JPH10108686A - 呈味性ペプチドのクローニング、発現、および製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質を消化して様々な呈味性ペプチド
の混合物を製造する代わりに、特定の呈味性ペプチドを
コードするＤＮＡ配列を生物内にトランスファーして、
特定の呈味性ペプチドを発現することにより、特定の呈
味性ペプチドを得る。 【解決手段】 ２〜５０アミノ酸までの長さを有する呈
味性ペプチドまたはその部分もしくはその抽出物、均一
な型の呈味性ペプチド、これらのペプチドをコードする
ＤＮＡ配列およびこれらのＤＮＡ配列を含有するベクタ
ーを含む生物を作製し、この生物を培養して呈味性ペプ
チドを単離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、呈味性ペプチドま
たはその部分もしくはその抽出物を含んでなる生物、均
一な型の呈味性ペプチド、組換えＤＮＡ技術を用いるそ
の製造、並びに味の印象を修飾、増強または遮蔽するた
めのその使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】味の多くは、揮発性および非揮発性部分
からなる。味の実質である非揮発性部分は口で知覚さ
れ、揮発性部分の臭気物質は蒸発して鼻腔に入りそこで
嗅覚上皮で認識される。基本的に４つの味（塩辛い、甘
い、すっぱい、苦い）があるが、うま味を加える人もい
る（日本語であり、これはおいしいを意味する、例えば
グルタミン酸）。

【０００３】非揮発性部分の分子は、かなり高い蒸気圧
を有し通常の大気圧下では蒸発しない。これらには、
塩、砂糖および他の甘味剤、脂肪（例えば、舌ざわりを
与えるバター）、タンパク質、ペプチドおよびアミノ酸
がある。アミノ酸の味は、主に苦いまたは甘いとして広
範に研究されている［ニシムラとカトウ（Ｎｉｓｈｉｍ
ｕｒａ ａｎｄ Ｋａｔｏ）、Ｆｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ４、１７５−１９４
（１９８８）］。グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）
は、味を増強するという特殊な役割があるとされてい
る。いくつかの小さなジ−、またはトリ−ペプチドが合
成されており、その味について評価されている［ニシム
ラとカトウ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ａｎｄ Ｋａｔ
ｏ）、前述］。このような研究において、ペプチドは味
の増強物質、修飾物質、強化物質、および遮蔽物質とし
て作用することが知られている。種々の魚、チーズ、お
よび肉製品をいくつかの非揮発性画分に分離することに
より、重要な呈味性ペプチドを性状解析することが可能
になった。これらのペプチドは天然には、ミルク中のカ
ゼインのようなタンパク質をプロテアーゼ（食物物質中
に存在する）が消化することにより生成される。特に、
牛肉中でオクタペプチドが見いだされている。その肉の
ような味と肉の味を増強する能力により、ビーフィーミ
ーティーペプチド（ＢＭＰ）と呼ばれ、またＳＴＥＴ
（おいしい味の増強ペプチド）とも呼ばれる。

【０００４】呈味性ペプチドは、カゼインやラクトアル
ブミン（ミルク）、筋肉タンパク質（牛肉）、ニワトリ
またはグルテン（大豆または小麦）として食物タンパク
質から調製される。プロテアーゼ消化により、タンパク
質はより小さいペプチドやアミノ酸に分解される。プロ
テアーゼの特異性に依存して、異なる呈味性ペプチドが
生成される。その長さとアミノ酸配列は可変である。ペ
プチドの長さは２〜５０アミノ酸であってよい［ラール
とブラウン（Ｌａｈｌ ａｎｄ Ｂｒａｕｎ）、Ｆｏｏ
ｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０、６８−７１（１９９
４）］。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】食物タンパク質のプロ
テアーゼ消化により、呈味性ペプチドの複雑な混合物が
得られ、その各呈味性ペプチドの解析はかなり困難であ
る。これらのペプチドは組合わさって相乗的に作用する
ことがあり、各ペプチドの味への寄与を一層複雑にして
いる。

【０００６】下記のようにいくつかの呈味性ペプチドが
精製され、その配列が決定されている：

【表１】 呈味性ペプチド 供給源 文献 ─────────────────────────────────── KGDEESLA (BMP) 牛肉 Yamasaki and Maekawa Agric. Biol. Chem. 42, 1761-1765(1978) Nakata et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59, 689-693 (1965) Leu-Pro,Val-Pro,Phe-Pro,..... チーズ Mojarro-Guera et al.,Journal of Food Science 56, 943-947(1991) Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-, ... チーズ Kaiser et al.,Z.Lebensm. Unters. Forsch. 195, 8-14 (1992) Ala-Vla-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg,... チーズ Bumberger and Belitz,Z.Lebensm. Unters. Forsch. 197, 14-19(1993) Ala-Glu,Asp-Ala,Asp-Gly, 魚 Noguchi et al.,J.Agr.Food Chem. 23, 49-53 (1975) Asp-Glu-Ser, Glu-Asp-Glu, 〃 Asp-Glu-Gly-Asp, 〃 Asp-Glu-Gly-Ser-Asp,... 〃

【０００７】本発明者らは、タンパク質を消化して様々
な呈味性ペプチドの混合物を製造する代わりに、特定の
呈味性ペプチドをコードするＤＮＡ配列を生物内にトラ
ンスファーして、次に特定の呈味性ペプチドを発現する
ことにより、特定の呈味性ペプチドが得られることを見
出した。呈味性ペプチドは、産生する生物と一緒に使用
されるか、または味の印象を修飾、増強および遮蔽する
ために均一に精製した後使用される。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明の第１の
面において、呈味性ペプチドまたはその部分もしくはそ
の抽出物を含んでなる生物が提供される。これらの生物
には、微生物、カビ、植物または動物が含まれる。呈味
性ペプチドを含んでなる特定の生物には、例えばラクト
コッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａ
ｃｔｉｓ）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ス
タフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓｃａｒｎｏｓｕｓ）、酵母、フサリウム（ｆｕ
ｓａｒｉｕｍ）および糸状菌（例えば、アスペルギルス
またはペニシリウム）などの食品グレードの生物があ
る。

【０００９】呈味性ペプチドを含んでなる生物の部分ま
たは抽出物には、動物のミルク、またはプロテアーゼで
処理したその調製物がある。

【００１０】本発明の第２の面において、均一な型の呈
味性ペプチドが提供される。

【００１１】

【発明の実施の態様】本明細書において「呈味性ペプチ
ド」という用語は、揮発性化合物と一緒に味の全体的印
象に寄与するペプチドを意味する。一般的に呈味性ペプ
チドは味活性があり、様々な味の印象を与え、修飾し、
増強しおよび／または遮蔽することができる。呈味性ペ
プチドは、その作用を単独でまたは他の呈味性ペプチド
との混合物として共同して発揮する。「呈味性ペプチ
ド」という用語は、ミルク、チーズ、肉、家禽、魚、大
豆および穀物食物からの呈味性ペプチドを含む。ペプチ
ドの長さは２〜５０アミノ酸まででもよい。このような
ペプチドの例は、例えばＢｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９、６８９−６９３（１９９
５）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ５６，９４３−９４７（１９９１）、Ｚ．Ｌｅｂｅ
ｎｓｍ．Ｕｎｔｅｒｓ．Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ １９５、
８−１４（１９９２）、Ｚ．Ｌｅｂｅｎｓｍ．Ｕｎｔｅ
ｒｓ．Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ １９７、１４−１９（１９
９３）およびＪ．Ａｇｒ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２３、
４９−５３（１９７５）に記載されている。特に呈味性
ペプチドは、以下のアミノ酸残基を含むと定義される。 Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala （配列番号１） Asp-Lys-Ile-His-Pro-Phe （配列番号２）、または Arg-Gly-Pro-Phe-Ile-Ile-Val （配列番号３）。

【００１２】「均一な」という用語は、特定の呈味性ペ
プチドが、他の呈味性ペプチドからは実質的に遊離して
得られることを意味する。本発明のために、９５％を超
える同じ種類のものから構成される呈味性ペプチドは、
他の呈味性ペプチドからは実質的に遊離していると考え
られる。

【００１３】本明細書において「呈味性ペプチド」とい
う用語は、例えば特定の親和性配列および／またはシグ
ナル配列の添加により意図的に修飾されるタンパク質を
含む。

【００１４】好ましくは親和性担体物質に結合する特定
の親和性配列は、例えば少なくとも２つの隣接ヒスチジ
ン残基を含有する配列である（この意味で、ヨーロッパ
特許第２８２０４２号を参照）。このような配列は、ニ
トリロ三酢酸ニッケルキレート樹脂（ホチュリとドベリ
（Ｈｏｃｈｕｌｉ ａｎｄ Ｄｏｅｂｅｌｉ）、Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｏｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３６８、７
４８（１９８７）；ヨーロッパ特許第２５３３０３号）
に選択的に結合する。従ってこのような特異的配列を含
有する呈味性ペプチドは、残りのペプチドおよびタンパ
ク質から選択的に分離される。この特異的配列は、特定
の呈味性ペプチドのＣ−末端またはＮ−末端に連結する
ことができる。

【００１５】シグナル配列は、細胞の表面で発現される
タンパク質のコード配列の最初に含まれる配列を意味す
る。この配列は、成熟ペプチドのＮ−末端であるシグナ
ルペプチドをコードし、ポリペプチドが転位するように
宿主細胞に指令を与える。本明細書において「転位シグ
ナル配列」という用語はまた、この種のシグナル配列を
意味する。転位シグナル配列は、真核生物および原核生
物に固有の種々のタンパク質に会合していることが見い
だされており、しばしば両方の生物で機能する。従って
このようなシグナル配列を含有する呈味性ペプチドは、
細胞を含まない培地中に効率的に分泌されることができ
る。

【００１６】親和性および／またはシグナル配列は、直
接または間接に特定の呈味性ペプチドに結合することが
できる。間接結合の場合は、親和性および／またはシグ
ナル配列は、それを介して特定の呈味性ペプチドに結合
している適当な選択的切断部位を含有する。好適な選択
的切断部位はアミノ酸配列 Ｇｌｕ−Ａｌａを含有し、
これはＳＴＥ１３ジアミノペプチドにより特異的に認識
される。このような親和性および／またはシグナル配列
は、次に当業者に公知の方法を用いて酵素により切断す
ることができる。

【００１７】「呈味性ペプチド」という用語は、さらに
特定の呈味性ペプチドを繰り返し含む反復性人工的タン
パク質（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を包含する。特定の呈味性ペプチ
ドのモノマー型を得るために、反復性人工的タンパク質
を酵素的に切断する。切断のためのプロテアーゼの例と
しては、リジルアミノペプチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．
１１．１５）またはアラニンカルボキシペプチダーゼ
（Ｅ．Ｃ．３．４．１７．６）がある。プロテアーゼは
反復性人工的タンパク質の単離後添加されるか、または
特定の生物中で同時発現されて反復性人工的タンパク質
の発現と処理を同時に行う。「反復性人工的タンパク
質」という用語は、前述の特異的親和性および／または
シグナル配列の添加により修飾されるタンパク質を包含
する。

【００１８】また、本発明の呈味性ペプチドをコードす
る単離されたＤＮＡ配列、本発明の呈味性ペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列を含有するベクターおよび発現ベク
ター、呈味性ペプチドの産生のためにそのようなベクタ
ーを含有する生物、並びにそのようなＤＮＡ配列、組換
えベクターおよび生物の製造方法も提供される。

【００１９】本発明の呈味性ペプチドの発現と精製法も
提供される。

【００２０】呈味性ペプチドをコードするＤＮＡ配列
は、当業者に公知の従来法で製造される。本出願に記載
の方法を用いて、オリゴヌクレオチドが合成され、これ
は正しく集合された時本発明の呈味性ペプチドをコード
する合成ＤＮＡ配列を生成する。この合成ＤＮＡ配列
は、適当な制限酵素部位が提供される。これらはＤＮＡ
化学で公知の方法に従って得られる。

【００２１】本発明の呈味性ペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列は、それ自身公知の便利な方法で導入される。

【００２２】宿主生物中で呈味性ペプチドを発現するに
は、原則として、選択される生物中で呈味性ペプチドを
コードするＤＮＡ配列を複製し発現するベクターならい
ずれも適している。原核細胞での使用に適した発現ベク
ターは、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの
教科書「モレキュラークローニング、実験室マニュアル
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）に記載され
ている。他のベクターの例は、ｐＤＳファミリーのプラ
スミドである［ブジャード（Ｂｕｊａｒｄ）ら、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ウーとグロス
マン（Ｗｕ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ）編、アカデ
ミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．）、第１５５巻、４１６−４３３（１９８７）］。

【００２３】発現制御配列に機能的に結合した呈味性ペ
プチドをコードするＤＮＡ配列を含有するそのような原
核生物発現ベクターは、従来法を用いて任意の適当な原
核細胞中に導入することができる。適当な原核細胞の選
択は、当業者に公知の異なる因子により決定される。す
なわち例えば、選択されるベクターとの適合性、発現産
物の毒性、発現特性、必要な生物学的安全上の注意点お
よびコストが重要であり、これらの因子のすべての間の
妥協点を見いだす必要がある。

【００２４】適当な原核生物には、グラム陰性細菌およ
びグラム陽性細菌、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）お
よび枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の
株がある。原核生物の例は、大腸菌Ｍ１５株（ビラレヨ
（Ｖｉｌｌａｒｅｊｏ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１２０，４６６−４７１［１９７４］によりＯＺ２９１
株として記載され、大腸菌Ｗ３１１０［ＡＴＣＣ ２７
３２５］）である。しかし前記大腸菌株以外に、他の一
般的に使用される大腸菌株、例えば大腸菌２９４（ＡＴ
ＣＣ ３１４４６）および大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ ３
１３４３）も使用できる。本発明の特に好適な大腸菌細
胞は、大腸菌ＤＨ５α（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ））である。

【００２５】大腸菌での呈味性ペプチドの発現と細胞を
含まない培地への呈味性ペプチドの分泌のために、プロ
モーターと、大腸菌の特異的親和性および／またはシグ
ナル配列を含有する呈味性ペプチドをコードするＤＮＡ
配列を含む発現ベクターが使用できる。

【００２６】好ましくは大腸菌発現ベクターは、以下を
含んでなる。 （ａ）プロモーター配列、および（ｂ）特異的親和性お
よびシグナル配列として大腸菌のマルトース結合タンパ
ク質を含有する呈味性ペプチドをコードするＤＮＡ配
列。

【００２７】ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ベクター系もまた、本発
明の呈味性ペプチドの産生のために使用することができ
る（総説については、プラットネーウ（Ｐｌａｔｔｎｅ
ｅｕｗ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．６２、１００８−１０１３［１９９６］を参
照）。特異的シグナル配列を用いて、目的の呈味性ペプ
チドを細胞内で分泌または産生することができる。ペプ
チドは均一な型で産生されるか、または宿主生物ととも
に産生される。

【００２８】ラクトバシラス・アシドフィルス（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ベク
ター系もまた、本発明の呈味性ペプチドの産生に使用す
ることができる（総説については、リン（Ｌｉｎ）ら、
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．４
５、４８４−４８９［１９９６］を参照）。特異的シグ
ナル配列を用いて、目的の呈味性ペプチドを細胞内で分
泌または産生することができる。ペプチドは均一な型で
産生されるか、または宿主生物とともに産生される。

【００２９】スタフィロコッカス・カルノサス（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ベクター
系もまた、本発明の呈味性ペプチドの産生に使用するこ
とができる（総説については、ブルックナーとゲッツ
（Ｂｒｕｃｋｎｅｒ ａｎｄＧｏｅｔｚ）、Ｓｙｓｔｅ
ｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８、５１０−５
１６［１９９５］を参照）。特異的シグナル配列を用い
て、目的の呈味性ペプチドを細胞内で分泌または産生す
ることができる。ペプチドは均一な型で産生されるか、
または宿主生物とともに産生される。

【００３０】本発明の好適な実施態様において、酵母が
生物として使用される。酵母細胞中での使用に適した発
現ベクターは、「酵母の遺伝学と分子生物学へのガイド
（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ ｍｅｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ）」、ガス
リーとフィンク（Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ）
編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ア
カデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．）、第１９４巻（１９９１）、および「遺伝子
発現技術（Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）」、ゲデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）編、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、アカデミッ
クプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．）、第１８５巻（１９９１）。本発明の好適な酵母
ベクターは、ｐＮＳファミリーのベクター（例えば、ｐ
ＮＳ２およびｐＮＳ３）である。適当な酵母細胞の例
は、サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パスト
リス（Ｐｉｃｈａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・
ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐ
ｈａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）細胞である。
種々の酵母発現系は、ロマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、
Ｙｅａｓｔ、第８巻、４２３−４８８（１９９２）によ
り与えられる。本発明の特に好適な酵母細胞は、サッカ
ロミセス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
ＤＢＹ７４６［ＡＴＣＣ ４４７７３］である。

【００３１】酵母発現ベクターによる形質転換は、クレ
ベ（Ｋｌｅｂｅ）ら、Ｇｅｎｅ、第２５巻、３３３−３
４１（１９８３）に記載のように行われる。

【００３２】酵母での呈味性ペプチドの発現と細胞を含
まない培地への呈味性ペプチドの分泌のために、プロモ
ーター、呈味性ペプチドをコードするＤＮＡ配列、およ
び呈味性ペプチドをコードするＤＮＡ配列の上流にシグ
ナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターが
使用できる。

【００３３】好ましくは酵母発現ベクターは、以下を含
んでなる。 （ａ）プロモーター配列、（ｂ）呈味性ペプチドをコー
ドする配列、および（ｃ）呈味性ペプチドをコードする
配列の上流にα−因子シグナルタンパク質をコードする
配列。

【００３４】酵母中で発現される呈味性ペプチドは、均
一な型で産生されるか、または宿主生物とともに産生さ
れる。呈味性ペプチドの発現が行われる方法は、選択さ
れる発現ベクター宿主細胞系に依存する。

【００３５】普通、目的の発現ベクターを含有する原核
宿主細胞は、その原核宿主細胞の増殖に最適な条件下で
増殖される。指数増殖の最後（この時、単位時間当たり
の細胞数の増加は低下する）に、目的の呈味性ペプチド
の発現が誘導される、すなわち目的の呈味性ペプチドを
コードするＤＮＡが転写され、転写されたｍＲＮＡが翻
訳される。誘導は、増殖培地に誘導物質または抑制解除
物質（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）を加えるか、または物
理的パラメータを変える（例えば、温度の変化）ことに
より行うことができる。例えば、発現はｌａｃリプレッ
サーにより制御することができる。

【００３６】イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、発現制御配列の抑制を解
除し、こうして目的の呈味性ペプチドの合成が誘導され
る。

【００３７】目的の発現ベクターを含有する酵母宿主細
胞は、その酵母宿主細胞の増殖に最適な条件下で増殖さ
れる。目的の呈味性ペプチドの発現は、例えばリン酸塩
を欠失させることで誘導される。

【００３８】フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ベクター
系もまた、本発明の呈味性ペプチドの産生に使用するこ
とができる（総説については、ロイヤー（Ｒｏｙｅｒ）
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３、１４７９−
１４８３［１９９５］を参照）。特異的シグナル配列を
用いて、目的の呈味性ペプチドを細胞内に分泌または産
生することができる。ペプチドは均一な型で産生される
か、または宿主生物とともに産生される。

【００３９】糸状菌（例えばアスペルギルスまたはペニ
シリウム）ベクター系もまた、本発明の呈味性ペプチド
の産生に使用することができる（総説については、ベル
カとバーネット（Ｂｅｒｋａ ａｎｄ Ｂｅｒｎｅｔ
ｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｄｖ．７．１２７−１５４
［１９８９］；デブチャントとグイネ（Ｄｅｖｃｈａｎ
ｄ ａｎｄ Ｇｗｙｎｎｅ）、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．１７、３−９［１９９１］を参照）。特異的シグナ
ル配列を用いて、目的の呈味性ペプチドを細胞内に分泌
または産生することができる。ペプチドは均一な型で産
生されるか、または宿主生物とともに産生される。

【００４０】バキュロウイルス−昆虫細胞ベクター系も
また、本発明の呈味性ペプチドの産生に使用することが
できる（総説については、ルクロウとサマーズ（Ｌｕｃ
ｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ）、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ６、４７−５５［１９８８］を参照）。
組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞で産生され
る呈味性ペプチドは、Ｎ−グリコシル化（スミス（Ｓｍ
ｉｔｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ｓｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８２、８４０４−８４０８［１９８５］を参照）
およびＯ−グリコシル化（トムセン（Ｔｈｏｍｓｅｎ）
ら、１２．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｒｐｅｓ
ｖｉｒｕｓ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、フィラデルフィア大
学、ペンシルバニア州）を含む翻訳後プロセシングを受
けることができる。

【００４１】植物も本発明の呈味性ペプチドの産生のた
めの宿主として使用することができる。呈味性ペプチド
をコードするＤＮＡ配列の移動は、種々の方法により行
われ（総説については、ポトリクスとスパンゲンベルグ
（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ａｎｄＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ）
編、「植物への遺伝子移動、実験室マニュアル（Ｇｅｎ
ｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｐｌａｎｔｓ．Ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ）」、スプリンガー・フ
ェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）、ハイ
デルベルグ、ドイツ（１９９５）を参照）、呈味性ペプ
チドのＤＮＡ配列は宿主細胞植物の染色体内に組み込ま
れる。例えば呈味性ペプチドをコードするＤＮＡ配列で
植物宿主を形質転換することにより、呈味性ペプチドを
過剰に産生してもよい。呈味性ペプチドの産生のための
植物宿主の例には、トウモロコシ（ジーメイズ（Ｚｅａ
ｍａｙｓ）、イシダ（Ｉｓｈｉｄａ）ら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４、７４５−７５
０（１９９６））、亜麻（リヌムウシタチシムム（Ｌｉ
ｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ドングとムチ
ュゲン（Ｄｏｎｇ ａｎｄ Ｍｃｈｕｇｈｅｎ）、Ｐｌ
ａｎｔ Ｓｃｉ．８８（１），６１−７１（１９９
３））および大豆（グリシンマックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍａｘ）、クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｔｉ
ｂｔｅｃｈ８、１４５−１５１（１９９０））がある
が、これらに限定されない。

【００４２】トランスジェニック動物ベクター系もま
た、本発明の呈味性ペプチドの産生に使用することがで
きる（総説については、ピンカート（Ｐｉｎｋｅｒ
ｔ）、「トランスジェニック動物技術：実験室ハンドブ
ック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌ ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ）、サンジエゴ［１９９３］を参照）。特異的
シグナル配列を用いて目的の呈味性ペプチドはまた、動
物のミルク中に分泌されることができ（例えば、ドロハ
ン（Ｄｒｏｈａｎ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ １７ａ、３８−３８［１９９３］；リー
（Ｌｅｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．５６、２１１−２２２［１９９６］を参
照）、こうしてミルクやそのプロテアーゼ処理調製物
を、呈味性ペプチドを含有する食物や味成分として使用
することが可能になる。

【００４３】前述のように生物中で発現される呈味性ペ
プチドは、標準的な精製法を用いて宿主細胞培地から単
離することができる。分析目的には、呈味性ペプチドは
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分離す
ることができる。分取用分離は、サイズ排除クロマトグ
ラフィーを用いて行うのが最も良い。原則としてタンパ
ク質分離に使用されるすべての他のクロマトグラフィー
系もペプチド分離に応用することができる。これらに
は、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩ
Ｃ）、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィーおよび正相および逆相ＨＰＬＣがある。

【００４４】あるいは前述のように、呈味性ペプチドを
宿主生物またはその部分もしくはその抽出物とともに使
用することができる。

【００４５】本発明の呈味性ペプチドまたはその部分も
しくはその抽出物を含んでなる生物および本発明の呈味
性ペプチドは、異なる味の印象を修飾、増強または遮蔽
するのに使用することができる。これらは、タンパク質
のプロテアーゼ消化により現在産生されているものと同
じ方法で使用することができる。これらは、それ自身公
知の方法で食物に加工される。

【００４６】

【実施例】本発明を一般的に説明したが、以下の具体例
により本発明をさらに詳細に説明する。以下の例は例示
のためであって、特に明記する場合を除いて決して本発
明を限定するものではない。

【００４７】図１Ａ−Ｅは、プラスミドｐＮＳ２の完全
なヌクレオチド配列を示す。図２は、プラスミドｐＮＳ
２の略図である。図３は、プラスミドｐＮＳ３の略図で
ある。図４は、ＢＭＰの電子スプレー質量スペクトルで
ある。プロトン化した分子イオン（ｍ／ｚ ８４８．
３）は、倍の電荷のイオン（ｍ／ｚ ４２４．９）より
少ない。

【００４８】例１ 大腸菌中でのビーフィーミーティー
ペプチド（ＢＭＰ）の発現 Ａ．発現ベクターの作製と形質転換 ＢＭＰ配列は、発現ベクターｐＭａｌ−Ｃ２（ニューイ
ングランドバイオラボズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，ＮＥＢ）、ビバリー、マサチューセッ
ツ州、米国）内にクローン化される。オリゴヌクレオチ
ド配列Ａ１とＡ２は、市販業者（ミクロシンス社（Ｍｉ
ｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）、バルガッハ（Ｂａｌｇａｃ
ｈ）、ＣＨ）から注文し、各０．６ｎｇを２μｌのＨ₂
Ｏ中で混合し、８０℃に加熱し、ゆっくり室温まで冷却
してアニーリングをさせた。

【００４９】 Ａ１：5' AAGGGTGACGAAGAATCTTTGGCTTAGA-3' Ａ２：3'-TTCCCACTGCTTCTTAGAAACCGAATCTTCGA-5'

【００５０】アニーリングしたオリゴヌクレオチドを次
に、製造業者の説明書（ＮＥＢ）に従ってリガーゼ（ギ
ブコ（Ｇｉｂｃｏ）、０．４Ｕ／μｌ）を用いてＸｍｎ
ＩとＨｉｎｄIII で処理したｐＭａｌ−Ｃ２ベクターと
連結した。マルトース結合タンパク質に対する融合蛋白
としてＢＭＰをコードする配列を含有するプラスミドを
大腸菌ＤＨ５α（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ））に形質転換した。

【００５１】Ｂ．ＢＭＰの精製、切断および検出 形質転換した大腸菌をＬＢ培地でＯＤ₆₀₀ が０．５にな
るまで増殖させた後、１ｍＭのＩＰＴＧを加えて融合蛋
白の産生を誘導した。超音波処理した細胞上清から出発
してマルトース−アガロース（ニューイングランドバイ
オラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ））を用いて融合蛋白を親和性精製した。融合蛋白を
カラムから抽出し、精製した融合蛋白を製造業者のプロ
トコールに概説されているように第Ｘａ因子で処理し、
ＢＭＰを切断した。ＢＭＰをＨＰＬＣクロマトグラフィ
ー（酵母の欄で後述されている）を用いて検出した。

【００５２】例２ 酵母中でのビーフィーミーティーペプチド（ＢＭＰ）の
発現 Ａ．ＢＭＰをコードするオリゴヌクレオチドの調製 以下のオリゴヌクレオチドをミクロシンス社（Ｍｉｃｒ
ｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）（バルガッハ（Ｂａｌｇａｃ
ｈ）、スイス）から得た：

【００５３】 Ｂ１：5'-TCGAGAAGAGAGAAGCTGAAGCTAAGGGT-3' Ｂ２：5'-CGTCACCCTTAGCTTCAGCTTCTCTCTTC-3' Ｂ３：5'-GACGAAGAATCTTTGGCTTGAG-3' Ｂ４：5'-GATCCTCAAGCCAAAGATTCTT-3'

【００５４】オリゴヌクレオチドを２００ピコモルの濃
度に希釈した。２４．８μｌのオリゴヌクレオチド溶液
を、３μｌの１０×ＰＮＫ緩衝液（ファルマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）のプロトコールを参照）、１．２μｌ
の１０ｍＭ ＡＴＰ、および１μｌのポリヌクレオチド
キナーゼ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５．
３Ｕ／μｌ）と混合した。混合物を３７℃で４５分間イ
ンキュベートした後、キナーゼを６５℃で１０分間不活
性化した。

【００５５】２つの対合しているオリゴヌクレオチド
（Ｂ１とＢ２，およびＢ３とＢ４）の各６μｌを、１
１．２μｌの２５ｍＭ ＭＧＣｌ₂ 、１．６μｌの０．
５ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、および１５．２μ
ｌのＨ₂ Ｏと６０℃で５分間インキュベートした。２０
分間かけて４０℃までゆっくり冷却してアニーリング
し、次に氷で冷却した。

【００５６】ＢＭＰをコードするオリゴヌクレオチドの
作製のために、対のオリゴヌクレオチドを混合し連結さ
せた。反応混合物は、２０μｌの各アニーリングしたオ
リゴヌクレオチド、０．５μｌの１Ｍ ＤＴＴ、１２．
５μｌの１０ｍＭ ＡＴＰ、３μｌのリガーゼ（ギブコ
（Ｇｉｂｃｏ））と最終容量を１００μｌにするための
水から構成されていた。次に混合物を室温で４時間イン
キュベートした。

【００５７】Ｂ．発現ベクターの調製 製造業者の説明書（ＮＥＢ）に従って、発現ベクターｐ
ＮＳ２（図１および図２）を、制限酵素ＸｈｏＩとＢａ
ｍＨＩで切断した。約１００ｎｇのゲル濾過し線状化し
たベクターを、製造業者の説明書に従ってリガーゼ（ギ
ブコ（Ｇｉｂｃｏ）０．４Ｕ／μｌ）の存在下でＢＭＰ
をコードする１μｌのオリゴヌクレオチドでインキュベ
ートした。連結したプラスミドを次に、大腸菌ＤＨ５α
（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））に形
質転換し、そこからキアゲンプラスミドミディキット
（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ）
（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ドイツ）を用いて単離し
た。オリゴヌクレオチド配列を商業的配列決定センター
（ミクロシンス社（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＡＧ）、バ
ルガッハ（Ｂａｌｇａｃｈ））で測定した。ＢＭＰをコ
ードするオリゴヌクレオチドを有するプラスミドを単離
し、酵母株の形質転換に使用した。これらのプラスミド
をｐＮＳ３と名付けた（図３）。

【００５８】Ｃ．サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換 クレベ（Ｋｌｅｂｅ）ら（前述）が記載したように、５
μｇのベクターｐＮＳ３をサッカロミセス・セレビッシ
ェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＢＹ７４６（ＡＴＣ
Ｃ ４４７７３）に形質転換した。形質転換した酵母細
胞を、適当な選択培地（アミノ酸ヒスチジンとロイシン
を補足したＳＤ培地、培地の説明についてはシャーマン
（Ｓｈｅｒｍａｎ）「酵母の遺伝学と分子生物学へのガ
イド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ａｎｄ ｍｅｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ）」、
ガスリーとフィンク（Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎ
ｋ）編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｉｎｃ．）、第１９４巻、３−２１（１９９１）
を参照）に蒔き、３０℃で４日間増殖させた。

【００５９】Ｄ．ＢＭＰペプチドの発現 選択的寒天培地で増殖させたコロニーを、前記アミノ酸
を補足した液体ＳＤ培地中で増殖させた。培養物の密度
が６００nmで２．０に達した時、細胞を洗浄し、Ｄ３最
少培地に再懸濁することにより、誘導を行った。代替法
では、細胞が増殖してリン酸塩が欠乏し、誘導が起きる
ように、培地に規定量のリン酸塩を加えた。ペプチドは
細胞内で、α−因子シグナルタンパク質に対する融合蛋
白として生成された。分泌されると、ペプチドはシグナ
ルプロテアーゼにより切断され、目的のペプチドが培地
中に放出された。

【００６０】Ｅ．ＨＰＬＣによるペプチドの検出 発酵からの上清を、４．６×２５０ｍｍ Ｃ₈ カラム
（ブラウンリー（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）カラム、アプライ
ドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ））を用いて流速１ｍｌ／分で、０．１％ＴＦＡ
を補足した水を緩衝液Ａとして、０．１％ＴＦＡを補足
した８０％アセトニトリルを緩衝液Ｂとして用いて、１
５分間ので０〜１００％の線形勾配で逆相ＨＰＬＣによ
り分離した。吸光度をそれぞれ２０２ｎｍ、２１４また
は２２２ｎｍで読んだ。産生したペプチドの保持時間
を、純粋な化学的に合成したＢＭＰからのものと比較し
た。

【００６１】Ｆ．ＬＣ−ＭＳによる検出 ＢＭＰ分子を確実に同定するために、ＭＳ装置をＨＰＬ
Ｃ装置につないだ。ＢＭＰ試料をまず、フィニガン（Ｆ
ｉｎｎｉｇａｎ）ＭＡＴ ＳＳＱ質量スペクトル計の質
量スペクトル計と組合せた液体クロマトグラフィー（前
述）で、電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いて解析
した。１：５の比を作成するためにポスト−カラムフロ
ースプリットを設定した。すなわち、イオン源に２００
μｌ／分の流れを導入した。電子スプレーニードルに４
５００Ｖのスプレー電圧を加えた。加熱キャピラリーの
温度を２１０℃に維持し、質量範囲２００〜１２００を
１．５秒間スキャンした。

【００６２】微生物で産生したＢＭＰから得られたｍ／
ｚスペクトル（図４）は、合成物質から得られたものと
同等であった。

【００６３】例３ 酵母中のタンデムリピート配列としてのＢＭＰの発現 ＢＭＰの産生レベルを増強するために、ＢＭＰのいくつ
かのタンデムリピート配列（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａ
ｔ）をコードするオリゴヌクレオチド配列を作成した。
各リピート配列の前には、短いスペーサーペプチド（Ly
s-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala ）があり、これは分泌中に切断
除去された。クローニングは例２と同様に行った。６μ
ｌの対合しているオリゴヌクレオチド（Ｂ１とＢ２；例
２）を、６〜６０μｌの対合しているオリゴヌクレオチ
ド（Ｂ５とＢ６）と混合した。オリゴヌクレオチドをア
ニーリングし、例２のように連結させた。オリゴヌクレ
オチドＢ５とＢ６の濃度を変えることにより、リピート
配列の平均数が制御できた。

【００６４】Ｂ５：5'-GACGAAGAATCTTTGGCTAAGAGAGAAGC
TGAAGCTAAGGGT-3' Ｂ６：3'-CGTCACCCTTAGCTTCAGCTTCTCTCTTAGCCAAAGATTCT
T-5'

【００６５】この連結混合物に、対合しているオリゴヌ
クレオチドＢ３とＢ４（例２）を加えた。得られた連結
した断片を、例２に記載したように大腸菌ＤＨ５αに形
質転換した。タンデムリピート配列の数は、プライマー
Ｂ１と下記のＰＣＲ−プライマーを用いてＰＣＲ断片の
サイズを推定して決定した。各リピート配列によりサイ
ズは余分に４２塩基対増えた。

【００６６】 ＰＣＲ−プライマー：5'-TAGACTGGCGTTGTAATG-3'

【００６７】２〜５のタンデムリピート配列を有するプ
ラスミドをサッカロミセス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）ＤＢＹ７４６に形質転換した。ＢＭＰ
タンデムリピート配列の発現は、例２に記載したように
行った。分泌時に縦に並んだペプチドは切断され、ＢＭ
Ｐが培地中に放出された。１つのＢＭＰ単位の生成は、
例２で行ったようにＨＰＬＣとＬＣ−ＭＳにより確認さ
れた。

【００６８】例４ ＢＭＰを繰り返して含有する反復性人工的タンパク質の
発現 ＢＭＰをコードするＤＮＡは数回繰り返されて連結単位
（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｃ ｕｎｉｔｓ）を生成す
る。以下の２つのオリゴヌクレオチドを前記したように
アニーリングした：

【００６９】 Ｃ３：5'-GACGAAGAATCTTTGGCTAAGGGT-3' Ｃ４：3'-TTCTTAGAAACCGATTCCCACTGC-5'

【００７０】連結物質（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｓ）は、
リガーゼ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を加えると互いに連
結される。長い連結形（＞６００塩基対）の選択は、ポ
リアクリルアミドゲルで分離することにより行われる
（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前述）。ゲル
から溶出した断片は、次に下記の２つの断片（これらは
各オリゴヌクレオチドのアニーリングにより得られる）
と連結される。

【００７１】 Ｃ１：5'-TCGAGAAGAGAGAAGCTGAAGCTAAGGGT-3' Ｃ２：3'-CTTCTCTCTTCGACTTCGATTCCCACTGC-5'

【００７２】 Ｃ５：5'-GACGAAGAATCTTTGGCTTGAG-3' Ｃ６：3'-TTCTTAGAAACCGAACTCCTAG-3'

【００７３】連結産物は次に、制限酵素ＸｈｏＩとＢａ
ｍＨIII であらかじめ切断した酵母発現ベクターｐＮＳ
２中に挿入される。連結混合物は大腸菌中に形質転換さ
れる。プラスミドは単離され、前述のようにサッカロミ
セス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中に
形質転換される。

【００７４】酵母の培養と誘導は前述のように行った。
タンパク質は培地中に分泌される。モノマー型のＢＭＰ
を得るために、反復性人工的タンパク質をＡｌａ−Ｌｙ
ｓアミノ酸結合を切断するプロテアーゼで処理する。可
能なプロテアーゼはリジルアミノペプチダーゼ（Ｅ．
Ｃ．３．４．１１．１５）またはアラニンカルボキシペ
プチダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１７．６）である。プロ
テアーゼは発酵後に加えられるか、または酵母株と同時
発現され、反復性人工的タンパク質の産生とプロセシン
グを同時に行う。

【００７５】例５ チーズ呈味性ペプチドの発現 チーズペプチドＤＫＩＨＰＦ（配列番号２）を、ＢＭＰ
で記載した方法と同じ方法で行った。以下のオリゴヌク
レオチドをアニーリングし、発現ベクターｐＮＳ２にア
ニーリングさせた。

【００７６】 5'-TCGAGAAGAGAGAAGCTGAAGCTGACAAGATTCACCCATTCTGAG 3'-CTTCTCTCTTCGACTTCGACTGTTCTAAGTGGGTAAGACTCCTAG-
5'

【００７７】オリゴヌクレオチド断片を、ＸｈｏＩとＢ
ａｍＨＩで切断したベクターｐＮＳ２に挿入した。ペプ
チドの形質転換、誘導および産生は、例２に記載したよ
うに行った。ペプチドはＢＭＰの場合と同様に、ＨＰＬ
ＣまたはＬＣ−ＭＳを用いて検出した。産生収率を上げ
るために、このペプチドは縦の繰り返し配列から得るか
または例４に記載の反復性人工的タンパク質として産生
した。

【００７８】例６ 苦味を有するペプチドの発現 苦味ペプチドＲＧＰＦＰＩＩＶ（配列番号３）を、ＢＭ
Ｐについて記載した方法と同じ方法で発現させた。下記
のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、発現ベクター
ｐＮＳ２中に連結した。

【００７９】5'-TCGAGAAGAGAGAAGCTGAAGCTAGAGGTCCATTC
CCAATTATTGTTTGAG-3' 3'-CTTCTCTCTTCGACTTCGATCTCCAGGTAAGGGTTAATAACAAACTC
CTAG-5' オリゴヌクレオチド断片を、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切
断したベクターｐＮＳ２に挿入した。ペプチドの形質転
換、誘導および産生は、例２に記載したように行った。
ペプチドはＢＭＰの場合と同様に、ＨＰＬＣまたはＬＣ
−ＭＳを用いて検出した。製造収率を上げるために、こ
のペプチドは縦の繰り返し配列から得るかまたは例４に
記載の反復性人工的タンパク質として製造した。

【００８０】

【配列表】

（１）配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列：配列番号：１： Lys Gly Asp Glu Glu Ser Leu Ala 1 5

【００８１】（２）配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列：配列番号：２ Asp Lys Ile His Pro Phe 1 5

【００８２】（３）配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：７アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数： （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ペプチド （xi）配列：配列番号：３ Arg Gly Pro Phe Ile Ile Val 1 5

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、プラスミドｐＮＳ２の完全なヌク
レオチド配列のうちのヌクレオチド番号１〜１５５０を
示す。

【図１Ｂ】図１Ｂは、プラスミドｐＮＳ２の完全なヌク
レオチド配列のうちのヌクレオチド番号１５５１〜３２
００を示す。

【図１Ｃ】図１Ｃは、プラスミドｐＮＳ２の完全なヌク
レオチド配列のうちのヌクレオチド番号３２０１〜４８
５０を示す。

【図１Ｄ】図１Ｄは、プラスミドｐＮＳ２の完全なヌク
レオチド配列のうちのヌクレオチド番号４８５１〜６５
００を示す。

【図１Ｅ】図１Ｅは、プラスミドｐＮＳ２の完全なヌク
レオチド配列のうちのヌクレオチド番号６５０１〜８１
４０を示す。

【図２】図２は、プラスミドｐＮＳ２の略図である。

【図３】図３は、プラスミドｐＮＳ３の略図である。

【図４】図４は、ＢＭＰの電子スプレー質量スペクトル
である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ナターシャ シルケ オーストラリア国ビクトリア，カールト ン，オーウェン ストリート １／７

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 均一な型の呈味性ペプチド。
2. 【請求項２】 ２〜５０アミノ酸までの長さを有する請
   求項１に記載の呈味性ペプチド。
3. 【請求項３】 配列番号１、配列番号２、または配列番
   号３のアミノ酸残基からなる請求項１または２に記載の
   呈味性ペプチド。
4. 【請求項４】 請求項１〜３に記載の呈味性ペプチドを
   コードする単離されたＤＮＡ配列。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡ配列を含んでな
   るベクター。
6. 【請求項６】 昆虫、微生物、カビ、植物、または動物
   中での発現を指令することができる請求項５に記載のベ
   クター。
7. 【請求項７】 請求項５および６に記載のベクターで形
   質転換した生物。
8. 【請求項８】 酵母である請求項７に記載の生物
9. 【請求項９】 呈味性ペプチドまたはその部分もしくは
   その抽出物を含んでなる生物。
10. 【請求項１０】 請求項７および８に記載の生物を適当
    な培地中で培養し、呈味性ペプチドを任意に単離するこ
    とからなる、請求項１〜３に記載の呈味性ペプチドの製
    造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法により調製さ
    れる呈味性ペプチド。
12. 【請求項１２】 様々な味の印象を修飾、増強または遮
    蔽するための、請求項１〜３に記載の呈味性ペプチドの
    使用。
13. 【請求項１３】 様々な味の印象を修飾、増強または遮
    蔽するための、請求項７および８に記載の生物の使用。
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の方法により調製さ
    れる呈味性ペプチドを含む食物。