JPH10127284A - プラスミドｄｎａの単離方法 - Google Patents
プラスミドｄｎａの単離方法Info
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- JPH10127284A JPH10127284A JP23731297A JP23731297A JPH10127284A JP H10127284 A JPH10127284 A JP H10127284A JP 23731297 A JP23731297 A JP 23731297A JP 23731297 A JP23731297 A JP 23731297A JP H10127284 A JPH10127284 A JP H10127284A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液から特
別な装置を必要とせずに簡単な操作で精製プラスミドＤ
ＮＡを効率よく得る方法を提供すること。 【解決手段】 １ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレ
ンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含有するｐＨ７．
０〜１０．０のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中にハイドロキ
シアパタイト粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操
作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液
を添加することにより該ハイドロキシアパタイト粒子に
ＲＮＡを吸着させて除去し、液中のプラスミドＤＮＡを
エタノール沈殿法などによって分離する。
別な装置を必要とせずに簡単な操作で精製プラスミドＤ
ＮＡを効率よく得る方法を提供すること。 【解決手段】 １ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレ
ンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含有するｐＨ７．
０〜１０．０のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中にハイドロキ
シアパタイト粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操
作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液
を添加することにより該ハイドロキシアパタイト粒子に
ＲＮＡを吸着させて除去し、液中のプラスミドＤＮＡを
エタノール沈殿法などによって分離する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学の分野
において最も基本的な操作の一つである核酸からプラス
ミドＤＮＡを単離する方法に関する。
において最も基本的な操作の一つである核酸からプラス
ミドＤＮＡを単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より、大腸菌プラスミドベクターに
目的のＤＮＡを組み込んで培養し、目的のＤＮＡを大量
に調製する方法は、遺伝子工学分野において最も頻繁に
行われている操作の一つである。現在、大腸菌からのプ
ラスミドベクターの回収は、溶菌操作の後ゲノムＤＮＡ
と蛋白質等を取り除いてＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混
合物を得ることによって行われ、その方法としては、ア
ルカリ−ＳＤＳ法をはじめとしていくつかの方法が知ら
れている。ＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混合物からさら
に精製プラスミドＤＮＡを得るためには、イオン交換樹
脂を用いたカラム分離法、塩化セシウム密度勾配超遠心
法などが一般的に用いられている。しかしながら、イオ
ン交換樹脂を用いたカラム分離法では目的とするプラス
ミドＤＮＡが多量の溶離液で希釈されるため、溶離され
たプラスミドＤＮＡの濃縮が煩雑であった。また、塩化
セシウム密度勾配超遠心法では、大がかりな装置で高い
回転数で長時間遠心処理を行うため、細心の注意を要
し、煩雑であり、また、経済的でなかった。
目的のＤＮＡを組み込んで培養し、目的のＤＮＡを大量
に調製する方法は、遺伝子工学分野において最も頻繁に
行われている操作の一つである。現在、大腸菌からのプ
ラスミドベクターの回収は、溶菌操作の後ゲノムＤＮＡ
と蛋白質等を取り除いてＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混
合物を得ることによって行われ、その方法としては、ア
ルカリ−ＳＤＳ法をはじめとしていくつかの方法が知ら
れている。ＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混合物からさら
に精製プラスミドＤＮＡを得るためには、イオン交換樹
脂を用いたカラム分離法、塩化セシウム密度勾配超遠心
法などが一般的に用いられている。しかしながら、イオ
ン交換樹脂を用いたカラム分離法では目的とするプラス
ミドＤＮＡが多量の溶離液で希釈されるため、溶離され
たプラスミドＤＮＡの濃縮が煩雑であった。また、塩化
セシウム密度勾配超遠心法では、大がかりな装置で高い
回転数で長時間遠心処理を行うため、細心の注意を要
し、煩雑であり、また、経済的でなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＲＮＡとプ
ラスミドＤＮＡを含む溶液から特別な装置を必要とせず
に簡単な操作で精製プラスミドＤＮＡを得る方法を提供
することを目的とする。
ラスミドＤＮＡを含む溶液から特別な装置を必要とせず
に簡単な操作で精製プラスミドＤＮＡを得る方法を提供
することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、特定濃度のト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとエチレンジア
ミン四酢酸のアルカリ金属塩を含む特定ｐＨ範囲の緩衝
液を作用させると、ＲＮＡはリン酸カルシウム系化合物
粒子に吸着されるのに対し、プラスミドＤＮＡは吸着さ
れないことを見出し、この知見に基づいて完成したもの
である。すなわち、本発明によるプラスミドＤＮＡの単
離方法は、１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジ
アミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１
０．０の緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン
酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中
に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡ
を含む溶液を添加することにより該リン酸カルシウム系
化合物粒子にＲＮＡを吸着させ、懸濁液の上清からプラ
スミドＤＮＡを回収することを特徴とする。
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとエチレンジア
ミン四酢酸のアルカリ金属塩を含む特定ｐＨ範囲の緩衝
液を作用させると、ＲＮＡはリン酸カルシウム系化合物
粒子に吸着されるのに対し、プラスミドＤＮＡは吸着さ
れないことを見出し、この知見に基づいて完成したもの
である。すなわち、本発明によるプラスミドＤＮＡの単
離方法は、１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジ
アミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１
０．０の緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン
酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中
に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡ
を含む溶液を添加することにより該リン酸カルシウム系
化合物粒子にＲＮＡを吸着させ、懸濁液の上清からプラ
スミドＤＮＡを回収することを特徴とする。
【０００５】本発明はまた、プラスミドＤＮＡを液体ク
ロマトグラフィーによって単離する方法に関し、この方
法は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム
系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填し、
１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢
酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝
液で平衡化した後、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプ
ラスミドＤＮＡを含む溶液及び１ｍＭ〜１００ｍＭのト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５
０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含
むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液を順次通水し、流出液
からプラスミドＤＮＡを回収することを特徴とする。
ロマトグラフィーによって単離する方法に関し、この方
法は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム
系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填し、
１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢
酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝
液で平衡化した後、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプ
ラスミドＤＮＡを含む溶液及び１ｍＭ〜１００ｍＭのト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５
０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含
むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液を順次通水し、流出液
からプラスミドＤＮＡを回収することを特徴とする。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明に用いるリン酸カルシウム
系化合物は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のものであれ
ば、特に制限はなく、例えば、Ｃａ10（ＰＯ4)6 （Ｏ
Ｈ)2、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｆ2 、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｃl2、
Ｃａ3(ＰＯ4)2 、Ｃａ2 Ｐ2 Ｏ7 及びＣａ4 Ｏ（ＰＯ4)
2 のうちから選ばれた１種又は２種以上を使用すること
ができる。これらのうち安定性や吸着性能の点からＣａ
／Ｐ比が１．５〜１．８のものが好ましく、Ｃａ／Ｐ比
が１．６７のハイドロキシアパタイトを主成分とするも
のが最も好ましい。フッ素アパタイトを用いる場合、全
リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率が５重量％
以下であるのが好ましい。フッ素含有率が５重量％を超
えると、フッ素の溶出が起こり好ましくない。これらの
リン酸カルシウム系化合物は、公知の方法で合成するこ
とができる。
系化合物は、Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のものであれ
ば、特に制限はなく、例えば、Ｃａ10（ＰＯ4)6 （Ｏ
Ｈ)2、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｆ2 、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｃl2、
Ｃａ3(ＰＯ4)2 、Ｃａ2 Ｐ2 Ｏ7 及びＣａ4 Ｏ（ＰＯ4)
2 のうちから選ばれた１種又は２種以上を使用すること
ができる。これらのうち安定性や吸着性能の点からＣａ
／Ｐ比が１．５〜１．８のものが好ましく、Ｃａ／Ｐ比
が１．６７のハイドロキシアパタイトを主成分とするも
のが最も好ましい。フッ素アパタイトを用いる場合、全
リン酸カルシウム系化合物中のフッ素含有率が５重量％
以下であるのが好ましい。フッ素含有率が５重量％を超
えると、フッ素の溶出が起こり好ましくない。これらの
リン酸カルシウム系化合物は、公知の方法で合成するこ
とができる。
【０００７】本発明においては、リン酸カルシウム系化
合物粒子は、その平均粒径が１μｍ〜１ｍｍの範囲にあ
り、かつＢＥＴ法による比表面積が１〜３００ｍ2 ／
ｇ、好ましくは５〜３００ｍ2 ／ｇの範囲内にあるもの
が好ましい。平均粒径が１μｍより小さいと、取扱いが
困難であり、比表面積が１ｍ2 ／ｇより小さいと、低比
表面積のため充分な吸着性能が得られない。一方、平均
粒径が１ｍｍより大きく、比表面積が３００ｍ2 ／ｇよ
り大きいと、それぞれ充填密度の低下、不均一な凝集体
の発生などの理由から性能が劣化する。上記のようなリ
ン酸カルシウム系化合物は、種々のカルシウム化合物及
びリン酸化合物を出発原料として合成し、造粒乾燥した
後分級することにより製造することができる。上記の条
件に適合した粒子を得るには、多孔質顆粒とすることが
必要となることもあるが、多孔質顆粒は、常法で製造す
ることができる。
合物粒子は、その平均粒径が１μｍ〜１ｍｍの範囲にあ
り、かつＢＥＴ法による比表面積が１〜３００ｍ2 ／
ｇ、好ましくは５〜３００ｍ2 ／ｇの範囲内にあるもの
が好ましい。平均粒径が１μｍより小さいと、取扱いが
困難であり、比表面積が１ｍ2 ／ｇより小さいと、低比
表面積のため充分な吸着性能が得られない。一方、平均
粒径が１ｍｍより大きく、比表面積が３００ｍ2 ／ｇよ
り大きいと、それぞれ充填密度の低下、不均一な凝集体
の発生などの理由から性能が劣化する。上記のようなリ
ン酸カルシウム系化合物は、種々のカルシウム化合物及
びリン酸化合物を出発原料として合成し、造粒乾燥した
後分級することにより製造することができる。上記の条
件に適合した粒子を得るには、多孔質顆粒とすることが
必要となることもあるが、多孔質顆粒は、常法で製造す
ることができる。
【０００８】本発明の方法においては、上記のようなリ
ン酸カルシウム系化合物粒子に核酸成分中のＲＮＡを吸
着させ、プラスミドＤＮＡは吸着させないために、１ｍ
Ｍ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸の
アルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中
にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化
合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操作の後に
得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液を添加す
る。溶菌操作は、アルカリ−ＳＤＳ法など、任意の公知
の方法で行うことができる。溶菌操作により大腸菌中の
ゲノムＤＮＡや菌体の構成成分としての蛋白質や脂質を
除去し、残りのプラスミドＤＮＡとＲＮＡを主として含
む溶液を用いる。
ン酸カルシウム系化合物粒子に核酸成分中のＲＮＡを吸
着させ、プラスミドＤＮＡは吸着させないために、１ｍ
Ｍ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸の
アルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液中
にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化
合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中に、溶菌操作の後に
得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液を添加す
る。溶菌操作は、アルカリ−ＳＤＳ法など、任意の公知
の方法で行うことができる。溶菌操作により大腸菌中の
ゲノムＤＮＡや菌体の構成成分としての蛋白質や脂質を
除去し、残りのプラスミドＤＮＡとＲＮＡを主として含
む溶液を用いる。
【０００９】トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
の濃度が１ｍＭ未満であると、緩衝作用がないため、溶
液のｐＨが補償されない。また、１００ｍＭを超える
と、プラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム系化合物粒子
への吸着が起こる。また、本発明に用いる緩衝液は、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの他に、１０ｍ
Ｍ〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜４０ｍＭのエチレ
ンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含有するが、エチ
レンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩の濃度が１０ｍＭ
未満では、リン酸カルシウム系化合物粒子に対するＲＮ
Ａの吸着は起こらず、５０ｍＭを超えると、プラスミド
ＤＮＡとＲＮＡが共にリン酸カルシウム系化合物粒子に
吸着されてしまう。
の濃度が１ｍＭ未満であると、緩衝作用がないため、溶
液のｐＨが補償されない。また、１００ｍＭを超える
と、プラスミドＤＮＡのリン酸カルシウム系化合物粒子
への吸着が起こる。また、本発明に用いる緩衝液は、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの他に、１０ｍ
Ｍ〜５０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭ〜４０ｍＭのエチレ
ンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含有するが、エチ
レンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩の濃度が１０ｍＭ
未満では、リン酸カルシウム系化合物粒子に対するＲＮ
Ａの吸着は起こらず、５０ｍＭを超えると、プラスミド
ＤＮＡとＲＮＡが共にリン酸カルシウム系化合物粒子に
吸着されてしまう。
【００１０】さらに、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンとエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩
（以下、ＥＤＴＡと記すこともある）を含有する緩衝液
（以下、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液と記すこともある）の
ｐＨを７．０〜１０．０にするのが好ましい。このｐＨ
が７より低いとリン酸カルシウム系化合物粒子にＲＮＡ
が吸着されず、ｐＨが１０より高いと、プラスミドＤＮ
Ａが吸着されてしまう。すなわち、上記ｐＨ範囲にある
緩衝液を用いたときに、ＲＮＡがリン酸カルシウム系化
合物粒子に吸着され、プラスミドＤＮＡが液中に精度よ
く残る。上記ｐＨ範囲に調製するには、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンは、ｐＨ５．０〜９．０とし
て用いるのが好ましく、例えば、塩酸などの酸及び／又
は０．１Ｍ水酸化ナトリウムなどのアルカリを用いて上
記ｐＨ範囲に調整する。なお、水酸化ナトリウムは、Ｅ
ＤＴＡを溶解する作用があるので、添加することが好ま
しい。
ノメタンとエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩
（以下、ＥＤＴＡと記すこともある）を含有する緩衝液
（以下、トリス−ＥＤＴＡ緩衝液と記すこともある）の
ｐＨを７．０〜１０．０にするのが好ましい。このｐＨ
が７より低いとリン酸カルシウム系化合物粒子にＲＮＡ
が吸着されず、ｐＨが１０より高いと、プラスミドＤＮ
Ａが吸着されてしまう。すなわち、上記ｐＨ範囲にある
緩衝液を用いたときに、ＲＮＡがリン酸カルシウム系化
合物粒子に吸着され、プラスミドＤＮＡが液中に精度よ
く残る。上記ｐＨ範囲に調製するには、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタンは、ｐＨ５．０〜９．０とし
て用いるのが好ましく、例えば、塩酸などの酸及び／又
は０．１Ｍ水酸化ナトリウムなどのアルカリを用いて上
記ｐＨ範囲に調整する。なお、水酸化ナトリウムは、Ｅ
ＤＴＡを溶解する作用があるので、添加することが好ま
しい。
【００１１】ＥＤＴＡはヌクレアーゼの失活を主な目的
として添加したものであるが、同時にリン酸カルシウム
系化合物からカルシウムイオンを遊離させてＲＮＡがリ
ン酸カルシウム系化合物粒子に吸着され、かつプラスミ
ドＤＮＡが吸着されない条件を同時に達成する点で非常
に画期的である。
として添加したものであるが、同時にリン酸カルシウム
系化合物からカルシウムイオンを遊離させてＲＮＡがリ
ン酸カルシウム系化合物粒子に吸着され、かつプラスミ
ドＤＮＡが吸着されない条件を同時に達成する点で非常
に画期的である。
【００１２】本発明の方法によれば、核酸成分中のＲＮ
Ａがリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着され、プラス
ミドＤＮＡだけがトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に残るの
で、この溶液からのプラスミドＤＮＡの回収は、エタノ
ールなどを用いたアルコール沈殿法などの方法で容易に
行うことができる。上記のようなリン酸カルシウム系化
合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填してお
き、液体クロマトグラフィーによってプラスミドＤＮＡ
を核酸成分から容易に単離することもでき、その際プラ
スミドＤＮＡは充填剤に吸着されず、流出液中に含まれ
る。クロマトグラフィーを行う場合、カラムにリン酸カ
ルシウム系化合物粒子を充填し、予め平衡化してから、
ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む試料溶液を注入し、分
離操作を行うが、その際、平衡化と分離操作の両方に同
じ濃度及びｐＨのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液を用いるのが
好ましい。
Ａがリン酸カルシウム系化合物粒子に吸着され、プラス
ミドＤＮＡだけがトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に残るの
で、この溶液からのプラスミドＤＮＡの回収は、エタノ
ールなどを用いたアルコール沈殿法などの方法で容易に
行うことができる。上記のようなリン酸カルシウム系化
合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに充填してお
き、液体クロマトグラフィーによってプラスミドＤＮＡ
を核酸成分から容易に単離することもでき、その際プラ
スミドＤＮＡは充填剤に吸着されず、流出液中に含まれ
る。クロマトグラフィーを行う場合、カラムにリン酸カ
ルシウム系化合物粒子を充填し、予め平衡化してから、
ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む試料溶液を注入し、分
離操作を行うが、その際、平衡化と分離操作の両方に同
じ濃度及びｐＨのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液を用いるのが
好ましい。
【００１３】
【実施例】次に、実施例に基づいて本発明をさらに詳細
に説明するが、本発明はこれによって制限されるもので
はない。
に説明するが、本発明はこれによって制限されるもので
はない。
【００１４】実施例１〜１１及び比較例１〜５ アンピシリン耐性遺伝子を持った pBulescriptSK（＋）
（ Stratagene 社の商品名）ベクターをＪＭ１０９コン
ピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ−寒天培地上で３７℃で一昼夜培養して
単一コロニー株を得た。これを５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含むＬＢ培養液中で３７℃で一昼夜振盪培養し
て菌体を得た。この菌体を遠心分離したのち、アルカリ
−ＳＤＳ法により核酸濃度２００μｇ／ｍｌのプラスミ
ド−ＲＮＡ混合溶液（以下、試料溶液と称する。）を得
た。表１に示す濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−塩酸塩と表１に示した濃度のエチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウムを含有し、０．１Ｍ水酸化ナトリウ
ムで表１に示すｐＨに調製したトリス−ＥＤＴＡ緩衝液
７０μｌ中に平均粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇ
のハイドロキシアパタイト２０ｍｇを懸濁させ、試料溶
液を１５μｌ添加し、室温で５分間振盪した。その後、
懸濁液の上清を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳
動を行い、臭化エチジウム染色により核酸成分の分析を
行い、表２に示す結果を得た。
（ Stratagene 社の商品名）ベクターをＪＭ１０９コン
ピテントセルに形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＬＢ−寒天培地上で３７℃で一昼夜培養して
単一コロニー株を得た。これを５０μｇ／ｍｌのアンピ
シリンを含むＬＢ培養液中で３７℃で一昼夜振盪培養し
て菌体を得た。この菌体を遠心分離したのち、アルカリ
−ＳＤＳ法により核酸濃度２００μｇ／ｍｌのプラスミ
ド−ＲＮＡ混合溶液（以下、試料溶液と称する。）を得
た。表１に示す濃度のトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン−塩酸塩と表１に示した濃度のエチレンジアミ
ン四酢酸ナトリウムを含有し、０．１Ｍ水酸化ナトリウ
ムで表１に示すｐＨに調製したトリス−ＥＤＴＡ緩衝液
７０μｌ中に平均粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇ
のハイドロキシアパタイト２０ｍｇを懸濁させ、試料溶
液を１５μｌ添加し、室温で５分間振盪した。その後、
懸濁液の上清を回収し、０．８％アガロースゲル電気泳
動を行い、臭化エチジウム染色により核酸成分の分析を
行い、表２に示す結果を得た。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】表２に示した結果から明らかなとおり、１
ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン塩酸塩と１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン
四酢酸のアルカリ金属塩を含有するｐＨ７．０〜１０．
０のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液を用いて高純度の精製プラ
スミドＤＮＡを得ることができたが、特にＥＤＴＡ濃度
が２０〜４０ｍＭである場合に、好結果が得られた。
ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン塩酸塩と１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン
四酢酸のアルカリ金属塩を含有するｐＨ７．０〜１０．
０のトリス−ＥＤＴＡ緩衝液を用いて高純度の精製プラ
スミドＤＮＡを得ることができたが、特にＥＤＴＡ濃度
が２０〜４０ｍＭである場合に、好結果が得られた。
【００１８】実施例１２ 平均粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇのハイドロキ
シアパタイトをクロマトグラフィー用カラムに充填し、
実施例２と同様の濃度及びｐＨのトリス−ＥＤＴＡ緩衝
液でカラム内を洗浄し、実施例１に記載した溶菌操作後
のプラスミド−ＲＮＡ混合溶液を試料溶液とし、この試
料溶液及び上記トリス−ＥＤＴＡ緩衝液をカラム容積の
３倍量通水し、これを溶離液とした。溶離液を回収し、
０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、臭化エチジ
ウム染色により拡散成分の分析を行った結果、プラスミ
ドＤＮＡの存在を確認した。
シアパタイトをクロマトグラフィー用カラムに充填し、
実施例２と同様の濃度及びｐＨのトリス−ＥＤＴＡ緩衝
液でカラム内を洗浄し、実施例１に記載した溶菌操作後
のプラスミド−ＲＮＡ混合溶液を試料溶液とし、この試
料溶液及び上記トリス−ＥＤＴＡ緩衝液をカラム容積の
３倍量通水し、これを溶離液とした。溶離液を回収し、
０．８％アガロースゲル電気泳動を行ない、臭化エチジ
ウム染色により拡散成分の分析を行った結果、プラスミ
ドＤＮＡの存在を確認した。
【００１９】
【発明の効果】本発明の方法によれば、溶菌操作によっ
て得られる、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液から
特別な装置を必要とせずに簡単な操作で精製プラスミド
ＤＮＡを効率よく得ることができる。また、イオン交換
樹脂を用いるカラム分離法などに比べて、溶離操作を必
要としないため操作工程が少なくてすみ、プラスミドＤ
ＮＡをアルコール沈殿法などにより容易に濃縮、精製す
ることができる。
て得られる、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液から
特別な装置を必要とせずに簡単な操作で精製プラスミド
ＤＮＡを効率よく得ることができる。また、イオン交換
樹脂を用いるカラム分離法などに比べて、溶離操作を必
要としないため操作工程が少なくてすみ、プラスミドＤ
ＮＡをアルコール沈殿法などにより容易に濃縮、精製す
ることができる。
Claims (7)
- 【請求項１】 １ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレ
ンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜
１０．０の緩衝液中にＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリ
ン酸カルシウム系化合物粒子を懸濁させ、この懸濁液中
に、溶菌操作の後に得られるＲＮＡとプラスミドＤＮＡ
を含む溶液を添加することにより該リン酸カルシウム系
化合物粒子にＲＮＡを吸着させ、懸濁液の上清からプラ
スミドＤＮＡを回収することを特徴とするプラスミドＤ
ＮＡの単離方法。 - 【請求項２】 緩衝液のｐＨが、酸及び／又はアルカリ
の添加により調整されたものである請求項１記載のプラ
スミドＤＮＡの単離方法。 - 【請求項３】 リン酸カルシウム系化合物粒子が１μｍ
〜１ｍｍの平均粒径及び１〜３００ｍ2 ／ｇのＢＥＴ法
による比表面積を有する粒子である請求項１記載のプラ
スミドＤＮＡの単離方法。 - 【請求項４】 Ｃａ／Ｐ比が１．０〜２．０のリン酸カ
ルシウム系化合物粒子をクロマトグラフィー用カラムに
充填し、１ｍＭ〜１００ｍＭのトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタンと１０ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジア
ミン四酢酸のアルカリ金属塩を含むｐＨ７．０〜１０．
０の緩衝液で平衡化した後、溶菌操作の後に得られるＲ
ＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液及び１ｍＭ〜１００
ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと１０
ｍＭ〜５０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸のアルカリ金
属塩を含むｐＨ７．０〜１０．０の緩衝液を順次通水
し、流出液からプラスミドＤＮＡを回収することを特徴
とするプラスミドＤＮＡの単離方法。 - 【請求項５】 緩衝液のｐＨが、酸及び／又はアルカリ
の添加により調整されたものである請求項４記載のプラ
スミドＤＮＡの単離方法。 - 【請求項６】 平衡化と分離操作とに、同じ濃度及びｐ
Ｈの溶液を用いる請求項４記載のプラスミドＤＮＡの単
離方法。 - 【請求項７】 リン酸カルシウム系化合物粒子が１μｍ
〜１ｍｍの平均粒径及び１〜３００ｍ2 ／ｇのＢＥＴ法
による比表面積を有する粒子である請求項４記載のプラ
スミドＤＮＡの単離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23731297A JP3831490B2 (ja) | 1996-09-05 | 1997-09-02 | プラスミドｄｎａの単離方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23539996 | 1996-09-05 | ||
| JP8-235399 | 1996-09-05 | ||
| JP23731297A JP3831490B2 (ja) | 1996-09-05 | 1997-09-02 | プラスミドｄｎａの単離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10127284A true JPH10127284A (ja) | 1998-05-19 |
| JP3831490B2 JP3831490B2 (ja) | 2006-10-11 |
Family
ID=26532100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23731297A Expired - Fee Related JP3831490B2 (ja) | 1996-09-05 | 1997-09-02 | プラスミドｄｎａの単離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3831490B2 (ja) |
-
1997
- 1997-09-02 JP JP23731297A patent/JP3831490B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3831490B2 (ja) | 2006-10-11 |
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