phe・
CF₃CO₂H)（化１２）： 融点１２８−１３０℃.

【００７０】

【化１２】

【００７１】¹H-NMR 300MHz (in DMSO-d₆): δ8.66 (s,
broad, 1H, -NH), 7.69 (s, broad, 0.5H, -NH), 7.3-
7.2 (m, 5H, phenyl), 7.10 (s, broad, 1H, -NH), 4.5
2 (m, 1H, Phe-α-H), 3.69 (m, 1H, TCit- α-H), 3.1
4 (d, 1H, J=10.8, Phe-β-H), 2.84 (d, 1H, J=9.5, P
he- β-H), 1.45 (m, 2H, TCit- β, γ-H), 1.20 (m,
2H, TCit- β, γ-H). 旋光度: ［α］_D = +16.7 °(2
4 ℃ in EtOH).

【００７２】実施例６ Ｌ−Ｎ−ニトロアルギニル−Ｌ
−ロイシン・トリフルオロ酢酸塩(L-N-(NO₂)Arg-L-Leu
・CF₃CO₂H)（化１３）の製造：

【００７３】

【化１３】

【００７４】1) Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌ−Ｎ−ニトロアルギ
ニル−Ｌ−ロイシンtert−ブチルエステル (Nα-BOC-L
-N-(NO₂)Arg-L-Leu-OtBu) の合成：

【００７５】市販のＬ−Ｎ^G −ニトロアルギニンから誘
導される Nα-BOC-L-N-(NO₂)Arg-OH1.631g (5.1mmol)
とH-L-Leu-OtBu 685mg (3.7mmol)をジメチルホルムアミ
ド(DMF)30ml 中で混合し、氷冷下 WSCI ・HCl 964mg (5
mmol) を加え、室温に戻して２日間攪拌した。反応後、
DMF をある程度減圧下に留去し、残渣に酢酸エチルを加
え、1%クエン酸水溶液、4%炭酸水素ナトリウム水溶液の
順に洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去
した。残渣をシリカゲルカラムグラフィー（溶出液: ジ
クロロメタン：酢酸エチル＝1 : 1, Rf 値=0.1）に付
し、精製し、溶媒を留去した。得られた結晶をｎ−ヘキ
サン−酢酸エチルから再結晶し、無色鱗片状結晶の Nα
-BOC-L-(NO₂)Arg-L-Leu-OtBu 1.182g (66%) を得た。

【００７６】¹H-NMR 300MHz (in CDCl₃-TMS): δ7.48
(s broad, 1H, -NH), 6.70 (d, 1H,J=6.0, amide-NH),
5.39 (d, 1H, J=7.9, -NH), 4.44 (m, 1H, Leu- α-C
H), 4.26 (m, 1H, NNA- α-CH), 3.32 (m, 2H, NNA- δ
-CH₂), 1.8-1.5 (m, 7H, NNA-β, γ-CH₂, Leu-β-CH₂,
Leu-γ-CH), 1.46 (s, 9H, t-butyl), 1.44 (s, 9H,t-
butyl), 0.93 (td, 6H, J=5.5, 1.5, Leu-CH₃ ×2).

【００７７】2) L-N-(NO₂)Arg-L-Leu ・CF₃CO₂H の合
成：N α-BOC-L-(NO₂)Arg-L-Leu-OtBuをTFA に溶解し、
室温下１時間攪拌した。TFA を留去し、残渣にエーテル
を加えて結晶化させ、結晶を濾取した。メタノール−エ
ーテルから再結晶し、白色粉末のL-N-(NO₂)Arg-L-Leu・
CF₃CO₂H 460mg (79%) を得た。融点１１６−１１８℃.

【００７８】¹H-NMR 300MHz (in D₂O): δ4.19 (t, 1H,
J=6.2, Leu-α-CH), 3.88 (t, 1H,J=6.2, NNA-α-CH),
3.15 (m, 2H, NNA- δ-CH₂), 1.78 (q, 2H, J=7.5, Le
u-β-CH₂), 1.50 (m, 5H, NNA-β, γ-CH₂, Leu-γ-C
H₂), 0.73 (dd, 6H, J=10.4,6.0, Leu-CH₃ ×2).

【００７９】対応する原料化合物を用いて、実施例６と
同様に反応／処理して、実施例７の化合物を得る。

【００８０】実施例７ Ｌ−Ｎ−ニトロアルギニル−Ｌ
−フェニルアラニン・トリフルオロ酢酸塩 (L-N-(NO₂)A
rg-L-Phe・CF₃CO₂H)（化１４）：融点１４９−１５１
℃．

【００８１】

【化１４】

【００８２】¹H-NMR 300MHz (in DMSO-d₆): δ7.2-7.1
(m, 5H, phenyl), 4.31(dd, 1H, J=9.0, 5.5, Phe- α-
H), 3.79 (t, 1H, J=6.4, Arg- α-H), 3.09 (t, 2H, J
=6.8,Arg- δ-H), 3.06 (dd, 1H, Jαβ=5.1, Phe-β-
H), 2.86 (dd, 1H, Jββ=14.2, Jαβ=9.2, Phe-β-
H), 1.72(m, 2H, Arg- β, γ-H), 1.45 (m, 2H, Arg-
β, γ-H).

【００８３】実施例８ Ｎε−イミノエチル−Ｌ−オル
ニチニル−Ｌ−フェニルアラニン・二塩酸塩 (L-NIO-L-
Phe ・2HCl) （化１５）の製造：

【００８４】

【化１５】

【００８５】1) Ｎα−Ｂｏｃ−Ｎε−イミノエチル−
Ｌ−オルニチニル−Ｌ−フェニルアラニンtert−ブチル
エステル (Nα-BOC-L-NIO-L-Phe-OtBu)の合成：

【００８６】Nε-Z-Nα-BOC-L-Orn-L-Phe-OtBu 501mg
(0.88mmol)を実施例１(2) と同様に処理して得られた N
ε-H-Nα-BOC-L-Orn-L-Phe-OtBu とイミノ酢酸エチル塩
酸塩124mg (1mmol) をメタノール5ml に加え均一に溶解
して、1 晩攪拌した。溶媒を留去し、残渣をアルミナカ
ラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン-2% メタノー
ルでカラムを洗い、ジクロロメタン-6% メタノールで溶
出）に付した。フラクションはアルミナTLC 上ジクロロ
メタン-10%メタノールで展開し、Ce-Mo 発色で追跡し、
原点付近のものを集め、 Nα-BOC-L-NIO-L-Phe-OtBu 17
3mg (38%) を無色のアモルファスとして得た。

【００８７】¹H-NMR 300MHz (in CDCl₃-TMS): δ7.27-
7.18 (m, 5H, phenyl), 4.70 (t, 1H, J=5.9, Phe- α-
H), 4.23 (m, 1H, NIO-α-H), 3.19 (m, 2H, NIO-δ-
H), 3.08 (d, 2H, J=6.6, Phe- β-H), 1.99 (s, 3H, C
H₃), 1.9-1.6 (m, 4H, NIO-β,γ-H), 1.43 (s, 9H, t-
butyl), 1.37 (s, 9H, t-butyl).

【００８８】2) L-NIO-L-Phe ・2HClの合成：N α-BOC
-L-NIO-L-Phe-OtBu 173mg (0.34mmol)をTFA 3ml に溶解
し、１時間攪拌した。反応液を濃縮乾固し、残渣にエー
テルを加え、ガム状の沈殿物を濾取し、塩酸飽和エーテ
ル中に懸濁させた。沈殿物を濾取、乾燥して、アモルフ
ァスのL-NIO-L-Phe ・2HCl 99mg (77%) を得た。吸湿
性。

【００８９】¹H-NMR 300MHz (in D₂O): δ7.24-7.15
(m, 5H, phenyl), 4.60-4.54 (m, 1H,Phe- α-H), 3.82
(t, 1H, J=6.2, NIO- α-H), 3.11 (dd, 1H, Jαα=1
5.4, Jαβ=5.5, Phe-β-H), 3.08 (t, 2H, J=7.1, NIO
- δ-H), 2.96 (dd, 1H, Jαα=14.2, Jαβ=8.7, Phe-
β-H), 2.05 (s, 3H, CH₃), 1.71 (m, 2H, NIO- β-H),
1.49 (m, 2H, NIO-β, γ-H). FAB MAS M ⁺ +1= 321.

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成９年３月５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００２】

【技術背景】1980年にFurchgott らにより、血管弛緩・
血小板凝集抑制作用を有する内皮由来弛緩因子（エンド
セリン由来弛緩因子：ＥＤＲＦ）の存在が初めて明らか
にされ、続いて、Moncada らによりその本態がＬ−アル
ギニン由来の一酸化窒素（Nitric Oxide: 以下ＮＯと略
称する）であることが示された1980年後半以降、生体内
のＮＯが神経系や循環器系で生理的に重要な役割を担っ
ており、一方で過剰なＮＯ産生は種々の炎症（慢性関節
リウマチ，潰瘍性大腸炎など）、自己免疫疾患、糖尿病
などの要因になっていることが種々報告され、生体内の
ＮＯ研究は急速に進展した。ＮＯは一酸化窒素合成酵素
（Nitric Oxide Synthase:以下ＮＯＳと略称する）によ
りＬ−アルギニンを基質として産生される。ＮＯＳには
恒常型ＮＯＳ（constitutive NOS: ｃＮＯＳと略称す
る）と誘導型ＮＯＳ（induced NOS:ｉＮＯＳと略称す
る）の２種のイソ酵素(isozyme) があり、それぞれ異な
る器官で異なる作用を担っている。ｃＮＯＳには血管内
皮細胞により産生される血管内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳと
略称する）と、神経組織から分泌される神経型ＮＯＳ
（ｎＮＯＳと略称する）の２種類があり、細胞内に恒常
的に存在し、生理的変化による酵素量の変化はほとんど
見られない。それに対して、ｉＮＯＳはマクロファー
ジ、好中球、血管内皮細胞、平滑筋細胞、血小板などか
ら産生されるが、通常細胞内で認められず、各種サイト
カインやエンドトキシンの成分であるリポポリサッカラ
イド（ＬＰＳ）による刺激を受けて大量に数時間から数
日に亘って分泌される誘導酵素である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３８】50mM Hepes・塩酸緩衝液(pH 7.4)，被検物
質, 17nM [³H]-L-アルギニン, 1mMNADPH, 1mMエチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)，1mM ジチオトレイトール(DTT),
6μM ６Ｓ- テトラヒドロビオプテリン（以下ｎＮＯＳ
のみ), 1.25mM 塩化カルシウム, 10μｇ/ml カルモジュ
リンを含む）125 μl に、ｎＮＯＳ（ケイマン60870,ラ
ット脳）またはｉＮＯＳ（ケイマン60862,マウスマクロ
ファージ）を50mM Hepes・塩酸緩衝液(pH 7.4, 10%グリ
セロール, 100 μM DTT （ｎＮＯＳのみ）を含む）で１
０倍に希釈して25μl 添加した。２２℃で５分間インキ
ュベートし、20mM Hepes ・塩酸緩衝液(pH 5.5, 5mM E
DTA を含む）を2mL 加えて反応を停止した。反応液を陽
イオン交換樹脂カラム(ISOLUTE PRS, H-form, 500mg, 3
ml) に通し4 mlの水で生成した[³H]- シトルリンを流出
させ、液体シンチレーションカクテルを加えて放射活性
(S) を測定した。尚、被検物質を含まない場合の放射活
性(C) および酵素を加えない場合の放射活性(B) も測定
し、阻害率を下記式（数１）により算出した。これよ
り、被検物質の50% 阻害に必要な濃度(IC₅₀)を求めた。
その結果を表１に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＤＰ Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＬ ＡＥＤ ＡＤＰ Ｃ１２Ｎ 9/99 ＡＥＤ // Ｃ０７Ｍ 7:00 (72)発明者 樋口 恒彦 東京都練馬区光が丘７丁目６番１号1102 (72)発明者 廣部 雅昭 東京都渋谷区元代々木町25番11号 (72)発明者 長野 哲雄 東京都杉並区阿佐谷北３丁目32番25号110

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化１で表されるジペプチド型化合物又は
   その生理的に許容される塩。 【化１】 （Ｒは水素原子、直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ ア
   ルキル基、Ｃ₃ 〜Ｃ₆ シクロアルキル基、直鎖状若しく
   は分岐状のヒドロキシＣ₁ 〜Ｃ₂ アルキル基、メルカプ
   トメチル基、メチルメルカプトエチル基、ベンジル基、
   ｐ−ヒドロキシベンジル基又はヘテロアリールメチル基
   を意味し、Ｒ¹ は化２で表される基を意味し、 【化２】 ここで、Ｒ^a は硫黄原子またはＮ−ＮＯ₂ 基を意味し、
   Ｒ^b は直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキル基、
   Ｃ₃ 〜Ｃ₆ シクロアルキル基又は直鎖状若しくは分岐状
   のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキルチオ基を意味し、＊印で指示され
   る炭素での配置はＬ型，Ｄ型又はＤＬ型である。）
2. 【請求項２】 ＊印で指示される炭素での配置がＬ型で
   あり、Ｒ¹ がＲ^a においてＮ−ＮＯ₂ であるか、又はＲ
   ^b において直鎖状若しくは分岐状のＣ₁ 〜Ｃ₅ アルキル
   チオ基である請求項１記載のジペプチド型化合物又はそ
   の生理的に許容される塩。
3. 【請求項３】 Ｓ−メチル−Ｌ−イソチオシトルリニル
   −Ｌ−フェニルアラニン、Ｓ−メチル−Ｌ−イソチオシ
   トルリニル−Ｌ−ロイシン及びＬ−Ｎ−ニトロアルギニ
   ル−Ｌ−フェニルアラニンから選ばれるいずれか１つの
   ジペプチド型化合物又はその生理的に許容される塩。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載の化合
   物を有効成分とする一酸化窒素合成酵素阻害剤。